Композиции и способы усиления экспрессии гена pklr

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к лентивирусному вектору доставки гена, содержащему кассету экспрессии, содержащую промоторную последовательность, последовательность, кодирующую полипептид пируваткиназы печени и эритроцитов (PKLR) человека и сигнал экспорта рибонуклеиновой кислоты (РНК), а также к содержащей его композиции. Также раскрыт способ экспрессии трансгена в эритроидных клетках in vitro, предусматривающий приведение одной или более эритроидных клеток с вышеуказанным вектором. Изобретение эффективно для лечения или предупреждения недостаточности пируваткиназы. 5 н. и 12 з.п. ф-лы, 22 ил., 4 табл., 11 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США № 62/325397, поданной 20 апреля 2016 года, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[001] Настоящее изобретение относится к генной терапии недостаточности пируваткиназы.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[002] Недостаточность пируваткиназы (PKD) является моногенным метаболическим заболеванием, вызываемым мутациями в гене PKLR, которое приводит к гемолитической анемии различной симптоматики и может приводить к смертельному исходу во время неонатального периода. Рецессивный характер наследования признака, вызывающего PKD, и радикальное лечение заболевания с помощью аллогенной трансплантации костного мозга обеспечивают наиболее подходящую ситуацию для разработки подходов генной терапии.

[003] Среди многих других врожденных ферментативных дефектов, поражающих эритроциты, недостаточность пируваткиназы (PKD) является наиболее распространенным дефектом, вызывающим хроническую несфероцитарную гемолитическую анемию (CNSHA) (Zanella et al. 2007). Проявление и тяжесть PKD сильно отличаются и варьируются от умеренной до тяжелой анемия новорожденных, которая в наиболее тяжелых случаях приводит к смертельному исходу в детском возрасте (Pissard et al 2006). Также сообщалось о случаях замедления роста, водянки плода и смерти во время неонатального периода, встречающихся с низкой частотой (Gilsanz et al. 1993). Встречаемость заболевания PKD среди общего европеоидного населения была оценена как 1:20000 (Beutler et al 2000), и к настоящему времени было идентифицировано более 195 различных мутаций в гене PKLR (http://www.lovd.nl/pklr). Для лечения больных тяжелой формой PKD с успехом применяли аллогенную трансплантацию костного мозга (BMT) (Tanphaichitr et al 2000), однако низкая доступность гистосовместимых доноров и серьезные осложнения, связанные с BMT, у этих больных (т. е. болезнь «трансплантат против хозяина», оппортунистические инфекции и т. д.) стали причиной того, что периодические переливания крови и спленэктомия являются основными вариантами терапии при большинстве тяжелых форм PKD (Zanella et al 2005), что резко увеличило число осложнений и смертность пациентов (Hilgard et al 2005). Ограниченная эффективность и побочные эффекты вариантов терапии для пациентов с тяжелой PKD и ее рецессивный характер наследования приводят к тому, что PKD представляет собой заболевание, для которого подходит лечение с помощью генной терапии.

[004] PKD вызывают дефекты в ферменте пируваткиназа (PK) (Zanella 2005), который катализирует последнюю генерирующую АТФ реакцию пути гликолиза во всех клетках. В зрелых эритроцитах PK становится очень важной, поскольку в RBC экспрессируется только специфическая изоформа R-типа (RPK) (Kanno et al 1992) вследствие регуляции альтернативного промотора локуса PKLR, специфического в отношении эритроидных клеток (Noguchi et al 1987). Таким образом, любая потеря активности RPK ухудшает метаболизм и продолжительность жизни RBC (Zanella 2005), что приводит к CNSHA.

[005] Перспективным подходом к лечению и профилактике генетических и других заболеваний и нарушений является доставка терапевтических средств с помощью вектора для генной терапии. В настоящее время наибольшую эффективность в переносе генов и при коррекции генетических заболеваний, при которых необходима устойчивая экспрессия генов, показывают вирусные векторы, при этом оптимальными являются векторы на основе герпесвирусов, ретровирусов, лентивирусов, аденовирусов или AAV вследствие интегрирующей природы жизненного цикла данных вирусов.

[006] Генная терапия моногенных заболеваний, в частности, тех, которые поражают систему кроветворения, представила убедительные доказательства того, что генетическая коррекция аутологических гемопоэтических стволовых клеток (HSC) представляет собой альтернативу варианту лечения аллогенными HSCT, который избегает его основных осложнений (Cartier et al 2009; Cavazzana-Calvo et al 2010; Cartier et al 2012; Aiuti et al 2013; Biffi et al 2013). Генетическая коррекция заболеваний, поражающих эритроцит, таких как β-талассемия и серповидноклеточная болезнь, была рассмотрена на животных моделях (Pestina et al 20091, Breda et al 2012), а также на людях (Cavazzana-Calvo et al 2010). Однако подходы для генной терапии наследственных метаболических недостаточностей эритроидных клеток, таких как PKD, все еще ограничены. Пригодность генной терапии HSC для PKD была продемонстрирована как на мышиной (Tani et al 1994; Meza et al 2009), так и на собачьей моделях недостаточности RPK (Trobridge et al 2012), которые показали, что донорский химеризм и уровни трансдукции являются ключевыми параметрами для достижения эффективной коррекции гемолитического фенотипа (Richard et al., 2004), принимая во внимание отсутствие селективного преимущества у HSC, подвергнутых коррекции с помощью донорского гена. В проведенной ранее работе на мышиной модели PKD показано, что экспрессия RPK человека, осуществляемая с помощью ретровируса, была способна полностью скорректировать фенотип PKD в случае трансплантации более 25% генетически скорректированных клеток (Meza et al 2009). Об аналогичном терапевтическом пороге для подвергнутых коррекции клеток недавно сообщали для одной собаки породы бассенджи с PKD, которой инфузировали HSC, in vivo размноженные и подвергнутые коррекции с помощью спумавирусного вектора (Trobridge et al 2012).

[007] Остается целый ряд проблем, касающихся разработки полинуклеотидных кассет и векторов экспрессии для применения в генной терапии. Одной из значимых проблем является обеспечение достаточной экспрессии трансгена в клетках-мишенях. В данной области техники существует давняя неудовлетворенная потребность в достаточно надежной экспрессии трансгенов после переноса гена. В некоторых случаях более эффективная экспрессия требуется для эффективности некоторых векторов, например, плазмидных ДНК-векторов. В других случаях более эффективные кассеты экспрессии генов необходимы для обеспечения более низкой терапевтической дозы, которая имеет более благоприятный профиль безопасности или менее инвазивный путь введения.

[008] Высоких уровней экспрессии трансгена можно достигнуть при применении гамма-ретровирусных (гамма-RV) векторов, вследствие того факта, что экспрессия терапевтического трансгена регулируется их последовательностями LTR. Однако первые клинические испытания на основе данного типа вектора вызвали проблемы безопасности, поскольку у нескольких пациентов неожиданно развился лейкоз (Hacein-Bey-Abina et al 2008). Сильная промоторная активность последовательностей LTR могла негативно воздействовать на регуляцию соседних генов либо путем активации протоонкогенных промоторов, либо путем ингибирования генов-супрессоров опухолей, что приводит к инсерционному мутагенезу (Ott et al 2006, Howe et al 2008; Stein et al 2010; Braun et al 2014). Эти данные подчеркивают необходимость применения для генной терапии PKD более безопасных и эффективных векторов, чем гамма-ретровирусные векторы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[009] В одном варианте осуществления настоящего изобретения представлена кассета экспрессии, содержащая полинуклеотидную последовательность, содержащую: a) промоторную последовательность; b) последовательность, кодирующую продукт гена; и c) сигнал экспорта рибонуклеиновой кислоты (РНК), где промоторная последовательность функционально связана с последовательностью, кодирующей полипептид пируваткиназы, и при этом необязательно a) - c) присутствуют в кассете экспрессии в 5’-3’-направлении. В определенных вариантах осуществления промотор представляет собой промотор гена фосфоглицераткиназы (PGK). В некоторых вариантах осуществления продукт гена представляет собой терапевтический продукт гена. В некоторых вариантах осуществления терапевтический продукт гена представляет собой полипептид пируваткиназы (PK), необязательно полипептид пируваткиназы печени и эритроцитов (PKLR). В определенных вариантах осуществления последовательность, кодирующая продукт гена, является кодон-оптимизированной. В конкретных вариантах осуществления сигнал экспорта РНК представляет собой мутантный посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков (Wpre). В определенных вариантах осуществления мутантный Wpre представляет собой химерный Wpre, содержащий последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 80% идентичностью с SEQ ID NО: 1. В некоторых вариантах осуществления кассета экспрессии дополнительно содержит одну или более энхансерных последовательностей. В некоторых вариантах осуществления кассета экспрессии дополнительно содержит последовательность полипуринового тракта (PPT) или сигнала полиаденилирования (polyA). В некоторых вариантах осуществления кассета экспрессии дополнительно содержит одну или более из следующих последовательностей: i) последовательность сигнала упаковки; ii) усеченную последовательность Gag; iii) Rev-чувствительный элемент (RRE); iv) центральный полипуриновый тракт (cPPT); v) центральную терминальную последовательность (CTS) и vi) элемент последовательности (USE), расположенный против хода транскрипции, необязательно из вируса обезьян 40 (SV40-USE). В некоторых вариантах осуществления кассета экспрессии дополнительно содержит последовательности длинного концевого повтора 5’- и 3’-конца.

[0010] В связанном варианте осуществления настоящего изобретения представлен рекомбинантный вектор доставки гена, содержащей кассету экспрессии, раскрываемую в данном документе. В определенных вариантах осуществления рекомбинантный вектор доставки гена представляет собой вирус или вирусный вектор. В определенных вариантах осуществления вирус или вирусный вектор представляет собой лентивирус (LV).

[0011] В другом родственном варианте осуществления настоящее изобретение относится к клетке, содержащей кассету экспрессии или вектор доставки гена, раскрываемые в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку крови. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой эритроидную клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку костного мозга, например, клетку костного мозга, подвергнутую деплеции по линии дифференцировки. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой гемопоэтическую стволовую клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой CD34+ гемопоэтическую стволовую клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой коммитированную гемопоэтическую эритроидную клетку-предшественник.

[0012] В еще одном связанном варианте осуществления настоящего изобретения представлена фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый наполнитель и рекомбинантный вектор доставки гена или клетку, раскрываемые в данном документе.

[0013] В другом варианте осуществления настоящего изобретения представлен способ лечения или предупреждения заболевания или нарушения у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающий обеспечение субъекта кассетой экспрессии, вектором доставки гена или фармацевтической композицией, раскрываемыми в данном документе. В одном варианте осуществления заболевание или нарушение представляет собой недостаточность пируваткиназы (PKD), а продукт гена представляет собой полипептид пируваткиназы (PK), необязательно полипептид пируваткиназы печени и эритроцитов (PKLR). В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит рекомбинантный вектор доставки гена. В других вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит клетку. В одном варианте осуществления клетка является аутологической по отношению к субъекту. В другом варианте осуществления клеткой является аллогенной по отношению к субъекту.

[0014] В связанном варианте осуществления настоящего изобретения представлен способ экспрессии трансгена в эритроидных клетках, предусматривающий приведение одной или более эритроидных клеток в контакт с эффективным количеством рекомбинантного вирусного вектора, где вектор содержит промотор гена фосфоглицераткиназы человека, кодон-оптимизированный вариант трансгена на основе кДНК пируваткиназы печени и эритроцитов (PKLR) человека и мутантный посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков, где после указанного приведения в контакт PKLR экспрессируется на выявляемых уровнях в одной или более эритроидных клетках.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0015] Новые признаки настоящего изобретения подробно изложены в прилагаемой формуле изобретения. Лучшему пониманию признаков и преимуществ настоящего изобретения будет способствовать ссылка на следующее подробное описание, изложенное в виде иллюстративных вариантов осуществления, в которых использованы принципы настоящего изобретения, а также сопутствующие графические материалы.

[0016] На фиг. 1 изображена схема, отражающая положение различных описанных элементов, присутствующих в остове лентивирусного вектора.

[0017] На фиг. 2a представлено схематическое изображение самоинактивирующихся лентивирусных векторов, применяемых на протяжении экспериментов по генной терапии, которые несут промотор гена PGK человека, регулирующий экспрессию трансгена EGFP в контрольном векторе (верхняя диаграмма) или экспрессию кодон-оптимизированной последовательности кДНК гена PKLR (coRPK) в терапевтическом векторе (нижняя диаграмма).

[0018] На фиг. 2b представлена схема протокола генной терапии, выполняемого для исследования функциональности разработанного лентивирусного вектора с PGK-coRPK.

[0019] На фиг. 3a-d изображены данные, показывающие коррекцию фенотипа PKD в периферической крови у первичных реципиентов после генной коррекции. На фиг. 3a представлен уровень RBC, а на фиг. 3b представлен уровень ретикулоцитов у здоровых (черный столбик, n=5) и мышей с PKD-анемией (серый столбик, n=6), а также мышей с PKD-анемией, которым трансплантировали клетки, трансдуцированные с помощью EGFP (белый столбик, n=9) или coRPK (заштрихованный столбик, n=17). Данные представлены как среднее ± SEM, и их анализировали с помощью непараметрического критерия Краскела-Уоллиса. На фиг. 3c представлена методика проточной цитометрии, применяемая для выявления меченных биотином RBC на протяжении определенного времени, а на фиг. 3d кинетика выживания RBC у здоровых мышей (черная линия, n=2), мышей с анемией (серая линия, n=2) и мышей, подвергнутых генетической коррекции (пунктирная линия, n=4). Данные представлены как среднее ± SEM, и их анализировали с помощью теста двухфакторного ANOVA. Здоровые, контрольные мыши, не подвергнутые трансплантации; PKD, мыши с PKD, не подвергнутые трансплантации; coRPK, мыши с PKD, экспрессирующие терапевтической трансген.

[0020] На фиг. 4a-c показано восстановление гемопоэза множественных линий дифференцировки у мышей, подвергнутых вторичной трансплантации. На фиг. 4a представлена диаграмма методики проточной цитометрии, применяемой для идентификации различных гемопоэтических линий дифференцировки путем мечения антителом к CD3, конъюгированным с PE, антителом к B220, конъюгированным с PE, антителом к B220, конъюгированным с PECy5, антителом к Gr1, конъюгированным с биотином, и антителом к Mac1, конъюгированным с биотином, с добавлением SAV-PE-Cy5. На фиг. 4b изображены типичные точечные диаграммы, а на фиг. 4c изображены процентные доли каждой линии дифференцировки в PB через 140 суток после трансплантации. Столбики представляют среднюю процентную долю ± SEM у здоровых мышей (n=2, черный столбик), контрольных мышей с PKD (n=2, серый столбик), а также мышей, подвергнутых вторичной трансплантации, экспрессирующих терапевтический трансген coRPK (n=4, заштрихованный столбик).

[0021] На фиг. 5a-d изображена коррекция фенотипа PKD у мышей, подвергнутых вторичной трансплантации. На фиг. 5a показано окрашивание бриллиантовым крезиловым синим мазков крови от мышей, не подвергнутых трансплантации, и вторичных реципиентов для идентификации популяции ретикулоцитов (синий цвет). На фиг. 5b показан анализ проточной цитометрии уровней ретикулоцитов в периферической крови. На фиг. 5c представлена процентная доля RBC, а на фиг. 5d представлена процентная доля ретикулоцитов у мышей, подвергнутых вторичной трансплантации, экспрессирующих трансген coRPK (заштрихованный столбик, n=4), у здоровых мышей (черный столбик, n=3) и у контрольных мышей с анемией (серый столбик, n=3). Данные представлены в виде среднего ± SEM, и их анализировали с помощью непараметрического двухстороннего критерия Манна-Уитни.

[0022] На фиг. 6a-c показана количественная оценка интеграций провируса. На фиг. 6a показано число копий вектора на клетку в КОЕ из BM от отдельных мышей, подвергнутых трансплантации, через 120-170 суток после трансплантации. Также показана процентная доля трансдукции и химеризма. На фиг. 6b показано число копий провируса в клетках из различных гемопоэтических компартментов. Колонки представляют среднее ± SEM у разных групп мышей, подвергнутых трансплантации. На фиг. 6c показана кинетика интеграций провируса в клетках ВМ у отдельных подвергнутых трансплантации мышей, экспрессирующих EGFP (серые линии), и мышей, несущих трансген coRPK (черные линии).

[0023] На фиг. 7a-c изображена нормализация паттерна эритроидной дифференцировки у мышей, подвергнутых генетической коррекции. На фиг. 7a показаны процентные доли разных эритроидных субпопуляций в костном мозге и селезенке через 140 суток после трансплантации. На фиг. 7b изображены типичные точечные диаграммы, полученные с применением методики проточной цитометрии. Интенсивность экспрессии маркеров CD71 и Ter119 позволяет идентифицировать четыре эритроидные субпопуляции, популяцию I:

ранние проэритробласты (Ter119^med CD71^high), популяцию II: базофильные эритробласты (Ter119^high CD71^high), популяцию III: поздние базофильные и полихроматофильные эритробласты (Ter119^high CD71^med) и популяцию IV: ортохроматофильные эритробласты, ретикулоциты и зрелые эритроидные клетки (Ter119^high CD71^low). На фиг. 7c показаны уровни Epo в плазме крови, измеренные с помощью ELISA у мышей, не подвергнутых трансплантации и подвергнутых трансплантации. Точки представляют значения отдельных мышей. Линии представляют среднее ± SEM, и их анализировали с помощью непараметрического критерия Краскела-Уоллиса. Здоровые, контрольные мыши, не подвергнутые трансплантации; PKD, мыши с PKD, не подвергнутые трансплантации; EGFP, мыши с PKD, экспрессирующие трансген EGFP; coRPK, мыши с PKD, экспрессирующие терапевтический трансген.

[0024] На фиг. 8a-b показаны анализы гемопоэтических предшественников у контрольных мышей и мышей, подвергнутых трансплантации с помощью трансдуцированных клеток. Данные демонстрируют суммарное количество КОЕ из селезенки (фиг. 8a) и костного мозга (фиг. 8b) через 140 суток после трансплантации. Точки представляют число колоний на анализируемую мышь, а линии представляют среднее ± SEM в каждой группе. Статистический анализ данных проводили с помощью непараметрического критерия Краскела-Уоллиса.

[0025] На фиг. 9a-c демонстрируют реверсию спленомегалии и патологии органа у мышей, подвергнутых генетической коррекции, через 140 суток после трансплантации. На фиг. 9a представлены изображения типичных селезенок, а на фиг. 9b показано отношение массы селезенки к общей массе тела у мышей с PKD, подвергнутых первичной и вторичной трансплантации. Точки представляют значения отдельных мышей. Линии представляют среднее ± SEM у группы. Данные анализировали с помощью непараметрического критерия Краскела-Уоллиса. На фиг. 9c показано гистологическое исследование селезенки и печени от мышей с PKD, подвергнутых первичной трансплантации. В первой и второй колонках показаны типичные гистологические срезы селезенки и печени, окрашенные гематоксилином-эозином и сфотографированные с применением 4x и 10x объектива соответственно на световом микроскопе. Стрелки указывают на кластеры эритроидных клеток, служащие признаком экстрамедуллярного эритропоэза. В третьей колонке показано окрашивание берлинской лазурью (Fe) срезов печени для выявления отложений железа, обозначенных стрелками-указателями. Фотографии получали с применением 20x объектива. Обозначения групп как на фиг. 7. 2^ые coRPK, вторичные реципиенты.

[0026] На фиг. 10a-g показано метаболическое профилирование в образцах RBC от мышей, подвергнутых трансплантации генетически модифицированных клеток. Анализ значимых изменений метаболического профиля у здоровых мышей и мышей, подвергнутых трансплантации, по сравнению с животными с PKD в двух независимых экспериментах. На фиг. 10a показана полная тепловая карта RBC, полученная с помощью нецелевого профилирования, при этом более высокие и низкие уровни метаболитов показаны красным и синим соответственно. Перечисленные метаболиты характеризуются по меньшей мере одним сравнением, которое является значимым при применении следующих критериев: абсолютная кратность изменения >1,5; минимальный сигнал >2000; скорректированное р-значение <0,01. Черными рамками выделен кластер изменений метаболитов с профилем, отличным у разных групп. На фиг. 10b, 10c и 10d изображены соответственно уровни ATФ, AДФ и пирувата в RBC, измеренные с помощью нецелевого профилирования в сравнении с мышами с PKD через 140 суток после трансплантации. Анализ 1: здоровые мыши (черные столбики), n=1, PKD (серые столбики), n=1, hPGK-EGFP (белые столбики), n=2, hPGK-coRPK (заштрихованные столбики), n=3. Анализ 2: здоровые мыши, n=2, PKD, n=2, hPGK-EGFP, n=6, hPGK-coRPK, n=10. На фиг. 10e, 10f и 10g изображены метаболическое профилирование, нацеленное на RBC, для выбранного числа метаболитов, вовлеченных в путь гликолиза (PEP, 3-фосфоглицериновой кислоты и D-молочной кислоты соответственно) через 280 суток после трансплантации. Точки представляют значения отдельных мышей. Линии представляют среднее ± SEM, и их анализировали с помощью непараметрического критерия Краскела-Уоллиса. Анализ 2: здоровые мыши, n=7, PKD, n=5, hPGK-EGFP, n=3, hPGK-coRPK, n=5.

[0027] На фиг. 11a-c изображена активность пируваткиназы, на фиг. 11b - активность гексокиназы, а на фиг. 11c - отношение ферментативной активности пируваткиназы и гексокиназы в RBC от контрольных мышей и мышей, подвергнутых трансплантации трансдуцированных клеток. RBC выделяли из образцов крови путем пропускания через колонку с целлюлозой, чтобы избавиться от посторонней активности лейкоцитарной PK, и подвергали оценке ферментативной активности. Черные столбики - здоровые мыши (n=2); белые столбики - мыши, подвергнутые трансплантации клеток, трансдуцированных экспрессирующим EGFP вектором (n=3); заштрихованные столбики - мыши, подвергнутые трансплантации клеток, трансдуцированных экспрессирующим coRPK вектором (n=3). Столбики с заливкой клетками представляют значения здорового волонтера (n=1). Данные представлены в виде среднего ± SEM каждой группы.

[0028] На фиг. 12a-d показано нецелевое метаболическое профилирование в образцах WBC от мышей, подвергнутых трансплантации генетически модифицированных клеток. На фиг. 12a представлен анализ главных компонент нецелевого профиля метаболитов в RBC (красные точки; слева и в центре) и WBC (синие точки; кластер справа) у контрольных мышей и мышей, подвергнутых трансплантации. На фиг. 12b, 12c и 12d изображены уровни ATФ, AДФ и пирувата соответственно в WBC при сравнении с мышами с PKD. Анализ 1: здоровые мыши (черные столбики), n=1, PKD (серые столбики), n=1, hPGK-EGFP (белые столбики), n=2, hPGK-coRPK (заштрихованные столбики), n=3. Анализ 2: здоровые мыши, n=2, PKD, n=2, hPGK-EGFP, n=6, hPGK-coRPK, n=10. Данные представлены в виде среднего ± SEM, и их анализировали с помощью непараметрического критерия Краскела-Уоллиса.

[0029] На фиг. 13 показано изображение гелей с продуктами LAM-PCR, образованными с помощью фермента Tsp509I, для образцов, собранных от всех мышей в разные моменты времени и в разных тканях. Сайты интеграции вектора идентифицировали путем LAM-PCR-амплификации мест соединений 3’-LTR вектора-геном. Использовали автоматизированную систему MultiNA с получением паттерна, характеризующегося несколькими полосками. Полоска внутреннего контроля (IC), полученного на основе векторного остова Tsp509I, показана стрелкой.

[0030] На фиг. 14 показано изображение гелей с продуктами LAM-PCR, образованными с помощью фермента HpyCH4IV5, для образцов, собранных от всех мышей в разные моменты времени и в разных тканях. Сайты интеграции вектора идентифицировали путем LAM-PCR-амплификации мест соединений 3’-LTR вектора-геном. Использовали автоматизированную систему MultiNA с получением паттерна, характеризующегося несколькими полосками. Полоска внутреннего контроля (IC), полученного на основе векторного остова HpyCH4IV5, показана стрелкой.

[0031] На фиг. 15 изображена общая схема анализа картирования сайта интеграции, выполненного на мышах, подвергнутых трансплантации генетически модифицированных гемопоэтических клеток-предшественников. Анализировали образцы костного мозга и белых кровяных клеток от мышей, подвергнутых трансплантации, относящиеся к двум независимым экспериментам (таблица 3) и собранные в разные моменты времени после трансплантации, как описано во вспомогательных способах после показанного технологического процесса.

[0032] На фиг. 16a-b показано распределение интеграций LV вдоль генома мышей, подвергнутых трансплантации. На фиг. 16a изображена плотность распределения сайтов интеграции (IS) вблизи сайта начала транскрипции (TSS) ближайшего гена RefSeq с охватом 500 т. о. в направлении против хода транскрипции и в направлении по ходу транскрипции от TSS. Числа вверху представляют собой число IS, выявленных для всех образцов и моментов времени. На фиг. 16b изображено распределение сайтов интеграции LV по хромосомам у мышей, подвергнутых трансплантации, экспрессирующих трансген EGFP (черные столбики) или терапевтический трансген coRPK (серые столбики), не показывающее отклонения в сторону какой-либо конкретной хромосомы.

