Слитые конструкции антител для вовлечения nk-клеток

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены мультиспецифические антигенсвязывающие белки, специфически связывающиеся с BCMA и CD16A. Также предложена включающая эти белки фармацевтическая композиция для лечения, ослабления или профилактики заболевания и/или для лечения субъекта, у которого истощена или сокращена популяция NK-клеток. CD16A-связывающие домены предложенных антигенсвязывающих белков распознают уникальный эпитоп на CD16A2, на который практически не влияет конкуренция с IgG в плазме и полиморфизм CD16A. Изобретение обеспечивает вовлечение естественных клеток-киллеров (NK-клеток), стимулирование NK-клеточной цитотоксичности за счет вовлечения CD16A и эффективный иммунный контроль. 3 н. и 11 з.п. ф-лы, 121 ил., 15 табл., 9 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

В данной заявке заявляется приоритет по предварительной европейской патентной заявке №ЕР18167384.9, поданной 13 апреля 2018 г., предварительной европейской патентной заявке №ЕР18167385.6, поданной 13 апреля 2018 г., предварительной европейской патентной заявке №ЕР18190661.1, поданной 24 августа 2018 г., предварительной европейской патентной заявке №ЕР18190662.9, поданной 24 августа 2018 г., содержания каждой из которых включено посредством ссылки в полном объеме.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

В данной заявке содержится перечень последовательностей, который был представлен в электронном виде в формате ASCII и полностью включен в данный документ посредством ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 10 апреля 2019 г., имеет название 087353_0101_SL.txt и размер 137653 байт.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение относится к мультиспецифическим антигенсвязывающим белкам для вовлечения естественных клеток-киллеров (NK-клеток), чтобы стимулировать NK-клеточную цитотоксичность, за счет вовлечения CD16A (FcγRIIIA), который экспрессируется на NK-клетках, причем антигенсвязывающий белок содержит по меньшей мере два фрагмента, связывающих антиген CD16A, и по меньшей мере дополнительный фрагмент, связывающий целевой антиген.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В WO 2006/125668 и Reusch et al., MABS, 2014, 6:3:728-739 описано биспецифическое тандемное диатело для вовлечения CD16A и его применение в NK-клеточной иммунотерапии.

Естественные клетки-киллеры (NK-клетки) представляют собой цитотоксические, ИНФ-γ-продуцирующие врожденные лимфоциты, которые, как полагают, формируют первую линию защиты против инфицированных вирусами клеток и раковых клеток (Cerwenka and Lanier, Nat Rev Immunol. 2001; 1 (1):41-9). Цитотоксический потенциал NK-клеток можно использовать в иммунотерапии онкологических заболеваний путем перенаправления NK-клеточного лизиса на опухолевые клетки и стимуляции активации рецептора CD16A, также известного как FcγRIIIA, экспрессируемого на поверхности NK-клеток.

Направление NK-клеток на лизис опухолевых клеток с использованием мультиспецифических антител считается действенным иммунотерапевтическим подходом с низкой токсичностью и полностью приемлемым профилем безопасности.

CD16A представляет собой активирующий рецептор, запускающий цитотоксическую активность NK-клеток. Аффинность антител к CD16A прямо коррелирует с их способностью запускать активацию NK-клеток, таким образом уменьшается доза антитела, требуемая для активации.

Цитотоксическую активность NK-клеток можно повысить путем повышения авидности за счет мультивалентного связывания с CD16A, например двухвалентного связывания с CD16A.

Однако двухвалентность и мультивалентность по отношению к CD16A может приводит к опосредованному антителом перекрестному связыванию клеток, экспрессирующих CD16A, включая NK-клетки, γδ Т-клетки и субпопуляции моноцитов, макрофагов и дендритных клеток. Ожидается, что такие взаимодействия приведут к нежелательной стимуляции клеток посредством CD16A. Например, перекрестное связывание NK-клеток с иммунными клетками, экспрессирующими CD16A, приводит к активации NK-клеток, высвобождению цитокинов и индукции опосредованной клетками цитотоксичности, которая снижает активность NK-клеток и ускоряет истощение NK-клеток, которое не зависит от требуемого противоопухолевого эффекта. Следовательно, ожидается, что перекрестное связывание NK-клеток с иммунными клетками, экспрессирующими CD16A, будет снижать терапевтическую эффективность вовлечения NK-клеток. Наиболее важно, что перекрестное связывание двух или более NK-клеток посредством двухвалентного или мультивалентного взаимодействия с CD16A может вызывать активацию NK-клеток и индукцию взаимного уничтожения (NK-NK-клеточного лизиса), приводящего в конечном итоге к эффективной деплеции NK-клеток in vivo, как ранее описано с использованием направленного на CD16 антитела IgG мыши (3G8), которое является двухвалентным к CD16A у макак-резусов и тамаринов (Choi et al., Immunology 2008; 124:215-222; Yoshida et al., Frontier in Microbiology (2010); 1:128). Следовательно, индукция NK-клеточного лизиса вызывает снижение количества эффекторных клеток, доступных для опосредования ADCC и нарушает терапевтическую эффективность антитела.

Таким образом, существует потребность в антителах, способных к усилению вовлечения NK-клеток, которое не уменьшается за счет взаимного уничтожения (NK-NK-клеточный лизис).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В изобретении предложено антитело, захватывающее CD16A, способное к по меньшей мере двухвалентному взаимодействию с CD16A на NK-клетках, а следовательно, с повышенной аффинностью связывания и цитотоксической активностью, но, предпочтительно, неспособное вызывать NK-NK-клеточный лизис.

Изобретение относится к:

мультивалентному и мультиспецифическому антителу, содержащему по меньшей мере один фрагмент, связывающий целевой антиген, и по меньшей мере два фрагмента, связывающих антиген CD16A, причем два фрагмента, связывающих антиген CD16A, слиты с константным доменом, например, фрагментом Fab или участком Fc. Предпочтительно, фрагмент, связывающий целевой антиген, также слит с фрагментом Fab или участком Fc.

Например, каждый из антигенсвязывающих фрагментов может быть выбран из группы, состоящей из одноцепочечного диатела (scDb), диатела (Db), одноцепочечного Fv (scFv) или фрагмента Fab.

В некоторых вариантах осуществления изобретения вариабельные области легкой цепи и тяжелой цепи фрагмента, связывающего антиген CD16A, связаны друг за другом в полипептид так, что вариабельная область на N-конце полипептидной цепи представляет собой вариабельную область легкой цепи, таким образом предотвращая взаимное уничтожение (NK-NK-клеточный лизис).

Доступно большое количество структур белков за счет слияния N-конца или С-конца антигенсвязывающих фрагментов с различными структурными единицами, содержащими константные домены, такие как F(ab)', F(ab)2', СН2-СН3, шарнирная область-СН2-СН3, Fc, CH1-шарнирная область-СН2-СН3 или IgG.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий белок содержит сайленсированный участок Fc, который не связывается с рецептором Fc-гамма, но сохраняет способность связываться с FcRn и необязательно с по меньшей мере одним функциональным элементом Fc.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий белок содержит участок Fc, который, с одной стороны, является сайленсированным, так что он не связывается с Fc-γR, и который, с другой стороны, может включать дополнительную мутацию для повышения или понижения его способности связываться с FcRn, которая не коррелирует с различной фармакокинетикой in vivo, основанной на различной способности к трансцитозу и рециклингу.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий белок содержит по меньшей мере фрагмент, связывающий антиген HSA. Например, антигенсвязывающий белок может содержать 2, 3 или 4 фрагмента, связывающих антиген HSA.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий белок содержит по меньшей мере два фрагмента, связывающих различные целевые антигены, т.е. фрагмент, связывающий первый и второй целевой антигены.

В некоторых вариантах осуществления изобретения применяют фрагменты, связывающие CD16A, с повышенной или сниженной аффинностью к CD16A.

Среди прочего изобретение характеризуется:

1. Повышенной функциональной способностью вовлекать NK-клетки, поскольку

• С фрагментом Fab или участком Fc слиты два фрагмента, связывающих CD16A, тем самым увеличивая цитотоксическую активность вследствие двухвалентного связывания с CD16A.

• Используются фрагменты, связывающие антиген CD16A, с высокой аффинностью связывания с CD16A.

• Устраняется индукция взаимного уничтожения (NK-NK-клеточный лизис) за счет расположения компонентов фрагмента, связывающего антиген CD16A, в определенном порядке, который не вызывает взаимное уничтожение и таким образом предотвращает ослабление цитотоксической активности NK-клеток по отношению к клеткам-мишеням.

• Устранение взаимного уничтожения не зависит от аффинности связывания фрагмента, связывающего антиген CD16A.

• Используется сайленсированный участок Fc для устранения дополнительного связывания с моноцитами, положительными по рецептору Fc-гамма, или другими клетками, экспрессирующими рецептор Fc-гамма, при этом сохраняется способность связываться с FcRn и таким образом увеличивается период полувыведения из сыворотки.

2. Такое увеличение функциональной способности вовлекать NK-клетки можно отнести к совместимости антигенсвязывающих фрагментов с различными белковыми структурами, за счет чего достигается настраиваемая цитотоксичность, целевая аффинность, функциональность CD16A, целевые биологические свойства, проникновение и распределение в тканях, период полувыведения и воздействие.

Применение различных форматов антител, конкретно описанных в данном документе, и функциональных компонентов, включая отличающиеся периоды полувыведения и различные степени воздействия, позволяет адаптировать новые терапевтические средства к различным показаниям с повышенными медицинскими потребностями, предлагая разработку целевого продукта для соответствующих условий.

Кроме того, отсутствие взаимного уничтожения NK-клетками друг друга представляет собой важную характеристику для по меньшей мере двухвалентных форматов агентов, вовлекающих иммунные клетки с высокой аффинностью, которые характеризуются большими временами удерживания в клетке, и которые или предназначены для использования для вовлечения эндогенных NK-клеток, или предназначены для объединения с терапевтическими подходами на основе NK-клеток. Они включают NK-клетки, полученные из различных источников, такие как, например, клетки из пуповинной крови, из периферической крови здоровых доноров, от пациентов для аутологичного лечения или из стволовых клеток. Такие вовлекающие агенты могут быть совместно введены или предварительно смешаны с такими NK-клетками.

В данном документе представлены форматы белков, которые дополнительно дают возможность повысить аффинность связывания с мишенью за счет двухвалентного связывания с мишенью и/или увеличить целевую селективность за счет двойного нацеливания на мишень двумя различными фрагментами, связывающими первый и второй целевой антиген.

В антигенсвязывающий белок можно включить дополнительные функциональные компоненты, такие как, например, фрагмент, связывающий человеческий сывороточный альбумин (HSA).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1-2 иллюстрируют антигенсвязывающий белок scDb-mFc, который является мономерным и содержит двухвалентный фрагмент, связывающий антиген CD16A, в формате scDb, слитый с мономерным участком Fc, причем на Фиг. 1 scDb, состоящее из двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, слито с N-концом участка Fc, который состоит из варианта полипептида СН2-CH3, и scFv, состоящий из одного фрагмента, связывающего целевой антиген, слит с С-концом участка Fc, и на Фиг. 2 scDb, состоящее из двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, слито с С-концом участка Fc, который состоит из варианта полипептида СН2-CH3, и scFv, состоящий из одного фрагмента, связывающего целевой антиген, слит с N-концом участка Fc. Мишень представляет собой мишень, ассоциированную с опухолью.

Фиг. 3-6 иллюстрируют антигенсвязывающие белки KiH-scDb-Fc, которые являются гетеродимерными и содержат двухвалентный фрагмент, связывающий антиген CD16A в формате scDb, слитый с гетеродимерным (КШ) участком Fc, причем на Фиг. 3 scDb, состоящее из двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, слито с шарнирной областью или средней шарнирной областью на N-конце участка Fc, который состоит из гетеродимера СН2-СН3, a scFv, состоящий из одного фрагмента, связывающего целевой антиген, слит с С-концом участка Fc; на Фиг. 4 the scDb, состоящее из двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, слито с шарнирной областью или средней шарнирной областью на N-конце участка Fc, который состоит из гетеродимера СН2-CH3, a scFv, состоящий из одного фрагмента, связывающего целевой антиген, слит с шарнирной областью на N-конце другого полипептида СН2-CH3 гетеродимерного (KiH) участка Fc; на Фиг. 5 scDb, состоящее из двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, слито с С-концом участка Fc, который состоит из гетеродимера СН2-CH3, a scFv, состоящий из одного фрагмента, связывающего целевой антиген, слит с шарнирной областью или средней шарнирной областью на N-конце другого полипептида СН2-CH3 гетеродимерного (KiH) участка Fc; и на Фиг. 6 scDb, состоящее из двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, слито с С-концом участка Fc, который состоит из гетеродимера СН2-CH3, и первый scFv, состоящий из фрагмента, связывающего первый целевой антиген, слит с шарнирной областью или средней шарнирной областью на N-конце участка Fc, и второй scFv, состоящий из фрагмента, связывающего второй (и отличный от первого) целевой антиген, слит с шарнирной областью или средней шарнирной областью на N-конце другого полипептида СН2-CH3 гетеродимерного (KiH) участка Fc. Первая и вторая мишени представляют собой различные мишени, ассоциированные с опухолью.

Фиг. 7-8 иллюстрируют триспецифический антигенсвязывающий белок scDb-TriB, который представляет собой слияние гетеродимерный фрагмент Fab-scDb, содержащее фрагменты, связывающие антиген CD16A, целевой антиген и антиген HSA, причем на Фиг. 7 двухвалентное scDb, состоящее из двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, слито с С-концом одного из двух полипептидов фрагмента Fab, а двухвалентное scDb, состоящее из двух фрагментов, связывающих целевой антиген, слито с С-концом другого полипептида фрагмента Fab, и Fv на N-конце фрагмента Fab обеспечивает фрагмент, связывающий антиген HSA; и на Фиг. 8 двухвалентное scDb, состоящее из двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, слито с С-концом одного из двух полипептидов фрагмента Fab, и scFv, состоящий из одного фрагмента, связывающего целевой антиген, слито с С-концом другого полипептида фрагмента Fab, a Fv на N-конце фрагмента Fab обеспечивает фрагмент, связывающий антиген HSA. Мишень представляет собой мишень, ассоциированную с опухолью.

Фиг. 9-10 иллюстрируют антигенсвязывающий белок Db-Fc, который является гомодимерным и содержит двухвалентный фрагмент, связывающий антиген CD16A, в формате Db, слитый со средней шарнирной областью на N-конце или с С-концом гомодимерного участка Fc, и два фрагмента, связывающих целевой антиген, в формате scFv, причем на Фиг. 9 scFv слиты с С-концом гомодимеризующегося полипептида СН2-CH3, и полипептиды, содержащие Db, слиты со средней шарнирной областью на N-конце полипептида СН2-CH3, причем два полипептида Db нековалентно связаны с Db, содержащим два фрагмента, связывающих антиген CD16A. Мишень представляет собой мишень, ассоциированную с опухолью, и на Фиг. 10 фрагменты scFv, связывающие целевой антиген, слиты со средней шарнирной областью на N-конце гомодимеризующегося полипептида СН2-CH3, и полипептид, содержащий Db, содержащее два фрагмента, связывающих антиген CD16A, слит с С-концом гомодимера Fc. Мишень представляет собой мишень, ассоциированную с опухолью.

Фиг. 11-12 иллюстрируют антигенсвязывающий белок би-scFv-Fc, который является гомодимерным и тетравалентным и содержит два фрагмента, связывающих антиген CD16A, и два фрагмента, связывающих целевой антиген, каждый в формате scFv, слитые с гомодимером Fc, причем на Фиг. 11 два scFv, связывающие антиген CD16A, слиты с шарнирной областью на N-конце одного из полипептидов СН2-CH3, и два scFv, связывающих целевой антиген, слиты с С-концом полипептидов СН2-CH3; и на Фиг. 12 фрагменты, связывающие антиген CD16A, представляют собой scFv, слитые С-концом с гомодимером Fc, тогда как scFv, связывающие целевой антиген, слиты с шарнирной областью на N-конце гомодимера Fc. Мишень представляет собой мишень, ассоциированную с опухолью.

Фиг. 13 иллюстрирует антигенсвязывающий белок scFv-IgAb, который содержит антитело IgG, слитое с двумя фрагментами, связывающими антиген CD16A, в формате scFvs, слитыми с С-концом Н-цепи, тогда как два фрагмента, связывающих целевой антиген, обеспечиваются каждым Fv в плечах Fab IgG. Мишень представляет собой мишень, ассоциированную с опухолью.

Фиг. 14 иллюстрирует антигенсвязывающий белок би-scFv-IgAb, который содержит антитело IgG, слитое с четырьмя антигенсвязывающими фрагментами scFv, причем каждый из двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, в формате scFv слит с С-концом Н-цепей, тогда как два антигенсвязывающих фрагмента, которые связываются с первой мишенью, обеспечиваются каждым Fv в плечах Fab IgG, и каждый из двух антигенсвязывающих фрагментов, которые связываюся со второй мишенью, слит с С-концом двух цепей CL.

Фиг. 15А и 15 В иллюстрируют антигенсвязывающий белок KiH-scFv-Fc, причем четыре антигенсвязывающих scFv слиты с гетеродимерным (KiH) участком Fc, при этом два фрагмента, связывающих антиген CD16A, слиты или N-, или С-концом с участком Fc. Фиг. 15А иллюстрирует KiH-scFv-Fc с двумя фрагментами, связывающими антиген CD16A, каждый из которых слит с шарнирной областью на N-конце одного из полипептидов СН2-CH3, и scFv, содержащий фрагмент, связывающий первый целевой антиген, слит с С-концом одного из полипептидов СН2-CH3, а другой scFv, содержащий фрагмент, связывающий второй целевой антиген, слит с С-концом другого полипептида СН2-CH3. Фиг. 15 В иллюстрирует KiH-scFv-Fc с двумя фрагментами, связывающими антиген CD16A, каждый из которых слит с С-концом одного из полипептидов СН2-CH3, и scFv, содержащий фрагмент, связывающий первый целевой антиген, слит с шарнирной областью на N-конце одного из полипептидов СН2-CH3, а другой scFv, содержащий фрагмент, связывающий второй целевой антиген, слит с шарнирной областью на N-конце другого полипептида СН2-CH3.

Фиг. 16 иллюстрирует антигенсвязывающий белок scFv-IgAb, который содержит антитело IgG, слитое с двумя фрагментами, связывающими целевой антиген, в формате scFvs, слитыми с С-концом Н-цепи, тогда как два фрагмента, связывающих антиген CD16A, обеспечиваются каждым Fv в плечах Fab IgG. Мишень представляет собой мишень, ассоциированную с опухолью.

Фиг. 17A-17N иллюстрируют результаты опосредованного антителом NK-NK-клеточного лизиса из Примера 6. Фиг. 17А иллюстрирует два фрагмента к CD16A в формате диатела (scDb), слитые с мономерным Fc на N-конце (и scFv, нацеленные на ТАА, на С-конце), как показано на Фиг. 1. Фиг. 17 В иллюстрирует два фрагмента к CD16A в формате диатела (scDb), слитые с мономерным Fc на С-конце (и scFv, нацеленные на ТАА, на N-конце), как показано на Фиг. 2. Фиг. 17С иллюстрирует два фрагмента к CD16A в формате диатела (scDb), слитые с асимметричным Fc на N-конце (и scFv, нацеленный на ТАА, на С-конце), как показано на Фиг. 3. Фиг. 17D иллюстрирует два фрагмента к CD16A в формате диатела (scDb), слитые с асимметричным Fc на N-конце (и scFv, нацеленный на ТАА, на N-конце), как показано на Фиг. 4. Фиг. 17Е иллюстрирует два фрагмента к CD16A в формате диатела (scDb), слитые с асимметричным Fc на С-конце (и scFv, нацеленный на ТАА, на N-конце), как показано на Фиг. 5. Фиг. 17F иллюстрирует два фрагмента к CD16A в формате диатела (scDb), слитые с Fab на С-конце CL (и scDb, нацеленное на ТАА, на С-конце СН1), как показано на Фиг. 7. Фиг. 17G иллюстрирует два фрагмента к CD16A в формате диатела (scDb), слитые с Fab на С-конце СН1 (и scDb, нацеленное на ТАА, на С-конце CL), как показано на Фиг. 8. Фиг. 17Н иллюстрирует два фрагмента к CD16A в формате диатела (Db), слитые с Fc на N-конце (и scFv, нацеленные на ТАА, на С-конце), как показано на Фиг. 9. Фиг. 171 иллюстрирует два фрагмента к CD16A в формате диатела (Db), слитые с Fc на С-конце (и scFv, нацеленные на ТАА, на N-конце), как показано на Фиг. 10. Фиг. 17J иллюстрирует два фрагмента к CD16A в формате scFv, слитые с Fc на N-конце (и scFv, нацеленные на ТАА, на С-конце), как показано на Фиг. 11. Фиг. 17К иллюстрирует два фрагмента к CD16A в формате scFv, слитые с Fc на С-конце (и scFv, нацеленные на ТАА, на N-конце), как показано на Фиг. 12. Фиг. 17L иллюстрирует два фрагмента к CD16A в формате scFv, слитые с Fc на С-конце (и плечи Fab, нацеленные на ТАА, на N-конце), как показано на Фиг. 13. Фиг. 17М иллюстрирует два фрагмента к CD16A в формате scFv, слитые с асимметричным Fc на N-конце (и 2 scFv, нацеленные на 2 ТАА, на С-конце), и два фрагмента к CD16A в формате scFv, слитые с асимметричным Fc на С-конце (и 2 scFv, нацеленные на 2 ТАА, на N-конце), как показано на Фиг. 15а и 15b. Фиг. 17N иллюстрирует два фрагмента к CD16A в плечах Fab IgG с двумя scFv, нацеленными на ТАА, слитыми с Fc на С-конце (как показано на Фиг. 16), в сравнении с двумя фрагментами к CD16A в формате scFv, слитыми с Fc на С-конце (и плечи Fab, нацеленные на ТАА, на N-конце); как показано на Фиг. 13.

Фиг. 18А и 18В иллюстрируют анализ SPR различных scFv к CD16. Сенсограммы SPR нормализованных относительных сигналов связывания антител scFv (Ат16^выс., Ат16^средн, 3G8, Ат16^низк.) с CD16 по сравнению с IgGl дикого типа и сконструированным Fc IgGl человека (S239D/I332E). Фиг. 18А иллюстрирует усиленное связывание с CD16A-158V человека. Фиг. 18 В иллюстрирует связывание с CD16A-158F человека. Аналиты измеряли при единственной концентрации 312,5 нМ.

Фиг. 19А-19С иллюстрируют, что тирозин (Y) в положении 140 является ключевым для образования конформационного эпитопа и С016А-специфической реакционной способности антител scFv. Анализировали различные рекомбинантные варианты CD16, экспрессируемые как слитые белки последовательностей ECD с мономерным Fc или мембранным якорем. Фиг. 19А иллюстрирует,что пятна белков, содержащие определенные варианты антигена CD16 на нитроцеллюлозных мембранах, исследовали относительно их реакционной способности по отношению к указанным scFv, связывающим CD16. Фиг. 19В иллюстрирует иллюстрирует, что реакционную способность различных scFv к CD16, контрольного scFv или мАт с вариантами антигена CD16 или антигеном РЭФР, экспрессируемым на клетках СНО, прикрепленным посредством слияния к трансмембранному домену РЭФР или GPI, анализировали с помощью окрашивания антителами и проточной цитометрии. Фиг. 19С иллюстрирует связывание различных антител к CD16 с вариантами антигена CD16 после разделения с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга.

Фиг. 20 иллюстрирует сенсограммы SPR доменов, связывающих CD16 (Ат16низк., Ат16 средн., Ат16выс., 3G8) в сравнении с Fc IgGl человека дикого типа, усиленного Fc IgG1 человека (S239D/I332E), сайленсированного Fc IgG1 человека (L234F/L235E/D265A), связывающих CD16A-158V человека и CD16A-158F человека. Величины KD рассчитывали в соответствии с моделью связывания 1:1 и показаны в Таблице 5. Абцисса: отклик (отн. ед.), ордината: время [с].

Фиг. 21 иллюстрирует выравнивание последовательностей ECD CD16A человека и яванского макака и вариантов CD16B человека, применяемых в качестве рекомбинантных антигенов в некоторых экспериментах, описанных в данном документе. Положения с полиморфизмом в CD16A или CD16B человека помечены тонкой и толстой стрелками, соответственно. Символ «#» обозначает положение присоединения CD16B человека к мембранному якорю GPI, положения, обозначенные «d», отщеплены от зрелой последовательности антигена CD16B. Вариации последовательности ECD CD16A яванского макака выделены жирным. Положения с вариациями последовательности между CD16A человека и CD16B человека взяты в скобки (важно для С016А-специфического связывания исследуемых антител к CD16). Для выравнивания использовали инструмент для множественного выравнивания последовательностей CLUSTAL 0(1.2.4).

Фиг. 22 иллюстрирует конкурирование связывания различных антител scFv к CD16 и мАт 3G8 с CD16A в ELISA. Планшеты, покрытые слитым антигеном CD16A-158V ECD-Fc, инкубировали со смесью 1 нМ мАт 3G8 и различных последовательно разбавленных scFvs к CD16 в указанном интервале концентраций. мАт 3G8, связанное с CD16A, детектировали с помощью конъюгированного с пероксидазой антитела козы против IgG (H+L) мыши. Реакции с субстратом ТМВ измеряли при 450 нм (экст.(450 нм)), представляли графически и анализировали.

Фиг.23 иллюстрирует обзор системы ROCK®.

Фиг. 24А-24С иллюстрируют сенсограммы SPR нормализованного относительного связывания фаз диссоциации различных вовлекающих агентов ROCK®, двухвалентно связывающихся с CD16A. Двухвалентный домен к CD16A, содержащий scFv-IgAb_C, Db-Fc_A, scFv-IgAb_D, KiH-scDb-Fc_A, TandAb_С, сравнивали с IgAb_Е (Fc-усиленный; S239D/I332E) и одновалентным фрагментом scFv Ат16^выс. к CD16A на иммобилизированном CD16A-158V человека и CD16 яванского макака. Фиг. 24А иллюстрирует сенсограмму SPR на иммобилизованном CD16A-158V человека. Фиг. 24В иллюстрирует сенсограмму SPR на CD16 яванского макака. Фиг. 24С иллюстрирует обозначения и процентные доли антител, оставшихся на рецепторе после 3 ч диссоциации. Аналиты измеряли при единственной концентрации 50 нМ.

Фиг. 25 иллюстрирует удержание на клеточной поверхности антител ROCK® в сравнении с IgG на NK-клетках. Обогащенные первичные NK-клетки человека предварительно помещали со 100 мкг/мл TandAb или 400 мкг/мл IgG на 45 мин на лед, промывали и инкубировали в течение указанных периодов времени при 37°С, чтобы обеспечить диссоциацию. После промывания оставшиеся антитела определяли с помощью меченого His растворимого ВСМА, а затем 10 мкг/мл мАт к His и 15 мкг/мл FITC-конъюгированного антитела козы к IgG мыши. Средние интенсивности флуоресценции в момент времени 0 принимали за 100%, и процентные доли оставшихся антител представляли графически с использованием нелинейной регрессии.

Фиг. 26А-26Силлюстрируют, что кажущаяся аффинность к CD16A в форматах ROCK^® регулируется за счет вариабельных доменов, расположения и длины соединительной группы. Связывание растворимого антигена CD16 с антителами ROCK^®, содержащими различные Fv, связывающие CD16, (Ат16^средн., Ат16^выс.) в различных положениях (N: Fv к CD16 на N-конце Fc, С: Fv к CD16 на С-конце Fc), форматы антител и различный порядок доменов, было проанализировано с использованием ELISA. Иллюстративные изображения с Fv, связывающими CD16, представленными заштрихованными символами, показаны под каждой группой. Фиг. 26А иллюстрирует обобщение кажущейся аффинности к CD16A для вовлечения CD16 на основе Fab или scFv. Фиг. 26В иллюстрирует обобщение кажущейся аффинности к CD16A для вовлечения CD16 на основе диатела (Db). Фиг. 26С иллюстрирует обобщение кажущейся аффинности к CD16A для вовлечения CD16 на основе С-концевого scFv с различными длинами соединительных групп (10 а.к. или 30 а.к.) или порядком доменов Fv к CD16 (HL: порядок доменов scFv VH-VL, LH: порядок доменов scFv VL-VH). Все анализируемые антитела содержат сайленсированный Fc или не содержат Fc в случае слияния с С-концом Fab. Специфичности связывания, изображенные черным или затемненным, включали домены антител, нацеленные на ВСМА, CD19, CD20, РЭФР, HSA или RSV.

Фиг. 27А-27С иллюстрируют связывание антител ROCK® с первичными NK-клетками человека в присутствии или в отсутствие IgG. Фиг. 27А иллюстрирует, что первичные NK-клетки человека были окрашены с использованием возрастающих концентраций указанного, не содержащего Fc ROCK® в присутствии или в отсутствие 10 мг/мл поликлонального IgG человека при 37°С. Фиг. 27 В иллюстрирует, что NK-клетки человека были окрашены с использованием возрастающих концентраций ROCK® слияния Fc в присутствии или в отсутствие 10 мг/мл поликлонального IgG человека при 37°С. Фиг. 27С иллюстрирует, что первичные NK-клетки человека были окрашены с использованием возрастающих концентраций указанного IgG-подобных конструкций ROCK® в присутствии или в отсутствие 10 мг/мл поликлонального IgG человека при 37°С. Антитела, связанные с клетками, определяли с помощью проточной цитометрии, и средние интенсивности флуоресценции (СИФ) использовали для расчета кажущихся аффинностей (K_D) с использованием нелинейной регрессии.

Фиг. 28 иллюстрирует сравнительный анализ различных форматов антител ROCK^® в отношении взаимного уничтожения NK-клетками друг друга in vitro. In vitro анализы цитотоксичности на основе высвобождения кальцеина обогащенных первичных NK-клеток человека в присутствии различных форматов антител ROCK^® по отношению к аутологическим NK-клеткам после совместной инкубации в течение 4 ч при Е:Т 1:1. Средние значения ЕС₅₀ нескольких независимых экспериментов обобщали и представляли графически в виде отдельных точек. Форматы антител ROCK^® классифицировали на основании положения домена к CD16 и формата/порядка доменов. На графике представлены только конструкции, содержащие домен к CD16 с высокой аффинностью и сайленсированный Fc. HL: порядок доменов scFv VH-VL, LH: порядок доменов scFv VL-VH. N-конец = N-концевой, С-конец = С-концевой.

Фиг. 29А-29Е иллюстрируют in vitro цитотоксичность обогащенных первичных NK-клеток человека в присутствии нескольких антител ROCK® по отношению к клеточным линиям, экспрессирующим их соответствующую целевую опухолевую мишень. Фиг. 29А иллюстрирует типичные сигмоидальные кривые доза-ответ указанных антител ROCK®, нацеленных на ВСМА, в 4-часовых анализах цитотоксичности на основе высвобождения кальцеина с NK-клетками и линиями клеток-мишеней NCI-H929, экспрессирующих различные уровни ВСМА, как указано значениями SABC (среднее из ≥3 анализов) при соотношении Е:Т 5:1. Фиг. 29В иллюстрирует типичные сигмоидальные кривые доза-ответ указанных антител ROCK®, нацеленных на ВСМА, в 4-часовых анализах цитотоксичности на основе высвобождения кальцеина с NK-клетками и линиями клеток-мишеней MM.1S, экспрессирующих различные уровни ВСМА, как указано значениями SABC (среднее из ≥3 анализов) при соотношении Е:Т 5:1. Фиг. 29С иллюстрирует типичные сигмоидальные кривые доза-ответ указанных антител ROCK®, нацеленных на ВСМА, в 4-часовых анализах цитотоксичности на основе высвобождения кальцеина с NK-клетками и линиями клеток-мишеней MC/CAR, экспрессирующих различные уровни ВСМА, как указано значениями SABC (среднее из ≥3 анализов) при соотношении Е:Т 5:1. Фиг. 29D иллюстрирует типичные сигмоидальные кривые доза-ответ указанных антител ROCK®, нацеленных на ФРЭР, сравнительных антител или связывающихся одновалентно контролей в 4-часовых анализах цитотоксичности на основе высвобождения кальцеина с NK-клетками и клетками-мишенями SW-982 при соотношении Е:Т 5:1. Фиг. 29Е иллюстрирует корреляцию антител ROCK® в отношении аффинности связывания NK-клеток и цитотоксической активности к опухолевым клеткам-мишеням in vitro. Показаны кажущиеся аффинности (K_D) форматов антител ROCK® на первичных NK-клетках человека. Значения EC₅₀ антител ROCK® определяли в 3-часовых анализах цитотоксичности на основе высвобождения кальцеина с NK-клетками и целевыми клетками RPMI-8226, экспрессирующими ВСМА при соотношении Е:Т 2:1 (слева), или в 4-часовых анализах цитотоксичности на основе высвобождения кальцеина с NK-клетками и целевыми клетками NCI-H929, экспрессирующими ВСМА, при соотношении Е:Т 5:1 (справа). SABC, специфическая способность связывания антитела.

Фиг. 30 иллюстрирует сравнение фармакокинетики различных форматов вовлекающих агентов ROCK^®: концентрация антител со временем (период наблюдения 1 или 3 недели) после однократного в/в введения 300 мкг исследуемого образца.

Фиг. 31А-31В иллюстрируют цитотоксичность антитела I к CD16A/BCMA по отношению к CD16A-158V/V здоровых доноров (непрерывные линии) и по отношению к CD16A-158F/F (пунктирные линии). Фиг. 31А иллюстрирует результаты для клеточных линий NCI-H929. Фиг. 31В иллюстрирует результаты для клеточных линий MM.1S.

Фиг. 32А-32Е иллюстрируют in vitro цитотоксичность антитела I к CD16A/BCMA в отношении линий клеток множественной миеломы. Приблизительное количество клеток CD56+CD3e- NK-клеток на 165 тысяч МКПК составляло около ~8000 клеток, таким образом соотношение МК:опухолевые клетки составляло ~0,4 (подобно данным клинических исследований, оценивающим соотношение NK-клеток и опухолевых клеток у пациентов с ММ; данные не показаны). Фиг. 32А иллюстрирует МКПК, которые были выделены из крови здорового донора-человека и заморожены для последующих экспериментов. МКПК после размораживания были жизнеспособными на ~85%, что определено окрашиванием триптановым синим и позднее подтверждено с помощью FACS с 7AAD. МКПК (~165 тысяч) культивировали совместно с ВСМА + линиями опухолевых клеток множественной миеломы (~20 тысяч) и подвергали действию последовательно разбавленных в 3 раза исследуемых образцов в интервале 0,1-3000 пМ в течение приблизительно 20 часов при 37С с 5% СО₂. Приблизительное количество клеток CD56⁺CD3e- NK-клеток на 165 тысяч МКПК составляло около ~8000 клеток, таким образом соотношение NK:опухолевые клетки составляло ~0,4 (подобно данным клинических исследований, оценивающим соотношение NK-клеток и опухолевых клеток у пациентов с ММ; данные не показаны). Как показано на Фиг. 32В-32Е, окрашивание антителами и FACS использовали для определения экспрессии ВСМА в опухолевых клетках ММ и контроля цитотоксичности клеток-мишеней множественной миеломы. Данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo и GraphPad Prism 6. Фиг. 32В иллюстрирует клеточные линии NCI-H929, Фиг. 32С иллюстрирует клеточные линии RPMI-8226, Фиг. 32D иллюстрирует клеточные линии MM.1S, и Фиг. 32Е иллюстрирует клеточные линии MOLP-2. Отрицательный контроль, не нацеленный на ВСМА/к CD16a, показан незакрашенными символами. Антитело I к CD16A/BCMA показано закрашенными символами.

Фиг. 33А-33С иллюстрируют in vitro цитотоксичность антитела I к CD16A/BCMA в отношении линий клеток множественной миеломы. Фиг. 33А иллюстрирует клеточные линии NCI-H929, Фиг. 33В иллюстрирует клеточные линии RPMI-8226, и Фиг. 33С иллюстрирует клеточные линии ММ. 15. Отрицательный контроль, не нацеленный на ВСМА/к CD16a, показан незакрашенными квадратами. Антитело I к CD16A/BCMA показано закрашенными кругами. Даратумумаб («Dara») показан закрашенными квадратами.

Фиг. 34А-34С иллюстрируют in vitro цитотоксичность антитела I к CD16A/BCMA в отношении линий клеток множественной миеломы. NK-клетки культивировали совместно с линиями ВСМА + опухолевых клеток множественной миеломы с Е:Т ~4-5. Донор А: NK-клетки и опухолевые клетки предварительно икубировали с 0,5 мг/мл IgG человека с низкой эндотоксичностью в течение по меньшей мере 30 минут до добавления NK-клеток и исследуемых образцов. Донор В: нет предварительной стадии инкубации. Фиг. 34А иллюстрирует деплецию ВСМА⁺ клеток-мишеней для донора А. Фиг. 34В иллюстрирует деплецию SK-MM-2 для донора В. Фиг. 34С иллюстрирует деплецию MOLP-2 для донора В. Для Фиг. 34В и 34С, отрицательный контроль не нацеленный наВСМА/к CD16a показан незакрашенными символами, а антитело I к CD16A/BCMA показано закрашенными символами.

Фиг. 35A-35D иллюстрируют in vitro цитотоксичность антитела I к CD16A/BCMA, антитела II к CD16A/BCMA и антитела III к CD16A/BCMA по отношению к линиям опухолевых клеток Raji, экспрессирующим ВСМА. Наблюдался лизис in vitro ВСМА + положительных клеток несмотря на полностью необнаружимую поверхностную экспрессию ВСМА. Этот анализ цитотоксичности in vitro осуществляли с использованием 4-часового анализа высвобождения кальцеина первичными NK-клетками человека, Е:Т 5:1. Фиг. 35А иллюстрирует лизис клеточных линий Raji. Фиг. 35В иллюстрирует цитотоксичность клеточных линий Raji. Фиг. 35С иллюстрирует экспрессию ВСМА, которую обнаруживали с помощью имеющихся в продаже антител к ВСМА, и изотипа. Фиг. 35D иллюстрирует экспрессию ВСМА, которую обнаруживали с помощью антитела I к CD16A/BCMA, антитела II к CD16A/BCMA, антитела III к CD16A/BCMA, ВСМА (Fc-сайленсированный) и изотипа.

Фиг. 36А-36С иллюстрируют in vitro цитотоксичность антитела I к CD16A/BCMA в отношении линий опухолевых клеток Raji с низкой экспрессией ВСМА. Фиг. 36А иллюстрирует экспрессию ВСМА в клетках Raji. Фиг. 36В иллюстрирует экспрессию ВСМА в клетках NCI-H929 (положительный контроль ММ). Для (А) и (В) для количественного определения экспрессии ВСМА в клетках Raji и NCI-H929 (положительный контроль ММ) использовали имеющееся в продаже антитело к ВСМА, конъюгированное с АРС.(С) Цитотоксичность клеток Raji и клеток Н929. Антитело I к CD16A/BCMA показано закрашенными символами, а отрицательный контроль, не нацеленный на ВСМА/к CD16a, показан незакрашенными символами.

Фиг. 37А и 37В иллюстрируют in vitro активность антитела I к CD16A/BCMA по отношению к аутологическим ВСМА+ нормальным плазматическим клеткам человека. Фиг. 37А иллюстрирует аллогенные клетки в качестве положительного контроля. Фиг. 37В иллюстрирует аутологические ВСМА+ нормальные плазматические клетки человека. Антитело I к CD16A/BCMA показано закрашенными символами, а отрицательный контроль, не нацеленный на ВСМА/к CD16a, показан незакрашенными символами.

Фиг. 38А-38С иллюстрируют активацию CD16 на NK-клетках антителом I к CD16A/BCMA в присутствии ВСМА⁺ клеток-мишеней. Фиг. 38А иллюстрирует количество CD16⁺ NK-клеток. Фиг. 38В иллюстрирует количество CD69⁺CD25⁺ NK-клеток. Фиг. 38С иллюстрирует количество клеток-мишеней.

Фиг. 39А и 39В иллюстрируют активацию CD16 на NK-клетках антителом I к CD16A/BCMA в отсутствие ВСМА⁺ клеток-мишеней. Фиг. 39А иллюстрирует количество CD16⁺ NK-клеток. Фиг. 39В иллюстрирует количество CD69⁺CD25⁺ NK-клеток.

Фиг. 40А-40Е иллюстрируют связывание антитела I к CD16A/BCMA с NK-клетками и цитотоксичность антитела I к CD16A/BCMA в присутствии сыворотки. Фиг. 40А иллюстрирует связывание антитела к BCMA/CD16a в присутствии экзогенного Ig человека. Свежеподготовленные NK-клетки человека предварительно инкубировали в течение 1 часа при 37С с 10 мг/мл SCIG (Hizentra) и без него, затем окрашивали меченым DyLight650 антителом к AFM26/CD16a в указанных концентрациях. Фиг. 40В иллюстрирует лизис клеток-мишеней, вызванный антителом к BCMA/CD16, в присутствии 100% аутологической сыворотки человека. Клеточную линию множественной миеломы NCI-H929 обрабатывали антителом I к CD16A/BCMA в указанной концентрации с использованием свежеподготовленных NK-клеток человека в качестве эффекторных клеток. До добавления антитела I к CD16A/BCMA клетки предварительно инкубировали с иннактивированной нагреванием аутологической сывороткой от того же здорового донора при 37С в течение получаса. Фиг. 40С и 40D иллюстрируют, что антитело к CD16A/BCMA вызывает деплецию ВСМА+ клеток-мишеней в присутствии 50% аутологической сыворотки человека без гибели NK-клеток. На Фиг. 40С и 40D антитело I CD16A/BCMA используется в качестве примера. На Фиг. 40С и 40D NK-клетки человека выделяли из крови здорового донора-человека. NK-клетки (Фиг. 40D) и клетки MM.1S (Фиг. 40С) предварительно инкубировали отдельно в 50% аутологической сыворотке человека в течение 2 часов до начала анализа. NK-клетки культивировали совместно с линией опухолевых клеток MM.1S при приблизительном соотношении Е:Т, составляющем 5, и подвергали действию последовательно разбавленных в 10 раз исследуемых образцов в интервале 0,1-100 нМ в течение приблизительно 20 часов при 37°С с 5% COi. Окрашивание антителами с использованием CD138 и CD56 с последующим FACS применяли для контроля цитотоксичности клеток-мишеней MM.1S и выживания NK-клеток. Данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo и GraphPad Prism 6. Ат-1, отрицательный контроль, не нацеленный на ВСМА/к CD16a, показан незакрашенными символами. Антитело I к BCMA/CD16a показано закрашенными символами. Фиг. 40Е иллюстрирует, что терапия R7R ММ второй линии представляет собой целевое показание для лечения антителом к BCMA/CD16A. В этом примере антитело I к BCMA/CD16A используется иллюстративно. Конкретнее, данные на этой фигуре показывают, что антитела к BCMA/CD16A (антитело к BCMA/CD16A используется с иллюстративной целью) отличаются от антитела к CD38 (даратумумаб). Даратумумаб обладает цитотоксической активностью, зависимой от комплемента, при MM (de Weers, М. et al. 2011. J. Immun. 186(3): 1840-1848) и способностью вызывать апоптоз путем передачи сигналов посредством перекрестного связывания с CD38 (Overdijk, М.В., et al., 2016 J. Immun. 197(3):807-813), тогда как антитело I к BCMA/CD16A не обладает такой активностью. Кроме того, в отличие от даратумумаба на активность антитела I к BCMA/CD16A не влияет полиморфизм CD16A, который снижает активность Fc-опосредованных лекарственных средств, как показано на Фиг. 41Аи 41В. В целом, Фиг. 40Е иллюстрирует, что антитело I к BCMA/CD16A не вызывает деплецию NK-клеток (которые являются СВ38-положительными), а даратумумаб вызывает.

Фиг. 41А и 41В иллюстрируют влияние сыворотки на экспрессию CD16A и активацию NK-клеток в отсутствие ВСМА⁺ клеток-мишеней. Кроме того, низкая экспрессия CD16 в присутствии сыворотки свидетельствует о не опосредованной CD1A активации NK-клеток. Фиг. 41А иллюстрирует ухудшение обнаружения CD16A в присутствии сыворотки. Фиг. 41В иллюстрирует более сильную не опосредованную мишенью активацию в присутствии сыворотки.

Фиг. 42А-42С иллюстрирует, что лечение с использованием ИЛ-15 повышает активность антител к CD16A/BCMA по отношению к клеткам ММ. Фиг. 42А иллюстрирует процент лизиса опухолевых клеток, которые обрабатывали: а) без антитела, b) отрицательным контролем 1, с) отрицательным контролем 2, d) антителом I к BCMA/CD16A, е) антителом к BCMA/CD19, и f) даратумумабом. Фиг. 42В иллюстрирует процент лизиса опухолевых клеток, которые обрабатывали: а) без антитела+ИЛ-15, b) отрицательным контролем 1+ИЛ-15, с) отрицательным контролем 2+ИЛ-15, d) антителом I к BCMA/CD16A+ИЛ-15, е) антителом к BCMA/CD19 + ИЛ-15, и f) даратумумабом +ИЛ-15. Фиг. 42С иллюстрирует структуры отрицательного контроля №1, отрицательного контроля №2 и BCMA/CD19, показанные на Фиг. 42А и 42В.

Фиг. 43 иллюстрирует количество NK-клеток в периферической крови пациентов, не получавших лечение даратумумабом, пациентов, рефрактерных к даратумумабу. Фиг. 43 иллюстрирует данные проточной цитометрии для NK-клеток в периферической крови (абсолютные количества/мкл) на исходном уровне в клиническом исследовании атезолизумаба. NK-клетки гейтировали как CD56/CD16 + лимфоциты: популяция с низким CD45xSSC (стандартное гейтирование), затем дополнительно гейтировали в CD56/CD16 + популяцию. Для атезолизумаба уровни NK-клеток у пациентов, рефрактерных к даратумумабу, были ниже, чем у пациентов, не получавших лечение даратумумабом, и ниже чем интервал для здоровых доноров (площадь между штриховыми линиями).

Фиг. 44 иллюстрирует соотношения NK-клетки/опухолевые клетки в костном мозге пациентов с R/R ММ.

Фиг. 45А и 45В иллюстрируют in vitro уничтожение клеточных линий антителом I к CD16A/BCMA. Антитело I к CD16A/BCMA показано закрашенными кругами, даратумумаб («Dara») показан закрашенными квадратами, и NTx16a, нецелевое биспецифическое антитело к CD16A, показано незакрашенными квадратами. На Фиг. 45А, Е:Т составляло 0,05. На Фиг. 45В, Е:Т составляло 0,5.

Фиг. 46A-46D иллюстрируют влияние свежеподготовленных NK-клеток на цитотоксичность антитела I к CD16A/BCMA и антитела II к CD16A/BCMA. «Свежеподготовленные NK-клетки» представляют собой NK-клетки, которые были выделены из свежеполученных МКПК в тот же день. «2-х дневные NK-клетки» представляют собой NK-клетки, которые получали из МКПК, выделенных в первый день и культивируемых в среде RPMI в течение ночи. Фиг. 46А иллюстрирует цитотоксичность свежеподготовленных NK-клеток по отношению к клеткам NCI-H929. Фиг. 46В иллюстрирует цитотоксичность свежеподготовленных NK-клеток по отношению к клеткам MM.1S. Фиг. 46С иллюстрирует цитотоксичность 2-х дневных NK-клеток по отношению к клеткам NCI-H929. Фиг. 46D иллюстрирует цитотоксичность 2-х дневных NK-клеток по отношению к клеткам MM.1S.

