Способ диагностики расстройства вегетативной нервной системы у девочек дошкольного возраста, ассоциированного с избыточной контаминацией биосред детей марганцем

Изобретение относится к биологическим исследованиям и медицине. Описан способ диагностики расстройства вегетативной нервной системы у девочек дошкольного возраста, ассоциированного с избыточной контаминацией биосред детей марганцем. У девочки дошкольного возраста производят отбор пробы крови и определяют в ней содержание марганца и содержание специфического к марганцу иммуноглобулина Ε (IgE). Выполняют генетические исследования, для этого отбирают пробу буккального эпителия, осуществляют выделение из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Проводят генотипирование полиморфизма гена ММР-9 и гена AGTR1, используя в качестве праймера участок ДНК путем исследования генотипов гена ММР-9 Gln279Arg (rs17576) и генотипов гена AGTR1 А1166С (rs5186). И при одновременном выполнении следующих диагностических критериев: наличие генотипа АА гена ММР-9 Gln279Arg (rs17576) и генотипа АА гена AGTR1 А1166С (rs5186), при условии превышения содержания марганца в крови в 2,0 и более раз по сравнению с референтным уровнем, а также при превышении по сравнению с верхней границей физиологической нормы уровня IgE к марганцу не менее чем в 1,5 раза диагностируют у девочек расстройство вегетативной нервной системы, ассоциированное с избыточной контаминацией биосред марганцем. Технический результат заключается в обеспечении достоверности способа. 1 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к биологическим исследованиям и медицине, и предназначено для идентификации неблагоприятного воздействия марганца, поступающего из окружающей среды, в виде расстройства вегетативной нервной системы девочек-дошкольниц, проживающих на территории с повышенным содержанием этого токсиканта в окружающей среде, и может быть использовано в целях диагностики.

Изобретение может быть использовано для постановки предварительного диагноза как в специализированных клиниках при обследовании пациентов, так и в обычных учреждениях здравоохранения. Результаты указанных обследований необходимы для разработки индивидуальных программ наблюдения и лечения в зависимости от тяжести нарушения нервной системы ребенка, а, кроме того, могут быть использованы при формировании санитарно-гигиенических мероприятий по предупреждению и устранению воздействия вредных химических веществ, обуславливающих формирование указанной патологии.

Для задач диагностики нарушений здоровья, в частности, нарушения нервной системы, ассоциированной с воздействием марганца, а также для оценки эффективности профилактики и лечения, актуальным является выделение маркерных показателей указанной патологии, которые можно использовать в качестве дополнительных диагностических показателей, характеризующих ответ организма на специфическое средовое окружение, в частности, марганца.

Под термином «расстройство вегетативной нервной системы» понимается функциональное расстройство вегетативной нервной системы, регулирующей нормальную деятельность всех внутренних органов и систем организма (код, согласно Международной классификации болезней 10-го пересмотра - МКБ10: G90.8 «Другие расстройства вегетативной (автономной) нервной системы»). У детей астенические расстройства зачастую характеризуются продолжительным инкубационным периодом и отсутствием каких-либо ярко выраженных клинических признаков на начальных этапах развития болезни. В процессе своего развития патологическое состояние начинает проявляться более интенсивно, проявляется раздражительностью, быстрой утомляемостью, нарушениями сна у ребенка. При ваготонии склонность к покраснению кожных покровов, кисти рук цианотичны, влажные и холодные на ощупь, мраморность кожных покровов, общий гипергидроз, склонность к угревой сыпи в пубертате, нередки проявления нейродермита, различные аллергические реакции по типу крапивницы, отека Квинке. При симпатикотонии кожные покровы у детей бледные, сухие, сосудистый рисунок не выражен. Кожа на кистях рук сухая, холодная, иногда проявляются экзематозные проявления, зуд. Дети с симпатикотонией чаше худые, хотя имеют повышенный аппетит. Склонность к гипертермии, к повышению артериального давления (АД).

В связи с широчайшим использованием химических технологий в различных производственных циклах и сферах человеческой деятельности пристальное внимание ученых и медиков привлекает проблема выявления пороговых критериев, позволяющих на ранних этапах оценить, что воздействие вредного химического вещества превышает компенсаторные возможности организма и наносит вред здоровью человека. Актуальность исследования неблагоприятного воздействия марганца особенно обусловлена на территориях, вблизи которых размещены предприятия цветной металлургии. Цветная металлургия использует марганец в малых объемах как легирующий металл при изготовлении специальных сплавов. Наибольшее потребление приходится на процесс выплавки AMS - сплава алюминия, кремния, железа и марганца, с содержанием последнего до 10%).

В условиях избыточной контаминации биосред марганцем возможно формирование риска возникновения патологии вегетативно (автономной) нервной системы, в основе которой лежит нарушение формирования (деградация) внеклеточного матрикса, с одной стороны, и дисбаланс сосудистого тонуса, с другой, ведущего к расстройствам, связанным с обменом веществ и питанием тканей. Возникающий продуктивный хронический воспалительный процесс приводит к транзиторным трофическим расстройствам, что является следствием нарушения кровотока, а клетки, в том числе нервной системы, не получают необходимой трофической поддержки.

Отсутствие специализированной технологии, ориентирующей врача на выявление случаев функциональных заболеваний центральной нервной системы (ЦНС), связанных с воздействием опасных химических факторов, ограничивает его диагностические возможности, снижает эффективность проводимых лечебных мероприятий и не позволяет в полной мере предупреждать развитие тяжелых и осложненных форм у детей.

Действующие стандарты и протоколы, устанавливающие объем и порядок диагностических мероприятий детям с функциональными заболеваниями ЦНС, не предусматривают проведение химико-аналитических исследований для идентификации токсикантов в биосредах, специальных лабораторных исследований для оценки морфофункционального состояния клеток ЦНС и функциональных исследований для оценки уровня развития когнитивных функций, что исключает возможность формирования доказательной базы развития этой патологии в связи с действием химических факторов.