[0033] На фиг. 17a-c продемонстрирован анализ обилия клонов у клеток, трансдуцированных coRPK-LV. В виде точечной диаграммы представлено обилие клонов объединенных интеграций для каждой мыши из анализов 1 (фиг. 17a) и 2 (фиг. 17b и 17c). Относительная процентная доля (ось y) каждого сайта интеграции подсчитана относительно общего числа ридов последовательностей, полученных в каждом наборе данных. IS - сайт интеграции; BM - костный мозг; PB - периферическая кровь; coRPK1-14 - мыши, подвергнутые трансплантации гемопоэтических клеток, трансдуцированных терапевтическим вектором.

[0034] На фиг. 18 представлены отслеженные интеграции, которые были общими для мышей, представляющих собой первичных и вторичных реципиентов, несущих терапевтический LV-вектор с PGK-coRPK. Объединены интеграции, выявленные у каждой мыши в любом органе и в любой момент времени. Вторичные реципиенты получали объединенный BM от мышей, подвергнутых трансплантации coRPK11-14. Остальные из выявленных IS выявляли либо у первичных, либо у вторичных реципиентов. Числа в ячейках показывают представленность соответствующей интеграции в виде процентной доли у упомянутой мыши. В дополнение к фильтру >5%, применяемому в анализе интеграции, исключали все интеграции с числом последовательностей <3.

[0035] На фиг. 19 продемонстрирован анализ обилия клонов клеток, трансдуцированных EGFP-LV. В виде точечной диаграммы представлено обилие клонов объединенных интеграций у каждой мыши в костном мозге. Относительная процентная доля (ось y) каждого сайта интеграции подсчитана относительно общего числа ридов последовательностей, полученных в каждом наборе данных. Аналогично клеткам, трансдуцированными co-RPK (фиг. 17), диаграмма показывает, что у подавляющего большинства мышей, подвергнутых трансплантации, показан поликлональный паттерн репопуляции гемопоэтических клеток. IS - сайт интеграции.

[0036] На фиг. 20 изображен профиль геномной интеграции LV. Анализ генной онтологии (GO) выполняли с применением программного обеспечения GREAT на образцах от мыши, подвергнутой трансплантации. Все данные по интеграциям, полученные в данном исследовании (N=2220), показали превалирование генных функций, указанных в левой части фигуры. Чтобы изучить, были ли наиболее распространенные интеграции обогащены с точки зрения определенных классов генов, выбирали все сайты интеграции с относительным числом последовательностей >5% от всего набора данных (показаны на фиг. 17), что показало отсутствие превалирования классов генов GO.

[0037] На фиг. 21 изображена схематическая диаграмма лекарственного продукта (LV с PGK-coRPK).

[0038] На фиг. 22a-b изображен механизм действия лекарственного продукта. На фиг. 22a показано, что эктопическая экспрессия лекарственного продукта на основе LV с PGK-coRPK будет восстанавливать фенотип дикого типа у эритроцитов с PKD, которые иначе не способны вырабатывать функциональный белок RPK, чтобы продуцировать достаточное количество энергии для осуществления своих функций. На фиг. 22b показана стратегия генной терапии пациентов с PKD, основанная на ex vivo трансдукции CD34⁺ гемопоэтических клеток-предшественников с дефицитом RPK с помощью лекарственного продукта и последующей трансплантации пациенту. Разработанный лекарственный продукт, несущий терапевтическую кДНК гена PKLR человека, будет интегрироваться в геном CD34⁺ клеток пациента поле ex vivo трансдукции. Такие клетки, подвергнутые генетической коррекции, затем будут инфузировать обратно пациенту, где они будут продуцировать RBC, экспрессирующие терапевтический трансген, и, следовательно, будут продуцировать функциональные белки RPK, которые будут корректировать патологический фенотип PKD. Фигура из блога Детской клиники Бостона с модификациями.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

[0039] Используемый в данном документе «вектор» относится к макромолекуле или ассоциации макромолекул, которые содержат полинуклеотид или ассоциированы с ним и которые можно использовать для опосредования доставки полинуклеотида в клетку. Иллюстративные векторы включают, например, плазмиды, вирусные векторы, липосомы и другие носители для доставки гена.

[0040] Термин «LV» является аббревиатурой лентивируса, и он может использоваться в отношении вируса самого по себе или его производных. Термин охватывает все подтипы, а также как встречающиеся в природе, так и рекомбинантные формы, кроме случаев, когда указано иное.

[0041] Используемый в данном документе термин «ген» или «кодирующая последовательность» относится к нуклеотидной последовательности in vitro или in vivo, которая кодирует продукт гена. В некоторых случаях ген состоит или состоит фактически из кодирующей последовательности, то есть последовательности, которая кодирует продукт гена. В других случаях ген содержит дополнительную некодирующую последовательность. Например, ген может включать или может не включать области, расположенные до и после кодирующей области, например, 5'-нетранслируемые (5'-UTR) или «лидерные» последовательности и 3'-UTR или «трейлерные» последовательности, а также промежуточные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими сегментами (экзонами).

[0042] Используемый в данном документе «терапевтический ген» относится к гену, при экспрессии которого обеспечивается полезный эффект в клетке или ткани, в которой он находится, или у млекопитающего, в котором ген экспрессируется. Примеры полезных эффектов включают облегчение признака или симптома состояния или заболевания, предупреждение или подавление состояния или заболевания, или обеспечение необходимой характеристики. Терапевтической гены включают гены, которые корректируют генетическую недостаточность в клетке или у млекопитающего.

[0043] Используемый в данном документе «трансген» представляет собой ген, который доставляется в клетку вектором.

[0044] Используемый в данном документе термин «продукт гена» относится к необходимому продукту экспрессии полинуклеотидной последовательности, такому как полипептид, пептид, белок или интерферирующая РНК, включая короткую интерферирующую РНК (siRNA), miRNA или малую шпилечную РНК (shRNA).

[0045] Используемые в данном документе термины «полипептид», «пептид» и «белок» относятся к полимерам из аминокислот любой длины. Термины также охватывают аминокислотный полимер, который был модифицирован; например, с помощью образования дисульфидной связи, гликозилирования, липидирования, фосфорилирования или конъюгации с компонентом для нанесения метки.

[0046] Под «содержащий» подразумевается, что упомянутые элементы являются необходимыми, например, в композиции, способе, наборе и т. д., но в объем заявляемого пункта могут включаться и другие элементы для образования, например, композиции, способа, набора и т. д. Например, кассета экспрессии, «содержащая» ген, кодирующий терапевтический полипептид, функционально связанный с промотором, представляет собой кассету экспрессии, которая может включать другие элементы в дополнение к гену и промотору, например, последовательность полиаденилирования, энхансерные элементы, другие гены, линкерные домены и т. д.

[0047] Под «состоящий фактически из» подразумевается ограничение объема, например, описанных композиции, способа, набора и т. д., указанными материалами или стадиями, которые не влияют существенно на основную и новую характеристику(и), например, композиции, способа, набора и т. д. Например, кассета экспрессии, «состоящая фактически из» гена, кодирующего терапевтический полипептид, функционально связанного с промотором и последовательностью полиаденилирования, может включать дополнительные последовательности, например, линкерные последовательности, при условии, что они не влияют существенно на транскрипцию или трансляцию гена. В качестве другого примера, вариантный или мутантный полипептидный фрагмент, «состоящий фактически из» упомянутой последовательности, имеет аминокислотную последовательность упомянутой последовательности плюс или минус приблизительно 10 аминокислотных остатков на границах последовательности, исходя из полноразмерного не подвергавшегося воздействию полипептида, из которого он был получен, например, на 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 остаток меньше, чем упомянутый граничный аминокислотный остаток, или на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остатков больше, чем упомянутый граничный аминокислотный остаток.

[0048] Под «состоящий из» подразумевается исключение из композиции, способа или набора любого элемента, стадии или ингредиента, не указанных в пункте формулы изобретения. Например, кассета экспрессии, «состоящая из» гена, кодирующего терапевтический полипептид, функционально связанного с промотором и посттранскрипционным регуляторным элементом, состоит только из промотора, полинуклеотидной последовательности, кодирующей терапевтической полипептид, и посттранскрипционного регуляторного элемента. В качестве другого примера полипептид, «состоящий из» упомянутой последовательности содержит только упомянутую последовательность.

[0049] Используемый в данном документе «вектор экспрессии» охватывает вектор, например, плазмиду, миникольцо, вирусный вектор, липосому и т. п., обсуждаемые выше или известные из уровня техники, содержащие полинуклеотид, который кодирует представляющий интерес продукт гена, и он используется для осуществления экспрессии продукта гена в предполагаемой клетке-мишени. Вектор экспрессии также содержит контрольные элементы, функционально связанные с кодирующей областью, для облегчения экспрессии продукта гена в мишени. Комбинацию контрольных элементов, например, промоторов, энхансеров, UTR, последовательностей, на которые нацеливается miRNA, и т. д., и гена или генов, с которыми они функционально связаны для экспрессии, иногда называют «кассетой экспрессии». Многие такие контрольные элементы известны и доступны из уровня техники или могут быть легко сконструированы из компонентов, которые доступны в данной области.

[0050] Используемый в данном документе «промотор» охватывает последовательность ДНК, которая управляет связыванием РНК-полимеразы и тем самым обеспечивает синтез РНК, т. е. минимальную последовательность, достаточную для управления транскрипцией. Промоторы и соответствующая экспрессия белка или полипептида могут быть убиквитарными, это означает, что они проявляют сильную активность в широком диапазоне клеток, тканей и видов, или специфическими в отношении типа клетки, тканеспецифическими или видоспецифическими. Промоторы могут быть «конститутивными», это означает постоянно активные, или «индуцибельными», это означает, что промотор может быть активирован или дезактивирован присутствием или отсутствием биотических или абиотических факторов. Также в состав конструкции нуклеиновой кислоты или векторы по настоящему изобретению входят энхансерные последовательности, которое могут быть или могут не быть смежными с промоторной последовательностью. Энхансерные последовательности влияют на зависимую от промотора экспрессию гена и могут быть расположены в 5'- или 3'-областях нативного гена.

[0051] Используемый в данном документе «энхансер» охватывает цис-действующий элемент, который стимулирует или подавляет транскрипцию соседних генов. Энхансер, который подавляет транскрипцию, также называется «сайленсер». Энхансеры могут функционировать (т. е. могут быть ассоциированы с кодирующей последовательностью) в любой ориентации, на расстояниях до нескольких тысяч пар оснований (т. п. о.) от кодирующей последовательности и из положения в направлении против хода транскрипции от транскрибируемой области.

[0052] Используемая в данном документе «последовательность сигнала терминации» охватывает любой генетический элемент, который заставляет РНК-полимеразу завершить транскрипцию, такой как, например, последовательность сигнала полиаденилирования.

[0053] Используемые в данном документе термины «оперативно связанный» или «функционально связанный» относятся к смежному положению генетических элементов, например, промотора, энхансера, последовательности сигнала терминации, последовательности полиаденилирования и т. д., где элементы находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать ожидаемым образом. Например, промотор функционально связан с кодирующей областью, если промотор помогает инициировать транскрипцию кодирующей последовательности. Между промотором и кодирующей областью могут находиться промежуточные остатки, при условии, что поддерживается функциональная взаимосвязь.

[0054] Используемый в данном документе термин «гетерологичный» означает полученный из объекта, генотипически отличного от остальной части объекта, с которой его сравнивают. Например, полинуклеотид, введенный с помощью методик генной инженерии в плазмиду или вектор, полученные от другого вида, является гетерологичным полинуклеотидом. В качестве другого примера, промотор, удаленный из своей нативной кодирующей последовательности и функционально связанный с кодирующей последовательностью, с которой он не связан в природе, является гетерологичным промотором. Таким образом, например, LV-вектор, который включает гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую гетерологичный продукт гена, представляет собой LV-вектор, который включает нуклеиновую кислоту, которая в норме не включена во встречающийся в природе LV дикого типа, а кодируемый гетерологичный продукт гена представляет собой продукт гена, в норме не кодируемый встречающимся в природе LV дикого типа.

[0055] Термин «эндогенный», используемый в данном документе в отношении нуклеотидной молекулы или продукта гена, относится к последовательности нуклеиновой кислоты, например, гену или генетическому элементу, или к продукту гена, например, РНК, белку, которые встречаются в природе в вирусе-хозяине или клетке или ассоциированы с ними.

[0056] Используемый в данном документе термин «нативный» относится к нуклеотидной последовательности, например гену, или к продукту гена, например, РНК, белку, которые присутствуют в вирусе или клетке дикого типа.

[0057] Используемый в данном документе термин «вариант» относится к мутанту эталонной полинуклеотидной или полипептидной последовательности, например, нативной полинуклеотидной или полипептидной последовательности, т. е. он характеризуется менее, чем 100% идентичностью последовательности с эталонной полинуклеотидной или полипептидной последовательностью. Другими словами, вариант содержит по меньшей мере одно аминокислотное отличие (например, аминокислотную замену, аминокислотную вставку, аминокислотную делецию) относительно эталонной полинуклеотидной последовательности, например, нативной полинуклеотидной или полипептидной последовательности. Например, вариантом может быть полинуклеотид, характеризующийся идентичностью последовательности, составляющей 70% или более, с полноразмерной нативной полинуклеотидной последовательностью, например, идентичностью, составляющей 75% или 80% или более, например, 85%, 90% или 95% или более, например, 98% или 99% идентичностью с полноразмерной нативной полинуклеотидной последовательностью. В качестве другого примера, вариантом может быть полипептид, характеризующийся идентичностью последовательности, составляющей 70% или более, с полноразмерной нативной полипептидной последовательностью, например, идентичностью, составляющей 75% или 80% или более, например, 85%, 90% или 95% или более, например, 98% или 99% идентичностью с полноразмерной нативной полипептидной последовательностью. Варианты также могут включать вариантные фрагменты эталонной, например нативной, последовательности, разделяющие идентичность последовательности, составляющую 70% или более, с фрагментом эталонной, например нативной, последовательности, например, идентичность 75% или 80% или более, например, 85%, 90% или 95% или более, например, 98% или 99% идентичность с нативной последовательностью.

[0058] Используемые в данном документе термины «биологическая активность» и «биологически активный» относятся к активности, свойственной конкретному биологическому элементу в клетке. Например, «биологическая активность» иммуноглобулина, антитела или их фрагмента или варианта относится к способности связывать антигенную детерминанту и тем самым облегчать иммунологическую функцию. В качестве другого примера, биологическая активность полипептида или его функционального фрагмента или варианта относится к способности полипептида или его функционального фрагмента или варианта выполнять свои нативные функции, например, связывание, ферментативную активность и т. д. В качестве третьего примера, биологическая активность регуляторного элемента гена, например промотора, энхансера, последовательности kozak и т. п., относится к способности регуляторного элемента или его функционального фрагмента или варианта регулировать, т. е. обеспечивать, усиливать или активировать, трансляцию, и соответственно, экспрессию гена, с которым он функционально связан.

[0059] Используемые в данном документе термины «применение» или «введение» относятся к доставке вектора для экспрессии рекомбинантного белка в клетку, в клетки и/или органы субъекта или субъекту. Такое применение или введение может происходить in vivo, in vitro или ex vivo. Вектор для экспрессии продукта гена может быть введен в клетку путем трансфекции, которая, как правило, означает внедрение гетерологичной ДНК в клетку с помощью физических средств (например, трансфекция с применением фосфата кальция, электропорация, микроинъекция или липофекция); инфекции, которая, как правило, относится к введению с помощью инфекционного агента, т. е. вируса; или трансдукции, которая, как правило, означает стабильное инфицирование клетки вирусом или перенос генетического материала из одного микроорганизма в другой с помощью вирусного агента (например, бактериофага).

[0060] «Трансформация», как правило, используется в отношении бактерий, содержащих гетерологичную ДНК, или клеток, которые экспрессируют онкоген и, следовательно, переведены в режим непрерывного роста, таких как опухолевые клетки. Вектором, применяемым для «трансформации» клетки, может быть плазмида, вирус или другой носитель.

[0061] Как правило, клетку называют «трансдуцированной», «инфицированной», «трансфицированной» или «трансформированной» в зависимости от средств, используемых для применения, введения или внедрения гетерологичной ДНК (т. е. вектора) в клетку. Термины «трансдуцированный», «трансфицированный» и «трансформированный» могут использоваться в данном документе взаимозаменяемо, независимо от способа введения гетерологичной ДНК.

[0062] Используемый в данном документе термин «клетка-хозяин» относится к клетке, которая была трансдуцирована, инфицирована, трансфицирована или трансформирована вектором. Вектором может быть плазмида, вирусная частица, фаг и т. д. Условия культивирования, такие как температура, pH и т. п., представляют собой условия, ранее применяемые для клетки-хозяина, выбранной для экспрессии, и они будут очевидны специалистам в данной области. Следует принимать во внимание, что термин «клетка-хозяин» относится к исходной трансдуцированной, инфицированной, трансфицированной или трансформированной клетке и к ее потомству.

[0063] Термины «лечение», «осуществление лечения» и т. п. используются в данном документе в основном для обозначения получения необходимого фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может быть профилактическим по типу полного или частичного предупреждения заболевания или его симптома, например, снижения вероятности того, что заболевание или его симптом возникнет у субъекта, и/или может быть терапевтическим по типу частичного или полного излечения заболевания и/или неблагоприятного воздействия, свойственного этому заболеванию. Используемое в данном документе «лечение» охватывает любое лечение заболевания у млекопитающего и включает: (a) предупреждение возникновения заболевания у субъекта, который может быть предрасположен к заболеванию, но при этом ему еще не поставлен диагноз наличия заболевания; (b) подавление заболевания, т. e. прекращение его развития; или (c) ослабление заболевания, т. e. обеспечение регрессии заболевания. Терапевтическое средство можно применять до, во время или после проявления заболевания или повреждения. Особый интерес представляет лечение протекающего заболевания, при этом лечение стабилизирует или уменьшает нежелательные клинические симптомы у пациента. Такое лечение желательно выполнять перед полной потерей функции у пораженных тканей. Указанную терапию желательно применять во время симптомaтической стадии заболевания, а в некоторых случаях после симптомaтической стадии заболевания.

[0064] Термины «индивидуум», «хозяин», «субъект» и «пациент» используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к млекопитающему, включая без ограничения человека и отличных от человека приматов, включая обезьян и людей; используемым в спорте млекопитающим (например, лошадям); сельскохозяйственным млекопитающим (например, овцам, козам и т. д.); домашним млекопитающим (собакам, кошкам и т. д.) и грызунам (например, мышам, крысам и т. д.).

[0065] Используемая в данном документе терминология предназначена для описания конкретных вариантов осуществления и не предусматривает ограничение настоящего изобретения. Используемые в данном документе формы единственного числа предусматривают также включение форм множественного числа, если контекст четко не указывает на иное. Кроме того, термины «включающий», «включает», «имеющий», «имеет», «с» или их варианты в том объеме, в котором они используются или в подробном описании, и/или в формуле изобретения, предусматриваются как включающие по аналогии с термином «содержащий».

[0066] Термин «приблизительно» или «примерно» означают в пределах допустимого диапазона погрешности для конкретного значения, определяемого рядовым специалистом в данной области, который будет частично зависеть от того, как измеряется или определяется значение, т. е. от ограничений измерительной системы. Например, «приблизительно» может означать в пределах 1 или более 1 стандартного отклонения, согласно установленному порядку в данной области. В качестве альтернативы «приблизительно» может означать диапазон до 20%, предпочтительно до 10%, более предпочтительно до 5% и еще более предпочтительно до 1% данного значения. В качестве альтернативы, в частности в отношении биологических систем или процессов, термин может означать в пределах порядка величины, предпочтительно в пределах 5-кратного и более предпочтительно в пределах 2-кратного значения. Если конкретные значения описываются в настоящей заявке и формуле изобретения, если не указано иное, следует принимать, что термин «приблизительно» означает в пределах допустимого диапазона погрешности для конкретного значения.

[0067] Если не указано иное, все термины, используемые в данном документе, имеют то же самое значение, которое вкладывает в них специалист в данной области, и при осуществлении настоящего изобретения на практике будут использоваться традиционные методики микробиологии и технологии рекомбинантной ДНК, которые известны специалистам в данной области.

[0068] Если не указано иное, для осуществления настоящего изобретения на практике используются традиционные методики клеточной биологии, молекулярной биологии (включая рекомбинантные методики), микробиологии, биохимии и иммунологии, которые известны специалистам в данной области. Такие методики полностью описаны в литературе, например, в "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", второе издание (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology" (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994); и "Current Protocols in Immunology" (J. E. Coligan et al., eds., 1991), при этом каждый из документов явным образом включен в данный документ посредством ссылки.

[0069] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлены полинуклеотиды, полинуклеотидные кассеты и векторы экспрессии для экспрессии гена в клетках. Также представлены фармацевтические композиции и способы применения любой из композиций в содействии экспрессии гена в клетках, например, у индивидуума, например, для лечения или профилактики нарушения. Эти и другие цели, преимущества и признаки настоящего изобретения станут очевидны специалистам в данной области после прочтения подробного описания композиций и способов, которые более полно описаны ниже.

[0070] Настоящее изобретение в целом относится к областям молекулярной биологии и вирусологии и, в частности, к генетическим кассетам экспрессии и векторам, содержащим их, применимым для доставки сегментов нуклеиновой кислоты, кодирующих выбранные терапевтические конструкции (включая, например, пептиды, полипептиды, рибозимы и каталитические молекулы РНК), в выбранные клетки и ткани позвоночных животных. В частности, такие генетические конструкции применимы в разработке векторов для генной терапии, включая, например, лентивирусные векторы, для лечения заболеваний, нарушений и дисфункций у млекопитающих и, в частности, людей.

[0071] Раскрываемые композиции могут использоваться в целом ряде исследовательских, диагностических и терапевтических схем, включая предупреждение и лечение целого ряда заболеваний человека. Различные композиции и способы по настоящему изобретению описаны ниже.

[0072] Хотя в данном документе в качестве примера представлены конкретные композиции и способы, следует учитывать, что любые из целого ряда альтернативных композиций и способов применимы и пригодны для применения при осуществлении настоящего изобретения на практике. Также следует учитывать, что оценку конструкций экспрессии и способов по настоящему изобретению можно выполнять с применением стандартных процедур из уровня техники.

[0073] В определенных вариантах осуществления представлены способы и композиции для получения композиций на основе векторов для генной терапии, например, вирусных векторов, содержащих такие генетические кассеты экспрессии, для применения в получении лекарственных средств, применимых в базовой и нацеленной генной терапии заболеваний, нарушений и дисфункций у животного и, в частности, у людей.

[0074] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлена генная терапия PKD на основе лентивирусного вектора, несущего эукариотический промотор hPGK, который управляет экспрессией кДНК PKLR. Этот терапевтический вектор может применяться для трансдукции гемопоэтических стволовых клеток (HSC) мыши с PKD и последующей трансплантации мышам с PKD, подвергнутым миелоабляции. Эктопическая экспрессия RPK нормализует эритроидный компартмент, корректируя гематологический фенотип и обращая патологию органа. Метаболомные исследования демонстрируют функциональную коррекцию пути гликолиза в RBC, полученных от HSC с PKD, подвергнутых генетической коррекции, при отсутствии метаболических нарушений в лейкоцитах. Анализ сайтов вставки лентивируса в геном трансплантированных гемопоэтических клеток демонстрирует отсутствие доказательств генотоксичности у какого-либо из животных, подвергнутых трансплантации. В целом, результаты подчеркивают терапевтический потенциал лентивирусного вектора с hPGK-coRPK и возлагают большие надежды на генную терапию PKD и других метаболических генетических нарушений в эритроидных клетках.

[0075] В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения представлен лентивирусный вектор (LV) с RPK для генетической коррекции PKD. Генетическая модификация PKD-HSC мыши с помощью данного вектора может эффективно корректировать гемолитический фенотип и профиль метаболитов RBC у мышей с PKD, подвергнутых трансплантации. Следует отметить, что, не наблюдали никаких доказательств метаболических нарушений в лейкоцитах и генотоксичности, полученных в результате интеграции вектора, что подтверждает терапевтический потенциал LV-вектора с PGK-coRPK. В целом, результаты обеспечивают обнадеживающие доказательства пригодности генной терапии PKD с помощью LV, разработанного для клинического применения.

[0076] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен самоинактивирующийся лентивирусный вектор, экспрессирующий кодон-оптимизированный вариант гена PKLR человека. Вектор экспрессии содержит промоторную область, кодирующую последовательность и посттранскрипционный регуляторный элемент.

[0077] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидные кассеты по настоящему изобретению содержат промоторную область, содержащую промоторную последовательность или ее функциональный фрагмент. В одном варианте осуществления промотор представляет собой промотор гена фосфоглицераткиназы (PGK) человека.