Фиг. 47 иллюстрирует экспрессию FcRH5, ВСМА и CD38 в замороженных мононуклеарных клетках костного мозга (ВММС)при первичной миеломе. Замороженные мононуклеарные клетки костного мозга при первичной миеломе (ВММС) от 20 доноров и контроль (миеломная клеточная линия MOLP-2) оценивали относительно экспрессии на поверхности клеток FcRH5, ВСМА (Biolegend 19F2), CD38. Кратко, ВММС размораживали, промывали стерильным ФСБ, затем ресуспендировали до конечной концентрации 1×10^6 клеток/мл. ВММС окрашивали маркерами жизнеспособности и миеломными маркерами (CD45, CD319, CD138, CD38, ВСМА, FcRH5). После фиксации и промывания клеток их считывали с использованием Canto II. Анализ FcRH5, ВСМА и CD38 выполняли в Flow Jo путем выбора живые/синглеты/СВ45-/СВЗ 19+клетки (миеломные клетки). Величины MESF (Log10) для FcRH5, ВСМА и CD38 представляли графически с использованием статистического графического программного обеспечения Prism.

Фиг. 48А и 48В иллюстрируют экспрессию ВСМА на нормальных плазматических клетках человека и первичных клетках ММ. Фиг. 48А иллюстрирует экспрессию ВСМА на нормальных плазматических клетках человека. Фиг. 48В иллюстрирует пример экспрессии ВСМА в замороженных ВММС при первичной миеломе. В случае обеих Фиг. 48А и 48В клетки окрашивали и гейтировали в соответствии с протоколом, описанным выше на Фиг. 47 с ВСМА, затем % от макс, представляли графически в FlowJo. Серый закрашенный пик представляет собой флуоресцентный контроль без одной детектируемой метки (FMO), а красный пик представляет собой экспрессию ВСМА.

Фиг. 49A-49F иллюстрируют, что активация NK-клеток и индукция высвобождения ИНФ-γ вовлекающими агентами ROCK сильно зависит от наличия клеток-мишеней. Фиг. 49А-49С иллюстрируют процентную долю CD69+ NK-клеток в культурах МКПК при возрастающих концентрациях вовлекающих агентов ROCK к BCMA/CD16A TandAb_A, scFv-IgAb_D и KiH-scDb-Fc_А в присутствии и в отсутствие ВСМА+ клеток-мишеней RPMI-8226. Фиг. 49А иллюстрирует TandAb_А, Фиг. 49В иллюстрирует scFv-Ig_Ab_D, и Фиг. 49С иллюстрирует KiH-scDb-Fc_A. МКПК человека культивировали с (закрашенные символы) или без (незакрашеные символы) клетками-мишенями RPMI-8226 (соотношение Е:Т: 50:1) в присутствии возрастающих концентраций антитела (квадраты) или без антитела (треугольники). После 22 ч инкубации экспрессию CD69 на поверхности CD56+ NK-клеток анализировали с помощью проточной цитометрии. Фиг. 49D-49F иллюстрируют, что свежеподготовленные выделенные МКПК человека культивировали в присутствии или в отсутствие ВСМА+ клеток NCI-H929 при соотношении Е:Т, составляющем 50:1, с или без 10 мкг/мл TandAb_A, scFv-IgAb_D или KiH-scDb-Fc_A. Фиг. 49D иллюстрирует TandAb_А, Фиг. 49Е иллюстрирует scFv-IgAb_D, и Фиг. 49F иллюстрирует KiH-scDb-Fc_А. После 24 ч инкубации количественно определяли концентрацию ИНФ-γ в супернатантах. *: ниже нижнего предела обнаружения.

Фиг. 50 иллюстрирует сравнение выброса воспалительных цитокинов в культурах МКПК человека, вызванного направленными на ВСМА Т-клеточными вовлекающими агентами и вовлекающими агентами ROCK. Свежеподготовленные МКПК человека культивировали совместно с ВСМА + клеточной линией NCI-H929 (соотношение Е:Т 50:1) в присутствии или в отсутствие возрастающей концентрации BCMA/CD3 BiTE или вовлекающих NK-клетки агентов ROCK, scFv-IgAb_D или KiH-scDb-Fc_А. После 24 ч инкубации количественно определяли концентрацию цитокинов в супернатантах. Контроль: антитело не добавляли.

Фиг. 51 иллюстрирует in vitro цитотоксичность обогащенных первичных NK-клеток человека по отношению к клеткам А-431 в присутствии нескольких форматов антител ROCK®. Иллюстративные сигмоидальные кривые доза-ответ указанных антител ROCK, нацеленных на РЭФР, в 4-часовом анализе цитотоксичности на основе высвобождения кальцеина при соотношении Е:Т 5:1. SABC, специфическая способность связывания антитела (среднее значение ≥3 анализов).

Фиг. 52A-52D иллюстрируют сравнение антител ROCK® и IgG в in vitro анализах цитотоксичности в присутствии или в отсутствие конкурирующего поликлонального, моноклонального или Fc-усиленного IgG. 4-Часовые анализы цитотоксичности на основе высвобождения кальцеина с мечеными кальцеином CD30+ клетками-мишенями KARPAS-299 с первичными NK-клетками в качестве эффекторных клеток при соотношении Е:Т 5:1 в присутствии последовательно разбавленных TandAb к CD30/CD16A, IgG1 (IgAb) к CD30 или IgG1 к CD30 с опосредованными Fc мутациями, усиливающими эффекторную функцию, S239D / I332E (IgAb (Fc-усиленный)). Анализы выполняли в среде RPMI 1640 или среде, дополненной 10 мг/мл поликлонального IgG человека, 10 мг/мл моноклонального IgG1 человека к РЭФР (IgAb) или 10 мг/мл моноклонального IgG1 человека с усиленным Fc к РЭФР (IgAb (Fc-усиленный)). Фиг. 52А иллюстрирует среду RPMI 1640. Фиг. 52 В иллюстрирует среду, дополненную 10 мг/мл поликлонального IgG человека. Фиг. 52С иллюстрирует 10 мг/мл моноклонального IgG1 человека к РЭФР. Фиг. 52D иллюстрирует 10 мг/мл моноклонального IgG1 человека к РЭФР с усиленным РЭФР.

Фиг. 53A-53D иллюстрируют последовательности фрагмента, нацеленного на ВСМА, и фрагмента, связывающего антиген CD16A, антитела I к CD16A/BCMA. Фиг. 53А иллюстрирует последовательности CDR фрагмента, нацеленного на ВСМА, антитела I к CD16A/BCMA. Фиг. 53В иллюстрирует последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей фрагмента, нацеленного на ВСМА, антитела I к CD16A/BCMA. Фиг. 53С иллюстрирует последовательности CDR фрагмента, связывающего антиген CD16A, антитела I к CD16A/BCMA. Фиг. 53D иллюстрирует последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей фрагмента, связывающего антиген CD16A, антитела I к CD16A/BCMA.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Определения

Термин «мультиспецифический» относится к антигенсвязывающей молекуле, содержащей антигенсвязывающие сайты, которые связываются с по меньшей мере двумя различными эпитопами, в частности эпитопами различных антигенов. «Мультиспецифический» включает, но не ограничивается этим, биспецифический, триспецифический и тетраспецифический.

Термин «валентный» обозначает наличие определенного числа антигенсвязывающих фрагментов в антигенсвязывающем белке. Природный IgG содержит два антигенсвязывающих фрагмента и является двухвалентным. Антигенсвязывающие белки в соответствии с изобретением являются по меньшей мере трехвалентными. В данном документе приведены примеры тетра-, пента- и гексавалентных антигенсвязывающих белков.

Термин «полипептид» относится к полимеру из остатков аминокислот, последовательно связанных амидными связями. В некоторых вариантах осуществления изобретения термин «полипептид» относится к группе молекул, которые обычно состоят из более чем 30 аминокислот. Полипептиды могут дополнительно образовывать мультимеры, например димеры, тримеры и высшие олигомеры, т.е. состоящие из боле чем одной полипептидной молекулы. Полипептидные молекулы, образующие такие димеры, тримеры и т.д. могут быть идентичными или неидентичными. Соответствующие структуры таких мультимеров более высоких порядков, следовательно, называют гомо- или гетеродимерами, гомо- или гетеротримеры и т.д. Пример гетеромультимера представляет собой молекулу антитела, которая в своей встречающейся в природе форме состоит из двух идентичных легких полипептидных цепей и двух идентичных тяжелых полипептидных цепей. Термины «пептид», «полипептид» и «белок» также относится к естественно модифицированным пептидам/полипептидам/белкам, причем модификация осуществляется, например, путем посттрансляционных модификаций, например гликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования и тому подобного. «Пептид», «полипептид» или «белок», при упоминании в данном документе, также может быть химически модифицированным, например пегилированным. Такие модификации хорошо известны в данной области техники и описаны в данном документе ниже.

«Полипептид Fv» обозначает слитый полипептид, в котором вариабельные домены (Fv) антитела связаны друг с другом. Указанный полипептид может подряд содержать аминокислотные остатки в дополнение к N-концевым и/или С-концевым удлинениям последовательности. Например, полипептид может содержать последовательность тэга, предпочтительно на С-конце, которая может быть полезной для очистки, а также обнаружения полипептида. Примеры последовательностей тэга представляют собой гистидиновый тэг, например His-тэг, состоящий из шести остатков His, (SEQ ID NO: 58), или С-тэг, например тетрапептид EPEA (SEQ ID NO: 59). Для мультимерной антигенсвязывающей молекулы различные последовательности тэгов можно использовать для различных полипептидов, например His-тэг для первого полипептида и С-тэг для второго полипептида гетеродимерной молекулы. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептид содержит вариабельные домены, обеспечивающие антигенсвязывающие сайты, константные домены антитела, например C_L, C_H1C_H, и/или участки Fc (СН2-СН3), связанные в полипептид. Например такие варианты осуществления содержат полипептид Fv, слитый с по меньшей мере одним константным доменом антитела, например участком Fc. В дополнительных вариантах осуществления изобретения полипептид может быть связан с другим агентом, например токсином, иммуномодулирующим агентом или сигналообразующим агентом.

Термин «участок Fc» относится к полипептиду, образующему С-концевую часть Н-цепи иммуноглобулина и сохраняющему по меньшей мере одно функциональное свойство области Fc области IgG, в частности функцию связывания с FcRn. Эффекторные функции антитела определяются последовательностями в области Fc. Участок Fc может содержать домен СН2, домен СН3 и полипептидную цепь СН2-СН3. Полипептидная цепь СН2-СН3 формирует с другой полипептидной цепью СН2-СН3 димер из двух полипептидов СН2-СН3, объединенных друг с другом, причем димеризация стимулируется ковалентным связыванием в шарнирной области на N/C-конце домена СН2. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления изобретения участок Fc содержит димер из двух полипептидных цепей СН2-СН3 и шарнирную область. Участок Fc предпочтительно содержит константные домены Ig различных классов, например константные домены IgA, IgD, IgE, IgM, предпочтительно IgG1, IgG₂, IgG₂, IgG4, в частности IgG1. Константные области легкой цепи (CL) могут быть выбраны из каппа (κ), лямбда (λ) и сигма (σ), причем класс лямбда человека содержит подклассы лямбда 1-4. «Шарнирный» домен может быть того же или отличного класса IgG, что и участок Fc, или представлять собой сконструированный, не встречающийся в природе шарнирный домен. Пример шарнирной области IgG имеет аминокислотную последовательность, как представлено в SEQ ID NO: 23. Включены также варианты шарнирных областей дикого типа, например укороченные шарнирные области, например шарнирные области обозначенные как средняя шарнирная область с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 24.

Термины «антигенсвязывающий белок» и «антигенсвязывающая молекула» (с дефисом и без него) используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения производного иммуноглобулина с антигенсвязывающими свойствами; т.е. связывающий белок представляет собой антигенсвязывающую молекулу. Связывающий белок содержит иммунологически функциональную часть иммуноглобулина, способного связываться с целевым антигеном. Иммунологически функциональная часть иммуноглобулина может включать иммуноглобулины или их части, слитые белки, полученные из частей иммуноглобулинов, или конъюгаты, объединяющие части иммуноглобулинов, которые образуют антигенсвязывающий сайт. Каждый антигенсвязывающий фрагмент содержит по меньшей мере CDR тяжелой или легкой цепей иммуноглобулина, из которого был получен антигенсвязывающий фрагмент. Термины «антигенсвязывающий белок» и «антигенсвязывающая молекула» (с дефисом или без него) используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения фрагментов антитела, производных антитела и подобных антителам связывающих белков, которые сохраняют специфичность и аффинность к своему антигену, в том числе, например, IgG-подобных слитых полипептидов на основании доменов Fv с дополнительными константными доменами. В зависимости от желаемых свойств, таких как валентность мультиспецифичность, фармакокинетические и фармакодинамические свойства, Fv и константные домены и/или дополнительные функциональные домены собраны модулями в молекулы различных форматов или белковые каркасы, например, как описано в Brinkmann and Kontermann, mAbs, 2017, 9(2):182-192 или в Spiess et al., Molecular Immunology 2015;67:95-106.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий белок состоит из одной полипептидной цепи. Такой антигенсвязывающий белок представляет собой мономер. В других вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий белок содержит по меньшей мере две полипептидные цепи. Такой антигенсвязывающий белок представляет собой мультимер, например димер, тример или тетрамер.

Антигенсвязывающий белок предпочтительно является человеческим, наиболее предпочтительно полностью человеческим.

Термин «антигенсвязывающий фрагмент» относится сайту объединения антитела и антигена или паратопу антигенсвязывающего белка, который связывается, в частности специфически, с антигенной детерминантой (эпитопом) антигена. Антигенсвязывающий сайт представляет собой участок связывания антигенсвязывающего белка, который способен распознавать антиген и специфически связываться с антигеном.

«Fv», как описано в данном документе, обозначает антигенсвязывающий фрагмент, содержащий вариабельные домены как легкой (V_L), так и тяжелой (V_H) цепей антитела, который распознает антиген, т.е. связывается с эпитопом антигена. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий сайт может представлять собой единственный домен (sdAb), например фрагменты VнH верблюдовых или фрагменты V_NAR хрящевых рыб.

Каждый антигенсвязывающий фрагмент образуется вариабельным доменом тяжелой цепи (V_H) антитела, т.е. иммуноглобулина, и вариабельным доменом легкой цепи антитела (V_L), связывающимися с одним и тем же эпитопом, тогда как вариабельный домен тяжелой цепи (V_H) содержит три области, определяющие комплементарность, (CDR) тяжелой цепи: HCDR1, HCDR2 и HCDR3; и вариабельный домен легкой цепи (V_L) содержит три области, определяющие комплементарность, (CDR) легкой цепи цепи: LCDR1, LCDR2 и LCDR3. Вариабельные домены тяжелой и легкой цепей антигенсвязывающего сайта могут быть ковалентно связаны друг с другом, например, посредством пептидного линкера, или нековалентно ассоциированы друг с другом с образованием антигенсвязывающего сайта.

«Линкер» относится к последовательности аминокислот, содержащей линкерный пептид, объединяющий два соседних вариабельных домена, образующих антигенсвязывающий фрагмент, с С-концом одного домена, связанного с N-концом другого соседнего домена или наоборот. Что касается аминокислотного состава, последовательность пептидного линкера выбирают так, чтобы она не мешала образованию Fv, т.е. V_H/V_L, сайтов связывания и распознавания антигена, а также не препятствовала мультимеризации, например димеризации полипептидов мультиспецифического антигенсвязывающего белка. Например, линкер, содержащий остатки глицина и серина, обычно обеспечивает устойчивость к протеазе. В некоторых вариантах осуществления изобретения используются пептидные линкеры (G₂S)_x, где, например, х = 1-20, например используются пептилные линкеры (G₂S), (G₂S)₂, (G₂S)₃, (G₂S)₄, (G₂S)₅, (G₂S)₆, (G₂S)₇, или (G₂S)₈, или (G₃S)_x, где, например, x = 1-15, или используются пептидные линкеры (G₄S)_x, где, например, х = 1-10, предпочтительно 1-6. Аминокислотную последовательность линкера можно оптимизировать, например, методами фагового дисплея, для улучшения образования антигенсвязывающего сайта и увеличения выхода выработки полипептида.

«Соединительная группа» относится к пептиду, связывающему антигенсвязывающий фрагмент с фрагментом Fab, шарнирной областью или участком Fc. Под определение соединительной группы не попадает пептид, соединяющий два вариабельных домена.

Длина линкеров и соединительных групп может влиять на свертывание и гибкость полипептида Fv антигенсвязывающего фрагмента. Желаемая гибкость полипептида Fv зависит от плотности целевого антигена и доступности целевого антигена, т.е. эпитопов на целевом антигене. Более длинные линкеры или соединительные группы могут давать более гибкие полипептиды Fv с более подвижными антигенсвязывающими сайтами. Влияние длины линкера на образование димерных антигенсвязывающих полипептидов описано, например, в Todorovska et al., Journal of Immunological Methods 2001;248:47-66; Perisic et al., Structure 1994;2:1217-1226; Le Gall et al., Protein Engineering 2004;17:357-366 и WO 94/13804.

«Одноцепочечный вариабельный фрагмент антитела» или «scFv» содержит антигенсвязывающий сайт, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), который необязательно слит посредством пептидного линкера с вариабельным доменом легкой цепи (V_L). scFv может представлять собой полипептидную цепь: V_L-линкер-V_H или V_H-линкер-V_L от N- к С-концу полипептидной цепи, (Huston et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 1988, 85:5879-83). Линкер между доменами V_H и V_L делает возможным образование требуемой структуры, которая обеспечивает связывание антигена.

«Антигенсвязывающий (Fab) фрагмент» или «Fab» содержит один константный (CH1, CL) и один вариабельный домены (V_H, V_L), образованные посредством димеризации каждой из последовательностей, полученных из тяжелой (Н) цепи и легкой (L) цепи, причем вариабельные домены V_H и V_L составляют антигенсвязывающий сайт. Два фрагмента Fab' присоединены как фрагмент F(ab')₂ N-концом к участку Fc посредством шарнирной области.

«Диатело» (Db) обозначает двухвалентную Fv-молекулу, состоящую из двух пар вариабельных доменов тяжелой (V_H) и вариабельных доменов легкой (V_L) цепи, первой пары и второй пары, которые ассоциированы с двумя антигенсвязывающими сайтами V_L/V_H. Каждая пара вариабельных доменов связана друг за другом в полипептид. В некоторых вариантах осуществления изобретения двухвалентная Fv-молекула состоит из первой и второй пары двух соседних вариабельных доменов, причем в каждой паре два вариабельных домена слиты коротким пептидным линкером, который предотвращает интрамолекулярную ассоциацию между вариабельными доменами, связанными коротким линкером. Первую пару вариабельных доменов ассоциируют со второй парой вариабельных доменов перекрестно с образованием двух антигенсвязывающих сайтов Fv. Следовательно, каждый из двух антигенсвязывающих фрагментов образуется одним вариабельным доменом первой пары вариабельных доменов и одним вариабельным доменом второй пары вариабельных доменов. Следовательно, такое диатело содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, состоящий из двух вариабельных доменов, которые не связаны непосредственно коротким линкером. В диателе вариабельные домены первого антигенсвязывающего фрагмента связаны посредством линкера с вариабельным доменом второго антигенсвязывающего фрагмента. Например, V_H первого антигенсвязывающего фрагмента связана посредством первого линкера с V_L второго антигенсвязывающего фрагмента в первом полипептиде, и V_L первого антигенсвязывающего фрагмента связана посредством второго линкера с V_H второго антигенсвязывающего фрагмента во втором полипептиде. В каждой паре соседних вариабельных доменов коротки первый или второй линкер связывает С-конец одного вариабельного домена с N-концом другого вариабельного домена или наоборот. В каждой паре вариабельные домены могут быть ориентированы от N- до С-концу как V_L-V_H, V_H-V_L, V_H-V_H и V_L-V_L, причем два вариабельных домена указанной пары могут обладать специфичностью к различным эпитопам антигена или к одному и тому же эпитопу антигена. В некоторых случаях два вариабельных домена связаны непосредственно пептидной связью между С-концом одного вариабельного домена и N-концом другого вариабельного домена пары. Длина короткого пептидного линкера, связывающего два вариабельных домена в каждой из первой и второй пары вариабельных доменов диатела, является такой, что предотвращается интрамолекулярная ассоциация между вариабельными доменами, связанными линкером. Такой линкер является «коротким», т.е. состоит из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или около 12 аминокислотных остатков. В случае 0 аминокислотных остатков линкер представляет собой пептидную связь. Такой коротки линкер способствует правильной димеризации между двумя парами вариабельных доменов и образованию двух антигенсвязывающих сайтов Fv. Укорочение линкера до около 12 или менее аминокислотных остатков обычно препятствует взаимодействию соседних доменов на одной и той же полипептидной цепи друг с другом. В некоторых вариантах осуществления изобретения эти линкеры состоят из от около 3 до около 12, например от 5 до 10, в частности от 7 до 9 аминокислотных остатков подряд. Длину линкера можно регулировать в соответствии с конкретной ориентацией домена в полипептиде диатела. Кроме того, в принципе возможно, что два полипептида, имеющие линкер из более чем 12 аминокислотных остатков между вариабельными доменами антитела пары, правильно димеризуются друг с другом (см., например, Le Gall et al., Protein Engineering 2004;17:357-366).

«Одноцепочечное антитело (scDb)» обозначает производное антитела, преобразованное в отдельную полипептидную цепь путем добавления дополнительного линкера для слияния первого и второго полипептидов (Kontermann et al., Immunol. Methods, 1999;226: 179-188). Следовательно, дополнительный линкер соединяет С-конец первого полипептида, содержащего вариабельные домены первого и второго антигенсвязывающих фрагментов, связанных первым линкером, с N-концом второго полипептида, содержащего сходные вариабельные домены первого и второго антигенсвязывающих фрагментов, связанных вторым линкером. Следовательно, scDb состоит из одной полипептидной цепи, т.е. полипептида Fv, причем четыре вариабельных домена двух антигенсвязывающих фрагментов расположены от N- к С-концу:

- VL-линкер 1-VH-линкер 3-VL-линкер 2-VH, или

- VL-линкер 1-VL-линкер 3-V_H-линкер 2-VH, или

- V_H-линкер 1-VL-линкер 3-V_H-линкер 2-VL, или

- VH-линкер 1-VH-линкер 3-VL-линкер 2-VL

Линкер 1 и линкер 2 являются «короткими» линкерами, используемыми в диателах, например, состоят из менее 13, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 аминокислотных остатков.

Линкер 3 является более гибким линкером, используемым, например, для scFv, который стимулирует интрамолекулярное сворачивание и ассоциацию двух N-концевых вариабельных доменов и двух С-концевых вариабельных доменов в два антигенсвязывающих фрагмента. Линкер 3 состоит из 13 или более аминокислотных остатков, например 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления изобретения линкер 3 составляет от 15 до 25, предпочтительно от 15 до 20 или от 13 до 18 аминокислот.

Термин «тандемное диатело» относится к антигенсвязывающей молекуле, построенной связыванием по меньшей мере четырех вариабельных доменов (двух вариабельных доменов тяжелой цепи (VH) и двух вариабельных доменов легкой цепи (VL)) в одну генную конструкцию, обеспечивающую возможность гомодимеризации двух из транслированных полипептидных цепей. В таких тандемных диателах длина линкера являет такой, что он предотвращает интрамолекулярное спаривание вариабельных доменов, так что молекула не может сворачиваться сама по себе с образованием мономерной одноцепочечной молекулы, но принудительно спаривается с комплементарными доменами другой цепи. Вариабельные домены также расположены так, что соответствующие вариабельные домены спариваются в процессе такой димеризации (Weichel et al., European Pharmaceutical Review 2015;20(1):27-32; Reusch et al., mAbs 2014;6:3, 728-739).

«Перенаправляющая молекула с двойной аффинностью (DART)» относится к белковому каркасу, причем VH первого антигенсвязывающего фрагмента связана с VL второго антигенсвязывающего фрагмента на втором полипептиде, и VH второго антигенсвязывающего фрагмента связана с VL на первом полипептиде в порядке VL(A)-VH(B) + VL(B)-VH(A), при этом межцепочечная дисульфидная связь введена для стабилизации молекулы.

Термин «мишень» или «целевой антиген» относится к антигену, который экспрессируется или ассоциирован с типом клеток, т.е. клеткой-мишенью или инфицированной вирусом клеткой, на которую следует направить NK-клетки, чтобы вызвать или запустить NK-клеточную цитотоксичность. Примеры целевого антигена могут представлять собой опухолевый антиген или опухолеассоциированный антиген (ТАА). Опухолевый антиген или ТАА может экспрессироваться на поверхности клетки-мишени или проявляться посредством МНС-комплекса в виде МНС-рестриктированного пептида. Примеры опухолевых антигенов включают, но не ограничиваются ими, CD5, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD123, CD138, CCR4, CS-1, GD2, матриксную металлопротеиназу 1 (ММР1), белок-предшественник рецептора ламинина, ВСМА, РЭФР, РЭФРvIII, Ер-САМ, gpA33, AMHRII, PDGFRα, SLAMF7, PLAP, антиген Томсона-Фриденрайха (TF), MUC-1 (муцин), IGFR, ИЛ-4-R альфа, ИЛ-13-R, HER2/neu, HER3, PSMA, СЕА, TAG-72, HPV Е6, HPV Е7, BING-4, циклин-B₁, 9D7, EphA2, EphA3, теломеразу, мезотелин, SAP-1, сурвивин, раково-тестикулярный антиген (семейство BAGE, семейство CAGE, семейство GAGE, семейство MAGE, семейство SAGE, семейство XAGE), NY-ESO-1/LAGE-1, PRAME, SSX-2, мелан-A/MART-l, Gp100/pmel17, тирозиназу, TRP-1/-2, MC1R, β-катенин, BRCA1/2, CDK4, CML66, MART-2, р53, Ras, TGF-βRII и TCR (из Categories of Tumor Antigens, Holland-Frei Cancer Medicine. 6^th edition. Kufe DW, Pollock RE, Weichselbaum RR. et al., editors Hamilton (ON):Becker; 2003). «Мишень» и «целевой антиген» также включают сывороточный альбумин, в частности человеческий сывороточный альбумин (HSA). В некоторых вариантах осуществления изобретения целевой антиген представляет собой ВСМА.

В других вариантах осуществления изобретения целевой антиген может представлять собой инфекционный агент, например вирусный или бактериальный патоген, от например, вируса денге, простого герпеса, цитомегаловируса, вирусов гепатита, Т-лимфотропных вирусов человека, вируса гриппа, RSV, вирусов папилломы (в том числе антигены в дополнение к Е6 и Е7, упомянутым выше), вируса гриппа или ВИЧ. Также включены пептидные мишени, проявляющиеся посредством МНС-комплекса в виде МНС-рестриктированного пептида.

«CD16A» относится к активирующему рецептору CD16A, также известному как FcγRIIIA, который экспрессируется на поверхности NK-клеток. CD16A представляет собой активирующий рецептор, запускающий цитотоксическую активность NK-клеток. Аффинность антител к CD16A прямо коррелирует с их способностью запускать активацию NK-клеток, таким образом более высокая аффинность по отношению к CD16A уменьшает дозу антитела, требуемую для активации. Антигенсвязывающий сайт антигенсвязывающего белка связывается с CD16A, но не с CD16 В. Например, антигенсвязывающий сайт, содержащий вариабельные домены тяжелой (VH) и легкой (VL) цепи, связывающиеся с CD16A, но не связывающиеся с CD16B, может быть представлен антигенсвязывающий сайтом, который специфически связывается с эпитопом CD16A, который содержит аминокислотные остатки С-концевой последовательности SFFPPGYQ (SEQ ID NO: 57) и/или остатки G130 и/или Y141 CD16A (SEQ ID NO: 48), не присутствующие в CD16B.

«Миеломная клетка» представляет собой злокачественную (раковую) плазматическую клетку, возникающую из плазматической клетки в костном мозге путем неопластической трансформации. При миеломе злокачественные плазматические клетки вырабатывают большие количества аномальных антител, у которых отсутствует способность бороться с инфекцией. Эти аномальные антитела представляют собой так называемый моноклональный белок или М-белок, который функционирует как опухолевый маркер миеломы. Миеломная клетка имеет фенотип CD19^-/CD38⁺/CD138⁺/BCMA⁺. Следовательно, CD38, CD138 и ВСМА представляют антигены, экспрессируемые на миеломной клетке. Также включены злокачественные фенотипы ростка В-клеток, которые являются положительными к CD19/CD20/CD22/BCMA и другим антигенам (сюда следует включить фенотипы, которые классически не считаются плазматическими клетками, но могут эволюционировать из В-клеток памяти или предплазматического клеточного ростка).

«РЭФР» относится к рецептору эпидермального фактора роста (РЭФР; ErbB-1; HER1 у людей, в том числе все описанные изоформы и варианты с активацией, мутациями и вовлеченные в патофизиологические процессы. Сайт, связывающий антиген РЭФР, распознает эпитоп на внеклеточном домене РЭФР. В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий сайт специфически связывается с РЭФР человека или яванского макака.

Рецептор эпидермального фактора роста (РЭФР) представляет собой член семейства HER рецепторных тирозинкиназ и состоит из четырех членов: РЭФР (ErbB1/HER1), HER2/neu (ErbB2), HER3 (ErbB3) и HER4 (ErbB4). Стимуляция рецептора посредством связывания с лигандом (например, ЭФР, TGFa, HB-EGF, нейрегулины, бетацеллулины, амфирегулины) активирует внутреннюю рецепторную тирозинкиназу во внутриклеточном домене посредством фосфорилирования тирозина и способствует гомо- или гетеродимеризации с членами семейства HER. Эти внутриклеточные фосфотирозины служат сайтами докинга для различных адаптерных белков или ферментов, в том числе MAPK и PI(3)K/Akt, которые одновременно инициируют множество сигнальных каскадов, которые влияют на пролиферацию, ангиогенез, устойчивость к апоптозу, инвазию и метастазирование клеток.

«РЭФРvIII» относится к мутанту внеклеточного домена РЭФР, возникающего в результате делеции пары оснований внутри рамки, изменяющей экзоны 2-7 кодирующей последовательности РЭФР (Gan НК et al., FEBS 2013, 280:5350-5370).

Термин «связывающий домен» характеризуется в связи с данным изобретением как домен, который (специфически) связывается с/взаимодействует с/ распознает указанный целевой эпитоп или указанный целевой участок на целевых молекулах (антигенах), например CD16 и антиген поверхности клетки-мишени, соответственно. Структура и функции первого связывающего домена (распознавание, например, CD16), и предпочтительно также структура и/или функции второго связывающего домена (распознавание антигена поверхности клетки-мишени) основаны на структуре и/или функциях антитела, например, нативной молекулы иммуноглобулина или молекулы полной длины и/или происходят от вариабельных доменов тяжелой цепи (V_H) и/или вариабельных доменов легкой цепи (V_L) антитела или его фрагмента. Первый связывающий домен предпочтительно характеризуется наличием трех CDR легкой цепи (т.е. CDR1, CDR2 и CDR3 области V_L) и/или трех CDR тяжелой цепи (т.е. CDR1, CDR2 и CDR3 области V_H). Ко второму связывающему домену предпочтительно предъявляются минимальные структурные требования к антителу, которые позволяют осуществлять связывание мишени. Второй связывающий домен более предпочтительно содержит три CDR легкой цепи (т.е. CDR1, CDR2 и CDR3 области V_L) и/или трех CDR тяжелой цепи (т.е. CDR1, CDR2 и CDR3 области V_H). Предусмотрено, что первый и/или второй связывающий домен продуцируется или его можно получить методами фагового дисплея или скриннинга библиотек, а не путем переноса последовательностей CDR из предсуществующих (моноклональных) антител на каркас.

Термин «(специфически) связывается с», «(специфически) распознает», «(специфически) направлено на» или «(специфически) реагирует с» означает в соответствии с этим изобретением, что связывающий домен взаимодействует или специфически взаимодействует с данным эпитопом или данным целевым сайтом на целевых молекулах (антигенах), например, CD16a и антиген на поверхности клетки-мишени, например ВСМА, соответственно.

Термин «не связывается существенно/в значительной степени» или «не способен связываться» означает, что связывающий домен по данному изобретению не связывается с белком или антигеном, отличным от CD16a, и что антиген поверхности клетки-мишени, например, не демонстрирует реакционную способность более около 30%, предпочтительно не более около 20%, предпочтительнее не более около 10%, особенно предпочтительно не более около 9%, около 8%, около 7%, около 6% или около 5% с белками и антигенами, отличными от CD 16а, и антигеном поверхности клетки-мишени, тогда как связывание с CD16a и антигеном на поверхности клетки-мишени, соответственной, принимают за 100%.

Полагают, что на специфическое связывание влияние оказывают специфические мотивы в аминокислотной последовательности связывающего домена и антигена. Таким образом, связывание достигается как результат их первичной, вторичной и/или третичной структуры, а также как результат вторичных модификаций указанных структур. Специфическое взаимодействие сайта, взаимодействующего с антигеном, с его специфическим антигеном может приводить простому связыванию указанного сайта с антигеном. Кроме того, специфическое взаимодействие сайта, взаимодействующего с антигеном, с его специфическим антигеном может альтернативно или дополнительно приводить к инициированию сигнала, например, вследствие индукции изменения конформации антигена, олигомеризации антигена и т.д.

Термин «вариабельный» относится к участкам доменов антитела или иммуноглобулина, которые демонстрируют вариабельность в своих последовательностях и которые вовлечены в определение специфичности и аффинности связывания конкретного антитела (т.е. «вариабельный домен(-ы)»). Спаривание вариабельного домена тяжелой цепи (V_H) и вариабельного домена легкой цепи (V_L) вместе приводит к образованию одного антигенсвязывающего сайта.

Вариабельность не равномерно распределена по вариабельным доменам антител; она сконцентрирована в субдоменах каждой из вариабельных областей тяжелой и легкой цепи. Эти субдомены называются «гипервариабельными областями» или «областями, определяющими комплементарность» (CDR). Более консервативные (т.е. негипервариабельные) участки вариабельных доменов называются «каркасными» областями (FRM или FR) и обеспечивают каркас для шести CDR в трехмерном пространстве с образованием антигенсвязывающей поверхности. Каждый вариабельный домен природных легких и тяжелых цепей содержит четыре области FRM (FR1, FR2, FR3 и FR4), преимущественно принимающих конфигурацию β-листа, соединенных тремя гипервариабельными областями, кторые образуют петли, соединяющие и в некоторых случаях образующие структуру β-листа. Гипервариабельные области в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости к FRM и с гипервариабельными областями другой цепи участвуют в образовании антигенсвязывающего сайта (см. Kabat et al., loc. cit.).

Термин «CDR» и во множественном числе «области CDR» относится к области, определяющей комплементарность, три из которых определяют характер связывания вариабельной области легкой цепи (CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3), а три определяют характер связывания вариабельной области тяжелой цепи (CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3). CDR содержат большинство остатков, ответственных за специфические взаимодействия антитела с антигеном и, следовательно, дают вклад в функциональную активность молекулы антитела: они являются основными детерминантами антигенной специфичности.

Точное определение границ и длины CDR является предметом различных систем классификации и нумерации. Следовательно, CDR могут относится к системе по Кабату, Чотиа, контакта или любым другим определениям границ, включая системы нумерации, описанные в данном документе. Несмотря на различные границы каждая их этих систем в некоторой степени перекрывается, что составляет так называемые «гипервариабельные области» в вариабельных последовательностях. Следовательно, определения CDR в соответствии с этими системами могут отличаться по длине граничным областям относительно соседней каркасной области. См., например, Кабат (подход на основе вариабельности последовательности между видами), Чотиа (подход на основе кристаллографических исследований комплексов антиген-антитело), MacCallum, Honegger и IMGT (Wu and Kabat, J. Exp.Med. 1970;132:211-250; Chothia et al., J. Mol. Biol, 1987, 196: 901 -917; MacCallum et al., J. Mol. Biol, 1996, 262: 732; Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 2003;27:55-77; Honegger et al., J. Mol. Bol. (2001);309:657-670). Еще один стандарт для характеризации антигенсвязывающего сайта представляет собой определение АЬМ, используемое в программном обеспечении для моделирования антител, АЬМ (Oxford Molecular). См., например, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). До той степени, с которой два способа идентификации остатков определяют области перекрывания, но не идентичные области, их можно объединять, чтобы определить гибридный CDR. Однако нумерация в соответствии так называемой системой по Кабату является предпочтительной. В некоторых вариантах осуществления изобретения CDR, описанные в данном документе, идентифицированы в соответствии с системой нумерации по Кабату. В некоторых вариантах осуществления изобретения CDR, описанные в данном документе, идентифицированы в соответствии с подходом IMGT. В некоторых вариантах осуществления изобретения CDR, описанные в данном документе, идентифицированы в соответствии с подходом Honegger.

CDR3 легкой цепи и особенно CDR3 тяжелой цепи могут составлять наиболее важные детерминанты в связывании антигена в вариабельных областях легкой и тяжелой цепей. В некоторых конструкциях антител CDR3 тяжелой цепи, по-видимому, составляет основную область контакта между антигеном и антителом. Можно использовать схемы in vitro селектирования, в которых изменяется отдельно CDR3, для варьирования свойств связывания антител или определения того, какой остаток дает вклад в связывание антигена. Следовательно, CDR3, как правило, представляет собой наибольшей источник молекулярной изменчивости в антитело-связывающем сайте. Н3, например, может быть коротким в два аминокислотных остатка или более чем 26 аминокислот.

В классическом антителе или иммуноглобулине полной длины каждая легкая (L) цепь связана с тяжелой (Н) цепью одной ковалентной дисульфидной связью, тогда как две Н-цепи связаны друг с другом одной или более дисульфидными связями в зависимости от изотипа Н-цепи. Домен СН, наиболее близкий к VH, обычно обозначают как СН1. Константные («С») домены непосредственно не вовлечены в связывание антигена, но демонстрируют различные эффекторные функции, например зависимую от антитела, опосредованную клетками цитотоксичность и активацию комплемента. Область Fc антитела содержится в константных доменах тяжелой цепи и способно, например, взаимодействовать с расположенными на поверхности клеток рецепторами Fc.

Также предусмотрены модификации аминокислотной последовательности молекул, связывающих антитела, описанные в данном документе. Например, может быть необходимо улучшить аффинность связывания и/или другие биологические свойства конструкции антитела. Варианты аминокислотной последовательности конструкций антитела получают путем введения соответствующих изменений нуклеотидов в нуклеиновые кислоты конструкций антител или с помощью пептидного синтеза. Все описанные ниже модификации аминокислотных последовательностей должны приводить к конструкции антитела, в котором все еще сохранена требуемая биологическая активность (связывание с CD16a и антигеном поверхности клетки-мишени) немодифицированной исходной молекулы.

Модификации аминокислот включают, например, делеции, и/или вставки, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях молекул, связывающих антитела. Для получения конечной молекулы осуществляют любую комбинацию делеций, вставок и замен при условии, что конечная молекула обладает желаемыми характеристиками. Замены аминокислот могут также изменять посттрансляционные процессы связывающих молекул антител, например изменение количества или положения сайтов гликозилирования.

Например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислот может быть вставлено, заменено или удалено в каждой из CDR (конечно в зависимости от их длины), тогда как 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 25 аминокислот может быть вставлено, заменено или удалено в каждой из FR. Вставки аминокислот в последовательности конструкций антител предпочтительно включают амино- и/или карбокси-концевые слияния с диапазоном длины от 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остатков до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также вставки внутри последовательности одного или некоторого количества аминокислотных остатков. Соответствующие модификации можно выполнять в третьем домене конструкции антитела, определенном в контексте изобретения. Вариант конструкции антитела со вставками, определенный в контексте данного изобретения, включает слияние с N-концом или с С-концом антителосвязывающей молекулы фермента или слияние с полипептидом.

Сайты, представляющие наибольший интерес для замещающего мутагенеза, включают (но не ограничиваются ими) CDR тяжелой и/или легкой цепи, в частности гипервариабельных областей, но также подразумеваются изменения FR в тяжелой и/или легкой цепи. Такие замены предпочтительно являются консервативными, как описано в данном документе. Предпочтительно, в CDR могут быть заменены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, тогда как 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 25 аминокислот могут быть заменены в каркасных областях (FR), в зависимости от длины CDR или FR. Например, если последовательность CDR охватывает 6 аминокислот, предусмотрено, что одна, две или три аминокислоты заменены. Подобным образом, если последовательность CDR охватывает 15 аминокислот, предусмотрено, что одна, две, три, четыре, пять или шесть аминокислот заменены.

Как правило, если аминокислоты заменены в одной или более или во всех CDR тяжелой и/или легкой цепи, предпочтительно, что полученная впоследствии «замещенная» последовательность по меньшей мере на около 60% или около 65%, более предпочтительно около 70% или около 75%, еще более предпочтительно около 80% или около 85%, и особенно предпочтительно около 90% или около 95% идентична «исходной» последовательности CDR. Это означает, что степень, до которой CDR идентична «замещенной» последовательности, зависит от ее длины. Например, CDR, содержащая 5 аминокислот, предпочтительно идентична соответствующей замещенной последовательности на около 80%, чтобы по меньшей мере одна аминокислота была заменена. Следовательно, CDR конструкции антитела могут иметь различные степени идентичности по отношению к своим замещенным последовательностям, например CDRL1 может иметь около 80%, тогда как CDRL3 может иметь около 90%.

Предпочтительные замены (или замещения) представляют собой консервативные замены. Однако предполагается любая замена (в том числе неконсервативная замена одной или более из «иллюстративных замен», перечисленных в Таблице А, ниже) при условии, что конструкция антитела сохраняет свою способность связываться CD16a посредством первого домена и с антигеном поверхности клетки-мишени посредством второго домена, и/или его CDR идентичны впоследствии замещенной последовательности (на по меньшей мере около 60% или около 65%, более предпочтительно около 70% или около 75%, еще более предпочтительно около 80% или около 85% и особенно предпочтительно около 90% или около 95% идентична «исходной» последовательности CDR).

Консервативные замены показаны в Таблице А под заголовком «предпочтительные замены». Если такие замены приводят к изменению биологической активности, то могут быть введены более существенные изменения, обозначенные «иллюстративными заменами» в Таблице А, или, как дополнительно описано ниже со ссылкой на классы аминокислот, и продукты подвергаются скринингу относительно требуемой характеристики.

Существенные модификации биологических свойств конструкции антитела по данному изобретению осуществляются путем выбора замен, которые в значительной степени отличаются по своему влиянию на сохранение (а) структуры полипептидного остова в области замены, например в конформации листа или спирали, (b) заряда или гидрофобности молекулы в целевом сайте, или (с) объема боковой цепи. Встречающиеся в природе остатки разделены на группы в соответствии с общими свойствами боковых цепей: (1) гидрофобные: норлейцин, met, ala, val, leu, ile; (2) нейтральные гидрофильные: cys, ser, thr, asn, gin; (3) кислотные: asp, glu; (4) основные: his, lys, arg; (5) остатки, которые влияю на ориентацию цепи: gly, pro; и (б) ароматические: trp, tyr, phe.

Неконсервативные замены приводят к замене представителя одного из этих классов на представителя другого класса. Любой цистеиновый остаток, не принимающий участие в поддержании необходимой конформации конструкции антитела, может быть замещен, как правило, серином, для улучшения окислительной стабильности молекулы и предотвращения ошибочного перекрестного связывания. С другой стороны, цистеиновую связь(-и) можно добавлять в антитело для улучшения его стабильности (особенно когда антитело представляет собой фрагмент антитела, такой как фрагмент Fv).

Для последовательностей аминокислот идентичность и/или подобие последовательности определяют с использованием стандартных способов, известных в данной области техники, в том числе, но не ограничиваясь ими, алгоритм локальной идентичности последовательностей Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482, алгоритм определения идентичности, включающий выравнивание последовательностей Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443, способ поиска подобия Pearson and Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, компьютеризированные реализации этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Медисон, Висконсин), программу Best Fit sequence, описанную Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387-395, предпочтительно с использованием параметров по умолчанию или путем изучения. Процент идентичности предпочтительно рассчитывают в FastDB на основании следующих параметров: штраф за несовпадение 1; штраф за гэп 1; штраф за размер гэпа 0,33; и штраф присоединения 30, "Current Methods in Sequence Comparison and Analysis," Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc.

Пример пригодного алгоритма представляет собой PILEUP. PILEUP проводит выравнивание множества последовательностей из группы родственных последовательностей с использованием прогрессивных попарных выравниваний. Он также может представить графически дерево, демонстрирующее взаимосвязи между группами, используемые для проведения выравнивания. В PILEUP используется упрщение прогрессивного способа выравнивания Feng & Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 35:351-360; способ подобен описанному Higgins and Sharp, 1989, CABIOS 5:151 -153. Использовали следующие параметры PILEUP: принимаемый по умолчанию вес гэпа 3,00, принимаемый по умолчанию вес длины гэпа 0,10, и взвешенные концы гэпов.

Другой пример пригодного алгоритма представляет собой алгоритм BLAST, описанный в: Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389- 3402; и Karin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787. Особенно полезная программа BLAST представляет собой программу WU-BLAST-2, которая была получена Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology 266:460-480. В WU-BLAST-2 используется несколько поисковых параметров, большинству из которых присвоены значения по умолчанию. Для регулируемых параметров установлены следующие значения: длина перекрывания = 1, доля перекрывания = 0,125, пороговая длина слова (Т) = 11. Параметры HSP S и HSP S2 являются динамическими величинами и устанавливаются самой программой в зависимости от состава конкретной последовательности и состава конкретной базы данных по отношению к которой выполняют поиск представляющей интерес последовательности; однако указанные величины можно регулировать, чтобы увеличить чувствительность.

Дополнительный пригодный алгоритм представляет собой BLAST с гэпами, как сообщалось в Altschul et al., 1993, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402. В BLAST с гэпами используются оценки замен BLOSUM-62; поргоговый парметр Т установлен равным 9; метод с двумя попаданиями для запуска удлинений без гэпа присваиваетгэпу длиной к оценку 10+k; Xu устанавливают равным 16, и Xg устанавливают равным 40 для стадии поиска в базе данных и to 67 выходной стадии алгоритмов. Выравнивания с гэпами запускаются оценкой, соответствующей около 22 битам.

Как правило, аминокислотная гомология, подобие и идентичность между отдельными вариантами последовательностей CDR или V_H/V_L составляют по меньшей мере около 60% по отношению к последовательностям, описанным в данном документе, и в основном с предпочтительно большими гомологиями или идентичностями, составляющими по меньшей мере около 65% или около 70%, более предпочтительно по меньшей мере около 75% или около 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере около 85%, около 90%, около 91%, около 92%, около 93%, около 94%, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или практически около 100%. Подобным образом, «процент (%) идентичности последовательности нуклеиновой кислоты» по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты связывающих белков, установленных в данном документе, определяют как процент нуклеотидных остатков в рассматриваемой последовательности, которые идентичны нуклеотидным остаткам в кодирующей последовательности конструкции антитела. В конкретном способе применяют модуль BLASTN WU-BLAST-2 с принимаемыми по умолчанию параметрами, и с длиной перекрывания и долей перекрывания установленными равными 1 и 0,125, соответственно.

