Hmgb1 мутанты

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен полипептид белка В1 группы высокой подвижности (HMGB1), при этом в указанном полипептиде HMGB1 по меньшей мере один, предпочтительно два, более предпочтительно три, наиболее предпочтительно все четыре остатка тирозина заменены на аминокислотный остаток. В настоящем изобретении также предложены полинуклеотид, кодирующий полипептид согласно настоящему изобретению, вектор, содержащий указанный полинуклеотид, и клетка-хозяин, содержащая указанный полипептид, указанный полинуклеотид и/или указанный вектор. Помимо этого, в рамках настоящего изобретения также предложены способы, наборы и применения, связанные с указанными изобретениями. Группа изобретений позволяет получить полипептид HMGB1, применение которого вызывает повышенную гибель раковых клеток. 9 н. и 28 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 2 пр.

 

В соответствии с настоящим изобретением предложен полипептид белка В1 группы высокой подвижности (HMGB1; high-mobility group box 1), при этом в указанном полипептиде HMGB1 в положениях, соответствующих положениям аминокислот Y109, Y144, Y155 и/или Y162 HMGB1 человека, по меньшей мере один, предпочтительно два, более предпочтительно три, наиболее предпочтительно, все четыре остатка тирозина заменены на аминокислотный остаток, независимо выбранный из глутаминовой кислоты, глутамина, аспарагиновой кислоты, аспарагина, гомоглутаминовой кислоты (2-аминогександиоевой кислоты) и гомоглутамина (2,6-диамино-6-оксогексановой кислоты). Кроме этого, в настоящем изобретении предложен полинуклеотид, кодирующий полипептид согласно настоящему изобретению, вектор, содержащий указанный полинуклеотид, и клетка-хозяин, содержащая указанный полипептид, указанный полинуклеотид и/или указанный вектор. Помимо этого, в настоящем изобретении предложены способы, наборы и применения, связанные с указанными изобретениями.

Белок В1 группы высокой подвижности (HMGB1) принадлежит к семейству ядерных белков, группе белков высокой подвижности (High Mobility Group (HMG)), названной так в связи с необычно высокой подвижностью ее членов при электрофорезе в SDS-полиакриламидном геле (SDS-PAGE). Указанные белки являются вторыми после гистонов наиболее распространенными белками, связанными с хроматином, указанные белки играют архитектурную роль в ядре эукариотической клетки, которая заключается в том, что они сгибают, деформируют или иным образом модифицируют конформацию ДНК, тем самым также модифицируя связывание факторов транскрипции с ДНК. Белки HMG были ассоциированы с возникновением ряда различных расстройств, например, некоторых видов доброкачественных опухолей и аутоиммунных заболеваний. Кроме того, высвобождение больших количеств HMGB1, в частности из натуральных киллеров (NK-клеток), является ключевым фактором активации дендритных клеток (Saidi et al. (2008), PloS one 3, e3601) и хемотаксиса (Yang et al. (2007), Journal of leukocyte biology 81, 59-66). HMGB1 также проявляет исключительную противомикробную активность, приводящую к быстрому уничтожению бактерий (Zetterstrom et al., (2002), Pediatric research 52, 148-154).

Эндогенный HMGB1 также активно вовлечен в энергетический обмен клеток и органов. Мыши с нокаутом HMGB1 не способны использовать запасы гликогена в гепатоцитах и погибают из-за перинатальной гипогликемии. Глюкоза ненадолго может их спасти, но животные все равно погибают через несколько дней из-за сильной атрофии внутренних органов, мышц и жировой ткани (Calogero et al. (1999), Nature genetics 22, 276-280). Инкубация мышечной ткани мышей с HMGB1 ex vivo приводит к быстрому истощению мышечных волокон, и обнаружено, что концентрация HMGB1 повышена в миоплазме пациентов, страдающих полимиозитом (Grundtman et al. (2010), The FASEB journal 24, 570-578). Таким образом, как недостаток, так и избыток HMGB1 сильно влияет на энергетический обмен клеток.

Внеклеточный HMGB1 является мощным цитокином и сильным активирующим фактором для макрофагов и других клеток иммунной системы, что ведет к обширной воспалительной реакции. Из-за этого механизма HMGB1 участвует в аутоиммунных заболеваниях, таких как системная красная волчанка и ревматоидный артрит. С другой стороны, высокое содержание HMGB1 в крови указывает на серьезные или опасные для жизни воспалительные состояния, например, сепсис. Для борьбы с такими патологическими состояниями, ассоциированными с HMGB1, описаны ингибиторы функции HMGB1, например, ингибирующие антитела или их фрагменты, мутированные в домене box А варианты HMGB1 или полимерные конъюгаты домена box A (US 6,468,533, WO 02/074337, US 2003/0144201, WO 2006024547 и WO 2008031612). В то же время HMGB1 был предложен в качестве противоракового средства (US 2011/0123483 A1, Gdynia et al. (2016), Nature Communications 7:10764. doi: 10.1038/ncomms 10764).

В белках HMGB1 описано несколько структурных мотивов: два ДНК-связывающих домена (box А и box В), две последовательности ядерной локализации и С-концевой кислотный домен. Белки HMGB1 могут подвергаться сильной посттрансляционной модификации путем ацетилирования, метилирования, АДФ-рибозилирования, фосфорилирования или гликозилирования. Ацетилирование сайтов ядерной локализации является сигналом, который приводит к активной секреции белка HMGB1 активированными клетками иммунной системы. Помимо активной секреции, HMGB1 также пассивно высвобождается из некротических клеток.

Кроме хирургического удаления опухолевой ткани, лечение рака, по существу, основано на применении лекарственных средств и/или терапии, которые оказывают негативное влияние на активно делящиеся клетки. Само по себе такое лечение наносит вред неопухолевым делящимся клеткам и тканям организма, что приводит к большинству широко известных и серьезных побочных эффектов химио- и лучевой терапии, включая тошноту, нарушения пищеварения, усталость, потерю волос и др. Таким образом, получение новых терапевтических агентов с новыми, еще неизвестными механизмами действия, которые потенциально позволили бы снизить дозу химио- и/или радиотерапии, ослабляя их побочные эффекты, является желательным. Обеспечение таких агентов, которые задействуют новые пути для уничтожения раковых клеток, может потенциально также способствовать устранению раковых стволовых клеток, которые способны выживать после химиотерапии, переходя в состояние покоя, и, как недавно установлено, ответственны по меньшей мере за часть рецидивов и метастазов.

В последние годы было показано, что NK-клетки могут быть потенциально использованы для лечения рака. Основное преимущество указанных клеток заключается в том, что они относятся к врожденной иммунной системе и не требуют антигенспецифичной активации. NK-клетки можно разделить на три основных подгруппы, в зависимости от их способности связывать и уничтожать чувствительные клетки-мишени: свободные, связывающие и киллерные NK-клетки (Jewett et al. (1996), J Clin Immunol. 16(1):46-54). Несвязывающие и не являющиеся киллерными NK-клетки являются наиболее незрелыми и могут быть активированы, превращаясь в связывающие и киллерные, и обнаружено, что способность NK-клеток секретировать TNF-альфа коррелирует с функциональной стадией созревания NK-клеток (Jewett et al., loc. cit).

Поскольку иммунотерапия рака становится все более многообещающей, более эффективной и более доступной, оптимальный контроль ее потенциальной токсичности становится все более важным (Lee et al. (2014), Blood 124(2): 188). В частности, синдром высвобождения цитокинов (Cytokine release syndrome, CRS), который представляет собой синдром, связанный с повышенным уровнем цитокинов в циркуляции, является потенциально опасным для жизни состоянием, которое наблюдали после введения природных и биспецифичных антител и, в последнее время, после терапии рака Т- или NK-клетками (Lee et al., loc. cit.).

Следовательно, существует потребность в усовершенствованных способах лечения рака. Данная проблема решается посредством средств и способов, раскрытых ниже в рамках настоящей заявки.

Таким образом, в рамках настоящего изобретения предложен полипептид белка В1 группы высокой подвижности (полипептид) HMGB1, при этом в указанном полипептиде HMGB1 по меньшей мере один, предпочтительно два, более предпочтительно три, наиболее предпочтительно, все четыре остатка тирозина в положениях, соответствующих положениям аминокислот 22, 57, 68 и 75 последовательности SEQ ID NO: 1, заменены на аминокислотный остаток, независимо выбранный из глутаминовой кислоты, глутамина, аспарагиновой кислоты, аспарагина, гомоглутаминовой кислоты (2-аминогександиоевой кислоты) и гомоглутамина (2,6-диамино-6-оксогексановой кислоты).

При использовании ниже, такие термины, как «иметь», «содержать» или «включать» или любые их произвольные грамматические формы являются неисключающими. Таким образом, указанные термины могут относиться как к ситуации, в которой, кроме признака, введенного этими терминами, другие признаки объекта в данном контексте отсутствуют, так и к ситуации, в которой один признак или более могут присутствовать. Например, выражения «А имеет В», «А содержит В» и «А включает В» могут относиться как к ситуации, в которой в А нет других элементов, кроме В (то есть к ситуации, в которой только и состоит исключительно из В), но также и к ситуации, в которой в А, кроме В, присутствуют один или несколько дополнительных элементов, например элемент С, элементы С и D или даже дополнительные элементы.

Кроме того, используемые ниже термины «предпочтительно», «более предпочтительно», «наиболее предпочтительно», «конкретно», «более конкретно», «особенно», «в особенности» и подобные им используются в сочетании с необязательными признаками, и не ограничивают дополнительные возможности. Таким образом, все признаки, описываемые этими терминами, являются необязательными и не имеют целью ограничить объем формулы изобретения каким-либо образом. Специалисту в данной области техники понятно, что данное изобретение может быть осуществлено также с использованием альтернативных признаков. Аналогично, признаки, которые описаны выражением «в варианте реализации изобретения» или сходными выражениями, предназначены для использования в качестве необязательных признаков без каких-либо ограничений в отношении других возможных вариантов реализации изобретения, без каких-либо ограничений в отношении объема изобретения и без каких-либо ограничений в отношении возможности комбинирования признаков, описанных таким образом, с другими необязательными или обязательными признаками данного изобретения. Кроме того, если не указано иное, термин «приблизительно» указывает на то, что указанное значение имеет интервал точности ±20%.