Например, из информации, размещенной на сайте интернет-ресурсов https.//diseases.medelement.com/disease/view/mtm4nzm%253d/fdb8, известно, что для диагностики заболевания по МКБ10: G90.8 «Другие расстройства вегетативной (автономной) нервной системы» проводят следующие основные и дополнительные диагностические мероприятия:

основные (обязательные) диагностические обследования, проводимые на амбулаторном уровне:

• измерение артериального давления, частоту сердечных сокращений, частоту дыхания в покое, при физической, умственной и эмоциональной нагрузках;

• клиноортопробу;

• общий анализ крови (6 параметров);

• определение натрия, кальция, калия в сыворотке крови;

• определение глюкозы в сыворотке крови;

• общий анализ мочи;

• электрокардиографическое исследование (в 12 отведениях);

Дополнительные (рекомендуемые) диагностические обследования, проводимые на амбулаторном уровне:

• биохимический анализ крови: определение аланинаминотрансферазы (АлАТ), аспартатаминотрансферазы (АсАТ), общего билирубина, прямого билирубина, тимоловой пробы, С - реактивного белка.

То есть, действительно, при диагностике функциональных расстройств ЦНС не предусматривается проведение химико-аналитических исследований для идентификации токсикантов в биосредах и специальных лабораторных показателей, отражающих токсическое действие токсичных химических соединений, что делает указанный известный способ не эффективным в условиях воздействия контаминантов из среды обитания окружающей среды.

Из уровня техники известны следующие технические решения, релевантные заявляемому изобретению.

Из уровня техники известен способ определения токсичности действия тяжелых металлов на организм (Патент РФ №2138816.), согласно которому определяют содержание тяжелых металлов в сыворотке крови и дополнительно лабораторный показатель - активность каталазы в эритроцитах, и при ее снижении (при норме 72,5-106,1 c-1/г гемоглобина) в сочетании с повышенным уровнем тяжелых металлов по сравнению с нормой действие последних определяют как токсическое. Данный способ верифицирован только с характером течения гастроэнтерологической патологии, что делает его малоинформативным для выявления других донозологических форм нарушений здоровья детей, в частности, касающихся ЦНС.

Также известен способ определения токсичности действия марганца на организм детей, проживающих в условиях техногенной нагрузки среды обитания (Патент РФ №2437095), согласно которому при одновременном установлении достоверных зависимостей: повышенный уровень марганца в крови - пониженный уровень антиоксидантной активности и/или повышенный уровень малонового диальдегида в плазме крови, действие марганца определяют как токсичное. Однако, указанный известный способ недостаточно информативен, т.к. отражает только работу антиоксидантной системы организма и неприменим для диагностики заболеваний нервной системы, т.к. используемые лабораторные показатели не могут быть достоверными маркерами развития синдрома вегетативной дисфункции.

Известен способ ранней диагностики заболеваний нервной системы у детей, потребляющих воду с повышенным содержанием марганца (Патент РФ №2569763). Способ характеризуется тем, что проводят корреляционный анализ зависимости: доза марганца из питьевой воды - содержание марганца в крови ребенка, дополнительно проводят корреляционный анализ между уровнем ГАМК и/или глутамата в сыворотке крови и уровнем марганца в крови и при определении в цельной крови пациентов уровня марганца выше референтного уровня, который составляет 0,011 мг/дм³, одновременно с определением в сыворотке крови пациентов уровня глутамата выше референтного уровня, который составляет 83,24 мкмоль/дм³, и/или с определением в сыворотке крови пациентов уровня ГАМК ниже референтного уровня, который составляет 0,077 мкмоль/дм³, диагностируют донозологическую стадию, предшествующую развитию заболеваний нервной системы у детей, потребляющих воду с повышенным содержанием марганца. Изобретение может использоваться для планирования санитарно-гигиенических мероприятий по предупреждению воздействия вредных веществ, в частности марганца, на нервно-психическое развитие детей. Вышеуказанное изобретение обеспечивает достаточно высокую точность диагностики. Однако, данное изобретение не позволяет уточнить развитие именно заболеваний вегетативной нервной системы, связанные с особенностями, в том числе генетическими, состояния регуляции тонуса (ангиотензин) и околососудистого матрикса (матриксная металлопротеиназа, васкуло-эндотелиальный фактор роста), идентификация которых позволяет выявить именно вегетативную составляющую патологии нервной системы, а уточнение избыточности не только содержания марганца в крови, но и специфического иммуноглобулина Ε (IgE) к марганцу позволяет установить, что марганец не только присутствует в организме, но и оказывает эффект. Исходя из этого, вышеуказанное изобретение не может обеспечить необходимую чувствительность и точность диагностики именно вегетативных нарушений нервной системы и именно в условиях присутствия в организме марганца, так как не определяется наличие эффекта контаминации марганцем.

Известен Способ диагностики у детей функционального расстройства центральной нервной системы, ассоциированного с сочетанным воздействием марганца, свинца, бензола, ксилола и стирола техногенного происхождения (Патент РФ №2622010). Сущность изобретения заключается в следующем. Производят отбор пробы крови у ребенка и устанавливают в ней содержание марганца, свинца, бензола, ксилола и стирола. При содержании в крови марганца и свинца, превышающем их референтный уровень, а также при наличии в крови бензола, ксилола и стирола выше нижнего предела обнаружения, проводят кардиоинтервалографию (КИГ) для определения исходного вегетативного тонуса. Выполняют биохимический и иммуноферментный анализ сыворотки крови с определением следующих лабораторных показателей: уровня малонового диальдегида (МДА), ионизированного кальция, уровня антиоксидантной активности сыворотки крови (АОА), уровня гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), уровня глутаминовой кислоты, уровня серотонина, глутатионпероксидазы (ГлПО) и тиреотропного гормона (ТТГ), и при установлении по результатам КИГ ваготонического типа исходного вегетативного тонуса у ребенка, а также при отклонениях следующих лабораторных показателей относительно физиологической возрастной нормы, заключающихся в повышении уровня МДА, глутаминовой кислоты, ионизированного кальция, ТТГ, при одновременном снижении уровня АОА, ГАМК, серотонина, ГлПО, диагностируют у ребенка функциональное расстройство центральной нервной системы, ассоциированное с сочетанным воздействием указанных токсикантов техногенного происхождения, причем диагностируют в том случае, если указанные отклонения результатов КИГ и лабораторных показателей присутствуют у ребенка в количестве не менее 80% от количества вышеуказанных отклонений. Изобретение обеспечивает диагностику у детей функциональных нарушений ЦНС, преимущественно когнитивных нарушений, ассоциированных с внешнесредовым сочетанным воздействием токсикантов техногенного происхождения: марганца, свинца, бензола, ксилола, стирола.