Как правило, гомология, подобие и идентичность последовательности нуклеиновой кислоты между нуклеотидными последовательностями, кодирующими отдельные варианты последовательностей CDR или V_H/V_L, и нуклеотидными последовательностями, изображенными в данном документе, составляют по меньшей мере около 60% и в основном с предпочтительно большими гомологиями или идентичностями, составляющими по меньшей мере около 65%, около 70%, около 75%, около 80%, около 81%, около 82%, около 83%, около 84%, около 85%, около 86%, около 87%, около 88%, около 89%, около 90%, около 91%, около 92%, около 93%, около 94%, около 95%, около 96%, около 97%, около 98% или около 99% и практически около 100%. Таким образом «вариант CDR» или «вариант области V_H/V_L» представляет собой вариант с установленной гомологией, подобием или идентичностью к исходным CDR/VH/VL, определенным в контексте изобретения, и имеет общие биологические функции, в том числе, но не ограничиваясь этим, на по меньшей мере около 60%, около 65%, около 70%, около 75%, около 80%, около 81%, около 82%, около 83%, около 84%, около 85%, около 86%, около 87%, около 88%, около 89%, около 90%, около 91%, около 92%, около 93%, около 94%, около 95%, около 96%, около 97%, около 98% или около 99% от указанной специфичности и/или активности CDR или V_H/V_L.

В одном варианте осуществления изобретения процент идентичности зародышевой линии человека конструкций антител в соответствии с изобретением составляет ≥ около 70% или ≥ около 75%, более предпочтительно ≥ около 80% или ≥ около 85%, еще более предпочтительно ≥ около 90%, и наиболее предпочтительно ≥ около 91%, ≥ около 92%, ≥ около 93%, ≥ около 94%, ≥ около 95% или даже ≥ около 96%. Полагают, что идентичность генным продуктам зародышевой линии антитела человека является важным признаком для уменьшения риска терапевтических белков вызывать иммунный ответ против лекарственного средства у пациента при лечении. В Hwang & Foote ("Immunogenicity of engineered antibodies"; Methods 36 (2005) 3-10) демонстрируется, что уменьшение частей конструкций лекарственного средства и антитела нечеловеческого происхождения приводит к уменьшению риска возникновения антител к лекарственному средству у пациентов при лечении. При сравнении всех данных клинически оцененных лекарственных антител и соответствующих данных касательно иммуногенности, наблюдается тенденция, что гуманизация V-областей антитела делает белок менее иммуногенным (в среднем около 5,1% пациентов), чем антитела с неизмененными V-областями нечеловеческого происхождения (в среднем около 23,59% пациентов). Следовательно, для белковых терапевтических средств на основании V-области в форме конструкций антител желательна более высокая степень идентичности последовательностям человека. С целью определения идентичности зародышевой последовательности V-области V_L можно выровнять по отношению к аминокислотным последовательностям V сегментов и J сегментов зародышевой линии человека (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) с использованием программного обеспечения Vector NTI, и рассчитать идентичность аминокислотной последовательности в процентах путем деления идентичных аминокислотных остатков на общее количество аминокислотных остатков V_L. Аналогично и для сегментов VH (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) с тем исключением, что CDR3 V_H можно исключить вследствие большой вариабельности и недостатка существующих партнеров по выравниванию CDR3 V_H зародышевой линии человека. Затем можно использовать рекомбинантные способы для увеличения идентичности последовательности генам зародышевой линии антитела человека.

Термин «антитело» в данном документе используется в самом широком смысле и включает различные структуры антител, включая, но не ограничиваясь ими, моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они проявляют требуемую антиген-связывающую активность.

При использовании в данном документе термин «около» или «приблизительно» означает в рамках приемлемого диапазона ошибок для конкретной величины, как определено специалистом в данной области техники, который будет зависеть частично от того, как величина измерена или определена, т.е. ограничений измерительной системы. Например, «около» может означать в рамках 3 или более 3 стандартных отклонений в соответствии с принятой в данном документе практикой. Альтернативно, «около» может означать интервал до 20%, предпочтительно до 10%, более предпочтительно до 5% и еще более предпочтительно до 1% данной величины. Альтернативно, особенно по отношению к биологическим системам или процессам термин может означать в рамках порядка величины, предпочтительно в 5-кратном размере и более предпочтительно в 2-кратном размере от величины.

При использовании в данном документе, формы единственного числа включают и формы множественного числа, если контекст явно не указывает иное. Таким образом, например упоминание «реагента» включает один или более из таких различных реагентов, а упоминание «способа» включает упоминание эквивалентных стадий и способов, известных специалисту в данной области техники, которые можно модифицировать и заменить способами, описанными в данном документе.

Если иное не указано, понимают, что термин «по меньшей мере», предшествующий ряду элементов, относится к каждому элементу ряда. Специалисты в данной области техники знают или способны установить с использованием не более чем традиционных экспериментов много эквивалентов конкретных вариантов осуществления изобретения, описанных в данном документе. Предполагается, что такие эквиваленты охвачены данным изобретением.

Термин «и/или» повсюду в данном документе включает «и», «или» и «все или любую другу комбинацию элементов, связанных указанным термином».

Термин «менее чем» или «более чем» включает конкретное число. Например, менее 20 означает менее или равняется. Подобным образом, более чем или больше чем означает более чем или равняется или больше чем или равняется, соответственно.

В данном описании и в нижеследующей формуле изобретения, если контекст не указывает на иное, термин «содержать» и его варианты, такие как «содержит» и «содержащий», следует понимать как подразумевающий включение указанного целого числа или стадии или группы целых чисел или стадий, но не исключение какого-либо другого целого числа или стадии или группы целых чисел или стадий. При использовании в данном документе, термин «содержащий» можно заменить термином «вмещающий» или «включающий» или иногда при использовании в данном документе термином «имеющий».

При использовании в данном документе, «состоящий из» исключает любой элемент, стадию или ингредиент, не указанные в пункте формулы изобретения. При использовании в данном документе, «состоящий по существу из» не исключает материалы или стадии, которые не влияют существенно на основные и новые характеристики изобретения.

В каждом случае в данном документе любой из терминов «содержащий», «состоящий по существу из» и «состоящий из» могут быть заменены любым из двух других терминов.

II. Белки, связывающие антиген CD16A

В первом аспекте в изобретении предложены белки, связывающие антиген CD16A, для нацеливающего подхода на основе естественных клеток-киллеров (NK-клеток), а именно:

мультиспецифический антигенсвязывающий белок, содержащий

- по меньшей мере фрагмент, связывающий первый целевой антиген;

- по меньшей мере два фрагмента, связывающие антиген CD16A; и

- по меньшей мере один константный домен антитела.

В некоторых вариантах осуществления изобретения константный домен представляет собой часть фрагмента Fab или участка Fc.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагменты, связывающие антиген CD16A, слиты с константным доменом, причем константный домен может представлять собой часть фрагмента Fab (CH1 или CL) или участка Fc.

Следовательно, в дополнительном варианте осуществления изобретения мультиспецифический антигенсвязывающий белок содержит:

- по меньшей мере фрагмент, связывающий первый целевой антиген;

- по меньшей мере два фрагмента, связывающих антиген CD16A, слитых с константным доменом, например, фрагмента Fab или участка Fc.

Антигенсвязывающий белок вовлекает NK-клетку, чтобы перенаправить цитотоксичность, опосредованную NK-клетками на мишень, например клетки, положительные по опухолевому антигену, клетки, инфицированные вирусами, или патогены.

Вследствие двухвалентного связывания с двумя фрагментами, связывающими CD16A, авидность силы связывания NK-клеток посредством CD16A увеличивается, и эффекторные функции NK-клеток, такие как, например, зависимая от антитела опосредованная клетками цитотоксичность (ADCC), могут быть увеличены по сравнению с моноклональными антителами или фрагментами антител.

NK-клетка вовлекается мультиспецифическим антигенсвязывающим белком посредством рецептора CD16A и таким образом перенаправляется на мишень, например, клетку-мишень, экспрессирующую связанный с опухолью антиген (ТАА). Следовательно, такой мультиспецифический антигенсвязывающий белок способен селективно перенаправлять NK-клетки и опосредовать лизис опухолевых клеток, клеток, инфицированных вирусом, или патогенов. В отличие от этого, антитела полной длины изотипа IgG связываются с активирующими и ингибирующими рецепторами Fcγ, в том числе CD 16А, CD16B (FcγRIIIB), CD32A (FcγRIIA), CD32B (FcγRIIB) и CD64 (FcγRI), посредством области Fc. Однако, антигенсвязывающий белок, имеющий специфичность к CD16A, селективно нацелен на активирующий субтип CD16A, который находится, например, на NK-клетках и макрофагах, но не на нейтрофилах. Кроме того, антигенсвязывающий белок, вовлекающий NK-клетки, двухвалентно взаимодействует с CD16A, что приводит к приблизительно в 1000 раз более высокой аффинности по сравнению с обычными антителами.

CD16A представляет собой активирующий рецептор, запускающий цитотоксическую активность NK-клеток. Аффинность антител к CD16A прямо коррелирует с их способностью запускать активацию NK-клеток. Предложены антигенсвязывающие белки, связывающиеся двухвалентно с CD16A, т.е. с двумя антигенсвязывающими фрагментами, таким образом увеличивая аффинность вследствие более высокой авидности по отношению к CD16A.

Дополнительно, период полувыведения из сыворотки может быть удлинен по сравнению с антигенсвязывающими остовами на основе scFv путем сливания антигенсвязывающего фрагмента с участком Fc или антителом на основе IgG, способным к связыванию с FcRn, что делает терапевтическое применение in vivo более удобным. Посредством этого такой участок Fc может быть модифицирован для усиления или ослабления связывания с FcRn, который дополнительно модулирует период полувыведения из сыворотки и/или транспорт связанного IgG через клетки. Последний также описан как трансцитоз (Dickinson et al., 1999).

Дополнительно, период полувыведения из сыворотки может быть удлинен путем соединения антигенсвязывающего белка с человеческим сывороточным альбумином (HSA) или фрагментом, связывающим HSA. Например, период полувыведения из сыворотки фрагмента Fab может быть удлинен за счет фрагмента, связывающего HSA, в области Fv фрагмента Fab, тогда как фрагменты, связывающие CD16A и целевой антиген, слиты с С-концом фрагмента Fab. Альтернативно, фрагмент, связывающий HSA, может быть слит с С-концом фрагмента Fab, а участок Fv фрагмента Fab может обеспечивать фрагмент, связывающий целевой антиген или CD16A.

Антигенсвязывающие фрагменты могут быть слиты с фрагментом Fab или участком Fc многими способами, а блочная структура антигенсвязывающего белка, описанного в данном документе, делает доступными многочисленные остовы, которые можно легко сконструировать и выбрать в зависимости от желаемого применения.

Предпочтительно, вариабельные области V_H и V_L связаны пептидным линкером, который позволяет вариабельным областям объединяться в требуемой для связывания антигена конформации. Полипептид, содержащий дополнительные вариабельные области, слит с константным доменом фрагмента Fab или участком Fc посредством соединительной группы.

Антигенсвязывающий фрагмент представлен в формате антигенсвязывающей молекулы, содержащей один или более полипептидов Fv, например, одноцепочечный Fv (scFv), тандемный одноцепочечный Fv ((scFv)₂), состоящий из двух scFv, соединенных в один полипептид, диатело (Db), одноцепочечное диатело (scDb), тандемное диатело (TandAb®), Fab, F(ab')₂ или переориентирующиеся антитела с двойной аффинностью (DART™). Особенно предпочтительными для белка, связывающего антиген CD16A, являются scFv, Db или scDb. Тогда как каждый scFv обеспечивает один аннтигенсвязывающий фрагмент, двухвалентные Db, scDb и (scFv)₂ обеспечивают два антигенсвязывающих фрагмента для антигенсвязывающего белка. Предпочтительно, двухвалентные Db, scDb или (scFv)₂ или два scFv являются моноспецифическими и обеспечивают два антигенсвязывающих фрагмента со специфичностью к одному и тому же антигену, т.е. CD16A или целевой антиген.

Каждый антигенсвязывающий фрагмент связан с константным доменом Fab или с участком Fc «соединительной группой» или пептидной связью. Предпочтительно, соединительная группа представляет собой пептид. В частности, соединительная группа представляет собой пептид, состоящий из непрерывной цепи из от 1 до 30 аминокислотных остатков, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 аминокислотных остатков. Конкретнее, соединительная группа состоит из от 3 до 30, от 6 до 20, от 6 до 18 или от 6 до 15 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления изобретения соединительная группа состоит из аминокислотных остатков G и S, например соединительная группа представляет собой пептид (G₂S)_x, где х=1-10, или (G₄S)_y, где у=1-6, например, соединительная группа, содержащая аминокислотную последовательность, как изображено в SEQ ID NO: 19, 20, 21 или 22.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент слит посредством шарнирной области с N-концом СН2-домена участка Fc. Шарнирная область может быть того же или отличного класса IgG, что и участок Fc, или представлять собой сконструированный, не встречающийся в природе шарнирный домен. Пример шарнирной области IgG дикого типа имеет аминокислотную последовательность, как изображено в SEQ ID NO: 23. Пример модифицированной (укороченной) шарнирной области (средняя шарнирная область) имеет аминокислотную последовательность, как изображено в SEQ ID NO: 24.

В некоторых вариантах осуществления изобретения два фрагмента, связывающие антиген CD16A, слиты с N-концом участка Fc, тогда как один или два фрагмента, связывающих целевой антиген, слиты с С-концом участка Fc; или два фрагмента, связывающих антиген CD16A, слиты с С-концом участка Fc, и один или два фрагмента, связывающих целевой антиген, слиты с N-концом участка Fc (например, KiH-scDb-Fc; Фиг. 3-6; Db-Fc, Фиг. 9-10; би-scFv-Fc, Фиг. 11-12 и KiH-scFv-Fc, Фиг. 15А и 15В).

В дополнительном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающие фрагменты встроены в или слиты с антителом Ig, например IgG. Каждый из фрагментов, связывающих антиген CD16A, может быть слит как scFv с С-концом участка Fc, а фрагменты, связывающие целевой антиген, встроены в каждое из двух плеч Fab (scFv-IgAb, Фиг. 13). Альтернативно, каждый из фрагментов, связывающих антиген CD16A, может быть встроен как домен Fv в каждое из плеч Fab, тогда как один или два фрагмента, связывающих целевой антиген, может быть слит с С-концом участка Fc (scFv-IgAb, Фиг. 16). В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагменты, связывающие целевые антигены, могут быть слиты с С-концом каждого из доменов CL (би-scFv-IgAb, Фиг. 14).

В дополнительном варианте осуществления изобретения два фрагмента, связывающих антиген CD16A, и фрагменты, связывающие целевой антиген, слиты с С-концом Fab, тогда как домен Fv Fab обеспечивает второй или третий фрагмент, связывающий целевой антиген (scDb-TriBs(-scFv), Фиг. 7 и 8). Альтернативно, два фрагмента, связывающих антиген CD16A, могут быть слиты с С-концом Fab, а фрагмент, связывающий целевой антиген, встроен в домен Fv Fab.

Антигенсвязывающий белок является по меньшей мере двухвалентным по отношению к CD16A, т.е. содержит по меньшей мере два фрагмента, связывающих антиген CD16A.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий белок является тетравалентным и биспецифическим, содержащим по меньшей мере два фрагмента, связывающих целевой антиген, для одного и того же антигена, и два фрагмента, связывающих антиген CD16A.

В дополнительном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент является тетравалентным и триспецифическим, содержащим фрагмент, связывающий первый и второй целевой антиген, и два фрагмента, связывающих антиген CD16A. Такой антигенсвязывающий белок можно использовать для совместного или двойного нацеливания. Например, такой антигенсвязывающий белок содержит фрагмент, связывающий первый опухолевый антиген (ТАА1), и фрагмент, связывающий второй опухолевый антиген (ТАА2), и два фрагмента, связывающие антиген CD16A, для перенаправления NK-клеточной цитотоксичности на клетку, демонстрирующую первый (ТАА1) и второй (ТАА2) опухолевые антигены. Альтернативно, такой триспецифический антигенсвязывающий белок, содержащий фрагмент, связывающий первый опухолевый антиген (ТАА1), и фрагмент, содержащий второй опухолевый антиген (ТАА2), и два фрагмента, связывающие антиген CD16A, можно использовать для перенаправления NK-клеточной цитотоксичности на типы клеток с отличным фенотипом, экспрессирующие первый (ТАА1) или второй (ТАА2) опухолевый антиген.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий белок может быть тривалентным и биспецифическим, тривалентным и триспецифическим, тетравалентным и биспецифическим, тетравалентным и тетраспецифическим, гексавалентным и триспецифическим или гексавалентным и биспецифическим.

Во втором аспекте изобретения предложены конкретные форматы антигенсвязывающих белков с по меньшей мере двумя фрагментами, связывающими антиген CD16A, и определенным расположением доменов к CD16A в полипептиде фрагмента, связывающего антиген CD16A, которое предотвращает взаимное уничтожение NK-клетками друг друга и обеспечивает эффективное связывание и рекрутинг NK-клеток для усиления иммунных эффекторных функций, например усиления ADCC.

Белок, связывающий антиген CD16A, считается не вызывающим NK-NK-клеточный лизис, если лизис не наблюдается совсем или наблюдается только в незначительной степени ниже 10% от измеримых концентраций антител до 30 мкг/мл в анализах, в которых даратумумаб вызывал более чем 50% лизис NK-клеток.

Влияние предотвращения взаимного уничтожения NK-клеток, тогда как усилены связывание и рекрутинг NK-клеток для эффекторных функций, необходимо связывать с внутренними свойствами конкретной 3D-структуры антигенсвязывающего белка, описанного в данном документе.

Включение CD16A на N-конце антигенсвязывающих белков, описанных в данном документе, (например, те, которые описаны в Примере 7) в общем приводит к меньшему взаимному уничтожению NK-клеток, чем включение CD16A на С-конце. Однако данное описание охватывает антигенсвязывающие белки, вовлекающие CD16A как на N-, так и на С-конце (например, см. Примеры 7, 8 и 9 в качестве примеров включения на любом из концов). Что касается вовлечения CD16 на N-конце, наблюдалась более значительная деплеция NK-клеток, как описано в Примере 8 с использованием вовлечения CD16A на основе Fab. Кроме того, анализируя порядок доменов Fv CD16, явно сниженное проявление взаимного уничтожения NK-клеток друг другом вызвано форматами антител, которые содержат порядок доменов VL-VH, по сравнению с теми, которые содержат порядок VH-VL.

В некоторых вариантах осуществления изобретения доля антител, вызывающих взаимное уничтожение NK-клеток, а также активность уничтожения NK-клеток ослаблена за счет устранения вовлечения CD16A на основе Fab и фокусировки на нужном порядке VL-VH домена Fv, связывающего CD16.

В некоторых вариантах осуществления изобретения вариабельные области в полипептиде фрагмента, связывающего антиген CD16A, должны быть связаны друг за другом, так что на N-конце полипептида, т.е. полипептида Fv, расположена вариабельная область легкой цепи (V_L). Вариабельная область рядом с V_L, расположенная на N-конце, может представлять собой V_L или V_H. Примечательно, что взаимное уничтожение можно устранить независимо от аффинности связывания фрагмента, связывающего антиген CD16A, если вариабельные области фрагмента, связывающего антиген CD16A, расположены так, что V_L расположен на N-конце полипептида фрагмента, связывающего антиген CD16A.

В частности, если фрагмент, связывающий антиген CD16A, представляет собой scFv, вариабельные области расположены от N- до С-конца полипептида: V_L-V_H.

В частности, если фрагмент, связывающий антиген CD16A, представляет собой Db, вариабельные области расположены от N- до С-конца в каждом из двух полипептидов, образующих Db: V_L-V_H.

В частности, если фрагмент, связывающий антиген CD16A, представляет собой scDb, вариабельные области расположены от N- до С-конца полипептида в виде или (i) V_L-V_H-V_L-V_H, или (ii) V_L-V_L-V_H-V_H., или (iii) V_H-V_H-V_L-V_L.

В частности, если фрагмент, связывающий антиген CD16A, представляет собой (scFv)2, вариабельные области расположены от N- до С-конца полипептида: V_L-V_H-V_L-V_H

Полипептид фрагмента, связывающего антиген CD16A, например scFv, Db или scDb, слит посредством соединительных групп или (i) своим С-концом с N-концом СН2-домена участка Fc или с шарнирной/средней шарнирной областью, или (ii) своим N-концом с С-концом СН3-домена участка Fc или с С-концом CL-или CH1-домена.

Оба фрагмента, связывающих антиген CD16A, предпочтительно расположены в антигенсвязывающем белке или на N-конце, или на С-конце.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент, связывающий антиген CD16A, слит с участком Fc. Оба фрагмента, связывающих CD16A, предпочтительно слиты или с N-концом, или с С-концом участка Fc. Участок Fc содержит участок константной области, сохраняющий по меньшей мере одно функциональное свойство области Fc IgG. «Участок Fc» включает области Fc с нативной последовательностью и вариантные области Fc.

Участок Fc предпочтительно является «сайленсированным». «Сайленсированный участок Fc» относится к модифицированному участку Fc, который сам по себе не связывается с рецепторами Fc-гамма (Fcγ) (FcγR), в том числе CD16A (FcγRIIIA), но сохраняет способность связываться с неонатальным рецептором Fc (FcRn). Связывание с FcRn делает возможным трансцитоз через эпителиальные барьеры и рециклинг для защиты IgG или слитых белков, содержащих участки Fc, связывающие FcRn, от лизосомальной деградации, что приводит к увеличению периода полувыведения из сыворотки и удлинению периода пребывания в кровотоке. Антигенсвязывающий белок сконструирован для вовлечения CD16A на NK-клетках, конкретно посредством фрагментов, связывающих антиген CD16A, и следовательно, в предпочтительных вариантах осуществления изобретения необходимо предотвратить связывание Fc с другими рецепторами Fc-гамма. Следовательно, предпочтительными являются модификации участка Fc антигенсвязывающих белков слияния с Fc, которые сохраняют или усиливают связывание с FcRn.

Было описано несколько наборов мутаций или изменений для получения участка Fc IgG1 со сниженным связыванием с рецептором Fc-гамма или без связывания (упоминаемые как «сайлене-мутации» или «мутации, приводящие к снижению эффекторной функции»), которые выбраны из мутаций из группы, состоящей из: C220S, C229S, Е233Р, L234A, L234V, L234F, L235A, L235E, P238S, D265A, N297A, N297Q, P331S; или мутаций для получения участка Fc IgG2 со сниженным связыванием с рецептором Fc-гамма, которые могут быть выбраны из группы, состоящей из: H268Q, V309L, A330S, A331S; или мутации для получения участка Fc IgG4 со сниженным связыванием с рецептором Fc-гамма, которые могут быть выбраны из группы, состоящей из L235A, G237A, Е318А (Strohl W., Current Opinion in Biotechnology (2009); 20:1-7; Kaneko E and Niwa R, Biodrugs (2011); 25(1): 1-11; Baudino L., J. Immunology (2008); 181:6664-6669).

Дополнительно, участок Fc может быть разработан для модулирования периода полувыведения из сыворотки, например увеличения или уменьшения. Описаны следующие мутации на участке Fc IgG1, которые увеличивают период полувыведения антигенсвязывающего белка из сыворотки: T250Q, M252Y, S254T, Т256Е, Т307А, Е380А, M428L, H433K, N434A, N434Y (Srohl W., Current Opinion in Biotechnology (2009); 20:1-7; Borrok MJ, et al., J. Pharmaceutical Sciences 2017; 106(4):1008-1017).

В некоторых вариантах осуществления IgG, в частности IgG1, участок Fc содержит набор мутаций в положениях 234, 235 и 265 в соответствии с нумерацией EU по Кабату, в частности набор мутаций выбран из L234F/V/A, L235A/E и D265A. Особенно предпочтительным является участок Fc IgG1, содержащий набор мутаций L234F, L235E и D265A. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий белок содержит сайленсированный участок Fc IgG1 с набором мутаций L234F, L235E и D265A. Все представленные мутации соответствуют системе нумерации EU в соответствии с Кабатом (Kabat, Е.А. et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication n° 91-3242, pp 662,680,689 (1991). В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий белок содержит сайленсированный участок Fc IgG1 с набором мутаций L234F и L235E.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент, связывающий антиген CD16A, слит с гомодимерным участком Fc, содержащим два идентичных СН2-СН3 полипептида, связанных друг с другом, причем ковалентная димеризация вызвана присоединением N-конца шарнирной области к СН2-домену.

Антигенсвязывающий фрагмент может быть слит или N-концом через шарнирную область с участком Fc, или С-концом с СН3-доменом. Когда фрагменты, связывающие антиген CD16A, слиты N-концами, фрагмент, связывающий первый целевой антиген, предпочтительно слит С-концом с областью Fc.

В конкретном варианте осуществления изобретения два фрагмента, связывающих антиген CD16A, слиты так, что на N-конце или С-конце участка Fc посредством димеризации образуется Db (Db-Fc), причем полипептид VL-VH, связывающий антиген CD16A, слит посредством соединительной группы и шарнирной области с полипептидом СН2-СН3 на N-конце или на С-конце СН3, и фрагменты, связывающие целевой антиген, слиты как scFv с соответствующими противоположными концами (Фиг. 9, 10). Шарнирная область предпочтительно представляет собой среднюю шарнирную область (SEQ ID NO: 24). Например, такой антигенсвязывающий белок содержит две полипептидные цепи, димеризованные в области Fc, причем каждая полипептидная цепь содержит в направлении от N- до С-конца:

(i) V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-шарнирная область-СН2-СН3-V_H(мишень)-V_L(мишень) (Фиг. 9);

(ii) V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-шарнирная область-СН2-СН3-V_L(мишень)-V_H(мишень) (Фиг. 9);

(iii) V_L(мишень)-V_H(мишень)-шарнирная область-СН2-СН3-V_L(CD16A)-V_H(CD16A) (Фиг. 10; или

(iv) V_H(мишень)-V_L(мишень)-шарнирная область-СН2-СН3-V_L(CD16A)-V_H(CD16A) (Фиг. 10).

В другом варианте осуществления изобретения два фрагмента, связывающих антиген CD16A, слиты как scFv с участком Fc (би-scFv-Fc), причем scFv с первой специфичностью (связывание мишени или CD16A) слиты с одним концом полипептида СН2-СН3, a scFv со второй специфичностью (связывание CD16A или мишени) слиты с другим концом полипептида СН2-СН3, образуя димерный участок Fc. Таким образом, каждый из двух фрагментов, связывающих целевой антиген, слиты как scFv с соответствующими противоположными концами каждого из двух полипептидов СН2-СН3 (Фиг. 11, 12). Например, такой антигенсвязывающий белок содержит две полипептидные цепи, гомодимеризующиеся в шарнирной области и области Fc, причем каждая полипептидная цепь содержит scFv на N-конце и на С-конце каждого из полипептидов СН2-СН3, и домены расположены от в направлении от N- до С-конца:

(i) V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-шарнирная область-СН2-СН3-V_H(мишень)-V_L(мишень) (Фиг. 11);

(ii) V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-шарнирная область-СН2-СН3-V_L(мишень)-V_H(мишень) (Фиг. 11);

(iii) V_L(мишень)-V_H(мишень)-шарнирная область-СН2-СН3-V_L(CD16A)-V_H(CD16A) (Фиг. 12; или

(iv) V_H(мишень)-V_L(мишень)-шарнирная область-СН2-СН3-V_L(CD16A)-V_H(CD16A) (Фиг. 12).

В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент, связывающий антиген CD16A, слит с гетеродимерным (асимметричным) участком Fc. Такой гетеродимерный участок Fc содержит модификации каждого из двух полипептидов СН2-СН3 области Fc, которые способствуют (гетеро)димеризации двух полипептидов. Это включает отдельные модификации в каждом из полипептидов, которые комплементарны друг другу для стимуляции объединения двух полипептидов СН2-СН3. Модификации могут представлять собой мутации нуклеиновой кислоты, которые транслируются в замены аминокислот. Такие модификации известны как «выступ во впадину» (KiH), и были описаны конструкции ряда вариантов, например, Ridgway et al. (Protein Engineering, vol. 9, no. 7, pp. 617-621, 1996): Например, замена T366Y в одном полипептиде СН2-СН3 и замена в другом полипептиде Y407T в соответствии с системой нумерации EU (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edn. NIH, 1991). Пример для участка Fc, содержащего замены типа «выступ во впадину» T366Y в первом полипептиде СН2-СН3 IgG1 и замену Y407T во втором полипептиде СН2-СН3 IgG1, имеет аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 31, 32. Кроме того, были разработаны дополнительные подходы для получения комплементарных границ раздела, стимулирующих гетеродимеризацию (рассмотрено в Brinkmann and Kontermann, MABS 2017; 9(2):182-212). В дополнительном варианте осуществления изобретения может быть включен дисульфидный мостик для дополнительной стабилизации гетеродимера и увеличения выхода (Merchant et al, Nature Biotech. 1998; 16: 677-681; Atwell et al.; J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35).

В конкретном варианте осуществления изобретения два фрагмента, связывающих антиген CD16A, слиты как scDb с гетеродимерным участком Fc (KiH-scDb-Fc), причем один полипептид scDb слит с первым полипептидом СН2-СН3, и один фрагмент, связывающий целевой антиген, слит как scFv с соответствующим противоположным концом того же или второго полипептида СН2-СН3 (Фиг. 3, 5). Например, такой антигенсвязывающий белок содержит две полипептидные цепи, гетеродимеризованные в средней шарнирной области или шарнирной области и области Fc, причем первая полипептидная цепь содержит в направлении от N- к С-концу: V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-шарнирная область-СН2-СН3 или V_L(CD16A)-V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-V_H(CD16A)-шарнирная область-СН2-СН3, и второй полипептид содержит в направлении от N- к С-концу: шарнирная область-СН2-СН3-V_H(мишень)-V_L(мишень) или шарнирная область-СН2-СН3-V_L(мишень)-V_H(мишень) (Фиг. 3); или первая полипептидная цепь содержит в направлении от N- к С-концу: шарнирная область-СН2-СН3-V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-V_L(CD16A)-V_H(CD16A) или шарнирная область-СН2-СН3-V_L(CD16A)-V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-V_H(CD16A), и второй полипептид содержит в направлении от N- к С-концу: V_H(мишень)-V_L(мишень)-шарнирная область-СН2-СН3 или V_L(мишень)-V_H(мишень)-шарнирная область-СН2-СН3 (Фиг. 5); или единственный полипептид scDb слит с первым полипептидом СН2-СН3, а единственный фрагмент, связывающий целевой антиген, слит как scFv с тем же концом второго полипептида СН2-СН3 (Фиг. 4). Например, такой антигенсвязывающий белок содержит две полипептидные цепи, причем первая полипептидная цепь содержит в направлении от N- к С-концу: V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-шарнирная область-СН2-СН3 или V_L(CD16A)-V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-V_H(CD16A)-шарнирная область-СН2-СН3, и второй полипептид содержит в направлении от N- к С-концу: V_H(мишень)-V_L(мишень)-шарнирная область-СН2-СН3 или V_L(мишень)-V_H(мишень)-шарнирная область-СН2-СН3 (Фиг. 4).

В другом варианте осуществления изобретения два фрагмента, связывающих антиген CD16A, слиты как scDb с гетеродимерным участком Fc, а один полипептид scDb слит с первым полипептидом СН2-СН3, и один фрагмент, связывающий первый целевой антиген (ТАА1), слит как scFv с соответствующим противоположным концом первого полипептида СН2-СН3, а фрагмент, связывающий второй целевой антиген (ТАА2), слит как scFv со вторым полипептидом СН2-СН3 на том же конце, что и фрагмент, связывающий первый целевой антиген (Фиг. 6). Например, такой антигенсвязывающий белок содержит две полипептидные цепи, гетеродимеризующиеся в шарнирной области или средней шарнирной области и области Fc, причем первая полипептидная цепь содержит в направлении от N- к С-концу: V_H(мишень 1)-V_L(мишень 1)-шарнирная область-СН2-СН3-V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-V_L(CD16A)-V_H(CD16A), или V_H(мишень 1)-V_L(мишень 1)-шарнирная область-СН2-СН3-V_L(CD16A)-V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-V_H(CD16A), или V_L(мишень 1)-V_H(мишень 1)-шарнирная область-СН2-СН3-V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-V_L(CD16A)-V_H(CD16A), или V_L(мишень 1)-V_H(мишень 1)-шарнирная область-СН2-СН3-V_L(CD16A)-V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-V_H(CD16A), и второй полипептид содержит в направлении от N- к С-концу: V_H(мишень 2)-V_L(мишень 2)-шарнирная область-СН2-СН3 или V_L(мишень 2)-V_H(мишень 2)-шарнирная область-СН2-СН3 (Фиг. 6).

В дополнительном варианте осуществления изобретения каждый из двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, слит как scFv с гетеродимерным участком Fc (KiH-scFv-Fc), и каждый из двух scFv слит с одним из первого и второго полипептидов СН2-СН3, и один фрагмент, связывающий первый целевой антиген (ТАА1), слит как scFv с соответствующим противоположным концом первого полипептида СН2-СН3, а фрагмент, связывающий второй целевой антиген (ТАА2), слит как scFv со вторым полипептидом СН2-СН3 на том же конце, что и фрагмент, связывающий первый целевой антиген (Фиг. 15). Например, такой антигенсвязывающий белок содержит две полипептидные цепи, гетеродимеризованные в области Fc, причем первая полипептидная цепь содержит в направлении otN- к С-концу: V_H(мишень 1)-V_L(мишень 1)-шарнирная область-СН2-СН3-V_L(CD16A)-V_H(CD16A) или V_L(мишень 1)-V_H(мишень 1)-шарнирная область-СН2-СН3-V_L(CD16A)-V_H(CD16A), а второй полипептид содержит в направлении от N- к С-концу: V_H(мишень 2)-V_L(target2)-шарнирная область-СН2-СН3-V_L(CD16A)-V_H(CD16A) или V_L(мишень 2)-V_H(мишень 2)-шарнирная область-СН2-СН3-V_L(CD16A)-V_H(CD16A) (Фиг. 15b); альтернативно, такой антигенсвязывающий белок содержит две полипептидные цепи, гетеродимеризованные в области Fc, причем первая полипептидная цепь содержит в направлении от N- к С-концу: V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-шарнирная область-СН2-СН3-V_H(мишень 1)-V_L(мишень 1) или V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-шарнирная область-СН2-СН3-V_L(мишень 1)-V_H(мишень 1), и второй полипептид содержит в направлении от N- к С-концу: V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-шарнирная область-СН2-СН3-V_H(мишень 2)-V_L(мишень 2) или V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-шарнирная область-СН2-СН3-V_L(мишень 2)-V_H(мишень 2) (Фиг. 15а).

В дополнительном варианте осуществления изобретения два фрагмента, связывающих антиген CD16A, слиты как scDb с мономерным участком Fc (scDb-mFc, Фиг. 1, 2). Такой мономерный участок Fc (mFc) содержит мутации в домене СН3, которые предотвращают димеризацию с другим полипептидом СН2-СН3, и в нем отсутствует шарнирная область, но он сохраняет способность связываться с рецептором FcRn, и не связывается с другими рецепторами Fc-гамма. Такие мутации описаны в Ying et al. (MABS, 2014; 6(5): 1201-1210; или WO 2013/138643). Пример такого мономерного участка Fc имеет аминокислотную последовательность, как изображено в SEQ ID NO: 30. Такой антигенсвязывающий белок состоит из единственной полипептидной цепи, причем scDb, содержащее два фрагмента, связывающих антиген CD16A, слито с одним концом мономерного участка Fc, а фрагмент, связывающий целевой антиген, слит с другим концом мономерного участка Fc. Такой антигенсвязывающий белок состоит из единственной полипептидной цепи, содержащей в направлении от N- к С-концу: V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-СН2-СН3-V_H(мишень)-V_L(мишень), или V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-СН2-СН3-V_L(мишень)-V_H(мишень), или V_L(CD16A)-V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-V_H(CD16A)-CH2-CH3-V_H(мишень)-V_L(мишень), или V_L(CD16A)-V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-V_H(CD16A)-CH2-CH3-V_L(мишень)-V_H(мишень) (Фиг. 1), или V_H(мишень)-V_L(мишень)-СН2-СН3-V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-V_L(CD16A)-V_H(CD16A), или V_L(мишень)-V_H(мишень)-CH2-CH3-V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-V_L(CD16A)-V_H(CD16A), или V_H(мишень)-V_L(мишень)-СН2-СН3-V_L(CD16A)-V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-V_H(CD16A), или V_L(мишень)-V_H(мишень)-СН2-СН3-V_L(CD16A)-V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-V_H(CD16A) (Фиг. 2).

В других вариантах осуществления изобретения N-конец полипептида антигенсвязывающего фрагмента слит с С-концом фрагмента Fab. Например, Db, scDb или два scFv, содержащие два фрагмента, связывающие антиген CD16A, слиты с С-концом фрагмента Fab, a Fv фрагмента Fab содержит фрагмент, связывающий целевой антиген.

В других вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий белок является триспецифическим (scDb-TriBs(-scFv), причем scDb, содержащее два фрагмента, связывающие антиген CD16A, слито С-концом с первым из двух полипептидов фрагмента Fab, а фрагмент, связывающий первый целевой антиген (ТАА1), слит С-концом или как scFv, или как двухвалентное scDb со вторым полипептидом фрагмента Fab, и Fv фрагмента Fab обеспечивает фрагмент, связывающий второй целевой антиген (ТАА2). В конкретном варианте осуществления изобретения фрагмент, связывающий второй целевой антиген, Fv представляет собой фрагмент, связывающий антиген человеческий сывороточный альбумин (HSA). Такой антигенсвязывающий белок содержит две полипептидные цепи, гетеродимеризованные с фрагментом Fab, слитым с двумя scDb, которые слиты с Fab С-концом, причем первая полипептидная цепь содержит от N- к С-концу: V_L(HSA)-CL-V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-V_L(CD16A)-V_H(CD16A), второй полипептид содержит от N- к С-концу: V_H(HSA)-CH1-V_H(мишень 1)-V_L(мишень 1)-V_H(мишень 1)-V_L(мишень 1) (Фиг. 7). В другом варианте осуществления изобретения scDb, содержащее два фрагмента, связывающих антиген CD16A, и scFv, содержащий фрагмент, связывающий первый целевой антиген, слиты С-концом с фрагментом Fab, причем первая полипептидная цепь содержит от N- к С-концу: V_L(Н8А)-CL-V_H(мишень 1)-V_L(мишень 1), и второй полипептид содержит от N- к С-концу: V_H(HSA)-CH1-V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-V_L(CD16A)-V_H(CD16A) (Фиг. 8).

В дополнительном варианте осуществления изобретения два фрагмента, связывающих антиген CD16A, слиты С-концом с IgG, причем два плеча Fab IgG обеспечивают два дополнительных антигенсвязывающих фрагмента (scFv-IgAb, Фиг. 13). В таком антигенсвязывающем белке первый scFv, содержащий фрагмент, связывающий антиген CD16A, слит С-концом с СН3 первой Н-цепи, и второй scFv, содержащий фрагмент, связывающий антиген CD16A, слит с СН3 второй Н-цепи, а два плеча Fab обеспечивают фрагменты, связывающие целевой антиген, в каждом Fv. Оба Fv могут иметь одинаковый фрагмент, связывающий целевой антиген, или два Fv могут обеспечивать фрагменты, связывающие первый и второй целевые антигены. Например, такой антигенсвязывающий белок содержит две идентичные Н- и две идентичные L-цепи, причем Н-цепь содержит в направлении otN- к С-концу: V_H(мишень)-СН1-шарнирная область-CH2-CH3-V_L(CD16A)-V_H(CD16A), и L-цепь содержит от N- к С-концу: V_L(мишень)-CL (Фиг. 13).

Альтернативно, в scFv-IgAb два фрагмента, связывающих антиген CD16A, обеспечиваются двумя Fv плеч Fab IgG, а один или два дополнительных фрагмента, связывающих антиген, слиты С-концом с IgG. В таком антигенсвязывающем белке каждое из двух плеч Fab обеспечивает фрагмент, связывающий антиген CD16A, в каждом Fv, и первый scFv, содержащий фрагмент, связывающий целевой антиген, слит С-концом с СН3 первой Н-цепи и, необязательно, второй scFv, содержащий дополнительный фрагмент, связывающий первый или второй целевой антиген, слит с СН3 второй Н-цепи. Например, такой антигенсвязывающий белок содержит две идентичные Н- и две идентичные L-цепи, причем Н-цепь содержит в направлении от N- к С-концу: V_H(CD16A)-СН1-шарнирная область-СН2-СН3-V_L(мишень)-V_H(мишень), и L-цепь содержит от N- к С-концу: V_L(CD16A)-CL (Фиг. 16), или Н-цепь содержит от N- к С-концу: V_H(CD16A)-СН1-шарнирная область-СН2-СН3-V_H(мишень)-V_L(мишень), и L-цепь содержит от N- к С-концу: V_L(CD16A)-CL.

В дополнительном варианте осуществления изобретения фрагменты, связывающие антиген CD16A, слиты на С-конце с IgG, два плеча Fab IgG обеспечивают два фрагмента, связывающих первый целевой антиген (ТАА1), а дополнительный фрагмент, связывающий второй целевой антиген (ТАА2), слит С-концом с каждым из двух CL-доменов (би-scFv-IgAb, Фиг. 14). В таком антигенсвязывающем белке первый scFv, содержащий фрагмент, связывающий антиген CD16A, слит С-концом с СН3 первой Н-цепи, а второй scFv, содержащий фрагмент, связывающий антиген CD16A, слит с СН3 второй Н-цепи, два плеча Fab обеспечивают фрагмент, связывающий первый целевой антиген (ТАА1), в каждом Fv, и два дополнительных фрагмента, связывающих второй целевой антиген (ТАА2), обеспечиваются каждым фрагментом, связывающим второй целевой антиген, scFv, слитым с каждым из CL-доменов. Например, такой антигенсвязывающий белок содержит две идентичные Н- и две идентичные L-цепи, причем Н-цепь содержит в направлении от N- к С-концу: V_H(мишень 1)-СН1-шарнирная область-СН2-СН3-V_L(CD16A)-V_H(CD16A), и L-цепь содержит от N- к С-концу: V_L(мишень 1)-CL-V_L(мишень 2)-V_H(мишень 2) или V_L(мишень 1)-CL-V_H(мишень 2)-V_L(мишень 2)(Фиг. 14).

В соответствии с изобретением мультиспецифический антигенсвязывающий белок содержит связывающие антиген CD16A фрагменты, специфически связывающиеся с CD16A и по меньшей мере целевым антигеном (ТА), отличным от CD16A.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент, связывающий CD16A, связывается с CD16A человека и яванского макака.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент, связывающий антиген CD16A, содержит вариабельный домен тяжелой и легкой цепи, специфический к CD16A, причем (i) вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), специфический к CD16A, содержит CDR1 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 50; CDR2 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 51 или SEQ ID NO: 56; CDR3 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 52, и вариабельный домен легкой цепи (V_L), специфический к CD16A, содержит CDR1 легкой цепи с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 53; CDR2 легкой цепи с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 54; и CDR3 легкой цепи с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 55; или

(ii) вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), специфический к CD16A, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3; и/или

(iii) вариабельный домен легкой цепи (V_L), специфический к CD16A, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент, связывающей антиген CD16A, содержит вариабельный домен тяжелой цепи (V_H) и вариабельный домен легкой цепи (V_L), причем (a) V_H содержит CDR1, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 73, CDR2, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 74, и CDR3, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:75; и (b) V_L содержит CDR1, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 76, CDR2 легкой цепи, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 77, и CDR3, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 78.

В некоторых вариантах осуществления изобретения V_H фрагмента, связывающего антиген CD16A, содержит или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления изобретения V_L фрагмента, связывающего антиген CD16A, содержит или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент, связывающей антиген CD16A, содержит V_H и V_L, причем (a) V_H содержит CDR1, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 82, CDR2, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 83, и CDR3, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:52; и (b) V_L содержит CDR1, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 84, CDR2, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 85, и CDR3, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 86.

В некоторых вариантах осуществления изобретения V_H фрагмента, связывающего антиген CD16A, содержит или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления изобретения V_L фрагмента, связывающего антиген CD16A, содержит или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент, связывающей антиген CD16A, содержит V_H и V_L, причем (a) V_H содержит CDR1, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 87, CDR2, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 88, и CDR3, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 52; и (b) V_L содержит CDR1, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 89, CDR2, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 95, и CDR3, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 90.

В некоторых вариантах осуществления изобретения V_H фрагмента, связывающего антиген CD 16А, содержит или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления изобретения V_L фрагмента, связывающего антиген CD16A, содержит или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент, связывающей антиген CD16A, содержит V_H и V_L, причем (a) V_H содержит CDR1, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 91, CDR2, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 92, и CDR3, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 52; и (b) V_L содержит CDR1, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 93, CDR2, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 85, и CDR3, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 94.

В некоторых вариантах осуществления изобретения V_H фрагмента, связывающего антиген CD 16А, содержит или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления изобретения V_L фрагмента, связывающего антиген CD 16А, содержит или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент, связывающей антиген CD16A, содержит V_H и V_L, причем (a) V_H содержит CDR1, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 82, CDR2, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 95, и CDR3, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 52; и (b) V_L содержит CDR1, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 96, CDR2, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 97, и CDR3, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 98.

В некоторых вариантах осуществления изобретения V_H фрагмента, связывающего антиген CD 16А, содержит или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах осуществления изобретения V_L фрагмента, связывающего антиген CD16A, содержит или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 11.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент, связывающей антиген CD16A, содержит V_H и V_L, причем (a) V_H содержит CDR1, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 82, CDR2, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 99, и CDR3, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 52; и (b) V_L содержит CDR1, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 100, CDR2, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 101, и CDR3, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 102.

В некоторых вариантах осуществления изобретения V_H фрагмента, связывающего антиген CD 16А, содержит или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления изобретения V_L фрагмента, связывающего антиген CD16A, содержит или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент, связывающей антиген CD16A, содержит V_H и V_L, причем (a) V_H содержит CDR1, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 50, CDR2, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 103, и CDR3, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 52; и (b) V_L содержит CDR1, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 53, CDR2, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54, и CDR3, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 104.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент, связывающей антиген CD16A, содержит V_H и V_L, причем (a) V_H содержит CDR1, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 50, CDR2, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 103, и CDR3, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 52; и (b) V_L содержит CDR1, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 53, CDR2, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54, и CDR3, содержащую или имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 105.

Фрагмент, связывающий антиген CD16A, к CD16A не связывается с CD16B и связывается с известными аллотипами CD16A F158 и V158 с подобной аффинностью. Два аллельных однонуклеотидных полиморфизма было обнаружено в CD16A человека, изменяя аминокислоту в положении 158, что является важным для взаимодействия с шарнирной областью IgG. Аллельные частоты гомозиготного 158 F/F и гетерозиготного 158 V/F аллелей являются подобными для популяции европеоидной расы, изменяясь между 35 и 52% или 38 и 50%, соответственно, тогда как гомозиготный аллель 158 V/V обнаружен только в 10-15% (Lopez-Escamez JA et al.; ВМС Med Genet 2011; 12:2). Следовательно, полезным будет овлечение и активация NK-клеток посредством этого домена к CD16A во всех группах пациентов вследствие подобной аффинности. Данный фрагмент, связывающий антиген CD 16А, связывается с CD16A человека и яванского макака. Дополнительно, в WO 2006/125668 описаны фрагменты, связывающие антиген CD16A, содержащие вариабельные домены тяжелой и легкой цепи, которые связываются с CD16A, но не CD16B.