Используемый в настоящей заявке термин «полипептид белка В1 группы с высокой подвижностью» (полипептид HMGB1) относится к члену группы полипептидов с высокой подвижностью, которые известны специалистам в данной области техники, и имеет модификации, указанные в формуле изобретения, и включает в том числе частичные аминокислотные последовательности или их производные как указано ниже. Таким образом, согласно настоящему изобретению, полипептид HMGB1 предпочтительно не будет являться встречающимся в природе полипептидом HMGB1. Также, предпочтительно полипептид HMGB1, согласно настоящему изобретению, не является HMGB1 человека, и не является HMGB1, фосфорилированным по аминокислотам Y109, Y144, Y155 и/или Y162. Предпочтительно, полипептид HMGB1 согласно настоящему изобретению обладает активностью, которая описана в настоящем изобретении, предпочтительно цитотоксической активностью и/или способностью активировать NK-клетки, предпочтительно согласно Примерам данной заявки. Предпочтительно, полипептид HMGB1 является производным полипептида HMGB1 человека (Genbank АСС No: NP 002119.1 GL4504425, SEQ ID NO: 3). Способы анализа, подходящие для измерения указанных выше активностей, также описаны в прилагаемых Примерах. Полипептид HMGB1 может быть очищен из клеток или тканей, или он может быть химически синтезирован или, предпочтительно, получен рекомбинантным способом. Полипептид HMGB1 может содержать дополнительные аминокислоты, которые могут служить меткой для очистки или обнаружения, и/или полипептид HMGB1 может содержаться в гибридном полипептиде в соответствии с настоящим изобретением.

Таким образом, в предпочтительном варианте реализации полипептид или пептид согласно настоящему изобретению, дополнительно содержит обнаруживаемую метку. Термин «обнаруживаемая метка» относится к ряду аминокислот, добавленных или встроенных в структуру полипептида или пептида. Предпочтительно, метку следует добавлять к С- или N-концу полипептида или пептида, описанный выше ряд аминокислот может, например, обеспечить распознавание пептида или полипептида антителом, которое специфично распознает метку, или он должен участвовать в образовании функциональной конформации, как, например, хелатор, или он должен обеспечивать визуализацию с помощью флуоресцентных меток. Предпочтительными метками являются Мус-tag, FLAG-tag, 6-His-tag, HA-tag, GST-tag или GFP-tag. Все указанные метки хорошо известны в данной области техники.

Предпочтительным вариантом реализации является полипептид HMGB1, включающий В-Вох мотив полипептида HMGB1, предпочтительно Box В HMGB1 человека, более предпочтительно включающий производное SEQ ID NO: 1 с мутациями, указанными в настоящей заявке, более предпочтительно включая мутированный Box В HMGB1 человека, как описано в данной заявке ниже.

В полипептиде HMGB1 согласно настоящему изобретению, по меньшей мере один, предпочтительно два, более предпочтительно три, наиболее предпочтительно, все четыре остатка тирозина в положениях, соответствующих положениям аминокислот 22, 57, 68 и 75 последовательности SEQ ID NO: 1, заменены на аминокислотный остаток, независимо выбранный из глутаминовой кислоты, глутамина, аспарагиновой кислоты, аспарагина, гомоглутаминовой кислоты (2-аминогександиоевой кислоты) и гомоглутамина (2,6-диамино-6-оксогексановой кислоты). Специалисту в данной области техники понятно, что вышеуказанные аминокислотные положения соответствуют аминокислотам Y109, Y144, Y155 и Y162 HMGB1 человека (SEQ ID NO: 3). Предпочтительно, чтобы в указанном полипептиде HMGB1 по меньшей мере один, предпочтительно два, более предпочтительно три, наиболее предпочтительно все четыре остатка тирозина в указанных положениях были заменены на аминокислотный остаток, независимо выбранный из глутаминовой кислоты, глутамина, аспарагиновой кислоты и аспарагина. Более предпочтительно, чтобы в указанном полипептиде HMGB1 по меньшей мере один, предпочтительно два, более предпочтительно три, наиболее предпочтительно все четыре остатка тирозина в указанных положениях были заменены на остатки глутаминовой кислоты или остатки глутамина. Еще более предпочтительно, чтобы в указанном полипептиде HMGB1 по меньшей мере один, предпочтительно два, более предпочтительно три, наиболее предпочтительно все четыре остатка тирозина в указанных положениях были заменены на остатки глутамина; таким образом, предпочтительно, полипептид HMGB1 предпочтительно включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, более предпочтительно включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. Наиболее предпочтительно, чтобы в указанном полипептиде HMGB1 по меньшей мере один, предпочтительно два, более предпочтительно три, наиболее предпочтительно все четыре остатка тирозина в указанных положениях были заменены на остатки глутаминовой кислоты; таким образом, предпочтительно, что полипептид HMGB1 содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 7, более предпочтительно, последовательность аминокислот SEQ ID NO: 8.

В возможном варианте реализации полипептид HMGB1 или его производное является олигофосфорилированным полипептидом HMGB1, в частности полипептидом HMGB1, в котором по меньшей мере один, предпочтительно два, более предпочтительно три и, наиболее предпочтительно, все четыре, остатка тирозина заменены на остаток(и) глутамина, аспарагина или гомоглутамина. В более предпочтительном варианте реализации полипептид HMGB1 или его производное является фосфомиметиком полипептида HMGB1, в частности полипептидом HMGB1, в котором по меньшей мере один, предпочтительно два, более предпочтительно три, наиболее предпочтительно все четыре остатка тирозина заменены на остаток(и) глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты или гомоглутаминовой кислоты.

Предпочтительно, полипептид HMGB1 или его производное является полипептидом HMGB1, как описано в данной заявке выше; при этом предпочтительно, термин также включает полипептид, последовательность аминокислот которого по меньшей мере на 70% идентична полипептиду HMGB1 или Box В полипептида HMGB1, как указано в настоящем изобретении, и, кроме того, обладал способностью усиливать гибель раковых клеток, например, клеток SW480. Таким образом, предпочтительно, полипептид HMGB1 в концентрации 0,8 мкМ обладает способностью вызывать повышенную гибель клеток в культуре клеток SW480 по сравнению с полипептидом, включающим или, предпочтительно, состоящим из последовательности аминокислот SEQ ID NO: 3. Более предпочтительно, полипептид HMGB1 в концентрации 0,8 мкМ обладает способностью вызывать повышенную гибель клеток в культуре клеток SW480 по сравнению с полипептидом, включающим или, предпочтительно, состоящим из последовательности аминокислот SEQ ID NO: 6. Также предпочтительно, что термин, предпочтительно, также включает полипептид, включающий последовательность аминокислот, по меньшей мере на 70% идентичную полипептиду HMGB1 или Box В полипептида HMGB1, в соответствии с данным изобретением, и обладающий способностью стимулировать уничтожение раковых клеток NK-клетками; более предпочтительно, что повышение способности клеток NK-92 CI уничтожать клетки SW480 в культуре клеток при концентрации 0,8 мкМ выше по сравнению с полипептидом, включающим, предпочтительно состоящим из последовательности аминокислот SEQ ID NO: 3; более предпочтительно, что повышение способности клеток NK-92 CI уничтожать клетки SW480 в культуре клеток при концентрации 0,8 мкМ выше по сравнению с полипептидом, включающим, предпочтительно состоящим из последовательности аминокислот SEQ ID NO: 6. Также предпочтительно, что термин, предпочтительно, включает также полипептид имеющий последовательность аминокислот, по меньшей мере на 70% идентичную полипептиду HMGB1 или Box В полипептида HMGB1, как указано в данном изобретении, и обладающий способностью стимулировать созревание NK-клеток, а также, предпочтительно, в концентрации 0,8 мкМ увеличивать секрецию фактора некроза опухоли альфа (TNF-альфа) культурой клеток NK-92 CI сильнее, чем полипептид, включающий или, предпочтительно, состоящий из последовательности аминокислот SEQ ID NO: 3. Более предпочтительно, указанный полипептид HMGB1 в концентрации 0,8 мкМ увеличивает секрецию фактора некроза опухоли альфа (TNF-альфа) культивированными клетками NK-92 CI сильнее, чем полипептид, включающий или, предпочтительно, состоящий из последовательности аминокислот SEQ ID NO: 6.

Термин «TNF-альфа» или «фактор некроза опухоли альфа» известен специалисту в данной области техники как цитокин, вовлеченный в процесс системного воспаления, в частности в реакцию его острой фазы. Предпочтительно, TNF-альфа представляет собой TNF-альфа человека.

Предпочтительно, полипептид HMGB1 содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую, по меньшей мере, 70%, предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, еще более предпочтительно 95% и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 98% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1 и/или содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую, по меньшей мере, 70%, предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, еще более предпочтительно 95% и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 98% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 3, и более предпочтительно, обладает по меньшей мере одной, более предпочтительно, по меньшей мере двумя, наиболее предпочтительно, всеми тремя описанными выше активностями. Более предпочтительно, полипептид HMGB1 содержит последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере с 70%, предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, еще более предпочтительно 95% и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 98% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 5-8, предпочтительно SEQ ID NO: 6 или 8 и, более предпочтительно, имеет по меньшей мере одну, более предпочтительно, по меньшей мере две, наиболее предпочтительно, все три из вышеперечисленных активностей.

Термин «агент, обеспечивающий полипептид HMGB1», используемый в настоящей заявке, относится к любому агенту или композиции, способной обеспечить или высвободить полипептид HMGB1, в соответствии с настоящим изобретением, в биологическую систему. Предпочтительно, агент, обеспечивающий полипептид HMGB1, используется в дозе, индуцирующей концентрацию в плазме от 1 нМ до 5 мкМ, более предпочтительно, от 10 нМ до 1 мкМ, наиболее предпочтительно, от 50 нМ до 900 нМ. Предпочтительно, термин также включает агент, специфично связывающийся с опухолевой клеткой, содержащей полипептид HMGB1. Предпочтительно, указанный агент, специфично связывающийся с опухолевой клеткой, являться антителом, аптамером, лектином или тому подобным. Предпочтительно также, термин агент, обеспечивающий полипептид HMGB1 относится к HMGB1-секретирующей клетке, индуцированной для секреции полипептида HMGB1. Клетки, которые могут быть индуцированы к секреции HMGB1, а также способы обеспечения указанной секреции известны в данной области техники и включают, предпочтительно, способы, приведенные в примерах; предпочтительными видами клеток, которые могут быть индуцированы для секреции HMGB1, являются макрофаги и NK-клетки. Также предпочтительно, термин агент, обеспечивающий полипептид HMGB1, относится к полинуклеотиду с возможностью экспрессии, кодирующему полипептид HMGB1. Как известно специалисту в данной области техники, такой полинуклеотид, предпочтительно, включен в вектор или в клетку-хозяина, предпочтительно, как описано здесь ниже.

