Биспецифический рекомбинантный белок и его применение

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению биспецифического рекомбинантного белка для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα, и может быть использовано в медицине. Полученный белок, содержащий усеченный вариант SIRPα, высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо специфическое к CD20, EGFR, HER2 или PD-L1, и Fc-область, может быть использован в изготовлении лекарственного препарата для лечения опухоли. 7 н. и 13 з.п. ф-лы, 22 ил., 12 табл., 9 пр.

 

Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно заявке на патент Китая № CN 201710317926.7, поданной 8 мая 2017 года, и заявке на патент Китая № CN 201711269620.5, поданной 5 декабря 2017 года, содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области биомедицины, в частности относится к рекомбинантному белку и его применению.

Предшествующий уровень техники

С углублением исследований в области терапии рака уделяется все больше внимания исследованиям, разработке и применению молекулярных таргетных терапевтических лекарственных средств против рака. Благодаря преимуществам четкой нацеленности, минимальных побочных эффектов и заметных терапевтических эффектов лекарственные средства на основе антител быстро становятся точкой повышенного интереса таргетной терапии рака. Уже существует множество нацеливающихся на опухоль лекарственных средств на основе антитела, одобренных для клинического использования, которые достигли значительных терапевтических эффектов. Лекарственные средства на основе антитела включают в себя, например, антитела, нацеливающиеся на CD20, такие как Rituxan® (ритуксимаб, который разработан компанией Roche, представляет собой первое моноклональное антитело, одобренное для лечения рака в Соединенных Штатах Америки и изначально применяемое для лечения неходжкинской лимфомы), Zevalin® (ибритумомаба тиуксетан, который разработан компанией IDEC Pharmaceuticals, изначально одобренный для лечения низкодифференцированной неходжкинской лимфомы с устойчивостью к Rituxan® от FDA), Bexxar® (тозитумомаб и йод I¹³¹ тозитумомаб, GSK), Arzerra® (офатумумаб, GSK); антитела, нацеливающиеся на Her2, такие как Herceptin® (трастузумаб, который разработан компанией Genentech, является хорошо известным лекарственным средством для лечения рака молочной железы), Perjeta® (пертузумаб, Roche), Kadcyla® (адотрастузумаба эмтанзин, Roche); антитела, нацеливающиеся на VEGF или его рецептор, такие как Avastin® (бевацизумаб, Genentech/Roche), Cyramaza® (рамуцирумаб, Eli Lilly); антитела, нацеливающиеся на EGFR, такие как Erbitux® (цетуксимаб, который разработан компанией Eli Lilly, является одним из 10 наиболее продаваемых в мире кораковых лекарственных средств и изначально одобренным для лечения рака прямой кишки), Vectibix® (панитумумаб, который разработан компанией Amgen для лечения колоректального рака); антитела, нацеливающиеся на PD-L1, такие как Tecentriq® (атезолизумаб, Roche) (Cao Rui et al., Advances in antibody drugs for cancer targeted therapy, Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics, 2016, 36(6): 15-18).

Клинически применяемые противоопухолевые лекарственные средства на основе антитела, которые нацеливаются на опухолевые клетки (неконъюгированные голые антитела), достигают противоопухолевого эффекта главным образом благодаря двум функциям антител. Первой функцией антител является аффинность, т.е. специфическое связывание с антигеном-мишенью на поверхности опухолевых клеток и выполнение их эффекторной функции с обеспечением уничтожения опухолевых клеток. Молекулы антител могут блокировать сигнальный путь фактора роста опухолей, индуцировать апоптоз или подавлять неоваскуляризацию в микроокружении опухоли путем связывания с антигеном-мишенью. Вторая функция антител достигается посредством иммунной системы, т.e. зависит от иммунной системы, опосредующей клеточную гибель, с целью достижения эффекта уничтожения опухолевых клеток, такого как антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (ADCC), опосредованная константной областью антител, комплементзависимая цитотоксичность (CDC) и зависимый от антител клеточный фагоцитоз (ADCP). Все больше исследований демонстрируют, что цитотоксичность опосредованного антителами иммунного ответа является важным механизмом противоопухолевой активности антител (для обзора см. Barnhart BC, et al. Role of Fc-FcγR interactions in the antitumor activity of therapeutic antibodies. Immunology и Cell Biology, 2017, 95: 340-346).