[0078] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрены полинуклеотидные кассеты для усиленной экспрессии пируваткиназы. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидная кассета содержит кодон-оптимизированный вариант кДНК PKLR (coRPK) человека для усиления стабильности мРНК при транскрипции. Для оптимизации можно использовать программное обеспечение GeneArt®, повышая содержание GC и удаляя криптические сайты сплайсинга, чтобы исключить транскрипционный сайленсинг, с увеличением тем самым экспрессии трансгена. Для оптимизированной последовательности coRPK показана 80,4% гомология с геном PKLR человека, при этом отсутствовали изменения в аминокислотной последовательности белка. В качестве альтернативы можно использовать любой способ оптимизации, известный из уровня техники.

[0079] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидная кассета содержит сигнал экспорта РНК направлении по ходу транскрипции от второго энхансера. Сигнал экспорта РНК может содержать последовательность посттранскрипционного элемента вируса гепатита сурков (WPRE). В некоторых вариантах осуществления также включен мутантный посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков (Wpre), без какой-либо остаточной открытой рамки считывания (Schambach, Bohne et al. 2006), чтобы улучшить уровень экспрессии и стабильности терапевтического гена.

[0080] В некоторых аспектах настоящего изобретения представлены векторы доставки гена, содержащие полинуклеотидную кассету по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления вектором доставки гена является лентивирус.

[0081] В некоторых аспектах настоящего изобретения представлены фармацевтические композиции, содержащие полинуклеотидную кассету по настоящему изобретению и фармацевтический наполнитель. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит вектор доставки гена по настоящему изобретению и фармацевтический наполнитель.

[0082] В некоторых аспектах настоящего изобретения представлены способы экспрессии трансгена в клетках млекопитающих. В некоторых вариантах осуществления способ предусматривает приведение одной или более клеток млекопитающего в контакт с эффективным количеством полинуклеотидной кассеты по настоящему изобретению или вектора доставки гена по настоящему изобретению, при этом трансген экспрессируется на выявляемых уровнях в одной или более клетках млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления способ предусматривает приведение одной или более клеток млекопитающего в контакт с эффективным количеством полинуклеотидной кассеты по настоящему изобретению или вектора доставки гена по настоящему изобретению, при этом трансген экспрессируется на терапевтических уровнях в одной или более клетках млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления способ осуществляется in vitro. В других вариантах осуществления способ осуществляется in vivo.

[0083] В некоторых аспектах настоящего изобретения представлены способы лечения или профилактики заболевания или нарушения у млекопитающего, нуждающегося в лечении или профилактике заболевания или нарушения. В некоторых вариантах осуществления способ предусматривает введение млекопитающему эффективного количества фармацевтической композиции по настоящему изобретению, при этом кодирующая последовательность кодирует терапевтической продукт гена.

Композиции

[0084] В некоторых аспектах настоящего изобретения представлены композиции для экспрессии трансгена в эукариотической клетке(ах). В некоторых аспектах эукариотическая клетка представляет собой клетку млекопитающего. В некоторых аспектах клетка млекопитающего представляет собой гемопоэтическую стволовую клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку костного мозга, например, клетку костного мозга, подвергнутую деплеции по линии дифференцировки. В некоторых аспектах клетка млекопитающего представляет собой коммитированную гемопоэтическую эритроидную клетку-предшественник.

[0085] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиция представляет собой полинуклеотидную кассету. Под «полинуклеотидной кассетой» подразумевают полинуклеотидную последовательность, содержащую две или более функциональных полинуклеотидных последовательностей, например, регуляторных элементов, последовательностей инициации трансляции, кодирующих последовательностей и/или последовательностей терминации и т. д., как правило, в функциональной связи друг с другом. Подобным образом, под «полинуклеотидной кассетой для экспрессии трансгена в клетке млекопитающего» подразумевают комбинацию двух или более функциональных полинуклеотидных последовательностей, например, промотора, энхансера, 5’-UTR, последовательности инициации трансляции, кодирующей последовательности и/или последовательностей терминации и т. д., которая обеспечивает экспрессию трансгена в клетке.

[0086] Например, в некоторых вариантах осуществления полинуклеотидная кассета содержит промотор гена фосфоглицераткиназы (PGK) человека, кодон-оптимизированный вариант кДНК PKLR (coRPK) человека и мутантный посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков (Wpre).

[0087] В конкретных вариантах осуществления любого из кассет экспрессии и векторов доставки гена, описываемых в данном документе, промотор гена PKLR человека содержит или состоит из следующей последовательности, ее функционального фрагмента или последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью со следующей последовательностью:

ATTATGGTAAATCCACTTACTGTCTGCCCTCGTAGCCATCGAGATAAACCCTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCGACCTGCAGCCC (SEQ ID NО: 4).

[0088] В конкретных вариантах осуществления любого из кассет экспрессии и векторов доставки гена, описываемых в данном документе, промотор гена PKLR человека содержит или состоит из следующей последовательности, ее функционального фрагмента или последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью со следующей последовательностью:

TCCACGGGGTTGGGGTTGCGCCTTTTCCAAGGCAGCCCTGGGTTTGCGCAGGGACGCGGCTGCTCTGGGCGTGGTTCCGGGAAACGCAGCGGCGCCGACCCTGGGTCTCGCACATTCTTCACGTCCGTTCGCAGCGTCACCCGGATCTTCGCCGCTACCCTTGTGGGCCCCCCGGCGACGCTTCCTCGTCCGCCCCTAAGTCGGGAAGGTTCCTTGCGGTTCGCGGCGTGCCGGACGTGACAAACGGAAGCCGCACGTCTCACTAGTACCCTCGCAGACGGACAGCGCCAGGGAGCAATGGCAGCGCGCCGACCGCGATGGGCTGTGGCCAATAGCGGCTGCTCAGCAGGGGCGCCCGAGAGCAGCGGCCGGGAAGGGGCGGTGCGGGAGGCGGGGTGTGGGGCGGTAGTGTGGGCCCTGTTCCTGCCCGCGCGGTGTTCCGCATTCTGCAAGCCTCCGGAGCGCACGTCGGCAGTCGGCTCCCTCGTTGACCGAATCACCGACCTCTCTCCCCAG (SEQ ID NО: 8).

[0089] В конкретных вариантах осуществления любого из кассет экспрессии и векторов доставки гена, описываемых в данном документе, последовательность RPE содержит или состоит из следующей последовательности или последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью со следующей последовательностью:

TCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCT (SEQ ID NО: 3).

[0090] В конкретных вариантах осуществления любого из кассет экспрессии и векторов доставки гена, описываемых в данном документе, последовательность psi представляет собой последовательность psi HIV-1, или последовательность psi содержит или состоит из следующей последовательности или последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью со следующей последовательностью:

TCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAG (SEQ ID NО: 5).

[0091] В конкретных вариантах осуществления любого из кассет экспрессии и векторов доставки гена, описываемых в данном документе, 5’-LTR содержит или состоит из следующей последовательности или последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью со следующей последовательностью:

TGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGT (SEQ ID NО: 6).

[0092] В конкретных вариантах осуществления любого из кассет экспрессии и векторов доставки гена, описываемых в данном документе, 3’-LTR содержит или состоит из следующей последовательности или последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью со следующей последовательностью:

TGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAG (SEQ ID NО: 7).

[0093] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидные кассеты по настоящему изобретению обеспечивают усиленную экспрессию трансгена в клетках млекопитающих. Как продемонстрировано в рабочих примерах настоящего изобретения, авторы настоящего изобретения обнаружили целый ряд полинуклеотидных элементов, т. е. улучшенных элементов по сравнению с элементами, известными из уровня техники, которые по отдельности и синергически обеспечивают усиленную экспрессию трансгенов в клетках млекопитающих. В определенных вариантах осуществления расположение двух или более функциональных полинуклеотидных последовательностей в пределах полинуклеотидных кассет по настоящему изобретению обеспечивают усиленную экспрессию трансгена в клетках млекопитающих. Под «усиленная» подразумевается, что экспрессия трансгена повышается, возрастает или становится более сильной в клетках, несущих полинуклеотидные кассеты по настоящему изобретению, по сравнению с клетками, несущими трансген, функционально связанный с сопоставимыми регуляторными элементами, например, известными из уровня техники. Другими словами, экспрессия трансгена повышается, возрастает или становится более сильной за счет полинуклеотидных кассет по настоящему изобретению по сравнению с экспрессией за счет полинуклеотидной кассеты, не содержащей один или более оптимизированных элементов по настоящему изобретению, т. е. эталонного контроля. В определенном варианте осуществления усиленная экспрессия является специфической в отношении одного или более необходимых типов клеток или ограничена ими.

[0094] Например, экспрессия трансгена может повышаться, или увеличиваться, или становиться более сильной в клетках, содержащих полинуклеотидную кассету, содержащую промотор, раскрываемый в данном документе, по сравнению с экспрессией в клетках, которые несут трансген, функционально связанный с другим промотором, например, известным из уровня техники. В качестве другого примера, экспрессия трансгена может усиливаться или повышаться, увеличиваться или становиться сильнее в клетках, содержащих полинуклеотидную кассету, содержащую энхансерную последовательность, раскрываемую в данном документе, по сравнению с экспрессией в клетках, которые несут трансген, функционально связанный с другой энхансерной последовательностью.

[0095] Промоторные и энхансерные элементы могут быть тканеспецифическими или специфическими в отношении стадии. Например, тканеспецифический промотор или энхансер преимущественно управляют экспрессией (или более высоким уровнем экспрессии) в одном или более конкретных типах клеток. Примеры типов клеток включают без ограничения гемопоэтические стволовые клетки, долгоживущие гемопоэтические стволовые клетки, короткоживущие гемопоэтические стволовые клетки, мультипотентные предшественники, гемопоэтические CD34+ клетки и клетки с любой субпопуляцией кластера дифференцировки в пределах CD34+ популяции. Специфический в отношении стадии промотор или энхансер преимущественно управляют экспрессией (или более высоким уровнем экспрессии) во время одной или более определенных стадий клеточного цикла или развития. Они включают без ограничения контрольную область локуса гена бета-глобина, промотор гена спектрина и промотор, специфический в отношении эритроидных клеток.

[0096] Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, полагают, что усиленная экспрессия трансгена в клетках обусловлена более быстрым наращиванием продукта гена в клетках или более стабильным продуктом гена в клетках. Вследствие этого, усиленную экспрессию трансгена за счет полинуклеотидных кассет по раскрываемому изобретению можно наблюдать с помощью целого ряда способов. Например, усиленную экспрессию можно наблюдать путем выявления экспрессии трансгена вскоре после контакта полинуклеотидной кассеты с клетками раньше, например, на 2 суток раньше, на 7 суток раньше, на 2 недели раньше, на 3 недели раньше, на 4 недели раньше, на 8 недель раньше, на 12 недель раньше или более, по сравнению с экспрессией, которая выявляли бы, если бы трансген был функционально связан с сопоставимыми регуляторными элементами, например, известными из уровня техники. Усиленную экспрессию также можно наблюдать как повышение количества продукта гена на клетку. Например, может наблюдаться 2-кратное повышение или более, например, 3-кратное повышение или более, 4-кратное повышение или более, 5-кратное повышение или более или 10-кратное повышение или более количества продукта гена на клетку млекопитающего. Усиленную экспрессию также можно наблюдать как повышение числа клеток млекопитающего, которые экспрессируют трансген, который несет полинуклеотидная кассета, на выявляемых уровнях. Например, может наблюдаться 2-кратное повышение или более, например, 3-кратное повышение или более, 4-кратное повышение или более, 5-кратное повышение или более или 10-кратное повышение или более числа клеток млекопитающего, которые экспрессируют трансген на выявляемых уровнях. В качестве другого примера полинуклеотид по настоящему изобретению может обеспечивать выявляемые уровни трансгена у большей процентной доли клеток по сравнению с традиционной полинуклеотидной кассетой; например, если традиционная кассета может обеспечивать выявляемые уровни экспрессии трансгена, например, у менее чем 5% клеток в определенной области, то полинуклеотид по настоящему изобретению обеспечивает выявляемые уровни экспрессии у 5% или более клеток в этой области; например, 10% или более, 15% или более, 20% или более, 25% или более, 30% или более, 35% или более, 40% или более, или 45% или более, в некоторых случаях 50% или более, 55% или более; 60% или более, 65% или более, 70% или более, или 75% или более, например, 80% или более, 85% или более, 90% или более, или 95% или более клеток, которые были приведены в контакт, будут экспрессировать продукт гена на выявляемых уровнях. Усиленную экспрессию также можно наблюдать как изменение жизнеспособности и/или функционирования клеток.

[0097] Полинуклеотидные кассеты по настоящему изобретению, как правило, содержат промоторную область. Любая подходящая промоторная область или промоторная последовательность в ней могут использоваться в заявляемых полинуклеотидных кассетах, при условии, что промоторная область обеспечивает экспрессию кодирующей последовательности в эукариотических клетках. В определенных вариантах осуществления промоторная область обеспечивает экспрессию кодирующей последовательности в клетках млекопитающих. В некоторых случаях промотор представляет собой убиквитарный промотор, т. е. промотор, который активен в широком диапазоне клеток, тканей и видов. В других случаях промотор представляет собой промотор гена фосфоглицераткиназы (PGK) человека.

[0098] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид содержит один или более энхансеров. Энхансеры представляют собой известные из уровня техники элементы в виде нуклеиновой кислоты для усиления транскрипции, и они могут располагаться в любом месте в ассоциации с геном, который они регулируют, например, в направлении против хода транскрипции, в направлении по ходу транскрипции, в интроне и т. д. Любой энхансерный элемент можно использовать в полинуклеотидных кассетах и векторах для генной терапии по настоящему изобретению, при условии, что он усиливает экспрессию гена, если применяется в комбинации с промотором.

[0099] Кодирующей последовательностью, подлежащей экспрессии в клетках, может быть любая полинуклеотидная последовательность, например, ген или кДНК, которая кодирует продукт гена, например, полипептид или терапевтическое средство на основе РНК (siRNA, антисмысловая последовательность, рибозим, shRNA и т. д.). Кодирующая последовательность может быть гетерологичной по отношению к промоторной последовательности, с которой она функционально связана, т. е. не ассоциирована с ней функционально в природе. В качестве альтернативы кодирующая последовательность может быть эндогенной по отношению к промоторной последовательности, с которой она функционально связана, т. е. ассоциирована с данным промотором в природе. Продукт гена может оказывать действие внутри клетки млекопитающего, или он может оказывать действие снаружи, например, он может секретироваться. Например, если трансген представляет собой терапевтический ген, то кодирующей последовательностью может быть любой ген, который кодирует необходимый продукт гена, или его функциональный фрагмент, или вариант, которые могут применяться в качестве терапевтического средства для лечения заболевания или нарушения. В разных предпочтительных вариантах осуществления трансген кодирует PKLR человека.

[00100] В одном варианте осуществления настоящего изобретения кодирующая последовательность трансгена является модифицированной или «кодон-оптимизированной» для усиления экспрессии путем замены редко представленных кодонов более часто представленными кодонами. Кодирующая последовательность представляет собой часть последовательности мРНК, которая кодирует аминокислоты для трансляции. Во время трансляции каждый из 61 тринуклеотидных кодонов транслируется в одну из 20 аминокислот, к чему приводит вырожденность или избыточность генетического кода. Однако разные типы клеток и разные виды животных используют тРНК (каждая из которых имеет антикодон), кодирующие одни и те же аминокислоты с разной частотой. Если последовательность гена содержит кодоны, которые являются редко представленными у соответствующей тРНК, то работа аппарата рибосомной трансляции может замедляться, что препятствует эффективной трансляции. Экспрессия может быть улучшена путем «кодон-оптимизации» для конкретного вида, при этом кодирующую последовательность изменяют для кодирования той же белковой последовательности, но с применением кодонов, которые представлены на высоком уровне и/или используются в белках человека с высоким уровнем экспрессии (Cid-Arregui et al., 2003; J. Virol. 77: 4928). В одном аспекте настоящего изобретения кодирующая последовательность трансгена модифицирована для замены кодонов, которые редко экспрессируются у млекопитающих или у приматов, кодонами, которые часто экспрессируются у приматов. Например, в некоторых вариантах осуществления кодирующая последовательность, кодируемая трансгеном, кодирует полипептид, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с полипептидом, кодируемым последовательностью, раскрываемой выше или в данном документе, например, по меньшей мере 90% идентичностью последовательности, например, по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, по меньшей мере 98% идентичностью, по меньшей мере 99% идентичностью, где по меньшей мере один кодон кодирующей последовательности характеризуется более высокой частотой встречаемости тРНК у человека, чем соответствующий кодон в последовательности, раскрываемой выше или в данном документе.

[00101] В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения кодирующая последовательность трансгена модифицирована для усиления экспрессии за счет терминации или удаления открытых рамок считывания (ORF), которые не кодируют необходимый трансген. Открытая рамка считывания (ORF) представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая следует за стартовым кодоном и не содержит стоп-кодон. ORF может находиться в прямой или обратной ориентации и может находиться «внутри рамки» или «вне рамки» относительно представляющего интерес гена. Такие открытые рамки считывания потенциально могут экспрессироваться в кассете экспрессии одновременно с представляющим интерес геном, и это может привести к нежелательным побочным эффектам. В одном аспекте настоящего изобретения кодирующая последовательность трансгена была модифицирована для удаления открытых рамок считывания путем дальнейшего изменения частоты использования кодона. Это выполняли путем удаления стартовых кодонов (ATG) и введения стоп-кодонов (TAG, TAA или TGA) в ORF обратной ориентации или вне рамки считывания, при этом сохраняя аминокислотную последовательность и поддерживая используемые в высокой степени кодоны в представляющем интерес гене (т. е. избегая кодонов с частотой <20%). В настоящем изобретении кодирующая последовательность трансгена может быть оптимизирована либо путем кодон-оптимизации, либо удалением ORF, не принадлежащих трансгену, либо путем применения обеих методик. Как будет понятно рядовому специалисту в данной области, предпочтительно удалять или минимизировать ORF, не принадлежащие трансгену, после кодон-оптимизации, чтобы удалить ORF, введенных во время кодон-оптимизации.

[00102] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидная кассета по настоящему изобретению дополнительно содержит сигнал экспорта РНК. Приведенные в качестве примера последовательности экспорта РНК включают без ограничения последовательности из посттранскрипционного элемента вируса гепатита сурков (WPRE). Посттранскрипционный регуляторный элемент (Wpre) вируса гепатита сурков (WHV) значимо повышает экспрессию трансгена в клетках-мишенях за счет увеличения стабильности РНК у трансгена способом, независимым от промотора и вектора (Zuffrey et al, 1999). Однако он может приводить к экспрессии усеченного белка из 60 аминокислот, происходящего из X-гена WHV, вовлеченного в рак печени (Kingsman et al, 2005). Поэтому, большинство доклинических протоколов и клинических испытаний включают мутантную версию элемента Wpre (Zanta-Boussif et al, 2009). С другой стороны, было обнаружено, что применение двух элементов SV40-USE в векторах SIN-LV было более эффективным в подавлении транскрипционного прочитывания, чем последовательность WPRE (Schambach et al, 2007). Более точно WPRE, раскрываемый в данном документе, представляет собой химерный WPRE, который несет 589 нуклеотидов из модифицированного WPRE, полученного Акселем Шамбахом (Axel Schambach) (нуклеотиды 1-589) (WO 2008136670 A2; [5]) и 88 из прежнего WPRE (нуклеотиды 590-677) (Zuffrey et al, 1999). Данные, раскрываемые в данном документе, показывают, что этот химерный wpre работает лучше, чем прежний WPRE. Последовательность химерного WPRE предусматривает последовательность, приведенную в таблице ниже.

[00103] Таблица 1. Последовательность модифицированного WPRE

[00104] Настоящее изобретение также включает нуклеиновую кислоту, например, полинуклеотидную последовательность, содержащую последовательность, характеризующуюся меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью с последовательностью, изложенной в SEQ ID NО: 1 или SEQ ID NО: 9. В конкретных вариантах осуществления полинуклеотидная последовательность содержит последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NО: 9.

[00105] В конкретных вариантах осуществления любого из кассет экспрессии и векторов доставки гена, описываемых в данном документе, последовательность Wpre содержит или состоит из последовательности под SEQ ID NО: 1 или последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью с последовательностью под SEQ ID NО: 1.

[00106] В конкретных вариантах осуществления любого из кассет экспрессии и векторов доставки гена, описываемых в данном документе, последовательность Wpre содержит или состоит из следующей последовательности или последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью со следующей последовательностью:

CGAGCATCTTACCGCCATTTATTCCCATATTTGTTCTGTTTTTCTTGATTTGGGTATACATTTAAATGTTAATAAAACAAAATGGTGGGGCAATCATTTACATTTTTAGGGATATGTAATTACTAGTTCAGGTGTATTGCCACAAGACAAACATGTTAAGAAACTTTCCCGTTATTTACGCTCTGTTCCTGTTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGATATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTGTGTGGATATGCTGCTTTAATGCCTCTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTACGGCTTTCGTTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCCGTCAACGTGGCGTGGTGTGCTCTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAACTCCTTTCTGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCGATCGCCACGGCAGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTAGGTTGCTGGGCACTGATAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG (SEQ ID NО: 9).

[00107] В определенных вариантах осуществления кассета экспрессии или вектор доставки гена, например лентивирус, содержат полинуклеотидную последовательность, содержащую следующие последовательности в 5’-3’-направлении:

a) промоторная последовательность PGK, необязательно промоторная последовательность PGK человека;

b) последовательность, кодирующая полипептид пируваткиназы, необязательно кодон-оптимизированная кодирующая последовательность или последовательность кДНК RPK; и

c) мутантная последовательность Wpre, необязательно содержащая или состоящая из последовательности под SEQ ID NО: 1.

[00108] В определенных вариантах осуществления кассета экспрессии или вектор доставки гена, например лентивирус, содержат полинуклеотидную последовательность, содержащую следующие последовательности в 5’-3’-направлении:

a) последовательность cPPT;

b) промоторная последовательность PGK, необязательно промоторная последовательность PGK человека;

c) последовательность, кодирующая полипептид пируваткиназы, необязательно кодон-оптимизированная кодирующая последовательность или последовательность кДНК RPK; и

d) мутантная последовательность Wpre, необязательно содержащая или состоящая из последовательности под SEQ ID NО: 1.

[00109] В определенных вариантах осуществления кассета экспрессии или вектор доставки гена, например лентивирус, содержат полинуклеотидную последовательность, содержащую следующие последовательности в 5’-3’-направлении:

a) 5’-LTR, необязательно модифицированный 5’-LTR;

b) последовательность cPPT;

c) промоторная последовательность PGK, необязательно промоторная последовательность PGK человека;

d) последовательность, кодирующая полипептид пируваткиназы, необязательно кодон-оптимизированная кодирующая последовательность RPK или последовательность кДНК;

e) мутантная последовательность Wpre, необязательно содержащая или состоящая из последовательности под SEQ ID NО: 1; и

f) 3’-LTR, необязательно модифицированный 3’-LTR.

[00110] В определенных вариантах осуществления вектор доставки гена представляет собой LV с PGK-coRPK или содержит элементы, изображенные на фиг. 21.

[00111] В конкретных вариантах осуществления любого из кассет экспрессии и векторов доставки гена, описываемых в данном документе, кодон-оптимизированная кДНК или кодирующая последовательность RPK кодирует полипептид PKLR, который содержит или состоит из последовательности, раскрываемой под каким-либо из номеров доступа в GenBank XP 016856982 1, XP 011507942.1, XP 006711449.1, NP 870986 1 или NP 000289,1, или функционального фрагмента любой из этих последовательностей, или последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью с любой из этих последовательностей.

[00112] Другие комбинации элементов, как раскрываемых в данном документе, так и известных из уровня техники, будут очевидны рядовым специалистам в данной области.

[00113] Кроме того, рядовому специалисту в данной области будет понятно, что полинуклеотидные кассеты необязательно могут содержать другие элементы, включая без ограничения сайты рестрикции для облегчения клонирования и регуляторные элементы для вектора экспрессии конкретного гена.

[00114] В некоторых аспектах настоящего изобретения заявляемые полинуклеотидные кассеты применяются для доставки гена в клетки животного, например, чтобы определить эффект, который данный ген оказывает на жизнеспособность и/или функционирование клетки, чтобы лечить клеточное нарушение и т. д. Следовательно, в некоторых аспектах настоящего изобретения композиция, которая обеспечивает экспрессию трансгена в клетках млекопитающих, представляет собой вектор доставки гена, где вектор доставки гена содержит полинуклеотидные кассеты по настоящему изобретению.

[00115] Любой подходящий вектор для генной терапии, который находит применение в доставке полинуклеотидных последовательностей в клетки млекопитающих, входит в число векторов доставки гена по настоящему изобретению. Например, вектор может содержать одно- или двухнитевую нуклеиновую кислоту, например, однонитевую или двухнитевую ДНК. Например, вектором доставки гена может быть ДНК, например, депротеинизированная ДНК, например, плазмида, миникольцо и т. д. Вектор может содержать однонитевую или двухнитевую РНК, включая модифицированные формы РНК. В другом примере вектором доставки гена может быть РНК, например, мРНК или модифицированная мРНК.