Термин «производное», используемый в контексте химического компонента настоящего изобретения, относится к молекуле, имеющей структуру, связанную с химическим соединением согласно настоящему изобретению. Предпочтительно, производное может быть получено из химического соединения согласно настоящему изобретению не более чем тремя, более предпочтительно не более, чем двумя, наиболее предпочтительно одной реакцией химической дериватизации. Предпочтительно, данное производное является компонентом, который метаболизируется в организме млекопитающих, предпочтительно человека, в химическое соединение согласно настоящему изобретению. Также предпочтительно, производное является компонентом, из которого химическое соединение согласно настоящему изобретению может быть получено гидролизом. В случае, если указанное химическое соединение является пептидом или полипептидом, то соответствующее производное, предпочтительно, по меньшей мере, до некоторой степени сходно, как указано в настоящем изобретении, с компонентом, из которого оно получено. В соответствии с настоящей заявкой, производное полипептида HMGB1 имеет, по меньшей мере, активность в ингибировании раковых клеток, как указано здесь выше.

Термин «производное», представляющий полипептид или пептид, включает варианты последовательности аминокислот упомянутого полипептида или пептида, указанные варианты являются по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичны последовательности аминокислот полипептида или пептида, а также указанные варианты сохраняют функцию полипептида или пептида согласно настоящему изобретению. Процентные значения, предпочтительно, рассчитаны исходя из полного участка последовательности аминокислот. Ряд программ, основанных на различных алгоритмах, доступен специалисту в данной области техники для сравнения различных последовательностей. В данном случае алгоритмы Нидлмана и Вунша или Смита и Уотермана (Needleman and Wunsch or Smith and Waterman) дают особенно надежные результаты. Для сравнения последовательностей, надлежит использовать программу PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153), Gap и BestFit (Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970)) или Smith и Waterman Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)), входящие в программное обеспечение (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)). Значения идентичности последовательностей, приведенные выше в процентах (%), следует определять, предпочтительно, с использованием программы GAP с учетом всей последовательности со следующими настройками: «Gap Weight: 50, Length Weight: 3, Average Match: 10.000 и Average Mismatch: 0.000».

Кроме того, производные полипептидов или пептидов также охватывают возможные варианты описанных выше специфичных последовательностей аминокислот, которые могут представлять ортологи, паралоги или другие гомологи определенных полипептидов или пептидов. Эти варианты, предпочтительно, содержат последовательность аминокислот, характеризуемую тем, что последовательность может быть получена из вышеупомянутых последовательностей полипептидов или пептидов, по меньшей мере, путем одной аминокислотной замены и/или добавления и/или делеции.

Термин «производное» также включает химически модифицированные полипептиды, например полипептиды, содержащие модифицированные аминокислоты или полипептиды, которые, например, биотинилированы или связаны с флуорофорами, такими, как флуоресцеин или Су 3, конформационно ограничены, например, путем введения дисульфидного мостика или сшивания (Walensky 2004, Science 305 (5689): 1466-1470), или связаны с полипептидами, отвечающими за проникновение в клетки, или с доменами белковой трансдукции (Snyder 2004, Pharm Res 21 (3): 389-393). Такие модификации способны улучшить биологические свойства полипептидов, например, проникновение в клетку, связывание, стабильность, или могут использоваться в качестве меток для обнаружения.

Предпочтительно, полипептид HMGB1 обеспечен в виде фармацевтически совместимого состава. Термины «фармацевтически совместимый состав» и «фармацевтическая композиция», используемые в настоящей заявке относятся к композициям, включающим по меньшей мере одно соединение согласно настоящему изобретению и один или более фармацевтически приемлемых носителей. Соединения согласно настоящему изобретению могут быть приготовлены в форме фармацевтически приемлемых солей. Предпочтительными солями являются ацетат, метиловый эфир, HCl, сульфат, хлорид и тому подобное. Фармацевтические композиции, предпочтительно, вводят местно или, более предпочтительно, системно. Подходящие пути введения, обычно используемые для введения лекарственных препаратов, представляют собой пероральное, внутривенное или парентеральное введение, а также ингаляция. Тем не менее, в зависимости от природы и способа действия соединения, фармацевтические композиции можно также вводить другими путями. Кроме того, соединения можно вводить в комбинации с другими лекарственными средствами, или в составе широко применяемой фармацевтической композиции или в виде отдельных фармацевтических композиций, как указано в настоящем изобретении, при этом указанные отдельные фармацевтические композиции могут быть предоставлены в форме составного набора.

Соединения вводят, предпочтительно, в общепринятых формах дозирования, полученных путем объединения лекарственных средств со стандартными фармацевтическими носителями, согласно общепринятым процедурам. Эти процедуры могут включать смешивание, гранулирование и прессование или растворение ингредиентов в зависимости от желаемой готовой формы. При этом форма и тип фармацевтически приемлемого носителя или растворителя определяется количеством активного ингредиента, с которым будет происходить объединение, путем ведения и другими хорошо известными переменными.

Носитель(и) должен быть приемлемым, что означает его совместимость с другими ингредиентами композиции и отсутствие опасности для того, кто его принимает. Используемый носитель может быть, например, твердым, гелем или жидкостью. Примерами твердых носителей являются лактоза, белый гипс, сахароза, тальк, желатин, агар, пектин, аравийская камедь, стеарат магния, стеариновая кислота и им подобные. Примерами жидких носителей являются натрий-фосфатный буфер, сироп, масло, включая, например, арахисовое и оливковое, вода, эмульсии, различные виды смачивающих агентов, стерильные растворы и им подобные. Похожим образом, носитель или разбавитель может включать какой-либо компонент для замедленного высвобождения, хорошо известный в данной области техники, такой, как глицерилмоно- или глицерилдистеарат, сам по себе или в смеси с воском. Названные подходящие носители включают упомянутые выше и другие, хорошо известные в данной области техники, согласно, например, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.

Разбавитель(и) выбирают так, чтобы избежать влияния биологическую активность действующего соединения или соединений. Примерами таких разбавителей являются дистиллированная вода, физиологический раствор, растворы Рингера, раствор декстрозы и раствор Хэнка. Кроме того, фармацевтическая композиция может включать и другие носители, адъюванты или нетоксичные, нетерапевтические, неиммуногенные стабилизаторы и им подобные.

Терапевтически эффективная доза относится к количеству соединений, которое используется в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, которая предотвращает, ослабляет или излечивает симптомы, сопровождающие заболевание или состояние согласно настоящему изобретению. Терапевтическую эффективность и токсичность этих соединений можно определить стандартными фармацевтическими подходами на клеточных культурах или в экспериментах на животных, например, полуэффективной дозой (ED50, ЭД50 - доза, терапевтически эффективная для 50% популяции) и полулетальной дозой (ЛД50, LD50 - доза, летальная для 50% популяции). Соотношение между дозами, вызывающими терапевтический и токсический эффекты, является терапевтическим индексом, и оно также может быть выражено как соотношение ЛД50/ЭД50.

Режим дозирования будет определяться лечащим врачом и другими клиническими факторами, предпочтительно в соответствии с одни из вышеописанных способов. Как хорошо известно в области медицины, дозировки для каждого отдельного пациента зависят от многих факторов, включая размер, поверхность тела, возраст, конкретное вводимое соединение, пол, время и путь введения, общее состояние здоровья и другие параллельно вводимые лекарственные средства. Прогресс можно отслеживать путем периодической оценки. Обычная доза может находиться, например, в интервале от 1 до 1000 мкг; тем не менее, дозы выше или ниже этого приблизительного диапазона также предусмотрены, особенно с учетом вышеупомянутых факторов. Как правило, режим для регулярного введения фармацевтической композиции должен находиться в интервале от 1 мкг до 10 мг единиц в день. Если режим представляет собой непрерывную инфузию, то она также должна быть в интервале от 1 мкг до 10 мг единиц на килограмм массы тела в минуту, соответственно. Прогресс можно отследить путем периодической оценки. Предпочтительные дозы и концентрации соединений данного изобретения, указаны в других частях документа. Фармацевтические композиции и препараты, упомянутые здесь, предпочтительно вводят, по меньшей мере однократно для лечения, ослабления или предотвращения заболеваний или состояний, перечисленных в этом документе. Тем не менее, названные фармацевтические композиции могут быть введены более одного раза, например, от одного до четырех раз в день в течение неограниченного количества дней.

Особые фармацевтические композиции приготовлены способами, известными в области фармацевтики, и включают, по меньшей мере, одно активное соединение согласно настоящему изобретению, смешанное или иным способом связанное с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Для изготовления этих особых фармацевтических композиций активное соединение(я) обычно будет смешано с носителем или разбавителем или заключено или инкапсулировано в капсулы, саше, облатки, бумагу и другие подходящие контейнеры или носители. Полученные составы надлежит адаптировать к способу введения, то есть представить в форме таблеток, капсул, суппозиториев, растворов, суспензий или тому подобного. Рекомендации по дозировке должны быть указаны в инструкции по назначению или применению, чтобы можно было произвести необходимые корректировки дозы в зависимости от особенностей предполагаемого пациента.

В ходе работы, лежащей в основе создания настоящего изобретения, было обнаружено, что мутированные полипептиды HMGB1 согласно настоящему изобретению обладают повышенными активностями по сравнению с HMGB1 дикого типа, при том, что Glu-HMGB1 более активен, чем Gln-HMGB1. Кроме того, было обнаружено, что, путем использования различных мутантов HMGB1, можно регулировать уровень цитотоксичности для раковых клеток и активации иммунной системы по мере необходимости.

Определения, введенные выше, применимы mutatis mutandis к следующему: дополнительные определения и пояснения, сделанные далее, также применимы mutatis mutandis ко всем описанным вариантам реализации, описанным в данной заявке.

Настоящее изобретение дополнительно относится к полинуклеотид у, кодирующему полипептид согласно настоящему изобретению.