В последние годы в исследованиях подтверждено, что опухолевые клетки могут непрерывно делиться и расти, модифицируя свои собственные поверхностные антигены и изменяя микроокружение вокруг ткани опухоли, чтобы избежать надзора, распознавания и атаки врожденной иммунной системы, т.е. так называемое ускользание опухоли от иммунного ответа. Например, опухолевые клетки подавляют иммунную функцию макрофагов и значительно подавляют активность иммунных клеток путем высокой экспрессии CD47, который связывается с ингибиторным сигнальным рецепторным регуляторным белком α (SIRPα) на поверхности макрофагов. Между тем, высокая экспрессия CD47 на опухолевых клетках обеспечивает подавление опосредованного Fc-рецептором фагоцитоза, что в конечном итоге влияет на целевые противораковые терапевтические эффекты лекарственных средств на основе антитела (Willingham SB, et al. The CD47-signal regulatory protein Alpha (SIRPα) interaction is a therapeutic target for human solid tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2012, 109(17): 6662-6667).

CD47 представляет собой широко экспрессируемый мембранный гликопротеин, который взаимодействует с SIRPα как одновременно рецептор и лиганд и образует сигнальный комплекс CD47-SIRPα, вызывая таким образом ряд реакций, таких как апоптоз, пролиферация и иммунитет. В 2000 году Oldenborg et al. продемонстрировали, что CD47 является важным сигнальным маркером на клеточной поверхности для регуляции фагоцитоза макрофагов (Oldenborg PA, et al. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science, 2000, 288 (5473): 2051-2054). CD47 обеспечивает высвобождение сигнала «не ешь меня» путем связывания с SIRPα на поверхности макрофагов, фосфорилирования его иммунорецепторного ингибирующего мотива на основе тирозина (ITIM), с последующим рекрутингом SH2-содержащего белка тирозинфосфатазы 1 и запуском ряда каскадов для подавления фагоцитоза макрофагов. Более молодые красные кровяные клетки (RBC) в высокой степени экспрессируют CD47 и высвобождают сигнал «я твой союзник, не ешь меня» для макрофагов, в то время как старые RBC снижают экспрессию CD47 и в конечном итоге устраняются макрофагами.

CD47 может быть мишенью при лечении различных видов рака, поскольку он широко экспрессируется на поверхности различных раковых клеток. В модели трансплантации аллогенной опухоли мыши продемонстрирована эффективность блокады CD47, поэтому CD47 стал новой мишенью терапии на основе иммунной контрольной точки в случае рака (Vonderheide R H. CD47 blockade as another immune checkpoint therapy for cancer. Nature Medicine, 2015, 21(10): 1122-1123). Антитело к CD47, слитый белок SIRPα-Fc и т.п. могут ослаблять подавляющее действие CD47 в отношении иммунных клеток путем блокирования пути передачи сигнала CD47-SIRPα и проявлять определенную противоопухолевую активность. Однако, поскольку RBC также в высокой степени экспрессируют белок CD47, обработка антителом к CD47, которое связывается с белком CD47 с высокой аффинностью, может вызывать токсические побочные эффекты, такие как агглютинация RBC и анемия (Mccracken MN, et al. Molecular Pathways: Activating T Cells after Cancer Cell Phagocytosis from Blockade of CD47 "Don't Eat Me" Signals. Clinical Cancer Research, 2015, 21(16): 3597-3601), что очень осложняет клиническую разработку лекарственных средств на основе антитела к CD47. До сих пор не существует лекарственных средств на основе антитела к CD47, поступающих в фазу III клинических испытаний. Слитый белок SIRPα-Fc дикого типа не обладает высокой эффективностью вследствие его низкой аффинности к CD47. Некоторые исследователи получают мутанты SIRPα с тысячекратным усилением аффинности и лучшей противоопухолевой эффективностью благодаря мутациям, обеспечивающим высокую аффинность, в SIRPα дикого типа (Weiskopf K, et al. Engineered SIRPα variants as immunotherapeutic adjuvants to anticancer antibodies. Science, 2013, 341 (6141): 88-91). Однако еще предстоит клинически проверить, влияют ли множественные точечные мутации на безопасность, иммуногенность, стабильность и даже специфичность к мишени слитых белков у человека.

С другой стороны, исследования показали, что противоопухолевая эффективность антител к CD47 может быть значительно улучшена путем объединения с другими нацеливающимися на опухоль терапевтическими антителами, такими как комбинированное средство терапии с помощью CD47+CD20, CD47+Her2 (Chao MP, et al. Anti-CD47 antibody synergizes with rituximab to promote phagocytosis and eradicate non-Hodgkin lymphoma. Cell, 2010, 142(5): 699-713; Zhao XW, et al. CD47-signal regulatory protein-α (SIRPα) interactions form a barrier for antibody-mediated tumor cell destruction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2011, 108(45): 18342-18347). Однако существует большая неопределенность в отношении того, можно ли выпускать на рынок антитело к CD47 и когда это делать. Кроме того, даже если антитело к CD47 будет доступно на рынке, пациентам будет все еще сложно принимать комбинированное средство терапии с помощью нацеливающихся на опухоль лекарственных средств на основе антитела по причине их высокой стоимости.