Недостатком указанного способа является то, что способ ориентирован на диагностику состояния психического здоровья, ассоциированного с нарушениями высшей нервной деятельности, а не на диагностику расстройства вегетативной нервной системы девочки-дошкольницы, а также в этом способе не учитывается возможность генетической предрасположенности по критериям полиморфности генов.

Из уровня техники известна диссертационная работа «Состояние эфферентного отдела нервной системы, психологического статуса и конституционально-генетические особенности у больных с вегетативными кризами (ВК)», автор: Закирова Д.Д., Казань, 2011 г. (Медицинские Диссертации http://medical-diss.com/medicina/sostoyanie-efferentnogo-otdela-nervnoy-sistemy-psihologicheskogo-statusa-i-konstitutsionalno-geneticheskie-osobennosti-u-#ixzz5BIkC5WjL), в которой указано, что при синдроме вегетативной дисфункции возникают сочетанные изменения в эфферентном звене анимальной нервной системы и психологическом статусе, проявляющиеся в ускорении процессов эфферентации и особом (демонстративном) типе акцентуации личности. Изучался полиморфизм генов: 1) G603A гена транспортера глутамата ЕААТ; 2) rs545098 G/A гена ионотропного рецептора глутамата GLUR 1 (GRIA1); 3) rs9307959 С/Т гена ионотропного рецептора глутамата GLUR 2 (GRIA2); 4) G49S гена бета-адренорецептора ADRB1. Была выявлена достоверная связь генотипов ADRB1 GG, Glur1 GG, Glur2 СТ, Glur2 СС, ЕААТ AG, ЕААТ АА, ADRB1 SG с нарушениями вегетативного гомеостаза, влияние генотипов Glur2 и ЕААТ на тяжесть, длительность заболевания и клинические проявления. В группе с гипервентиляционными вегетативными кризами прослежена связь «неблагоприятного» вегетативного гомеостаза с генотипом ADRB1 GG, GLUR2 СС. Полученные данные свидетельствуют о наличии предрасположенности к вегетативными кризам у лиц с определенным генотипом.

Недостатком указанного способа является то, что способ позволяет характеризовать исключительно предрасположенность к развитию вегетативных кризов, при этом не оценивается фактическое состояние вегетативной нервной системы по уровню экспрессии медиаторов вегетативной регуляции и самих геноопосредованных белков, например, глутамата. Тем более этот способ не был испытан на девочках-дошкольницах.

Из патента РФ №2687731 известен способ диагностики у детей астено- вегетативного синдрома в условиях экспозиции алюминием. Согласно способу в пробе мочи ребенка определяют содержание алюминия. Выделяют ДНК из пробы буккального эпителия. Затем на детектирующем амплификаторе с использованием ПЦР в режиме реального времени проводят генотипирование полиморфизма генов ионотропного рецептора глутамата GRIA1 (rs545098) и гена глиального глутаматного транспортера SLC2A1 (rs841839). При одновременном выполнении следующих условий: наличие вариантного гомозиготного или гетерозиготного генотипов гена GRIА1 (rs545098) и гена SLC2A1 (rs841839), при условии одновременного обнаружения у пациента превышения содержания алюминия в моче более чем в 1,3 раза по сравнению с референтным диагностируют у ребенка наличие астено-вегетативного синдрома в условиях экспозиции алюминием.

Однако этот известный способ применим только в ассоциации с токсикантом - алюминием, и не позволяет диагностировать расстройство нервной системы от химического контаминанта марганца.

При этом из уровня техники не были выявлены известные способы генетической оценки нарушений вегетативной нервной системы, ассоциированных с внешнесредовым воздействием марганца, поэтому сделать выбор ближайшего аналога к заявляемому объекту не представляется возможным.

Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в обеспечении достоверности установления на ранней стадии оценки влияния марганца на развитие расстройства вегетативной нервной системы, за счет использования в качестве информативного критерия совокупности маркеров, а именно: уровня контаминации марганцем и наличия генетического полиморфизма в отношении двух генов: матриксной металлопротеиназы ММР-9 Gln279Arg (rs17576) и рецептора ангиотензина AGTR1 А1166С (rs5186).

Поставленный технический результат достигается предлагаемым способом диагностики расстройства вегетативной нервной системы у девочек дошкольного возраста, ассоциированного с избыточной контаминацией биосред детей марганцем, согласно которому у девочки дошкольного возраста производят отбор пробы крови, определяют в ней содержание марганца и содержание специфического к марганцу иммуноглобулина Ε (IgE), и при превышении марганца в 2,0 и более раз по сравнению с референтным количеством, равным 0,004 мкг/см³, выполняют следующие генетические исследования, отбирают пробу буккального эпителия, осуществляют выделение из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), затем на детектирующем амплификаторе с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени проводят генотипирование полиморфизма гена ММР-9 и гена AGTR1, используя в качестве праймера участок ДНК путем исследования генотипов гена ММР-9 Gln279Arg (rs 17576) и генотипов гена AGTR1 А1166С (rs5186), устанавливая при этом для гена ММР-9 одно из следующих его состояний: дикое гомозиготное АА, или вариантное гомозиготное GG, или гетерозиготное AG; а для гена AGTR1 одно из следующих его состояний: гетерозиготное АС, или дикое гомозиготное АА, или вариантное гомозиготное СС, и при одновременном выполнении следующих диагностических критериев: наличие генотипа АА гена ММР-9 Gln279Arg (rs17576) и генотипа АА гена AGTR1 А1166С (rs5186), при условии превышения содержания марганца в крови в 2,0 и более раз по сравнению с референтным уровнем, а также при превышении по сравнению с верхней границей физиологической нормы уровня IgE к марганцу не менее, чем в 1,5 раза, диагностируют у девочек дошкольного возраста расстройство вегетативной нервной системы, ассоциированное с избыточной контаминацией биосред марганцем.