Термин «полинуклеотид», как он использован настоящей заявке, относится к полинуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, имеющий биологическую активность, описанную выше, предпочтительно включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, включающий последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 5 и/или 8 или их производное, как описано здесь выше. Следует понимать, что полипептид с последовательностью аминокислот, описанной подробно выше, вследствие вырожденности генетического кода, может быть кодирован более, чем одним видом полинуклеотида. Более того, термин «полинуклеотид», как он использован в соответствии с настоящим изобретением, дополнительно охватывает варианты вышеупомянутых специфичных полинуклеотидов. Указанные варианты полинуклеотидов могут являться ортологами, паралогами или другие гомологами полинуклеотида согласно настоящему изобретению. Варианты полинуклеотида предпочтительно включают нуклеотидную последовательность, отличающуюся тем, что эта последовательность может быть получена из вышеупомянутых специфичных последовательностей нуклеиновых кислот по меньшей мере одной заменой, добавлением и/или удалением нуклеотида, при том, что вариантная нуклеотидная последовательность должна по-прежнему кодировать полипептид, имеющий мутацию(и) и активность, описанные выше. Варианты также включают полинуклеотиды, с нуклеотидной последовательностью, которая способна гибридизоваться с вышеупомянутыми специфичными нуклеотидными последовательности, предпочтительно, в жестких условиях гибридизации. Эти строгие условия известны специалисту в данной области техники и могут быть найдены в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Предпочтительный пример жестких условий гибридизация условия гибридизации в 6х концентрированном растворе хлорида натрия/цитрата натрия (=SSC) приблизительно при 45°C с последующей одно- или многократной промывкой в 0,2х растворе SSC, 0,1% SDS при 50-65°C. Специалисту в данной области техники известно, что эти условия гибридизации различаются, в зависимости от типа нуклеиновой кислоты и, например, в случае присутствия органических растворителей, в отношении температуры и концентрации буфера. Например, при «стандартных условиях гибридизации» температура варьирует, в зависимости от типа нуклеиновой кислоты, от 42 до 58°C в водном буфере с концентрацией от 0,1 до 5х SSC (рН 7,2). Если органический растворитель присутствует в вышеупомянутом буфере, например 50% формамид, температура в стандартных условиях составляет приблизительно 42°C. Условия гибридизациии для ДНК:ДНК-гибридов составляют, предпочтительно, например, 0,1 × SSC буфер и от 20°C до 45°C, предпочтительно от 30 до 45°C. Условия формирования гибридов ДНК: РНК составляют, предпочтительно, например, 0,1× раствор SSC и от 30 до 55°C, предпочтительно от 45 до 55°C. Вышеупомянутые температуры гибридизации определены, например, для нуклеиновой кислоты длиной приблизительно 100 п.н. (= пары нуклеотидов) в длину и с содержанием G+С (Г+Ц) 50% в отсутствие формамида. Специалисту в данной области техники известно, как определять необходимые условия гибридизации, обращаясь к справочникам, в т.ч. справочнику упомянутому выше.

В альтернативном варианте, варианты полинуклеотида могут быть получены путями, основанными на ПЦР, такими, как амплификация ДНК на основе смешанных олигонуклеотидных праймеров, в частности использование вырожденных праймеров против консервативных доменов полипептидов согласно настоящему изобретению. Консервативные домены полипептидов согласно настоящему изобретению могут быть идентифицированы в результате сравнения нуклеотидных последовательностей полинуклеотида или последовательности аминокислот полипептида, как указано выше. Подходящие условия ПЦР хорошо известны в данной области техники. В качестве матрицы можно использовать ДНК или кДНК из AAV (аденоассоциированный вирус). Кроме того, варианты полинуклеотидов, включающие нуклеотидные последовательности, которые, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичны последовательностям нуклеиновых кислот, детально описанным выше. Процентные значения идентичности, предпочтительно, рассчитаны, как установлено выше.

Полинуклеотид, включающий фрагмент любой из вышеупомянутых нуклеотидных последовательностей, также включен в объем полинуклеотида согласно настоящему изобретению. Фрагмент должен кодировать полипептид, который по-прежнему будет иметь описанную выше биологическую активность. Соответственно, полипептид может содержать или состоять из доменов полипептида согласно настоящему изобретению, отвечающих за указанную биологическую активность. Фрагмент, как он понимается в настоящей заявке, предпочтительно включает по меньшей мере 50, по меньшей мере 100, по меньшей мере 250 или по меньшей мере 500 последовательных нуклеотидов любой из вышеупомянутых нуклеотидных последовательностей или кодирует последовательность аминокислот, включающую по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, по меньшей мере 50, по меньшей мере 80, по меньшей мере 100 или по меньшей мере 150 последовательных аминокислот любой из вышеуказанных последовательностей аминокислот.

Полинуклеотид согласно настоящему изобретению должен быть обеспечен, предпочтительно, либо как выделенный полинуклеотид (то есть, выделенный из его естественной среды) или в генетически модифицированной форме. Полинуклеотид, предпочтительно, является ДНК, включая кДНК, или РНК. Термин охватывает как одноцепочечные, так и двухцепочечные полинуклеотиды. Кроме того, включает также химически модифицированные полинуклеотиды, включая встречающиеся в природе модифицированные полинуклеотиды, такие как гликозилированные или метилированные полинуклеотиды, или искусственно модифицированные, такие как биотинилированные полинуклеотиды.

Полинуклеотиды согласно настоящему изобретению либо, по существу, состоят из вышеупомянутых последовательностей нуклеиновых кислот, либо содержат вышеупомянутые последовательности нуклеиновых кислот. Следовательно, они также могут содержать дополнительные последовательности нуклеиновых кислот. В частности, настоящее изобретение также относится к вектору, включающему вышеописанный полинуклеотид согласно настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также относится к вектору, включающему полинуклеотид согласно настоящему изобретению.

Термин «вектор», предпочтительно, охватывает фаговые, плазмидные, вирусные или ретровирусные векторы, а также искусственные хромосомы, такие как бактериальные и дрожжевые искусственные хромосомы. Более предпочтительно, термин относится к вектору, полученному из вируса, и указанный вирус, предпочтительно, направленно инфицирует опухолевые клетки (онкотропный вирус) или направленно лизирует раковые клетки (онколитический вирус). Кроме того, указанный термин относится к направленным конструкциям, которые обеспечивают случайную или сайт-специфичную интеграцию в геномную ДНК. Такие направленные конструкции, предпочтительно, содержат ДНК достаточной длины либо для гомологичной, либо для гетерологичной рекомбинации. Вектор, включающий полинуклеотид согласно настоящему изобретению, предпочтительно также включает селектируемые маркеры для размножения и/или селекции в хозяине. Вектор может быть включен в клетку-хозяина различными способами, хорошо известными в данной области техники. Например, плазмидный вектор может быть доставлен в составе преципитата, такого как преципитат фосфата кальция или преципитат хлорида рубидия, или в составе комплекса с заряженным липидом или в углеродных кластерах, таких как фуллерены. В альтернативном варианте плазмидный вектор может быть введен с использованием теплового шока или электропорации. В случае, если вектор является вирусом, то он может быть упакован in vitro с использованием подходящей упаковочной клеточной линии до применения на клетках-хозяевах. Вирусные векторы могут быть компетентными по репликации или дефектными по репликации.

Предпочтительно, в векторе согласно настоящему изобретению полинуклеотид согласно настоящему изобретению функционально связан с последовательностями, обеспечивающими экспрессию в прокариотических или эукариотических клетках или выделенных фракциях указанных клеток. Экспрессия указанного полинуклеотида подразумевает транскрипцию полинуклеотида, предпочтительно в мРНК с возможностью трансляции. Регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию в эукариотических клетках, предпочтительно в клетках млекопитающих, хорошо известны в данной области техники. Они, предпочтительно, включают регуляторные последовательности, обеспечивающие инициацию транскрипции, и, необязательно, поли-А-сигналы, обеспечивающие прекращение транскрипции и стабилизацию транскрипта. Дополнительными регуляторные элементы могут включать транскрипционные, а также трансляционные энхансеры. Возможные регуляторные элементы, разрешающие экспрессию в прокариотических клетках-хозяевах, включают, например, промоторы lac, trp или tac в E.coli, и примерами регуляторных элементов, разрешающих экспрессию в эукариотических клетках-хозяевах являются промоторы АОХ1 или GAL1 для дрожжей или CMV-, SV40 - RSV-промоторы (вирус саркомы Рауса), CMV-энхансер, 8У40-энхансер и интрон глобина для клеток млекопитающих и других клеток животных. Помимо этого, индуцибельные контролирующие экспрессию последовательности могут быть использованы в векторе, обеспечивающем экспрессию согласно настоящему изобретению. Такие индуцибельные векторы могут, предпочтительно, содержать последовательности операторов tet или lac или последовательности, активируемые тепловым шоком или другими факторами окружающей среды. Подходящие последовательности для контроля экспрессии хорошо известны в данной области техники. Помимо элементов, ответственных за начало транскрипции, такие регуляторные элементы могут также включать сигналы прекращения транскрипции, такие как сайт SV40-poly-A или сайт tk-poly-A, в направлении 5'-3' от полинуклеотида. В данном контексте подходящими экспрессионными векторами, известными в данной области техники, являются, например, pcDV1 (Pharmacia), pBluescript (Stratagene), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (InVitrogene) или pSPORTl (GIBCO BRL). Экспрессионные векторы, полученные из вирусов, такие как ретровирусы, вирус коровьей оспы, аденоассоциированный вирус, вирусы герпеса или вирус бычьей папилломы, могут быть использованы для доставки полинуклеотидов или вектора согласно настоящему изобретению в целевые популяции клеток. Способы, хорошо известные специалистам в данной области техники, могут быть использованы для конструирования рекомбинантных вирусных векторов; см., например, способы, описанные в Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. и Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994).

Также настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей полипептид, полинуклеотид и/или вектор согласно настоящему изобретению.

Термин «клетка-хозяин», предпочтительно, относится к клетке, совместимой с введением субъекту. Более предпочтительно, указанная клетка является иммунологически совместимой с субъектом. Наиболее предпочтительно, клетка является клеткой, полученной от указанного субъекта. Клетка-хозяин настоящего изобретения, предпочтительно, является клеткой, обладающей склонностью мигрировать в область расположения раковых клеток. Более предпочтительно, клетка-хозяин является иммунной клеткой, наиболее предпочтительно клеткой иммунной системы, способной избирательно распознавать специфичные антигены опухоли, например, Т-клеткой, специфичной к опухолевому антигену.

Более того, клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид или вектор согласно настоящему изобретению, предпочтительно является клеткой, способной вырабатывать полипептид HMGB1 согласно настоящему изобретению, например, клеткой бактерий, дрожжей, насекомых или млекопитающих.

Настоящее изобретение также относится к полипептиду, полинуклеотиду, вектору и/или клетке-хозяину согласно настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного средства.