[00116] В качестве другого примера вектором доставки гена может быть вирусный вектор, полученный из вируса, например, аденовируса, аденоассоциированного вируса, лентивируса (LV), вируса герпеса, альфавируса или ретровируса, например, вируса мышиного лейкоза Молони (M-MuLV), вируса саркомы мышей Молони (MoMSV), вируса саркомы мышей Харви (HaMuSV), вируса опухоли молочной железы мышей (MuMTV), вируса лейкоза гиббонов (GaLV), вируса лейкоза кошек (FLV), спумавируса, вируса лейкоза мышей Френда, вируса стволовых клеток мышей (MSCV) и вируса саркомы Роуса (RSV)) или лентивируса. Хотя ниже более подробно описаны варианты осуществления, охватывающие применение лентивируса, предполагается, что рядовому специалисту в данной области будет понятно, что подобные знания и навыки в данной области также могут быть применены к отличным от LV векторам для генной терапии. В некоторых вариантах осуществления вектором доставки гена является самоограничивающийся лентивирус.

[00117] В таких вариантах осуществления заявляемая полинуклеотидная кассета фланкирована на 5'- и 3'-концах функциональными последовательностями длинного концевого повтора (LTR). В одном варианте осуществления положение разных элементов, присутствующих в остове лентивирусного вектора, изображены на фигуре 1. Обе последовательности LTR были модифицированы для получения самоинактивирующихся (SIN) LV-векторов. SIN-векторы имеют делецию 400 п. о. в 3’-LTR, охватывающую промоторные/энхансерные элементы из U3-области. В связи с этим экспрессия трансгена зависит от внутренних промоторов, что снижает риск RCL и уменьшает интерференцию промоторов (Ginn et al, 2003). Такая делеция в 3’-LTR удаляет ТАТА-бокс, предотвращая инициацию транскрипции (Miyoshi et al. 1998; Zuffrey et al 1998) и, следовательно, инактивируя вектор. U3-область в 5’-LTR была заменена другими гетерологичными промоторными последовательностями (т. е. CMV или RSV), чтобы обеспечить Tat-независимую транскрипцию и что усилить синтез геномной РНК, что приводит к повышению вирусного титра. Поскольку 5’-U3-область управляет экспрессией первичных транскриптов, ее модификации не будут присутствовать в клетках, подвергнутых трансдукции (Schambach et al. 2009). Экзогенные элементы, такие как сигналы полиаденилирования β-глобина или SV40 (Iwakuma et al, 1999) или элемент последовательности, расположенный против хода транскрипции (USE) от вируса обезьян 40 (SV40-USE) (Schambach et al. 2007), также были включены в R-область вирусного 3’-LTR, чтобы снизить транскрипционное сквозное прочтение с внутренних промоторов (Zaiss et al, 2002) или остатков удаленной U3-области векторов SIN-LV (Almarza et al. 2011), что предотвращает потенциальную транскрипционную активацию генов, расположенных по ходу транскрипции. Лидерная область содержит сигнал упаковки (ᴪ), и полагали, что для LV-векторов требуется примерно 300 п. о. гена Gag в этой области. В настоящее время эта последовательность Gag была уменьшена всего лишь до 40 п. о. (фигура 1). Для повышения эффективности переноса генов также был включен Rev-чувствительный элемент (RRE), хотя он содержит прилегающие к нему остатки Env. Как было обнаружено, центральный полипуриновый тракт (cPPT), который облегчает ядерную транслокацию прединтеграционных комплексов, вместе с центральной терминальной последовательностью (CTS), вовлеченной в отделение обратной транскриптазы, увеличивают вирусный титр (Zennou, et al. 2000; Follenzi et al. 2000). В конкретных вариантах осуществления cPPT, присутствующий в любом из кассет экспрессии или векторов доставки генов, описываемых в данном документе, содержит или состоит из следующей последовательности: TTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGT (SEQ ID NО: 2) или последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью с SEQ ID NО: 2.

[00118] Сигнал dNEF/PPT необходим для обратной транскрипции, и его включение значимо улучшает продуцирование LV-вектора.

[00119] Векторы для генной терапии, инкапсулирующие полинуклеотидные кассеты по настоящему изобретению, могут быть получены с применением стандартных методов. Например, в случае LV-вирионов в клетку-продуцент может вводиться LV-вектор экспрессии по настоящему изобретению с последующим введением конструкции LV-помощника, при этом конструкция помощника включает кодирующие области LV, способные экспрессироваться в клетке-продуценте и которые комплементируют функции LV-помощника, отсутствующие у LV-вектора. За этим следует внесение вируса-помощника и/или дополнительных векторов в клетку-продуцент, при этом вирус-помощник и/или дополнительные векторы обеспечивают вспомогательные функции, способные поддерживать эффективное продуцирование вируса LV. Затем клетки-продуценты культивируют для продуцирования LV. Эти стадии выполняют с применением стандартных методов.

[00120] Для доставки заявляемых полинуклеотидных кассет может применяться любой подходящий способ продуцирования вирусных частиц, включая без ограничения описываемые в приведенных ниже примерах. Для приведения в контакт с клетками млекопитающих in vitro или in vivo можно приготовить любую концентрацию вирусных частиц, подходящую для эффективной трансдукции клеток млекопитающих. Например, вирусные частицы можно составлять при концентрации 10⁸ векторных геномов на мл или более, например, 5 х 10⁸ векторных геномов на мл; 10⁹ векторных геномов на мл; 5 x 10⁹ векторных геномов на мл, 10¹⁰ векторных геномов на мл, 5 х 10¹⁰ векторных геномов на мл; 10¹¹ векторных геномов на мл; 5 х 10¹¹ векторных геномов на мл; 10¹² векторных геномов на мл; 5 х 10¹² векторных геномов на мл; 10¹³ векторных геномов на мл; 1,5 x 10¹³ векторных геномов на мл; 3 х 10¹³ векторных геномов на мл; 5 х 10¹³ векторных геномов на мл; 7,5 х 10¹³ векторных геномов на мл; 9 х 10¹³ векторных геномов на мл; 1 x 10¹⁴ векторных геномов на мл, 5 x 10¹⁴ векторных геномов на мл или более, но, как правило, не больше 1 x 10¹⁵ векторных геномов на мл.

[00121] При получении заявляемых композиций LV можно использовать любые клетки-хозяева для продуцирования LV-вирионов, включая, например, клетки млекопитающих (например, клетки 293), клетки насекомых (например, клетки SF9), микроорганизмы и дрожжи. Клетками-хозяевами также могут быть упаковывающие клетки, при этом гены rep и cap LV стабильно поддерживаются в клетке-хозяине, или клетки-продуценты, в которых геном LV-вектора стабильно поддерживается и упаковывается. Приведенные в качестве примера упаковывающие и клетки-продуценты получены из клеток SF-9, 293, A549 или HeLa. LV-векторы очищают и составляют с применением стандартных методик, известных из уровня техники.

[00122] В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение включает клетку, содержащую кассету экспрессии или вектор доставки гена, раскрываемые в данном документе. В связанных вариантах осуществления клетка трансдуцирована вирусным вектором, содержащим кассету экспрессии, раскрываемую в данном документе, или имеет кассету экспрессии, раскрываемую в данном документе, интегрированную в геном клетки. В определенных вариантах осуществления клетка представляет собой клетку, применяемую для продуцирования вирусного вектора доставки гена. В других вариантах осуществления клетка представляет собой клетку, подлежащую доставке в субъекта, чтобы обеспечить субъекта продуктом гена, кодируемым кассетой экспрессии. Таким образом, в определенных вариантах осуществления клетка является аутологической по отношению к субъекту, подлежащему лечению, или была получена от субъекта, подлежащего лечению. В других вариантах осуществления клетка является аллогенной по отношению к субъекту, подлежащему лечению, или была получена от донора, отличного от субъекта, подлежащего лечению. В конкретных вариантах осуществления клетка представляет собой клетку млекопитающего, например, клетку человека. В определенных вариантах осуществления клетка представляет собой клетку крови, эритроцит, гемопоэтическую клетку-предшественник, клетку костного мозга, например, клетку костного мозга, подвергнутую деплеции по линии дифференцировки, гемопоэтическую стволовую клетку (например, CD34+) или коммитированную гемопоэтическую эритроидную клетку-предшественник.

[00123] Настоящее изобретение включает фармацевтические композиции, содержащие полинуклеотидную кассету, вектор доставки гена или клетку, описываемые в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель. Заявляемые полинуклеотидная кассета, вектор доставки гена или клетка могут быть объединены с фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями и реагентами, применимыми в получении состава, который в целом является безопасным, нетоксичным и желательным, и он включает наполнители, которые приемлемы для применения у приматов. Такие наполнители могут быть твердыми, жидкими, полужидкими или, в случае аэрозольной композиции, газообразными. Примеры таких наполнителей, носителей или разбавителей включают без ограничения воду, солевой раствор, растворы Рингера, раствор декстрозы и 5% человеческий сывороточный альбумин. Дополнительные активные соединения также могут быть включены в составы. Растворы или суспензии, применяемые для составов, могут включать стерильный разбавитель, такой как вода для инъекций, солевой раствор, нелетучие масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные соединения, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие соединения, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA); буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты; поверхностно-активные вещества, такие как Tween 20, для предотвращения агрегации и соединения для регулирования тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. pH можно регулировать с помощью кислот или оснований, таких как хлористоводородная кислота или гидроксид натрия. В конкретных вариантах осуществления фармацевтические композиции являются стерильными.

[00124] Фармацевтические композиции, подходящие для применения в настоящем изобретении, дополнительно включают стерильные водные растворы или дисперсии, а также стерильные порошки для экстемпорального приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсии.

[00125] Стерильные растворы могут быть получены путем включения необходимого количества активного соединения в соответствующий растворитель с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости с последующей стерилизацией фильтрованием. В целом, дисперсии получают путем включения активного соединения в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов способами получения являются вакуумная сушка и сушка вымораживанием, которая дает порошок активного ингредиента с любым дополнительным необходимым ингредиентом из предварительно стерилизованного фильтрованием их раствора.

[00126] В одном варианте осуществления композиции получают с носителями, которые будут защищать генную кассету или вектор экспрессии от быстрого выведения из организма, как, например, в случае состава с контролируемым высвобождением, включая имплантаты и микроинкапсулированные системы доставки. Могут применяться биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортоэфиры и полимолочная кислота. Способы получения таких составов будут очевидны специалистам в данной области. Материалы также могут быть получены коммерческим путем.

[00127] Особенно удобно составлять композиции для перорального, глазного или парентерального применения в виде единичной дозированной формы для легкости введения и однородности дозировки. Используемая в данном документе «единичная дозированная форма» относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве однократных дозировок для субъекта, подлежащего лечению; при этом каждая единица содержит предварительно заданное количество активного соединения, рассчитанное для получения необходимого терапевтического эффекта, в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Спецификация единичных дозированных форм по настоящему изобретению обусловлена и непосредственно зависит от уникальных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического эффекта, который следует достигнуть, а также от ограничений в области составления такого активного соединения для лечения индивидуумов.

[00128] Фармацевтические композиции могут быть включены в контейнер, пакет или дозатор, например, шприц, например, предварительно наполненный шприц, вместе с инструкциями по применению.

[00129] Фармацевтические композиции по настоящему изобретению охватывают любые фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или соли таких сложных эфиров, или любое другое соединение, которое после введения животному, включая человека, способно обеспечивать (непосредственно или опосредованно) его биологически активный метаболит или остаток.

[00130] Термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к физиологически и фармацевтически приемлемым солям соединений по настоящему изобретению, т. е. солям, которые сохраняют необходимую биологическую активность исходного соединения и не вызывают нежелательные токсикологические эффекты, присущие ему. Множество фармацевтически приемлемых солей известно из уровня техники и описано, например, в “Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 17-е издание, Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, USA, 1985 (и более поздние его издания), в “Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology”, 3-е издание, James Swarbrick (Ed.), Informa Healthcare USA (Inc.), NY, USA, 2007, а также в J. Pharm. Sci. 66: 2 (1977). См. также обзор подходящих солей в Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use by Stahl and Wermuth (Wiley-VCH, 2002).

[00131] Фармацевтически приемлемые соли присоединения основания образуются с металлами или аминами, такими как щелочные и щелочноземельные металлы или органические амины. Металлы, применяемые в качестве катионов, включают натрий, калий, магний, кальций и т. п. Амины предусматривают N-N’-дибензилэтилендиамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, дициклогексиламин, этилендиамин, N-метилглюкамин и прокаин (см., например, Berge et al., “Pharmaceutical Salts,” J. Pharma Sci., 1977, 66, 119). Соли присоединения основания указанных кислотных соединений получают путем приведения формы свободной кислоты в контакт с достаточным количеством необходимого основания c получением соли традиционным путем. Форма свободной кислоты может быть восстановлена путем приведения солевой формы в контакт с кислотой и выделения свободной кислоты традиционным путем. Формы свободной кислоты несколько отличаются от своих соответствующих солевых форм определенными физическими свойствами, такими как растворимость в полярных растворителях, но в остальном соли эквивалентны своей соответствующей свободное кислоте для целей настоящего изобретения.

[00132] Заявляемые полинуклеотидная кассета, вектор доставки гена, например, рекомбинантный вирус (вирионы), или клетка (например, трансдуцированную вектором доставки гена, раскрываемым в данном документе) могут быть включены в фармацевтические композиции для применения у пациентов-млекопитающих, в частности у приматов и более конкретно у людей. Заявляемые полинуклеотидная кассета, вектор доставки гена, например, вирионы, или клетка могут быть составлены в нетоксичных, инертных фармацевтически приемлемых водных носителях, предпочтительно при pH, варьирующей от 3 до 8, более предпочтительно варьирующей от 6 до 8. Такие стерильные композиции будут содержать вектор или вирион, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую терапевтическую молекулу, растворенные в водном буфере с приемлемым pH после растворения.

[00133] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, представленная в данном документе, содержит терапевтически эффективное количество клетки, вектора или вириона, раскрываемых в данном документе, в смеси с фармацевтически приемлемым носителем и/или наполнителем, например, солевым раствором, забуференным фосфатом солевым раствором, фосфатом и аминокислотами, полимерами, многоатомными спиртами, сахаром, буферами, консервантами и другими белками. Приведенными в качестве примера аминокислотами, полимерами, сахарами и т. п. являются окстилфеноксиполиэтоксиэтанольные соединения, соединения полиэтиленгликольмоностеарата, полиоксиэтиленсорбитановые сложные эфиры жирных кислот, сахароза, фруктоза, декстроза, мальтоза, глюкоза, маннит, декстран, сорбит, инозит, галактит, ксилит, лактоза, трегалоза, бычий или человеческий сывороточный альбумин, цитрат, ацетат, растворы Рингера и Хэнкса, цистеин, аргинин, карнитин, аланин, глицин, лизин, валин, лейцин, поливинилпирролидон, полиэтилен и гликоль. Предпочтительно данный состав остается стабильным на протяжении по меньшей мере шести месяцев при 4°C.

[00134] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, представленная в данном документе, содержит буфер, такой как забуференный фосфатом солевой раствор (PBS) или фосфат натрия/сульфат натрия, tris буфер, глициновый буфер, стерильная вода и другие буферы, известные рядовым специалистам в данной области, как, например, описываемые в Good et al. (1966) Biochemistry 5:467. pH буфера, в котором находится фармацевтическая композиция, содержащая подавляющий опухоль ген, содержащийся в системе доставки на основе аденовирусного вектора, может быть в диапазоне от 6,5 до 7,75, предпочтительно от 7 до 7,5 и наиболее предпочтительно от 7,2 до 7,4.

[00135] В определенных вариантах осуществления вирусные векторы могут быть составлены в любой подходящей однократной дозировке, включающей без ограничения 1 х 10^s векторных геномов или более, например, 1 х 10⁹, 1 х 10¹⁰, 1 х 10¹¹, 1 х 10¹² или 1 х 10¹³ векторных геномов или более, в определенных случаях 1 х 10¹⁴ векторных геномов, но обычно не больше 4 х 10¹⁵ векторных геномов. В некоторых случаях однократная дозировка составляет не более приблизительно 5 х 10¹⁵ векторных геномов, например, 1 х 10¹⁴ векторных геномов или менее, например 1 х 10¹³, 1 х 10¹², 1 х 10¹¹, 1 х 10¹⁰ или 1 х 10⁹ векторных геномов или менее, в определенных случаях 1 х 10⁸ векторных геномов или менее и, как правило, не меньше 1 х 10⁸ векторных геномов. В некоторых случаях однократная дозировка составляет от 1 х 10¹⁰ до 1 х 10¹¹ векторных геномов. В некоторых случаях однократная дозировка составляет от 1 х 10¹⁰ до 3 х 10¹² векторных геномов. В некоторых случаях однократная дозировка составляет от 1 х 9¹⁰ до 3 х 10¹³ векторных геномов. В некоторых случаях однократная дозировка составляет от 1 х 8¹⁰ до 3 х 10¹⁴ векторных геномов. В одном варианте осуществления диапазон составляет от приблизительно 5 х 10¹⁰ до приблизительно 1 х 10¹¹ векторных геномов. В некоторых вариантах осуществления диапазон составляет от приблизительно 1 х 10⁹ до приблизительно 1 х 10¹⁰ векторных геномов.

[00136] В некоторых случаях однократная дозировка фармацевтической композиции может быть измерена с применением множественности заражения (MOI). Под MOI подразумевают отношение или кратное число векторных или вирусных геномов к клеткам, в которые может быть доставлена нуклеиновая кислота. В некоторых случаях MOI может составлять 1 х 10⁶. В некоторых случаях MOI может составлять 1 х 10⁵ – 1 х 10⁷. В некоторых случаях MOI может составлять 1 х 10⁴ – 1 х 10⁸. В некоторых случаях рекомбинантные вирусы по настоящему изобретению характеризуются по меньшей мере приблизительно 1 х 10¹, 1 х 10², 1 х 10³, 1 х 10⁴, 1 х 10⁵, 1 х 10⁶, 1 х 10⁷, 1 х 10⁸, 1 х 10⁹, 1 х 10¹⁰, 1 х 10¹¹, 1 х 10¹², 1 х 10¹³, 1 х 10¹⁴, 1 х 10¹⁵, 1 х 10¹⁶, 1 х 10¹⁷ и 1 х 10¹⁸ MOI. В некоторых случаях рекомбинантные вирусы по настоящему изобретению характеризуются 1 х 10⁸ – 3 х 10¹⁴ MOI. В некоторых случаях рекомбинантные вирусы по настоящему изобретению характеризуются не более приблизительно 1 х 10¹, 1 х 10², 1 х 10³, 1 х 10⁴, 1 х 10⁵, 1 х 10⁶, 1 х 10⁷, 1 х 10⁸, 1 х 10⁹, 1 х 10¹⁰, 1 х 10¹¹, 1 х 10¹², 1 х 10¹³, 1 х 10¹⁴, 1 х 10¹⁵, 1 х 10¹⁶, 1 х 10¹⁷ и 1 х 10¹⁸ MOI. В некоторых вариантах осуществления диапазон составляет от приблизительно 20 до приблизительно 400 MOI.

[00137] В некоторых аспектах определенное количество фармацевтической композиции содержит от приблизительно 1 х 10⁸ до приблизительно 1 x 10¹⁵ рекомбинантных вирусов, от приблизительно 1 x 10⁹ до приблизительно 1 x 10¹⁴ рекомбинантных вирусов, от приблизительно 1 x 10¹⁰ до приблизительно 1 x 10¹³ рекомбинантных вирусов или от приблизительно 1 x 10¹¹ до приблизительно 3 x 10¹² рекомбинантных вирусов.

Способы

[00138] Как раскрывается в данном документе, заявляемые полинуклеотидные кассеты и векторы доставки гена, называемые в данном документе совместно «заявляемые композиции», находят применение в экспрессии трансгена в клетках животного. Например, заявляемые композиции могут применяться в исследовании, например, для определения эффекта, который данный ген оказывает на жизнеспособность и/или функционирование клетки. В качестве другого примера, заявляемые композиции могут применяться в медицине, например, для лечения или предупреждения заболевания или нарушения. Таким образом, в некоторых аспектах настоящего изобретения представлены способы экспрессии гена в клетках, при этом способ предусматривает приведение клеток в контакт с композицией по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт осуществляется in vitro или ex vivo. В некоторых вариантах приведение в контакт осуществляется in vivo, т. е. заявляемая композиция применяется в отношении субъекта.

[00139] В тех случаях, когда клетки млекопитающих подлежат in vitro или ex vivo приведению в контакт с заявляемыми полинуклеотидной кассетой или вектором доставки гена, содержащим заявляемую полинуклеотидную кассету, клетки могут быть получены от любого вида млекопитающих, например, грызуна (например, мышей, крыс, песчанок, белок), кролика, представителя кошачьих, представителя собачьих, козы, представителя овечьих, свиньи, лошади, представителя бычьих, примата, человека. Клетки могут происходить из стабильных клеточных линий, или они могут представлять собой первичные клетки, при этом «первичные клетки», «первичные клеточные линии» и «первичные культуры» используются в данном документе взаимозаменяемо в отношении клеток и клеточных культур, которые были получены от субъекта и росли in vitro в течение ограниченного количества пассажей, т. е. разделений культуры. Например, первичными культурами являются культуры, которые могли быть пассированы 0 раз, 1 раз, 2 раза, 4 раза, 5 раз, 10 раз или 15 раз, но не достаточное число раз для прохождения кризисной стадии. Как правило, первичные клеточные линии по настоящему изобретению поддерживают на протяжении менее 10 пассажей in vitro.

[00140] Варианты осуществления настоящего изобретения предусматривают клетки млекопитающих (например, CD34+ клетки), трансдуцированные вирусным вектором доставки, например, лентивирусным вектором, содержащим ген печеночной и эритроидной пируваткиназы (PKLR) человека. Следовательно, настоящее изобретение включает способ трансдукции клетки млекопитающего, например, гемопоэтической стволовой клетки человека или другой клетки, описываемой в данном документе, предусматривающий приведение клетки в контакт с вирусным вектором доставки, например, лентивирусным вектором, содержащим кассету экспрессии, описываемую в данном документе. В определенных вариантах осуществления клетку ранее получили от субъекта, подлежащего лечению, или от другого донора. В конкретных вариантах осуществления у субъекта диагностировали PKD и клетку трансдуцировали LV, содержащим кассету экспрессии, кодирующую пируваткиназу, например, кодон-оптимизированную область или кДНК, кодирующие RPK. Следует понимать, что раскрываемые способы, например, применяемые для доставки субъекту продукта гена пируваткиназы, например, с применением последовательности кДНК coPRK, также могут применяться для лечения гемолитической анемии и/или нормализации дифференцировки эритроидных клеток, повышения числа функциональных зрелых эритроцитов, снижения экстрамедуллярного эритропоэза, уменьшения спленомегалии и других вторичных эффектов гемолитической анемии или PKD.

[00141] Для обеспечения экспрессии трансгена заявляемые полинуклеотидная кассета или вектор доставки гена, содержащий заявляемую полинуклеотидную кассету, будут приводить в контакт с клетками в течение от приблизительно 30 минут до 24 часов или более, например, 1 час, 1,5 часа, 2 часа, 2,5 часа, 3 часа, 3,5 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 12 часов, 16 часов, 18 часов, 20 часов, 24 часа и т. д.

[00142] Заявляемые полинуклеотидная кассета или вектор доставки гена, содержащий заявляемую полинуклеотидную кассету, могут применяться в отношении заявляемых клеток один раз или более, например, один раз, два раза, три раза или более трех раз, и клетки оставляют инкубироваться клеток со средством(ами) в течение некоторого количества времени после каждого события приведения в контакт, например, в течение 16-24 часов, после чего среду замещают на свежую среду и клетки культивируют далее. Приведение клеток в контакт может происходить в любой культуральной среде и при любых условиях культивирования, которые обеспечивают выживание клеток. Культура может содержать ростовые факторы, к которым клетки чувствительны. Ростовые факторы, как определяется в данном документе, представляют собой молекулы, способные обеспечивать выживание, рост и/или дифференцировку клеток либо в культуре, либо в интактной ткани за счет специфических эффектов в отношении трансмембранного рецептора. Ростовые факторы включают полипептиды и факторы, отличные от полипептидов.

[00143] Как правило, для осуществления экспрессии трансгена в клетках применяют эффективное количество заявляемых полинуклеотидной кассеты или вектора доставки гена, содержащего заявляемую полинуклеотидную кассету. Как обсуждалось в другом месте настоящего документа, эффективное количество можно легко определить эмпирически, например, путем выявления присутствия или уровней трансгенного продукта гена, путем выявления эффекта в отношении жизнеспособности или функционирования клеток и т. д. Как правило, эффективное количество заявляемых полинуклеотидной кассеты или вектора доставки гена, содержащего заявляемую полинуклеотидную кассету, будет обеспечивать более высокую экспрессию трансгена в клетках, чем то же количество полинуклеотидной кассеты, известной из уровня техники. Как правило, экспрессия будет 2-кратной или более усиленной по сравнению с экспрессией за счет эталонной или контрольной полинуклеотидной кассеты, например, известной из уровня техники, например, 3-кратной, 4-кратной или 5-кратной или более, в некоторых случаях 10-кратной, 20-кратной или 50-кратной или более, например 100-кратной.