Указанный технический результат обеспечивается за счет следующего.

Согласно современным эпидемиологическим и клиническим научным данным отечественных и зарубежных авторов воздействие химического загрязнения среды обитания играет значимую роль в развитии заболеваний нервной системы у детей. Детская популяция представляет собой группу высокого риска, так как дети имеют ряд физиологических особенностей, характеризуются наличием критических периодов развития, большей чувствительностью к влиянию токсичных веществ.

Поиск биологических генетических маркеров и разработка методов, позволяющих идентифицировать патологию нервной системы у детей на ранних этапах ее возникновения, является одной из важнейших задач фундаментальной медицины на современном этапе (Иванова С.А. и др., 2013; Craig-Schapiro R., Fagan Α.Μ., 2009). Генетические биомаркеры -это индикаторные показатели, объективно измеряемые и оцениваемые, которые могут служить предикторами нормальных и патофизиологических процессов. Они позволяют проводить анализ и прогнозировать предполагаемый механизм возникновения и развития патологических состояний (Craig-Schapiro R., Fagan Α.Μ., 2009; Grandjean P., Budtz-Jorgensen E., 2010).

Воздействие марганца на функциональное состояние ЦНС реализуется за счет того, что этот металл при поступлении в организм легко проникает через гематоэнцефалический барьер, кумулируется в митохондриях и лизосомах. Угнетая активность митохондриальных ферментов, данный металл вызывает нарушения в митохондриальной дыхательной цепи переноса электронов. В результате интенсивного образования активных форм кислорода происходит необратимая модификация нуклеиновых кислот и белков, нарушение целостности мембран нейронов, высвобождение эксайтотоксических медиаторов.

Было установлено, что из проанализированных полимофизмов (48) генов-кандидатов, 2 генетических полиморфизма кандидатных генов достоверно ассоциированы с развитием вегетативных нарушений у девочек-дошкольниц: гена матриксной металлопротеиназы ММР-9 Gln279Arg rs17576 и гена рецептора ангиотензина AGTR1 A1166С rs5186.

Особенностью вегетативных нарушений у девочек является избыточность экспрессии ключевых ферментов деструкции и ангиогенеза - ММР-9, а также ангиотензинпревращающий фермент (АПФ), рецептором которого является ангиотензиногеновый рецептор (Тимошенко О.С, Кугаевская Е.В., Гуреева Т.Α., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю., Соловьева Н.И. Матриксные металлопротеиназы-2 и -9, их эндогенные регуляторы и ангиотензинпревращающий фермент при плоскоклеточной карциноме шейки матки. Архив патологии. 2015;77(5):31-35. https://doi.org/10.17116/patol201577531-35).

Для доказательства правомерности применяемых в предлагаемом способе генетических критериев был использован корреляционный анализ между полученными показателями и содержанием марганца в крови ребенка с использованием модели логистической регрессии, согласно которой рассчитывают вероятность негативного изменения маркера ответа организма (вышеуказанные показатели) при воздействии на организм маркера экспозиции (указанного токсиканта марганца). Выявление и оценка связи между изменением критериев и концентрацией марганца в крови выполняется на основании расчета показателя отношения шансов (OR) и его доверительного интервала (DI). Критерием наличия связи «концентрация марганца в крови - показатель ответа» является 0R≥1. Обоснование маркеров ответа осуществляется на основании оценки параметров зависимости изменения показателя отношения шансов от концентрации марганца в крови, описываемой регрессионной моделью в виде экспоненциальной функции. В качестве критерия для проверки статистических гипотез используется критерий Фишера (F). Различия считаются статистически значимыми при вероятности р≤0,05.

По результатам анализа полиморфизма генов-кандидатов между исследуемыми группой наблюдения (девочки дошкольного возраста с расстройством вегетативной (автономной) нервной системы) и группой сравнения (условно здоровые девочки дошкольного возраста), где в роли действующего фактора выступает марганец, были установлены значимые различия между частотами генотипов и аллелей:

- более высокая распространенность в группе наблюдения по сравнению с группой сравнения генотипа АА и аллеля А гена матриксной металлопротеиназы ММР-9 Gln279Arg rs17576, а именно, в 3,4 и в 1,5 раза соответственно, наследуемого по доминантному типу (р<0,01). Согласно моделям наследования установлено, что вариантный генотип АА (OR=6,93; CI:1,92-25,05; р<0,01) и аллель A (OR=3,00; CI:1,28-7,05; р<0,01) являются факторами увеличивающими вероятность развития патологии вегетативной (автономной) нервной системы.

- для генотипа гена ангиотензина AGTR1 А1166С rs5186 в группе наблюдения установлена повышенная частота АА генотипа в 1,6 раза, наследуемого по доминантному типу (р<0,01), при этом аллель А (OR=6,06; CI:1,29-28,43; р<0,05) и генотип АА (OR=7,05; CI:1,38-36,0; р<0,01) выступили как факторы, увеличивающие вероятность развития патологии нервной системы.

Указанные обстоятельства в условиях избыточной контаминации биосред марганцем могут привести к формированию риска возникновения патологии вегетативной (автономной) нервной системы, в основе которой лежит нарушение формирования (деградация) внеклеточного матрикса, с одной стороны, и дисбаланс сосудистого тонуса, с другой, ведущего к расстройствам, связанным с обменом веществ и питанием тканей. Возникающий продуктивный хронический воспалительный процесс приводит к транзиторным трофическим расстройствам, что является следствием нарушения кровотока, а клетки, в том числе нервной системы, не получают необходимой трофической поддержки.

Оценка равновесия распределения частот генотипов генов: гена матриксной металлопротеиназы ММР-9 Gln279Arg rs17576 и гена рецептора ангиотензина AGTR1 A1166С rs5186 в исследуемых группах по кандидатным генам показала соответствие закону распределения Харди-Вайнберга, что позволило использовать модели наследования для оценки вклада генотипов и/или аллелей в развитие нарушений, ассоциированных с автономной нервной системой.