Кроме того, настоящее изобретение относится к полипептиду, полинуклеотиду, вектору и/или клетке-хозяину согласно настоящему изобретению для применения при лечении рака и/или иммуномодуляции.

Термин «рак», как он использован в настоящей заявке, относится к заболеванию животного, предпочтительно человека, характеризуемому неуместным и/или неконтролируемым ростом группы клеток тела. Указанный неконтролируемый рост может сопровождаться проникновением в окружающую ткань и разрушением окружающей ткани и, возможно, распространением неправильно размножающихся клеток в другие участки тела. Таким образом, предпочтительно, полинуклеотид, вектор и/или клетка-хозяин согласно настоящему изобретению предназначены для применения при лечении рака.

Предпочтительно, вид рака был выбран из следующего перечня: острый лимфобластный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, адренокортикальный рак, лимфома, связанная со СПИДом, рак ануса, рак аппендикса, астроцитома, атипичная тератоидно-рабдоидная опухоль, базалиома, холангиокарцинома, рак мочевого пузыря, глиома ствола головного мозга, рак молочной железы, лимфома Беркитта, карциноидная опухоль, астроцитома мозжечка, рак шейки матки, хордома, хронический лимфолейкоз, хроническая миелоидная лейкемия, рак толстой кишки, колоректальный рак, краниофарингиома, рак эндометрия, эпендимобластомы, эпендимома, рак пищевода, экстракраниальная герминогенная опухоль, внегонадная герминогенная опухоль, рак внепеченочных желчных протоков, рак желчного пузыря, рак желудка, гастроинтестинальная стромальная опухоль, гестационная трофобластическая опухоль, волосатоклеточный лейкоз, рак головы и шеи, гепатоцеллюлярный рак, лимфома Ходжкина, гипофарингеальный рак, глиома гипоталамуса, глиома зриетльных путей, саркома Капоши, рак гортани, медуллобластома, медуллоэпителиома, меланома, карцинома Меркеля, мезотелиома, рак ротовой полости, множественная эндокринная неоплазия, множественная миелома, грибовидный микоз, рак полости носа и околоносовых пазух, рак носоглотки, нейробластома, нейроэндокринная опухоль (НЭ)/карцинома, неходжкинская лимфома, не мелкоклеточный рак легкого, рак ротовой полости, рак ротоглотки, остеосаркома, рак яичника, эпителиальная опухоль яичника, герминогенная опухоль яичника, опухоль яичников с низким злокачественным потенциалом, рак поджелудочной железы, папилломатоз, рак околоносовых пазух и полости носа, рак паращитовидной железы, рак полового члена, рак глотки, феохромоцитома, опухоль гипофиза, плевропульмональная бластома, первичная лимфома центральной нервной системы, рак предстательной железы, рак прямой кишки, рак почек, ретинобластома, рабдомиосаркома, рак слюнных желез, синдром Сезари, мелкоклеточный рак легкого, рак тонкой кишки, саркома мягких тканей, плоскоклеточный рак, плоскоклеточный рак шеи, рак яичка, рак горла, рак тимуса, тимома, рак щитовидной железы, рак уретры, саркома матки, рак влагалища, рак вульвы, макроглобулинемия Вальденстрема и опухоль Вильмса.

Наиболее предпочтительно, рак является лейкозом, лимфомой, раком, связанным с HPV, колоректальной карциномой, раком желудка, раком поджелудочной железы, раком легкого, раком головного мозга или раком молочной железы. Предпочтительно, колоректальная карцинома представляет собой карциному толстой кишки. Еще более предпочтительно, рак представляет собой лейкоз, наиболее предпочтительно хронический лимфолейкоз (ХЛЛ).

Термин «терапия рака» включает все средства и методы, известные специалисту в данной области техники, подходящие для лечения рака. Предпочтительно, термин представляет терапию, одобренную для применения на людях. Термин «клеточная иммунотерапия рака» предпочтительно представляет способ лечения рака, включающий введение клеток, предпочтительно аутологичных клеток, субъекту, например, предпочтительно В-клеток, Т-клеток и/или NK-клеток, или их клеток-предшественников, например, кроветворных стволовых клеток. Предпочтительно, указанные клетки являются NK-клетками или их предшественниками. Более предпочтительно, указанные клетки являются NK-клетками, распознающими опухоль, или их предшественниками. Еще более предпочтительно, указанные клетки являются аутологичными распознающими опухоль NK-клетками.

Предпочтительно, лечение рака и иммуномодуляция включают клеточную иммунотерапию рака. Также предпочтительно, лечение рака и иммуномодуляция включают стимуляцию секреции TNF-альфа NK-клетками, предпочтительно стимуляцию созревания NK-клеток. Кроме того, предпочтительно, лечение рака и/или иммуномодуляция включают предотвращение побочных эффектов, более предпочтительно включают предотвращение синдрома высвобождения цитокинов (CRS).

Термины «NK-клетки» и «натуральные киллеры» (NK-cells) известны специалистам в данной области техники и представляют цитотоксические лимфоциты, которые являются частью врожденной иммунной системы и которые, с помощью рецепторов, включая NKG2D, NKp44, NKp46, NKp30 и др., распознают определенное число лигандов, включая ULBP и MICA, обычно экспрессируемые на опухолевых клетках. Термин «созревание NK-клеток» также понятен специалисту в данной области техники. Предпочтительно, созревание NK-клеток заключается в увеличении фракции NK-клеток, способных связывать и/или уничтожать опухолевые клетки, в общей фракции NK-клеток.

«Побочные эффекты», которые относятся к лечению HMGB1 и клеточной иммунотерапии, а также к соответствующим индикаторам, симптомам и подходящим способам лечения известны специалисту в данной области техники (например, как описано в обзоре Теу, S-K (2014), Clinical and Translational Immunology 3, el7; doi: 10.1038/cti.2014.11). Побочные эффекты, предпочтительно включают нейротоксичность (приводящую, например, к потере слуха, судорогам или коме), витилиго, колит, повышение уровня печеночных ферментов, острые легочные инфильтраты, истощение В-клеток, гипогаммаглобулинемию и синдром высвобождения цитокинов (CRS). Термин «синдром высвобождения цитокинов (CRS)» и его симптомы и маркеры известны специалисту в данной области техники, например, по материалам Lee et al. (loc. cit.). Предпочтительно, маркер для распространенного или задерживающегося CRS являются С-реактивный белок, IL-6 и/или TNF-альфа, предпочтительно TNF-альфа.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения рака и/или индуцирования иммуномодуляции у субъекта, а именно:

а) осуществление контакта данного субъекта с полипептидом, соответствующим любому из вариантов реализации 1-18, полинуклеотид ом, соответствующим варианту реализации 19, вектором, соответствующим варианту реализации 20, и/или клеткой-хозяином, соответствующей варианту реализации 21, и, таким образом,

б) лечение рака и/или индуцирование иммуномодуляции у указанного субъекта.

Способы согласно настоящему изобретению, предпочтительно являются способами in vivo. Помимо этого, они могут включать этапы в дополнение к тем, которые непосредственно упомянуты выше. Например, следующий шаг для способа лечения рака и/или индукции иммунной модуляции реакции может быть представлен, к примеру, хирургическим удалением опухолевой ткани до или после введения указанных фармацевтически активных соединений. Предпочтительно, способы осуществляют таким образом, что этапы следуют в предлагаемом порядке. Кроме того, один или несколько из указанных этапов могут быть проведены на автоматизированном оборудовании.

Термин «субъект», как он использован в настоящей заявке, относится к животному, предпочтительно сельскохозяйственному или домашнему животному, более предпочтительно млекопитающему, наиболее предпочтительно человеку. Предпочтительно, указанный субъект является субъектом, страдающим от рака, более предпочтительно как указано выше.

Термин «лечение» относится к облегчению заболеваний и состояний, описанных в настоящей заявке, или симптомов, их сопровождающих в высокой степени. Указанное лечение, согласно настоящей заявке, также включает, предпочтительно, полное восстановление здоровья от соответствующих заболеваний или расстройств согласно настоящей заявке. Следует понимать, что лечение, как использовано в соответствии с настоящим изобретением, может быть неэффективным для всех субъектов, подлежащих лечению. Однако, термин должен, предпочтительно, требовать, что статистически значимая доля субъектов, страдающих от заболевания и расстройства, представленного здесь, могла быть успешно вылечена. Является ли эта доля статистически значимой, может быть легко определена специалистом в данной области техники с использованием широко известных инструментов статистической оценки, например, определением доверительных интервалов, определением р-значения, t-теста Стьюдента, тестом Манна-Уитни и т.д. Предпочтительные доверительные интервалы составляют, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%. Р-значения составляют, предпочтительно, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 или 0,0001. Предпочтительно, лечение должно быть эффективно для, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% субъектов из данной когорты или популяции.

Термин «иммуномодуляция», как он использован в настоящей заявке, относится к индуцированию изменения в степени реакции иммунной системы субъекта на антиген. Предпочтительно, иммунная модуляция является активацией. Предпочтительно, антиген является опухолевым антигеном, более предпочтительно опухолеспецифичным антигеном, то есть, предпочтительно экспрессируемым и/или презентируемым только опухолевыми клетками субъекта. Более предпочтительно, модулирование иммунного ответа субъекта заключается в индуцировании секреции TNF-альфа NK-клетками, наиболее предпочтительно в индуцировании созревания NK-клеток, предпочтительно как описано выше.

Настоящее изобретение также относится к способу обеспечения субъекта лечением HMGB1, предотвращая побочный эффект, предпочтительно предотвращая индуцирование синдрома высвобождения цитокинов (CRS), который включает

a) введение указанному субъекту агента, обеспечивающего HMGB1,

b) определение по меньшей мере одного параметра побочных эффектов, предпочтительно синдрома высвобождения цитокинов (CRS), в образце от указанного пациента,

с) продолжение введения агента, обеспечивающего HMGB1, с использованием альтернативного агента для обеспечения HMGB1,

при этом в случае, если указанный альтернативный агент для обеспечения HMGB1 обеспечивает полипептид HMGB1, отличающийся пониженной способностью стимулировать секрецию TNF-альфа и/или пониженной способностью стимулировать уничтожение клеток NK-клетками в случае, если указанный параметр, определенный на этапе b), указывает на повышенную вероятность побочного эффекта, предпочтительно синдрома высвобождения цитокинов (CRS); и/или

в случае, если указанный альтернативный агент для обеспечения HMGB1 обеспечивает полипептид HMGB1 с повышенной способностью стимулировать секрецию TNF-альфа и/или пониженной способностью стимулировать уничтожение клеток NK-клетками в случае, если указанный параметр, определенный на этапе Ь), указывает на пониженную вероятность побочного эффекта, предпочтительно синдрома высвобождения цитокинов (CRS),

d) обеспечение тем самым лечения HMGB1 у субъекта, предотвращая побочный эффект, предпочтительно предотвращая индуцирование синдрома высвобождения цитокинов (CRS).