Следовательно, существует необходимость в разработке нового лекарственного средства, нацеливающегося на опухоль, которое может специфически нацеливаться на опухоль, активировать и усиливать иммунную функцию у пациентов, значительно улучшать эффективность при обеспечении безопасности и при этом снижении стоимости лекарственного препарата.

Кроме того, ввиду потенциального риска безопасности нацеливающихся на CD47 моновалентных или поливалентных антител или рекомбинантных белков (например, анемия, агглютинация RBC, цитотоксичность CD47-положительных неопухолевых клеток-мишеней), связывание человеческого SIRPα с CD47 человека является видоспецифическим, в то время как применение человеческой крови ограничено этикой и доступностью генетических ресурсов и т.д., срочно необходим способ ранней оценки иммунологической безопасности для оценки иммунологической безопасности антител или рекомбинантных белков, нацеливающихся на CD47 in vivo/in vitro.

Краткое описание настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к биспецифическому рекомбинантному белку и его применению, который может обеспечивать значительное увеличение относительного содержания рекомбинантного белка, обеспечивающее его насыщающее связывание с нацеливанием на опухоль с эффектом модулирования функции макрофагов и снижения нецелевых побочных эффектов в отношении опухоли.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к биспецифическому рекомбинантному белку, где биспецифический рекомбинантный белок содержит «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» и «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα».

В одном варианте осуществления «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» не связывается с CD47, и отношение аффинности связывания, характеризующей антитело, соответствующее «высокоаффинному нацеливающемуся на опухоль плечу», с антигеном-мишенью на опухолевой клетке (клетках) к аффинности связывания гомодимера мономерного слитого белка, соответствующего «слитому белку с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα», с CD47 на опухолевой клетке (клетках) составляет по меньшей мере 6, необязательно 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или больше, или любое значение между ними.

Аффинность связывания «слитого белка с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» с CD47 не превышает аффинность связывания гомодимера «мономерного слитого белка, содержащего внеклеточный усеченный вариант SIRPα», с CD47. «Слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» содержит внеклеточный усеченный вариант SIRPα.

В одном варианте осуществления внеклеточный усеченный вариант SIRPα содержит полную аминокислотную последовательность внеклеточного домена человеческого SIRPα (дикого типа или варианта с невысокой аффинностью к CD47) или ее часть.

В одном варианте осуществления внеклеточный усеченный вариант SIRPα представляет собой внеклеточный усеченный вариант человеческого SIRPα. В конкретном варианте осуществления внеклеточный усеченный вариант SIRPα содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из a1), a2), a3) и a4): a1) SEQ ID No: 30; a2) SEQ ID No: 31; a3) SEQ ID No: 32; a4) аминокислотная последовательность, полученная путем осуществления вставки, делеции, модификации и/или консервативной замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка, например, 1-5 аминокислотных остатков, любой из аминокислотных последовательностей, описанных выше, где аффинность связывания ее мономера с CD47 не превышает аффинность связывания мономера a1), a2) или a3) с CD47.

В одном варианте осуществления биспецифический рекомбинантный белок имеет конфигурацию, предусматривающую левое плечо и правое плечо, которые расположены симметрично, при этом «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» расположено в левом плече, а «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» расположен в правом плече; предпочтительно левое плечо имеет форму Fab или Fab' иммуноглобулина, а правое плечо является внеклеточным усеченным вариантом SIRPα. При этом термин «левое плечо и правое плечо, которые расположены симметрично» в настоящем документе описан в отношении традиционной «Y»-конфигурации иммуноглобулина, в данном случае левая и правая стороны биспецифического рекомбинантного белка в соответствии с настоящим изобретением имеют специфические функциональные белки, нацеливающиеся на разные мишени соответственно; такое структурное описание в основном отличается от случая, когда два специфических функциональных белка образуют структуру «вверх и вниз» путем связывания С-конца и N-конца. Следовательно, пространственные положения левого и правого плеч, описанных в настоящем изобретении, не являются конкретными ограничениями для структуры биспецифического рекомбинантного белка и служат только для того, чтобы отличить структуру двух плеч рекомбинантного белка от структуры «вверх и вниз», образованной путем связывания С-конца и N-конца, описанной выше. Следует учитывать, что когда одно плечо расположено на одной стороне, другое плечо расположено на другой стороне; очевидно, что левое и правое положения двух плеч взаимозаменяемы.