Реализующим процесс вегетативных нарушений нервной системы служит экспозиция марганца, превышающая референтную концентрацию его содержания в крови в 2,0 и более раз (референтный уровень марганца в крови 0,004 мг/л).

По этим показателям можно судить о генетически детерминированном характере функциональных нарушений нервной системы и разрабатывать индивидуальные программы диагностики и коррекции для девочек-дошкольниц.

Матриксные металлопротеиназы (ММР) представляют собой семейство структурно связанных протеолитических ферментов, содержащих ион Zn2+ в активном центре. ММР секретируются разными клетками (фибробласты, макрофаги, гладкомышечные клетки сосудистой стенки, нейтрофилы, хондроциты, остеобласты и др.) и гидролизируют все компоненты экстрацеллюлярного матрикса (ЭМ): все коллагены и проколлагены, протеогликаны, эластин, фибронектин, ламинин, а также адгезивные и другие белки соединительной ткани.

Источником ММР, циркулирующих в системном кровотоке, могут быть активированные лейкоциты, а также клетки нервной ткани при их повреждении. Поэтому предполагают, что определение концентрации и/или активности ММР в периферической крови может быть использовано для выявления повреждения ЦНС. Матриксные металлопротеиназы играют ключевую роль в патогенезе повреждения ЦНС, в частности, повреждения гемато-энцефалического барьера, которое в свою очередь обусловливает развитие воспаление и увеличение объема повреждения нервной ткани.

В настоящее время известно, что лидирующие позиции среди матриксинов по влиянию на атеросклеротическое поражение, систолическую дисфункцию, гипертоническую болезнь, острые коронарные катастрофы занимает ген ММР-9.

Ген AGTR1 - рецептор ангиотензина 1. Мутация А1166С является регуляторной областью гена. Среди множества патогенетических механизмов, которые могут привести к дистонии сосудов, ведущими являются те, которые опосредуют свое влияние через ренин-ангиотензиновую систему (РАС). Работа РАС тесно связана с электролитами, они поддерживают гомеостаз, что необходимо для регуляции сердечной функции, баланса жидкости и многих других процессов.

К настоящему времени установлено, что ангиотензины являются биопептидами с широким физиологическим спектром действия. Они обладают вазопрессорными эффектами, регулируют уровень артериального давления и почечную фильтрацию, водно-солевой обмен, участвуют в регуляции стрессорных реакций. Ангиотензины способны воздействовать на гладкомышечные клетки сосудистой стенки, вызывая вазокон-стрикторные реакции; на эндотелий сосудов, изменяя продукцию N0 и эндотелинов; на миокард, усиливая его сокращения и др. Изменения структуры гена AGTR1 могут приводить к изменениям в регуляции сосудистого тонуса, пролиферации сосудистой стенки, поэтому данный ген можно считать одним из генов-кандидатов, связанных с патологией сердечно-сосудистой системы.

В случае наличия в генетическом профиле у девочек в допубертатном периоде типичного варианта АА генотипа гена рецептора ангиотензиногена AGTR1 А1166С rs5186, избыточное поступление и контаминация гаптенов, обладающих свойствами мутагенов (марганец), приводит к гиперэкспрессии ангиотензина II, что в свою очередь ведет к каскадным процессам - увеличение сосудистой пролиферации клеток гладких мышц, периферической норадренергической активности, модуляция центральной активности симпатической нервной системы, формирование и модуляция внеклеточного матрикса, что подтверждается повышенной экспрессией VEGF. Последующая активация матриксных металлопротеиназ (ММР) посредством индуцированной экспрессии ММР-9 Gln279Arg rs17576, являющихся ключевыми ферментами деградации коллагена приводит к изменению равновесия образования и распада коллагена, что ведет к дисбалансу развития соединительной ткани во внеклеточном матриксе.

Модификация экспрессии матриксных металлопротеиназы в условиях типичного генотипа АА ММР-9 Gln279Arg rs17576 будет характеризоваться избыточностью, несоответствием физиологическим условиям, а дополнительная разрешающая индукция ММР марганцем приводит к замене цинка на марганец с возрастанием транскриптомной агрессивности фермента, что играет ключевую роль в патогенезе нарушений ЦНС и ее вегетативных функций, в частности, повреждения гемато-энцефалического барьера, которое в свою очередь обусловливает развитие воспаления и увеличение объема повреждения нервной ткани, что становится ключевым патогенетическим фактором формирования нарушений регуляции вегетативной (автономной) нервной системы (G90), потенцированной экспозицией низкомолекулярными гаптенами (марганцем).

Таким образом, наличие генотипа АА гена матриксной металлопротеиназы ММР-9 Gln279Arg rs17576 и генотипа АА гена рецептора ангиотензина AGTR1 А1166С rs5186 является фактором, предрасполагающим к вегетативным нарушениям (формирование патологии автономной нервной системы) в условиях избыточной контаминации биосред марганцем

Благодаря использованию в качестве исследуемого материала проб буккального эпителия и крови, а также стандартных методик изучения иммунологических и генетических параметров, обеспечивается простота, надежность и доступность исследований, а также получение результатов нужной информативности.

Установление содержания химического контаминанта - марганца, именно в крови обусловлено тем, что кровь является средой преимущественной элиминации из организма данного элемента, имеющего реферируемые уровни в данной биологической среде.

Благодаря использованию в качестве исследуемого материала буккального эпителия (пробы биологического материала со слизистой щеки), обеспечивается простота и надежность исследований, а также получение нужной информативности в плане выделения из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) проведения генотипирования полиморфизма указанных генов: гена ММР-9 Gln279Arg rs17576 и гена AGTR1 А1166С rs5186. При этом устанавливается для каждого гена одно из следующих его состояний: гетерозиготное, или дикое гомозиготное, или вариантное гомозиготное. Например, для гена ММР-9 устанавливают одно из следующих его состояний: дикое гомозиготное АА, или вариантное гомозиготное GG, или гетерозиготное AG, а для гена AGTR1 одно из следующих его состояний: гетерозиготное АС, или дикое гомозиготное АА, или вариантное гомозиготное СС.