В некоторых вариантах осуществления изобретения мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит домен Fv к CD16A с повышенным связыванием с CD16A по сравнению с фрагментом к CD16A с SEQ ID NO: 1 и 2, и который не связывается с CD16B и распознает известные аллотипы CD16A F158 и V158 с подобной аффинностью. В некоторых вариантах осуществления изобретения домен Fv к CD16A у повышенной аффинностью содержит VCDR с последовательностью, изображенной на SEQ ID NO: 53, 54, 55, или состоит из V_L с последовательностью, изображенной на SEQ ID NO: 2, и V_H с по меньшей мере одной вариацией в последовательности, изображенной в SEQ ID NO: 1.

Такой улучшенный связующий агент может представлять собой фрагмент Fv, связывающий антиген CD16A, со зрелой аффинностью.

Следовательно, в некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент, связывающий антиген CD16A, содержит домен Fv, демонстрирующий более высокую аффинность (например, улучшения за счет созревания аффинности) и/или селективность к CD16A человека, чем Fv к CD16A с SEQ ID NO: 1 и 2, при исследовании с помощью ELISA в лунках, покрытых 0,16 мкг/мл CD16A человека (SEQ ID NO: 48), измеряя с помощью очищенных молекул scFv в системе Biacore Т200. Например, такая более высокая аффинность к CD16A человека может быть выше в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 150 раз. Например, аффинность одновалентного связывания, измеренная в системе Biacore Т200, может представлять собой K_D=0,27 нМ до 1,91 нМ, что представляет собой в 21-150 раз более высокую аффинность, чем 40,5 нМ, измеренную для связывания SEQ ID NO: 1 и 2 с CD16A человека.

Предпочтительно, такой домен Fv со зрелой аффинностью дополнительно демонстрирует подобным образом возросшую аффиность к CD16A яванского макака, при исследовании ELISA в лунках, покрытых 0,16 мкг/мл CD16A яванского макака (SEQ ID NO: 49), измеряя с использованием очищенных молекул scFv в системе Biacore Т200 Х100. Например, такая более высокая аффинность к CD16A яванского макака может быть выше в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 541 раз. Например, аффинность одновалентного связывания, измеренная в системе Biacore Т200, может представлять собой K_D=0,24-3,63 нМ, что представляет собой в 36-541 раз более высокую аффинность, чем 132 нМ, измеренную для связывания SEQ ID NO: 1, 2 с CD16A яванского макака.

В Fv к CD16 с SEQ ID NO: 1, 2 были идентифицированы некоторые положения последовательностей (Х37, Х44, Х46), в которых аминокислотные замещения полезны для специфического связывания CD16A в домене V_L (SEQ ID NO: 2). См. Таблицу 1.

Не все аминокислотные замены, показанные в Таблице 1, одинаково важны для связывания с CD 16А. Замены в положениях Х44 и Х46 могут иметь большее значение, и клоны со зрелой аффинностью предпочтительно сохраняют указанные аминокислоты SEQ ID NO: 2.

В дополнительных вариантах осуществления изобретения за связывания с CD16A дополнительно отвечает последовательность LCDR3, а также N-концевые остатки N1 LCDR1 или мотив последовательности QDX в LCDR2.

В некоторых вариантах осуществления изобретения V_L фрагмента, связывающего антиген CD16A, содержит CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи, содержащие 1, 2, 3, 4 или 5 замен аминокислот по сравнению с последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 53, 54 и 55, и V_L сохранять специфичность связывания с CD 16А. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна или более замен в последовательности SEQ ID NO: 53 находятся в положениях 3-6. В некоторых вариантах осуществления изобретения замена в последовательности SEQ ID NO: 54 находится в положении 3. В некоторых вариантах осуществления изобретения остатки Y в положении 6 и V в положении 8 последовательности SEQ ID NO: 55 не заменены. LCDR3 предпочтительно имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 55.

В дополнительном варианте осуществления изобретения V_L фрагмента, связывающего антиген CD 16А, имеет последовательность, идентичную по меньшей мере на 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81% или 80% последовательности SEQ ID NO: 2, причем остатки GGHNI в положениях 23-27 в SEQ ID NO: 2, мотив последовательности QDXK в положениях 49-52 в SEQ ID NO: 2 не мутированы, и V_L сохраняет специфичность связывания с CD16A.

В V_H фрагмента, связывающего антиген CD 16А, замена в положении 9 в HCDR1 и/или положении 11 в HCDR2 по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 1 полезна для улучшения связывания с CD 16А. В частности, остаток в положении 9 в HCDR1 представляет собой Q, и/или остаток в положении 11 HCDR2 представляет собой V.

Следовательно, в дополнительном варианте осуществления изобретения последовательность V_H фрагмента, связывающего антиген CD 16А, идентична по меньшей мере на 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81% или 80% последовательности SEQ ID NO: 1, остаток в положении 9 в HCDR1 представляет собой Q, и/или остаток в положении 11 HCDR2 представляет собой V.

Следовательно, в определенном варианте осуществления изобретения фрагмент, связывающий антиген CD 16А, содержит V_L и V_H, причем последовательность V_L CD16A идентична по меньшей мере на 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81% или 80% последовательности SEQ ID NO: 2, при этом остатки GGHNI из положений 23-27 в SEQ ID NO: 2, мотив последовательности QDXK в положениях 49-52 в SEQ ID NO: 2 не мутированы, и V_L сохраняет специфичность связывания с CD16A, а последовательность V_H фрагмента, связывающего антиген CD16A, идентична по меньшей мере на 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81% или 80% последовательности SEQ ID NO: 1, остаток в положении 9 в HCDR1 представляет собой Q, и/или остаток в положении 11 в HCDR2 представляет собой V.

В дополнительном варианте осуществления изобретения последовательность V_L фрагмента, связывающего антиген CD 16А, идентична по меньшей мере на около 99%, около 98%, около 97%, около 96%, около 95%, около 94%, около 93%, около 92%, около 91%, около 90%, около 89%, около 88%, около 87%, около 86%, около 85%, около 84%, около 83%, около 82%, около 81% или около 80% последовательности SEQ ID NO: 2, причем остатки GGHNI в положениях 23-27 в SEQ ID NO: 2, мотив последовательности QDXK в положениях 49-52 в SEQ ID NO: 2 не мутированы, и V_L сохраняет специфичность связывания с CD16A.

В V_H фрагмента, связывающего антиген CD 16А, замена в положении 9 в HCDR1 и/или положении 11 в HCDR2 по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 1 полезна для улучшения связывания с CD 16А. В частности, остаток в положении 9 в HCDR1 представляет собой Q, и/или остаток в положении 11 HCDR2 представляет собой V.

Следовательно, в дополнительном варианте осуществления изобретения последовательность V_H фрагмента, связывающего антиген CD 16А, идентична по меньшей мере на около 99%, около 98%, около 97%, около 96%, около 95%, около 94%, около 93%, около 92%, около 91%, около 90%, около 89%, около 88%, около 87%, около 86%, около 85%, около 84%, около 83%, около 82%, около 81% или около 80% последовательности SEQ ID NO: 1, остаток в положении 9 в HCDR1 представляет собой Q, и/или остаток в положении 11 HCDR2 представляет собой V.

Следовательно, в некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент, связывающий антиген CD 16А, содержит V_L и V_H, причем последовательность V_L фрагмента, связывающего антиген CD 16А, идентична по меньшей мере на около 99%, около 98%, около 97%, около 96%, около 95%, около 94%, около 93%, около 92%, около 91%, около 90%, около 89%, около 88%, около 87%, около 86%, около 85%, около 84%, около 83%, около 82%, около 81% или около 80% последовательности SEQ ID NO: 2, при этом остатки GGHNI из положений 23-27 в SEQ ID NO: 2, мотив последовательности QDXK в положениях 49-52 в SEQ ID NO: 2 не мутированы, и V_L сохраняет специфичность связывания с CD16A, а последовательность V_H фрагмента, связывающего антиген CD 16А, идентична по меньшей мере на около 99%, около 98%, около 97%, около 96%, около 95%, около 94%, около 93%, около 92%, около 91%, около 90%, около 89%, около 88%, около 87%, около 86%, около 85%, около 84%, около 83%, около 82%, около 81% или около 80% последовательности SEQ ID NO: 1, остаток в положении 9 в HCDR1 представляет собой Q, и/или остаток в положении 11 в HCDR2 представляет собой V.

В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность V_H фрагмента, связывающего антиген CD16A, идентична по меньшей мере на около 99%, около 98%, около 97%, около 96%, около 95%, около 94%, около 93%, около 92%, около 91%, около 90%, около 89%, около 88%, около 87%, около 86%, около 85%, около 84%, около 83%, около 82%, около 81% или около 80% последовательности, представленной в SEQ ID NO: 3.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент, связывающий антиген CD 16А, содержит V_H, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на около 99%, около 98%, около 97%, около 96%, около 95%, около 94%, около 93%, около 92%, около 91%, около 90%, около 89%, около 88%, около 87%, около 86%, около 85%, около 84%, около 83%, около 82%, около 81% или около 80% идентична или гомологична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на около 99%, около 98%, около 97%, около 96%, около 95%, около 94%, около 93%, около 92%, около 91%, около 90%, около 89%, около 88%, около 87%, около 86%, около 85%, около 84%, около 83%, около 82%, около 81% или около 80% идентична или гомологична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 3.

В конкретном варианте осуществления изобретения фрагмент, связывающий антиген CD 16А, содержит V_L и V_H, причем V_L выбрана из группы, состоящей из областей с SEQ ID NO: 2, 5, 7, 9, 11 и 13, a V_H выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 8, 10 и 12.

III Фрагмент, связывающий целевой антиген

В некоторых вариантах осуществления изобретения целевой антиген фрагмента, связывающего целевой антиген, представляет собой антиген, представленный на миеломной клетке или плазматической клетке. Миеломная клетка является злокачественной (раковой) плазматической клеткой, возникающей из плазматической клетки в костном мозге. При миеломе злокачественные плазматические клетки вырабатывают большие количества аномальных антител, у которых отсутствует способность бороться с инфекцией. Эти аномальные антитела представляют собой моноклональный белок или М-белок, который функционирует как опухолевый маркер миеломы. Миеломная клетка имеет фенотип CD19^-/CD38⁺/CD138⁺/BCMA⁺. Следовательно, CD38, CD138 и ВСМА представляют антигены, экспрессируемые на миеломной клетке.

А. ВСМА

Антиген созревания В-клеток (ВСМА, CD269 или TNFRSF17) представляет собой белок суперсемейства рецепторов ФНО, который является ключевым для длительной выживаемости плазматических клеток посредством его связывания с активирующим В-клетки (BAFF) и вызывающим пролиферацию А лигандами (APRIL) (O'Connor, В.P. et al. ВСМА is essential for the survival of long-lived bone marrow plasma cells. J. Exp.Med. 2004, 199, 91-96). ВСМА человека представляет собой белок из 184 аминокислот (а.к.), состоящий из внеклеточного домена из 54 а.к., трансмембранного домена из 23 а.к. и внутриклеточного домена из 107 а.к. (Entrez Gene ID: 608 (человек) 102145399 (яванский макак); UniProt Q02223 (человек)).

ВСМА играет роль в длительном выживании плазматических клеток (O'Connor, JEM 2004;199(1):91 98). ВСМА экспрессируется в нормальных плазматических клетках и повышенно экспрессируется и значительно распространен при множественной миеломе.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент, связывающий целевой антиген, специфически связывается с ВСМА, например внеклкточным доменом ВСМА.

Такой Fv к ВСМА, используемый в антигенсвязывающем белке по изобретению, предпочтительно взаимодействует с ВСМА с равновесной константой диссоциации (K_D) (измерено с помощью Biacore) менее 10^-7 М, предпочтительно менее 10^-8 М, менее 10^-9 М, наиболее предпочтительно менее 10^-10 М. Такие домены Fv к ВСМА, включенные во фрагмент, связывающий целевой антиген, способны перенаправлять NK-клетки, вовлеченные за счет CD 16А, и вызывать ADCC в присутствии ВСМА⁺ клеток ММ (множественной миеломы). Сообщалась проверка правильности концепции для биспецифических антител, вовлекающих Т-клетки посредством CD3 в направлении ВСМА⁺ миеломных клеток in vitro и in vivo (например, Hipp S. et al., Leukemia. 2017 Aug;31(8): 1743-1751. Epub 2016 Dec 27). В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент, связывающий целевой антиген, связывается с ВСМА с K_D между около 1 × 10^-9 М и около 5 × 10^-9 М. В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент, связывающий целевой антиген, связывается с K_D, составляющей около 2 × 10^-9 М.

Такой фрагмент, связывающий антиген ВСМА, можно получить, например, с помощью методов скриннинга библиотек фагов или рибосом или иммунизации животных внеклеточным доменом ВСМА, как описано, например, в Ryan М.С, et al., Antibody targeting of B-cell maturation antigen on malignant plasma cells. Mol Cancer Ther. (2007);6:3009-3018.

Ryan et al. описывает получение антитело к ВСМА с цитотоксической активностью или в виде IgG, или в виде конъюгатов антитела и лекарственного средства. В публикации Ryan М.С, et al., которая включена посредством ссылки, описано получение антител, селективных к ВСМА, для нацеливания на опухолевые клетки. Эти антитела были получены против внеклеточного домена ВСМА человека (ECD, аминокислоты 5-51; NP 001183). Антитело вызывало сильную ADCC по отношению к клеткам MM in vitro, которая была увеличена с помощью мутаций Fc, которые усиливают связывание с CD16A. Аффинность связывания K_D SGI по отношению к клеткам Н929 составляла 51 нмоль/л в соответствии со связыванием насыщения. Эти антитела демонстрировали in vitro противоопухолевую активность против клеточных линий ММ, и они, а следовательно их Fv-домены, можно использовать как фрагмент, связывающий антиген ВСМА, в антигенсвязывающем белке по изобретению.

Дополнительно, в WO 02/066516 описаны антитела к ВСМА, способные также к взаимодействию с TACI. Описано, что биспецифические антитела к BCMA/TACI связываются с остатками 1-48 ВСМА и остатками 30-67 и 68-154 TACI. Их вариабельные домены тяжелой и легкой цепей можно использовать как фрагмент, связывающий антиген ВСМА, в антигенсвязывающем белке по изобретению, и включены посредстом ссылки.

В Ramadoss et al., J. Am.Chem.Soc. 2015;137:5288-5291, включенной посредством ссылки, описано биспецифическое антитело (6nFab-BCMA), которое перенаправляет Т-клетки для лизиса злокачественных клеток ММ. Описано, что биспецифические антитела могут быть эффективны для лечения ММ, поскольку они нацелены на латентные раковые стволовые клетки, а также с низкими количествами опухолеассоциированных антигенов.

В WO 2014/122144 описано биспецифическое антитело, которое специфически связывается с ВСМА и CD3 человека в биспецифическом формате. Раскрытые вариабельные домены к ВСМА пригодны для фрагмента, связывающего антиген ВСМА в соответствии с изобретением.

В WO 2013/072406 раскрыты домены Fv к ВСМА, обозначенные как ВСМА-1-ВСМА-108, в биспецифических одноцепочечных антителах, имеющих второй тип специфичности к CD3 для вовлечения Т-клеток. Описана противоопухолевая эффективность этих биспецифических одноцепочечных антител к BCMA/CD3 в модели ксенотрансплантата опухоли человека, и следовательно, эти домены Fv к ВСМА можно использовать во фрагменте, связывающем антиген ВСМА, по изобретению.

Дополнительные антитела к ВСМА, которые можно использовать в биспецифических антителах, вовлекающих иммунные эффекторные клетки, такие как Т- или NK-клетки, раскрыты в WO 2010/104949, WO 2012/163805, WO 2013/072415, WO 2014/140248 и WO 2014/068079. Также в этих источниках описаны домены Fv к ВСМА, которые специфически нацелены на ВСМА с высокой аффинностью, и биспецифические антитела, в которых используются такие домены Fv к ВСМА, вызывающие сильный и эффективный лизис миеломных клеток. Следовательно, предоставлено доказательство правильности концепции для доменов Fv к ВСМА в биспецифических антителах для перенаправления Т-клеток для лизиса клеток ММ.

Дополнительные антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с антигенами, экспрессирующимися на миеломных клетках, в частности ВСМА, могут быть получены из других известных или коммерчески доступных антител или созданы de novo способами, хорошо известными в данной области техники. Например, вариабельные домены, специфические к ВСМА, можно получить путем подбора вариабельных фрагментов (Fv), которые являются специфичными к ВСМА. Это можно осуществить, например, путем скриннинга библиотек фагового дисплея одноцепочечного Fv (scFv) или по технологии гибридом. Например, библиотеки фагового дисплея на основе IgM последовательностей scFv человека можно подвергать нескольким циклам отбора in vitro для обогащения связующими компонентами, специфическими к ВСМА (Пример 1).

Аффинности выбранных scFv можно дополнительно повышать за счет созревания аффинности.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент, нацеленный на ВСМА, содержит CDR1 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 67, CDR2 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 68, V_H CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 69, CDR1 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 70, CDR2 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 71, и CDR3 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 72.

В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность V_H фрагмента, нацеленного на ВСМА, содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на около 80%, около 81%, около 82%, около 83%, около 84%, около 85%, около 86%, около 87%, около 88%, около 89%, около 90%, около 91%, около 92%, около 93%, около 94%, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 65.

В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность V_L фрагмента, нацеленного на ВСМА, содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на около 80%, около 81%, около 82%, около 83%, около 84%, около 85%, около 86%, около 87%, около 88%, около 89%, около 90%, около 91%, около 92%, около 93%, около 94%, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 66.

В некоторых вариантах осуществления изобретения V_H фрагмента, нацеленного на ВСМА, содержит или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 65. В некоторых вариантах осуществления изобретения V_L фрагмента, нацеленного на ВСМА, содержит или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 66.

В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность V_H фрагмента, нацеленного на ВСМА, содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на около 80%, около 81%, около 82%, около 83%, около 84%, около 85%, около 86%, около 87%, около 88%, около 89%, около 90%, около 91%, около 92%, около 93%, около 94%, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 37.

В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность V_L фрагмента, нацеленного на ВСМА, содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на около 80%, около 81%, около 82%, около 83%, около 84%, около 85%, около 86%, около 87%, около 88%, около 89%, около 90%, около 91%, около 92%, около 93%, около 94%, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 38.

В некоторых вариантах осуществления изобретения V_H фрагмента, нацеленного на ВСМА, содержит или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 65. В некоторых вариантах осуществления изобретения V_L фрагмента, нацеленного на ВСМА, содержит или имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 66.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, связывающее CD16A/BCMA, представляет собой антигенсвязывающий белок scFv-IgAb, имеющий структуру, представленную на Фиг. 13, который содержит (а) два фрагмента, связывающих антиген CD 16А, в формате scFv, слитые с С-концом гомодимерного участка Fc СН2-СН3 IgG человека в порядке V_L-V_H, и (b) два фрагмента, связывающих целевой антиген, представленных каждым Fv в плечах Fab IgG, причем фрагменты, связывающие целевой антиген, связываются с ВСМА.

В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый из фрагментов, связывающий антиген CD 16 А, содержит CDR1 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 73, CDR2 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 74, V_H CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 75, CDR1 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 76, CDR2 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 77, и CDR3 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 78. В некоторых вариантах осуществления изобретения CDR идентифицированы в соответствии с системой нумерации по Кабату. Каждый из фрагментов, связывающих антиген CD16A, содержит V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, и V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент, связывающий антиген CD16A, слит с С-концом участка Fc, присоединенного с помощью соединительной группы с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 22, в следующем порядке: V_L (С016А)-линкер L3-V_L (CD16A), где линкер L3 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18.

В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый из фрагментов, нацеленных на ВСМА, содержит CDR1 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 67, CDR2 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 68, V_H CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 69, CDR1 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 70, CDR2 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 71, и CDR3 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 72. В некоторых вариантах осуществления изобретения CDR идентифицированы в соответствии с системой нумерации по Кабату. Каждый из фрагментов, нацеленных на ВСМА, содержит V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 65, и V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 66.

В некоторых вариантах осуществления изобретения участок Fc антитела CD16A/BCMA представляет собой сайленсированный участок Fc, который содержит константный домен тяжелой цепи СН2 и СНЗ IgG1 человека, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в SED ID NO: 29. Константный домен тяжелой цепи СН2 содержит две сайленс-мутации (также обозначаемые как «мутации, приводящие к снижению эффекторной функции»): L234F и L235E. Константный домен тяжелой цепи СН2 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SED ID NO: 79. Константный домен тяжелой цепи СНЗ содержит аминокислотную последовательность, представленную в SED ID NO: 109. Константный домен тяжелой цепи СН1, который связан с фрагментом, нацеленным на ВСМА, содержит аминокислотную последовательность, представленную в SED ID NO: 33.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело I к CD16A/BCMA содержит полипептидную цепь 1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 61, и полипептидную цепь 2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 62.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к CD16A/BCMA представляет собой KiH-scDb-Fc, имеющий структуру, показанную на Фиг. 5, который содержит (а) два фрагмента, связывающих антиген CD16A, в формате scDb, слитые с С-концом участка Fc СН2-СН3 IgG в порядке V_L-V_H-V_L-V_H, и (b) один фрагмент, связывающий целевой антиген, в формате scFv, слитый с N-концом участка Fc, причем фрагмент, связывающий целевой антиген, связывается с ВСМА.

В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый из фрагментов, связывающий антиген CD 16 А, содержит CDR1 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 73, CDR2 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 74, V_H CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 75, CDR1 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 76, CDR2 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 77, и CDR3 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 78. В некоторых вариантах осуществления изобретения CDR идентифицированы в соответствии с системой нумерации по Кабату. Каждый из фрагментов, связывающих антиген CD16A, содержит V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, и V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент, связывающий антиген CD 16А, слит с гетеродимерным участком Fc и присоединен с помощью соединительной группы с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 20, в следующем порядке: V_L (С016А)-линкер L1-V_H (С016А)-линкер L2-V_L (С016А)-линкер L1-V_H (CD16A), где линкер L1 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16, и линкер L2 имеет аминокислотную последоательность, представленную в SEQ ID NO: 17.

В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый из фрагментов, нацеленных на ВСМА, содержит CDR1 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 67, CDR2 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 68, V_H CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 69, CDR1 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 70, CDR2 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 71, и CDR3 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 72. В некоторых вариантах осуществления изобретения CDR идентифицированы в соответствии с системой нумерации по Кабату. Каждый из фрагментов, нацеленных на ВСМА, содержит V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 65, и V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 66.

В некоторых вариантах осуществления изобретения участок Fc антитела III CD16A/BCMA представляет собой сайленсированный участок Fc, который содержит константный домен тяжелой цепи СН2 и СН3 IgG1 человека с аминокислотной последовательностью, представленной в SED ID NO: 31. Константный домен тяжелой цепи СН2 содержит две сайленс-мутации или мутации, приводящие к снижению эффекторной функции: L234F и L235E. Константный домен тяжелой цепи СН2 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SED ID NO: 79. Константный домен тяжелой цепи СН3 содержит одну сайленс-мутацию или мутацию, приводящую к снижению эффекторной функции, D265A. Константный домен тяжелой цепи СНЗ содержит аминокислотную последовательность, представленную в SED ID NO: 81.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к CD16A/BCMA содержит полипептидную цепь 1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 63, и полипептидную цепь 2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 64.

В одном варианте осуществления изобретения мультиспецифический антигенсвязывающий белок по изобретению представляет собой тетрамер, содержащий полипептиды с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 61 и 62 или SEQ ID NO: 63 и 64. В. РЭФР

Также представлены белки, связывающие антигены РЭФР/С016А, для подхода нацеливания на РЭФР, основанного на естественных клетках-киллерах (NK-клетках).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент к РЭФР, описанный в данном документе, также связывается с РЭФРvIII. Таким образом, белок, связывающий антигены РЭФР/С016А, можно использовать для лечения онкологических заболеваний, при которых экспрессируется как РЭФР, так и РЭФРvIII. РЭФРvIII в отличие от РЭФР экспрессируется исключительно в раковых клетках, но не здоровых тканях. Следовательно, белок, связывающий антигены РЭФР/С016А, описанный в данном документе, может быть нацелен на большее разнообразие РЭФР- и/или РЭФРvIII-положительных опухолей, а таким образом га большую популяцию пациентов. Пример домена, связывающего РЭФР, пригодного для антигенсвязывающих белков, описанных в данном документе, содержит как VH аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40, и как VL аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 41. IV. Полину клеотиды

Антигенсвязывающий белок по любому из вариантов осуществления изобретения, описанный в данном документе, может быть получен путем экспрессии полинуклеотидов, кодирующих индивидуальные полипептидные цепи, которые образуют антигенсвязывающую молекулу. Следовательно, дополнительные варианты осуществления изобретения представляют собой полинуклеотиды, например ДНК или РНК, кодирующие полипептиды молекул антител, как описано в данном документе выше.

Полинуклеотиды могут быть построены с помощью способов, известных специалисту в данной области техники, например путем объединения генов, кодирующих вариабельные домены, или разделенные пептидными линкерами, или непосредственно связанные пептидной связью, полипептидных цепей, в генетическую конструкцию, функционально связанную с подходящим промотором и необязательно пригодным терминатором транскрипции, и экспрессии в бактериях или другой подходящей экспрессионной системе, такой как, например, клетки СНО. В зависимости от векторной системы и используемого хозяина можно использовать любое количество пригодных транскрипционных и трансляционных элементов, включая конститутивные и индуцируемый промоторы. Промотор выбран так, что он запускает экспрессию полинуклеотидов в соответствующей клетке-хозяине.

Полинуклеотиды могут быть встроены в вектора, предпочтительно вектора экспрессии, которые представляют дополнительный вариант осуществления изобретения.

Разнообразие систем вектор экспрессии/хозяин можно использовать, чтобы содержать и экспрессировать полинуклеотиды, кодирующие полипептидные цепи по данному изобретению. Примеры векторов экспрессии представляют собой pSKK для экспрессии в E.coli (LeGall et at., J Immunol Methods. (2004);285(1):111-27) или pcDNA5 (Invitrogen) для экспрессии в клетках млекопитающих. V. Способы лечения

В изобретении дополнительно предложен мультиспецифический антигенсвязывающий белок, в частности композиция, содержащая мультиспецифический антигенсвязывающий белок, описанный в данном документе выше, и по меньшей вере один дополнительный компонент.

В изобретении дополнительно предложен мультиспецифический антигенсвязывающий белок или композиция, содержащая мультиспецифический антигенсвязывающий белок, описанный в данном документе выше, для применения в иммунотерапии на основе NK-клеток. Иммунотерапия на основе NK-клеток включает терапию на основе активных NK-клеток, в которых или эндогенные или адоптивно пересаженные NK-клетки активированы посредством вовлечения антигенсвязывающей молекулой по изобретению. В частности, способность NK-клеток атаковать и уничтожать аномальные клетки, такие как раковые клетки, усилена.

Кроме того, нынешнее иммуноонкологическое (IO) направление включает имеющиеся в продаже модуляторы иммунных точек, такие как антитела к CTLA4 и PD-1. Несмотря на то, что эти агенты продемонстрировали клиническую эффективность (как правило, 20-30% ЧОО для ряда показателей), в области медицины все еще остается потребность и перспектива. Следовательно, необходимы новые терапии для достижения повышенных показателей ответа и длительный ремиссий у большего количества пациентов, несмотря на недавние достижения в лечении. Например, NK-клетки играют ключевую роль в иммунном ответе на ММ и вовлечены в клиническую эффективность нынешних стандартов лечения, включая IMiD, ингибиторы протеасом, недавно одобренные иммунотерапии и аутологичную трансплантацию стволовых клеток (ASCT). Были разработаны многочисленные подходы для увеличения природной цитотоксичности NK-клеток по отношению к миеломным клеткам, регуляция которых часто нарушена при ММ. Подходы включают модуляцию активности посредством стимуляции цитокинами или нацеливания на иммунные контрольные точки или адоптивный перенос NK-клеток, размножаемых в культуре при ММ с возможностью ASCT. Хотя эти подходы и являются очень привлекательными, они не являются прицельными, поскольку они основаны на природной цитотоксичности NK-клеток, и пользу может принести антигенспецифическое перенацеливание и эффекторная активация.

Кроме того, целесообразные комбинации в IO должны быть основаны на агентах, которые способны к достижению максимальной иммунной эффективности, при этом сохраняя возможность контролировать безопасность. Перспективные подходы выходят за рамки адаптивного иммунитета (большинство антител к контрольным точкам активны только на Т-клетках) и включают активацию врожденного иммунитета, давая таким образом объединенный иммунный ответ. На основании длительного периода полувыведения из сыворотки форматы антител, описанные в данном документе, идеально подходят для этих целей и дают возможность удобного дозирования, подобного имеющимся на данный момент в продаже моноклональным антителам, и и могут быть идеально объединены с модуляторами контрольных точек, таких как антитела к LAG3 или PD1.

В некоторых вариантах осуществления в изобретении предложен мультиспецифический антигенсвязывающий белок, специфически связывающийся с CD16A и антигеном, экспрессирующимся на миеломной клетке или плазматической клетке, выбранной из группы, состоящей из ВСМА, CS-1, CD19, CD20, CD22, CD38 и CD138, как описано выше, для применения в лечении множественной миеломы, включающем стадию введения мультиспецифического антигенсвязывающего белка. В некоторых вариантах осуществления в изобретении предложена мультиспецифическая антигенсвязывающая молекула, которая специфически связывается с антигеном клетки-мишени, например опухолевым антигеном, и CD16A для применения в NK-клеточной иммунотерапии, причем мультиспецифический антигенсвязывающий белок смешан с NK-клетками ex vivo, и композицию NK-клеток и мультиспецифического антигенсвязывающего белка вводят пациенту.

В конкретном варианте осуществления изобретения опухолевый антиген представляет собой ВСМА, и композицию используют для лечения расстройства плазматических клеток или аутоиммунного заболевания, в частности множественной миеломы.

Расстройства плазматических клеток включают множественную миелому, плазмацитому, плазмоклеточный лейкоз, макроглобулинемию, амилоидоз, макроглобулинемию Вальденстрема, плазмоцитому отдельной кости, экстрамедуллярную плазмацитому, остеосклеротическую миелому, болезнь тяжелых цепей, моноклональную гаммапатию неопределенного значения (MGUS) и вялотекущую миелому.

Аутоиммунные заболевания представляют собой, например, системную красную волчанку (СКВ, SLE) или ревматоидный артрит (PA, RA).

Следовательно, в данном изобретении в некоторых вариантах осуществления изобретения предложено медицинское применение и способы, причем антигенсвязывающий белок, специфический к ВСМА и CD16A, например scDb-mFc, KiH-scDb-Fc, scDb-Trib(-scFv), scFv-IgAb, би-scFv-IgAb, KiH-scFv-Fc, Db-Fc или би-scFv-Fc, как описано в данном документе выше, вводят субъекту в эффективной дозе для лечения ВСМА⁺ онкологического заболевания или аутоиммунного заболевания, например множественной миеломы.

Введение осуществляют различными путями, например внутривенным, внутрибрюшинным, подкожным, внутримышечным, местным или интрадермальным. Дозировка будет определяться лечащим врачом или другими клиническими факторами. Дозировка для любого субъекта зависит от многих факторов, включая массу тела пациента, площадь поверхности тела, возраст, пол, конкретное соединение, которое вводят, время и путь введения, тип терапии, общее состояние здоровья и другие лекарственные средства, вводимые одновременно. «Эффективная доза» относится к количествам активного ингредиента, которых достаточно для влияния на протекание и тяжесть заболевания, приводящего к ослаблению или ремиссии такой патологии. «Эффективную дозу», пригодная для лечения и/или профилактики ВСМА⁺ заболевания можно определить, используя известные способы.

Кроме того, в изобретении предложен способ лечения или ослабления заболевания, причем способ включает введение мультиспецифического антигенсвязывающего белка по изобретению субъекту, нуждающемуся в этом.

В предпочтительном варианте осуществления способа лечения или ослабления заболевания, указанное заболевание представляет собой множественную миелому.

В данном изобретении предложено применение раскрытых в данном документе антигенсвязывающих молекул, например молекул, связывающих антигены CD16A/BCMA, для лечения и/или профилактики онкологического заболевания, например множественной миеломы. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ включает введение раскрытой в данном документе антигенсвязывающей молекулы, например молекулы, связывающей антигены CD16A/BCMA, или фармацевтической композиции, содержащей ее, субъекту, страдающему множественной миеломой («ММ»).

В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект, получающий лечение антигенсвязывающими молекулами, например молекулой, связывающей антигены CD16A/BCMA, или фармацевтической композицией, содержащей ее, представляет собой пациента с рецидивирующей/рефрактерной («R/R») множественной миеломой. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект получает даратумумаб. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект ранее получал лечение даратумумабом. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект является резистентным к даратумумабу. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект является рефрактерным к даратумумабу. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект имеет рецидив после лечения даратумумабом.

В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект, получающий лечение антигенсвязывающей молекулой, например молекулой, связывающей антигены CD16A/BCMA, или фармацевтической композицией, содержащей ее, демонстрирует полиморф CD16A. В качестве примера, но не ограничения, полиморфизм CD16A представляет собой полиморфизм CD16A-158V/F. См. Пример 8 (например, Фиг. 31А и 31В).

В некоторых вариантах осуществления изобретения способы лечения, описанные в данном документе, дополнительно включают применение второго вида терапии, например терапии на основе Т-клеток или терапии на основе ингибиторов контрольных точек. Такая вторая терапия включает, но не ограничивается ими, способы лечения, включающие введение антитела к TIGIT, способы лечения, включающие введение антитела к PD-1 (например, ниволумаба, пембролизумаба), способы лечения, включающие введение антитела к PD-L1 (например, атезолизумаба), способы лечения, включающие введение антитела к VEGF (например, бевацизумаба), и способы лечения, включающие введение биспецифического антитела к CD3 (например, антитела к FcRH5/CD3 (в том числе, но не ограничиваясь ими, те антитела, которые раскрыты в PCT/U S2016/037879, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки)).

В некоторых вариантах осуществления изобретения способы лечения, описанные в данном документе, дополнительно включают применение терапии с использованием цитокинов. При использовании в данном документе, «терапия с использованием цитокинов» относится к любой терапии, цитокин, его любое производное или модификацию, в том числе, но не ограничиваясь ими, пегилированные цитокины и цитокины слияния с Fc. Неограничивающие примеры цитокинов, которые можно использовать в связи с такими вариантами осуществления изобретения, включают ИЛ-15, ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-21, ИЛ-17, ИЛ-18, ИЛ-23, ИЛ-27 и ИЛ-6. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ дополнительно включает введение ИЛ-15. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ дополнительно включает введение ИЛ-2. Как показано в Примере 8, ИЛ-15 и ИЛ-2 могут увеличивать активность раскрытой в данном документе молекулы, связывающей антигены CD16A/BCMA.

В некоторых вариантах осуществления изобретения введение антигенсвязывающей молекулы, раскрытой в данном документе, например молекулы, связывающей антигены CD16A/BCMA, или фармацевтической композиции, содержащей ее, будет осуществляться как введение терапевтического средства первой линии (1L). В качестве примера, а не ограничения, такое введение первой линии, будет осуществляться у субъектов, демонстрирующих полиморфизм CD16A, который будет указывать на сниженную эффективность терапевтического средства, действующего посредством МОА на основе Fc, например терапии даратумумабом. В некоторых вариантах осуществления изобретения введение первой линии антигенсвязывающих молекул по данному изобретению будет осуществляться у субъектов, когда взаимное уничтожение NK-клеток является противопоказанием. См. Пример 8 (например, Фиг. 40А-40Е). В некоторых вариантах осуществления изобретения введение первой линии антигенсвязывающих молекул по данному изобретению будет осуществляться у субъектов, когда желательно избежать СВЦ.

В некоторых вариантах осуществления изобретения введение антигенсвязывающей молекулы, раскрытой в данном документе, например молекулы, связывающей антигены CD16A/BCMA, или фармацевтической композиции, содержащей ее, будет осуществляться как введение терапевтического средства второй линии (2L) или третьей линии (3L). В качестве примера, но не ограничения, введение второй линии или третьей линии будет осуществляться у субъектов, которые уже получали терапевтическое средство, действующее посредством МОА на основе Fc, например лечение даратумумабом. В некоторых вариантах осуществления изобретения такое лечение второй линии или третьей линии будет осуществляться у субъектов, которые являются рефрактерными или резистентными к лечению даратумумабом.

В некоторых вариантах осуществления изобретения для выбора агента, вовлекающего NK-клетки, для применения в лечении множественной миеломы, используются один или более из следующих критериев:

• агент, вовлекающий NK-клетки, способен связываться с двумя мишенями: CD16A на NK-клетках, и ВСМА на клетках множественной миеломы,

• агент, вовлекающий NK-клетки, является по меньшей мере двухвалентным по отношению к CD16A, например, содержит по меньшей мере два фрагмента, связывающих антиген CD16A,

• агент, вовлекающий NK-клетки, представляет собой биспецифическое антитело NK-клеток, которое не реагирует перекрестно с CD16B и предпочтительно реагирует перекрестно с антигенами низших приматов,

• агент, вовлекающий NK-клетки, является сильнодействующим и широко распространенным и обладает зависимой от мишени способностью уничтожать in vitro ВСМА⁺ опухолевые клетки (например, ≥около 60% клеток уничтожается с ЕС50≤5 нМ) и первичную миелому,

• агент, вовлекающий NK-клетки, не уничтожает в значительной степени NK-клетки, например уменьшает или устраняет взаимное уничтожение NK-клетками друг друга,

• агент, вовлекающий NK-клетки, имеет приемлемый профиль безопасности, например имеет профиль высвобождения цитокинов, превосходящий другие агенты, вовлекающие Т-клетки (например, агент, вовлекающий NK-клетки, без СВЦ), побочные эффекты являются отслеживаемыми, контролируемыми и обратимыми,

• агент, вовлекающий NK-клетки, можно вводить субъекту с множественной миеломой внутривенно, и

• Агент, вовлекающий NK-клетки, необходимо вводить раз в неделю (QW) или реже.

В некоторых вариантах осуществления изобретения следующие биомаркеры фармакодинамики (ФД) можно использовать в сочетании с введением антигенсвязывающих белков по данному изобретению: концентрация белка М и свободных легких цепей (FLC) в сыворотке, уменьшение моноклональных плазматических клеток, активация и рекрутинг NK-клеток в образцах костного мозга после лечения и активация периферических NK-клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения способы лечения могут включать ВМСА-зависимую диагностику, хотя такая не обязательно необходима на основании сильного преобладания ВМСА при множественной миеломе.

VI. Иллюстративные варианты осуществления изобретения

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к мультиспецифическим антигенсвязывающим белкам, содержащим (а) по меньшей мере фрагмент, связывающий первый целевой антиген, и (b) по меньшей мере два фрагмента, связывающих антиген CD16A, причем по меньшей мере два фрагмента, связывающих антиген CD16A, слиты с фрагментом Fab, содержащим по меньшей мере один константный домен или участок Fc. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере два фрагмента, связывающих антиген CD16A, представляют собой антигенсвязывающую молекулу, выбранную из группы, состоящей из одноцепочечного Fv (scFv), одноцепочечного диатела (scDb) и диатела Db. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый из по меньшей мере двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, представляет собой scFv. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере два фрагмента, связывающих антиген CD16A, представлены в формате scDb. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый из по меньшей мере двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, содержит вариабельную область легкой цепи (V_L) и вариабельную область тяжелой цепи (V_H), связанные друг за другом в полипептидную цепь, и вариабельная область на N-конце полипептидной цепи представляет собой V_L. В некоторых вариантах осуществления изобретения вариабельные области по меньшей мере двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, в полипептидной цепи расположены от N-конца к С-концу в порядке V_L-V_H, V_L-V_L-V_H-V_H или V_L-V_H-V_L-V_H. В некоторых вариантах осуществления изобретения вариабельные области по меньшей мере двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, в полипептидной цепи расположены от N-конца к С-концу в порядке V_L-V_H. В некоторых вариантах осуществления изобретения вариабельные области по меньшей мере двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, в полипептидной цепи расположены от N-конца к С-концу в порядке V_L-V_H-V_L-V_H. В некоторых вариантах осуществления изобретения (i) С-конец полипептидной цепи слит с N-концом СН2-домена участка Fc; или (ii) С-конец полипептидной цепи слит с N-концом шарнирной области участка Fc; (iii) N-конец полипептидной цепи слит с С-концом СН3-домена участка Fc, или (iv) N-конец полипептидной цепи слит с С-концом фрагмента Fab. В некоторых вариантах осуществления изобретения N-конец полипептидной цепи слит с С-концом СН3-домена участка Fc. В некоторых вариантах осуществления изобретения участок Fc выбран из группы, состоящей из мономерного фрагмента СН2-СН3, гетеродимерной области Fc и гомодимерной области Fc. В некоторых вариантах осуществления изобретения участок Fc не связывается с рецептором Fc-гамма, но может связываться с неонатальным Fc-рецептором. В некоторых вариантах осуществления изобретения scDb или Db, содержащее два фрагмента, связывающих антиген CD16, слито с С-концом одной цепи фрагмента Fab, а фрагмент, связывающий первый целевой антиген, слит с С-концом другой цепи фрагмента Fab. В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент Fab на N-конце содержит Fv, связывающий антиген HSA.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающие белки, описанные в данном документе, являются четырехвалентными.

В некоторых вариантах осуществления изобретения мультиспецифические антигенсвязывающие белки, описанные в данном документе, содержат по меньшей мере два фрагмента, связывающих целевой антиген.

В некоторых вариантах осуществления изобретения мультиспецифические антигенсвязывающие белки, описанные в данном документе, содержат фрагмент, связывающий первый целевой антиген, фрагмент, связывающий второй целевой антиген, и по меньшей мере два фрагмента, связывающих антиген CD16A, слитые с димерным участком Fc.

В некоторых вариантах осуществления изобретения мультиспецифические антигенсвязывающие белки, описанные в данном документе, содержат фрагмент, связывающий антиген CD16A, слитый с С-концом каждой тяжелой цепи IgG, и при этом IgG содержит на N-конце фрагмент Fv, связывающий первый целевой антиген, в каждом из двух Fab, а фрагмент, связывающий второй целевой антиген, слит на С-конце с каждым из доменов CL.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагменты, связывающие антиген CD16A, описанные в данном документе, содержат: (i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 50; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 51; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 52, и/или (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 53; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 54; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 55.

В некоторых вариантах осуществления изобретения мультиспецифические антигенсвязывающие белки, описанные в данном документе, содержат фрагмент, связывающий антиген CD16A, содержащий: (i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 73; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 74; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 75, и/или (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 76; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 77; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 78.

В некоторых вариантах осуществления изобретения мультиспецифические антигенсвязывающие белки, описанные в данном документе, содержат фрагмент, связывающий антиген CD16A, который содержит (i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на около 80% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 3, и/или (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на около 80% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.

В некоторых вариантах осуществления изобретения мультиспецифические антигенсвязывающие белки, описанные в данном документе, содержат фрагмент, связывающий антиген CD16A, который содержит (i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и/или (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

В некоторых вариантах осуществления изобретения мультиспецифические антигенсвязывающие белки, описанные в данном документе, связываются с первым целевым антигеном, который выбран из ВСМА и РЭФР. В некоторых вариантах осуществления изобретения мультиспецифические антигенсвязывающие белки, описанные в данном документе, связываются с первым целевым антигеном, который представляет собой ВСМА.

В некоторых вариантах осуществления изобретения мультиспецифические антигенсвязывающие белки, описанные в данном документе, содержат тетрамер, содержащий первую полипептидную цепь с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 61 или 63, и вторую полипептидную цепь с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 62 или 64. В некоторых вариантах осуществления изобретения мультиспецифические антигенсвязывающие белки, описанные в данном документе, содержат тетрамер, содержащий первый и второй полипептид, выбранные из: (i) первого полипептида с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 61, и второго полипептида с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 62; (ii) первого полипептида с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 61, и второго полипептида с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 64; (iii) первого полипептида с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 63, и второго полипептида с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 62; и (iv) первого полипептида с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 63, и второго полипептида с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 64.

В некоторых вариантах осуществления изобретения мультиспецифические антигенсвязывающие белки, описанные в данном документе, содержат фрагмент, связывающий антиген ВСМА, содержащий: (i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 67; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 68; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 69, и/или (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 70; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 71; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 72.

В некоторых вариантах осуществления изобретения мультиспецифические антигенсвязывающие белки, описанные в данном документе, содержат фрагмент, связывающий антиген ВСМА, содержащий: (i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на около 80% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 65, и/или (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на около 80% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 66.

В некоторых вариантах осуществления изобретения мультиспецифические антигенсвязывающие белки, описанные в данном документе, содержат фрагмент, связывающий антиген ВСМА, содержащий: (i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 65, и/или (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 66. В некоторых вариантах осуществления изобретения мультиспецифические антигенсвязывающие белки, описанные в данном документе, включают антигенсвязывающий белок, содержащий: (i) фрагмент, связывающий антиген CD16A, содержащий: (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 73; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 74; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 75, и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 76; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 77; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 78; и (ii) фрагмент, связывающий антиген ВСМА, содержащий: (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 67; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 68; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 69, и (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 70; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 71; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 72.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим мультиспецифический антигенсвязывающий белок, как описано в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления изобретения мультиспецифические антигенсвязывающие белки, описанные в данном документе, представлены для применения в качестве лекарственного препарата.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу лечения или ослабления заболевания, при этом способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, мультиспецифического антигенсвязывающего белка, как описано в данном документе, или фармацевтической композиции, как описано в данном документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание представляет собой онкологическое заболевание. В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание представляет собой гемобластоз. В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание представляет собой множественную миелому.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам лечения и/или профилактики заболевания у субъекта, при этом способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, биспецифического антигенсвязывающего белка, как описано в данном документе, или фармацевтических композиций, как описано в данном документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения мультиспецифический антигенсвязывающий белок вводят внутривенно. В некоторых вариантах осуществления изобретения мультиспецифический антигенсвязывающий белок вводят подкожно. В некоторых вариантах осуществления изобретения способы, описанные в данном документе, включают применение второго вида терапии. В некоторых вариантах осуществления изобретения вторая терапия выбрана из группы, состоящей из способов лечения, включающих антитело к PD-1, способов лечения, включающих антитела к PD-L1, способов лечения, включающих биспецифические антитела к CD3, способов лечения, включающих антитело к TIGIT, способов лечения, включающих антитело к VEGF, и способов лечения, включающих антитело к FcRH5. В некоторых вариантах осуществления изобретения вторая терапия представляет собой терапию с использованием цитокинов. В некоторых вариантах осуществления изобретения терапия с использованием цитокинов включает введение цитокина, выбранного из группы, состоящей из ИЛ-15, ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-21 и ИЛ-6. В некоторых вариантах осуществления изобретения терапия с использованием цитокинов включает введение ИЛ-2. В некоторых вариантах осуществления изобретения терапия с использованием цитокинов включает введение ИЛ-15.