Предпочтительно, полипептид HMGB1 с пониженной активностью к стимулированию секреции TNF-альфа и/или пониженной активностью к стимулированию уничтожения клеток NK-клетками является полипептидом HMGB1 по варианту реализации 5, предпочтительно полипептидом, содержащим последовательность аминокислот SEQ ID NO: 5 или 6. Также предпочтительно, полипептид HMGB1 с пониженной активностью к стимулированию секреции TNF-альфа и/или пониженной активностью к стимулированию уничтожения клеток NK-клетками является полипептидом HMGB1 по варианту реализации 4, предпочтительно полипептидом, содержащим последовательность аминокислот SEQ ID NO: 7 или 8. Предпочтительно, параметр CRS является концентрацией TNF-альфа.

Также настоящее изобретение относится к способу модуляции иммунного ответа субъекта, включающему:

а) введение агента, обеспечивающего полипептид HMGB1, указанному субъекту, при том, что указанный полипептид HMGB1 является полипептидом в соответствии с настоящим изобретением и, таким образом,

б) модулирование иммунного ответа указанного субъекта.

Предпочтительно, указанная модуляция иммунного ответа субъекта заключается в индуцировании секреции TNF-альфа NK-клетками, предпочтительно в индуцировании созревания NK-клеток, предпочтительно в соответствии с указанным выше.

Кроме того, настоящее изобретение относится к набору, содержащему полипептид, полинуклеотид, вектор и/или клетку-хозяина, в соответствии с настоящим изобретением, в корпусе (футляре).

Термин «набор», как он использован в настоящей заявке, относится к коллекции, включающей по меньшей мере одно вышеуказанных средств, предоставленных отдельно или в комбинации, предпочтительно в одном контейнере. Контейнер, также предпочтительно, дополнительно включает инструкции для осуществления способа согласно настоящему изобретению. Компоненты набора предоставлены, предпочтительно, в «готовом к использованию» виде, например, концентрации соответственно откорректированы и пр. Предпочтительно, также включены NK-клетки и/или средства для выделения этих клеток. Средства для выделения NK-клеток являются средствами для специфичного применения при выделении NK-клеток и включают, в частности, антитела, специфично связывающиеся с NK-клетками.

С учетом вышеуказанного, предпочтительными являются следующие варианты реализации изобретения.

1. Полипептид белка В1 группы высокой подвижности (HMGB1), при этом в указанном полипептиде HMGB1 по меньшей мере один, предпочтительно два, более предпочтительно три, наиболее предпочтительно, все четыре остатка тирозина в положениях, соответствующих положениям аминокислот 22, 57, 68 и 75 последовательности SEQ ID NO: 1, заменены на аминокислотный остаток, независимо выбранный из глутаминовой кислоты, глутамина, аспарагиновой кислоты, аспарагина, гомоглутаминовой кислоты (2-аминогександиоевой кислоты) и гомоглутамина (2,6-диамино-6-оксогексановой кислоты).

2. Полипептид HMGB1 согласно варианту реализации 1, отличающийся тем, что в указанном полипептиде HMGB1 по меньшей мере один, предпочтительно два, более предпочтительно три, наиболее предпочтительно, все четыре остатка тирозина в указанных положениях заменены на аминокислотный остаток, независимо выбранный из глутаминовой кислоты, глутамина, аспарагиновой кислоты и аспарагина.

3. Полипептид HMGB1 согласно варианту реализации 1 или 2, отличающийся тем, что в указанном полипептиде HMGB1 по меньшей мере один, предпочтительно два, более предпочтительно три или, наиболее предпочтительно, все четыре остатка тирозина в указанных положениях заменены на остаток глутаминовой кислоты заменены на остаток глутамина.

4. Полипептид HMGB1 согласно любому из вариантов реализации 1-3, отличающийся тем, что в указанном полипептиде HMGB1 по меньшей мере один, предпочтительно два, более предпочтительно три, наиболее предпочтительно, все четыре остатка тирозина в указанных положениях заменены на остатки глутаминовой кислоты.

5. Полипептид HMGB1 согласно любому из вариантов реализации 1-4, отличающийся тем, что в указанном полипептиде HMGB1 по меньшей мере один, предпочтительно два, более предпочтительно три, наиболее предпочтительно, все четыре остатка тирозина в указанных положениях заменены на остатки глутамина.

6. Полипептид HMGB1 согласно любому из вариантов реализации 1-5, отличающийся тем, что указанный полипептид HMGB1 содержит последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно на 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 98% идентичную SEQ ID NO: 1 и/или содержит последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно на 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 98% идентичную SEQ ID NO: 3.

7. Полипептид HMGB1 согласно любому из вариантов реализации 1-6, отличающийся тем, что указанный полипептид HMGB1 содержит последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно на 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 98% идентичную по меньшей мере одной из последовательностей SEQ ID NO: 5-8, предпочтительно SEQ ID NO: 6 или 8.

8. Полипептид HMGB1 согласно любому из вариантов реализации 1-7, отличающийся тем, что указанный полипептид HMGB1 является производным полипептида HMGB1 человека.

9. Полипептид HMGB1 согласно любому из вариантов реализации 1-8, отличающийся тем, что указанный полипептид HMGB1 не встречается в природе.

10. Полипептид HMGB1 согласно любому из вариантов реализации 1-9, отличающийся тем, что указанный полипептид HMGB1 вызывает повышенную гибель клеток в культуре клеток SW480 при концентрации 0,8 мкМ по сравнению с полипептидом, содержащим, предпочтительно состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3.

11. Полипептид HMGB1 согласно любому из вариантов реализации 1-10, отличающийся тем, что указанный полипептид HMGB1 вызывает повышенную гибель клеток в культуре клеток SW480 при концентрации 0,8 мкМ по сравнению с полипептидом, содержащим, предпочтительно состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6.

12. Полипептид HMGB1 согласно любому из вариантов реализации 1-11, отличающийся тем, что указанный полипептид HMGB1 повышает указанную гибель клеток по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 20%, более предпочтительно по меньшей мере на 30% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 40%.

13. Полипептид HMGB1 согласно любому из вариантов реализации 1-12, отличающийся тем, что указанный полипептид HMGB1 вызывает повышенное уничтожение культивируемых SW480 клеток NK-92 CI клетками в концентрации 0,8 мкМ по сравнению с полипептидом, содержащим, предпочтительно состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3.

14. Полипептид HMGB1 согласно любому из вариантов реализации 1-13, отличающийся тем, что указанный полипептид HMGB1 вызывает повышенное уничтожение культивируемых SW480 клеток NK-92 CI клетками в концентрации 0,8 мкМ по сравнению с полипептидом, содержащим, предпочтительно состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6.

15. Полипептид HMGB1 согласно любому из вариантов реализации 1-14, отличающийся тем, что указанный полипептид HMGB1 повышает указанное уничтожение клеток по меньшей мере на 5%, предпочтительно по меньшей мере на 10%, более предпочтительно по меньшей мере на 15% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 20%.

16. Полипептид HMGB1 согласно любому из вариантов реализации 1-15, отличающийся тем, что указанный полипептид HMGB1 вызывает повышенную секрецию фактора некроза опухоли альфа (TNF-альфа) культурой клеток NK-92 CI в концентрации 0,8 мкМ по сравнению с полипептидом, включающим или, предпочтительно, состоящим из последовательности аминокислот SEQ ID NO: 3.

17. Полипептид HMGB1 согласно любому из вариантов реализации 1-16, отличающийся тем, что указанный полипептид HMGB1 вызывает повышенную секрецию фактора некроза опухоли альфа (TNF-альфа) культурой клеток NK-92 CI в концентрации 0,8 мкМ по сравнению с полипептидом, включающим или, предпочтительно, состоящим из последовательности аминокислот SEQ ID NO: 6.

18. Полипептид HMGB1 согласно любому из вариантов реализации 1-17, отличающийся тем, что для указанного полипептида HMGB1 указанная секреция фактора некроза опухоли альфа (TNF-альфа) увеличена по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 20%, более предпочтительно по меньшей мере на 30%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 40% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 50%.

19. Полинуклеотид, кодирующий полипептид, соответствующий любому из вариантов реализации 2-18.

20. Вектор, содержащий полинуклеотид согласно варианту реализации 19.

21. Клетка-хозяин, содержащая полипептид согласно любому из вариантов реализации 1-18, полинуклеотид согласно варианту реализации 19 и/или вектор согласно варианту реализации 20.

22. Полипептид согласно любому из вариантов реализации 1-18, полинуклеотид согласно варианту реализации 19, вектор согласно варианту реализации 20 и/или клетка-хозяин согласно варианту реализации 21, применяемые в качестве лекарственного средства.

23. Полипептид согласно любому из вариантов реализации 1-18, полинуклеотид согласно варианту реализации 19, вектор согласно варианту реализации 20 и/или клетка-хозяин согласно варианту реализации 21, для применения для лечения рака и/или для иммуномодуляции.

24. Полипептид, полинуклеотид, вектор и/или клетка-хозяин согласно варианту реализации 23, отличающиеся тем, что указанное применение для лечения рака и для иммуномодуляции включает клеточную иммунотерапию рака.

25. Полипептид, полинуклеотид, вектор и/или клетка-хозяин согласно варианту реализации 23, отличающиеся тем, что указанное применение для лечения рака и/или для иммуномодуляции включает индукцию секреции TNF-альфа NK-клетками, предпочтительно, индуцирует созревание NK-клеток.

26. Полипептид, полинуклеотид, вектор и/или клетка-хозяин согласно варианту реализации 23, отличающиеся тем, что указанное применение для лечения рака и/или иммуномодуляции включает предотвращение побочного эффекта, предпочтительно включает предотвращение индукции синдрома высвобождения цитокинов (CRS).

27. Способ лечения рака и/или иммуномодуляции у субъекта, включающий:

а) осуществление контакта указанного субъекта с полипептидом согласно любому из вариантов реализации 1-18, полинуклеотидом согласно варианту реализации 19, вектором согласно варианту реализации 20 и/или клеткой-хозяином согласно варианту реализации 21 и, таким образом,

б) лечение рака и/или индуцирование иммуно модуляции у указанного субъекта.