[00144] В тех случаях, когда клетки подлежат in vivo приведению в контакт с заявляемыми полинуклеотидной кассетой или вектором доставки гена, содержащим заявляемую полинуклеотидную кассету, субъектом может быть любое млекопитающее, например, грызун (например, мыши, крысы, песчанки), кролик, представитель кошачьих, представитель собачьих, коза, представитель овечьих, свинья, лошадь, представитель бычьих или примат. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления примат представляет собой человека. В дополнительном варианте осуществления клетки представляют собой CD34+ клетки.

[00145] Способы и композиции по настоящему изобретению находят применение, например, в лечении недостаточности пируваткиназы.

[00146] В другом варианте осуществления настоящее изобретение включает способ лечения заболевания у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающий введение субъекту эффективного количества клеток, трансдуцированных вектором доставки гена, например, вирусным вектором, который экспрессирует терапевтический продукт гена в клетках. В конкретных вариантах осуществления клетки являются аутологическими по отношению к субъекту. В определенных вариантах осуществления клетки представляют собой эритроидные клетки, например, гемопоэтические стволовые клетки или коммитированные гемопоэтические эритроидные клетки-предшественники. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку костного мозга, например, клетку костного мозга, подвергнутую деплеции по линии дифференцировки. В конкретных вариантах осуществления способ применяют для лечения PKD, а вирусный вектор представляет собой LV, содержащий конструкцию экспрессии, раскрываемую в данном документе, содержащую промотор гена PGK человека, функционально связанный с кодон-оптимизированной кДНК или кодирующей последовательностью гена PKLR человека, и мутантный Wpre, раскрываемый в данном документе. В конкретных вариантах осуществления клетки вводят субъекту парентерально, например, путем внутривенной инъекции.

[00147] В другом варианте осуществления настоящее изобретение включает способ лечения PKD у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающий введение субъекту эффективного количества аутологических C34+ стволовых клеток, трансдуцированных лентивирусным вектором, который экспрессирует кодон-оптимизированную кДНК PKLR в клетках, где лентивирусный вектор содержит промотор гена PGK человека, функционально связанный с кодон-оптимизированной кДНК или кодирующей последовательностью PKLR человека, и мутантную последовательность Wpre, раскрываемую в данном документе. В конкретных вариантах осуществления клетки представляют собой гемопоэтические стволовые клетки или коммитированные гемопоэтические эритроидные клетки-предшественники, например, клетки костного мозга. В конкретных вариантах осуществления клетки вводят субъекту парентерально, например, путем внутривенной инъекции.

[00148] В другом варианте осуществления настоящего изобретения представлено лечение заболевания у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающее введение субъекту эффективного количества вектора доставки гена, например, вирусного вектора, который экспрессирует терапевтический продукт гена у субъекта. В конкретных вариантах осуществления способ применяют для лечения PKD, а вирусный вектор представляет собой LV, содержащий конструкцию экспрессии, раскрываемую в данном документе, содержащую промотор гена PGK человека, функционально связанный с кодон-оптимизированной кДНК или кодирующей последовательностью гена PKLR человека, и мутантный Wpre, раскрываемый в данном документе. В конкретных вариантах осуществления вектор доставки гена вводят субъекту парентерально, например, путем внутривенной инъекции.

[00149] В конкретных вариантах осуществления клетки или векторы доставки гена вводят субъекту в фармацевтических композициях.

[00150] В некоторых вариантах осуществления заявляемые способы приводят к терапевтической пользе, например, предотвращению развития нарушения, прекращению прогрессирования нарушения, обращению прогрессирования нарушение и т. д. В некоторых вариантах осуществления заявляемый способ предусматривает стадию выявления того, что терапевтическая польза была достигнута. Рядовому специалисту в данной области будет понятно, что такие измерения терапевтической эффективности будут подходить к конкретному заболеванию, подлежащему модифицированию, и ему будут известны соответствующие способы выявления, чтобы применять их в измерении терапевтической эффективности.

[00151] Ожидается, что экспрессия трансгена с применением заявляемого трансгена является надежной. Следовательно, в некоторых случаях экспрессию трансгена, например, выявляемую путем измерения уровней продукта гена, путем измерения терапевтической эффективности и т. д., можно наблюдать через два месяца или менее после введения, например, через 4, 3 или 2 недели или менее после введения, например, через 1 неделю после введения заявляемой композиции. Также ожидается, что экспрессия трансгена сохраняется со временем. Следовательно, в некоторых случаях экспрессию трансгена, например, выявляемую путем измерения уровней продукта гена, путем измерения терапевтической эффективности и т. д., можно наблюдать в течение 2 месяцев или более после введения заявляемой композиции, например, в течение 4, 6, 8 или 10 месяцев или более, в некоторых случаях в течение 1 года или более, например, в течение 2, 3, 4 или 5 лет, в определенных случаях в течение больше 5 лет.

[00152] В определенных вариантах осуществления способ предусматривает стадию выявления экспрессии трансгена в клетках или у субъекта, где экспрессия усилена по сравнению с экспрессией за счет полинуклеотидной кассеты, не содержащей один или более улучшенных элементов по настоящему изобретению. Как правило, экспрессия будет 2-кратной или более усиленной по сравнению с экспрессией за счет эталонной, т. е. контрольной, полинуклеотидной кассеты, например, известной из уровня техники, например, 3-кратной, 4-кратной или 5-кратной или более, в некоторых случаях 10-кратной, 20-кратной или 50-кратной или более, например, 100-кратной, доказательством чего служит, например, более ранее выявление, более высокие уровни продукта гена, более сильное функциональное воздействие на клетки и т. д.

[00153] Как правило, если заявляемая композиция представляет собой LV, содержащий заявляемую полинуклеотидную кассету по настоящему изобретению, то эффективное количество для достижения изменения будет составлять приблизительно 1 х 10⁸ векторных геномов или более, в некоторых случаях 1 х 10⁹, 1 х 10¹⁰, 1 х 10¹¹, 1 х 10¹² или 1 х 10¹³ векторных геномов или больше, в определенных случаях 1 х 10¹⁴ векторных геномов или более, и обычно не больше 1 х 10¹⁵ векторных геномов. В некоторых случаях количество векторных геномов, которое доставляется, составляет не более приблизительно 1 х 10¹⁵ векторных геномов, например, 1 х 10¹⁴ векторных геномов или менее, например, 1 х 10¹³, 1 х 10¹², 1 х 10¹¹, 1 х 10¹⁰ или 1 х 10⁹ векторных геномов или менее, в определенных случаях 1 х 10⁸ векторных геномов и, как правило, не меньше 1 х 10⁸ векторных геномов. В некоторых случаях количество векторных геномов, которое доставляется, составляет от 1 х 10¹⁰ до 1 х 10¹¹ векторных геномов. В некоторых случаях количество векторных геномов, которое доставляется, составляет от 1 х 10¹⁰ до 3 х 10¹² векторных геномов. В некоторых случаях количество векторных геномов, которое доставляется, составляет от 1 х 10⁹ до 3 х 10¹³ векторных геномов. В некоторых случаях количество векторных геномов, которое доставляется, составляет от 1 х 10⁸ до 3 х 10¹⁴ векторных геномов.

[00154] В некоторых случаях количество фармацевтической композиции, подлежащей введению, может быть измерено с применением множественности заражения (MOI). В некоторых случаях MOI может означать отношение или кратное число векторных или вирусных геномов к клеткам, в которые может быть доставлена нуклеиновая кислота. В некоторых случаях MOI может составлять 1 х 10⁶. В некоторых случаях MOI может составлять 1 х 10⁵ – 1 х 10⁷. В некоторых случаях MOI может составлять 1 х 10⁴ – 1 х 10⁸. В некоторых случаях рекомбинантные вирусы по настоящему изобретению характеризуются по меньшей мере приблизительно 1 х 10¹, 1 х 10², 1 х 10³, 1 х 10⁴, 1 х 10⁵, 1 х 10⁶, 1 х 10⁷, 1 х 10⁸, 1 х 10⁹, 1 х 10¹⁰, 1 х 10¹¹, 1 х 10¹², 1 х 10¹³, 1 х 10¹⁴, 1 х 10¹⁵, 1 х 10¹⁶, 1 х 10¹⁷ и 1 х 10¹⁸ MOI. В некоторых случаях рекомбинантные вирусы по настоящему изобретению характеризуются 1 х 10⁸ – 3 х 10¹⁴ MOI. В некоторых случаях рекомбинантные вирусы по настоящему изобретению характеризуются не более приблизительно 1 х 10¹, 1 х 10², 1 х 10³, 1 х 10⁴, 1 х 10⁵, 1 х 10⁶, 1 х 10⁷, 1 х 10⁸, 1 х 10⁹, 1 х 10¹⁰, 1 х 10¹¹, 1 х 10¹², 1 х 10¹³, 1 х 10¹⁴, 1 х 10¹⁵, 1 х 10¹⁶, 1 х 10¹⁷ и 1 х 10¹⁸ MOI.

[00155] В некоторых аспектах определенное количество фармацевтической композиции содержит от приблизительно 1 х 10⁸ до приблизительно 1 x 10¹⁵ частиц рекомбинантных вирусов, от приблизительно 1 x 10⁹ до приблизительно 1 x 10¹⁴ частиц рекомбинантных вирусов, от приблизительно 1 х 10¹⁰ до приблизительно 1 х 10¹³ частиц рекомбинантных вирусов или от приблизительно 1 x 10¹¹ до приблизительно 3 x 10¹² частиц рекомбинантных вирусов.

[00156] В отношении млекопитающего может применяться любое общее число вирусных частиц, подходящее для достижения соответствующей трансдукции клеток, чтобы обеспечить необходимый эффект или лечение заболевания. В разных предпочтительных вариантах осуществления инъецируют по меньшей мере 10⁸; 5 х 10⁸; 10⁹; 5 x 10⁹, 10¹⁰, 5 х 10¹⁰; 10¹¹; 5 x 10¹¹; 10¹²; 5 х 10¹²; 10¹³; 1,5 x 10¹³; 3 х 10¹³; 5 х 10¹³; 7,5 х 10¹³; 9 х 10¹³, 1 x 10¹⁴ вирусных частиц или 5 x 10¹⁴ вирусных частиц или более, но, как правило, не больше 1 х 10¹⁵ вирусных частиц. Можно осуществлять любое подходящее число применений вектора в отношении млекопитающего или глаза примата. В одном варианте осуществления способы предусматривают однократное применение; в других вариантах осуществления осуществляют многократные применения за период времени, который лечащий врач считает соответствующим. В некоторых вариантах осуществления при однократном введении (24-часовая трансдукция) требуется по меньшей мере 2 x 10⁸ VG/мл в 5 x 10⁵ клеток/мл, чтобы получить высокие эффективности трансдукции.

[00157] Как правило, в состав индивидуальных доз входит количество, которое не меньше количества, необходимого для осуществления измеримого эффекта на субъект, и они могут быть определены на основании показателей фармакокинетики и фармакологии в отношении абсорбции, распределения, метаболизма и выведения (“ADME”) заявляемой композиции или ее побочных продуктов и, таким образом, на основании этапов фармакокинетики в субъекте. Это включает рассмотрение пути введения, а также величину дозировки. Эффективные количества дозы и/или схему введения доз можно легко определить эмпирически на основании доклинических анализов, из испытаний по безопасности и по повышению и диапазону доз, индивидуальных взаимоотношений лечащего врача и пациента, а также in vitro и in vivo анализов, таких как описываемые в данном документе и проиллюстрированные в примерах.

[00158] Некоторые аспекты настоящего изобретения описаны в данном документе со ссылкой на типичные пути применения для иллюстрации. Следует учитывать, что многочисленные специфические подробности, взаимосвязи и способы изложены для обеспечения полного понимания настоящего изобретения. Однако рядовой специалист в данной области без усилий поймет, что настоящее изобретение может быть осуществлено на практике без одной или более специфических подробностей или с помощью других способов. Настоящее изобретение не ограничивается проиллюстрированным порядком действий или событий, поскольку некоторые действия могут осуществляться в другом порядке и/или одновременно с другими действиями или событиями. Кроме того, не все проиллюстрированные действия или события необходимы для реализации методов в соответствии с настоящим изобретением.

[00159] Кроме того, следует отметить, что пункты формулы изобретения могут быть составлены с исключением любого необязательного элемента. В связи с этим, данное заявление предназначено для использования в качестве ранее упомянутого основания для применения такой исключающей терминологии, как «исключительно», «только» и т. п., в отношении изложения заявляемых элементов или для применение «отрицательного» ограничения.

[00160] Публикации, обсуждаемые в данном документе, представлены исключительно для их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничто в настоящем документе не должно толковаться как признание того, что настоящее изобретение не имеет права датировать такую публикацию задним числом ввиду предшествующего изобретения. Кроме того, представленные даты публикации могут отличаться от фактических дат публикации, которые, возможно, необходимо будет подтвердить независимо.

[00161] Все вышеупомянутые патенты США, публикации заявок на патент США, заявки на патент США, иностранные патенты, заявки на иностранные патенты и непатентные публикации, упомянутые в настоящем описании и/или перечисленные в информационном листке заявки, включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте, например, для раскрытия и описания способов и/или материалов, в связи с которыми данные публикации цитируются. Следует учитывать, что настоящее раскрытие заменяет любое раскрытие включенной публикации в тех случаях, когда имеется противоречие.

[00162] Из вышесказанного будет понятно что, хотя в иллюстративных целях в данном документе описаны конкретные варианты осуществления настоящего изобретения, могут быть выполнены различные модификации без отступления от идеи и объема настоящего изобретения. Соответственно, изобретение не ограничивается ничем, кроме прилагаемой формулы изобретения.

ПРИМЕРЫ

[00163] Следующие примеры приведены, чтобы предоставить рядовым специалистам в данной области полное раскрытие и описание вариантов осуществления и применения настоящего изобретения, и они не предназначены для ограничения объема того, что авторы настоящего изобретения считают своим изобретением, и не предполагается, что эксперименты, приведенные ниже, являются всеми или единственными выполненными экспериментами. Были приложены усилия для обеспечения точности с точки зрения используемых чисел (например, количеств, температуры и т.д.), но следует учитывать некоторые экспериментальные ошибки и отклонения. Если не указано иное, части представляют собой части по весу, молекулярная масса представляет собой средневесовую молекулярную массу, температура представлена в градусах Цельсия, а давление является атмосферным или близким к атмосферному.

Экспериментальные способы

[00164] Получение векторов и супернатанта, содержащего лентивирус. LV получали, как описано в данном документе. Последовательность coRPK конструировали с применением программного обеспечения GeneArt® с повышением содержания GC в последовательности и предупреждением криптических сайтов сплайсинга. Векторы разрабатывали с применением конструкции pCCL.sin.ppt.hPGK-EGFP-Wpre* в качестве остова, великодушно предоставленной др. Налдини (HSR-TIGET, San Raffaele Telethon Institute, Милан, Италия). Исходный векторный материал в виде LV, псевдотипированных VSV-G, получали с помощью опосредованной фосфатом кальция трансфекции 3-плазмидами клеток 293T (ATCC: CRL-1573, Роквилл, Мэриленд, США), как описано ранее [Follenzi A, et al. (2000). Nat Genet 25: 217-222]. Титры инфекционных LV определяли в клетках HT1080 (ATCC: CCL-121) с помощью кПЦР, как описано в другом месте [Charrier S, et al. (2005). Gene Ther 12: 597-606]. Исходный лентивирусный материал с титрами 10⁷-10⁸ вирусных частиц (vp)/мл получали традиционным образом.

[00165] Очистка и трансдукция HSC мыши. BM от 8-14-недельных самцов мышей с PKD собирали из костей ноги и клетки негативные по линии дифференцировки (Lin^-) очищали с применением набора Lin^- Cell Depletion (Miltenyi Biotec, Гладбах, Германия) с получением 70-90% чистоты. Клетки Lin^- предварительно стимулировали с помощью 100 нг/мл рекомбинантного IL-11 человека (Peprotech EC Ltd., Лондон, Великобритания) и 100 нг/мл рекомбинантного SCF мыши (R&D Systems Inc., Миннеаполис, Миннесота) в среде IMDM-Glutamax, дополненной 20% FBS и 0,5% антибиотиков (50 ед./мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс), в течение 24 часов, а затем трансдуцировали LV, несущими EGFP или coRPK, в двух циклах трансдукции при MOI 1-10 vp/клетка. Каждую трансдукцию выполняли в течение 24 часов в присутствии вышеупомянутых цитокинов на планшетах, предварительно покрытых фрагментом фибронектина CH-296 (2 мкг/см²; Retronectin, TakaraShuzo, Оцу, Япония) на протяжении ночи при 4°C.

[00166] In vivo выживание RBC. Подвергнутым трансплантации мышам, несущим трансген coRPK, инъецировали с помощью трех последовательных внутривенных инъекций (с интервалом 12 ч) натриевую соль биотин-3-сульфо-N-гидроксисукцинимидного сложного эфира (50 мг/кг) (Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури). Через двенадцать часов после последней инъекции кровь собирали из хвостовой вены и метили ее с помощью 2 мкг/мл антитела к Ter119 мыши, конъюгированного с PE (BD Bioscience, Сан-Хосе, Калифорния), и стрептавидина, конъюгированного с FITC (50 мкг/мл, BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния), в течение 30 минут при 4°C. Образцы анализировали на проточном цитометре EPICS XL (Beckman Coulter, Брея, Калифорния) каждые 2-4 суток в течение 40 суток после инъекции. Показатели кинетики выживания RBC измеряли по процентной доле биотинилированных клеток в пределах общей популяции RBC.

[00167] Анализ CFC. Анализ CFC выполняли на BM и селезенке от контрольных мышей и мышей, подвергнутых трансплантации, в соответствии с процедурой изготовителя среды Methocult GF M3434 (Stem Cell Technologies, Ванкувер, Канада). Клетки BM собирали в разные моменты времени после трансплантации от всех групп мышей и КОЕ (кластеры из 30 или более клеток) оценивали через 7 суток после посева с помощью микроскопа Nikon Diaphot-TMD.

[00168] Идентификация гемопоэтических линий дифференцировки. PBMC получали из хвостовой вены животных, подвергнутых трансплантации, и метили с помощью панели антител для выявления различных гемопоэтических клеток. Миелоидные клетки выявляли с помощью биотинилированных антител к GR-1 и Mac-1 (BD Bioscience, Сан-Хосе, Калифорния, 5 мкг/мл), тогда как лимфоидные клетки выявляли с применением антитела к CD3, конъюгированного с PE, в случае T-клеток и антитела к B220, конъюгированного с PE, и антитела к B220, конъюгированного с PECy5, в случае B-клеток (BD Bioscience, Сан-Хосе, Калифорния, 10 мкг/мл) вместе со вторичным антителом SAV-TRC (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс). Образцы анализировали на цитометре BD LSR Fortessa (BD Bioscience, Сан-Хосе, Калифорния, CIF) c добавлением DAPI (Boehringer, Ингельхайм, Германия, 2 мкг/мл), чтобы исключить мертвые клетки.

[00169] Структурные и гистологические исследования. Селезенки собирали, фотографировали и взвешивали на прецизионных весах для определения наличия спленомегалии. Гистологические исследования выполняли на срезах селезенки и печени, полученных путем выполнения традиционных гистологических способов и окрашенных гематоксилином (гематоксилин Gill-2, Thermo, Питтсбург, США) и эозином (спиртовой раствор эозина, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс). Также исследовали отложения железа в селезенке с помощью окрашивания берлинской лазурью или окраски по Перлсу (Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури) согласно инструкциям изготовителя. Все срезы просматривали с применением светового микроскопа Olympus BX40 и фотографировали камерой Olympus DP21 с конечным увеличением 100x или 200x.

[00170] Дифференцировка эритроидных клеток. Анализ с применением проточной цитометрии интенсивности маркеров Ter119 и CD71 в BM и селезенке использовали для идентификации разных субпопуляций эритроидных клеток, как описано в другом месте [Socolovsky M, et al. (2001). Blood 98: 3261-3273], с применением 4 мкг/мл антитела к Ter119 мыши, конъюгированного с PE (BD Bioscience, Сан-Хосе, Калифорния), 10 мкг/мл биотинилированного антитела к CD71 (BD Bioscience, Сан-Хосе, Калифорния) и стрептавидина, конъюгированного с Tricolor (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс). Затем клетки анализировали на проточном цитометре EPICS XL (Beckman Coulter, Брея, Калифорния) с применением йодида пропидия (IP, 2 мкг/мл) для выявления живых клеток.

[00171] Количественная оценка провируса. Выявление и количественную оценку интегрированного провируса на клетку выполняли с применением праймеров, комплементарных упаковывающей провирусной последовательности (ψ) и гену «домашнего хозяйства» Titin мыши. Образцы общего BM и периферической крови собирали периодически и геномную ДНК выделяли из содержащих ядро клеток с применением набора DNeasy Blood & Tissue (Qiagen, Venlo, Лимбург, Нидерланды). От двадцати до 50 нг геномной ДНК (гДНК) подвергали амплификации с помощью мультиплексной кПЦР с применением системы для ПЦР в режиме реального времени 7500 Fast (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс), а также праймеров и зондов, описанных ранее [Charrier S, et al. (2011). Gene Ther 18: 479-487].

[00172] Химеризм. Присутствие клеток донора количественно оценивали путем выявления с помощью кПЦР гена SRY на Y хромосоме и гена «домашнего хозяйства» β-актина мыши. Использовали праймеры и зонды, описанные ранее [Navarro S et al (2006). Mol Ther 14: 525-535], и геномную ДНК из PB мышей, подвергнутых трансплантации, амплифицировали с применением системы для ПЦР в режиме реального времени 7500 Fast (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс). Стандартные кривые получали с применением экстрактов гДНК из образцов, содержащих от 0% до 100% клеток BM из смеси клеток от самцов/самок мышей, и химеризм рассчитывали как: % приживления донорских клеток = 100 х 2(^{число β-актин - число SRY}).

[00173] Процедура LAM-PCR. Чтобы идентифицировать сайты интеграции вектора места соединений 3’-LTR вектора-геном амплифицировали с помощью LAM-PCR согласно способу, опубликованному Schmidt et al. 2007 [Nat Methods 4: 1051-1057]. Начальную линейную амплификацию (100 циклов) выполняли с применением биотинилированных LTR специфических праймеров и до 100 нг гДНК в качестве матрицы. Продукты линейной амплификация очищали с применением покрытых стрептавидином магнитных гранул, а далее следовал синтез комплементарной нити, параллельное расщепление 2 разными ферментами рестрикции (Tsp509I и HpyCH4IV) и две реакции лигирования с применением линкерных кассет, комплементарных концам, оставленным после разрезания ферментом. Полученные фрагменты амплифицировали с помощью двух дополнительных стадий экспоненциальной ПЦР. Продукты LAM-PCR отделяли и количественно оценивали с помощью гель-электрофореза на автоматизированной системе MultiNA (Shimadzu).

[00174] Подготовка продуктов LAM-PCR для секвенирования с помощью Illumina MiSeq. Согласно способу, опубликованному Parazynski et al [Paruzynski A, et al. (2010). Nat Protoc 5: 1379-1395], 40 нг продуктов второй экспоненциальной ПЦР, полученных за счет ферментов Tsp509I и HpyCH4IV, повторно амплифицировали с применением перекрывающихся праймеров, содержащих специфические последовательности, которые обеспечивают секвенирование спаренных концов на секвенаторе Illumina MiSeq. Образцы LAM-PCR адаптировали для 454-пиросеквенирования с помощью ПЦР с перекрывающимися праймерами путем добавления адаптеров Roche 454 GS-FLX: адаптер A вместе с 8-нуклеотидным штрих-кодом добавляли на LTR-конец ампликона, полученного в LAM-PCR; адаптер В добавляли со стороны линкерной кассеты. Конечный ампликон в 5’-3’ ориентации составляли следующим образом: адаптер A, штрих-код, последовательность LTR, неизвестная геномная последовательность, последовательность линкерной кассеты и праймер B. Очищенные продукты ПЦР с перекрывающимися праймерами прогоняли и количественно оценивали на автоматизированной электрофоретической системе MultiNA и объединяли, чтобы получить конечную эквимолярную библиотеку из 10 нM. Затем конечную библиотеку повторно оценивали количественно с применением набора для количественной оценки библиотек КАРА для платформы секвенирования Illumina (Кара Biosystems, Вилмингтон, Массачусетс) на системе ПЦР в режиме реального времени Viia7 (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс) с получением подсчитанной концентрации, составляющей 16,35 нM. Наконец, библиотеки секвенировали с применением набора реагентов Illumina MiSeq.

[00175] Биоинформатический анализ. Для выделения сайтов интеграции (IS) вектора из высокопроизводительной платформы секвенирования, как Roche 454, так и Illumina MiSeq/HiSeq, разработали технологический процесс, собирающий в качестве ввода необработанные данные (как правило, в формате файла FastQ), с получением перечня надежных IS и ближайшего гена. Анализы более высоких уровней в отношении количественной оценки обилия клонов и обогащения генной онтологии выполняли с применением Excel, GraphPad Prism (TM) и инструментов, доступных онлайн.

[00176] Обработка данных NGS и использование технологического процесса. Стадия обработки данных NGS связана с управлением данными из высокопроизводительной платформы секвенирования Illumina MiSeq и направлена на идентификацию IS, при которой все допустимые риды последовательности выравниваются с эталонным геномом. Обработка данных предусматривает два основных процесса. 1. Проверка и анализ качества данных, при котором обрезаются последовательности лентивирусного вектора и другие контаминанты. 2. Идентификация сайта интеграции, при котором все допустимые риды последовательности выравниваются с эталоном и отыскиваются допустимые IS.