В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект, которого лечат, как описано в данном документе, представляет собой пациента с онкологическим заболеванием. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект представляет собой пациента с гемобластозом. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект представляет собой пациента с множественной миеломой. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект представляет собой пациента с рецидивирующей/рефрактерной множественной миеломой. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект получает терапию с использованием антител к CD38. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект получает даратумумаб. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект ранее не получал лечение даратумумабом, резистентный к даратумумабу, рефрактерный к даратумумабу или имеет рецидив после лечения даратумумабом. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект резистентный к даратумумабу, рефрактерный к даратумумабу или имеет рецидив после лечения даратумумабом. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект демонстрирует полиморфизм CD16A. В некоторых вариантах осуществления изобретения полиморфизм CD16A представляет собой полиморфизм CD16A-158V/F.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к биспецифическим антигенсвязывающим белкам, содержащим (а) по меньшей мере фрагмент, связывающий ВСМА, и (b) по меньшей мере два фрагмента, связывающих антиген CD16A, причем по меньшей мере два фрагмента, связывающих антиген CD16A, слиты с фрагментом Fab, содержащим по меньшей мере один константный домен или участок Fc. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере два фрагмента, связывающих антиген CD16A, представляют собой антигенсвязывающую молекулу, выбранную из группы, состоящей из одноцепочечного Fv (scFv), одноцепочечного диатела (scDb) и диатела Db. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый из по меньшей мере двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, представляет собой scFv. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере два фрагмента, связывающих антиген CD16A, представлены в формате scDb. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый из по меньшей мере двух антигенсвязвающих фрагментов к CD16A содержит вариабельную область легкой цепи (V_L) и вариабельную область тяжелой цепи (V_H), связанные друг за другом в полипептидную цепь, и вариабельная область на N-конце полипептидной цепи представляет собой V_L. В некоторых вариантах осуществления изобретения вариабельные области по меньшей мере двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, в полипептидной цепи расположены от N-конца к С-концу в порядке V_L-V_H, V_L-V_L-V_H-V_H или V_L-V_H-V_L-V_H. В некоторых вариантах осуществления изобретения вариабельные области по меньшей мере двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, в полипептидной цепи расположены от N-конца к С-концу в порядке V_L-V_H. В некоторых вариантах осуществления изобретения вариабельные области по меньшей мере двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, в полипептидной цепи расположены от N-конца к С-концу в порядке V_L-V_H-V_L-V_H.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к биспецифическому антигенсвязывающему белку: (i) С-конец полипептидной цепи слит с N-концом СН2-домена участка Fc; или (ii) С-конец полипептидной цепи слит с N-концом шарнирной области участка Fc; (iii) N-конец полипептидной цепи слит с С-концом СН3-домена участка Fc, или (iv) N-конец полипептидной цепи слит с С-концом фрагмента Fab. В некоторых вариантах осуществления изобретения N-конец полипептидной цепи слит с С-концом СН3-домена участка Fc. В некоторых вариантах осуществления изобретения участок Fc выбран из группы, состоящей из мономерного фрагмента СН2-СН3, гетеродимерной области Fc и гомодимерной области Fc. В некоторых вариантах осуществления изобретения участок Fc не связывается с рецептором Fc-гамма, но может связываться с неонатальным Fc-рецептором. В некоторых вариантах осуществления участок Fc содержит по меньшей мере одну мутацию, приводящую к снижению эффекторной функции. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна мутация, приводящая к снижению эффекторной функции, выбрана из группы, состоящей из C220S, C229S, Е233Р, L234A, L234V, L234F, L235A, L235E, P238S, D265A, N297A, N297Q и P331S. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна мутация, приводящая к снижению эффекторной функции, выбрана из группы, состоящей из L234A, L234V, L234F, L235A, L235E, P238S и D265A. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна мутация, приводящая к снижению эффекторной функции, выбрана из группы, состоящей из L234F, L235E и D265A. В некоторых вариантах осуществления изобретения участок Fc содержит по меньшей мере две мутации, приводящие к снижению эффекторной функции. В некоторых вариантах осуществления изобретения две мутации, приводящие к снижению эффекторной функции, представляют собой L234F и L235E. В некоторых вариантах осуществления изобретения участок Fc содержит по меньшей мере три мутации, приводящие к снижению эффекторной функции. В некоторых вариантах осуществления изобретения три мутации, приводящие к снижению эффекторной функции, представляют собой L234F, L235E и D265A.

В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифические антигенсвязывающие белки по данному изобретению содержат по меньшей мере два фрагмента, связывающих антиген CD16A, слитые с участком Fc. В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифические антигенсвязывающие белки по данному изобретению содержат два фрагмента, нацеленных на ВСМА. В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифические антигенсвязывающие белки по данному изобретению содержат два фрагмента, связывающих антиген CD16A, и два фрагмента, нацеленные на ВСМА. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый из двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, слит с С-концом каждой тяжелой цепи IgG, и каждый из двух фрагментов, нацеленных на ВСМА, слит с N-концом IgG.

В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифические антигенсвязывающие белки по данному изобретению включают биспецифические антигенсвязывающие белки, имеющие структуру, представленную на Фиг. 13. В некоторых таких вариантах осуществления изобретения биспецифические антигенсвязывающие белки содержат один фрагмент, нацеленный на ВСМА. В некоторых таких вариантах осуществления изобретения фрагмент, нацеленный на ВСМА, слит с N-концом участка Fc, с которым слиты по меньшей мере два фрагмента, связывающих антиген CD16A.

В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифическое антигенсвязывающее антитело имеет структуру, показанную на Фиг. 5.

В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифический антигенсвязывающий белок по данному изобретению содержит фрагмент, связывающий антиген CD16A, содержащий: (i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 50; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 51 или 56; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 52, и/или (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 53; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 54; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 55. В некоторых вариантах осуществления изобретения CDR2 вариабельной области тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 51. В некоторых вариантах осуществления изобретения CDR2 вариабельной области тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 56.

В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифические антигенсвязывающие белки по данному изобретению содержит фрагмент, связывающий антиген CD16A, содержащий: (i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 73; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 74; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 75, и/или (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 76; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 77; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 78. В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент, связывающий антиген CD16A, содержит (i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на около 80% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 3, и/или (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на около 80% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент, связывающий антиген CD16A, содержит (i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и/или (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифические антигенсвязывающие белки по данному изобретению содержат фрагмент, связывающий антиген ВСМА, содержащий: (i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 67; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 68; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 69, и/или (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 70; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 71; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 72. В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент, связывающий антиген ВСМА, содержит (i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на около 80% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 65, и/или (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на около 80% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 66. В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент, связывающий антиген ВСМА, содержит (i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 65, и/или (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 66.

В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифические антигенсвязывающие белки по данному изобретению содержат два фрагмента, связывающих антиген CD16A, и два фрагмента, нацеленных на ВСМА, причем: (а) каждый из фрагментов, связывающих антиген CD16A, содержит CDR1 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 73, CDR2 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 74, CDR3 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 75, CDR1 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 76, CDR2 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 77, и CDR3 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 78; и (b) каждый из фрагментов, нацеленных на ВСМА, содержит CDR1 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 67, CDR2 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 68, CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 69, CDR1 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 70, CDR2 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 71, и CDR3 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 72. В некоторых вариантах осуществления изобретения (а) каждый из фрагментов, связывающих антиген CD 16А, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2; и (b) каждый из фрагментов, нацеленных на ВСМА, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 65, и (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 66.

В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифический антигенсвязывающий белок по данному изобретению представляет собой тетрамер, содержащий первый полипептид с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 61, и второй полипептид с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 62. В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифический антигенсвязывающий белок по данному изобретению представляет собой тетрамер, содержащий первый полипептид с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 63, и второй полипептид с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 64.

В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифический антигенсвязывающий белок по данному изобретению содержит два фрагмента, связывающих антиген CD16A, и два фрагмента, связывающих ВСМА, причем: (i) каждый из фрагментов, связывающих антиген CD16A, содержит: (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 73; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 74; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 75, и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 76; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 77; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 78; и (ii) каждый из фрагментов, связывающих антиген ВСМА, содержит: (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 67; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 68; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 69, и (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 70; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 71; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 72.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим биспецифический антигенсвязывающий белок, как описано в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция предназначена для использования в качестве лекарственного препарата.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу лечения и/или профилактики заболевания, который включает введение биспецифического антигенсвязывающего белка или фармацевтической композиции, как описано в данном документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное заболевание представляет собой онкологическое заболевание. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное заболевание представляет собой гемобластоз. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное заболевание представляет собой множественную миелому. В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифический антигенсвязывающий белок вводят внутривенно. В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифический антигенсвязывающий белок вводят подкожно. В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифический антигенсвязывающий белок вводят совместно со вторым способом лечения. В некоторых вариантах осуществления изобретения вторая терапия выбрана из группы, состоящей из способов лечения, включающих антитело к PD-1, способов лечения, включающих антитела к PD-L1, способов лечения, включающих биспецифические антитела к CD3, способов лечения, включающих антитело к TIGIT, способов лечения, включающих антитело к VEGF, и способов лечения, включающих антитело к FcRH5. В некоторых вариантах осуществления изобретения вторая терапия представляет собой терапию с использованием цитокинов. В некоторых вариантах осуществления изобретения терапия с использованием цитокинов представляет собой введение цитокина, выбранного из группы, состоящей из ИЛ-15, ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-21, ИЛ-17, ИЛ-18, ИЛ-23, ИЛ-27 и ИЛ-6. В некоторых вариантах осуществления изобретения цитокин представляет собой ИЛ-15. В некоторых вариантах осуществления изобретения цитокин представляет собой ИЛ-2. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект представляет собой пациента с онкологическим заболеванием. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект представляет собой пациента с гемобластозом. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект представляет собой пациента с множественной миеломой. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект представляет собой пациента с рецидивирующей/рефрактерной множественной миеломой. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект получает терапию с использованием антител к CD38. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект получает даратумумаб. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект ранее не получал лечение даратумумабом, резистентный к даратумумабу, рефрактерный к даратумумабу или имеет рецидив после лечения даратумумабом. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект резистентный к даратумумабу, рефрактерный к даратумумабу или имеет рецидив после лечения даратумумабом. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект демонстрирует полиморфизм CD16A. В некоторых вариантах осуществления изобретения полиморфизм CD16A представляет собой полиморфизм CD16A-158V/F.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к мультиспецифическому антигенсвязывающему белку, описанному в данном документе, или биспецифическому антигенсвязывающему белку, описанному в данном документе, причем мультиспецифический антигенсвязывающий белок или биспецифический антигенсвязывающий белок не вызывают деплецию или не сокращают в значительной степени популяцию естественных клеток-киллеров (NK-клеток) у субъекта при введении указанному субъекту.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к способу лечения субъекта, у которого истощена или сокращена популяция NK-клеток, включающему введение мультиспецифического антигенсвязывающего белка, как описано в данном документе, или биспецифического антигенсвязывающего белка, как описано в данном документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения для лечения субъекта ранее применяли терапию с использованием антител к cd38. В некоторых вариантах осуществления изобретения терапия с использованием антител к cd38 представляет собой терапию даратумумабом.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к биспецифическому антигенсвязывающему белку, содержащему два фрагмента, связывающих антиген CD16A, и два фрагмента, нацеленных на ВСМА, причем каждый из двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, слит с С-концом каждой тяжелой цепи IgG, и каждый из двух фрагментов, нацеленных на ВСМА, слит с N-концом каждой из тяжелых цепей IgG, и при этом: (i) каждый из фрагментов, связывающих антиген CD16A, содержит: (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 73; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 74; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 75, и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 76; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 77; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 78; и (ii) каждый из фрагментов, связывающих антиген ВСМА, содержит: (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 67; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 68; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 69, и (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 70; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 71; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 72.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к способам лечения онкологического заболевания у субъекта, включающим введение субъекту биспецифического антигенсвязывающего белка, содержащего два фрагмента, связывающих антиген CD16A, и два фрагмента, нацеленных на ВСМА, причем каждый из двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, слит с С-концом каждой тяжелой цепи IgG, и каждый из двух фрагментов, нацеленных на ВСМА, слит с N-концом каждой из тяжелых цепей IgG, и при этом: (i) каждый из фрагментов, связывающих антиген CD16A, содержит: (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 73; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 74; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 75, и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 76; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 77; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 78; и (ii) каждый из фрагментов, связывающих антиген ВСМА, содержит: (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 67; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 68; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 69, и (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 70; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 71; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 72. В некоторых вариантах осуществления изобретения онкологическое заболевание представляет собой множественную миелому.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к антителу или антигенсвязывающему белку, который связывается с или способен к связыванию с CD16A и ВСМА, содержащему: (i) первую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 73; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 74; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 75, (ii) первую вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 76; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 77; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 78; (iii) вторую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 67; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 68; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 69, и (iv) вторую вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 70; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 71; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 72. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или антигенсвязывающий белок, который связывается с или способен к связыванию с CD16A и ВСМА, содержит: (i) первую вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3; (ii) первую вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2; (iii) вторую вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 65; (iv) вторую вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 66; (v) первую вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и первую вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2; (vi) вторую вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 65, и вторую вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 66; или (vii) первую вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3; и первую вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2; и вторую вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 65, и вторую вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 66. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или антигенсвязывающий белок, который связывается или способен к связыванию с CD16A и ВСМА, как описано в данном документе, не связывается с CD16B. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или антигенсвязывающий белок, который связывается или способен к связыванию с CD16A и ВСМА, как описано в данном документе, не вызывают деплецию или не сокращают в значительной степени популяцию естественных клеток-киллеров (NK-клеток) у субъекта при введении субъекту. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или антигенсвязывающий белок, который связывается или способен к связыванию с CD16A и ВСМА, как описано в данном документе, связывается с CD16A человека. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или антигенсвязывающий белок, который связывается или способен к связыванию с CD16A и ВСМА, как описано в данном документе, связывается с ВСМА человека.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело или антигенсвязывающий белок, который связывается с или способен к связыванию с CD16A и ВСМА, как описано в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или антигенсвязывающий белок, который связывается или способен к связыванию с CD16A и ВСМА, как описано в данном документе, предназначен для использования в качестве лекарственного препарата.

143. В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к способу лечения и/или профилактики заболевания, причем способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, антитела или антигенсвязывающего белка, который связывается с или способен связываться с CD16A и ВСМА, как описано в данном документе, или фармацевтической композиции, содержащей антитело или антигенсвязывающий белок, который связывается с или способен связываться с CD16A и ВСМА, как описано в данном документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание представляет собой онкологическое заболевание. В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание представляет собой гемобластоз. В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание представляет собой множественную миелому. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или антигенсвязывающий белок вводят внутривенно. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или антигенсвязывающий белок вводят подкожно. В некоторых вариантах осуществления лечение и/или профилактика заболевания, причем способ включает введение антитела или антигенсвязывающего белка, который связывается с или способен связываться с CD16A и ВСМА, как описано в данном документе, или фармацевтической композиции, содержащей антитело или антигенсвязывающий белок, который связывается с или способен связываться с CD16A и ВСМА, как описано в данном документе, включают применение второго вида терапии. В некоторых вариантах осуществления изобретения вторая терапия выбрана из группы, состоящей из способов лечения, включающих антитело к PD-1, способов лечения, включающих антитела к PD-L1, способов лечения, включающих биспецифические антитела к CD3, способов лечения, включающих антитело к TIGIT, способов лечения, включающих антитело к VEGF, и способов лечения, включающих антитело к FcRH5. В некоторых вариантах осуществления изобретения вторая терапия представляет собой терапию с использованием цитокинов. В некоторых вариантах осуществления изобретения терапия с использованием цитокинов представляет собой введение цитокина, выбранного из группы, состоящей из ИЛ-15, ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-21, ИЛ-17, ИЛ-18, ИЛ-23, ИЛ-27 и ИЛ-6. В некоторых вариантах осуществления изобретения цитокин представляет собой ИЛ-15. В некоторых вариантах осуществления изобретения цитокин представляет собой ИЛ-2. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект представляет собой пациента с онкологическим заболеванием. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект представляет собой пациента с гемобластозом. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект представляет собой пациента с множественной миеломой. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект представляет собой пациента с рецидивирующей/рефрактерной множественной миеломой. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект получает терапию с использованием антител к CD38. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект получает даратумумаб. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект ранее не получал лечение даратумумабом, резистентный к даратумумабу, рефрактерный к даратумумабу или имеет рецидив после лечения даратумумабом. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект резистентный к даратумумабу, рефрактерный к даратумумабу или имеет рецидив после лечения даратумумабом. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект демонстрирует полиморфизм CD16A. В некоторых вариантах осуществления изобретения полиморфизм CD16A представляет собой полиморфизм CD16A-158V/F.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к способу лечения субъекта, у которого истощена или сокращена популяция NK-клеток, включающему введение антитела или антигенсвязывающего белка, который связывается с или способен связываться с CD16A и ВСМА, как описано в данном документе, или фармацевтической композиции, содержащей антитело или антигенсвязывающий белок, который связывается с или способен связываться с CD16A и ВСМА, как описано в данном документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения для лечения субъекта ранее применяли терапию с использованием антител к CD38. В некоторых вариантах осуществления изобретения терапия с использованием антител к CD38 представляет собой терапию даратумумабом.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к антителу или антигенсвязывающему белку, содержащему по меньшей мере одно плечо, которое связывается с или способно связываться с CD16A, и по меньшей мере одно плечо, которое связывается с или способно связываться с ВСМА, причем: (i) по меньшей мере одно плечо, которое связывается с или способно связываться с CD16A, содержит: (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 73; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 74; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 75, и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 76; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 77; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 78; и (ii) по меньшей мере одно плечо, которое связывается с или способно связываться с ВСМА, содержит: (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 67; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 68; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 69, и (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 70; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 71; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 72. В некоторых из таких вариантов осуществления изобретения по меньшей мере одно плечо, которое связывается с или способно связываться с CD16A, отличается от по меньшей мере одного плеча, которое связывается или способно связываться с ВСМА. В некоторых из таких вариантов осуществления: (i) по меньшей мере одно плечо, которое связывается или способно связываться с CD16A, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3; (ii) по меньшей мере одно плечо, которое связывается или способно связываться с CD16A, содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2; (iii) по меньшей мере одно плечо, которое связывается или способно связываться с ВСМА, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 65; (iv) по меньшей мере одно плечо, которое связывается или способно связываться с ВСМА, содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 66; (v) по меньшей мере одно плечо, которое связывается или способно связываться с CD16A, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2; (vi) по меньшей мере одно плечо, которое связывается или способно связываться с ВСМА, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 65, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 66; или (vii) по меньшей мере одно плечо, которое связывается или способно связываться с CD16A, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2; и по меньшей мере одно плечо, которое связывается или способно связываться с ВСМА, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 65, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 66. В некоторых из таких вариантов осуществления изобретения антитело или антигенсвязывающий белок не связывается с CD16B. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или антигенсвязывающий белок не вызывают деплецию или не сокращают в значительной степени популяцию естественных клеток-киллеров (NK-клеток) у субъекта при введении указанному субъекту. В некоторых из таких вариантов осуществления изобретения антитело или антигенсвязывающий белок связывается с CD16A человека. В некоторых из таких вариантов осуществления изобретения антитело или антигенсвязывающий белок связывается с ВСМА человека.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело или антигенсвязывающий белок, содержащий по меньшей мере одно плечо, которое связывается с или способно связываться с CD16A, и по меньшей мере одно плечо, которое связывается с или способно связываться с ВСМА, как описано в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к антителу или антигенсвязывающему белку, содержащему по меньшей мере одно плечо, которое связывается с или способно связываться с CD16A, и по меньшей мере одно плечо, которое связывается с или способно связываться с ВСМА, для использования в качестве лекарственного препарата.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к способу лечения и/или профилактики заболевания, который включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, антитела или антигенсвязывающего белка, содержащего по меньшей мере одно плечо, которое связывается или способно связываться с CD16A, и по меньшей мере одно плечо, которое связывается или способно связываться с ВСМА, как описано в данном документе, или фармацевтической композиции, содержащей такое антитело или антигенсвязывающий белок. В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание представляет собой онкологическое заболевание. В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание представляет собой гемобластоз. В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание представляет собой множественную миелому. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или антигенсвязывающий белок вводят внутривенно. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или антигенсвязывающий белок вводят подкожно. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ лечения и/или профилактики заболевания, который включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, антитела или антигенсвязывающего белка, содержащего по меньшей мере одно плечо, которое связывается или способно связываться с CD16A, и по меньшей мере одно плечо, которое связывается или способно связываться с ВСМА, как описано в данном документе, или фармацевтической композиции, содержащей такое антитело или антигенсвязывающий белок, включает применение второго вида терапии. В некоторых вариантах осуществления изобретения вторая терапия выбрана из группы, состоящей из способов лечения, включающих антитело к PD-1, способов лечения, включающих антитела к PD-L1, способов лечения, включающих биспецифические антитела к CD3, способов лечения, включающих антитело к TIGIT, способов лечения, включающих антитело к VEGF, и способов лечения, включающих антитело к FcRH5. В некоторых вариантах осуществления изобретения вторая терапия представляет собой терапию с использованием цитокинов. В некоторых вариантах осуществления изобретения терапия с использованием цитокинов представляет собой введение цитокина, выбранного из группы, состоящей из ИЛ-15, ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-21, ИЛ-17, ИЛ-18, ИЛ-23, ИЛ-27 и ИЛ-6. В некоторых вариантах осуществления изобретения цитокин представляет собой ИЛ-15. В некоторых вариантах осуществления изобретения цитокин представляет собой ИЛ-2. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект представляет собой пациента с онкологическим заболеванием. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект представляет собой пациента с гемобластозом. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект представляет собой пациента с множественной миеломой. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект представляет собой пациента с рецидивирующей/рефрактерной множественной миеломой. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект получает терапию с использованием антител к CD38. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект получает даратумумаб. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект ранее не получал лечение даратумумабом, резистентный к даратумумабу, рефрактерный к даратумумабу или имеет рецидив после лечения даратумумабом. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект резистентный к даратумумабу, рефрактерный к даратумумабу или имеет рецидив после лечения даратумумабом. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект демонстрирует полиморфизм CD16A. В некоторых вариантах осуществления изобретения полиморфизм CD16A представляет собой полиморфизм CD16A-158V/F. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ включает лечение субъекта, у которого истощена или сокращена популяция NK-клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения для лечения субъекта ранее применяли терапию с использованием антител к CD38. В некоторых вариантах осуществления изобретения терапия с использованием антител к CD38 представляет собой терапию даратумумабом.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к антителу или антигенсвязывающему белку, который связывается с или способен к связыванию с ВСМА, содержащему: (i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 67; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 68; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 69, и (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 70; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 71; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 72. В некоторых вариантах осуществления изобретения ВСМА представляет собой ВСМА человека. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или антигенсвязывающий белок содержат по меньшей мере одно плечо, которое связывается или способно к связыванию с CD16A. В некоторых вариантах осуществления изобретения CD16A представляет собой CD16A человека. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одно плечо, которое связывается с или способно связываться с CD16A, содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 73; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 74; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 75, и (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 76; CDR2 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 77; и CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 78. В некоторых таких вариантах осуществления изобретения антитело или антигенсвязывающий белок, который связывается с или способен к связыванию с ВСМА, содержит: (i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3; (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2; (iii) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 65; (iv) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 66; (v) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2; (vi) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 65, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 66; или (vii) первую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3; первую вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2; и вторую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 65, и вторую вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 66.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело или антигенсвязывающий белок, который связывается с или способен к связыванию с ВСМА, как раскрыто в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к антителу или антигенсвязывающему белку, который связывается с или способен к связыванию с ВСМА, как описано в данном документе, для использования в качестве лекарственного препарата.

В некоторых вариантах осуществления данное изобретение относится к способам лечения и/или профилактики заболевания, которые включают введение субъекту, нуждающемуся в этом, антитела или антигенсвязывающего белка, который связывается или способен к связыванию с ВСМА, или фармацевтической композиции, содержащей то же самое. В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание представляет собой онкологическое заболевание. В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание представляет собой гемобластоз. В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание представляет собой множественную миелому. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или антигенсвязывающий белок вводят внутривенно. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или антигенсвязывающий белок вводят подкожно. В некоторых вариантах осуществления изобретения способы лечения и/или профилактики заболевания, которые включают введение субъекту, нуждающемуся в этом, антитела или антигенсвязывающего белка, который связывается или способен к связыванию с ВСМА, или фармацевтической композиции, содержащей то же самое, включают применение второго вида терапии. В некоторых вариантах осуществления изобретения вторая терапия выбрана из группы, состоящей из способов лечения, включающих антитело к PD-1, способов лечения, включающих антитела к PD-L1, способов лечения, включающих биспецифические антитела к CD3, способов лечения, включающих антитело к TIGIT, способов лечения, включающих антитело к VEGF, и способов лечения, включающих антитело к FcRH5. В некоторых вариантах осуществления изобретения вторая терапия представляет собой терапию с использованием цитокинов. В некоторых вариантах осуществления изобретения терапия с использованием цитокинов представляет собой введение цитокина, выбранного из группы, состоящей из ИЛ-15, ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-21, ИЛ-17, ИЛ-18, ИЛ-23, ИЛ-27 и ИЛ-6. В некоторых вариантах осуществления изобретения цитокин представляет собой ИЛ-15. В некоторых вариантах осуществления изобретения цитокин представляет собой ИЛ-2. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект представляет собой пациента с онкологическим заболеванием. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект представляет собой пациента с гемобластозом. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект представляет собой пациента с множественной миеломой. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект представляет собой пациента с рецидивирующей/рефрактерной множественной миеломой. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект получает терапию с использованием антител к CD38. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект получает даратумумаб. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект ранее не получал лечение даратумумабом, резистентный к даратумумабу, рефрактерный к даратумумабу или имеет рецидив после лечения даратумумабом. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект резистентный к даратумумабу, рефрактерный к даратумумабу или имеет рецидив после лечения даратумумабом. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект демонстрирует полиморфизм CD16A. В некоторых вариантах осуществления изобретения полиморфизм CD16A представляет собой полиморфизм CD16A-158V/F. В некоторых вариантах осуществления изобретенияантитело или антигенсвязывающий белок вводят субъекту, у которого истощена или сокращена популяция NK-клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения для лечения субъекта ранее применяли терапию с использованием антител к CD38. В некоторых вариантах осуществления изобретения терапия с использованием антител к CD38 представляет собой терапию даратумумабом.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1. Конструкция фрагмента, связывающего антиген ВСМА

Для создания антигенсвязывающих фрагментов фрагменты антител с селективным связыванием с выбранным целевым антигеном можно выделять из библиотеки человеческих антител путем экспрессии и отображения одноцепочечных доменов Fv (scFv) на филаментном фаге слияния и обогащения частицами фага, кодирующими scFv, демонстрирующий целевое связывание, путем пэннинга на рекомбинанатный целевой антиген или целевые антиген-положительные клетки, как описано, например, в Smith GP (Science, 1985, 228: 1315-7) и Clackson et al. (Nature, 1991, 352: 624-8). Для выделения фрагментов антител, связывающих ВСМА, можно использовать рекомбинантные ВСМА(1-54)-Fc человека, BCMA(1-53)-Fc яванского макака и клетки СНО, стабильно экспрессирующие закрепленный на поверхности клетки ВСМА(1-54) человека или ВСМА(1-53) яванского макака, слитые с трансмембранной областью и цитоплазматическим доменом CD3-зета человека в последовательных циклах пэннинга для обогащения связывающих частиц фага. Для этого частицы фага инкубируют с рекомбинантным антигеном слияния Fc, например, в течение 2 ч при комнатной температуре с последующим захватом шариками, покрытыми белком G, и промыванием в ФСБ-твин и ФСБ для удаления несвязанного фага. Связанный фаг элюируют глицином. Для обогащения связывающим фагом на клетках-мишенях, экспрессирующих антиген, фаг инкубируют со стабильно трансфектированными клетками СНО, например, в течение 1 ч при комнатной температуре с последующим промыванием средой для культивирования клеток и элюированием связанного фага глицином. Для уменьшения обогащения частицами фага, кодирующими фрагменты антител с селективным связыванием с Fc или нетрансфектированными клетками СНО, фаговые пулы инкубируют с несоответствующим антигеном слияния Fc или антиген-отрицательными клетками-мишенями СНО. После каждого цикла пэннинга и элюирования связанного фага элюированные частицы фага используют для инфицирования E.coli (XL1 Blue) и репродуцирования фага и scFv-кодирующей ДНК. После нескольких циклов пэннинга фага и репродуцирования обогащенных клонов фага из E.coli выделяют ДНК и повторно клонируют в бактериальные экспрессионные векторы, например pSKK2, с использованием стандартных способов молекулярной биологии для последующей выработки меченых His (SEQ ID NO: 59) фрагментов антитела scFv в E.coli получения бактериальных периплазматических экстрактов. Периплазматические экстракты, содержащие фрагменты антител scFv, подвергают методам скриннинга, таким как ELISA или проточная цитометрия, чтобы оценить связывание целевого антигена. Например, рекомбинантный BCMA(1-54)-Fc человека или BCMA(1-53)-Fc яванского макака связывают с антителом к Fc человека, нанесенным на стандартные микролуночные планшеты для ELISA, с последующей инкубацией с бактериальными периплазматическими экстрактами и интенсивным промыванием. Связывание scFv обнаруживают с использованием конъюгата к His-HRP. Для оценки связывания scFv с экспрессируемым клетками ВСМА бактериальные периплазматические экстракты инкубируют с рекомбинантными клетками СНО, экспрессирующими прикрепленный к поверхности клетки ВСМА человека или яванского макака, с последующим промыванием и обнаружением связанного scFv с использованием анти-His-R-PE с помощью проточной циометрии. Плазмиды, кодирующие фрагменты антител scFv с селективным связыванием с антигеном ВСМА человека и/или яванского макака, выделяют из соответствующих бактериальных клонов и анализируют секвенированием ДНК, чтобы получить последовательности ДНК, кодирующие scFv. Например, получен фрагмент, связывающий антиген ВСМА, с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 39, причем VH представлена в SEQ ID NO: 37, a VL предсталена в SEQ ID NO: 38. ПРИМЕР 2. Получение различных антигенсвязывающих белковых каркасов

2.1 scDb-mFc (Фиг. 1 и Фиг. 2):

scDb-mFc относится к антигенсвязывающему белку, который является мономерным и содержит двухвалентный фрагмент, связывающий антиген CD16A, в формате scDb, слитый с мономерным участком Fc. scDb, состоящий из двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, слито с N-концом участка Fc, который состоит из варианта полипептида СН2-СН3, и scFv, состоящий из одного фрагмента, связывающего целевой антиген, слит с С-концом участка Fc (Фиг. 1), или scDb, состоящий из двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, слито с С-концом участка Fc, который состоит из варианта полипептида СН2-СН3, и scFv, состоящий из одного фрагмента, связывающего целевой антиген, слит с N-концом участка Fc (Фиг. 2).

Для экспрессии антигенсвязывающего белка scDb-mFc в клетках СНО кодирующую последовательность молекулы клонировали в экспрессионную векторную систему на основе клеток млекопитающих. Кратко, генные последовательности, кодирующие домены Fv к ТАА (опухолеассоцированный антиген), и домены Fv к CD16A (SEQ ID NO: 1-13) в формате scFv, связанные с генными последовательностями, кодирующими короткие пептидные линкеры (SEQ ID NO: 16-18) в scFv, синтезировали с использованием Invitrogen GeneArt, Thermo Fisher Scientific (Регенсбург, Германия). С соответствующими праймерами создавали ПЦР-ампликоны различных вариабельных доменов и мономерного участка Fc, содержащего точечные сайленс-мутации (SEQ ID NO: 30). После этого различные перекрывающиеся фрагменты ДНК и и линеаризованный вектор остова объединяли вместе в одной изотермической реакции. Экспрессионную конструкцию scDb-mFc разрабатывали так, чтобы она содержала кодирующие последовательности для N-концевого сигнального пептида для облегчения секреции антитела и участка Fc для облегчения секреции и очистки антитела, соответственно. Последовательности всех конструкций были подтверждены с помощью секвенирования ДНК в GATC (Кельн, Германия) с использованием изготовленных по заказу праймеров. Экспрессионную кассету для scDb-mFc клонируют так, что домены к CD16A располагаются на N- или С-конце мономерного участка Fc и связаны соединительной последовательностью (SEQ ID NO: 19-22) в следующих возможных порядках:

1.) VL(CD16A)-L1-VH(CD16A)-L2-VL(CD16A)-L1-VH(CD16A)

2.) VH(CD16A)-L1-VL(CD16A)-L3-VH(CD16A)-L1-VL(CD16A)

3.) VL(CD16A)-L4-VL(CD16A)-L3-VH(CD16A)-L4-VH(CD16A)

4.) VH(CD16A)-L4-VH(CD16A)-L2-VL(CD16A)-L4-VL(CD16A)

В структурах антигенсвязывающих белков scDb-mFc 01, scDb-mFc 02, scDb-mFc_05 и scDb-mFc_06, SEQ ID NO: 16 используется для линкера L1, SEQ ID NO: 17 используется для линкера L2, и SEQ ID NO: 18 используется для L3. E структурах антигенсвязывающих белков scDb-mFc_03, _scDb-mFc_04, _ scDb-mFc_07 and scDb-mFc_08 SEQ ID NO: 60 используется для линкера L4, SEQ ID NO: 17 используется для линкера L2, и SEQ ID NO: 18 используется для L3.

2.2 KiH-scDb-Fc (Фиг. 3-6):

Антигенсвязывающий белок KiH-scDb-Fc является гетеродимерным и содержит двухвалентный фрагмент, связывающий антиген CD16A, в формате scDb, слитый с гетеродимерным участком Fc (KiH). Один фрагмент, связывающий целевой антиген, обеспечивается scFv.

Экспрессионную конструкцию ДНК, кодирующую KiH-scDb-Fc, получают путем клонирования кодирующих последовательностей доменов Fv к CD16A (SEQ ID NO: 1-13) в модифицированный экспрессионный вектор на основе клеток млекопитающих, содержащий CMV-контролируемые экспрессионные кассеты, в том числе константные домены СН2 и СН3 IgG1 с сайленсингом Fc и точечными мутациями «выступы-во-впадины» (SEQ ID NO: 31, 32) для совместной экспресии двух генных кассет из одного и того же вектора. Мутации «выступы-во-впадины» позволяют получать гетеродимерные трехвалентные биспецифические (Фиг. 3-5) или четырехвалентные триспецифические (Фиг. 6) конструкции слияния с Fc. После этого получали ПЦР-ампликоны изгенных последовательностей, кодирующих домены Fv к ТАА (опухолеассоциированный антиген), с соответствующими праймерами. Полученные перекрывающиеся фрагменты ДНК встраивали в коэкспрессионный вектор в подходящее положение. Все необходимые генные последовательности, кодирующие вариабельные домены и константные домены, содержащие сайленсинг Fc и точечные мутации «выступы-во-впадины», синтезировали с использованием Invitrogen GeneArt, Thermo Fisher Scientific (Регенсбург, Германия). Экспрессионную конструкцию KiH-scDb-Fc разрабатывали так, чтобы она содержала кодирующие последовательности для N-концевых сигнальных пептидов, С-тэга и/или His-тэга (6×His) для облегчения секреции и очистки антитела, соответственно. Последовательности всех конструкций были подтверждены с помощью секвенирования ДНК в GATC (Кельн, Германия) с использованием изготовленных по заказу праймеров. Экспрессионные кассеты для конструкций KiH-scDb-Fc клонируют так, что фрагменты, связывающие антиген CD16A, располагаются на N-конце гетеродимерного участка Fc и связаны с помощью соединительной группы (SEQ ID NO: 19-22) и шарнирной области (SEQ ID NO: 23) или средней шарнирной области (SEQ ID NO: 24) или на С-конце гетеродимерного участка Fc и связаны соединительной группой (SEQ ID NO: 19-22) только в следующих возможных порядках:

1.) VL(CD16A)-L1-VH(CD16A)-L2-VL(CD16A)-L1-VH(CD16A)

2.) VH(CD16A)-L1-VL(CD16A)-L3-VH(CD16A)-L1-VL(CD16A)

3.) VL(CD16A)-L4-VL(CD16A)-L3-VH(CD16A)-L4-VH(CD16A)

4.) VH(CD16A)-L4-VH(CD16A)-L2-VL(CD16A)-L4-VL(CD16A)

SEQ ID NO: 16 используется для линкера L1, SEQ ID NO: 17 используется для линкера L2, SEQ ID NO: 18 используется для линкера L3, и SEQ ID NO: 60 используется для линкера L4.

Примеры таких антигенсвязывающих белков представляют собой KiH-scDb-Fc_08 и KiH-scDb-Fc_12, которые содержат следующую структуру от N- до С-конца:

Первая полипептидная цепь V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-средняя шарнирная область-СН2-СН3 и вторая полипептидная цепь шарнирная область -СН2-СН3-V_H(мишень)-V_L(мишень) (Фиг. 3); или первая полипептидная цепь средняя шарнирная область -СН2-СН3-V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-V_L(CD16A)-V_H(CD16A) и второй полипептид V_H(мишень)-V_L(мишень)-шарнирная область-СН2-СН3 (Фиг. 5).

2.3 scDb-TriBs или scDb-TriBs-scFv

scDb-TriBs представляет собой антигенсвязывающий белок, который является гетеродимерным фрагментом Fab, содержащим фрагменты, связывающие антиген CD16A, целевой антиген и антиген HSA, причем антигенсвязывающие фрагменты или обеспечиваются двумя scDb, слитыми с С-концом фрагмента Fab (Фиг. 7), или scDb, содержащее два фрагмента, связывающих антиген CD16A, и scFv, содержащее фрагмент, связывающий целевой антиген, слиты с С-концом фрагмента Fab (Фиг. 8).

Экспрессионную конструкцию ДНК, кодирующую scDb-TriBs(-scFv), получают путем клонирования кодирующих последовательностей доменов Fv к HSA (SEQ ID NO: 14, 15) в модифицированный экспрессионный вектор на основе клеток млекопитающих, содержащий CMV-контролируемые экспрессионные кассеты, в том числе только константные домены тяжелой и легкой цепей участка Fab (SEQ ID NO: 33-35) со слияниями и для совместной экспресии двух генных кассет из одного и того же вектора. После этого получали ПЦР-ампликоны изгенных последовательностей, кодирующих домены Fv к ТАА (опухолеассоциированный антиген), и домены Fv к CD16A (SEQ ID NO: 1-13), с соответствующими праймерами. Полученные перекрывающиеся фрагменты ДНК встраивали в коэкспрессионный вектор в подходящее положение. Все необходимые генные последовательности, кодирующие вариабельные домены и только константные домены участка Fab, синтезированы с использованием Invitrogen GeneArt, Thermo Fisher Scientific (Регенсбург, Германия). Экспрессионную конструкцию scDb-TriBs(-scFv) разрабатывали так, чтобы она содержала кодирующие последовательности для N-концевых сигнальных пептидов, С-тэга и/или His-тэга (6×His) для облегчения секреции и очистки антитела, соответственно. Последовательности всех конструкций были подтверждены с помощью секвенирования ДНК в GATC (Кельн, Германия) с использованием изготовленных по заказу праймеров. Экпрессионные кассеты для конструкций scDb-TriBs(-scFv) клонируют так, что домены к CD16A располагаются на С-конце CL или CH1 Fab, связанного соединительной группой (SEQ ID NO: 19-22) с тяжелой или легкой цепью Fab в следующем возможном порядке:

1.) VL(CD16A)-L1-VH(CD16A)-L2-VL(CD16A)-L1-VH(CD16A)

2.) VL(CD16A)-L1-VL(CD16A)-L2-VH(CD16A)-L1-VH(CD16A)

Пример такого антигенсвязывающего белка представляет собой scDb-TriB-scFv 01, который содержит следующую структуру от N- до С-конца: Первая полипептидная цепь V_H(HSA)-CH1-V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-V_L(CD16A)-V_H(CD16A) и вторая полипептидная цепь V_L(HSA)-CL-V_H(мишень)-V_L(мишень) (Фиг. 8). SEQ ID NO: 16 используется для линкера L1, и SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 18 используется для линкера L2.

2.4 Db-Fc (Фиг. 9-10):

Db-Fc представляет собой антигенсвязывающий белок, который является гомодимерным и содержит двухвалентный фрагмент, связывающий антиген CD16A, в формате Db, слитый с шарнирной областью на N-конце гомодимерного участка Fc (СН2-СН3), и два фрагмента, связывающих целевой антиген, в формате scFv, слитые с другим концом участка Fc. Для экспрессии антигенсвязывающего белка Db-Fc в клетках СНО кодирующую последовательность молекулы клонировали в экспрессионную векторную систему на основе клеток млекопитающих. Кратко, генные последовательности, кодирующие домены Fv к ТАА (опухолеассоцированный антиген), и домены Fv к CD16A (SEQ ID NO: 1-13), связанные коротким пептидным линкером (SEQ ID NO: 16), синтезировали с использованием Invitrogen GeneArt, Thermo Fisher Scientific (Регенсбург, Германия). С соответствующими праймерами создавали ПЦР-ампликоны различных вариабельных доменов и участка Fc, содержащего точечные сайленс-мутации (SEQ ID NO: 29). После этого различные перекрывающиеся фрагменты ДНК и и линеаризованный вектор остова объединяли в одной изотермической реакции. Экспрессионную конструкцию Db-Fc разрабатывали так, что она содержала последовательность N-концевого сигнального пептида для облегчения секреции антитела. Последовательности всех конструкций были подтверждены с помощью секвенирования ДНК в GATC (Кельн, Германия) с использованием изготовленных по заказу праймеров. Экспрессионную кассету для Db-Fc клонируют так, что домены к CD16A расположены от N-конца до С-конца гомодимерного участка Fc (СН2-СН3), связанного соединительной группой (SEQ ID NO: 19-22) со средней шарнирной областью (SEQ ID NO: 24) или соединительной группой (SEQ ID NO: 19-22) с С-концом СН3 только в следующих возможных порядках:

1.) VL(CD16A)-L1-VH(CD16A)

2.) VH(CD16A)-L1-VL(CD16A)

Примеры таких антигенсвязывающих белков представляют собой Db-Fc_02 и Db-Fc_04, которые имеют следующую структуру от N- до С-конца: V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-средняя шарнирная область-СН2-СН3-V_H(мишень)-V_L(мишень) (Фиг. 9); или V_H(мишень)-V_L(мишень)-средняя шарнирная область-CH2-CH3-V_L(CD16A)-V_H(CD16A) (Фиг. 10). SEQ ID NO: 16 используется для линкера L1.

2.5 Би-scFv-Fc (Фиг. 11-12):

Би-scFv-Fc представляет собой гомодимерный и тетравалентный антигенсвязывающий белок, содержащий два фрагмента, связывающих антиген CD16A, и два фрагмента, связывающих целевой антиген, каждый в формате scFv, слитых с гомодимером Fc.

Для экспрессии антигенсвязывающего белка би-scFv-Fc в клетках СНО кодирующую последовательность молекулы клонировали в экспрессионную векторную систему на основе клеток млекопитающих. Кратко, генные последовательности, кодирующие домены Fv к ТАА (опухолеассоцированный антиген), и домены Fv к CD16A (SEQ ID NO: 1-13), которые связаны короткими пептидными линкерами (SEQ ID N0:17-18), синтезировали с использованием GeneArt, Thermo Fisher Scientific (Регенсбург, Германия). С соответствующими праймерами создавали ПЦР-ампликоны различных вариабельных доменов и участка Fc, содержащего точечные сайленс-мутации (SEQ ID NO: 29), или участка Fc дикого типа (SEQ ID NO: 36). После этого различные перекрывающиеся фрагменты ДНК и и линеаризованный вектор остова объединяли вместе в одной изотермической реакции. Экспрессионную конструкцию би-scFv-Fc разрабатывали так, чтобы она содержала кодирующие последовательности для N-концевого сигнального пептида и участка Fc для облегчения секреции и очистки антитела, соответственно. Последовательности всех конструкций были подтверждены с помощью секвенирования ДНК в GATC (Кельн, Германия) с использованием изготовленных по заказу праймеров. Экспрессионную кассету для би-scFv-Fc клонируют так, что домены к CD16A расположены на N-конце участка Fc, связанного соединительной группой (SEQ ID NO: 19-22) с шарнирной областью (SEQ ID NO: 23), или на С-конце участка Fc, связанного соединительной группой (SEQ ID NO: 19-22) с СН3, только в следующих возможных порядках:

1.) VL(CD16A)-L3-VH(CD16A)

2.) VH(CD16A)-L2-VL(CD16A)

Примеры таких антигенсвязывающих белков представляют собой би-scFv-Fc_27 и би-scFv-Fc_26, которые содержат следующую структуру от N- до С-конца: V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-шарнирная область-СН2-СН3-V_H(мишень)-V_L(мишень) (Фиг. 11); или V_H(мишень)-V_L(мишень)-шарнирная область-СН2-CH3-V_L(CD16A)-V_H(CD16A) (Фиг. 12). SEQ ID NO: 17 используется для линкера L2, и SEQ ID NO: 18 используется для линкера L3.

2.6 scFv-IgAb (Фиг. 13):

Антигенсвязывающий белок scFv-IgAb содержит антитело IgG и два фрагмента, связывающих антиген CD16A, в формате scFvs, причем каждый фрагмент scFv, связывающий антиген CD16A, слит с С-концом одной из Н-цепей, и два фрагмента, связывающих целевой антиген, обеспечиваются каждым Fv в плечах Fab IgG.

Экспрессионную конструкцию ДНК, кодирующую scFv-IgAb, получают клонированием кодирующих последовательностей доменов Fv к ТАА в модифицированный экспрессионный вектор на основе клеток млекопитающих, содержащий CMV-контролируемые экспрессионные кассеты, в том числе константные домены тяжелой и легкой цепей с точечными сайленс-мутациями Fc (SEQ ID NO: 25, 27-28) или с участком Fc дикого типа (SEQ ID NO: 26-28), для совместной экспрессии обеих генных кассет из одного и того же вектора. После этого с соответствующими праймерами получали ампликоны ПЦР из генных последовательностей, кодирующих домены Fv к CD16A (SEQ ID NO: 1-13), разделенные короткими пептидными линкерами (SEQ ID NO: 17-18). Полученный перекрывающийся фрагмент ДНК встраивали в коэкспрессионный вектор в подходящее положение. Все необходимые генные последовательности, кодирующие вариабельные домены и константные домены, содержащие точечные сайленс-мутации Fc, синтезировали с использованием Invitrogen GeneArt, Thermo Fisher Scientific (Регенсбург, Германия). Экспрессионную конструкцию scFv-IgAb разрабатывали так, чтобы она содержала кодирующие последовательности для N-концевых сигнальных пептидов и участка Fc для облегчения секреции и очистки антитела, соответственно. Последовательности всех конструкций были подтверждены с помощью секвенирования ДНК в GATC (Кельн, Германия) с использованием изготовленных по заказу праймеров. Экспрессионную кассету для scFv-IgAb клонируют так, что домены к CD16A располагаются на С-конце участка Fc, связанного соединительной группой (SEQ ID NO: 19-22), в следующих возможных порядках:

1.) VL(CD16A)-L3-VH(CD16A)

2.) VH(CD16A)-L2-VL(CD16A)

Пример такого антигенсвязывающего белка представляет собой scFv-IgAb_30, который содержит следующую структуру от N- до С-конца:

Первая полипептидная цепь V_H(мишень)-СН1-шарнирная область-СН2-CH3-V_L(CD16A)-V_H(CD16A) и вторая полипептидная цепь V_L(мишень)-CL (Фиг. 13). SEQ ID NO: 17 используется для линкера L2, и SEQ ID NO: 18 используется для линкера L3.