Таким образом, при оценке влияния марганца на нарушение состояния вегетативной нервной системы у девочек-дошкольниц в предлагаемом способе рекомендуется использовать следующие критерии:

наличие генотипа АА гена ММР-9 Gln279Arg (rs17576) и генотипа АА гена AGTR1 А1166С (rs5186), при условии превышения содержания марганца в крови в 2,0 и более раз по сравнению с референтным уровнем, а также при превышении по сравнению с верхней границей физиологической нормы уровня IgE к марганцу не менее, чем в 1,5 раза.

Именно благодаря расширению информационных показателей, связанных с полиморфными вариантами указанных генов, тропных к вегетативной нервной системе, и одновременно с количеством химического токсиканта - марганца в крови, и будет обеспечена точность оценки модифицирующего влияния марганца на возникновение расстройства вегетативной нервной системы.

Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод, что поставленный технический результат обеспечивается за счет совокупности операций предлагаемого способа, их последовательности и режимов его реализации.

Предлагаемый способ реализуется следующим образом. 1. Выбирают территорию экологического риска, характеризующуюся наличием химических токсикантов, обусловленных экологической средой обитания. Исследования были проведены на территории области, характеризующейся наличием предприятий цветной металлургии, выбрасывающего в атмосферный воздух отходы с высоким содержанием марганца. Качество атмосферного воздуха селитебной застройки, расположенной в зоне влияния производства цветной металлургии, характеризуется постоянным присутствием марганца на уровне 0,5-1,0 ПДКс.с.

2. На указанной территории производят отбор группы детей девочек-дошкольниц 4-6 лет, одной этнической популяции. Затем производят отбор пробы крови у обследуемого ребенка в специальные пробирки с антикоагулянтом ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) (0,05М раствор ЭДТА в соотношении 500 мкл крови на 50 мкл антикоагулянта) - для определения содержания марганца, иммуноглобулина Ε специфического к марганцу и уровня VEGF.

Содержание марганца в крови определяют по Методике масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой «Методы контроля. Химические факторы. Определение содержания химических элементов в диагностируемых биосубстратах, препаратах и биологически активных добавках методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной аргоновой плазмой», изложенной в МУК 4.1.1483-03, с использованием масс-спектрометра с индуктивно связанной плазмой Agilent 7500сх с октопольной реакционной/столкновительной ячейкой (USA). В качестве референтного значения содержания марганца в крови был принят показатель, равный 0,004 мкг/см³ (Н. Тиц, 2003).

Содержание уровня VEGF в крови определяют по методике, изложенной в инструкции «Иммуноферментный набор для количественного in vitro определения глутамата в образцах ЭДТА сыворотки или плазмы крови» («Sigma», США, Кат №К7731). В качестве физиологического диапазона содержания VEGF был принят диапазон менее 132 пг/мл (Н. Тиц, 2003).

3. В том случае, если у девочки в пробе крови обнаружен марганец в количестве, превышающий его референтное количество, равное 0,004 мкг/см³, в 2,0 и более раз, то у указанного ребенка отбирают пробу буккального эпителия (в виде мазка со слизистой оболочки щеки), причем забор осуществляют сухими стерильными зондами с ватными тампонами вращательными движениями без травматизации после предварительного полоскания полости рта водой. После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную пробирку типа «Эппендорф» с 500 мкл транспортной среды (стерильный 0,9%-ный раствор NaCl). Конец зонда отламывают или отрезают, с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть крышку пробирки. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают.

Далее производят выделение ДНК из пробы. Для этого пробы в количестве 100 мкл лизируют 300 мкл лизирующего раствора, представляющего собой 0,5%-ный раствор саркозила и протеиназы К (20 мг/мл) в ацетатном буфере (рН 7,5). Затем добавляют сорбент (каолин) и последовательными процедурами промывки отмывают фосфатно-солевым буфером (рН 7,2) пробы от белков и смесью изопропиловый спирт: ацетон от липидов. Нуклеиновые кислоты остаются при этом на сорбенте. Далее адсорбированные на сорбенте ДНК из пробы экстрагируют ТЕ-буфером, представляющим собой смесь 10 мМ трис-HCl и 1 мМ ЭДТА (рН 8,0). Экстракт подвергают центрифугированию. После центрифугирования пробирки надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК.

Полученный материал готов к постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полимеразную цепную реакцию проводят на детектирующем амплификаторе с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» с использованием готовых наборов праймеров и зондов производства ЗАО «Синтол», Россия, в котором в качестве праймеров использовались участки ДНК: гена ММР-9 Gln279Arg (rs17576) и гена AGTR1 А1166С (rs5186).

Проводят реакцию амплификации, это достигается тем, что для исследования аллельного состояния каждого гена у отдельного человека готовят свою реакционную смесь. В каждую пробирку вносят 0,1 мкл готовой смеси праймеров (принятый в генетике термин, обозначающий конечные нуклеотиды с меткой, ограничивающие (отрезающие) амплифицируемую цепочку нуклеотидов гена) и зондов для выбранных генов: гена ММР-9 Gln279Arg (rs17576) и гена AGTR1 А1166С (rs5186), использованы Наборы реагентов для определения полиморфизма АА гена ММР-9 Gln279Arg (rs17576) и полиморфизма АА гена AGTR1 А1166С (rs5186) ЗАО «Синтол», Россия). В каждую пробирку добавляют остальные компоненты необходимые для осуществления ПЦР: нуклеотиды (дезоксинуклеозидтрифосфаты: по 10 мМ дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ), буфера (100 мМ трис-НСl-буфера, 500 мМ KСl, 40 мМ MgCl₂) и Tag F-полимеразы. Вносят пробу в количестве 10 мкл. Таким образом, общий объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Каждая пробирка плотно закрывается пробкой и устанавливается в амплификатор.

При проведении ПЦР амплификацию и детекцию проводят на детектирующем амплификаторе CFX96 фирмы Bio-Rad.