[00177] Анализ качества данных. Чтобы идентифицировать IS на основании необработанных данных Illumina MiSeq, разрабатывали биоинформатический технологический процесс. Стандартные продукты LAM-PCR содержат последовательность LTR, фланкирующую геномную последовательность человека и последовательность линкерной кассеты (LC). 459-технология позволила получить последовательности LAM-PCR с длиной, варьирующей от 10 п. о. до 900 п. о. Аналогичные результаты получали за счет ридов спаренных концов Illumina MiSeq. Данные ограничения длины являются важными параметрами для рассмотрения в процессе анализа качества, поскольку они влияют как на последующую процедуру выравнивания, так и на алгоритм идентификации компонентов вектора. Отбрасывали последовательности, которые были слишком короткими, чтобы быть правильно выровнены с эталонным геном, а также те, которые превышали максимальный размер, достигаемый с помощью технологии NSG, чтобы избежать пропуска части или всей последовательности LC. Как только технологический процесс для каждого пула заканчивался, все сайты интеграции собирали как в файлы (заархивированные в хранилище прикрепленных файлов сети TIGET -NAS-), так и во внутренней базе данных и хранили на сервере хранения, который отслеживает модифицированные копии.

[00178] Идентификация сайтов интеграции. Чтобы идентифицировать уникальные сайты интеграции и извлечь файл Excel со всеми IS в рядах и каждым образцом в колонках (матрица IS) с аннотациями ближайшего гена, выполняли следующие стадии. 1. Создание матрицы IS с применением программы, называемой create matrix, позволяющей осуществлять выявления конфликтов между проектами. Эта программа будет создавать файл с разделением знаками табуляции (TSV). 2. Аннотирование файла матрицы IS с применением программы annotate bed, в файл, который будет называться следующим образом для каждого пула с применением вводного файла TSV: awk '{print”chr”$1”\t”$2”\t”$2}' TSV_FILE\tail-n+2> TSV_FILE.bed; annotate bed-a/opt/genome/mouse/mm9/annotation/mm9.refGene. TIGET. gtf -b TSV_FILE.bed -o TSV_FILE.annotated.bed. 3. Импорт как аннотированного файла, так и файла матрицы в новый рабочий лист Excel, называемого в данном случае XLS.

[00179] Выявление конфликтов. Чтобы получить надежный набор данных IS от каждой мыши, подвергнутой трансплантации, фильтровали данные потенциальных контаминаций/конфликтов и ложноположительных результатов на основании числа последовательностей. Для объединения сайтов интеграции, полученных в результате различных экспериментов, требовалась дополнительная стадия нормализации данных.

[00180] Термин «конфликт» используют для идентификации наличия идентичных IS в независимых образцах. В условиях проведения эксперимента по настоящему изобретению интеграция вектора в то же самое геномное положение в разных клетках является событием с очень низкой вероятностью. Таким образом, выявление идентичных IS в независимых образцах, вероятно, происходит вследствие контаминации, которая может происходить на разных стадиях влажных лабораторных процедур (очистка образцов, экстракция ДНК, LAM-PCR и секвенирование). Хотя технологический процесс настоящего изобретения разработан для минимизации возникновения контактов между образцами, высокопроизводительный анализ IS по своей природе несет определенную степень фоновой контаминации. Идентификация степени контаминации между образцами имеет решающее значение также потому, что получение одного и того же IS в разных образцах, полученных от одной и той же мыши, используют на следующих стадиях для вывода о биологических свойствах маркированных вектором гемопоэтических клеток (т. е. способность к дифференцировке во множественные линии и устойчивая клоногенная активность). Таким образом, должна существовать возможность отличать действительное появление одного и того же IS в разных образцах (от одной и той же мыши) от контаминации/конфликта. Чтобы решить эти проблемы, в качестве способа измерения степени конфликта в анализах настоящего изобретения среди образцов, полученных из разных тестируемых объектов и мышей, оценивали степень общих IS, а затем разрабатывали правила отбрасывания из набора данных каждой мыши тех IS, которые могут быть отнесены к конфликту, и минимизировали вероятности подсчета ложноположительных результатов при поиске общего IS между образцами от одной и той же мыши. Авторы настоящего изобретения разработали процесс выявления конфликтов, обеспечивающий возможность валидации каждого локуса интеграции. Общий результат будет заключаться в следующем, если имеется набор I локусов интеграции, в случае классификации локуса интеграции i в I как конфликта, i отбрасывается из I. Авторы настоящего изобретения применяли процесс выявления конфликтов между 3 независимыми группами трансплантации. 1. coPKR170: мыши из анализа 1, умерщвленные через 170 суток после трансплантации клеток Lin^-, трансдуцированных экспрессирующим coRPK LV-вектором (coRPK 1-3). 2. EGFP: мыши из анализа 2, подвергнутые трансплантации клеток Lin^-, несущих экспрессирующий EGFP LV-вектор (EGFP 1-6). 3. coPKR-TC: мыши из анализа 2, подвергнутые трансплантации клеток Lin^-, трансдуцированных экспрессирующим coPKR LV-вектором (coRPK 1-14), кровь и BM которых анализировали в разные моменты времени, включая вторичных реципиентов, подвергнутых трансплантации с помощью объединенного BM от подгруппы мышей, подвергнутых первичной трансплантации (coRPK 11-14).

[00181] Каждый идентичный IS имеет разные риды последовательности (число последовательностей) у разных мышей. Число последовательностей можно применять для определения того, являются ли образцы от одной мыши контаминированными образцами другой мыши, на основании критерия обилия. Согласно данному принципу интеграция, обнаруженная у двух мышей, будет приписана мыши, у которой показано самое высокое обилие, в то время как у другой мыши она будет рассматриваться как контаминант. Следовательно, можно было идентифицировать порог числа отличающихся последовательностей, который позволяет приписать данный конфликт мыши и удаление его у других. Авторы получили пороговое значение на основе данных настоящего изобретения с получением значения, составляющего 10, что означает, что для каждого IS среди всех TI, если IS имеет значение обилия (процентная доля отношения числа последовательностей) в 10 раз ниже, чем самое высокое значение обилия (процентная доля числа последовательностей) других TI, то его отбрасывают из текущего TI. Авторы настоящего изобретения применяли данные правила в отношении как TI, так и выбранных групп, и файлы Excel использовали для вычисления выявления конфликтов путем применения следующих правил (здесь подробно описана фильтрация TI, но это также распространяется и на фильтрацию групп). 1. Выделение каждого TI, группировка всех образцов одного и того же TI вместе путем суммирования числа последовательностей. 2. Для трех полученных TI, для каждого IS рассчитать процентную долю числа последовательностей IS в зависимости от общей суммы ридов для TI. 3. Затем применение следующего правила для расчета стадии принятия решения с пороговым значением 10, что обеспечивает присвоение каждого IS надежному TI.

[00182] После выявления IS, подлежащего удалению, риды этого IS удаляли из группы так, что он не будет приписываться также этой группе. Фильтр, описанный выше, применяли у мышей, подвергнутых трансплантации различных популяций ex-vivo трансдуцированных клеток (одна когорта экспрессирующих EGFP мышей из анализа 2 и две когорты мышей coPKR, принадлежащие к двум независимым экспериментам по трансплантации). Более того, для группы coPKR-TC (анализ 2) описанный выше метод фильтрации модифицировали двумя путями: a) для лучшего различения совместного присутствия интеграций в разные моменты времени в контексте анализа обилия клонов авторы настоящего изобретения добавили следующее правило: если одна интеграция является общей у одной или более мышей, то интеграция будет сохраняться для всех моментов времени, даже если число последовательностей для нее составляет меньше 10% от максимального числа последовательностей среди мышей; b) для взаимосвязей при отслеживании линии дифференцировки авторы настоящего изобретения применяли более строгий фильтр путем исключения IS с числом последовательностей менее 3 и 10%-ный фильтр числа последовательностей для совместного присутствия в разные моменты времени. Это означает, что интеграция, общая для двух моментов времени, будет сохраняться или отбрасываться только в том случае, если она больше или меньше другой соответственно.

[00183] Анализ генной онтологии. Все анализы генной онтологии осуществляли с применением программного обеспечения GREAT в режиме онлайн (http://bejerano.stanford.edu/great/public/html/). Веб-страница позволяет загружать геномные координаты интеграций из каждого набора данных и вычисляет уровни обогащения в тестируемом наборе данных путем сопоставления информации о положении (на основании анализа биномиального распределения для вычислений p-значения) и аннотированной функции генов, ближайших к сайтам интеграции (на основании анализа гипергеометрического распределения для вычислений р-значения) [Groeschel S, et al. (2011). J Inherit Metab Dis 34: 1095-1102]. Для анализа обогащения из базы данных генной онтологии выбирали биологические процессы и молекулярные функции. В случае обоих статистических анализов рассматривали только классы генов с уровнем ложноположительных результатов <0,05 (фиг. 20).

[00184] Хранение данных. Все данные, как необработанные данные, так и результаты, хранятся в хранилище прикрепленных файлов сети TIGET (NAS) в корневой папке, в которой доступны все выравнивания из технологического процесса, а также матрица обилия и графики. Хранилище NAS защищено политиками аутентификации и авторизации, и оно было построено на надежной и масштабируемой инфраструктуре с применением резервного массива дисковой памяти RAID 5 и подлежит резервному копированию на программном обеспечении настоящего изобретения CrashPlan, зарегистрированном в TIGET.

Пример 1

Терапевтический лентивирусный вектор с PGK-coRPK приводит к стабильной и долгосрочной коррекции фенотипа анемии у мышей с PKD, подвергнутых генетической коррекции

[00185] In vivo эффективность LV с PGK-coRPK (фиг. 2a) анализировали путем трансдукции и трансплантации клеток BM, подвергнутых деплеции по линии дифференцировки (клеток Lin^-), от мышей с PKD (фиг. 2b). На фиг. 2a представлено схематическое изображение самоинактивирующихся лентивирусных векторов, применяемых на протяжении всех экспериментов по генной терапии, которые содержат промотор гена PGK человека, регулирующий экспрессию трансгена EGFP в контрольном векторе (верхняя диаграмма) или экспрессию кодон-оптимизированной последовательности кДНК гена PKLR (coRPK) (coRPK) в терапевтическом векторе (нижняя диаграмма). Для последовательности coRPK показана 80,4% гомология с кДНК PKLR человека и 76,5% гомология с кДНК Pklr мыши при отсутствии изменений в аминокислотной последовательности. На фигуре 2b представлена схема протокола генной терапии, выполняемого для изучения функциональности разработанного лентивирусного вектора с PGK-coRPK. Коррекцию фенотипа PKD исследовали в течение 4-9 месяцев после трансплантации в PB и BM путем гематологического анализа и метаболического профилирования. Анализ интеграции выполняли в различных тканях и в разные моменты времени у всех мышей для изучения безопасности LV-вектора. Через 280 суток после трансплантации общий BM от мышей, подвергнутых первичной трансплантации, которые несли трансген coRPK, опять трансплантировали облученным летальными дозами самкам мышей с PKD (вторичные реципиенты) для тестирования стабильности и безопасности приживления. У облученных летальными дозами мышей с PKD, подвергнутых трансплантации клеток с недостаточностью, трансдуцированных LV с coRPK, показано значимое улучшение по всем протестированным параметрам крови в отношении эритроидных клеток по сравнению с однопометными мышами с PKD, не подвергнутым трансплантации, или с мышами, подвергнутыми трансплантации клеток, трансдуцированных LV с EGFP (фиг. 3 и таблица 2).

[00186] Таблица 2. Гематологические показатели, регистрируемые через 140 суток после трансплантации в периферической крови

[00187] Данные представляют среднее ± SEM, и их статистический анализ проводили путем сравнения с мышами, экспрессирующими EGFP, с применением непараметрического критерия Краскела-Уоллиса. *p<0,05; **p<0,01.

[00188] Число RBC повышалось не позже, чем через 40 суток после трансплантации (фиг. 3a), а конститутивный ретикулоцитоз, который является одним из наиболее распространенных признаков PKD, в значительной степени обращался у мышей, несущих трансген PGK-coRPK, достигая уровней, близких к наблюдаемым у здорового контроля, в течение по меньшей мере 9 месяцев после трансплантации (фиг. 3b). Напротив, у животных с PKD, подвергнутых трансплантации клетками, трансдуцированными LV с EGFP, показана анемия и заметный ретикулоцитоз, аналогичные мышам с PKD, во время всех проанализированных моментов времени. Значения уровней гемоглобина (HGB), индекса гематокрита (HTC), среднего корпускулярного объема (MCV) и среднего корпускулярного гемоглобина (MCH) также подвергались коррекции у мышей, подвергнутых трансплантации клеток, подвергнутых коррекции лентивирусом, по сравнению с однопометными мышами с PKD, не подвергнутыми трансплантации (таблица 2). Данная гематологическая коррекция достигалась при 63,66 ± 4,45% донорском химеризме и эффективности трансдукции, варьирующейся от 60% до 90% (таблица 3).

[00189] Таблица 3. Релевантные молекулярные параметры у мышей, подвергнутых трансплантации генетически модифицированных клеток

[00190] Данные представляют среднее ± SEM, н. о. - не определяли. ^a подсчитанная процентная доля трансдукции, полученная путем интерполяции в линейной регрессии, построенной на основе эксперимента 1 (ось X: VCN/WBC, ось Y: % КОЕ провирус⁺).

[00191] Для трансдуцированных клеток показано в среднем 1,65 ± 0,08 интегрированных копий вектора на клетку, что указывает на то, что LV-вектор с PGK-coRPK обеспечил экспрессию трансгена RPK человека, достаточную для обращения гемолитической анемии. Следует отметить, что, экспрессия трансгена coRPK приводила к продлению периода полужизни эритроидных клеток по сравнению с мышами с PKD, не подвергнутыми трансплантации (фиг. 3c, d). В среднем для мышей с PKD показан период полужизни RBC, составляющий 19 суток, тогда как у подвергнутых генетической коррекции мышей он продлевался до 25 суток (продление на 6 суток), достигая значений, близких периоду полужизни RBC дикого типа (фиг. 3d). Таким образом, для RBC от мышей, экспрессирующих coRPK, показана кинетика выживания, промежуточная между клетками от здоровых и контрольных мышей с недостаточностью (фиг. 3c), наиболее вероятно вследствие того, что полный химеризм у этих животных не достигался (таблица 3).

[00192] Через девять месяцев после трансплантации гемопоэтических клеток-предшественников от первичных реципиентов трансплантировали вторичным реципиентам, у которых поддерживались уровни приживления (62,89 ± 5,61%) и VCN (1,44 ± 0,08 копий) (таблица 3). Для реципиентов, подвергнутых вторичной трансплантации, показано восстановление гемопоэза множественных линий дифференцировки вплоть до 5 месяцев после трансплантации (фиг. 4) и значимое улучшение всех эритроидных параметров в PB (фиг. 5 и таблица 2). На фигуре 4a представлена диаграмма методики проточной цитометрии, применяемой для идентификации различных гемопоэтических линий дифференцировки путем мечения антителом к CD3, конъюгированным с PE, антителом к B220, конъюгированным с PE, антителом к B220, конъюгированным с PECy5, антителом к Gr1, конъюгированным с биотином, и антителом к Mac1, конъюгированным с биотином, с добавлением SAV-PE-Cy5. На фигуре 4b изображены типичные точечные диаграммы и процентные доли (фигура 4c) каждой линии дифференцировки в PB через 140 суток после трансплантации. Столбики представляют собой среднюю процентную долю ± SEM у контрольных мышей, здоровых (n=2, черный столбик), мышей с PKD (n=2, серый столбик), а также мышей с вторичной трансплантацией, экспрессирующих терапевтический трансген coRPK (n=4, заштрихованный столбик). Кроме того, интеграцию провирусов выявляли у различным образом коммитированных гемопоэтических клеток-предшественников (фиг. 6a, b), и их число оставалось постоянным с течением времени (фиг. 6c), демонстрируя стабильность генетической коррекции и подчеркивая безопасность LV с PGK-coRPK. На фигуре 6a показано число копий вектора на клетку в КОЕ из BM от отдельных мышей, подвергнутых трансплантации, через 120-170 суток после трансплантации. Также показана процентная доля трансдукции и химеризма. На фигуре 6b показано число копий провируса в клетках из различных гемопоэтических компартментов. Колонки представляют среднее ± SEM у разных групп мышей, подвергнутых трансплантации. На фигуре 6c показана кинетика интеграций провируса в клетках ВМ у отдельных подвергнутых трансплантации мышей, экспрессирующих EGFP (серые линии), и мышей, несущих трансген coRPK (черные линии).

Пример 2

Экспрессия RPK, осуществляемая с помощью лентивируса, нормализует эритроидную дифференцировку и обеспечивает продуцирование функциональных зрелых эритроцитов

Для мышей с PKD показано характерная экспансия эритроидного компартмента, вызванное компенсаторным механизмом эритропоэза (Min-oo et al 2004). Исследование паттерна эритроидной дифференцировки у мышей, подвергнутых трансплантации, указывало на то, что эктопическая экспрессия RPK обращала этот механизм (фиг. 7a, b). Для мышей, экспрессирующие PKD и EGFP, показано преобладание незрелых эритроидных предшественников (субпопуляция I: проэритробласты, и субпопуляция II: базофильные эритробласты) в BM и селезенке, а также заметное падение числа поздних эритроидных клеток (популяция IV: ретикулоциты и зрелые эритроциты), тогда как для мышей, подвергнутых трансплантации клеток, трансдуцированных LV с coRPK, показано значимое снижение числа незрелых эритроидных предшественников (субпопуляции I и II) в BM и селезенке, а также значимое повышение самого позднего эритроидного компартмента (субпопуляция IV), что эквивалентно здоровым мышам (фиг. 7a, b). Кроме того, в отличие от мышей, экспрессирующих PKD и EGFP, для мышей, несущих трансген coRPK, показано значимое снижение уровней эритропоэтина (Epo) в плазме крови (фиг. 7c). На фигуре 8a показаны общее число КОЕ для селезенки, а на фигуре 8b оно показано для костного мозга через 140 суток после трансплантации. Точки представляют число колоний на анализируемую мышь, а линии представляют среднее ± SEM в каждой группе. Статистический анализ данных проводили с помощью непараметрического критерия Краскела-Уоллиса. Нормализация эритропоэза у мышей с PKD, обработанных терапевтическим вектором, сопровождалась снижением содержания числа предшественников в селезенке до нормальных уровней (фиг. 8a), хотя изменения содержания КОЕ в BM не отмечалось (фиг. 8b).

Пример 3

Трансплантация клеток, трансдуцированных лентивирусным вектором с coRPK, обращает экстрамедуллярный эритропоэз и патологию органа

[00193] Вследствие активного разрушения эритроцитов с недостаточностью RPK у мышей, экспрессирующие PKD и EGFP, проявляется острая спленомегалия с повышением массы и размера селезенки, составляющим более 200% по сравнению со здоровыми контролями (фиг. 9a, b). Также у этих животных наблюдали дезорганизованную структуру ткани селезенки и расширение красной пульпы селезенки, это указывает на интенсивный экстрамедуллярный эритропоэз, что также подтверждается присутствием кластеров эритроидных клеток на срезах печени у животных, экспрессирующих PKD и EGFP (фиг. 9c). Следует отметить, что эктопическая экспрессия трансгена coRPK полностью обращала патологию селезенки и печени у мышей, подвергнутых генетической коррекции, с уменьшением скоплений RBC и нормализацией гистологической структуры и размера селезенки (фиг. 9). Кроме того, гистологические исследования показали полное отсутствие отложений железа в печени мышей, подвергнутых генетической коррекции, тогда как у мышей с PKD как из группы, не подвергнутой трансплантации, так и из группы, подвергнутой трансплантации HSC, трансдуцированными вектором, несущим EGFP, проявлялось интенсивное перенасыщение железом вследствие непрерывного процесса гемолиза (фиг. 9c). В целом, трансплантация HSC, подвергнутых генетической коррекции, мышам с PKD восстанавливала нормальный статус эритропоэза и все вторичные эффекты, вызванные гемолитической анемией.

Пример 4

Экспрессия, осуществляемая с помощью LV с PGK-coRPK, восстанавливает путь гликолиза в RBC без модификации метаболического равновесия WBC

Далее выполняли расширенный метаболомный анализ всех мышей, подвергнутых трансплантации, и контрольных мышей для исследования функциональной коррекции ферментативной активности RPK. Следуя стратегии нецелевого профилирования, наблюдали значимые изменения промежуточных соединений гликолиза в RBC у разных групп, с идентификацией трех широких кластеров паттернов метаболитов с отличающимися тенденциями (фиг. 10a). Для RBC от мышей, экспрессирующих coRPK, показано повышение уровней метаболитов из кластера 1, аналогично здоровым контролям, но в отличие от мышей, подвергнутых трансплантации, которые несли трансген EGFP. Подобный образом, кластер 3 отражал тенденцию снижения метаболитов у мышей, подвергнутых генетической коррекции, аналогично мышам дикого типа, и но в отличие от мышей, экспрессирующих EGFP. Однако для кластера 2 из анализа 1 показано отсутствие различий профиля метаболитов у групп мышей, подвергнутых трансплантации (мышей, экспрессирующих EGFP и coRPK) (фиг. 10a). Нецелевое метаболическое профилирование также показало, что генетическая модификация была способна модифицировать некоторые важные промежуточные соединения гликолиза с достижением повышения уровней ATФ (фиг. 10b), AДФ (фиг. 10c) и пирувата (фиг. 10d) в эритроцитах, выделенных от мышей, подвергнутых трансплантации HSC, трансдуцированными LV с PGK-coRPK. Учитывая тенденции для данных метаболитов, затем анализировали другие метаболиты, локализованные вблизи реакции, катализируемой PK, с применением подхода целевого профилирования. Уровни прямого субстрата PK, фосфоенолпирувата (PEP) (фиг. 10e), и 3-фосфоглицерата (3-PG) (фиг. 10f), локализованного в противоположном направлении от катализируемой PK реакции, приближались к уровням у здоровых контрольных мышей. Эритроциты с недостаточностью, экспрессирующие трансген coRPK, также продуцировали повышенное количество D-лактата (фиг. 10g), конечного продукта анаэробного гликолиза, по сравнению с мышами, экспрессирующими PKD и EGFP. Чтобы протестировать, была ли компенсация метаболитов гликолиза результатом нормализации активности PK в зрелых эритроцитах, измеряли активность этого фермента и нормализовали ее относительно активности гексокиназы, чтобы избежать влияния высоких количеств ретикулоцитов у животных с недостаточностью. RBC очищали, пропуская через колонку c целлюлозой, чтобы предотвратить контаминацию активностью лейкоцитарной PK. Полную компенсацию активности PK наблюдали у животных, экспрессирующих coRPK, у которых достигались отношения, подобные таковым, полученным у здоровых животных дикого типа и нормальных здоровых добровольных доноров крови (фиг. 11). На фиг. 11a показана активность пируваткиназы, на фиг. 11b показана активность гексокиназы, а на фиг. 11c показано отношение ферментативных активностей пируваткиназы и гексокиназы в RBC от контрольных мышей и мышей, подвергнутых трансплантации трансдуцированных клеток. RBC выделяли из образцов крови путем пропускания через колонку с целлюлозой, чтобы избавиться от посторонней активности лейкоцитарной PK, и подвергали оценке ферментативной активности. Черные столбики - здоровые мыши (n=2); белые столбики - мыши, подвергнутые трансплантации клеток, трансдуцированных экспрессирующим EGFP вектором (n=3); заштрихованные столбики - мыши, подвергнутые трансплантации клеток, трансдуцированных экспрессирующим coRPK вектором (n=3). Столбики с заливкой клетками представляют значения здорового волонтера (n=1). Данные представлены в виде среднего ± SEM каждой группы.

[00194] Анализ главных компонент показал, что паттерн метаболитов в RBC отличался в зависимости от группы и заметно отличался от профиля WBC (фиг. 12a). Напротив, подгруппы WBC группировались вместе при очень незначительном различии между группами, что указывает на отсутствие изменений в метаболическом равновесии лейкоцитов при экспрессии эктопической coRPK (фиг. 12a). Кроме того, специфические изменения метаболитов, наблюдаемые при нецелевом профилировании RBC, отсутствовали в WBC (фиг. 12b-d).

Пример 5

Клетки, трансдуцированные LV с PGK-coRPK, обеспечивают поликлональное гемопоэтическое восстановление без доказательств генотоксичности вектора

[00195] Профиль интеграции LV, несущих один из трансгенов coRPK или EGFP, анализировали у мышей, подвергнутых трансплантации. Исходя из профиля интеграции LV по всему геному, каждая вставка создает уникальную генетическую метку, которую можно использовать для отслеживания клонального поведения в отдельных трансдуцированных клетках. Геномную ДНК (гДНК) получали из WBC и клеток BM от мышей, подвергнутых первичной и вторичной трансплантации, а также из пулов трансдуцированных клеток перед трансплантацией (клетки Lin^-). Опосредованную линейной амплификацией ПЦР (LAM-PCR) (фиг. 13 и 14) применяли для амплификации мест соединений вектор/геном и для идентификации сайтов вставки (IS) вектора. На фигуре 13 показаны сайты интеграции вектора, идентифицированные путем LAM-PCR-амплификации мест соединения 3’-LTR вектора-геном. Использовали автоматизированную систему MultiNA с получением паттерна, характеризующегося несколькими полосками. Полоска внутреннего контроля (IC), полученного на основе векторного остова Tsp509I, показана стрелкой. На фигуре 14 показаны сайты интеграции вектора, идентифицированные путем LAM-PCR-амплификации мест соединения 3’-LTR вектора-геном. Использовали автоматизированную систему MultiNA с получением паттерна, характеризующегося несколькими полосками. Полоска внутреннего контроля (IC), полученного на основе векторного остова HpyCH4IV5, показана стрелкой.