2.7 Би-scFv-IgAb (Фиг. 14):

Антигенсвязывающий белок би-scFv-IgAb содержит антитело IgG и четыре антигенсвязывающих фрагмента scFv, слитых с ним, причем каждый из двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, в формате scFv, слит с С-концом одной из двух Н-цепей, и каждый из двух фрагментов, связывающих целевой антиген, слит с С-концом одной из двух областей CL.

Экспрессионную конструкцию ДНК, кодирующую би-scFv-IgAb, получают клонированием кодирующих последовательностей доменов Fv к ТАА в модифицированный экспрессионный вектор на основе клеток млекопитающих, содержащий CMV-контролируемые экспрессионные кассеты, в том числе константные домены тяжелой и легкой цепей с точечными сайленс-мутациями Fc (SEQ ID NO: 25, 27-28), для совместной экспрессии обеих генных кассет из одного и того же вектора. После этого с соответствующими праймерами получали ампликоны ПЦР из генных последовательностей, кодирующих домены Fv, связывающие CD16A или целевой антиген, (SEQ ID NO: 1-13), разделенные короткими пептидными линкерами. Полученные перекрывающиеся фрагменты ДНК встраивали в коэкспрессионный вектор в подходящее положение. Все необходимые генные последовательности, кодирующие вариабельные домены и константные домены, содержащие точечные сайленс-мутации Fc, синтезировали с использованием Invitrogen GeneArt, Thermo Fisher Scientific (Регенсбург, Германия). Экспрессионную конструкцию би-scFv-IgAb разрабатывали так, чтобы она содержала кодирующие последовательности для N-концевых сигнальных пептидов и участка Fc для облегчения секреции и очистки антитела, соответственно. Последовательности всех конструкций были подтверждены с помощью секвенирования ДНК в GATC (Кельн, Германия) с использованием изготовленных по заказу праймеров. Экспрессионную кассету для би-scFv-IgAb клонируют так, что домены к CD16A располагаются на С-конце участка Fc, связанного соединительной группой (SEQ ID NO: 19-22), в следующих возможных порядках:

1.) VL(CD16A)-L3-VH(CD16A)

2.) VH(CD16A)-L2-VL(CD16A)

Пример такого антигенсвязывающего белка представляет собой би-scFv-IgAb_03, который содержит следующую структуру от N- до С-конца:

первая полипептидная цепь V_H(мишень 1)-СН1-шарнирная область-СН2-CH3-V_L(CD16A)-V_H(CD16A) и вторая полипептидная цепь V_L(мишень 1)-CL-V_L(мишень 2)-V_H(мишень 2) (Фиг. 14). SEQ ID NO: 17 используется для линкера L2, и SEQ ID NO: 18 используется для линкера L3.

2.8 KiH-scFv-Fc (Фиг. 15а и 15b):

Антигенсвязывающий белок KiH-scFv-Fc содержит четыре антигенсвязывающих фрагмента scFv, слитых с гетеродимерным (KiH) участком Fc, причем два фрагмента, связывающих антиген CD16A, слиты или N-, или С-концом с участком Fc.

Экспрессионную конструкцию ДНК, кодирующую KiH-scFv-Fc, получают путем клонирования кодирующих последовательностей доменов Fv к CD16A (SEQ ID NO: 1-13) в модифицированный экспрессионный вектор на основе клеток млекопитающих, содержащий CMV-контролируемые экспрессионные кассеты, в том числе константные домены СН2 и СН3 IgG1 с точечными сайленс-мутациями и точечными мутациями «выступы-во-впадины» Fc (SEQ ID NO: 31-32) для совместной экспресии двух генных кассет из одного и того же вектора. Мутации «выступы-во-впадины» позволяют получать биспецифические конструкции слияния Fc. После этого получали ПЦР-ампликоны изгенных последовательностей, кодирующих домены Fv к ТАА (опухолеассоциированный антиген), с соответствующими праймерами. Полученные перекрывающиеся фрагменты ДНК встраивали в коэкспрессионный вектор в подходящее положение. Все необходимые генные последовательности, кодирующие вариабельные домены и константные домены, содержащие сайленсинг Fc и точечные мутации «выступы-во-впадины», синтезировали с использованием Invitrogen GeneArt, Thermo Fisher Scientific (Регенсбург, Германия). Экспрессионную конструкцию KiH-scFv-Fc разрабатывали так, чтобы она содержала кодирующие последовательности для N-концевых сигнальных пептидов, участка Fc, С-тэга и/или His-тэга (6xHis) для облегчения секреции и очистки антитела, соответственно. Последовательности всех конструкций были подтверждены с помощью секвенирования ДНК в GATC (Кельн, Германия) с использованием изготовленных по заказу праймеров. Экспрессионные кассеты для конструкций KiH-scFv-Fc клонируют так, что домены к CD16A расположены на N-конце гетеродимерного участка Fc, связанного посредством соединительной группы (SEQ ID NO: 19-22) и шарнирной области (SEQ ID NO: 23), или на С-конце участка Fc, связанного посредством соединительной группы (SEQ ID NO: 19-22), только в следующих возможных порядках: 1.) VL(CD16A)-L3-VH(CD16A) 2.) VH(CD16A)-L2-VL(CD16A)

Примеры таких антигенсвязывающих белков представляют собой KiH-scFv-Fc_09 и KiH-scFv-Fc_11, которые содержат следующую структуру от N- до С-конца:

первая полипептидная цепь V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-шарнирная область-СН2-СН3-V_H(мишень 1)-V_L(мишень 1) и вторая полипептидная цепь V_L(CD16A)-V_H(CD16A)-шарнирная область-СН2-СН3-V_H(мишень 2)-V_L(мишень 2) (Фиг. 15а); или первая полипептидная цепь V_H(мишень 1)-V_L(мишень 1)-шарнирная область-СН2-СН3-V_L(CD16A)-V_H(CD16A) и вторая полипептидная цепь V_H(мишень 2)-V_L(мишень 2)-шарнирная область-СН2-СН3-V_L(CD16A)-V_H(CD16A) (Фиг. 15b). SEQ ID NO: 17 используется для линкера L2, и SEQ ID NO: 18 используется для линкера L3.

Пример 3. Получение антител, вовлекающих NK-клетки, в различных форматах с использованием стабильных популяций клеток CHO

Культура клеток-хозяев

Клетки Flp-In СНО (Life Technologies), производное яйцеклеток китайского хомяка СНО-K1 (АТСС, CCL-61) (Kao and Puck, 1968), культивировали в питательной смеси Хама F-12, дополненной L-глутамином, 10% ФБС и 100 мкг/мл зеоцина. Прилипающие клетки отделяли с помощью 0,25% трипсина-ЭДТА и пересевали в соответствии со стандартными протоколами для клеточных культур, предоставленными Life Technologies.

Для подготовки к росту в суспензии клетки отделяли от сосуда с тканевой культурой и помещали в бессывороточную среду HyClone CDM4 СНО для последующей инкубации во встряхиваемых колбах при 37°С, 5% СО₂ и 120 об/мин. Стандартная среда для культивирования адаптированных к суспензии клеток-хозяев Flp-In СНО представляла собой HyClone CDM4 СНО, дополненная L-глутамином, добавкой НТ, пенициллином/стрептомицином и 100 мкг/мл зеоцина. Адаптированные к суспензии клетки для хранения замораживали в среде с 10% ДМСО и проверяли на отсутствие микоплазмы с использованием набора для обнаружения микоплазмы MycoAlert (Lonza).

Получение стабильно трансфектированных клеточных популяций

Клеточные линии рекомбинантных Flp-In СНО, стабильно экспрессирующие секретируемые рекомбинантные антитела, конструкции слияния Fc или антитела сравнения, получали трансфектированием адаптированных к суспензии клеток-хозяев. Для этого клетки помещали в стандартную среду без зеоцина за один день до совместной трансфекции с экспрессионными плазмидами (2,5 мкг), кодирующими представляющий интерес белок (рсДНК5-FRT), и рекомбиназой Flp (pOG44, Life Technologies) с использованием полиэтиленимина (PEI). Кратко, векторную ДНК и реагент для трансфекции смешивали в соотношении ДНК:PEI 1:3 (мкг/мкг) в общем объеме 100 мкл среды OptiMEM I и инкубировали в течение 10 минут до добавления 2Е+6 клеток Flp-In СНО, суспендированных в 1 мл среды CHO-S-SFMII (Life Technologies). После 24-48 ч инкубации начинали отбор стабильно трансфектированных клеток путем добавления 6-7 мкг/мл пуромицина дигидрохлорида после развдения культур до плотности 0,2Е+6 жизнеспособных клеток/мл в среде CHO-S-SFMII. Рекомбиназа Flp опосредует вставку экспрессионной конструкции Flp-In в геном в объединенном сайте FRT посредством сайт-специфической рекомбинации ДНК (О' Gorman et al 1991). В процессе отбора плотности жизнеспособных клеток измеряли два раза в неделю, и клетки центрифугировали и ресуспендировали в свежей среде для отбора при максимальной плотности 0,2Е+6 жизнеспособных клеток/мл. Популяции клеток, стабильно экспрессирующие рекомбинантные белковые продукты, извлекали через 2-3 недели отбора, после чего клетки переносили в стандартную среду для культивирования во встряхиваемых колбах. Экспрессию рекомбинантных секретируемых белков подтверждали гель-электрофорезом белков супернатантов клеточных культур с использованием технологии Criterion Stain-Free (Bio-Rad) (см. ниже). Стабильные популяции клеток для хранения замораживали в среде, содержащей 7,5% ДМСО.

Получение рекомбинантного белка в суспензионных культурах клеток СНО с подпиткой

Рекомбинантные белки получали в течение 10 или 11 дней в культурах стабильно трансфектированных клеток СНО с подпиткой путем секреции в супернатант клеточной культуры. Для этого клетки, стабильно экспрессирующие рекомбинантные антитела, антигены слияния Fc или сравнительные антитела высевали с исходными плотностями 6Е+5 клеток/мл в стандартной питательной среде в поликарбонатных колбах Эрленмейера с газопроницаемыми крышками (Corning) и инкубировали при 37°С и 5% CO₂ со встряхиванием при 140 об/мин. В процессе культивирования с подпиткой среду дополняли 40 мл/л питательной смеси A ActiCHO (GE Healthcare) и 4 мл/л питательной смеси В ActiCHO (GE Healthcare) в день 0 (исходный день) и двойными количествами в дни 3, 5 и 7. Супернатанты клеточных культур собирали через 10 или 11 дней при жизнеспособности культуры, составляющей, как правило, >75%. Образцы отбирали из культур для продуцирования через день до подпитки, и оценивали плотность и жизнеспособность клеток. В день сбора супернтатанты клеточных культур до дальнейшего использования очищали центрифугированием и вакуумным фильтрованием (0,22 мкм) с использованием мембранных фильтров Millipore Express PLUS (Millipore).

Количественное определение титра экспрессии:

Титры экспрессии белков и чистоту продукта в супернатантах клеточных культур (CSS) определяют с помощью SDS-PAGE в дни 5, 7 и 10 или 11 продуцирования культур. Образцы смешивают с буфером для образца SDS PAGE до помещения в 4-20% готовые гели Criterion TGX для SDS PAGE (Biorad). Общий белок визуализируют в геле с использованием молекулярной системы визуализиции без красителя Criterion (Biorad). Титры продуктов определяли полуколичественно путем сравнения с антителами сравнения известной концентрации.

Очистка антиген связывающих белков

1. Антигенсвязывающие белки, содержащие участок Fc (scDb-mFc, Db-Fc, би-scFv-Fc, би-scFv-IgAb, scFv-Fc, scFv-IgAb, как описано в Примере 2)

Целевые белки выделяли из очищенных супернатантов клеточной культуры СНО с использованием двухстадийного процесса, включающего белок А и препаративную SEC. Для белка А очищенный супернатант помещали в колонку HiTrap MabSelectSuRe (GE-Healthcare). После промывания фосфатно-солевым буферным раствором с рН 7,4 и 10 мМ фосфатом натрия с рН 7,0 белок элюировали с использованием двухстадийного градиента с 50 мМ ацетата натрия рН 3,5 и 10 мМ глицина/HCL с рН 2,0. Чистоту фракций анализировали с использованием экслюзионной ВЭЖХ и SDS-PAGE. Фракции, демонстрирующие приемлемую чистоту, объединяли и подвергали препаративной гель-фильтрации с использованием препаративной колонки Superdex 200 (GE-Healthcare). Фракции элюата, содержащие очищенные целевые молекулы, объединяли и подвергали замене буфера с использованием колонки Sephadex G-25 с 10 мМ ацетата натрия, 4,5% сорбита, рН 5,0, и концентрировали ультрафильтрованием обычно до концентрации приблизительно 1 мг/мл. Типичная чистота этих конструкций (измерено с помощью эксклюзионной ВЭЖХ) находилась в интервале от 87,6% до 99,8%, а однородность (в невосстанавливающем SDS-PAGE) от 58,4% до 100%.

2. Антигенсвязывающие белки KiH-scDb-Fc и scDb-триатело-scFv в соответствии с Примером 2, содержащие легкую цепь к и His-тэг

Целевые белки выделяли из очищенных супернатантов клеточной культуры СНО с использованием трехстадийного процесса, включающего белок L, IMAC и препаративную SEC. Для белка L очищенный супернатант помещали в колонку HiTrap с белком L (GE Healthcare). После промывания фосфатно-солевым буферным раствором с рН 7,4 и 10 мМ фосфатом натрия с рН 7,0 белок элюировали с использованием двухстадийного градиента с 10 мМ глицина/НС1, рН 3,0 и 10 мМ глицина/HCl, рН 2,0. Чистоту фракций анализировали с использованием экслюзионной ВЭЖХ и SDS-PAGE. Фракции, демонстрирующие приемлемую чистоту, объединяли и подвергали дальнейшей очистке с помощью IMAC. Таким образом, образцы разбавляли (1:4) равновесным буфером (50 мМ Трис/HCL, 150 мМ хлорида натрия, рН7,5) и помещали в колонку HisTrap FF (GE Healthcare). После промывания равновесным буфером (50 мМ Трис/HCl, 150 мМ хлорида натрия, рН 7,5) белок элюировали с использованием трехстадийного градиента: 7%/30%/100% буфера для элюирования (50 мМ трис/HCl, 0,4 М аргинина, 500 мМ имидазола, рН 7,5). Чистоту фракций анализировали с использованием экслюзионной ВЭЖХ и SDS-PAGE. Фракции, демонстрирующие приемлемую чистоту, объединяли и подвергали препаративной гель-фильтрации с использованием препаративной колонки Superdex 200 (GE-Healthcare). Фракции элюата, содержащие очищенные целевые молекулы, объединяли и подвергали замене буфера с использованием колонки Sephadex G-25 с 10 мМ ацетата натрия, 4,5% сорбита, рН 5,0, и концентрировали ультрафильтрованием обычно до концентрации приблизительно 1 мг/мл. Типичная чистота этих конструкций (измерено с помощью эксклюзионной ВЭЖХ) находилась в интервале от 95,9% до 99,8%, а однородность (в невосстанавливающем SDS-PAGE) от 72,2% до 99,0%. 3) Молекулы антигенсвязыващих белков KiH-scFv-Fc и KiH-scDb-Fc, содержащие С-тэг на первом полипептиде и His-тэг на втором полипептиде

Целевые белки выделяли из очищенных супернатантов клеточной культуры СНО с использованием трехстадийного процесса, включающего хроматографию по сродству к С-тэгу, IMAC и препаративную SEC. Для хроматографии по сродству к С-тэгу очищенный супернатант помещали в колонку XL CaptureSelect к С-тэгу (Thermo Scientific). После промывания фосфатно-солевым буферным раствором, рН 7,4, белок элюировали с использованием 20 мМ цитрата натрия, рН 3,0. Чистоту фракций анализировали с использованием экслюзионной ВЭЖХ и SDS-PAGE. Фракции, демонстрирующие приемлемую чистоту, объединяли и подвергали дальнейшей очистке с помощью IMAC. Таким образом, образцы разбавляли (1:4) равновесным буфером (50 мМ Трис/HCL, 150 мМ хлорида натрия, рН7,5) и помещали в колонку HisTrap FF (GE Healthcare). После промывания равновесным буфером (50 мМ Трис/HCl, 150 мМ хлорида натрия, рН 7,5) белок элюировали с использованием трехстадийного градиента: 7%/30%/100% буфера для элюирования (50 мМ трис/HCl, 0,4 М аргинина, 500 мМ имидазола, рН 7,5). Чистоту фракций анализировали с использованием экслюзионной ВЭЖХ и SDS-PAGE. Фракции, демонстрирующие приемлемую чистоту, объединяли и подвергали препаративной гель-фильтрации с использованием препаративной колонки Superdex 200 (GE-Healthcare). Фракции элюата, содержащие очищенные целевые молекулы, объединяли и подвергали замене буфера с использованием колонки Sephadex G-25 с 10 мМ ацетата натрия, 4,5% сорбита, рН 5,0, и концентрировали ультрафильтрованием обычно до концентрации приблизительно 1 мг/мл. Типичная чистота этих конструкций (измерено с помощью эксклюзионной ВЭЖХ) находилась в интервале от 94,8% до 99,0%, а однородность (в невосстанавливающем SDS-PAGE) от 86,8% до 100%. 4) scDb-триатело

Белки выделяли из очищенных супернатантов клеточной культуры СНО с использованием двухстадийного процесса, включающего IMAC и препаративную SEC. Для IMAC очищенный супернататнт и 5 мМ имидазола, рН 7,0 помещали в колонку HisTrap FF (GE Healthcare). После промывания равновесным буфером (50 мМ Трис/HCl, 150 мМ хлорида натрия, рН 7,5) белок элюировали с использованием трехстадийного градиента: 7%/30%/100% буфера для элюирования (50 мМ трис/HCl, 0,4 М аргинина, 500 мМ имидазола, рН 7,5). Чистоту фракций анализировали с использованием экслюзионной ВЭЖХ и SDS-PAGE. Фракции, демонстрирующие приемлемую чистоту, объединяли и подвергали препаративной гель-фильтрации с использованием препаративной колонки Superdex 200 (GE-Healthcare). Фракции элюата, содержащие очищенные целевые молекулы, объединяли и подвергали замене буфера с использованием колонки Sephadex G-25 с 10 мМ ацетата натрия, 4,5% сорбита, рН 5,0, и концентрировали ультрафильтрованием обычно до концентрации приблизительно 1 мг/мл. Типичная чистота этих конструкций (измерено с помощью эксклюзионной ВЭЖХ) находилась в интервале от 95,1% до 100%, а однородность (в невосстанавливающем SDS-PAGE) составляла более 85,8%.

a) scDb-триатело_09-10

Белки выделяли из очищенных супернатантов клеточной культуры СНО с использованием двухстадийного процесса, включающего хроматографию по сродству к Fab/лямбда-цепи и препаративную SEC. Для хроматографии по сродству к Fab/лямбда-цепи очищенный супернатант помещали в колонку со сродством к Fab/лямбда цепи (GE Healthcare). После промывания фосфатно-солевым буферным раствором, рН 7,4, белок элюировали с использованием 100 мМ ацетата натрия, рН 3,5. Чистоту фракций анализировали с использованием экслюзионной ВЭЖХ и SDS-PAGE. Фракции, демонстрирующие приемлемую чистоту, объединяли и подвергали препаративной гель-фильтрации с использованием препаративной колонки Superdex 200 (Ge-Healthcare). Фракции элюата, содержащие очищенные целевые молекулы, объединяли и подвергали замене буфера с использованием колонки Sephadex G-25 с 10 мМ ацетата натрия, 4,5% сорбита, рН 5,0, и концентрировали ультрафильтрованием обычно до концентрации приблизительно 1 мг/мл. Типичная чистота этих конструкций (измерено с помощью эксклюзионной ВЭЖХ) составляла более 94,8%, а однородность (в невосстанавливающем SDS-PAGE) составляла более 92,7%.

Анализ белков

Однородность конечных образцов оценивали с помощью SDS-PAGE в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. Образцы смешивали с 2-кратным невосстанавливающим буфером для образцов SDS PAGE или 2-кратным восстанавливающим буфером для образцов SDS PAGE, содержащим дитиотреитол (ДТТ) в качестве восстанавливающего агента. Все образцы нагревали при 95°С в течение 5 мин до нанесения на 4-20% готовый гель Criterion TGX для SDS PAGE. Наносили 2 мкг очищенного образца белка. Для разделения белков в геле SDS-PAGE проводили в 1-кратном буфере Трис/глицин/ДСН при 300 В в течение приблизително 22 мин. Общий белок визуализировали в геле с использованием молекулярной системы визуализиции без красителя Criterion (Biorad). В качестве маркера молекулярной массы использовали набор неокрашенных белков Page Ruler. Относительную интенсивность сигнала полосы продукта в невосстанавливающем SDS-PAGE сравнивали с возможными высоко- и низкомолекулярными частицами.

Чистоту белковых препаратов оценивали с помощью аналитической эксклюзионной хроматографии, используя колонку Superdex 200 Increase 10/300GL (GE-Healthcare).

Очищенные белки хранили в виде аликвот при -80°С до дальнейшего использования.

Пример 4. Связывание белков, связывающих антиген CD16A, с первичными NK-клетками человека при 37°С или с рекомбинантным растворимым антигеном CD16A в ELISA

Способы

Выделение МКПК из лейкотромбоцитарных слоев и обогащение NK-клеток человека

МКПК выделяли из лейкотромбоцитарных слоев (German Red Cross, Мангейм, Германия) с помощью центрифугирования в градиенте плотности. Образцы лейкотромбоцитарных слоев разбавляли двух-трехкратным объемом ФСБ (Invitrogen, кат: 14190-169), наносили на основание Lymphoprep (Stem Cell Technologies, кат.: 07861) и центрифугировали при 800 × g в течение 25 мин при комнатной температуре без перерыва. МКПК, расположенные на границе раздела, собирали и промывали 3 раза ФСБ, после чего их культивировали в полной среде RPMI 1640, дополненной 10% ФБС, в течение ночи без стимуляции. Для обогащения NK-клеток МКПК собирали после культивирования в течение ночи и использовали для одного цикла негативного отбора с использованием набора для обогащения NK-клеток человека EasySep™ (Stem Cell Technologies, кат.: 19955) для иммуномагнитного выделения несвязанных NK-клеток человека с помощью магнита Big Easy EasySep™ (Stem Cell Technologies, кат: 18001) в соответствии с инструкциями производителя.

Анализы связывания клеток и проточно-цитометрические анализы

Аликвоты обогащенных NK-клеток человека инкубировали со 100 мкл последовательно разбавленных указанных конструкций к CD16A в буферном растворе FACS (ФСБ, Invitrogen, кат.: 14190-169), содержащем 2% инактивированной нагреванием ФБС (Invitrogen, кат: 10270-106), 0,1% азида натрия (Roth, Карлсруэ, Германия, кат: А1430.0100) в течение 45 мин при 37°С. После повторных промываний буфером FACS, связанные с клетками антитела обнаруживали при 15 мкг/мл конюъюгированных с FITC антител козы к IgG человека(Dianova, кат.: 109-095-098). После последней стадии окрашивания клетки снова промывали и ресуспендировали в 0,2 мл буфера FACS, содержащего 2 мкг/мл пропидиума йодида (PI) (Sigma, кат.: Р4170), чтобы исключить мертвые клетки. Флуоресценцию 2-5 × 10³ живых клеток измеряли с использованием проточного цитометра Millipore Guava EasyCyte (Merck Millipore, Швальбах, Германия). Средние интенсивности флуоресценции образцов клеток рассчитывали с использованием программного обеспечения Incyte (Merck Millipore, Швальбах, Германия). После вычитания величин интенсивности флуоресценции клеток, окрашенных вторичными и третичными реагентами отдельно, значения использовали для нелинейного регрессионного анализа с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (GraphPad Prism версии 6.00 для Windows, GraphPad Software, Ла-Хойя, калифорния, США). Для расчета K-D использовали уравнение для односайтового связывания (гипербола).

Анализ связывания растворимого антигена CD16A в ELISA 96-Луночные планшеты для ELISA (Immuno MaxiSorp; Nunc) покрывали в течение ночи при 4°С рекомбинантными антителами в различных форматах для вовлечения NK-клеток или контрольными антителами в 100 мМ карбонатном-гидрокарбонатном буфере. В зависимости от молекулярной массы антитела наносили в концентрациях 2,0-5,0 мкг/мл, что соответствует молярной концентрации приблизительно 20 нМ. После стадии блокирования с использованием 3% (мас./об.) обезжиренного сухого молока (Merck), растворенного в ФСБ, в планшетах инкубировали последовательно разбавленный рекомбинантный CD16A (48R-158V) человека, слитый с участком Fc IgGl человека, в ФСБ, содержащем 0,3% (мас./об.) обезжиренного сухого молока, в течение 1,5 ч при комнатной температуре. После трехкратного промывания 300 мкл на лунку ФСБ, содержащего 0,1% (об./об.) твин 20, планшеты инкубировали с конъюгатами для детектирования, стрептавидин-HRP (Roche) при разбавлении 1:10000 в течение 1 ч при комнатной температуре. После трехкратного промывания 300 мкл на лунку ФСБ, содержащего 0,1% (об./об.) твин 20, планшеты инкубировали с тетраметилбензидиновым (ТМВ) субстратом (Seramun), пока явно не было видно изменения цвета. Рекцию останавливали путем добавления 100 мкл на лунку 0,5 М H₂SO₄. Поглощение измеряли при 450 нм с использованием многоканального планшет-ридера (Victor, Perkin Elmer). Величины поглощения наносили на график и анализировали с помощью нелинейной регрессии, аппроксимации сигмоидальной кривой доза-ответ (переменный наклон), методом наименьших квадратов (стандартный) с использованием GraphPad Prism версии 6.07 (GraphPad Software, Ла-Хойя, Калифорния, США).

Результаты

Кажущиеся аффинности связывания указанных белков, связывающих антиген CD16A, определяли на первичных NK-клетках человека при 37°С в по меньшей мере двух независимых экспериментах. Кроме того, с помощью ELISA устанавливали способность белков, связывающих антиген CD16A, связывать растворимый CD16A. Оба способа демонстрируют, что белки, связывающие антиген CD16A, показывают специфическое связывание с CD16A. Вследствие двухвалентного связывания CD16A получены высокие аффинности. Различия в абсолютных значениях величин KD, измеренных при связывании с NK-клетками, и величин ЕС50, измеренных в ELISA, наблюдаются вследствие различных методологий, реагентов и установок для анализа. Результаты приведены в Таблице 2.

Пример 5. Цитотоксическая активность белка, связывающего анттиген CD16A, на опухолевых клетках-мишенях

Способы:

Культивирование клеточных линий

А-431 (АТСС, кат.: CRL-1555) культивировали в стандартных условиях в среде DMEM, дополненной 10% инактивированной нагреванием ФБС, 2 мМ L-глутамина, и 100 МЕ/мл пенициллина G натрия, и 100 мкг/мл стрептомицина сульфата (все компоненты производства Invitrogen). RPMI-8226 (DSMZ, кат.: АСС402) и MM.1S (АТСС, кат.: CRL2974) культивировали в среде RPMI 1640, дополненной 10% инактивированной нагреванием ФБС, 2 мМ L-глутамина, и 100 МЕ/мл пенициллина G натрия, и 100 мкг/мл стрептомицина сульфата. SU-DHL-6 (DSMZ, кат.: АСС572) культивировали в среде RPMI 1640, дополненной 20% инактивированной нагреванием ФБС, 2 мМ L-глутамина, и 100 МЕ/мл пенициллина G натрия, и 100 мкг/мл стрептомицина сульфата. NCI-H929 (DSMZ, кат.: АСС163) культивировали в среде RPMI 1640, дополненной 20% инактивированной нагреванием ФБС, 2 мМ L-глутамина и 100 МЕ/мл пенициллина G натрия, 100 мкг/мл стрептомицина сульфата, 1 мМ пирувата натрия и 50 мкл меркаптоэтанола (все компоненты производства Invitrogen).

Все клеточные линии культивировали при 37°С во влажной атмосфере с 5% CO₂.

Выделение МКПК из лейкотромбоцитарных слоев и обогащение NK-клеток человека

МКПК выделяли из лейкотромбоцитарных слоев (German Red Cross, Мангейм, Германия) с помощью центрифугирования в градиенте плотности. Образцы лейкотромбоцитарных слоев разбавляли двух-трехкратным объемом ФСБ (Invitrogen, кат.: 14190-169), наносили на основание Lymphoprep (Stem Cell Technologies, кат.: 07861) и центрифугировали при 800 × g в течение 25 мин при комнатной температуре без перерыва. МКПК, расположенные на границе раздела, собирали и промывали 3 раза ФСБ, после чего их культивировали в среде RPMI 1640, дополненной 10% инактивированной нагреванием ФБС, 2 мМ L-глутамина и 100 МЕ/мл пенициллина G натрия и 100 мкг/мл стрептомицина сульфата, в течение ночи без стимуляции. Для обогащения NK-клеток МКПК собирали после культивирования в течение ночи и использовали для одного цикла негативного отбора с использованием набора для обогащения NK-клеток человека EasySep™ (Stem Cell Technologies, кат.: 19055) для иммуномагнитного выделения несвязанных NK-клеток человека с помощью магнита Big Easy EasySep™ (Stem Cell Technologies, кат.: 18001) в соответствии с инструкциями производителя.

4-Часовые анализы цитотоксичности на основе высвобождения кальцеина Для анализов цитотоксичности на основе высвобождения кальцеина указанные клетки-мишени собирали из культур, промывали средой RPMI 1640 без ФБС и метили 10 мкМ кальцеина AM (Invitrogen/Molecular Probes, кат.: С3100МР) в течение 30 мин в среде RPMI без ФБС при 37°С. После осторожного промывания меченные клетки ресуспендировали в полной среде RPMI (среда RPMI 1640, дополненная 10% инактивированной нагреванием ФБС, 4 мМ L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина G натрия, 100 мкг/мл стрептомицина сульфата) до плотности 1×10⁵/мл. 1×10⁴ клеток-мишеней затем высевали вместе с обогащенными NK-клетками человека в указанном (эффектор к мишени) соотношении Е:Т (обычно 5:1 или 2:1) и с указанными антителами в отдельных лунках круглодонного 96-луночного микропланшета в общем объеме 200 мкл/лунка в двух повторениях. Спонтанное высвобождение, максимальное высвобождение и уничтожение мишеней эффекторами в отсутствие антител определяли в четырех повторениях на каждом планшете.

После центрифугирования в течение 2 мин при 200 g реакционные смеси обычно инкубировали в течение 4 ч (в некоторых анализах 3 ч, как указано) при 37°С во влажной атмосфере с 5% СО₂. За 15 мин до конца инкубации в лунки, содержащие клетки-мишени, добавляли 20 мкл 10% тритона Х-100 в среде RPMI. 20 мкл среды RPMI добавляли во все остальные лунки. 100 мкл супернатанта клеточной культуры отбирали из каждой лунки после дополнительного центрифугирования в течение 5 мин при 500 g, и измеряли флуоресценцию высвобожденного кальцеина при 520 нм с использованием планшет-ридера флуоресценции (Victor 3, Perkin Elmer). На основе измеренных импульсов рассчитывали специфический клеточный лизис в соответствии со следующей формулой: [флуоресценция (образец) флуоресценция (спонтанная)] / [флуоресценция (максимальная) флуоресценция (спонтанная)] × 100%. Флуоресценция (спонтанная) представляет число импульсов флуоресценции от клеток-мишеней в отсутствие эффекторных клеток и антител, а флуоресценция (максимальная) представляет полный клеточный лизис, вызванный добавлением тритона Х-100. Сигмоидальные кривые доза-ответ и величины ЕС₅₀ рассчитывали с помощью нелинейной регрессии/4-параметрической логарифмической аппроксимации с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (GraphPad Prism версии 6.00 для Windows, GraphPad Software, Ла-Хойя, Калифорния, США).

Результаты цитотоксической активности антигенсвязывающих белков против опухолевых клеток-мишеней показаны в Таблице 3.

Пример 6. Оценка NK-NK лизиса с помощью белка, связывающего антиген CD16A

Способы:

Выделение МКПК из лейкотромбоцитарных слоев и обогащение NK-клеток человека

МКПК выделяли из лейкотромбоцитарных слоев (German Red Cross, Мангейм, Германия) с помощью центрифугирования в градиенте плотности. Образцы лейкотромбоцитарных слоев разбавляли двух-трехкратным объемом ФСБ (Invitrogen, кат.: 14190-169), наносили на основание Lymphoprep (Stem Cell Technologies, кат.: 07861) и центрифугировали при 800 х g в течение 25 мин при комнатной температуре без перерыва. МКПК, расположенные на границе раздела, собирали и промывали 3 раза ФСБ, после чего их культивировали в полной среде RPMI 1640, дополненной 10% ФБС, в течение ночи без стимуляции. Для обогащения NK-клеток МКПК собирали после культивирования в течение ночи и использовали для одного цикла негативного отбора с использованием набора для обогащения NK-клеток человека EasySep™ (Stem Cell Technologies, кат.: 19055) для иммуномагнитного выделения несвязанных NK-клеток человека с помощью магнита Big Easy EasySep™ (Stem Cell Technologies, кат: 18001) в соответствии с инструкциями производителя.

4-Часовые анализы цитотоксичности на основе высвобождения калъцеина

В анализах цитотокичности по высвобождению кальцеина, чтобы оценить NK-NK-клеточный лизис половину обогащенных неактивированных NK-клеток промывали средой RPMI 1640 без ФБС и метили 10 мкМ кальцеина AM (Invitrogen/Molecular Probes, кат.: С3100МР) в течение 30 мин в среде RPMI без ФБС при 37°С. После осторожного промывания меченные клетки ресуспендировали в полной среде RPMI (среда RPMI 1640, дополненная 10% инактивированной нагреванием ФБС, 4 мМ L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина G натрия, 100 мкг/мл стрептомицина сульфата). 5×10⁴ клеток-мишеней затем высевали вместе с NK-клетками от того же донора в соотношении Е:Т 1:1 и указанными антителами в отдельных лунках круглодонного 96-луночного микропланшета в общем объеме 200 мкл/лунка в двух повторениях. Спонтанное высвобождение, максимальное высвобождение и уничтожение мишеней эффекторами в отсутствие антител определяли в четырех повторениях на каждом планшете.

После центрифугирования в течение 2 мин при 200 х g реакционную смесь инкубировали в течение 4 ч при 37°С во влажной атмосфере с 5% CO₂. За 15 мин до конца инкубации в лунки, содержащие клетки-мишени, добавляли 20 мкл 10% тритона Х-100 в среде RPMI. 20 мкл среды RPMI добавляли во все остальные лунки. 100 мкл супернатанта клеточной культуры отбирали из каждой лунки после дополнительного центрифугирования в течение 5 мин при 500 g, и измеряли флуоресценцию высвобожденного кальцеина при 520 нм с использованием планшет-ридера флуоресценции (Victor 3, Perkin Elmer). На основе измеренных импульсов рассчитывали специфический клеточный лизис в соответствии со следующей формулой: [флуоресценция (образец) - флуоресценция (спонтанная)] / [флуоресценция (максимальная) флуоресценция (спонтанная)] х 100%. Флуоресценция (спонтанная) представляет число импульсов флуоресценции от клеток-мишеней в отсутствие эффекторных клеток и антител, а флуоресценция (максимальная) представляет полный клеточный лизис, вызванный добавлением тритона Х-100. Сигмоидальные кривые доза-ответ рассчитывали с помощью нелинейной регрессии/4-параметрической логарифмической аппроксимации с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (GraphPad Prism версии 6.00 для Windows, GraphPad Software, Ла-Хойя, Калифорния, США) и использовали для определения величин ЕС₅₀ [пМ] и Е_макс.[%].

Белок, связывающий антиген CD16A, считается не вызывающим NK-NK-клеточный лизис, если лизис не наблюдается совсем или наблюдается только в незначительной степени ниже 10% от измеримых концентраций антител до 30 мкг/мл в анализах, в которых даратумумаб вызывал более чем 50% лизис NK-клеток. Результаты:

Каждый из антигенсвязывающих белков исследовали в по меньшей мере двух независимых 4-часовых анализах цитотоксичности по высвобождению кальцеина для опосредованного NK-клетками лизиса NK-клеток.

Результаты, обобщенные в Таблице 4 и на Фиг. 17A-17N, явно демонстрируют, что активность (ЕС₅₀) и эффективность (Е_макс.) для NK-NK лизиса, вызванного белками, связывающими антиген CD16A, не коррелирует с кажущейся аффинностью связывания этих белков с рекомбинантным антигеном CD16A или CD16A на NK-клетках (обобщено в Таблице 2). Кроме того, активность (ЕС₅₀) белков, связывающих антиген CD16A, по отношению к лизису антиген положительных опухолевых клеток-мишеней не коррелирует с активностью в опосредовании NK-NK лизиса. Из этих данных можно сделать вывод, что склонность к опосредованию NK-NK-клеточного лизиса не является свойством домена Fv к CD16A самого по себе и не является функцией кажущейся аффинности, а является характеристическим свойством формата, в частности порядка доменов вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи данного белка, связывающего антиген CD16A.

Таблица 4 иллюстрирует, что антигенсвязывающие белки, содержащие два фрагмента, связывающих CD16A, в формате scDb, Db или scFv, слитые с участком Fc или областью Fab, не вызывают NK-NK лизис, если вариабельные области расположены от N- к С-концу в scDb V_L-V_H-V_L-V_H или scDb V_L-V_L-V_H-V_H, в Db V_L-V_H или scFv V_L-V_H. Таким образом результаты демонстрируют, что NK-NK лизис не зависит от кажущейся аффинности связывания этих антигенсвязывающих фрагментов с рекомбинантным CD16A или CD16A на NK-клетках, что определено по ЕС50 и Емакс.Дополнительно, NK-NK лизис также не зависит от домена, связывающего целевой антиген.

Пример 7 - Перенаправленное оптимизированное уничтожение клеток (ROCK®): Высоко универсальная мультиспецифическая соответствующая целевому назначению система антител для вовлечения врожденного иммунитета

Краткое изложение

На основании системы ROCK® (перенаправленное оптимизированное уничтожение клеток) был разработан ряд агентов, вовлекающих иммунные клетки. Эта новая модулярная система приводит к преимуществам при вовлечении NK-клеток по сравнению с классическими моноклональными антителами и другими концепциями вовлекающих агентов. Рассматривали молекулярный дизайн, аффинность связывания, активацию иммунных эффекторных клеток и ФК свойства. Систему ROCK® можно использовать для получения новых антител, нацеленных на активацию врожденного и адаптивного иммунитета.

В этом Примере представлена новая, полностью модулярная система, называемая система «перенаправленного оптимизированного уничтожения клеток» (ROCK®), которая включает большое разнообразие различных форматов, оснащенных уникальным доменом, связывающим CD16A, для получения нового класса антител, рекрутирующих NK-клетки, нацеленных на активацию врожденного и адаптивного иммунитета. Материалы и способы

Получение рекомбинантных антител ROCK®, контролен и вариантов антигена

Генные последовательности для различных рекомбинантных белков (антигены, антитела, контроли) синтезировали с помощью Invitrogen GeneArt, Thermo Fisher Scientific (Регенсбург, Германия) или получали с помощью ПЦР.

Экспрессионные вектора, кодирующие эти рекомбинантные белки, получали клонированием соответствующих элементов последовательности в экспрессионный вектор на основе клеток млекопитающих рсДНК5/FRT (Life Technologies) или его модифицированную версию с использованием стандартных методик молекулярной биологии. Растворимые рекомбинантные варианты антигена получали как слитые белки последовательностей ECD с мономерным Fc (Ying et al., J Biol Chem 2012; 287:19399-408). Для экспрессии вариантов антигена, прикрепленных к поверхности клетки, последовательности ECD были или слиты с трансмембранным доменом человека РЭФР (Wang et al., Blood 2011; 118:1255-63), или прикреплены посредством GPI с использованием эндогенной последовательности CD16B человека с последовательностью пропептида полной длины для посттрансляционного процессинга и липидизации GPI-якоря. В некоторых экспрессионных конструкциях исходный вектор был модифицирован так, что содержал две экспрессионные кассеты, контролируемые промотором CMV, для совместной экспрессии двух цепей антител. Дополнительная модификация экспрессионного вектора на основе клеток млекопитающего представляла собой замену гена устойчивости к гигромицину на ген устойчивости к пуромицину. Кроме того, экспрессионные конструкции дополнительно разрабатывали так, что они содержали кодирующие последовательности N-концевых сигнальных пептидов для облегчения секреции. Для рекомбинантных конструкций слияния (например, антигены с участком Fc IgG1) последовательности, кодирующие партнеров слияния, были амплифицированы с помощью ПЦР с использованием удлиненных праймеров для построения соответствующих линкерных или соединительных последовательностей для слияния генов или ограничения расщепления ферментами. Полученные перекрывающиеся фрагменты ДНК встраивали в коэкспрессионный вектор в необходимое положение с использованием метода сборки Гибсона, чтобы получить конечную конструкцию (Gibson et al., Nat Methods 2010; 7:901-3; Gibson et al, Nat Methods 2009; 6:343-5). Последовательности всех конструкций были подтверждены с помощью секвенирования по Сенгеру в GATC (Кельн, Германия) с использованием изготовленных по заказу праймеров.

Растворимые антитела или антигены или антигены, прикрепленные к клеточной поверхности, экспрессировали в СНО, как ранее описано (Reusch et al., Clin Cancer Res 2016; 22:5829-38). Целевые белки очищали из супернатантов клеточных культур с использованием одного или двух стандартных методов аффинной хроматографии (белок А, белок L, Capture Select с С-тэгом или IMAC) в зависимости от мономерной или мультимерной (гомодимерной, гетеродимерной или тетрамерной) формы продукта и аффинных тэгов слияния, присутствия легкой цепи к или участка Fc. Все белковые препараты дополнительно очищали с помощью эксклюзионной хроматографии и анализировали с использованием SEC-MALS, SDS-PAGE и спектроскопии в УФ-ВИД области.

Дот-блоттииг, SDS-PAGE и еестерн-блоттинг

Очищенные рекомбинантные варианты антигена CD 16 наносили на нитроцеллюлозные мембраны или смешивали с буфером для образца и разделяли на 4-20% готовых гелях Criterion (Bio-Rad). Общий белок визуализировали с использованием системы протоколирования гелей Molecular Imager, Bio-Rad. Белок переносили с помощью вестерн-блоттинга на мембраны среднего размера из ПВДФ с использованием системы Trans-Blot Turbo (Bio-Rad). Мембраны блокировали в течение 30 мин с помощью 3% (мас./об.) сухого обезжиренного молока (Merck), растворенного в TBS, и инкубировали с 2-4 мкг/мл антител scFv к CD 16 в течение 1 часа при комнатной температуре с последующим промыванием TBST (TBS, содержащим 0,1% (об./об.) твин 20) и дважды TBS. Мембраны инкубировали с анти-пента-His-HRP (QIAGEN), разбавленного 1:3000 в качестве вторичного конъюгата для детектирования в течение 1 часа при комнатной температуре. После промывания начинали колориметрическую обработку путем добавления свежеприготовленной смеси 0,66 мг/мл DAB, 0,02% CoCl₂, 0,015% Н₂О₂ в TBS и останавливали путем промывания мембран в воде. Мембраны высушивали и хроматографировали. Анализ связывания антигена CD16A в ELISA

96-Луночные планшеты для ELISA (Immuno MaxiSorp; Nunc) покрывали в течение ночи при 4°С рекомбинантными антигенами или антителами в различных форматах, вовлекающими NK-клетки, в 100 мМ карбонатно-гидрокарбонатном буфере. В зависимости от молекулярной массы наносили 0,5-3 мкг/мл антигена или 2-5 мкг/мл антител в различных форматах, выравнивая молярности до приблизительно 30 нМ для нанесенных антигенов или 10-20 нМ для нанесенных антител. После блокирования с помощью 3% (мас./об.) обезжиренного сухого молока (Merck), растворенного в ФСБ, последовательно разбавленные антитела scFv с His-тэгом или биотинилированный ECD-мономерный слитый с Fc антиген CD16A-158V в ФСБ, содержащем 0,3% (мас./об.) сухого обезжиренного молока, инкубировали в планшетах с нанесенными антигеном или антителами, соответственно, в течение 1,5 часов при комнатной температуре. Для оценки конкуренции связывания определяли титр scFvs и инкубировали в планшетах совместно с 1 нМ или 10 нМ мАт 3G8. После трехкратного промывания 300 мкл на лунку ФСБ, содержащего 0,1% (об./об.) твин 20, планшеты инкубировали с конъюгатами для обнаружения, пента-His-HRP (Qiagen), при разбавлении 1:3000, стрептавидином-HRP (Roche) или для обнаружения конкурирующего 3G8, конъюгированным с пероксидазой антителом козы к IgG мыши AffiniPure (H+L) (Dianova) при разбавлении 1:10000 в течение 1 часа при комнатной температуре. После промывания планшеты инкубировали с тетраметилбензидиновым (ТМВ) субстратом (Seramun) в течение 1-2 мин или пока окраска не становилось явно заметной. Реакцию останавливали добавлением 0,5М H2SO4 (100 мкл/лунка). Поглощение измеряли при 450 нм (1 с) с использованием многолуночного планшет-ридера (Victor, Perkin Elmer). Величины поглощения наносили на график и определяли величины ЕС₅₀ путем аппроксимации с помощью нелинейной регрессионной модели к сигмоидальным кривым доза-ответ (четырехпараметрическая логарифмическая аппроксимация) с использованием GraphPad Prism версии 6.07 (GraphPad Software, Ла-Хойя, Калифорния, США). Клеточные линии и клеточная культура

NCI-H929 (DSMZ, кат.: АСС-163), MC/CAR (АТСС, кат.: CRL-8083), MM.1S (АТСС, кат.: CRL-2974), RPMI-8226 (DSMZ, кат.: АСС 402), KARPAS-299 (DSMZ, кат.: АСС 31) и SW-982 (АТСС, кат.: НТВ-93) были приобретены, а А-431 была предоставлена Dr. G. Moldenhauer (DKFZ, Гейдельберг). Все клетки культивировали в стандартных условиях в среде DMEM (кат.: 41965 039), IMDM (кат.: 12440-053) или RPMI 1640 (кат.: 21875-034), дополненной: 10% инактививрованной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (ФБС) (кат.: 10270-106), 100 ед./мл пенициллина G/100 мг/мл стрептомицина (кат.: 1540-122) и 2 мМ L-глутамина (кат.: 25030-024; все из Life Technologies), при 37°С во влажной атмосфере с 5% СО₂. Выделение NK-клеток человека Мононуклеарные клетки периферической крови человека (МКПК) выделяли из лейкотромбоцитарных слоев здоровых волонтеров (German Red Cross, Мангейм, Германия) путем центрифугирования в градиенте плотности с использованием Lymphoprep (StemCell Technologies, кат.: 07861), как описано ранее (Fuss et al., Curr Protoc Immunol 2009; Chapter 7:Unit7 1). МКПК культивировали в течение ночи в среде RPMI 1640, дополненной 10% инактивированной нагреванием ФБС, 2 мМ L-глутамина и 100 ед./мл пенициллина G натрия/100 мкг/мл стрептомицина сульфата при 37°С и 5% СО₂ во влажной атмосфере, после чего NK-клетки были обогащены с помощью шариков для негативной селекции с использованием набора для обогащения негативными NK-клетками EasySEP™ (StemCell Technologies, кат.: 17955) в соответствии с инструкциями производителя. Чистоту выделения NK-клеток определяли с помощью проточной цитометрии, и обнаруживали обычно >80% CD56⁺ клеток (данные не показаны).