Используется универсальная программа амплификации, подобранная производителем реактивов. Она включает в себя несколько этапов: 1 этап -активация TaqF-полимеразы (режим «горячего старта») продолжается 15 мин при 95°С; 2 этап - установочные циклы амплификации без измерения флуоресценции (5 циклов); 3 этап - рабочие циклы амплификации с измерением флюоресценции (40 циклов).

Каждый цикл амплификации включает в себя денатурацию ДНК (5 с при 95°С), отжиг праймеров (20 с при 60°С) и саму реакцию полимеризации ДНК (15 с при 72°С).

Регистрация сигнала флюоресценции, возникающего при накоплении продуктов амплификации участков ДНК проводится в режиме «реального времени» после стадии отжига праймеров для выбранных генов по каналу VIC - для детекции одного из аллельных вариантов генов, и по каналу FAM - для альтернативного варианта.

Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флюоресценции с установленной на заданном уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла (N) в соответствующей графе в таблице результатов, отображаемой в программном обеспечении для амплификатора CFX96.

По соотношению пороговых циклов, полученных по двум каналам детекции, определяют состояние гена ММР-9 в исследуемом участке ДНК АА Gln279Arg (rs17576), а также гена AGTR1 в исследуемом участке ДНК АА А1166С (rs5186) (метод аллельной дискриминации). Возможных вариантов состояния гена было два: гомозиготное - в случае, когда одно из значений порогового цикла не определяется (ниже пороговой линии) и гетерозиготное - в случае, когда получено два значения пороговых циклов и по этим каналам получены параболические кривые флюоресценции. В зависимости от того, накопление какого продукта амплификации происходит в реакции, устанавливается гетерозиготное, или дикое гомозиготное, или вариантное гомозиготное состояние гена ММР-9 Gln279Arg (rs17576) и гена AGTR1 А1166С (rs5186).

4. И при одновременном выполнении следующих условий: наличие генотипа АА гена ММР-9 Gln279Arg (rs17576) и генотипа АА гена AGTR1 А1166С (rs5186), при условии превышения содержания марганца в крови в 2,0 и более раз по сравнению с референтным уровнем, а также при превышении по сравнению с верхней границей физиологической нормы уровня IgE к марганцу не менее, чем в 1,5 раза, диагностируют у девочек дошкольного возраста расстройство вегетативной нервной системы, ассоциированное с избыточной контаминацией биосред марганцем.

При проведении испытаний по реализации предлагаемого способа выполнено обследование детского населения, проживающего в условиях влияния выбросов отходов комбината цветной металлургии.

Группу наблюдения составили 80 девочек-дошкольниц возраста 4-6 лет, страдающих расстройством вегетативной нервной системы. Клинические признаки, характеризующие данное состояние: усталость, слабость, плаксивость, капризность, быстрая смена настроения, нестабильное наступление сна, истеричность, избыточное потоотделение, диспепсические явления (тошнота), угрюмость, агрессивность, учащенное сердцебиение (Кильдиярова P.P. Нарушения адаптации детей к школе: лечение и профилактика. Пособие для врачей. - М: ООО «Медицинское информационное агентство», 2016 - 40 с. ISBN 978-5-8948-1974-7).

Группа контроля - 81 девочек-дошкольниц, не имеющих патологии нервной системы.

Группа наблюдения и группа контроля были сопоставимы по полу, возрасту, соматической заболеваемости. Результаты обследования девочек из указанных групп, приведены в таблице 1.

В качестве маркера, доказывающего, что у ребенка возникло расстройство нервной системы под влиянием марганца, использовали уровень VEGF в крови ребенка.

VEGF - фактор роста эндотелия сосудов, представляет собой сигнальный белок, продуцируемый клетками, который стимулирует образование кровеносных сосудов. VEGF представляет собой подсемейство факторов роста, семейство факторов роста тромбоцитов из факторов роста цистинового узла. Они являются важными сигнальными белками, участвующими как в васкулогенезе (de novo формирование эмбриональной системы кровообращения), и в ангиогенезе (рост кровеносных сосудов из уже существующей сосудистой сети). Это часть системы, которая восстанавливает снабжение тканей кислородом.

Данные, приведенные в таблице 1, показывают, что при сочетании дикого гомозиготное состояние генотипа АА гена ММР-9 Gln279Arg rs17576 и дикого гомозиготное состояние генотипа АА гена AGTR1 А1166С rs5186, при одновременном превышении концентрации виновного фактора экспозиции (марганца) выше референтной концентрации в крови в 2 и более раз (референтная норма - 0,004 мкг/см³), при одновременном повышенном уровне IgE специфического к марганцу в 1,5 и более раз, наблюдается повышение содержание VEGF в сыворотке крови у ребенка выше физиологического уровня (опыты 1-4). То есть при этом фиксируется реализация марганцем негативной генетической программы у девочки-дошкольницы.

Тогда как при допустимом (на уровне референтной концентрации) содержании марганца в крови (опыты 12-14), даже в условиях наследования кандидатного дикого гомозиготного генотипа АА предлагаемых генов (опыт 14), указанный показатель VEGF находится в пределах физиологической нормы.

И, наоборот, в случае превышения содержания марганца в крови по сравнению с референтным уровнем, но при отсутствии генотипа АА одновременно у 2-х указанных генов (опыты 5-11), содержание VEGF в крови также находится в пределах физиологической нормы.

Кроме того, данные таблицы 1 показывают, что даже в случае превышения содержания марганца в крови по сравнению с референтным уровнем, но при отсутствии генотипа АА только в одном или только в другом из указанных генов (опыты 5, 8, 10, 11), содержание VEGF в крови также находится в пределах физиологической нормы.

Это указывает на то, что только одновременное превышение содержания марганца в крови по отношению к референтному уровню, превышение IgE специфического к марганцу по отношению к норме, наличие одновременно типичных генотипов АА и у гена ММР-9 Gln279Arg rs17576, и у гена AGTR1 А1166С rs5186, характеризуется проявлением негативных эффектов в виде отклонения от нормы содержания VEGF в крови, и таким образом подтверждает точность и достоверность предлагаемого способа.