28. Способ обеспечения субъекта лечением HMGB1 с предотвращением побочного эффекта, предпочтительно с предотвращением индуцирования синдрома высвобождения цитокинов (CRS), включающий:

a) введение указанному субъекту агента, обеспечивающего HMGB1,

b) определение по меньшей мере одного параметра побочного эффекта, предпочтительно синдрома высвобождения цитокинов (CRS), в образце от указанного пациента,

c) продолжение введения агента, обеспечивающего HMGB1, посредством альтернативного агента для обеспечения HMGB1,

в случае, если указанный альтернативный агент для обеспечения HMGB1 обеспечивает полипептид HMGB1, отличающийся пониженной способностью стимулировать секрецию TNF-альфа и/или пониженной способностью стимулировать уничтожение клеток NK-клетками в случае, если указанный параметр, определенный на этапе b), указывает на повышенную вероятность побочного эффекта, предпочтительно синдрома высвобождения цитокинов (CRS); и/или

в случае, если указанный альтернативный агент для обеспечения HMGB1 обеспечивает полипептид HMGB1 с повышенной способностью стимулировать секрецию TNF-альфа и/или пониженной способностью стимулировать уничтожение клеток NK-клетками в случае, если указанный параметр, определенный на этапе b), указывает на пониженную вероятность побочного эффекта, предпочтительно синдрома высвобождения цитокинов (CRS);

d) тем самым обеспечивая субъекта HMGB1 лечением, позволяющим предотвратить побочный эффект, предпочтительно синдром высвобождения цитокинов (CRS).

29. Способ согласно варианту реализации 28, отличающийся тем, что указанный полипептид HMGB1 с пониженной активностью к стимулированию секреции TNF-альфа и/или пониженной активностью в стимулировании уничтожения клеток NK-клетками представляет собой полипептид HMGB1 согласно варианту реализации 5.

30. Способ согласно варианту реализации 28 или 29, отличающийся тем, что указанный полипептид HMGB1 с повышенной активностью к стимулированию секреции TNF-альфа и/или повышенной активностью в стимулировании уничтожения клеток NK-клетками представляет собой полипептид HMGB1 по варианту реализации 4.

31. Способ согласно любому из вариантов реализации 28-30, где указанным параметром CRS является концентрация TNF-альфа.

32. Способ модуляции иммунного ответа субъекта, включающий:

а) введение агента, обеспечивающего полипептид HMGB1, указанному субъекту, при этом указанный полипептид HMGB1 является полипептидом согласно любому из вариантов реализации 1-18 и, таким образом,

б) модуляция иммунного ответа указанного субъекта.

33. Способ согласно варианту реализации 32, отличающийся тем, что указанная модуляция иммунного ответа субъекта заключается в индуцировании секреции TNF-альфа NK-клетками, предпочтительно, в индуцировании созревания NK-клеток.

34. Набор, содержащий в корпусе полипептид согласно любому из вариантов реализации 1-18, полинуклеотид согласно варианту реализации 19, вектор согласно варианту реализации 20 и/или клетку-хозяина согласно варианту реализации 21.

35. Набор согласно варианту реализации 34, отличающийся тем, что указанный набор дополнительно содержит клетки-натуральные киллеры (NK-клетки) и/или средство для выделения указанных клеток.

36. Набор согласно варианту реализации 34 или согласно варианту реализации 35, отличающийся тем, что указанные клетки-киллеры представляют собой распознающие опухоль NK-клетки.

37. Применение полипептида согласно любому из вариантов реализации 1-18, полинуклеотида согласно варианту реализации 19, вектора согласно варианту реализации 20 и/или клетки-хозяина согласно варианту реализации 21, для получения лекарственного средства, предпочтительно лекарственного средства для лечения рака и/или для иммуномодуляции.

Все источники, использованные в этом документе, включены в него посредством ссылки в отношении всего их доступного содержимого, а также доступного содержимого, отдельно упомянутого в данном тексте.

Описания фигур

Фигура 1. Сильная активация NK-клеток (NK-92 CI) соединением Glu-HMGB1 (n=3, р<0.05). WT=HMGB1 WT, E-Variant=Glu-HMGBl (SEQ ID NO: 8), Q-Variant=Gln-HMGBl (SEQ ID NO: 6).

Следующие примеры предназначены исключительно для иллюстрирования данного изобретения. При этом следующие примеры ни в коей мере не должны использоваться для ограничения объема данного изобретения.

Пример 1. Способы

Тест на высвобождение Cr-51

SW480 клетки колоректального рака были культивированы в планшетах с 96 ячейками (20000 клеток/ячейку) и помечены ⁵¹Cr (25 мкКи/ячейку) в течение 2 часов. После этого клетки были обработаны в течение 24 часов HMGB1 и NK-клетками. Питательная среда этих клеток была удалена и использована для измерения радиоактивности (cpm1). Клетки были промыты 4 раза средой и растворены в 100 мкл 0.5Н растворе гидроксида натрия NaOH. Полученные лизаты также были использованы для измерения радиоактивности (cpm2).

Измерение радиоактивности

Образцы были смешаны с 10 мл UltimaGold и измерены с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика.

Получение GluHMGB1, GlnHMGB1 и HMGB1 дикого типа

Плазмиды, кодирующие полипептид HMGB1, в котором все четыре остатка тирозина домена В-Вох заменены на остатки глутамата или глутамина, соответственно, были трансфицированы в клетки НЕК (культура клеток в суспензии, без содержания сыворотки, 1000 мл (приблизительно 2,5×10⁶ клеток/мл, в которую после была добавлена вальпроевая кислота). Для получения HMGB1 дикого типа, остатки тирозина в домене В-Вох были оставлены без изменений. Осадок клеток был гомогенизирован и очищен с помощью Смол IMAC и TALON (Clontech), элюирование произведено с помощью имидазола. Полученные таким образом элюаты (15 образцов) анализировали с помощью SDS-PAGE (окрашивание кумасси). После того как все положительные элюаты объединили, белок подвергли гель-фильтрации (Superdex) и, наконец, анализировали с помощью SDS-PAGE. В экспериментах использовали 800 нМ очищенного белка.

Активация NK-клеток

Активация клеточной линии NK-клеток NK-92 CI была измерена путем детекции высвобждения TNF-альфа в супернатант после 24 часов стимуляции 400000 этих клеток 800 нМ указанного белка HMGB1. Обнаружение TNF-альфа было осуществлено с помощью набора ELISA (Avia Systems Biology, Catalog No. OKAA00027_96W) в соответствии с инструкциями производителя.

Пример 2. Результаты и обсуждение

Различные формы HMGB1 проявляют выраженную цитотоксичность в отношении раковых клеток и различную активность в отношении усиления цитотоксичности NK-клеток в отношении раковых клеток и активации NK-клеток

Авторы изобретения использовали как очень короткий период времени для оценки цитотоксичности HMGB1, равный 24 ч, так и высокочувствительный анализ, основанный на высвобождении ⁵¹Cr (хром 51), являющийся золотым стандартом среди тестов для определения гибели клеток, и обнаружили неожиданные новые формы цитотоксичности различных модификаций HMGB1, модифицированных в домене В-Вох. Влияние Gln-HMGB1 на гибель раковых клеток оказалось на 43% выше, чем влияние HMGB1 дикого типа, тогда как Glu-HMGB1 продемонстрировал гибель клеток на 83% выше по сравнению с HMGB1 дикого типа (Таблица 1).

Далее, эффекторные клетки (Е, линия NK-клеток NK-92 CI) были инкубированы с клетками-мишенями (Т, клетки рака толстой кишки SW480), меченными с помощью ⁵¹Cr. Инкубация была проведена при различных соотношениях Е:Т, а именно 5:1, 10:1 и 20:1 (Таблица 1). В присутствии Gln-HMGB1 NK-клетки вызвали гибель раковых клеток на 55% эффективнее, чем те же NK-клетки без стимуляции. В присутствии же Glu-HMGB1 продемонстрирована повышенная на 94% гибель раковых клеток по сравнению с литической активностью NK-клеток без стимуляции (при соответствующем отношении Е:Т 5:1) (Таблица 1). Кроме того, NK-клетки в присутствии Gln-HMGB1 вызывали на 13% большую гибель раковых клеток по сравнению с литической активностью NK-клеток после их стимуляции HMGB1 дикого типа. В то же время, Glu-HMGB1 был на 25% эффективнее в отношении гибели клеток по сравнению с литической активностью NK-клеток после их стимуляции HMGB1 дикого типа (при соответствующем отношении Е:Т 5:1) (Таблица 1).

Суммируя вышеуказанное, три разные изоформы HMGB1 обладают различными профилями цитотоксичности. Glu-HMGB1 превосходит как HMGB1 дикого типа, так и Gln-HMGB1 по цитотоксичности в отношении раковых клеток и способности усиливать литическую активность NK-клеток в отношении раковых клеток. Gln-HMGB1 превосходит HMGB1 дикого типа по цитотоксичности в отношении раковых клеток и способности усиливать литическую активность NK-клеток в отношении раковых клеток. Таким образом, HMGB1 дикого типа демонстрирует самую слабую цитотоксичность по сравнению с Glu-HMGB1 и Gln-HMGB1. Gln-HMGB1 по-прежнему проявляет сильную цитотоксичность в отношении раковых клеток (хотя и меньше, чем Glu-HMGB1) с умеренным усилением литической активности NK-клеток в диапазоне между HMGB1 дикого типа (низкая литическая активность NK-клеток) и Glu-HMGB1 (высокая литическая активность NK-клеток).

Более того, три разные изоформы HMGB1 проявляют различную активность в отношении активации NK-клеток. Авторы изобретения измерили секрецию фактора некроза опухоли-альфа (TNF-альфа) клетками CI NK-92 после их стимуляции HMGB1. Оказалось, что Glu-HMGB1 наиболее сильно стимулировал секрецию TNF-альфа и, таким образом, сильнее других активировал NK-клетки с их дифференцировкой в связующие и киллеры.

Таким образом, применяя различные формы HMGB1, Glu-HMGB1 и Gln-HMGB1 в лечении рака, можно регулировать (i) прямую цитотоксичность в отношении раковых клеток, (ii) цитотоксичность находящихся вблизи опухоли NK-клеток в отношении раковых клеток, и (iii) общую активацию циркулирующих NK-клеток (переключение их на связующие и киллеры) и, таким образом, усиливать привлечение NK-клеток в опухоль. Представленные результаты свидетельствуют, что Glu-HMGB1 и Gln-HMGB1 сами по себе или в сочетании с клеточной иммунотерапией (например, NK-клетками) проявляют увеличенную цитотоксичность в отношении раковых клеток по сравнению с HMGB1 дикого типа.