Анализы связывания клеток и проточно-цитометрический анализ

Аликвоты 0,2-1 × 10⁶ обогащенных NK-клеток человека инкубировали со 100 мкл последовательно разбавленных указанных конструкций в буферном растворе FACS (ФСБ, Invitrogen, кат.: 14190-169), содержащем 2% инактивированной нагреванием ФБС (Invitrogen, кат.: 10270-106), 0,1% азида натрия (Roth, Карлсруэ, Германия, кат.: А1430.0100) в отсутствие или, если указано, в присутствии 10 мг/мл поликлонального IgG человека (Gammanorm, Octapharma) в течение 45 мин при 37°С. После нескольких промываний буфером FACS, связанные с клетками, меченые His антитела scFv, антитела TandAb или TriFlex обнаруживали с помощью 10 мкг/мл мАт к His 13/45/31-2 (Dianova, Гамбург, Германия, кат.: DIA910-1MG), а затем 15 мкг/мл FITC-конъюгированного антитела козы к IgG мыши (Dianova, кат.: 115-095-062). Биспецифические конструкции антител к BCMA/CD16A обнаруживали с использованием растворимого, меченого His ВСМА, а затем 10 мкг/мл мАт к His 13/45/31-2, а затем 15 мкг/мл FITC-конъюгированного антитела козы к IgG мыши, и биспецифические Fc-содержащие конструкции к РЭФР/CD16A с использованием 15 мкг/мл FITC-конъюгированного антитела козы к IgG человека (Dianova, кат.: 109-095-098). После последней стадии окрашивания клетки снова промывали и ресуспендировали в 0,2 мл буфера FACS, содержащего 2 мкг/мл пропидиума йодида (PI) (Sigma, кат.: Р4170), чтобы исключить мертвые клетки. Флуоресценцию 2-5 × 10³ живых клеток измеряли с использованием проточного цитометра Millipore Guava EasyCyte (Merck Millipore, Швальбах, Германия) или цитометра.CytoFlex (Beckman Coulter, Крефельд, Германия), и определяли средние интенсивности флуоресценции образцов клеток. После вычитания величин интенсивности флуоресценции клеток, окрашенных вторичными или третичными реагентами отдельно, полученные значения использовали для нелинейного регрессионного анализа. Равновесные константы диссоциации (K_D) рассчитывали с использованием аппроксимации односайтового связывания (гипербола) и программного обеспечения GraphPad Prism V6 или V7 (GraphPad Software, Ла-Хойя, Калифорния, США). Анализы цитотоксичности

В анализе высвобождения кальцеина клетки-мишени метили 10 мМ кальцеина AM (Life Technologies, кат.: С3100МР) в течение 30 мин в среде RPMI при 37С, промывали, и 1×10⁴ опухолевых клеток-мишеней высевали в отдельные лунки 96-луночного микропланшета вместе с эффекторными клетками в общем объеме 200 мкл в указанных соотношениях эффектор:мишень (Е:Т) в присутствии возрастающих концентраций антитела. Для оценки взаимного уничтожения NK-клетками друг друга, 5×10⁴ меченых кальцеином первичных NK-клеток человека инкубировали совместно с аутологическими NK-клетками в соотношении Е:Т 1:1 в присутствии возрастающих концентраций антитела. После инкубации при 37°С во влажной атмосфере с 5% СО₂ в течение 4 ч, если не указано иное, измеряли флуоресценцию (F) кальцеина, высвободившегося в супернатант, с использованием планшет-ридера при 520 нм (Victor 3 или EnSight, Perkin Elmer, Турку, Финляндия). Специфический клеточный лизис рассчитывали следующим образом: [F(образца)-F(спонтанная)]/[F(максимальная)-F(спонтанная)] х 100%. F(спонтанная) представляет флуоресценцию, испущенную клетками-мишенями в отсутствие эффекторных клеток и антител, а F(максимальная) представляет флуоресценцию, испущенную после полного клеточного лизиса, вызванного добавлением тритона Х-100 (Roth, кат.: 3051.2) до конечной концентрации 1%. Средние величины специфического лизиса клеток-мишеней (%) и стандартные отклонения (ст.откл.) представляли графически и определяли in vitro активность (ЕС₅₀) путем аппроксимации с помощью нелинейной регрессионной модели сигмоидальными кривыми доза-ответ (переменный наклон) с использованием GraphPad Prism (v6 и v7; GraphPad Software, Ла-Хойя, Калифорния, США). Поверхностный плазмонный резонанс

Анализы кинетики связывания одновалентных взаимодействий с CD16A и качественное сравнение фазы диссоциации одновалентных и двухвалентных аналитов, связывающих CD16A, выполняли на оборудовании Biacore Т200 (GE Healthcare) при 25°С с сипользованием HBS-P+(10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 0,05% (мас./об.) полисорбатае 20, рН 7,4) в качестве подвижного буфера и для разбавлений. Сенсорные чипы САР (набор Biotin Capture Kit, GE Healthcare) предварительно кондиционировали в течение ночи с использованием буфера HBS-P+. На стадии, предшествующей захвату, поверхности чипов обрабатывали реагентом Biotin CAPture (GE Healthcare) при 5 мкл/мин в течение 100 с в проточных ячейках 1-4.

Для кинетических анализов связывания различных scFv к CD16A биотинилированные рецепторы, меченые moho-Fc(сайл.)-Avi, готовили в HBS-P+ и захватывали (CD16A-158V человека, CD16A-158F человека, прибл. 40 отн. Ед. для измерения взаимодействия с scFv и приблиз. 10 отн. ед. для измерения взаимодействия с IgG) в проточных ячейках Fc 2 и Fc 4. IgG и scFv готовили в буфере HBS-P+ при указанном ряде концентраций и вводили на поверхности сравнения (Fc 1, Fc 3) и поверхности с захваченным рецептором (Fc 2, Fc 4) при скорости потока 40 мкл/мин (время ассоциации 180 с, время диссоциации 300 с). Взаимодействия измеряли с использованием мультициклического кинетического режима (все антитела готовили с последовательным 4-кратным разбавлением: scFv-Ат16^средн. 150 нМ-0,586 нМ; scFv-Ат16^выс. 50 нМ-0,195 нМ, scFv-Ат16^низк. 500 нМ-1,953 нМ, scFv-3G8 и IgG1 Fc-усиленный человека 200 нМ-0,781 нМ, IgG1 человека и IgG1 Fc-сайленсированный человека 2000 нМ-7,813 нМ) после цикла регнерации с 6 М гуанидина-НС1/250 мМ NaOH при 10 мл/мин в течение 120 с. Данные преобразовывали, вычитая сигналы поверхностей сравнения (Fc 2-1, Fc 4-3) и сигналы от нулевой концентрации (буферный контроль). Кинетическую оценку выполняли путем аппроксимации данных моделью связывания 1:1 (Rмакс.и RI локально аппроксимированный) с использованием программного обеспечения для выполнения оценок Biacore Т200 (v3.1). Для количественного сравнения сенсограмм scFv и IgG в единственной концентрации (312,5 нМ) вводили на поверхности сравнения и поверхности с захваченным рецептором с повышенными уровнями захвата (CD16A-158V человека, 180 отн. ед. и CD16A-158F человека, 90 отн. ед.). Кривые, учитывающие образцы сравнения, нормализовали к максимуму каждой кривой и совмещали. Для исследования удерживания рецептора посредством количественного сравнения фаз диссоциации одновалентные и двухвалентные антитела или лиганды, связывающие CD16A, биотинилированные рецепторы, меченые moho-Fc(сайл.)-Avi готовили в HBS-P+и захватывали (CD16A-158V человека, прибл. 160 отн. ед., CD16 яванского макака, прибл. 320 отн. ед.) в проточных ячейках Fc 2 и Fc 3. Антитела, представляющие интерес, (scFv-IgAb, Db-Fc, KiH-scDb-Fc, TandAb), включающие связывающий домен Ат16^выс., и сравнительные антитела, усиленный Fc IgG1 человека (S239D/I332E) и одновалентно связывающий scFv-АТ16^выс. разбавляли до концентрации 50 нМ в буфере HBS-P+ и вводили на поверхность сравнения (Fc 1) и поверхности с захваченным рецептором (Fc 2, Fc 3) при скорости потока 30 мкл/мин (время ассоциации 180 с, время диссоциации 3 ч). Поверхность регенерировали с помощью 6 М гуанидина-НС1 / 250 мМ NaOH при 10 мл/мин в течение 120 с. Данные преобразовывали, вычитая сигналы от поверхностей сравнения (Fc 2-1, Fc 4-3) и сигналы от нулевой концентрации (буферный контроль). Кривые, учитывающие образцы сравнения, нормализовали к максимуму каждой кривой и совмещали.

Фармакокинетические исследования вовлекающих агентов ROCK

Основные фармакокинетические параметры различных форматов ROCK® оценивали на мышах CD-1 SWISS. Прижизненные фазы были проведены в Heidelberg Pharma GmbH. Самкам мышей CD-1 SWISS (например, n=24) проводили однократное внутривенное введение 0,3 мг (~10 мг/кг массы тела) исследуемого образца. В различные моменты времени кровь собирали в течение периода от 1 до 3 недель. Брали сыворотку крови и анализировали с помощью известных методик на основе технологий ELISA или MSD. Иллюстративная схема забора крови охватывала 13 моментов времени, например за 7 дней до введения дозы, 5 минут, 30 минут, 30 минут, 1 час, 4 часа, 8 часов и дни 1, 2, 3, 4, 7, 14 и 21. Концентрации в сыворотке определяли с помощью ELISA на Tristar LB941 (Berthold instruments), используя обнаружение усиленной хемолюминисценции (ECL). Для установления схемы анализа тестировали различные комбинации антигенов сыворотки и/или монокланальных антител для захвата и/или обнаружения. Способы анализа характеризовали в отношении других критических параметров, меж-/внутрианалитическая сходимость и точность, линейность разбавления и селективность, хук-эффект и матричные эффекты.

Анализ активации NK-клеток

5×10⁵ МКПК высевали в отдельные лунки плоскодонного 96-луночного микропланшета в присутствии или в отсутствие 1×10⁴ клеток RPMI-8226 в полной среде RPMI 1640 в присутствии указанных концентраций антитела. После инкубации в течение 22 ч при 37°С с 5% CO₂ во влажной атмосфере, клетки собирали, промывали, и ресуспендировали в буфере FACS/hIgG (буфер FACS, дополненный 1 мг/мл поликлонального IgG человека). Затем клетки окрашивали с помощью CD56-PC7 и CD69-PC5 в буфере FACS/hIgG в течение 15 мин на льду в темноте. После нескольких промываний буфером FACS, 1×10³-1×10⁴ клеток анализировали с помощью проточной цитометрии и количественно определяли процентную долю клеток CD69⁺ в CD56⁺ NK-клетках. Анализ высвобождения цитокинов

Плоскодонные 96-луночные титрационные микропланшеты блокировали RPMI-1640/5% ФБС в течение 2-4 ч при к.т. До высевания 5×10⁵ МКПК с 1×10⁴ опухолевых клеток NCI-H929 или без них, с 10 мкг/мл указанных антител или без них в общем объеме 200 мкл/лунка. Планшеты инкубировали в течение 24 ч при 37°С и 5% СО₂ во влажной камере. Супернатанты клеточных культур собирали и хранили при -80°С до количественного определения цитокинов в Bioassay GmbH (Гейдельберг, Германия) с помощью набора II для анализа цитокинов Th1/Th2 человека с использованием цитометрического мультиспецифического анализа на гранулах (СВА) BD™ (BD Bioscience). Результаты

Обоснование для получения доменов антитела к CD16A

Большинство классических терапевтических антител, содержащих участок Fc, демонстрируют низкую собственную аффинность связывания с CD16A (FcγRIIIA), а иммунные вовлекающие агенты, в которых используется сайт распознавания на CD16A, также связываются участком Fc антител IgG (de Palazzo et al., Cancer Res. 1990;50:7123-8; de Palazzo et al., Cancer Res. 1992;52:5713-9) и должны конкурировать с IgG сыворотки за связывание с CD16A, таким образом ограничивая заселенность CD16A и увеличивая дозу терапевтического антитела, необходимую, чтобы она являлась эффективной. Конкуренция с IgG может быть даже более выраженной в условиях болезни, которая харатеризуется высокими уровнями IgG в плазме, например множественной миеломы (Michallet et al., Leukemia 2017). Кроме того, полиморфизм CD16A у людей (Mahaweni et al., Sci. Rep 2018;8:15983), с наиболее значимыми вариантами CD16A-158V и CD16A-158F, которые отличаются аффинностями связывания с IgG, а следовательно функциями FcR, например ADCC, приводит к различным уровням эффективности классической терапии с использованием мАт в зависимости от индивидуального генотипа CD16A пациента (Bowles et al., Blood 2006;108:2648-54; Burchard et al., Cancer Genetics 2013;206:130-4). Используя систему ROCK®, авторы изобретения создали домен к CD16A, который распознает уникальный эпитоп на CD16A2 и на который практически не влияет конкуренция с IgG в плазме и полиморфизм CD16A. Кроме того, он был разработан для связывания с CD16A с высокой аффинностью, опосредуя высокоактивную ADCC, а таким образом эффективный иммунный контроль.

Для того чтобы найти соответствие описанным выше критериям к таким фрагментам антител с высокой активностью и селективностью к CD 16А, проводили скриннинг библиотеки scFv, полученных из МКПК человека. С использованием вариантов CD16 В человека для негативной селекции удалось идентифицировать антитело с изначально низкой аффинностью, но высокой селективностью к CD16A. С использованием различных подходов для созревания аффинности (например, шаффлинг легких цепей, целесообразные мутации в CDR тяжелой цепи) можно увеличить аффинность по отношению к CD16A по меньшей мере в 100 раз до Kd, составляющей 2 нМ (Ат16выс, Таблица 5). CD16A-связывающие свойства антител scFv с низкой аффинностью (Ат16^низк.), средней аффинностью (Ат16^средн.) и высокой аффинностью связывания (Аb16^выс) характеризовали с помощью SPR и сравнивали с ранее описанным и хорошо охарактеризованным антителом 3G8, специфическим ко всем формам CD16 (Tamm et al., J Immunol 1996; 157:1576-81), а также Fc IgG1 или генетически модифицированным вариантом Fc с мутациями, усиливающими эффекторную функцию, опосредованную Fc, и связывание с CD16A, S239D/I332E (Lazar et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103:4005-10) или сайленс-мутациями L234F/L235E/D265A (Vidarsson et al., Front Immunol 2014; 5:520; Baudino et al., J Immunol 2008; 181:6664-9; Hezareh et al., Journal of virology 2001; 75:12161-8). Оба Ат16^средн. и Ат16^выс. продемонстрировали исключительные свойства связывания с CD16A (Фиг. 18А и 18В). Тогда как кинетика связывания с CD16A Fc IgG1 дикого типа, усиленного Fc IgGl и антитела 3G8, специфического ко всем формам CD16, зависит от полиморфизма CD16A, Ат16^выс., а также Ат16^средн. и Ат16^низк. демонстрировали сопоставимые кинетические свойства связывания вне зависимости от аллельных форм, CD16A-158V и CD16A-158F (Таблица 5, Фиг. 18А, 18В и 20). Оба антитела дополнительно продемонстрировали хорошую перекрестную реактивность с CD16A яванского макака (Фиг. 19А, Таблица 6). Кроме того, характеризация агентов, связывающих CD16A, идентифицированных при различных подходах к созреванию аффинности, подтвердила следующую уникальную характеристику: вовлечение CD16A равномерное и не зависит от генотипического разнообразия CD16A (Таблица 5, Фиг. 18А, 18В и 20).

CD16A-специфическое связывание с отдаленным эпитопом и в присутствии IgG сыворотки

Кроме того, что CD16A демонстрирует высокую степень полиморфизма, аллотипические варианты CD16B человека (FcγRIIIB) отличаются пятью аминокислотами внеклеточного домена (ECD) (Фиг. 21), некоторые позволяют осуществлять дополнительное гликозилирование, которое приводит к трем различным вариантам антигенов гранулоцитов CD16B, прикрепленных посредством GPI, называемых NA1, NA2 и SH. Примечательно, что только два аминокислотных положения отличаются в ECD зрелых CD16A и В (Фиг. 21). Дополнительные вариации связаны с различными типами мембранного прикрепления CD16A и CD16B. Карбоксиконцевая последовательность пропептида CD16B, отщепляемая в зрелой GPI-заякоренной форме, имеет высокую степень гомологичности к последовательности, связывающей ECD CD16A с его трансмембранным доменом (Фиг. 21). Для исследования того, какой вариант последовательности CD16A/CD16B определяет сайт связывания в указанных строго CD16A-селективных антителах, получали и характеризовали набор рекомбинантных вариантов антигена CD16. ECD CD16B(NA1) или экспрессировался в зрелой форме (без пропептида) (CD16B^зрел.), или в виде предшественника, содержащего пропептидну последовательность (CD16B^пр.). Дополнительно, получали и исследовали в анализах связывания мутантные варианты ECD CD16B^пр., в которых CD16B-специфические аминокислоты заменяли гомологичными остатками CD16A: CD16B^{пр., D129G}, CD16B^{пр., H140Y}, СD16В^{пр., S185F}.

Все исследуемые варианты антигенов CD16A и CD16B распознавались антителом 3G8, специфическим ко всем формам CD16, подтверждая их молекулярную целостность (Фиг. 19А, 19В, 19С и Таблица 6). Антитела ScFv Ат16^средн. или с улучшенной аффинностью Ат16^выс. распознавали антиген CD16A, но не зрелые или содержащие пропептид антигены слияния ECD CD16B. Однако, если гистидин (Н) ECD CD16B в положении 140 изменяли на тирозин (Y), аминокислоту, присутствующую в соответствующем положении в CD16A, такая мутантная форма CD16B (CD16B^{пр., H140Y}) хорошо распознавались антителами scFv с оптимизированной аффинностью Ат16^средн. и Ат16^выс. (Фиг. 19А-19С, Таблица 6). Как показано на Фиг. 19А, 19В, и 19С, иллюстрируют, что тирозин (Y) в положении 140 является ключевым для образования конформационного эпитопа и CD16A-специфической реакционной способности антител scFv.

Оба scFv к CD16 демонстрировали хорошую перекрестную реактивность к CD16 яванского макака (Фиг. 19А, 19В, 19С и Таблица 6), несмотря на тот факт, что последовательность ECD CD16 яванского макака отличается в общем на 16 аминокислот от CD16A человека (см. выравнивание на Фиг. 21). Селективность связывания и важность тирозина (Y) в положении 140 в ECD CD16 для CD16A-специфического распознавания исследуемыми антителами Ат16^средн. и Ат16^выс. подтверждали с использованием рекомбинантных клеток СНО с трансгенной экспрессией различных вариантов антигена CD16 (Фиг. 19В). CD16A или CD16B^{пр., H140Y} в противоположность вариантам антигенов CD16B^пр. или CD16B^зрел. также распознавали после SDS-PAGE с помощью вестерн-блоттинга с использованием этих антител scFv (Фиг. 19С, и данные не показаны). Для восстановленных образцов не получали сигналов при вестерн-блоттинге (данные не показаны), что свидетельствует о том, что конформационный эпитоп в случае распознавания Ат16^средн. и Аb16^выс., может быть определен тирозином в положении 140 CD16.

Сайт связывания IgG на CD16A представляет собой прерывистую область связывания на проксимальном к мембране ECD рецептора. Ключевые аминокислоты для взаимодействия CD16A с участком Fc IgG с низкой аффинностью были ранее идентифицированы и описаны (Ahmed et al., J Struct Biol 2016; 194:78-89). Сообщалось, что антитело 3G8 связывается с CD16A и CD16B и блокирует связывание IgG (Tamm et al., J Immunol 1996; 157:1576-81). Не наблюдалось блокирования связывания исследуемых антител с CD16A за счет IgG. Хотя связывание мАт 3G8 с CD16A подавлялось с увеличением концентраций антитела scFv, содержащего соответствующие вариабельные домены 3G8, антитела scFv к CD16 Ат16^средн. и Ат16^выс. не блокируют или вытесняют мАт 3G8, связанное с CD16A, и связываются независимо (Фиг. 22) и с подобной афффинностью в отсутствие и в присутствии конкурирующего мАт 3G8 (Таблица 8). Как показано в Таблице 8, 3G8 блокировал сайт связывания Fc на CD16. Поскольку известно, что заполнение сайтов связывания 3G8 на CD16A блокирует связывание IgG, был сделан вывод, что сайт связывания исследуемых антител к CD16 на CD16A отличается от сайта связывания IgG. Следовательно, на величины k_d связывания NK-клеток антителами scFv Ат16^выс. и Ат16^средн. только в незначительной степени влияет добавление 10 мг/мл IgG человека IgG, тогда как аффинность связывания фрагментов, связывающих CD16, антитела 3G8 была более чем в 20 раз ниже в присутствии физиологических концентраций IgG (Таблица 7). Следовательно, эти результаты свидетельствуют, что исследуемые антитела, связывающие CD16A, Ат16^выс. и Ат16^средн. дают преимущество, состоящее в высокой аффинности связывания с CD16A-специфическим эпитопом, которая лишь в незначительной степени или совсем не ухудшается конкурирующими уровнями IgG (например, в крови человека), и затем их способность была использована в мультивалентных противоопухолевых антителах ROCK®, вовлекающих NK-клетки.

Система ROCK^®

Форматы ROCK^®

Для того чтобы продемонстрировать универсальность домена к CD16A и полностью использовать его потенциал, создавали широкий спектр архитектур ROCK^® на основании известных форматов антител (Spiess et al., Mol Immunol 2015; 67:95-106) и их новых разработанных вариантов.

Антитела системы ROCK^® являются мультивалентными и мультиспецифическими с по меньшей мере одним сайтом связывания мишени и двумя фрагментами, связывающими антиген CD16A, что делает возможным двухвалентное связывание. В зависимости от желаемых характеристик, например валентности, мультиспецифичности, фармакодинамических и фармакокинетических свойств, конструкции собраны из модулей связывающих доменов с константной областью или без нее. Форматы антител ROCK^® можно сгруппировать в четыре различных семейства, включающих i) ROCK^® без Fc, ii) ROCK^® слияние с Fc, iii) IgG-подобный ROCK^® и iv) ROCK^® слияние с участком связывания антигена (домен Fab). Фрагменты, связывающие целевые и эффекторные клетки, членов семейств ii), iii) и iv) могут быть представлены в формате или одноцепочечного Fv (scFv), одноцепочечного диатела (scDb), диатела (Db), или как Fab, что обеспечивает ряд функциональных свойств. Связывающие домены или слиты с N- и С-концами константных доменов СН2/СН3 посредством гибкого линкера, или, альтернативно, с N-концом посредством шарнирной области или более короткой средней шарнирной области (Merchant et al., Proc. Nail. Acad. Sci. U.S.A. 2013;110:E2987-96). Для семейства i) связывающие домены связаны пептидными линкерами и собраны как молекулы TandAb (McAleese et al.. Future Oncol 2012; 8:687-95) или aTriFlex (Gantke et al., Protein Eng Des Sel 2017; 30:673-84). Для того чтобы обеспечить сильное вовлечение и активацию NK-клеток фрагмент к CD16A разработан с возможностью двухвалентного связывания во всех семействах. Домен, связывающий опухолевую мишень, в вовлекающих агентах ROCK® может быть как одновалентным, так и двухвалентным, в зависимости от желаемой силы связывания и/или биологии мишени. Кроме того, модульное строение системы дает возможность конструкции мультивалентных и мультиспецифических вовлекающих агентов нацеливаться одновременно на более чем один опухолевый антиген. Фиг. 23 иллюстрирует все четыре семейства ROCK^® (i-iv), их связанные форматы. Для того чтобы продемонстрировать универсальность форматов ROCK^®, были выбраны фрагменты, связывающие различные мишени, например ВСМА, CD19, CD20, РЭФР, HSA или RSV.

Иллюстративные примеры конструкций ROCK^®, которые охарактеризованы более подробно в функциональных анализах, описанных в данном документе, нацелены мишень солидной опухоли РЭФР или антиген созревания В-клеток (ВСМА), мишень при множественной миеломе (Таблицы 9А, 9В и 9С). Символы, представленные на структурах в Таблицах 9А, 9В и 9С, согласуются с символами, представленными на Фиг. 23. Все конструкции ROCK^® состояли из полностью человеческих доменов антител и имели приблизительную молекулярную массу 102-250 кДа. В нескольких случаях добавляли тэги (С-тэг и/или 6xHis-тэг) на С-конец, чтобы сделать возможным селективную очистку гетеродимерных антител посредством аффинной хроматографии, анализ двух различных полипептидных цепей в асимметрических продуктах, высокую чистоту (>90%) желаемых частиц продукта.

Семейство (i) ROCK^® без Fc: Эта группа конструкций без Fc объединяет хорошо известные молекулы TandAb, несколько продуктов которого уже находятся на стадии клинических исследований (Reusch et al., MAbs 2014; 6:728-39; Reusch et al., MAbs 2015; 7:584-604; Ellwanger et al., Frontiers in Oncology 2017; 7; Reusch et al., Clin. Cancer Res. 2016;22:5829-38) и aTriFlex (Gantke et al., Protein Eng Des Sel 2017; 30:673-84) Последний можно сконструировать в триспецифическом формате, используя два scFv с различными специфичностями, чтобы нацеливать на два различных опухолеассоциированных антигена или целевых эпитопа или использовать для удлинения ФК. С этой целью использовали домены, связывающие сывороточный альбумин человека (HSA), для удлинения периода полувыведения из сыворотки в других случаях короткоживущего формата антитела без Fc. Оба формата в этом семействе собирали в виде димеров за счет взаимодействия соответствующих вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей на двух отдельных полипептидных цепях в виде гомодимеров «голова-к-хвосту» (формат TandAb) или в виде гетеродимеров типа «голова-к-хвосту» или «голова-к-голове» (aTriFlex). Члены этой группы являются наименьшими по размеру биспецифическими конструкциями ROCK^® с приблизительной массой функционального димера 105 кДа и отсутствием как участка Fc, так и гликозилирования.

Семейство (ii) ROCK^® слияния Fc: Это семейство содержащих Fc форматов антител содержит различные варианты Fc (Vidarsson et al.. Front Immunol 2014; 5:520; Baudino et al., J Immunol 2008; 181:6664-9; Hezareh et al., Journal of virology 2001; 75:12161-8), чтобы избежать связывания с рецептором Fcγ, но тем не менее сохранить способность связываться с FcγRn с увеличенным периодом полувыведения. Таким образом, связывание рецептора Fcγ опосредовано исключительно доменом, связывающим NK-клетки, и ограничено CD16A. Дополнительно, участок Fc этого семейства может быть или гомодимерным на основе IgG1 (би-scFv-Fc, Db-Fc), или гетеродимерным (KiH-scFv-Fc, KiH-scDb-Fc), или мономерным Fc (scDb-mFc). Для облегчения гетеродимеризации применяют технологию «выступы-во-впадины» (KiH), в которой используются классические мутации Y407T («впадина») и T366Y («выступ») (Ridgway et al., Protein Eng 1996; 9:617-21). Мономерный участок Fc (mFc) был сконструирован, как описано ранее (Ying et al., J. Biol. Chem. 2012;287:19399-408) с использованием гибких соединительных групп для слияния с фрагментами, связывающими мишень и NK-клетки. Фрагмент к CD16A расположен или напротив домена, связывающего мишень, на N- или С-конце, или рядом с ним на N-конце, как было показано для одной из конструкций KiH-scDb-Fc. Формат scDb для домена, связывающего CD16A, применяли в конструкциях KiH-scDb-Fc и scDb-mFc. Формат Db-Fc представляет собой гомодимер, содержащий молекулу диатела на С- или N-конце. Этот формат Db-Fc собран из двух доменов VL/VH, которые слиты с константными областями посредством гибкого линкера на С- или посредством удлиненной шарнирной области на N-конце.

Семейство (iii) IgG-подобных ROCK^®: Эта группа биспецифических антител охватывает scFv-IgAb и би-scFv-IgAb, которые по сути представляют собой «удлиненные молекулы IgG1 человека» (Coloma et al., Nat Biotechnol 1997; 15:159-63) с двумя фрагментами, связывающими антиген CD16A, слитыми с С-концом или расположенными на N-конце в качестве вариабельных фрагментов (Fv) в обоих плечах Fab. Это же справедливо для доменов, связывающих опухолевую мишень, которые расположены на соответствующих противоположных концах. Молекулы би-scFv-IgAb демонстрируют гексавалентную триспецифическую IgG-подобную архитектуру с двумя дополнительными парами антиген-связывающих scFv, слитых с С-концом константной области каппа или лямбда и CH3 посредством гибких линкеров.

Семейство (iv) ROCK^® слияние с Fab: Члены этой группы представляют собой «удлиненные молекулы Fab» и могут быть подразделены на форматы scDb-TriB и scDb-TriB-scFv. Оба содержат фрагменты, связывающие CD16A, в качестве двухвалентного scDb, слитого с С-концом константной области каппа или лямбда в scDb-TriB-scFv или в случае scDb-TriB к С-концу CH1. Для удлинения ФК вариабельный домен на N-конце фрагмента Fab обеспечивает связывание с HSA. Нацеливание на опухолевые клетки осуществляется как одновалентными (scDb-TriB-scFv), так и двухвалентными (scDb-TriB) связывающими фрагментами (scFv в сравнении с scDb), слитыми с соответствующим свободным С-концом.

В вовлекающих агентах ROCK® используется авидность для максимального усиления вовлечения NK-клеток посредством CD16A

Исследовали сохранение связывания CD16A различных форматов вовлекающих агентов ROCK® с использованием SPR и сравнивали с одновалентным связыванием scFv Ат16^выс. и со связыванием сконструированного Fc IgG1 (S239D/I332E) человека, усиливающего связывание с CD16A человека, путем сравнения диссоциации от CD16A-158V человека или CD16 яванского макака. Относительные сигналы связывания исследуемых антител в течение 3 ч диссоциации явно продемонстрировали превосходство в удерживании рецептора для всех исследуемых вовлекающих агентов ROCK® как на CD16A-158V человека(76,6%-92,5%), так и CD16 яванского макака (84,9%-97,9%) по сравнению со значительно более быстрой диссоциацией Fc IgG (S239D/I332E) (10%) или одновалентно связывающегося scFv Aт16^выс. (0%-2,4%) (Фиг. 24А-24С). В соответствии с результатами измерений диссоциации с помощью SPR, вовлекающие агенты ROCK®, например TandAb с доменами Fv Аb16^выс., продемонстрировали значительно более длительное удерживание на поверхности NK-клеток, чем классический IgG с доменом Fc дикого типа или усиленный IgG с мутациями S239D/I332E в Fc (Фиг. 25).

Кажущиеся силы связывания CD 16 различных агентов ROCK®, вовлекающих NK-клетки, все из которых содержат два сайта связывания CD16A, кроме того, зависели от природы вариабельного домена к CD16 (Ат16^выс. с высокой аффинностью или Ат16^средн. со средней аффинностью), формата антитела и положения фрагментов к CD16 в мультиспецифических (в том числе, но не ограничиваясь ими, би- или триспецифических) и многовалентных (тетра- или гексавалентных) агентах ROCK®, вовлекающих NK-клетки. Подобно одновалентно связывающим белкам, двухвалентные антитела ROCK®, связывающие CD16A за счет Ат16^выс., обладали более высокими аффинностями связывания в ELISA, чем соответствующие вовлекающие агенты ROCK®, содержащие домены Аb16^средн.. Дополнительно, различные положения доменов к CD16A в вовлекающих агентах ROCK® делали возможным постепенную регулировку аффинности: архитектуры ROCK®, содержащие фрагменты, связывающие CD16, на N-конце доменов Fc приводят к более высоким кажущимся аффинностям связывания с CD16A, чем антитела, содержащие домены к CD16 на С-конце Fc (Фиг. 26А и 26В). Точную регулировку аффинностей связывания можно осуществлять с использованием связывающих модулей на основе Fab или диатела на N-конце Fc, что усиливало силу связывания по сравнению со слиянием двух CD16-связывающих scFv (Фиг, 26А и 26В). Дополнительную регулировку силы связывания CD16 в вовлекающих агентах ROCK®, содержащих scFv на С-конце Fc, можно осуществить путем варьирования длины соединительной группы, причем более длинная соединительная группа обеспечивала более высокую кажущуюся аффинность связывания CD16, чем более короткая соединительная группа (Фиг. 26С). Вероятно, что не только авидность, но и стерические аспекты влияют на кажущиеся аффинности связывания в этих структурах, тогда как влияние различных типов специфичности связывания мишени, разработанных для связывания CD16A, было несущественным.

Для оценки того, коррелирует ли способность связывать CD16A, измеренная с помощью ELISA, со связыванием с NK-клетками, определенный набор вовлекающих агентов ROCK®, содержащих домены Fv Ат16^средн. Титровали на первичных NK-клетках человека в отсутствие и в присутствии поликлонального IgG человека, имитирующего физиологические условия в сыворотке человека, и кажущиеся аффинности определяли с помощью нелинейной регрессии (Фиг. 27А, 27В и 27С). Конструкции с доменами к CD16A в Fab или scFv на N-конце (scFv-IgAb_A и би-scFv-Fc_A) демонстрировали значительно более высокую аффинность к NK-клеткам относительно соответствующих конструкций с доменами к CD16A в scFv на С-конце (scFv-IgAb_B и би-scFv-Fc_C). Интересно, что TandAb с центральным диателом к CD16A (Таблица 9В) продемонстрировало подобную высокую аффинность к NK-клеткам, что и конструкции с Fab или scFv на N-конце, тогда как aTriFlex продемонстрировало наиболее низкую аффинность к NK-клеткам, несмотря на подобный мотив диатела к CD16A в центральной части конструкции, но также асимметрический порядок вариабельных доменов. Высокие концентрации IgG не влияли в значительной степени на кажущуюся аффинность TandAb и конструкций scFv-IgAb с доменами к CD16A в Fab на N-конце, умеренно влияли (коэффициент 4-9) на связывание конструкций, содержащих scFv к CD16A, независимо от того, слитых с конструкцией на N- или С-конце, и наиболее сильный ингибирующий эффект наблюдался для аффинности aTriflex.

Взаимное уничтожение NK-клетками друг друга и разработка форматов ROCK®

Многовалентные антитела к CD16 с высокой аффинностью содержат в себе риск перекрестного связывания рецептора на нескольких NK-клетках, что приводит к CD16A-опосредованному уничтожению перекрестие связанных клеток, таким образом вызывая деплецию популяции NK-клеток (Choi et al., Immunology 2008; 124:215-22). Такое взаимное уничтожение NK-клетками друг друга уже было продемонстрировано для других моноклональных антител, например даратумумаба, который нацелен на CD38 на плазматической мембране NK-клеток (Casneufet al., Blood Adv. 2017 Oct 24;1(23):2105-2114). Сокращение популяции основным эффекторных клеток, по-видимому, ухудшает эффективность опосредованного антителом противоопухолевого ответа. Поэтому был организован in vitro анализ для контроля степени NK-клеточного взаимного уничтожения, вызванного различными форматами ROCK®. В этом анализе использовали первичные NK-клетки от одного и того же донора в качестве эффекторных клеток и клеток-мишеней, что позволяет определить активность NK-клеточного лизиса, как описано выше. В качестве положительного контроля в анализ был включен даратумумаб. Авторы изобретения никогда не наблюдали NK-NK-клеточное взаимное уничтожение для антител, содержащих только один сайт связывания для CD16A, что свидетельствует о том, что двухвалентность к CD16A является необходимым условием для перекрестного связывания NK-клеток и последующего взаимного уничтожения. Интересно, что в зависимости от формата антитела ROCK® и порядка доменов, можно модулировать не только возникновение NK-клеточного взаимного уничтожения, но также активность уничтожения NK-клетками (Фиг. 28).

В общем, все проанализированные форматы антител ROCK® продемонстрировали улучшенный профиль NK-клеточного взаимного уничтожения в отличие от даратумумаба, который приводил к направленному уничтожению NK-клеток со средней активностью 158 пМ. Все исследуемые форматы антител ROCK® характеризовались или менее явным, или полным отсутствием NK-клеточного уничтожения.

Вовлечение CD16A посредством слитых на N-конце фрагментов к CD16A антител ROCK®, по-видимому, устраняет NK-клеточное взаимное уничтожение более надежно по сравнению с вовлечение CD16A на С-конце. Однако, более подробная фокусировка на N-концевом вовлечении CD16 показала более заметную деплецию NK-клеток с использованием вовлечения CD16A на основе Fab со средними значениями активности от 1439 до 2389 пМ.

Интересно, что при анализе порядка доменов Fv CD16 установлено, что значительно меньшее количество конструкций вызвало NK-клеточное взаимное уничтожение, когда порядок доменов представлял собой VL-VH, в отличие от конструкций, содержащих порядок доменов VH-VL, все из которых вызывали NK-клеточный лизис. Среди тех антител ROCK®, которые содержали домены VL-VH Fv CD16 или на С-, или на N-конце, только несколько конструкций вообще вызывали NK-клеточное взаимное уничтожение.

Таким образом, доля антител, вызывающих взаимное уничтожение NK-клеток, а также активность уничтожения NK-клеток может быть эффективно ослаблена за счет устранения вовлечения CD16A на основе Fab и фокусировки на нужном порядке VL-VH домена Fv, связывающего CD16.

Превосходная in vitro цитотоксичность вовлекающих агентов ROCK

In vitro цитотоксичность различных вовлекающих агентов ROCK®, нацеленных на РЭФР или ВСМА, оценивали в анализах высвобождения кальцеина (Фиг. 29А, 29В, 29С, 29D и 29Е). Вовлекающие агенты, нацеленные на ВСМА, с доменами Fv Ат16^выс. (TandAb A, scFv-IgAb_D, би-scFv-Fc_В и KiH-scDb-Fc_A) сравнивали с вовлекающим агентом scFv-IgAb_E, содержащим Fv Ат16^выс., и Fc-усиленным IgG1 к ВСМА с мутациями S239D/I332E в Fc (IgAb_С) в клетках-мишенях, экспрессирующих высокие (NCI-H929), средние (MM. 1S) или низкие (MC/CAR) уровни ВСМА на клеточной поверхности (Фиг. 29А-29С). Иллюстративные результаты цитотоксичности указывали только на незначительные различия в активности и эффективности среди различных форматов вовлекающих агентов ROCK® в клетках-мишенях NCI-H929 с ВСМА^выс. (интервал ЕС₅₀: 9,5 пМ - 52,7 пМ), подобную эффективность, но более сильные различия в активности (интервал ЕС₅₀: 1,8 пМ - 29,1 пМ) в клетках-мишенях MM. IS с ВСМА^средн., и сильные различия в эффективности и активности (интервал ЕС₅₀: 59 пМ - 859 пМ) в клетках-мишенях MAC/CAR с ВСМА^низк.. Более низкие значения ЕС₅₀ были получены для нацеленных на ВСМА TandAb_A, KiH-scDb-Fc_А и scFv-IgAb_D. Эти результаты свидетельствуют о том, что двухвалентность к CD16A и кажущиеся аффинности для NK-клеток являются благоприятными для запуска опосредованного NK-клетками лизиса менее восприимчивых клеток-мишеней и/или клеток-мишеней, экспрессирующих более низкие количества целевых антигенов на поверхности клетки. Следует отметить, что только двухвалентности к CD16A не было достаточно для опосредования активации NK-клеток, поскольку вызванная антителом экспрессия маркера активации NK-клеток CD69 и высвобождение цитокинов в культурах МКПК человека сильно зависела от наличия клеток-мишеней (Фиг. 49A-49F). Кроме того, уровни воспалительных цитокинов, высвобожденных в культурах МКПК человека за счет антител ROCK®, вовлекающих NK-клетки, были на несколько порядков ниже, чем уровни цитокинов, высвобожденных за счет направленных на ВСМА агентов, вовлекающих Т-клетки (Фиг. 50).

Подобно результатам, полученным с вовлекающими агентами ROCK, нацеленными на ВСМА, вовлекающие агенты ROCK®, нацеленные на РЭФР, продемонстрировали превосходную активность в анализах уничтожения на клетках-мишенях SW-982 и А-431, достигая однозначных пМ величин ЕС₅₀, по сравнению с Fc-усиленным IgG1 к РЭФР с мутациями S239D/I332E в Fc (IgAb_D), классическим нацеленным на РЭФР IgG1 (IgAb_В) или связывающимися одновалентно биспецифическими вовлекающими агентами (BiKE), содержащими идентичные домены, связывающие эффектор и мишень (Фиг. 29D и Фиг. 51). aTriFlex_A к РЭФР/CD16A, несмотря на значительно более низкую кажущуюся аффинность к NK-клеткам человека по сравнению с другими вовлекающими агентами ROCK® (Фиг. 27А-27С) продемонстрировал активность, подобную Fc-усиленному IgG1 к РЭФР (IgAb_D) (Фиг. 51). Неспецифическое уничтожение можно исключить, поскольку нацеленный на ВСМА scFv-IgAb_E не демонстрировал активности уничтожения РЭФР-положительной, ВСМА-негативной линии клеток-мишеней А-431 (Фиг. 51).

Анализ кажущихся аффинностей различных вовлекающих агентов к BCMA/CD16A и соответствующая активность в in vitro анализах цитотоксичности, показанных на Фиг. 29Е, свидетельствует о корреляции кажущейся аффинности к CD16A на NK-клетках и активности. Корреляция наблюдалась не только в 3-часовых анализах цитотоксичности в клетках-мишенях RPMI-8226 при Е:Т, составляющем 2:1, но также в 4-часовых анализах в клетках-мишенях NCI-H929 при соотношении Е:Т, составляющем 5:1, подтверждая то, что высокая аффинность связывания с CD16A на NK-клетках дает вклад в превосходную цитотоксическую активность.

Преимущество ROCK® TandAb, нацеленного на CD30/CD16A, по сравнению с традиционными и Ес-сконструированными антителами к CD30, было даже более явным, когда in vitro анализы цитотоксичности выполняли в присутствии физиологических уровней конкурирующего IgG. Дополнение 10 мг/мл поликлонального IgG отчетливо усиливало исходный лизис во всех культурах (Фиг. 52В), наиболее вероятно вследствие вызванной IgG сыворотки дегрануляции NK-клетками (Jacobi et al., Clin. Immunol. 2009;133:393-401). Однако, конкуренция с моноклональным IgG (Фиг. 52С) или Fc-сконструированным IgG (Фиг. 52D) полностью блокировало активность или явно нарушало активность и эффективность традиционных антител. Антитело ROCK TandAb к CD30/CD16A продемонстрировало максимальную цитотоксическую активность и эффективность во всех тестируемых условиях, даже в присутствии физиологических концентраций конкурирующего IgG (Фиг. 52A-52D, Таблица 10).

4-Часовые анализы цитотоксичности на основе высвобождения кальцеина с мечеными кальцеином CD30+ клетками-мишенями KARPAS-299 с первичными NK-клетками в качестве эффекторных клеток при соотношении Е:Т 5:1 в присутствии последовательно разбавленных TandAb к CD30/CD16A, IgG1 (IgAb) к CD30 или IgG1 с усиленным Fc к CD30 (IgAb (Fc-усиленный)). Анализы выполняли в среде RPMI 1640 отдельно или среде, дополненной 10 мг/мл поликлонального IgG человека, 10 мг/мл моноклонального IgG1 к РЭФР (IgAb_B) или 10 мг/мл IgG1 с усиленным Fc к РЭФР (IgAb_D (Fc-усиленный)).

Модулирование ФК

Другой важный параметр для терапевтических антител представляет собой их период полувыведния из сыворотки. Для антител с высокой цитотоксичностью короткий период полувыведения может быть предпочтительным, так как обеспечивает быстрый клиренс. В отличие от этого для антител с хорошими профилями безопасности более длительные периоды полувыведения, вероятно, будут предпочтительными для повышения удобства для пациента путем устранения необходимости частого введения или выполнения продолжительных инфузий.

Основные фармакокинетические параметры выбранной группы форматов системы ROCK® анализировали на мышах CD-1 SWISS. Для IgG-подобного семейства вовлекающих агентов ROCK^® выбрали два иллюстративных антитела scFv-IgAb (scFv-IgAb_А и scFv-IgAb_D), каждое из которых содержало фрагменты к CD16 в Fab на N-конце или в виде scFv, слитых с С-концом СН3. Для семейства вовлекающих агентов ROCK® слияния с Fc анализировали симметрическое би-scFv-Fc_A и асимметрическое, scDb-содержащее антитело KiH-scDb-Fc_А. Наконец, для семейств слияния с Fab и без Fc для анализа ФК были выбраны TandAb_В, aTriFlex_A, aTriFlex_В и scDb-Trib_А. В двух последних используется HSA-связывающий фрагмент с низкой аффинностью по сравнению с HSA-связывающим доменом с высокой аффинностью в aTriFlex_A для удлинения ФК. Домены, нацеленные на опухоль, в выбранных вовлекающих агентах ROCK® были специфичны или РЭФР, или ВСМА человека. Поскольку фрагменты, связывающиеся как с мишенью, так и CD16A, не реагируют перекрестно с соответствующими мышиными аналогами (данные не показаны), невозможно предположить каких-либо фармакодинамических эффектов, связанных с мишенью. Образцы сыворотки крови от животных, получивших одно внутривенное введение 0,3 мг (~10 мг/кг массы тела) различных исследуемых образцов собирали в различные моменты времени в течение периода от 1 до 3 недель и анализировали по установленным методикам на основании технологий ELISA или MSD. Основные фармакокинетические параметры определяли с помощью некомпартментного фармакокинетического анализа (Таблица 11). Символы, представленные на структурах в Таблице 11, согласуются с символами, представленными на Фиг. 23. После внутривенного введения различных форматов ROCK^® концентрации в сыворотке падали биэкспоненциальным образом (Фиг. 30). Показано, что периоды полувыведения обоих IgG-подобных форматов находились в одном и том же интервале, 329,2 и 364,3 часов, соответственно, и сравнимы со стандартными молекулами IgG⁶³. Более короткие периоды полувыведения, 95,8 или 74,3 часов, соответственной, были получены для форматов слияния с Fc, би-scFv-Fc_А и KiH-scDb-Fc_А. Их периоды полувыведения из сыворотки находились между IgG-подобным форматом и форматами ROCK^® без Fc и слияния с Fab. Однако период наблюдения для би-scFv-FcA составлял только 1 неделю по сравнению с 3 неделями для обоих форматов scFv-IgAb. Следовательно, эта величина может быть заниженной. Наиболее короткие периоды полувыведения были получены для ROCK^® форматов без Fc и слияния с Fab. Средние кажущиеся конечные периоды полувыведения составляли 37,4 часа для aTriFlex_А, содержащего фрагмент, связывающий HSA, с высокой аффинностью, и 18,0 часов для TandAb. Домен к HSA с низкой аффинностью в scDb-Trib_A не смог удлинить период полувыведения этой конструкции (14,0 часов). Подобное ранжирование можно выполнить на основании средних времен удержания (MRT), которые определяют неизменное лекарственное средство в кровотоке. Наиболее высокие MRT были продемонстрированы для IgG-подобных исследуемых образцов и исследуемых образцов слияния с Fc, составляющие от 528,5 до 110,6 часов, за которыми следуют относительно короткие величины MRT от 61,6 до 28,5 часов для форматов без Fc и слияния с Fab, представленных TandAb, aTriFlex и scDb-Trib, соответственно. Такое ранжирование также справедливо для клиренса (С), изменяющегося от 0,006 до 1,228 мл/ч, причем наивысшее значение получено для конструкции TandAb, не содержащей ни Fc, ни домен к HSA. Важный параметр также определяется площадью под кривой (AUC), который устанавливает максимальное количество или воздействие молекулы в организме со временем. Как и ожидалось, наивысшие значения AUC были достигнуты для Fc-содержащих форматов. Примерно в 10 раз меньшие величины были измерены для меньших форматов без Fc. TandAb снова продемонстрировало наименьшее воздействие со 100-кратным отличием в AUC по сравнению с долгоживущими исследуемыми образцами. Стационарный объем распределения (V_ss), который определяет кажущийся объем, необходимый для обеспечения общего количества лекарственного средства в организме, если лекарственное средство равномерно распределено по организму, был наивысшим для TandAb (4,8 мл), затем для обоих IgG-подобных (3,3 мл и 3,1 мл, соответственной), слияние с Fc (2,2 мл), aTriFlex (2,2 мл) и триатело scDb (1,5 мл). Наиболее низкое значение V_ss триатела scDb подразумевает, что большинство молекул остается в компартменте крови (крови). В заключение необходимо отметить, что различные форматы ROCK^® демонстрировали различные профили ФК у мышей CD-1 с периодами полувыведения в интервале от 14 до 364 часов.