[00196] Продукты ПЦР секвенировали с помощью платформы MiSeq Illumina и полученные последовательности картировали в геноме мыши с помощью биоинформационного технологического процесса и фильтровали в отношении конфликтов, как описано выше в разделе Способы (фиг. 15). На фигуре 15 изображена общая схема анализа картирования сайта интеграции, выполненного на мышах, подвергнутых трансплантации генетически модифицированных гемопоэтических клеток-предшественников. Анализировали образцы костного мозга и белых кровяных клеток от мышей, подвергнутых трансплантации, относящиеся к двум независимым экспериментам (таблица 3) и собранные в разные моменты времени после трансплантации, как описано во вспомогательных способах после показанного технологического процесса.

[00197] Всего картировали 5173892 ридов секвенирования в геноме мыши, подвергнутой трансплантации, с получением 2220 уникальных сайтов интеграции вектора. Геномное распределение IS из двух независимых экспериментов соответствовало сообщаемой ранее предпочтительной интеграции LV в пределах единиц транскрипции (особенно в пределах первых 50 т. о. в направлении по ходу транскрипции от сайта начала транскрипции -TSS-) (фиг. 16a), что показывает отсутствие отклонения в сторону какой-либо конкретной хромосомы в геноме мыши (фиг. 16b). На фигуре 16a представлена плотность распределения сайтов интеграции (IS) вблизи сайта начала транскрипции (TSS) ближайшего гена RefSeq с охватом 500 т. о. в направлении против хода транскрипции и в направлении по ходу транскрипции от TSS. Числа вверху представляют собой число IS, выявленных для всех образцов и моментов времени. На фигуре 16b показано распределение сайтов интеграции LV по хромосомам у мышей, подвергнутых трансплантации, экспрессирующих трансген EGFP (черные столбики) или терапевтический трансген coRPK (серые столбики), не показывающее отклонения в сторону какой-либо конкретной хромосомы.

[00198] Безопасность генной терапии на основе LV с PGK-coRPK исследовали с помощью оценки обилия клонов, вычисляя процентную долю числа последовательностей для каждого IS (клональная метка) относительно общего числа последовательностей в наборе данных. Точечные диаграммы и представления в виде тепловой карты относительного обилия каждого IS, полученные для каждой мыши (фиг. 17, 18 и 19), показали большие флуктуации клонального состава у разных мышей и в in vitro культивируемых клетках Lin^-. На фигуре 17 представлена диаграмма отслеженных интеграций, которые были общими для мышей, представляющих собой первичных и вторичных реципиентов, несущих терапевтический LV-вектор с PGK-coRPK. Объединены интеграции, выявленные у каждой мыши в любом органе и в любой момент времени. Вторичные реципиенты получали объединенный BM от мышей, подвергнутых трансплантации coRPK11-14. Остальные из выявленных IS выявляли либо у первичных, либо у вторичных реципиентов. Числа в ячейках показывают представленность соответствующей интеграции в виде процентной доли у упомянутой мыши. В дополнение к фильтру >5%, применяемому в анализе интеграции, исключали все интеграции с числом последовательностей <3. На фигуре 19 представлена в виде точечной диаграммы обилие клонов объединенных интеграций у каждой мыши в костном мозге. Относительная процентная доля (ось y) каждого сайта интеграции подсчитана относительно общего числа ридов последовательностей, полученных в каждом наборе данных. Аналогично клеткам, трансдуцированными co-RPK (фиг. 17), диаграмма показывает, что у подавляющего большинства мышей, подвергнутых трансплантации, показан поликлональный паттерн репопуляции гемопоэтических клеток.

[00199] Кроме того, можно было понять, что в случае некоторых образцов небольшое число интеграций приводило к большому количеству ридов последовательностей (фиг. 17 и 18), выявляя поликлональный паттерн репопуляции трансдуцированных HSC. Кроме того, отслеженная интеграция, общая для мышей, подвергнутых первичной трансплантации, несущих терапевтический LV с PGK-coRPK, и мышей, подвергнутых последующей вторичной трансплантации, показывала отсутствие большого совместного присутствия интеграций у разных групп, что подтверждает отсутствие клонального доминирования (фиг. 18).

[00200] Чтобы определить, присутствовали ли отличительные признаки инсерционного мутагенеза у мышей, подвергнутых трансплантации, оценивали появление общих сайтов вставки (CIS), аналогично проводящимся клиническим испытаниям, связанными с LV. CIS представляют собой инсерционные горячие точки, которые могут возникать в результате смещения интеграции во время трансдукции или in vivo отбора клонов, содержащих интеграции вектора, которые придают преимущество для роста. CIS идентифицировали с применением алгоритма из работы Abel и соавт. и критерия Граббса для выбросов, при этом не были выявлены CIS и, таким образом, отсутствовали какие-либо тревожные признаки генотоксичности при таком считывании данных. Более того, анализ генной онтологии (GO) не выявил смещения в сторону классов генов, вовлеченных в рак, пролиферацию клеток или регуляцию апоптоза в каких-либо из наборов данных по интеграции, отсортированных по распределению в тканях, моменту времени или обилию клонов репопулирующих гемопоэтических клеток (фиг. 20). На фигуре 20 представлен профиль геномной интеграции LV. Анализ генной онтологии (GO) выполняли с применением программного обеспечения GREAT на образцах от мыши, подвергнутой трансплантации. Все данные по интеграциям, полученные в данном исследовании (N=2220), показали превалирование генных функций, указанных в левой части фигуры. Чтобы изучить, были ли наиболее распространенные интеграции обогащены с точки зрения определенных классов генов, выбирали все сайты интеграции с относительным числом последовательностей >5% от всего набора данных (показаны на фиг. 17), что показало отсутствие превалирования классов генов GO.

[00201] Данные результаты означают нейтральность интеграции вектора и демонстрируют безопасность LV с PGK-coRPK в доклинических исследованиях.

Пример 6

Клиническое испытание на людях

[00202] Клиническое испытание проводили для оценки безопасности и предварительной эффективности трансплантации аутологических гемопоэтических стволовых клеток (HSCT) с применением лекарственного продукта EU/3/14/1130 (аутологические CD34+ гемопоэтические стволовые клетки, трансдуцированные лентивирусным вектором, содержащим ген RPK) у пациентов с недостаточностью пируваткиназы с тяжелой и зависимой от переливания крови анемией, не поддающейся лечению с помощью спленэктомии, в анамнезе.

[00203] ODD EU/3/14/1130 содержит самоинактивирующийся лентивирусный вектор, экспрессирующий кодон-оптимизированный вариант терапевтического гена PKLR человека (фигура 21).

[00204] Самоинактивирующиеся лентивирусные векторы (SIN-LV) обеспечивают более надежную экспрессию (Ellis 2005) и являются менее восприимчивыми к транскрипционному сайленсингу, чем гамма-ретровирусные векторы (Pfeifer, Ikawa et al. 2002). Для них также показан намного более безопасный профиль интеграции (Schroder, Shinn et al. 2002), (Mitchell, Beitzel et al. 2004), (Wu, Li et al. 2003), а также вследствие делеции размером 400 п. о., которую они несут в последовательности 3’-LTR (Miyoshi, Blomer et al. 1998) (Zufferey, Dull et al. 1998), экспрессия трансгена регулируется внутренними промоторами, что повышает безопасность генетической модификации на основе LV.

[00205] Векторная последовательность приемлемого лентивирусного вектора также включает несколько модификаций для улучшения экспрессии и безопасности трансгена в клетках-мишенях.

[00206] Одна модификация заключается в применении промотора гена фосфоглицераткиназы (PGK) человека, и так характеризующегося своей стабильной in vivo активностью и улучшенными свойствами безопасности по сравнению с другими промоторами, применяемыми в генной терапии (Montini, Cesana et al. 2006, Modlich, Navarro et al. 2009, Montini, Cesana et al. 2009, Biffi, Montini et al. 2013). PGK приводит к более физиологической экспрессии трансгена и более низкой восприимчивостью к транскрипционному сайленсингу (Gerolami, Uch et al. 2000, Zychlinski, Schambach et al. 2008).

[00207] Другой модификацией является кодон-оптимизированный вариант кДНК PKLR (coRPK) человека для усиления стабильности мРНК после транскрипции. Для оптимизации использовали программное обеспечение GeneArt®, повышая содержание GC и удаляя криптические сайты сплайсинга, чтобы исключить транскрипционный сайленсинг, с увеличением тем самым экспрессии трансгена. Для оптимизированной последовательности coRPK показана 80,4% гомология с геном PKLR человека, при этом отсутствовали изменения в аминокислотной последовательности белка.

[00208] Другой модификацией также является мутантный посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков (Wpre), без какой-либо остаточной открытой рамки считывания (Schambach, Bohne et al. 2006), чтобы улучшить уровень экспрессии и стабильности терапевтического гена. Последовательности остова, промотора и Wpre* данного лентивирусного вектора (LV с PGK-coRPK) являются такими же, как последовательность, соответствующая лекарственному продукту в испытании «Lentiviral vector containing the Fanconi anemia A (FANCA) gene for the therapy of Fanconi anemia Type A patients» (№ 141/2000), а также векторный остов, используемый в проводящемся в настоящее время клиническом испытании в отношении метахроматической лейкодистрофии (MLD) (Biffi, Montini et al. 2013).

[00209] Механизм действия

[00210] После сбора CD34⁺ клеток-предшественников, либо из костного мозга (BM), либо мобилизированных клеток периферической крови пациентов с PKD, их будут трансдуцировать ex vivo лекарственным продуктом, и терапевтический вектор будет интегрироваться в геном клеток. После интеграции терапевтический ген человека (coRPK) будет транскрибироваться и транслироваться в клетках с недостаточностью с продуцированием терапевтического белка RPK, которого отсутствует или снижен в зрелых эритроцитах при PKD. Трансдуцированные гемопоэтические клетки-предшественники с PKD затем будут подвергнуты генетической коррекции и, таким образом, приобретут способность продуцировать RBC с достаточными количествами ATФ для выполнения своих функций (фигура 22). Данные подвергнутые генетической коррекции гемопоэтические клетки-предшественники (которые будут входить в состав лекарственного продукта) затем будут трансплантировать обратно пациенту, при этом после приживления они будут давать нормальные эритроциты, излечивающие заболевание на всю жизнь.

[00211] Активное начало будет состоять из клеточной суспензии из подвергнутых коррекции гемопоэтических стволовых клеток (CD34⁺) с терапевтическим лентивирусным вектором PGK.coRPK.wpre, разработанным в качестве лекарственного средства для лечения редкого заболевания Европейской комиссией (ODD EU/3/14/1130) для лечения недостаточности пируваткиназы. Таким образом, данный новый медикамент должен быть включен в группу усовершенствованных терапевтических разработок в пределах подкласса генной терапии.

[00212] В состав активного начала будет входить суспензия генетически модифицированных клеток из расчета по меньшей мере 2 х 10⁶ CD34⁺ клеток/кг массы тела, содержащих по меньшей мере 0,1 копии терапевтического вектора на клетку. Клетки будут суспендированы в солевом буфере с 2% HSA.

[00213] Конечный терапевтический продукт будут получать согласно правилам GMP, поэтому требования к продукту по его высвобождению и его инфузии у пациенту будут связаны с качеством продукта. В связи с этим такими спецификациями будут жизнеспособность клеток >30%, стерильность (тест Грама и стерильность согласно фармакопее), отсутствие микоплазмы, отсутствие репликативных конкурирующих лентивирусных частиц и демонстрация эффективности терапевтического потенциала путем выявления наличия по меньшей мере 0,1 копии вектора на клетку с помощью количественной ПЦР. Кроме того, будет проводиться изучение и научные исследования содержания гемопоэтических клеток-предшественников и числа копий вектора в них. Будут выполнены три независимых валидации со здоровыми контрольными клетками, чтобы гарантировать, что процедура достигает описанных выше требований.

[00214] Конечный продукт будет окончательно упакован в пакет для переливания, запаянный нагреванием, и, особенно в случае замораживания и хранения до инфузии его пациенту, до проведения этого будут отбираться образцы для точных контролей соответствия качеству.

[00215] Мобилизация

[00216] Пациентов будут мобилизовать в их соответствующих больницах, хотя двух первых пациентов будут мобилизовать в Hospital del Niño Jesús, Мадрид (Испания). Процесс мобилизации будет заключаться в применении рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF, Neupogen, Amgen, Таузанд-Окс, Калифорния, США) при дозах, составляющих 12 мг/кг, два раза в сутки вплоть до восьми суток от рождения, плериксафора, 4-е сутки, 240 мг/кг/сутки (Mozobil®, Genzyme Europe BV, Наарден, Нидерланды), в виде четырех подкожных доз в течение 4 последовательных суток. Гемопоэтические клетки-предшественники из периферической крови будут собирать путем лейкафереза больших объемов от дня 5 мобилизации через клеточный сепаратор и согласно стандартным протоколам в Hospital Niño Jesús в Мадриде. Все инструменты и растворы маркированы согласно CE и отвечают спецификациям законодательства в отношении медицинских устройств.

[00217] Очистка CD34⁺ клеток

[00218] В соответствии с процессом мобилизации аферез будет проходить в больнице, где пациента подвергают мобилизации. Аферез будет обрабатываться немедленно для отбора гемопоэтических клеток-предшественников (CD34⁺ клеток) с помощью технологии «магнитная сортировка клеток» MACS (Miltenyi Biotec, Германия), которая позволяет разделять клетки с помощью высокого градиента магнитного поля посредством мощного постоянного магнита и разделительной колонки с ферромагнитной матрицей. Система CliniMACS (Miltenyi Biotec, Брегиш-Гладбах, Германия) состоит из компьютера (устройство CliniMACS®plus), специального программного обеспечения для отбора CD34⁺ клеток, набора стерильных пробирок (наборы пробирок CliniMACS), контролируемого магнитным полем реактивного стерильного устройства (набор реагентов для выделения CD34 клеток CliniMACS) и стерильного буфера (буфер PBS/EDTA CliniMACS). Используемое устройство и реагенты будут маркированы согласно СЕ и будут соответствовать спецификациям законодательства для медицинских устройств. Во время этой фазы и при последующих промывках используется неспецифический иммуноглобулин (внутривенный препарат флебогамма 5%, 0,5 г, Grifols) и человеческий альбумин (человеческий альбумин Grifols® 20%, Grifols), которые позднее удаляют путем промывки после центрифугирования. Затем будут количественно оценивать CD34+ клетки. Микробиологические контроли полученных продуктов будут выполнять путем отбора стандартных образцов на грибки, аэробные бактерии и анаэробные микроорганизмы для культивирования согласно определенным протоколам.

[00219] Трансдукция CD34⁺ клеток

[00220] Трансдукцию очищенных CD34⁺ клеток с помощью ODD EU/3/14/1130 будут выполнять в условиях GMP в пределах временного промежутка 48 часов с момента извлечения клеток из пациента (аферез). Ex-vivo культивирование клеток будет продолжаться меньше 48 часов и будет происходить согласно установленным стандартам, включая применение правильным образом составленной среды X-vivo-20 (Lonza), добавление гемопоэтических ростовых факторов (100 нг/мл hrSCF, 100 нг/мл hrFlt-3, 100 нг/мл TPO и 20 нг/мл IL-3 (все от Prepotech), 1 мкг/мл пульмозима и контролируемой концентрации 5% O₂. Трансдукцию будут выполнять с помощью GMP-партии лентивируса ODD EU/3/14/1130, полученной в VIVEbiotech (Сан-Себастьян, Испания). После трансдукции клетки будут промывать в X-vivo-20 (Lonza) для конечной упаковки в пакет для переливаний, подходящий для криоконсервации. Специфические образцы будут собирать для определения того, отвечает ли конечный продукт всем уже упомянутым спецификациям для его окончательного выпуска. Для оценки стабильности продукта будут проводиться три независимые валидации. Все продукты и растворы, включая вектор, будут соответствовать спецификациям законодательства для медицинских устройств и клинического применения. Перед получением все сырье (включая расходные материалы, биологические реактивы и химические порошки) будут проверяться группой контроля качества (QC) CliniStem согласно стандартным рабочим процедурам (SOP).

[00221] Кондиционирование

[00222] Пациентов будут кондиционировать согласно стандартизированным и специфическим протоколам, предусматриваемым для испытания. С учетом пациента, проходящего кондиционирование, альтернативный резерв из 2 х 10⁶ необработанных CD34⁺ клеток/кг будут хранить замороженными для использования в том случае, если полученный продукт не полностью восстановит гематопоэз у получающего лечение пациента.

[00223] Инфузия

[00224] Перед проведением инфузии пациента, отвечающего критериям выбора, будут проверять на соответствие требованиям исследования. Будет регистрироваться день проведения инфузии, премедикация и используемые профилактические лекарства.

Пример 7

Доклиническая разработка

[00225] В предыдущей работе продемонстрирована пригодность генной терапии HSC для лечения PKD у мышей при трансплантации свыше 25% клеток, подвергнутых генной коррекции. Эти результаты означают, что для достижения терапевтического эффекта в отношении PKD необходимо значительное число HSC, подвергнутых коррекции с помощью донорского гена (Zaucha, Yu et al. 2001), и высокие уровни экспрессии трансгена. Авторы настоящего изобретения разработали новый терапевтический лентивирусный вектор, предлагаемый для данного клинического испытания, который содержит эукариотический промотор гена hPGK, управляющий экспрессией кДНК PKLR, который был разработан в качестве лекарственного средства для лечения редких заболеваний в августе 2014 года (EU/3/14/1130). В отношении данного вектора провели доклинический протокол генной терапии PKD на мышиной модели заболевания. При дозировках лентивируса, основанных на клинических стандартах, эктопическая экспрессия RPK была способна нормализовать эритроидный компартмент, корректируя гематологический фенотип и обращая патологию органа. Метаболомные исследования продемонстрировали функциональную коррекцию пути гликолиза в RBC, подвергнутых генетической коррекции, при отсутствии метаболических нарушений, наблюдаемых в лейкоцитах. Следует отметить, что в случае WBC, анализируемых параллельно, показано отсутствие изменений метаболического равновесия в лейкоцитах при эктопической экспрессии RPK под действием убиквитарного промотора, такого как PGK, что исключает метаболическое преимущество лейкоцитов в качестве возможной проблемы безопасности и усиливает терапевтический потенциал вектора EU/3/14/1130.

[00226] Восстановление множественных линий дифференцировки и отсутствие какого-либо лейкозного осложнения или клональной экспансии у вторичных реципиентов после пролиферативного стресса, индуцированного ретрансплантацией BM, демонстрируют долгосрочную стабильность и безопасность протокола на основе вектора LV с PGK-coRPK. Применение эукариотического промотора гена PGK человека, который i) по-видимому, приводит к более физиологической экспрессии трансгена RPK, ii) как было доказано, является слабым трансактиватором, и iii) в настоящее время используется в клиническом испытании в отношении метахроматической лейкодистрофии (MLD), также может объяснять безопасность процедуры в целом.

[00227] Чтобы оценить долгосрочную безопасность генной терапии HSC посредством анализа сайтов интеграции вектора, использовали секвенирование нового поколения для прогнозирования риска инсерционного онкогенеза в HSC. В мышином геноме картировали более чем 5173892 ридов последовательностей с получением в общей сложности 2220 уникальных IS вектора, при этом не были выявлены доказательства in vivo экспансии или отбора клонов, содержащих IS. Напротив, данные настоящего изобретения указывают на клональный состав и динамику гемопоэза после трансплантации трансдуцированных HSC у мышей, что означает истинную и стабильную генетическую in vivo модификацию HSC с течением времени. В целом, анализ паттерна интеграции вектора подчеркивает свойства безопасности LV-вектора с PGK-coRPK, который обеспечивает генетические коррекцию PKD, при отсутствии доказательств генотоксичности.

Пример 8

Клиническая разработка

[00228] До настоящего момента никаких клинических исследований данного лекарственного продукта не проводили. Впервые заявка на предоставление помощи в составлении протоколов исследований передается в регуляторный орган. Цель авторов настоящего изобретения заключается в выполнении клинического испытания, спонсируемого Еврокомиссией. Консорциум ForGeTPKD, состоящий из различных врачей и фундаментальных исследователей Европы, был создан, чтобы сосредоточиться на исследовании PKD и разработке новых стратегий терапии. Клиническое испытание ForGeTPKD будет первым применением данного лекарственного продукта в отношении людей. Оно разработано как международное многоцентровое открытое исследование фазы I/II для оценки безопасности и эффективности трансплантации аутологических CD34+ клеток, трансдуцированных ex vivo лентивирусным вектором, содержащим ген пируваткиназы (RPK) эритроцитов (EU/3/14/1130), у пациентов с тяжелой недостаточностью пируваткиназы.

[00229] Регуляторный статус

[00230] В настоящее время лекарственный продукт не имеет разрешения на продажу. Целью Консорциума PKD является продвижение вперед клинической разработки лекарственного продукта, чтобы в конечном итоге получить разрешение на продажу.

[00231] Указанный конечный продукт будут получать с лентивирусным вектором, который получил статус лекарственного средства для лечения редких заболеваний.

[00232] Показание. Лечение недостаточности пируваткиназы.

[00233] Критерии. Единственным радикальным лечением PKD является аллогенная BMT, которую применяли у пациентов с зависимой от переливания тяжелой анемией, не поддающейся лечению другими способами. Однако аллогенная BMT не является широко принятым методом лечения PKD (только один пациент, о котором сообщается в литературе (Tanphaichitr, Suvatte et al. 2000)), поскольку она ассоциирована с тяжелыми осложнениями, связанными с интенсивным кондиционированием перед проведением аллогенной BMT с помощью химиотерапии или химиолучевой терапии, а также острой и хронической болезнью «трансплантат против хозяина» (GVHD). Гипотеза авторов настоящего изобретения заключается в том, что генная терапия с применением аутологических гемопоэтических стволовых клеток, трансдуцированных вирусными векторами, содержащими вариант гена дикого типа, представленная как ODD EU/3/14/1130, может предоставить потенциальную возможность для излечения таких пациентов, при этом избегая рисков GVHD, основной причины неудачи при трансплантации гемопоэтических клеток-предшественников.

[00234] Действующее вещество. Аутологические CD34⁺ гемопоэтические стволовые клетки, трансдуцированные лентивирусным вектором, содержащим ген пируваткиназы (RPK) эритроцитов (ODD EU/3/14/1130), которые экспрессируют вариант белка дикого типа.

[00235] Готовый продукт. Замороженные пакет, содержащий по меньшей мере 2 х 10⁶ действующего вещества/кг массы тела пациента, которое суспендировано в солевом буфере с 2% HAS.

Пример 9

Фармакология

[00236] Завершенные исследования. Разрабатываемый лекарственный продукт включает несколько модификаций в своей последовательности, которые обеспечивают некоторые преимущества генной терапии PKD: 1) применение дизайна вектора SIN-LV обеспечило возможность относительно легко и безопасно получать исходные вирусные материалы, способные эффективно трансдуцировать HSC; 2) применение слабого и эукариотического промотора, такого как hPGK, который менее восприимчив к сайленсингу под действием метилирования (Gerolami, Uch et al. 2000), приводит к более физиологической экспрессии трансгена, с достижением терапевтических уровней при дозировке вируса (1,65 VCN) в пределах клинических стандартов (Matrai, Chuah et al. 2010); и 3) кодон-оптимизированная последовательность трансгена и присутствие мутантной последовательности Wpre повышают стабильность мРНК трансгена: в последовательность терапевтического вектора не включен репортерный ген, что предотвращает возможные проблемы с иммуногенностью (Morris, Conerly et al. 2004); (Stripecke, Carmen Villacres et al. 1999).

[00237] Разрабатываемый лекарственный продукт LV с hPGK-coRPK эффективно обращал патологию PKD как у мышей с недостаточностью, подвергнутых как первичной, так и вторичной трансплантации предшественников, трансдуцированных и подвергнутых коррекции с помощью ODD EU/3/14/1130. Коррекцию осуществляли клетки, несущие в среднем 1,65 копии терапевтического трансгена на клетку.

[00238] Промотор гена PGK человека был достаточно эффективным для экспрессии клинически соответствующих уровней белка coRPK с компенсацией гемолитического фенотипа у мышей, подвергнутых трансплантации.

[00239] Генетическая коррекция была способна продлевать период полужизни RBC; нормализовать гематологические показатели и уровни ретикулоцитов; обращать компенсаторный эритропоэз, конститутивно активируемый у мышей с PKD; избавлять от патологии селезенки и печени, заметно снижать перенасыщение железом, которое является одним из осложнений PKD, опасных для жизни. Кроме того, эктопическая экспрессия RPK человека корректировала энергетический дефект в RBC без изменения метаболического равновесия в WBC, что подчеркивает эффективность и безопасность лекарственного продукта.