Имея GluHMGB1 и GlnHMGB1, врачи получают инструмент, с помощью которого при терапии рака на основе HMGB1 они могут регулировать общую активацию иммунной системы (например, активацию NK-клеток, секретирующих различные цитокины, в том числе TNF-альфа). В зависимости от желаемой степени активации или желаемого уровня цитокинов в плазме крови (например, TNF-альфа), Glu-HMGB1 можно использовать для сильной активации иммунной системы и повышенного высвобождения цитокинов, тогда как Gln-HMGB1 можно использовать для умеренной активации и умеренного высвобождения цитокинов (в частности, из NK-клеток). Сочетая Glu-HMGB1 с Gln-HMGB1, можно повышать или понижать уровень высвобождения цитокинов, при этом имея постоянно повышенную прямую цитотоксичность по отношению к раковым клеткам и повышенную цитотоксичность находящихся вблизи опухоли NK-клеток, направленную на раковые клетки, по сравнению с HMGB1 дикого типа.

1. Полипептид белка В1 группы высокой подвижности (HMGB1), обладающий цитотоксичностью в отношении раковых клеток, при этом в указанном полипептиде HMGB1 по меньшей мере один, предпочтительно два, более предпочтительно три или, наиболее предпочтительно, все четыре остатка тирозина в положениях, соответствующих положениям аминокислот 22, 57, 68 и 75 последовательности SEQ ID NO: 1, заменены на аминокислотный остаток, независимо выбранный из глутаминовой кислоты, глутамина, аспарагиновой кислоты, аспарагина, гомоглутаминовой кислоты (2-аминогександиоевой кислоты) и гомоглутамина (2,6-диамино-6-оксогексановой кислоты).

2. Полипептид HMGB1 по п. 1, отличающийся тем, что в указанном полипептиде HMGB1 по меньшей мере один, предпочтительно два, более предпочтительно три, наиболее предпочтительно все четыре остатка тирозина в указанных положениях заменены на аминокислотный остаток, независимо выбранный из глутаминовой кислоты, глутамина, аспарагиновой кислоты и аспарагина.

3. Полипептид HMGB1 по п. 1 или 2, отличающийся тем, что в указанном полипептиде HMGB1 по меньшей мере один, предпочтительно два, более предпочтительно три, наиболее предпочтительно все четыре остатка тирозина в указанных положениях заменены на остатки глутаминовой кислоты или заменены на остатки глутамина.

4. Полипептид HMGB1 по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что в указанном полипептиде HMGB1 по меньшей мере один, предпочтительно два, более предпочтительно три, наиболее предпочтительно все четыре остатка тирозина в указанных положениях заменены на остатки глутаминовой кислоты.

5. Полипептид HMGB1 по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что в указанном полипептиде HMGB1 по меньшей мере один, предпочтительно два, более предпочтительно три, наиболее предпочтительно все четыре остатка тирозина в указанных положениях заменены на остатки глутамина.

6. Полипептид HMGB1 по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что указанный полипептид HMGB1 содержит последовательность, по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно на 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 98% идентичную SEQ ID NO: 1, и/или содержит последовательность, по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно на 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 98% идентичную SEQ ID NO: 3.

7. Полипептид HMGB1 по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что указанный полипептид HMGB1 содержит последовательность, по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно на 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 98% идентичную по меньшей мере одной из последовательностей SEQ ID NO: 5-8, предпочтительно SEQ ID NO: 6 или 8.

8. Полипептид HMGB1 по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что указанный полипептид HMGB1 является производным полипептида HMGB1 человека.

9. Полипептид HMGB1 по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что указанный полипептид HMGB1 не встречается в природе.

10. Полипептид HMGB1 по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что указанный полипептид HMGB1 вызывает повышенную гибель клеток в культуре клеток SW480 при концентрации 0,8 мкМ по сравнению с полипептидом, содержащим последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, предпочтительно состоящим из указанной последовательности.

11. Полипептид белка B1 группы высокой подвижности (HMGB1) для активации иммунной системы, при этом в указанном полипептиде HMGB1 по меньшей мере один, предпочтительно два, более предпочтительно три или, наиболее предпочтительно, все четыре остатка тирозина в положениях, соответствующих положениям аминокислот 22, 57, 68 и 75 последовательности SEQ ID NO: 1, заменены на аминокислотный остаток, независимо выбранный из глутаминовой кислоты, глутамина, аспарагиновой кислоты, аспарагина, гомоглутаминовой кислоты (2-аминогександиоевой кислоты) и гомоглутамина (2,6-диамино-6-оксогексановой кислоты).

12. Полипептид HMGB1 по п. 11, отличающийся тем, что в указанном полипептиде HMGB1 по меньшей мере один, предпочтительно два, более предпочтительно три, наиболее предпочтительно все четыре остатка тирозина в указанных положениях заменены на аминокислотный остаток, независимо выбранный из глутаминовой кислоты, глутамина, аспарагиновой кислоты и аспарагина.

13. Полипептид HMGB1 по п. 11 или 12, отличающийся тем, что в указанном полипептиде HMGB1 по меньшей мере один, предпочтительно два, более предпочтительно три, наиболее предпочтительно все четыре остатка тирозина в указанных положениях заменены на остатки глутаминовой кислоты или заменены на остатки глутамина.

14. Полипептид HMGB1 по любому из пп. 11-13, отличающийся тем, что в указанном полипептиде HMGB1 по меньшей мере один, предпочтительно два, более предпочтительно три, наиболее предпочтительно все четыре остатка тирозина в указанных положениях заменены на остатки глутаминовой кислоты.

15. Полипептид HMGB1 по любому из пп. 11-14, отличающийся тем, что в указанном полипептиде HMGB1 по меньшей мере один, предпочтительно два, более предпочтительно три, наиболее предпочтительно все четыре остатка тирозина в указанных положениях заменены на остатки глутамина.

16. Полипептид HMGB1 по любому из пп. 11-15, отличающийся тем, что указанный полипептид HMGB1 содержит последовательность, по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно на 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 98% идентичную SEQ ID NO: 1, и/или содержит последовательность, по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно на 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 98% идентичную SEQ ID NO: 3.

17. Полипептид HMGB1 по любому из пп. 11-16, отличающийся тем, что указанный полипептид HMGB1 содержит последовательность, по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно на 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 98% идентичную по меньшей мере одной из последовательностей SEQ ID NO: 5-8, предпочтительно SEQ ID NO: 6 или 8.

18. Полипептид HMGB1 по любому из пп. 11-17, отличающийся тем, что указанный полипептид HMGB1 является производным полипептида HMGB1 человека.

19. Полипептид HMGB1 по любому из пп. 11-18, отличающийся тем, что указанный полипептид HMGB1 не встречается в природе.

20. Полипептид HMGB1 по любому из пп. 11-19, отличающийся тем, что указанный полипептид HMGB1 вызывает повышенную гибель клеток в культуре клеток SW480 при концентрации 0,8 мкМ по сравнению с полипептидом, содержащим последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, предпочтительно состоящим из указанной последовательности.

21. Полинуклеотид, кодирующий полипептид по любому из пп. 2-10, 12-20.

22. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п. 21.

23. Клетка-хозяин, способная продуцировать полипептид HMGB1 согласно настоящему изобретению, содержащая полипептид по любому из пп. 1-20, полинуклеотид по п. 21 и/или вектор по п. 22.

24. Способ лечения рака у субъекта, включающий:

а) приведение в контакт указанного субъекта с полипептидом по любому из пп. 1-20, полинуклеотидом по п. 21, вектором по п. 22 и/или клеткой-хозяином по п. 23, и таким

образом б) обеспечение лечения рака у указанного субъекта.

25. Способ по п. 24, отличающийся тем, что указанное лечение рака включает клеточную иммунотерапию рака.

26. Способ по п. 24 или 25, отличающийся тем, что указанное лечение рака включает индукцию секреции TNF-альфа NK-клетками, предпочтительно, индуцирует созревание NK-клеток.

27. Способ по любому из пп. 24-26, отличающийся тем, что указанное лечение рака включает предотвращение возникновения побочного эффекта, предпочтительно, включает предотвращение возникновения синдрома высвобождения цитокинов (CRS).

28. Способ индукции иммуномодуляции у субъекта, включающий:

а) приведение в контакт указанного субъекта с полипептидом по любому из пп. 1-20, полинуклеотидом по п. 21, вектором по п. 22 и/или клеткой-хозяином по п. 23, и таким образом б) обеспечение иммуномодуляции у указанного субъекта.

29. Способ по п. 28, отличающийся тем, что указанная иммуномодуляция включает клеточную иммунотерапию рака.

30. Способ по п. 28 или 29, отличающийся тем, что указанная иммуномодуляция включает индукцию секреции TNF-альфа NK-клетками, предпочтительно, индуцирует созревание NK-клеток.

31. Способ по любому из пп. 28-30, отличающийся тем, что указанная иммуномодуляция включает предотвращение возникновения побочного эффекта, предпочтительно, включает предотвращение возникновения синдрома высвобождения цитокинов (CRS).

32. Набор для применения в способе лечения рака у нуждающегося в этом субъекта, содержащий в корпусе полипептид по любому из пп. 1-20, полинуклеотид по п. 21, вектор по п. 22 и/или клетку-хозяина по п. 23 и инструкцию по осуществлению указанного способа.

33. Набор по п. 32, отличающийся тем, что указанный набор дополнительно содержит клетки-натуральные киллеры (NK-клетки) и/или средство для выделения указанных клеток.

34. Набор по п. 32 или 33, отличающийся тем, что указанные клетки-киллеры представляют собой распознающие опухоль NK-клетки.

35. Набор для применения в способе иммуномодуляции у нуждающегося в этом субъекта, содержащий в корпусе полипептид по любому из пп. 1-20, полинуклеотид по п. 21, вектор по п. 22 и/или клетку-хозяина по п. 23 и инструкцию по осуществлению указанного способа.

36. Набор по п. 35, отличающийся тем, что указанный набор дополнительно содержит клетки-натуральные киллеры (NK-клетки) и/или средство для выделения указанных клеток.

37. Набор по п. 35 или 36, отличающийся тем, что указанные клетки-киллеры представляют собой распознающие опухоль NK-клетки.