Для иллюстрации реализации предлагаемого способа приведены два примера по конкретным пациентам одного возраста и этнической принадлежности из группы пациентов с повышенным содержанием марганца в крови и наличием полиморфности генотипа (дикого гомозиготного генотипа АА) гена ММР-9 Gln279Arg rs17576 и одновременно дикого гомозиготного генотипа АА гена AGTR1 А1166С rs5186; и из группы пациентов с повышенным содержанием марганца в крови и отсутствием генотипов АА указанных генов.

Пример 1. Пациент, девочка-дошкольница 6 лет, русская, страдающая расстройством вегетативной нервной системы. Клинические признаки этого состояния: тошнота, слабость, усталость, вялость, капризность, агрессивность, отсутствие прилежности и послушания, отставание в нервно-психическом развитии, сложности восприятия и обучения. Определяется уровень марганца в крови выше референтного уровня более, чем в 2 раза - 0,015 мкг/см³. Определяется уровень содержания специфического IgE к марганцу в крови выше референтного уровня более, чем в 1,5 раза - 0,40 у.е. Определено наличие у девочки дикого гомозиготного генотипа гена ММР-9 Gln279Arg rs17576 - АА и одновременно наличие дикого гомозиготного генотипа гена AGTR1 А1166С rs5186 - АА. Содержание васкуло-эндотелиального фактора роста в крови - медиатора регуляции состояния и тонуса сосудов - 193,2 пг/мл, т.е. выше верхней границы нормы (<132 пг/мл) в 1,46 раза. Таким образом, установлены высокое содержание VEGF на фоне повышенных по отношению к фоновому уровню значений содержания марганца в крови, а также наличие дикого гомозиготного генотипа АА гена ММР-9 Gln279Arg rs17576 и одновременно дикого гомозиготного генотипа АА гена AGTR1 А1166С rs5186, кодирующих белки, ответственные за формирование избыточного тонуса сосудов и агрессивность разрушения внеклеточного матрикса эндотелия сосудов и поддержания воспалительного процесса, что ведет к реализации нарушений нервной регуляции тонуса сосудов у данного пациента, инициированной избыточной контаминацией крови марганцем.

Пример 2. Пациент, девочка-дошкольница 5 лет, русская, здорова, не имеет патологии нервной системы. Определяется в крови уровень марганца, который более, чем в 2,0 раза выше фонового уровня - 0,016 мг/дм³. Определяется уровень содержания специфического IgE к марганцу в крови выше референтного уровня менее, чем в 1,5 раза - 0,25 у.е. Отсутствуют кандидатные генотипы генов развития вегетативных нарушений, как дикий гомозиготный генотип гена ММР-9 Gln279Arg rs17576 - АА, так и одновременно дикий гомозиготный генотип гена AGTR1 A1166C rs5186 - АА. Содержание васкуло-эндотелиального фактора роста (VEGF) в крови - медиатора регуляции состояния и тонуса сосудов - 83,2 пг/м - в диапазоне физиологической нормы (норма<132 пг/мл). Таким образом, отсутствие дикого гомозиготного генотипа гена ММР-9 Gln279Arg rs17576 - АА, и одновременно отсутствие дикого гомозиготного генотипа гена AGTR1 А1166С rs5186 - АА на фоне повышенного по отношению к фоновому уровню содержания марганца в крови, не приводит к развитию негативных эффектов в виде отклонения от нормы VEGF, а также превышения уровня специфического IgE к марганцу более чем в 1,5 раз, то есть в отсутствии негативной генетической программы, а только лишь превышение референтной концентрации марганца в крови, не формирует развитие нарушений вегетативной нервной регуляции и функционального расстройства вегетативной нервной системы, G90.8 «Другие расстройства вегетативной (автономной) нервной системы» у данного пациента.

Таким образом, приведенные данные показывают, что при реализации предлагаемого способа с использованием предлагаемых критериев по содержанию марганца в крови и вариантов дикого гомозиготного генотипов АА генов ММР-9 Gln279Arg rs17576 и AGTR1 А1166С rs5186, обеспечивается его назначение.

Таким образом, реализация способа диагностики расстройства вегетативной нервной системы в условиях экспозиции марганцем, позволяет предложить систему критериев возникновения и течения данной патологии у девочек-дошкольниц, что в свою очередь позволит оптимизировать мероприятия по коррекции данного состояния у детей.

Способ диагностики расстройства вегетативной нервной системы у девочек дошкольного возраста, ассоциированного с избыточной контаминацией биосред детей марганцем, характеризующийся тем, что у девочки дошкольного возраста производят отбор пробы крови, определяют в ней содержание марганца и содержание специфического к марганцу иммуноглобулина Ε (IgE) и при превышении марганца в 2,0 и более раз по сравнению с референтным количеством, равным 0,004 мкг/см³, выполняют следующие генетические исследования: отбирают пробу буккального эпителия, осуществляют выделение из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), затем на детектирующем амплификаторе с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени проводят генотипирование полиморфизма гена ММР-9 и гена AGTR1, используя в качестве праймера участок ДНК путем исследования генотипов гена ММР-9 Gln279Arg (rs17576) и генотипов гена AGTR1 А1166С (rs5186), устанавливая при этом для гена ММР-9 одно из следующих его состояний: дикое гомозиготное АА, или вариантное гомозиготное GG, или гетерозиготное AG; а для гена AGTR1 одно из следующих его состояний: гетерозиготное АС, или дикое гомозиготное АА, или вариантное гомозиготное СС, и при одновременном выполнении следующих диагностических критериев: наличие генотипа АА гена ММР-9 Gln279Arg (rs17576) и генотипа АА гена AGTR1 А1166С (rs5186), при условии превышения содержания марганца в крови в 2,0 и более раз по сравнению с референтным уровнем, а также при превышении по сравнению с верхней границей физиологической нормы уровня IgE к марганцу не менее чем в 1,5 раза диагностируют у девочек дошкольного возраста расстройство вегетативной нервной системы, ассоциированное с избыточной контаминацией биосред марганцем.