Пример 8 - Активность антител, связывающих CD16A/BCMA

8.1. Антитела, связывающие CD16A/BCMA

В этом Примере представлены исследования антител, связывающих CD16A/BCMA: антитело I к CD16A/BCMA, антитело II к CD16A/BCMA и антитело III к CD16A/BCMA.

Как продемонстрировано данными, показанными в этом Примере, антитело I к CD16A/BCMA представляет собой агент, вовлекающий NK-клетки, для применения в лечении множественной миеломы с подобным механизмом, что и ADCC, и способно достичь значительной активности с благоприятным профилем безопасности. Дополнительно, показано, что антитело I к CD16A/BCMA способно лечить пациентов с множественной миеломой, резистентных и рефракторных к даратумумабу (антитело к CD38). Кроме того, антитело I к CD16A/BCMA можно объединить с другим лечением множественной миеломы, например, способами лечения, включающими антитело (в том числе, но не ограничиваясь ими, антитело к TIGIT, антитело к PD1, антитело к PD-L1 и антитело к VEGF), и способами лечения, включающими цитокин (например, ИЛ-12, ИЛ-2 и т.д.).

8.1.1. Антитело I к CD16A/BCMA

Антитело I, связывающее CD16A/BCMA, представляет собой антигенсвязывающий белок scFv-IgAb, имеющий структуру, представленную на Фиг. 13, который содержит (а) два фрагмента, связывающих антиген CD16A, в формате scFv, слитых с С-концом гомодимерного участка Fc СН2-СН3 IgG человека в порядке V_L-V_H и (b) два фрагмента, связывающих целевой антиген, представленных каждым Fv в плечах Fab IgG, причем фрагменты, связывающие целевой антиген, связываются с ВСМА.

Каждый из фрагментов, связывающий антиген CD16A, содержит CDR1 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 73, CDR2 V_H c аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 74, V_H CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 75, CDR1 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 76, CDR2 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 77, и CDR3 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 78. CDR идентифицированы в соответствии с системой нумерации по Кабату. Каждый из фрагментов, связывающих антиген CD16A, содержит V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, и V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2.

Фрагмент, связывающий антиген CD16A, антитела I к CD16A/BCMA слит с С-концом участка Fc молекулы и присоединен с помощью соединительной группы (с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 22), в следующем порядке: V_L (CD16A)-линкер L3- V_L (CD16A). Линкер L3 имеет амиеокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18.

Каждый из фрагментов, нацеленных на ВСМА, содержит CDR1 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 67, CDR2 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 68, V_H CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 69, CDR1 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 70, CDR2 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 71, и CDR3 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 72. CDR идентифицированы в соответствии с системой нумерации по Кабату. Каждый из фрагментов, нацеленных на ВСМА, содержит V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 65, и V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 66.

Антитело I к CD16A/BCMA содержит два фрагмента, связывающих антиген CD16A, и два фрагмента, нацеленных на ВСМА, причем (а) каждый из двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, содержит CDR1 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 73, CDR2 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 74, CDR3 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 75, CDR1 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 76, CDR2 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 77, и CDR3 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 78; и (b) каждый из двух фрагментов, нацеленных на ВСМА, содержит CDR1 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 67, CDR2 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 68, CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 69, CDR1 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 70, CDR2 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 71, и CDR3 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 72.

Сводка последовательностей CDR фрагментов, связывающих антиген CD16A, и фрагментов, нацеленных на ВСМА, в антителе I к CD16A/BCMA показана на Фиг. 53А и 53С.

Антитело I к CD16A/BCMA содержит два фрагмента, связывающих антиген CD16A, и два фрагмента, нацеленных на ВСМА, причем (а) каждый из двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, содержит V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2; и (b) каждый из двух фрагментов, нацеленных на ВСМА, содержит V_H, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 65, и V_L, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 66.

Сводка последовательностей V_H и V_L, фрагментов, связывающих антиген CD16A, и фрагментов, нацеленных на ВСМА, в антителе I к CD16A/BCMA показана на Фиг. 53В и 53D. Участок Fc антитела I к CD16A/BCMA представляет собой сайленсированный участок Fc, который содержит константный домен тяжелой цепи СН2 и СН3 IgG1 человека, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в SED ID NO: 29. Константный домен тяжелой цепи СН2 содержит две сайленс-мутации (также обозначаемые как «мутации, приводящие к снижению эффекторной функции»): L234F и L235E. Константный домен тяжелой цепи СН2 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SED ID NO: 79. Константный домен тяжелой цепи СН3 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SED ID NO: 109. Константный домен тяжелой цепи СН1, который связан с фрагментом, нацеленным на ВСМА, содержит аминокислотную последовательность, представленную в SED ID NO: 33.

Антитело I к CD16A/BCMA содержит полипептидную цепь 1, содержащую фрагмент, связывающий антиген CD16A, гомодимерный участок Fc СН2-СН3 IgG человека, V_H фрагмента, нацеленного на ВСМА, причем полипептидная цепь 1 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 61. Антитело I к CD16A/BCMA содержит полипептидную цепь 2, содержащую V_L фрагмента, нацеленного на ВСМА, причем полипептидная цепь 2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 62.

8.2.1. Антитело II к CD16A/BCMA

Антитело II к CD16A/BCMA представляет собой не содержащее Fc TandAb со структурой, показанной на Фиг. 23 (см. структуру для «TandAb»), которое содержит два фрагмента, связывающих антиген CD16A, и два фрагмента, связывающий целевой антиген, причем фрагмент, связывающий антиген CD16A, представлен в формате scFv и расположен между V_H и V_L фрагмента, связывающего целевой антиген.

Фрагмент, связывающий антиген CD16A, слит с фрагментом, связывающим целевой антиген в следующем порядке:

V_H ВСМА-Линкер L5-V_L CD16A-Линкер L6-V_H CD16A-Линкер L5-V_L ВСМА

Линкер L5 имеет амиеокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 129. Линкер L5 имеет амиеокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 130.

Каждый из фрагментов, связывающий антиген CD16A, содержит CDR1 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 73, CDR2 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 74, V_H CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 75, CDR1 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 76, CDR2 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 77, и CDR3 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 78. CDR идентифицированы в соответствии с системой нумерации по Кабату. Каждый из фрагментов, связывающих антиген CD16A, содержит V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, и V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2.

Каждый из фрагментов, нацеленных на ВСМА, содержит CDR1 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 67, CDR2 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 68, V_H CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 69, CDR1 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 70, CDR2 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 71, и CDR3 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 72. CDR идентифицированы в соответствии с системой нумерации по Кабату. Каждый из фрагментов, нацеленных на ВСМА, содержит V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 65, и V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 66.

Антитело II к CD16A/BCMA содержит два полипептида, каждый из которых имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 126.

8.3.1. Антитело III к CD16A/BCMA

Антитело III к CD16A/BCMA представляет собой KiH-scDb-Fc, имеющий структуру, показанную на Фиг. 5, который содержит (а) два фрагмента, связывающих антиген CD16A, в формате scDb, слитые с С-концом участка Fc СН2-СН3 IgG в порядке V_L-V_H-V_L-V_H, и (b) один фрагмент, связывающий целевой антиген, в формате scFv, слитый с N-концом участка Fc, причем фрагмент, связывающий целевой антиген, связывается с ВСМА.

Каждый из фрагментов, связывающий антиген CD16A, содержит CDR1 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 73, CDR2 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 74, V_H CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 75, CDR1 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 76, CDR2 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 77, и CDR3 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 78. CDR идентифицированы в соответствии с системой нумерации по Кабату. Каждый из фрагментов, связывающих антиген CD16A, содержит V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, и V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2.

Фрагмент, связывающий антиген CD16A, слит с гетеродимерным участком Fc и присоединен с помощью соединительной группы с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 20, в следующем порядке: V_L (CD16A)-Линкер L1-V_H (CD16A)-Линкер L2-V_L (CD16A)-Линкер L1-V_H (CD16A). Линкер L1 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16, и линкер L2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17.

Фрагмент, нацеленный на ВСМА, содержит CDR1 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 67, CDR2 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 68, V_H CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 69, CDR1 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 70, CDR2 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 71, и CDR3 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 72. CDR идентифицированы в соответствии с системой нумерации по Кабату. Каждый из фрагментов, нацеленных на ВСМА, содержит V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 65, и V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 66.

Антитело III к CD16A/BCMA содержит два фрагмента, связывающих антиген CD16A, и один фрагмент, нацеленный на ВСМА, причем (а) каждый из двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, содержит CDR1 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 73, CDR2 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 74, CDR3 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 75, CDR1 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 76, CDR2 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 77, и CDR3 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 78; и (b) фрагмент, нацеленный на ВСМА, содержит CDR1 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 67, CDR2 V_H с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 68, CDR3 с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 69, CDR1 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 70, CDR2 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 71, и CDR3 V_L с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 72.

Участок Fc антитела III к CD16A/BCMA представляет собой сайленсированный участок Fc, который содержит константный домен тяжелой цепи СН2 и СН3 IgG1 человека с аминокислотной последовательностью, представленной в SED ID NO: 31. Константный домен тяжелой цепи СН2 содержит две сайленс-мутации (мутации, приводящие к снижению эффекторной функции): L234F и L235E. Константный домен тяжелой цепи СН2 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SED ID NO: 79. Константный домен тяжелой цепи СН3 содержит одну сайленс-мутацию (мутацию, приводящую к снижению эффекторной функции) D265A. Константный домен тяжелой цепи СН3 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SED ID NO: 81.

Антитело III к CD16A/BCMA содержит полипептидную цепь 1, содержащую два фрагмента, связывающих антиген CD16A, и участок Fc СН2-СН3 IgG, причем полипептидная цепь 1 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 63. Антитело III к CD16A/BCMA содержит полипептидную цепь 2, содержащую один фрагмент, нацеленный на ВСМА, причем полипептидная цепь 2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 64.

8.2. Характеристики связывания

Как антитело I к CD16A/BCMA, так и антитело III к CD16A/BCMA специфически связываются с CD16A, но не CD16B. Антитело I к CD16A/BCMA имеет высокую аффинность связывания с CD16A и ВСМА, например, антитело связывается с CD16A с K_D, составляющей около 16 нМ, и связывается с ВСМА с K_D, составляющей около 2 нМ.

Антитело I к CD16A/BCMA не связывается с FcγR, что подтверждено с помощью ELISA. Поскольку антитело I к CD16A/BCMA не связывается с CD16A посредством своей области Fc, оно связывается с CD16A независимо от полиморфизма CD16A. Например, цитотоксичность антитела I к CD16A/BCMA по отношению к клеточным линиям множественной миеломы оценивали с CD16A-158V/V от здоровых доноров и с CD16A-158F/F от здоровых доноров в один и тот же день. Результаты показаны на Фиг. 31А и 31В. Антитело I к CD16A/BCMA или не демонстрировало никаких изменений, или демонстрировало даже повышенную активность по отношению к CD16A-158F/F по сравнению с CD16A-158V/V. В отличие от этого, даратумумаб, который связывается посредством своей области Fc с CD16a, демонстрирует сниженную активность по отношению к CD16A-158F/F по сравнению с CD16A-158V/V. Цитотоксичность антитела I к CD16A/BCMA по отношению к клеточным линиям множественной миеломы также оценивали с CD16A-158V/F от здоровых доноров, и она находилась между цитотоксичностью, наблюдаемой для CD16A-158F/F и CD16A-158V/V (данные не показаны).

8.3 Цитотоксичность клеток-мишеней множественной миеломы in vitro

8.3.1. Оценка цитотоксичности с использованием анализов цитотоксичности на основе кальцеина AM

Анализы цитотоксичности на основе кальцеина AM выполняли с использованием NK-клеток человека в качестве эффекторных клеток и клеточной линии множественной миеломы как клеток-мишеней. Кратко, клетки-мишени метили 10 мкМ кальцеина AM (Thermo Fisher Scientific; Уолтем, Массачусетс) в течение 30 минут при 37°С в бессыроваточной среде непорседственно перед анализом. После двух промывания посредством центрифугирования клетки ресуспендировали в среде для анализа (RPMI 1640, дополненная 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки) и распределяли в 96-луночные планшеты для культивирования тканей с U-образным дном при плотности 1×10⁴ клеток/лунка. Затем в каждую лунку добавляли свежеподготовленные эффекторные клетки при плотности 5×10⁴ клеток/лунка. После 30 минут инкубации в планшеты добавляли последовательно разбавленные исследуемые образцы (0,64, 3,2, 16, 80, 400 и 2000 пМ) и инкубировали в течение еще 4 часов при 37С во влажной камере с 5% CO₂. После инкубирования планшеты центрифугировали при 300 × g в течение 10 минут. Супернатанты переносили в черные непрозрачные 96-луночные микропланшеты (OptiPlate-96; PerkinElmer; Уолтем, Массачусетс), и флуоресцентные сигналы измеряли в относительных единицах флуоресценции (ОЕФ) с использованием планшет-ридера Infinite M1000 PRO (Tecan Trading AG; Маннедорф, Швейцария) с возбуждением/эмиссией при 495/515 нм. Сигналы из лунок, содержащих только клетки-мишени, представляли спонтанное высвобождение кальцеина из меченных клеток, тогда как лунки, содержащие клетки-мишени, лизированные 10% тритона Х-100 (Sigma-Aldrich; Сент-Луис, Миссури), представляли максимальное высвобождение. Неспецифическую цитотоксичность, опосредованную эффекторными клетками, измеряли в лунках, содержащих клетки-мишени и эффекторные клетки без добавления исследуемых образцов. Степень специфической цитотоксичности рассчитывали следующим образом:

Цитотоксичность, % = 100 * (экспериментальное высвобождение неспецифическое высвобождение) / (максимальное высвобождение спонтанное высвобождение)

Данные анализировали и представляли графически, аппроксимируя четырехпараметрической нелинейной регрессионной моделью с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 6 (GraphPad Software; Сан-Диего, Калифорния).

Результаты приведены в Таблице 12.

8.3.2. Оценка цитотоксичности с использованием FACS

МКПК человека и выделенные NK-клетки были выделены из крови здорового донора-человека А и были заморожены для последующих экспериментов. МКПК после размораживания были жизнеспособными на ~85%, что определено окрашиванием триптановым синим и позднее подтверждено с помощью FACS с 7AAD. МКПК культивировали совместно с ВСМА⁺ линиями опухолевых клеток множественной миеломы при соотношении Е:Т около 0,4 или около 4-5, и подвергали действию последовательно разбавленных в 3 раза исследуемых образцов в интервале 0,1-3000 пМ в течение приблизительно 20 часов при 37С с 5% СО₂. Окрашивание антителами и FACS использовали для определения экспрессии ВСМА в опухолевых клетках ММ и наблюдения за цитотоксичностью клеток-мишеней множественной миеломы. Данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo и GraphPad Prism 6. Результаты показаны на Фиг. 32А-32Е, 33А-33С и 34А-34С. Фиг. 32А-32Е иллюстрируют, что антитело I CD16A/BCMA было эффективным при соотношении Е:Т около 0,4 (определено в группе пациентов с множественной миеломой). Фиг. 33А-33С и 34А-34С иллюстрируют что, NK-клетки человека, на которые воздействовали антителом I к CD16A/BCMA, специфически нацеливались и вызывали деплецию ВСМА⁺ клеток-мишеней.

Оценки, выполненные с помощью обоих способов, демонстрируют, что антитело I к CD16A/BCMA является активным in vitro в ироком диапазоне целевых уровней экспрессии. Наблюдаемая эффективность не коррелировала с соотношением Е:Т и не коррелировала с экспрессией ВСМА. Кроме того, антитело I к CD16A/BCMA, продемонстрировало активность, подобную даратумумабу, на клеточные линии множественной миеломы. См. Фиг. 33А-33С.

8.4. Цитотоксичность по отношению к опухолевым клеткам с низкой экспрессией ВСМА in vitro

In vitro цитотоксичность по отношению к линии опухолевых клеток Raji с низкой экспрессией ВСМА для антитела I к CD16A/BCMA оценивали с помощью анализа высвобождения кальцеина и FACS. В этом исследовании использовали анализы высвобождения кальцеина, применяемые для in vitro оценки цитотоксичности клеток-мишеней множественной миеломы, описанные выше. Соотношение Е:Т свежеподготовленных NK-клеток и линии опухолевых клеток лимфомы Беркитта Raji составляло около 5. Результаты показаны на Фиг. 35А-35D. In vitro лизис ВСМА+ клеток-мишеней наблюдался для антитела I к CD16A/BCMA, антитела II к CD16A/BCMA и антитела III CD16A/BCMA, несмотря на практически необнаружимую поверхностную экспрессию ВСМА.

В анализе FACS NK-клетки человека выделяли из крови здорового донора-человека. NK-клетки и клетки Raji предварительно инкубировали отдельно с 0,5 мг/мл IgG человека с низкой эндотоксичностью в течение по меньшей мере 1 часа до начала анализа. NK-клетки культивировали совместно с линией опухолевых клеток лимфомы Беркитта Raji при приблизительном соотношении Е:Т 5, и подвергали действию последовательно разбавленных в 3 раза исследуемых образцов в интервале 10-1000 пМ в течение приблизительно 20 часов при 37°С с 5% СО₂. Окрашивание антителами и FACS использовали для наблюдения за цитотоксичностью клеток-мишеней RAJI. Данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo и GraphPad Prism 6. Результаты показаны на Фиг. 36А-36С. Как показано на Фиг. 36С, антитело I CD16A/BCMA продемонстрировало in vitro цитотоксичность по отношению к опухолевой клеточной линии Raji с низкой экспрессией ВСМА.

8.5. Активность in vitro по отношению к аутологическим ВСМА⁺ нормальным плазматическим клеткам человека

Активность in vitro антитела I к CD16A/BCMA по отношению к аутологическим ВСМА⁺ нормальным плазматическим клеткам человека оценивали с помощью FACS. NK-клетки человека выделяли из периферической крови здорового донора-человека. Костный мозг того же донора-человека использовали для выделения плазматических клеток человека. NK-клетки, плазматические клетки и клетки NCI-H929 предварительно инкубировали отдельно с 0,5 мг/мл IgG человека с низкой эндотоксичностью в течение по меньшей мере 1 часа до начала анализа. Аллогенные: NK-клетки культивировали совместно с линией опухолевых клеток NCI-H929 при приблизительном соотношении Е:Т, составляющем 3, и одновременно подвергали действию последовательно разбавленных в 3 раза исследуемых образцов в интервале 3-3000 пМ в течение приблизительно 20 часов при 37°С с 5% CO₂. Аутологические: NK-клетки культивировали совместно с плазматическими клетками человека при приблизительном соотношении Е:Т, составляющем 23, и инкубировали с исследуемыми образцами, как описано выше. Окрашивание антителами с помощью антител к CD56 Е-450 и CD138-APC с последующим FACS использовали для контроля цитотоксичности Н929 и плазматических клеток. Данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo и GraphPad Prism 6.

Результаты показаны на Фиг. 37А и 37В. Антитело I к CD16A/BCMA продемонстрировало in vitro активность по отношению к аутологическим ВСМА⁺ нормальным плазматическим клеткам человека.

8.6. Отсутствие активации CD16A в отсутствие ВСМА⁺ клеток-мишеней

Исследователи также исследовали, может ли антитело I к CD16A/BCMA активировать NK-клетки в отсутствие ВСМА⁺ клеток-мишеней. Во-первых, была изучена активация CD16 и поддержание уровней CD16 на NK-клетках в присутствии ВСМА⁺ клеток-мишеней. NK-клетки были получены из крови двух различных здоровых доноров-людей. NK-клетки культивировали совместно с ВСМА⁺ клетками-мишенями MM.1S и воздействовали 0, 0,03 или 0,1 нМ антитела I к BCMA/CD16A или Ат-1 (отрицательный контроль/CD16a) или антитела к CD38 (DARA-положительный контроль) в течение 20 часов при 37°С. Окрашивание антителами и FACS использовали для определения количества живых CD561^дим./CD16⁺ клеток и CD56^дим./CD16⁺/CD69⁺/CD25⁺, как проиллюстрировано на Фиг. 34А и 34В, соответственно. Деплеция ВСМА⁺ клеток-мишеней представлена на Фиг. 34С. Данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo и GraphPad Prism 6. Результаты показаны на Фиг. 38А-38С. Антитело к CD16A/ВСМА активировало и поддерживало уровни CD16 на NK-клетках в присутствии ВСМА⁺ клеток-мишеней.

Затем, была изучена активация CD16 и поддержание уровней CD16 на NK-клетках в отсутствие ВСМА⁺ клеток-мишеней. NK-клетки были получены из крови двух различных здоровых доноров-людей. NK-клетки культивировали отдельно и подвергали воздействию 0, 0,03 или 0,1 пМ антитела I к BCMA/CD16a или Ат-1 (отрицательный контроль/CD16a) или антитела к CD38 (DARA-положительный контроль) в течение 20 часов при 37°С. Окрашивание антителами против маркеров CD (CD56, CD16, CD69 и CD25) и FACS использовали для определения количества живых СD56^дим./CD16⁺ клеток и CD56^дим./CD16⁺/CD69⁺/CD25⁺, как проиллюстрировано на Фиг. 32А и 32В, соответственно. Данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo и GraphPad Prism 6. Результаты показаны на Фиг. 39А-39С. Как показано на Фиг. 39А-39С, антитело I к CD16A/BCMA не активировало и не уменьшало уровни CD16 на NK-клетках в отсутствие ВСМА⁺ клеток-мишеней. В сравнении с даратумумабом антитело I к CD16A/ВСМА демонстрировало минимальное уменьшение количества и экспрессии CD16⁺ на NK-клетках и показало значительно меньшее количество CD69⁺25⁺ NK-клеток (например, ~100-кратное (n=2 донора; отдельный эксперимент)) в отсутствие ВСМА⁺ клеток-мишеней. В присутствии ВСМА+ клеток-мишеней антитело I к CD16A/BCMA продемонстрировало активность, подобную даратумумабу. См. Фиг. 38С.

8. 7. Активность в присутствии Is сыворотки

Изучали связывание антитела I KCD16A/BCMA с NK-клетками и цитотоксичность антитела I к CD16A/BCMA и выживание NK-клеток в присутствии сыворотки или Ig.

NK-клетки человека выделяли из крови здорового донора-человека. NK-клетки и клетки NCI-H929 или клетки MM.1S инкубировали предварительно отдельно в 10 мг/мл Ig сыворотки, 50% аутологической сыворотки человека или 100% сыворотке человека в течение 2 часов до начала анализа. NK-клетки культивировали совместно с клетками NCI-H929 или MM.1S при приблизительном соотношении Е:Т, составляющем 5, и подвергали действию последовательно разбавленных в 10 раз исследуемых образцов в интервале 0,1-100 нМ в течение приблизительно 20 часов при 37°С с 5% СО₂. Окрашивание антителами с использованием CD138 и CD56 с последующим FACS применяли для контроля цитотоксичности клеток-мишеней MM.1S или NCI-H929 и выживания NK-клеток. Данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo и GraphPad Prism 6.

Как показано на Фиг. 40А, антитело I к CD16A/BCMA способно связываться с NK-клетками в присутствии 10 мг/мл Ig или сыворотки со сниженной аффинностью по сравнению с отсутствием Ig или сыворотки. Как показано на Фиг. 40В, антитело I к CD16A/BCMA способно уничтожать ВСМА⁺ клетки-мишени в присутствии сыворотки со сниженной активностью по сравнению с отсутствием Ig или сыворотки. Как показано на Фиг. 40С и 40D, антитело I к CD16A/BCMA вызывало деплецию ВСМА⁺ клеток-мишеней в присутствии 50% аутологической сыворотки человека без гибели NK-клеток. Как показано на Фиг. 40D и 40Е, антитело I к CD16A/BCMA не вызывало деплецию NK-клеток, тогда как даратумумаб вызывал. Таким образом, Ig человека не затрагивает активность антитела I к CD16A/BCMA по отношению к NK-клеткам.

В отсутствие ВСМА⁺ клеток-мишеней, сыворотка влияла на экспрессию CD16A и активацию NK-клеток. См. Фиг. 41А и 41В. Как показано на Фиг. 41А, сыворотка снижала экспрессию CD16A. Как показано на Фиг. 41В, сыворотка повышает неприцельную опосредованную активацию NK-клеток. Таким образом, низкая экспрессия CD16 в присутствии сыворотки свидетельствует о неопосредованной CD16A активации NK-клеток.

8.8. Комбинированная терапия с цитокинами

Даратумумаб и элотузумаб являются эффективными в комбинации с иммуномодулирующими средствами (IMiD) и ингибиторами протеасомы. Ожидается, что этот механизм комбинированной активности применим к агентам, вовлекающим NK-клетки. например, IMiD влияют на выработку ФНО-, ИЛ-12 и ИЛ-6 и стимулируют Т-клетки к секреции ИЛ-2 и ИНФ-, косвенно увеличивая число NK-клеток и усиливая их функцию (Liu et al., Jour. Of Leukocyte. (2018); 103(5):821-828). Ингибиторы протеазы снижают экспрессию МН класса I. Обоснование для объединения антитела I к CD16A/BCMA с iMiD включает следующее: ИЛ-15 увеличивает количество NK-клеток посредством пролиферации, антитело к TIGIT представляет собой ингибитор конечной точки для CD8+ Т-клеток и NK-клеток, и антитело к FcRH5/CD3 использует цитотоксический потенциал NK-клеток и запускает дополнительную инфильтрацию Т-клеток в опухоли.

Для исследования того, может ли воздействие с использованием цитокинов влиять на активность антител к CD16A/BCMA, ИЛ-15 добавляли при воздействии антителом I к CD16A/BCMA. Как показано на Фиг. 42А и 42В, ИЛ-15 увеличивал активность антитела I к CD16A/BCMA в клетках ММ. Усиление деплеции ММ наблюдалось для антитела I к CD16A/BCMA при добавлении ИЛ-15, но не даратумумаба.

8.9. Применение антитела I к CD16A/ВСМА для лечения пациентов с рецидивирующей/рефрактерной к даратумумабу множественной миеломой

Антитела к CD16A/BCMA отличаются от даратумумаба (также называемого «Dara»). Например, даратумумаб обладает комлемент-зависимой цитотоксической активностью при множественной миеломе (также называемой «ММ») (de Weers, М. et al., J. immun. 2011, 186(3): 1840-1848) и способностью вызывать апоптоз посредством передачи сигнала через перекрестное связывание с CD38 (Overdijk, М.В. et al., Journal of immunology 2016; 197(3):807-813). Однако, антитело I к CD16A/BCMA не обладает такими свойствами.

В противоположность даратумумабу на активность антитела I к CD16A/BCMA не влияет полиморфизм CD16A, который снижает активность Fc-опосредованных лекарственных средств. См. Фиг. 31А и 31В. Кроме того, в отличие от терапии с использованием CD38 (например, даратумумаба), антитело I к CD16A/BCMA не вызывает деплецию NK-клеток. См. Фиг. 40А, 40В, 40С, 40D и 40Е. Дополнительно, лечение с использованием ИЛ-15 усиливает активность антитела I к CD16A/BCMA, но не даратумумаба. См. Фиг. 42А и 42В.

Учитывая свойства антител к BCMA/CD16A, описанных в данном документе, например антитела I к CD16A/BCMA, которые отличают их от даратумумаба, эти антитела к BCMA/CD16A, например антитело I к CD16A/BCMA, являются возможными агентами для лечения пациентов с рецидивирующей/рефрактерной («R/R») ММ (например, пациент с R/R к даратумумабу множественной миеломой). Фенотип устойчивости к даратумумабу, по-видимому, опосредован отрицательной регуляцией CD38 и положительной регуляцией белков, ингибирующих комплемент (Nijhof et al., Leukemia (2015); 29(10); 2039-2049 Nijhof et al., Blood (2016); 128(7):959-970). Отсутствие такой экспрессии CD38, а также взаимное уничтожение NK-клетками друг друга также дает вклад в устойчивость к даратумумабу. Механизм действия антител к BCMA/CD16A, описанных в данном документе, указывает на то, что такие антитела к BCMA/CD16A можно использовать для лечения пациентов с R/R к даратумумабу множественной миеломой.

Пациенты, рефрактерные к даратумумабу, имеют низкие уровни NK-клеток в периферической крови (Casneuf et al., Blood Adv. (2017); 24; 1(23):2105-2114). В Steward et al., Blood Cancer J. (2019);9(2):17 описано исследование фазы I DFRF4539A, антитела к FcRH5, конъюгированного с лекарственным средством монометилауристатином Е (ММАЕ), для лечения R/R ММ. Сравнивали количество NK-клеток в периферической крови пациентов с ММ, ранее не получавших лечение даратумумабом, пациентов с ММ, рефрактерных к даратумумабу, и пациентов с R/R ММ в фазе I исследования DFRF4539A, и результаты показаны на Фиг. 43.

Соотношения Е:Т для NK-клеток/опухолевых клеток в костном мозге пациентов с R/R ММ в фазе I исследования DFRF4539A показаны на Фиг. 44. Данные об уничтожении клеточной линии in vitro для антитела I к CD16A/BCMA, показанные на Фиг. 45А и 45В, указывают, что антитело I к CD16A/BCMA является эффективным при соотношениях Е:Т, установленных в группе изучения DFRF4539A в фазе I.

8.10. Цитотоксичность по отношению к свежим NK-клеткам

Цитотоксичность антитела I к CD16A/BCMA и антитела II к CD16A/BCMA по отношению к свежим NK-клеткам сравнивали с двухдневными NK-клетками. Свежие NK-клетки представляли собой NK-клетки, которые были выделены из свежеполученных МКПК в тот же день. Двухдневные (2-й день) NK-клетки представляли собой NK-клетки, которые получали из МКПК, выделенных в первый день и культивируемых в среде RPMI в течение ночи. Результаты показаны на Фиг. 46А, 46В, 46С и 46D. Как показано на Фиг. 46А, 46В, 46С и 46D, свежие NK-клетки демонстрировали более высокую цитотоксичность, чем двухдневные NK-клетки.

Пример 9 - Применение антител, связывающих CD16A/BCMA, для лечения множественной миеломы

Множественная миелома («ММ») представляет собой злокачественное новообразование плазматических клеток. В США и Европе каждый год диагностируется около 56000 новых случаев ММ. Хотя общая выживаемость улучшается, остаются важные неудовлетворенные потребности, в том числе случаи, рецидивирующие/рефрактерные к имеющимся способам лечения, и случаи с очень высоким риском при терапии первой линии («1L»). Три класса терапевтических средств изменили терапию ММ и образуют основу нынешнего стандарта лечения («SOC»), включая в некоторых случаях классы, применяемые на нескольких линиях терапии: (1) иммуномодуляторы («IMiD», например леналидомид) - несколько возможных МОА, в том числе антипролиферативные эффекты, усиление адаптивной и врожденной иммунной системы); (2) ингибиторы протеасомы (например, бортезомиб); и (3) даратумумаб (антитело к CD38, ADCC, CDC и апоптоз которого запускаются перекрестным связыванием с CD38).

NK-клетки широко используются в иммунотерапии. Баланс между активирующими и ингибирующими сигналами рецепторов регулирует активация и цитотоксичность NK-клеток, например ингибирующие сигналы доминируют в нормальных здоровых тканях. NK-клетки являются ключевыми эффекторами в опосредованных Fc способах лечения онкологического заболевания множественной миеломы, например даратумумабом или элотузумабом (антитело к SLAMF7). Активация NK-клеток и уничтожение опухолевых клеток может происходить посредством следующих механизмов действия («МОА»): (а) устранение МНС класса I на опухолевых клетках (например, чтобы устранить ответ Т-клеток); (b) сверхэкспрессия стрессовых лигандов поврежденными клетками, связывающихся с активированными NK-клеточными рецепторами (NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46 и DNAM-1), и (с) активация NK-клеток терапевтическими антителами, специфичными к опухолеассоциированному антигену (ТАА), связывающимися посредством своей области Fc с активирующим рецептором CD16A (FcγRIIIa). Агенты, вовлекающие NK-клетки имитируют МОА (с), хотя, как обсуждалось в данном документе, подчиняются МОА, отличному от механизма действия даратумумаба. Агент, вовлекающий NK-клетки, по данному изобретению, который не рекрутирует NK-клетки посредством традиционного взаимодействия с Fc-CD16A, потенциально способен использоваться для лечения пациентов с ММ, особенно пациентов второй линии («2L»), в комбинации с SOC. Кроме того, ожидается, что большая группа пациентов второй линии (2L) и третьей линии («3L»), которые являются устойчивыми к даратумумабу после рецидива, тем не менее будут отвечать (вследствие различий в МОА) на агенты, вовлекающие NK-клетки, например, антитела I и III к CD16A/BCMA, описанные в данном документе.

Описанные в данном документе белки, связывающие антиген CD16A, (например, антитела I и III к CD16A/BCMA) представляют собой агенты, вовлекающие NK-клетки, которые связываются с CD16A. CD16A конститутивно экспрессируется на около 95% NK-клеток и макрофагов и представляет собой активирующий рецептор NK-клеток.

Антитела I, II и III к CD16A/BCMA связываются с В-клеточным антигеном созревания (ВСМА). Как обсуждалось в данном документе, ВСМА является членом суперсемейства рецепторов ФНО и играет роль в длительной выживаемости плазматических клеток (O'Connor, JEM 2004; 199(1):91-98). ВСМА экспрессируется в нормальных плазматических клетках и повышенно экспрессируется и значительно распространен при множественной миеломе. ВСМА представляет собой полностью подтвержденную мишень для иммунотерапии R/R множественной миеломы, включая Т-клеточную терапию с использованием нацеленных на ВСМА химерных антигенных рецепторов (CAR), и терапию с использованием конъюгата антитела к ВСМА и лекарственного средства (ADC).

Измеряли уровни экспрессии ВСМА, CD38 и FcRH5 в замороженных мононуклеарных клетках костного мозга (ВММС) при первичной миеломе, и результаты показаны на Фиг. 47. Как показано на Фиг. 47, замороженные мононуклеарные клетки костного мозга при первичной миеломе (ВММС) от 20 доноров и контроль (миеломная клеточная линия MOLP-2) оценивали относительно экспрессии на поверхности клеток FcRH5, ВСМА (Biolegend 19F2), CD38. Кратко, ВММС размораживали, промывали стерильным ФСБ, затем ресуспендировали до конечной концентрации 1×10^6 клеток/мл. ВММС окрашивали маркерами жизнеспособности и миеломными маркерами (CD45, CD319, CD138, CD38, ВСМА, FcRH5). После фиксации и промывания клеток их считывали с использованием Canto II. Анализ FcRH5, ВСМА и CD38 выполняли в FlowJo путем выбора живые/синглеты/CD45-/CD319+ клетки (миеломные клетки). Величины MESF (Log10) для FcRH5, ВСМА и CD38 представляли графически с использованием статистического графического программного обеспечения Prism.

Как показано на Фиг. 48А и 48В, ВСМА экспрессируется в нормальных плазматических клетках человека (Фиг. 48А) и повышенно экспрессируется и обнаруживается с большим преобладанием при ММ (Фиг. 48В). Первичные клетки ММ, используемые в экспериментах, показанных на Фиг. 48В, представляют собой замороженные ВММС первичной миеломы, которые окрашивали и сортировали в соответствии с протоколом, описанным выше для Фиг. 47, а затем % от максимального значения представляли графически в FlowJo. Серый закрашенный пик на Фиг. 48В представляет собой флуоресцентный контроль без одной детектируемой метки (FMO), а другой пик представляет собой экспрессию ВСМА. Антитело I к CD16A/BCMA демонстрировало результаты, подобные исследуемому антителу к ВСМА.

Хотя Т-клеточная терапия с нацеленным на ВСМА CAR и биспецифическое антитело к CD3/BCMA показали впечатляющую активность против ММ, они также связаны с серьезными случаями синдрома выброса цитокинов (СВЦ, CRS). МОА раскрытых в данном документе белков, связывающих антиген CD16A, (например, антитело I к CD16A/BCMA), которые представляют собой агенты, вовлекающие NK-клетки, указывает на отличие от таких способов лечения, связанных с СВЦ. Например, благоприятный профиль безопасности и отсутствие СВЦ делает возможным объединить белки, связывающие антиген CD16A, раскрытые в данном документе, (например, антитело I к CD16A/BCMA) с SOC или другими видами иммунотерапии при ММ (например, цитокины (например, ИЛ-15 и ИЛ-12, как показано в данном документе (см., например, Фиг. 42А и 42В). Подход, основанный на NK-клетках, раскрытых в данном документе, также можно синергетически объединять со способами лечения с использованием Т-клеток и способами лечения с использованием ингибиторов контрольных точек (например, биспецифические антитела к CD3, антитела к PD-1 (например, ниволумаб, пембролизумаб), антитела к TIGIT, антитела к PD-L1 (например, атезолизумаб), антитела к VEGF (например, бевацизумаб), биспецифические антитела к FcRH5/CD3 и т.д.).

Ввиду вышеизложенного для выбора агента, вовлекающего NK-клетки, для применения в лечении множественной миеломы, используются один или более из следующих критериев:

• агент, вовлекающий NK-клетки, способен связываться с двумя мишенями: CD16A на NK-клетках, и ВСМА на клетках множественной миеломы,

• агент, вовлекающий NK-клетки, является по меньшей мере двухвалентным по отношению к CD16A, например, содержит по меньшей мере два фрагмента, связывающих антиген CD16A,

• агент, вовлекающий NK-клетки, представляет собой биспецифическое антитело NK-клеток, которое не реагирует перекрестно с CD16B, но может реагировать перекрестно с CD16A низших приматов,

• агент, вовлекающий NK-клетки, является сильнодействующим и преобладающим и обладает зависимой от мишени способностью уничтожать in vitro ВСМА⁺ опухолевые клетки и первичную миелому (например, ≥ около 60% клеток уничтожается и EC₅₀ ≤ 5 нМ),

• агент, вовлекающий NK-клетки, не уничтожает в значительной степени NK-клетки, например уменьшает или устраняет взаимное уничтожение NK-клетками друг друга,

• агент, вовлекающий NK-клетки, имеет приемлемый профиль безопасности, например имеет профиль высвобождения цитокинов, превосходящий другие агенты, вовлекающие Т-клетки (например, агент, вовлекающий NK-клетки, без СВЦ), побочные эффекты являются отслеживаемыми, контролируемыми и обратимыми,

• агент, вовлекающий NK-клетки, можно вводить субъекту с множественной миеломой внутривенно, и

• агент, вовлекающий NK-клетки, необходимо вводить раз в неделю (QW) или реже.

В связи с описанной в данный момент стратегией отбора можно использовать следующие фармакодинамические биомаркеры (ФД): белок М и свободные легкие цепи (FLC) в сыворотке, снижение количества моноклональных плазматических клеток, активация и рекрутинг NK-клеток в образцах костного мозга после лечения и активация периферических NK-клеток. Хотя описанная в данный момент стратегия отбора может включать диагностику, диагностика не обязательно необходима, исходя из сильного преобладания ВМСА при множественной миеломе.

Некоторые белки, связывающие антигены CD16A/BCMA, (например, антитело I к CD16A/BCMA и антитело III к CD16A/BCMA) отвечают вышеописанным критериям.

Таким образом, раскрытые в данном документе белки, связывающие антигены CD16A/BCMA, (например, антитело I к CD16A/BCMA и антитело III к CD16A/BCMA) можно использовать для лечения множественной миеломы, чтобы достичь длительной ремиссии с благоприятным профилем безопасности.

Хотя вышеизложенный, раскрытый в данном документе объект изобретения был подробно описан посредством иллюстрации и примеров в целях ясности понимания, описания и примеры не следует понимать как ограничивающие объем раскрытого в данном документе объекта изобретения. Раскрытие всех патентов и научной литературы, цитируемых в данном документе, в полном объеме и явным образом включено посредством ссылки.

Обобщение последовательностей

1. Мультиспецифический антигенсвязывающий белок, который связывается с антигеном созревания B-клеток (BCMA) и CD16A, содержащий:

a) два фрагмента, связывающих антиген BCMA, каждый из которых содержит фрагмент Fab и участок Fc, и каждый фрагмент Fab содержит: вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 67, CDR2, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 68, и CDR3, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 69; и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 70, CDR2, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 71, и CDR3, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 72, и

b) два фрагмента, связывающих антиген CD16A, каждый в формате одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv), содержащие: вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 73, CDR2, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 74, и CDR3, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 75; и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 76, CDR2, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 77, и CDR3, состоящий из аминокислотной последовательности представленной в SEQ ID NO: 78, где вариабельная область на N-конце каждого из двух scFv представляет собой вариабельную область легкой цепи,

где N-конец первого из двух scFv слит с C-концом участка Fc первого из двух фрагментов, связывающих BCMA, а N-конец второго из двух scFv слит с C-концом участка Fc второго из двух фрагментов, связывающих BCMA.

2. Мультиспецифический антигенсвязывающий белок по п. 1, содержащий мутацию участка Fc, выбранную из группы, состоящей из (а) C220S, C229S, E233P, L234A, L234V, L234F,L235A, L235E, P238S, D265A, N297A, N297Q и P331S, или (b) L234A, L234V, L234F, L235A,L235E, P238S и D265A, с нумерацией EU по Кабату.

3. Мультиспецифический антигенсвязывающий белок по п. 1 или 2, в котором каждый из двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, включает: вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3; и/или вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

4. Мультиспецифический антигенсвязывающий белок по любому из пп. 1-3, где белок представляет собой тетрамер, содержащий первую полипептидную цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 61, и вторую полипептидную цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 62.

5. Мультиспецифический антигенсвязывающий белок по любому из пп. 1-3, в котором каждый из двух фрагментов, связывающих ВСМА, включает: вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 65, и/или вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 66.

6. Фармацевтическая композиция для лечения, ослабления и/или профилактики заболевания и/или для лечения субъекта, у которого истощена или сокращена популяция NK-клеток, содержащая мультиспецифический антигенсвязывающий белок, который связывается с BCMA и CD16A, и фармацевтически приемлемый носитель, при этом мультиспецифический антигенсвязывающий белок содержит два фрагмента, связывающих антиген CD16A, где

каждый фрагмент, связывающий антиген CD16A, представлен в формате одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv) и двух фрагментов, связывающих антиген BCMA, где каждый фрагмент, связывающий антиген ВСМА, включает фрагмент Fab и участок Fc, где:

(i) каждый из двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, включает:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 73, CDR2, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 74, и CDR3, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 75; и

(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 76, CDR2, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 77, и CDR3, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 78; где вариабельная область на N-конце каждого из двух scFv представляет собой вариабельную область легкой цепи;

(c) где N-конец первого из двух scFv слит с C-концом участка Fc первого из двух связывающих BCMA фрагментов, а N-конец второго из двух scFv слит с C-концом участка Fc второго из двух связывающих BCMA фрагментов; и

(ii) каждый из двух фрагментов, связывающих антиген ВСМА, включает:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 67, CDR2, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 68, и CDR3, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 69; и

(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 70, CDR2, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 71, и CDR3, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 72.

7. Биспецифический антигенсвязывающий белок, который связывается с антигеном созревания B-клеток (BCMA) и CD16A, содержащий два фрагмента, связывающих антиген CD16A, каждый в формате одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv), и два фрагмента, связывающих BCMA, каждый из которых содержит фрагмент Fab и участок Fc, где N-конец первого из двух scFv слит с C-концом первого из двух фрагментов, нацеленных на BCMA, а N-конец второго из двух scFv слит с C-концом второго из двух фрагментов, нацеленных на ВСМА, где:

(i) каждый из двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, включает:

(а) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий CDR1, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 73; CDR2, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 74; и CDR3, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 75, и

(b) вариабельный участок легкой цепи, содержащий CDR1, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 76; CDR2, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 77; и CDR3, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 78; где вариабельная область на N-конце каждого из двух scFv представляет собой вариабельную область легкой цепи; и

(ii) каждый из двух фрагментов, связывающих антиген ВСМА, включает:

(а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 67; CDR2, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 68; и CDR3, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 69, и

(ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 70; CDR2, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 71; и CDR3, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 72.

8. Биспецифический антигенсвязывающий белок по п. 7, отличающийся тем, что:

(i) каждый из двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, включает вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3;

(ii) каждый из двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, включает вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2;

(iii) каждый из двух фрагментов, связывающих антиген BCMA, включает вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 65;

(iv) каждый из двух фрагментов, связывающих антиген BCMA, включает вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 66;

(v) каждый из двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, включает вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3; и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2;

(vi) каждый из двух фрагментов, связывающих антиген BCMA, включает вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 65; и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 66; и/или

(vii) каждый из двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, включает вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3; и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2; и каждый из двух фрагментов, связывающих антиген BCMA, включает вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 65; и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 66.

9. Фармацевтическая композиция по п. 6, где биспецифический антигенсвязывающий белок содержит мутацию участка Fc, выбранную из группы, состоящей из (а) C220S, C229S, E233P, L234A, L234V, L234F, L235A, L235E, P238S, D265A, N297A, N297Q и P331S или (b) L234A, L234V, L234F, L235A, L235E, P238S и D265A, в соответствии с нумерацией EU по Кабату.

10. Фармацевтическая композиция по п. 6 или 9, где каждый из двух фрагментов, связывающих антиген CD16A, включает: вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, и/или вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

11. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 6, 9 и 10, где каждый из двух фрагментов, связывающих антиген ВСМА, содержит: вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 65, и/или вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 66.

12. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 6 и 9-11, где биспецифический антигенсвязывающий белок представляет собой тетрамер, содержащий первую полипептидную цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 61, и вторую полипептидную цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 62.

13. Биспецифический антигенсвязывающий белок по п. 7, содержащий мутацию участка Fc, выбранную из группы, состоящей из (а) C220S, C229S, E233P, L234A, L234V, L234F, L235A, L235E, P238S, D265A, N297A, N297Q и P331S или (b) L234A, L234V, L234F, L235A, L235E, P238S и D265A, в соответствии с нумерацией EU по Кабату.

14. Биспецифический антигенсвязывающий белок по п. 7 или 13, отличающийся тем, что биспецифический антигенсвязывающий белок представляет собой тетрамер, содержащий первую полипептидную цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 61, и вторую полипептидную цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 62.