Пример 10

Проводящиеся исследования

[00240] Трансдукция гемопоэтических клеток-предшественников человека от здоровых доноров и пациенты с PKD для исследования: 1) эффективности трансдукции ODD EU/3/14/1130 в человеческие клетки; 2) определения оптимального числа копий вектора/клетка для получения эффективной и терапевтической экспрессии терапевтического белка RPK и 3) определения оптимальных условий для получения терапевтических уровней трансдукции без потери потенциала гемопоэтических стволовых клеток.

[00241] Планируемые исследования включают создание условий для крупномасштабной трансдукции на оборудовании GMP, а также предварительную валидацию и 3 валидационных исследования для установки оптимальных условий для достижения требуемых спецификаций, определенных для конечного терапевтического продукта.

[00242] Токсикология

[00243] Завершенные исследования включают следующее: 1) эктопическая экспрессия RPK человека корректировала энергетический дефект в RBC без изменения метаболического равновесия в WBC; 2) анализ геномной интеграции вектора продемонстрировал, что (i) анализ относительного обилия клонов специфических клеток выявил олигоклональное восстановление гемопоэтических клеток у некоторых мышей, что показывает отсутствие клонального доминирования у любых мышей, подвергнутых первичной и вторичной трансплантации; (ii) общие сайты интеграции (CIS, плотные кластеры интеграций вектора в определенных промежутках генома), считающиеся отличительным признаком инсерционного мутагенеза, не показали признаков генотоксичности, отсутствовало аномальное обогащение CIS с течением времени, а CIS, выявленные в двух независимых экспериментах по генной терапии, выполненных на мышах, не были представлены большим числом последовательностей и не были нацелены преимущественно на онкогены; (iii) анализ генной онтологии (GO) генов, на которые нацеливалась интеграция лентивируса, и исследование положения интеграций вектора в специфические области генома продемонстрировали отсутствие смещения в сторону класса генов, вовлеченных в рак, пролиферацию клеток или регуляцию апоптоза; и (iv) общий анализ интеграции лекарственного продукта не показал никаких признаков генотоксичности.

[00244] Планируемые исследования включают следующее: 1) анализ получения рекомбинантных компетентных лентивирусов (RCL): T-лимфоциты человека от здоровых доноров и от пациентов с PKD будут трансдуцировать ODD EU/3/14/1130 и культивировать in vitro в течение длительных периодов времени; присутствие вирусного белка p24 будут анализировать в супернатантах с помощью ELISA для оценки потенциального получения RCL, и 2) биораспределение лекарственного продукта: гемопоэтические клетки-предшественники мыши будут трансдуцировать с помощью ODD EU/3/14/1130 и трансплантировать облученным летальными дозами реципиентам; Животных будут умерщвлять через один месяц после трансплантации и различные органы (половые железы, печень, почка, головной мозг, костный мозг, селезенка и периферическая кровь) будут анализировать в отношении присутствия ДНК вектора; и 3) интегром вектора в клетках человека: гемопоэтические клетки-предшественники от здоровых доноров и от пациентов с PKD будут трансдуцировать с помощью ODD EU/3/14/1130 и трансплантировать мышам с тяжелым иммунодефицитом для обеспечения возможности приживления и пролиферации человеческих гемопоэтических клеток. В разные моменты времени (через 1, 2 и 3 месяца после трансплантации) будут отбирать образцы крови и BM, сортировать клетки человека и подвергать анализу на интегрома вектора, как уже выполняли с клетками мыши.

Пример 11

Клиническое испытание на людях

[00245] Для тестирования клинической эффективности будет проводиться испытание ForgetPKD. Целью предлагаемого клинического испытания служит оценка безопасности и предварительной эффективности аутологической трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (HSCT) с применением лекарственного продукта EU/3/14/1130 (аутологические CD34⁺ гемопоэтические стволовые клетки, трансдуцированные лентивирусным вектором, содержащим ген пируваткиназы (RPK) эритроцитов) у пациентов с недостаточностью пируваткиназы с тяжелой и зависимой от переливания анемией, не поддающейся лечению с помощью спленэктомии, в анамнезе.

[00246] Главная цель заключается в оценке безопасности и переносимости/пригодности лечения. В связи с этим будут измеряться следующие конечные точки: 1) возникновение и характеристика нежелательных явлений (AE), включая AE, связанные с инфузией трансдуцированных клеток, AE, происходящие в результате кондиционирования перед инфузией клеток, и AE, происходящие в результате клональной эволюции, связанной с трансдуцированными клетками; и 2) число пациентов с приживлением стволовых клеток через 30 суток после трансплантации.

[00247] Вторичные цели заключаются в предварительной оценке эффективности лечения. В связи с этим будут измеряться следующие конечные точки: число пациентов, которые стали «независимыми от переливания» в конце исследования; у пациентов, которые все еще нуждаются в переливаниях после лечения, отношение среднего числа переливаний, необходимых на протяжении периода исследования (1 год), к среднему числу переливаний за последние 1,5 года перед оценкой исходного уровня; клинически значимое снижение анемии, определяемое как число пациентов с повышением уровней гемоглобина на 2 г/дл от исходного уровня в конце исследования; клинически значимое снижение ретикулоцитоза, определяемое как число пациентов со снижением на 50% от оценки исходного уровня в конце исследования; и число пациентов с приживлением стволовых клеток, при этом 1% трансдуцированных клеток может выявляться через 6 и 12 месяцев после инфузии клеток и в конце исследования.

[00248] Поисковая цель заключается в оценке влияния лечения на качество жизни пациента. В связи с этим будут измеряться следующие конечные точки: улучшение качества жизни от исходного уровня в конце исследования с применением опросника качества жизни (SF-36 для взрослых или PEDSQL для детей) и его валидированных вариантов, переведенных на язык стран-участников (итальянский, голландский и испанский).

[00249] Испытание ForGetPKD представляет собой многоцентровое, международное испытание, которое будет выполняться в 3 странах-членах ЕС: Испании, Италии и Нидерландах. Центры, принимающие участие, включают компетентных национальных исследователей и институты в отношении диагностики и лечения PKD.

[00250] Испытание будет представлять собой первое применение в отношении людям описываемого продукта. Оно разработано как несравнительное открытое исследование фазы I/II.

[00251] Продолжительность глобального исследования составит 2 года от момента первого визита первого пациента до последнего визита последнего пациента. Оно включает 1 год периода набора и 1 год периода лечения и раннего (немедленного) последующего наблюдения. После окончания испытания включенным субъектам будет предложено принять участие в исследовании на основе последующего наблюдения, которое будет контролировать безопасность и эффективность вплоть до 5 лет после трансплантации.

[00252] В соответствии с частотой встречаемости заболевания и схемой исследования авторы настоящего изобретения планируют включить 6 пациентов в течение одного года. Эта оценка была сделана с учетом того, что уже идентифицированы 3 потенциальных участника.

[00253] Процедуры исследования включают период скрининга, период лечения и период последующего наблюдения. Подробная информация о визитах на каждой фазе и связанных процедурах исследования подробно описана ниже и обобщена в таблице 4.

[00254] Таблица 4.

[00255] Период скрининга

[00256] Визит -1. Визит прескрининга

[00257] Потенциальных кандидатов проинформируют о целях и характеристиках испытания, и будут получать письменное информированное согласие, заполненное и подписанное пациентом (или его законным представителем, в случае несовершеннолетия пациента) в двух экземплярах. Чтобы подходить для участия для исследования, пациенты должны полностью отвечать всем критериям включения и ни одному из критериев исключения, которые будут проверяться. Он включает процедуру предварительной обработки для мобилизации и получения жизнеспособных CD34⁺ клеток для осуществления: A. хранения 2 х 10⁶ CD34+ клеток/кг массы тела в качестве резерва в случае отсутствия приживления, B. трансдукции по меньшей мере 6 х 10⁶ CD34+ клеток/кг массы тела с помощью вектора EU/3/14/1130 для получения лекарственного продукта и для выполнения всех контролей качества, необходимых для выпуска лекарственного продукта. В исследование будут включены только пациенты с достаточным количеством трансдуцированных клеток, доступных после выпуска лекарственного продукта (2 х 10⁶ трансдуцированных CD34⁺ клеток/кг массы тела).

[00258] При этом визите также будут выполнены следующие процедуры:

- регистрация соответствующего медицинского анамнеза или хирургических операций в анамнезе;

- регистрация демографических данных и клинически значимых результатов физикального обследования;

- регистрация соответствующих сопутствующих лекарственных препаратов;

- тестирование периферической крови с проведением стандартного клинического анализа крови (CBC), биохимического анализа, определение коагуляции и серологии;

- выполнение эхокардиограммы, теста на функцию легких и рентгенологического анализа грудной клетки;

- заполнение опросника качества жизни (SF-36 или PEDSQL);

- генетическая диагностика PKD.

[00259] Чтобы подходить для участия в исследовании, пациенты должны полностью отвечать всем из следующих критериев включения и ни одному из критериев исключения.

[00260] Критерии включения являются следующими: пациенты мужского или женского пола, возраст >2 лет на момент набора, готовность дать подписанное информированное согласие (которое будет подписано родителями или законным представителем в случае детей возрастом до 18 лет), ранее поставленный диагноз PKD, подтвержденный генетическим тестированием, в анамнезе тяжелая зависимая от переливания анемия, не реагирующая на спленэктомию, кандидат для аутологической трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, доступность ≥ 2 х 10⁶ трансдуцированных CD34⁺ клеток/кг массы тела, а также лечение и последующее наблюдение в течение по меньшей мере 2 последних лет в специализированном центре, в котором сохранились подробные медицинские записи, включая историю переливаний.

[00261] Критериями исключения являются следующие: положительные результаты теста на наличие вируса иммунодефицита человека типа 1 или 2 (HIV 1 и HIV 2), нескорректированное нарушение свертываемости крови, наличие других причин гемолиза, любое предшествующее или текущее злокачественное, или миелопролиферативное, или иммунодефицитное нарушение, близкий родственник с известным или подозреваемым семейным раковым синдромом (включая без ограничения наследственный синдром рака молочной железы и яичника, наследственный синдром неполипозного колоректального рака и семейный аденоматозный полипозом), в случае пациентов с предшествующей аллогенной трансплантацией наличие остаточных клеток донорского происхождения, пациенты с тяжелыми осложнениями, которые после медицинской оценки считаются страдающими патологиями сердечной, легочной, печеночной или почечной функции III/IV степени, неконтролируемое припадочное расстройство, диффузионная способность легких для монооксида углерода (DLco) < 50% от прогнозируемой (скорректированной по гемоглобину), любое другое доказательство тяжелого перенасыщения железом, которое по мнению исследователя гарантирует исключение, участие в другом клиническом исследовании с экспериментальным лекарственным средством не позднее 30 суток до проведения скрининга, доступность HLA-идентичного донора-родственника для аллогенной трансплантации костного мозга, для женщин беременность или кормление грудью, пациенты, которые по критериям исследователя не смогут понять цели исследования, преимущества и риски и/или не смогут соблюдать процедуры исследования, неудовлетворительный функциональный статус, о чем свидетельствует индекс Камофского <80 у взрослых или балл по шкале Лански <80 у детей.

[00262] Статистический анализ исследования будет описательным. Качественные конечные точки будут описываться в виде частот и процентов. Качественные конечные точки включают нежелательные явления, число пациентов с приживлением стволовых клеток, число пациентов, которые стали «независимыми от переливания», число пациентов, у которых наблюдается клинически значимое снижение анемии, число пациентов, у которых наблюдается клинически значимое снижение ретикулоцитоза, число пациентов с приживлением стволовых клеток, у которых может быть выявлено присутствие трансдуцированных клеток, и улучшение качества жизни по сравнению с исходным уровнем, измеренное с помощью опросника SF-36 или PEDSQL. Качественные конечные точки будут описываться с помощью среднего и стандартного отклонения или с помощью медианы и квартилей. Качественные конечные точки включают снижение анемии и ретикулоцитоза по сравнению с исходным уровнем, число переливаний, необходимых на протяжении периода исследования, относительно числа переливаний за последний 1 год перед исходной оценкой и число копий вектора в клетках периферической крови и костного мозга. Все конечные точки будут описываться в конце исследования.

[00263] В предыдущей работе продемонстрирована пригодность генной терапии HSC для лечения PKD у мышей при трансплантации свыше 25% клеток, подвергнутых генной коррекции. Эти результаты означают, что для достижения терапевтического эффекта в отношении PKD необходимо значительное число HSC, подвергнутых коррекции с помощью донорского гена (Zaucha, Yu et al. 2001), и высокие уровни экспрессии трансгена. Авторы настоящего изобретения разработали новый терапевтический лентивирусный вектор, предлагаемый для данного клинического испытания, который содержит эукариотический промотор гена hPGK, управляющий экспрессией кДНК PKLR, который был разработан в качестве лекарственного средства для лечения редких заболеваний в августе 2014 года (EU/3/14/1130). В отношении данного вектора провели доклинический протокол генной терапии PKD на мышиной модели заболевания. При дозировках лентивируса, основанных на клинических стандартах, эктопическая экспрессия RPK была способна нормализовать эритроидный компартмент, корректируя гематологический фенотип и обращая патологию органа. Метаболомные исследования продемонстрировали функциональную коррекцию пути гликолиза в RBC, подвергнутых генетической коррекции, при отсутствии метаболических нарушений, наблюдаемых в лейкоцитах. Следует отметить, что в случае WBC, анализируемых параллельно, показано отсутствие изменений метаболического равновесия в лейкоцитах при эктопической экспрессии RPK под действием убиквитарного промотора, такого как PGK, что исключает метаболическое преимущество лейкоцитов в качестве возможной проблемы безопасности и усиливает терапевтический потенциал вектора EU/3/14/1130.

[00264] Восстановление множественных линий дифференцировки и отсутствие какого-либо лейкозного осложнения или клональной экспансии у вторичных реципиентов после пролиферативного стресса, индуцированного ретрансплантацией BM, демонстрируют долгосрочную стабильность и безопасность протокола на основе вектора LV с PGK-coRPK. Применение эукариотического промотора гена PGK человека, который, по-видимому, приводит к более физиологической экспрессии трансгена RPK, который, как было доказано, является слабым трансактиватором, и в настоящее время используется в клиническом испытании в отношении метахроматической лейкодистрофии (MLD), также может объяснять безопасность процедуры в целом.

[00265] Чтобы оценить долгосрочную безопасность генной терапии HSC посредством анализа сайтов интеграции вектора, использовали секвенирование нового поколения для прогнозирования риска инсерционного онкогенеза в HSC. В мышином геноме картировали более чем 5173892 ридов последовательностей с получением в общей сложности 2220 уникальных IS вектора, при этом не были выявлены доказательства in vivo экспансии или отбора клонов, содержащих IS. Напротив, данные настоящего изобретения указывают на клональный состав и динамику гемопоэза после трансплантации трансдуцированных HSC у мышей, что означает истинную и стабильную генетическую in vivo модификацию HSC с течением времени. В целом, анализ паттерна интеграции вектора подчеркивает свойства безопасности LV-вектора с PGK-coRPK, который обеспечивает генетические коррекцию PKD, при отсутствии доказательств генотоксичности.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> СЕНТРО ДЕ ИНВЕСТИГАСЬОНЕС ЭНЕРХЕТИКАС, МЕДИОАМБЬЕНТАЛЕС И ТЕКНОЛОХИКАС

ФУНДАСЬОН ИНСТИТУТО ДЕ ИНВЕСТИГАСЬОН САНИТАРИА ФУНДАСЬОН ХИМЕНЕС ДИАС

СЕНТРО ДЕ ИНВЕСТИГАСЬОН БИОМЕДИКА ЭН РЕД

СЕГОВИЯ, Хосе С.

ГОМЕС, Мария Г.

НАВАРРО, Сусана

МЕСА, Нестор

БУЭРЕН, Хуан

БРАВО, Мария Г.

<120> КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ УСИЛЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА PKLR

<130> ROPA-001/01US 329592-2034

<140> PCT/US2017/028695

<141> 2017-04-20

<150> US 62/325,397

<151> 2016-04-20

<160> 9

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 677

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерный модифицированный посттранскрипционный регуляторный элемент

вируса гепатита сурков (Wpre)

<400> 1

cgagcatctt accgccattt attcccatat ttgttctgtt tttcttgatt tgggtataca 60

tttaaatgtt aataaaacaa aatggtgggg caatcattta catttttagg gatatgtaat 120

tactagttca ggtgtattgc cacaagacaa acatgttaag aaactttccc gttatttacg 180

ctctgttcct gttaatcaac ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctgatattct 240

taactatgtt gctcctttta cgctgtgtgg atatgctgct ttaatgcctc tgtatcatgc 300

tattgcttcc cgtacggctt tcgttttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct 360

ttatgaggag ttgtggcccg ttgtccgtca acgtggcgtg gtgtgctctg tgtttgctga 420

cgcaaccccc actggctggg gcattgccac cacctgtcaa ctcctttctg ggactttcgc 480

tttccccctc ccgatcgcca cggcagaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac 540

aggggctagg ttgctgggca ctgataattc cgtggtgttg tcggggaagg gcctgctgcc 600

ggctctgcgg cctcttccgc gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg 660

ggccgcctcc ccgcctg 677

<210> 2

<211> 28

<212> ДНК

<213> Вирус иммунодефицита человека 1

<400> 2

tttaaaagaa aaggggggat tggggggt 28

<210> 3

<211> 205

<212> ДНК

<213> Вирус иммунодефицита человека 1

<400> 3

tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg 60

tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta 120

ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 180

gaatcctggc tgtggaaaga tacct 205

<210> 4

<211> 566

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 4

attatggtaa atccacttac tgtctgccct cgtagccatc gagataaacc ctaccgggta 60

ggggaggcgc ttttcccaag gcagtctgga gcatgcgctt tagcagcccc gctgggcact 120

tggcgctaca caagtggcct ctggcctcgc acacattcca catccaccgg taggcgccaa 180

ccggctccgt tctttggtgg ccccttcgcg ccaccttcta ctcctcccct agtcaggaag 240

ttcccccccg ccccgcagct cgcgtcgtgc aggacgtgac aaatggaagt agcacgtctc 300

actagtctcg tgcagatgga cagcaccgct gagcaatgga agcgggtagg cctttggggc 360

agcggccaat agcagctttg ctccttcgct ttctgggctc agaggctggg aaggggtggg 420

tccgggggcg ggctcagggg cgggctcagg ggcggggcgg gcgcccgaag gtcctccgga 480

ggcccggcat tctgcacgct tcaaaagcgc acgtctgccg cgctgttctc ctcttcctca 540

tctccgggcc tttcgacctg cagccc 566

<210> 5

<211> 138

<212> ДНК

<213> Вирус иммунодефицита человека 1

<400> 5

tcgacgcagg actcggcttg ctgaagcgcg cacggcaaga ggcgaggggc ggcgactggt 60

gagtacgcca aaaattttga ctagcggagg ctagaaggag agagatgggt gcgagagcgt 120

cagtattaag cgggggag 138

<210> 6

<211> 236

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированная нуклеотидная последовательность LTR

<400> 6

tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatctgct ttttgcttgt actgggtctc 60

tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 120

agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 180

ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagt 236

<210> 7

<211> 235

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Модифицированная нуклеотидная последовательность LTR

<400> 7

tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatctgct ttttgcttgt actgggtctc 60

tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 120

agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 180

ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcag 235

<210> 8

<211> 516

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированная кодон-оптимизированная промоторная последовательность

PKLR человека

<400> 8

tccacggggt tggggttgcg ccttttccaa ggcagccctg ggtttgcgca gggacgcggc 60

tgctctgggc gtggttccgg gaaacgcagc ggcgccgacc ctgggtctcg cacattcttc 120

acgtccgttc gcagcgtcac ccggatcttc gccgctaccc ttgtgggccc cccggcgacg 180

cttcctcgtc cgcccctaag tcgggaaggt tccttgcggt tcgcggcgtg ccggacgtga 240

caaacggaag ccgcacgtct cactagtacc ctcgcagacg gacagcgcca gggagcaatg 300

gcagcgcgcc gaccgcgatg ggctgtggcc aatagcggct gctcagcagg ggcgcccgag 360

agcagcggcc gggaaggggc ggtgcgggag gcggggtgtg gggcggtagt gtgggccctg 420

ttcctgcccg cgcggtgttc cgcattctgc aagcctccgg agcgcacgtc ggcagtcggc 480

tccctcgttg accgaatcac cgacctctct ccccag 516

<210> 9

<211> 677

<212> ДНК

<213> Вирус гепатита сурков

<400> 9

cgagcatctt accgccattt attcccatat ttgttctgtt tttcttgatt tgggtataca 60

tttaaatgtt aataaaacaa aatggtgggg caatcattta catttttagg gatatgtaat 120

tactagttca ggtgtattgc cacaagacaa acatgttaag aaactttccc gttatttacg 180

ctctgttcct gttaatcaac ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctgatattct 240

taactatgtt gctcctttta cgctgtgtgg atatgctgct ttaatgcctc tgtatcatgc 300

tattgcttcc cgtacggctt tcgttttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct 360

ttatgaggag ttgtggcccg ttgtccgtca acgtggcgtg gtgtgctctg tgtttgctga 420

cgcaaccccc actggctggg gcattgccac cacctgtcaa ctcctttctg ggactttcgc 480

tttccccctc ccgatcgcca cggcagaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac 540

aggggctagg ttgctgggca ctgataattc cgtggtgttg tcggggaagg gcctgctgcc 600

ggctctgcgg cctcttccgc gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg 660

ggccgcctcc ccgcctg 677

<---

1. Рекомбинантный вектор доставки гена, содержащий кассету экспрессии, содержащую полинуклеотидную последовательность, содержащую следующее в 5’-3’-направлении:

a) промоторную последовательность;

b) последовательность, кодирующую терапевтический продукт гена, где терапевтический продукт гена представляет собой полипептид пируваткиназы печени и эритроцитов (PKLR) человека; и

c) сигнал экспорта рибонуклеиновой кислоты (РНК),

где промоторная последовательность функционально связана с последовательностью, кодирующей полипептид PKLR, и где рекомбинантный вектор доставки гена представляет собой лентивирус (LV).

2. Рекомбинантный вектор доставки гена по п. 1, где промотор представляет собой промотор фосфоглицераткиназы (PGK).

3. Рекомбинантный вектор доставки гена по п. 1 или 2, где последовательность, кодирующая продукт гена, является кодон-оптимизированной.

4. Рекомбинантный вектор доставки гена по любому из пп. 1-3, где сигнал экспорта РНК представляет собой мутантный посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков (Wpre).

5. Рекомбинантный вектор доставки гена по п. 4, где мутантный Wpre представляет собой химерный Wpre, содержащий последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 80% идентичностью с SEQ ID NО: 1.

6. Рекомбинантный вектор доставки гена по любому из пп. 1-5, дополнительно содержащий одну или более энхансерных последовательностей.

7. Рекомбинантный вектор доставки гена по любому из пп. 1-6, дополнительно содержащий последовательность полипуринового тракта (PPT) или последовательность сигнала полиаденилирования (polyA).

8. Рекомбинантный вектор доставки гена по любому из пп. 1-7, дополнительно содержащий одну или более из следующих последовательностей:

i) последовательность сигнала упаковки;

ii) усеченную последовательность Gag;

iii) Rev-чувствительный элемент (RRE);

iv) центральный полипуриновый тракт (cPPT);

v) центральную терминальную последовательность (CTS) и

vi) элемент последовательности (USE), расположенный против хода транскрипции, необязательно из вируса обезьян 40 (SV40-USE).

9. Рекомбинантный вектор доставки гена по любому из пп. 1-8, дополнительно содержащий последовательности длинного концевого повтора 5’- и 3’-конца.

10. Фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения недостаточности пируваткиназы (PKD), содержащая эффективное количество клеток, содержащих рекомбинантный вектор доставки гена по любому из пп. 1-9.

11. Фармацевтическая композиция по п. 10, где клетки представляют собой гемопоэтические стволовые клетки.

12. Фармацевтическая композиция по п. 11, где клетки представляют собой коммитированные гемопоэтические эритроидные клетки-предшественники.

13. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 10-12, где клетки являются аутологическими по отношению к субъекту.

14. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 10-12, где клетки являются аллогенными по отношению к субъекту.

15. Фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения недостаточности пируваткиназы (PKD), содержащая фармацевтически приемлемый наполнитель и эффективное количество рекомбинантного вектора доставки гена по любому из пп. 1-9.

16. Способ экспрессии трансгена в эритроидных клетках in vitro, предусматривающий приведение одной или более эритроидных клеток в контакт с эффективным количеством рекомбинантного вектора доставки гена по любому из пп. 1-9.

17. Способ экспрессии трансгена в эритроидных клетках in vitro, предусматривающий приведение одной или более эритроидных клеток в контакт с эффективным количеством рекомбинантного вектора доставки гена по любому из пп. 1-9, где после указанного приведения в контакт PKLR экспрессируется на выявляемых уровнях в одной или более эритроидных клетках.