В одном варианте осуществления длина правого плеча сконфигурирована так, чтобы соответствовать расстоянию от эпитопа, с которым связывается левое плечо, до поверхности мембраны клетки-мишени. Предпочтительно, если «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» сконфигурировано для связывания проксимального по отношению к мембране эпитопа клетки-мишени, то внеклеточный усеченный вариант SIRPα выбран из более короткой аминокислотной последовательности среди a1), a2), a3) и a4).

В одном варианте осуществления «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» является специфическим в отношении мишени, выбранной из группы, состоящей из 5T4, AGS-16, ALK1, ANG-2, B7-H3, B7-H4, c-fms, c-Met, CA6, CD123, CD19, CD20, CD22, EpCAM, CD30, CD32b, CD37, CD38, CD40, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD98, CEA, CEACAM5, CLDN18.2, CLDN6, CS1, CXCR4, DLL-4, EGFR, EGP-1, ENPP3, EphA3, ETBR, FGFR2, FN, FR-α, GCC, GD2, GPC-3, GPNMB, HER2, HER3, HLA-DR, ICAM-1, IGF-1R, IL-3R, LIV-1, MSLN, MUC16, MUC1, NaPi2b, нектина-4, Notch 2, Notch 1, PD-L1, PD-L2, PDGFR-α, PS, PSMA, SLTRK6, STEAP1, TEM1, VEGFR, CD25, CD27L, DKK-1, CSF-1R, MSB0010718C, BCMA и CD138.

Предпочтительно, если мишенью является CD20, EGFR или PD-L1, то внеклеточный усеченный вариант SIRPα представляет собой a1); если мишенью является HER2, то внеклеточный усеченный вариант SIRPα представляет собой a1) или a2).

В одном варианте осуществления «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» и «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» объединены посредством двух или трех из следующих видов связывания: силы межмолекулярного взаимодействия, ковалентной связи (такой как межцепочечная дисульфидная связь) и солевой связи.

В одном варианте осуществления «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» и «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» дополнительно содержат Fc-область. Обычно Fc-область в соответствии с настоящим изобретением содержит природную последовательность Fc-области. Однако Fc-область в соответствии с настоящим изобретением может иметь одно или более изменений или модификаций аминокислотной последовательности в природной последовательности Fc-области, таких как изменение(-ия) или модификация(-ии) аминокислотной последовательности, обеспечивающие изменение активности связывания C1q Fc-области.

В одном варианте осуществления «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» представляет собой слитый белок, включающий в себя внеклеточный усеченный вариант SIRPα и связывающую последовательность для связывания плеча, где внеклеточный усеченный вариант SIRPα и связывающая последовательность для связывания плеча необязательно соединены адапторной последовательностью, и связывающая последовательность для связывания плеча необязательно содержит Fc-область.

В одном варианте осуществления Fc-область в соответствии с настоящим изобретением является концептуальной, т. e., хотя она может фактически не присутствовать, конструирование антитела может быть выполнено в соответствии с аминокислотной последовательностью желаемого варианта Fc-области с получением полипептида или слитого белка, содержащего последовательность, или ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность желаемого варианта Fc-области.

В одном варианте осуществления Fc-область может представлять собой вариант Fc-области. «Вариант Fc-области», используемый в настоящем документе, относится к Fc-области с модификацией(-ями) одного или более аминокислотных остатков в природной аминокислотной последовательности Fc. Способы таких модификаций хорошо известны специалистам в данной области, включают в себя без ограничения сайт-направленный мутагенез последовательности ДНК, кодирующей Fc-область, такой как мутагенез с применением ПЦР и кассетный мутагенез, для получения варианта Fc-области. Например, один или более аминокислотных остатков Fc-области могут быть удалены с целью усиления связывания FcR. Например, в одном варианте осуществления тип вставки варианта Fc-области может быть осуществлен с изменением эффекторной функции Fc-области.

В одном варианте осуществления, например, по меньшей мере один аминокислотный остаток (например, 1-2 аминокислотных остатка, обычно не более 10 аминокислотных остатков) могут быть вставлены рядом с одним или более сайтами Fc-области, которые, как определено, влияниют на связывание FcR. «Рядом» означает на расстоянии 1-2 аминокислотных остатка от сайта Fc-области, который, как определено, влияет на связывание FcR. Такие варианты Fc-области могут демонстрировать повышенное или пониженное связывание FcR и/или активность ADCC. Для получения такого типа вставки в вариантах сокристаллическая структура полипептида, содержащего область связывания FcR (такую как внеклеточный домен FcR мишени) и Fc-область, в которую аминокислотный остаток должен быть вставлен, может быть оценена для включения варианта Fc-области, обладающего, например, повышенной способностью связывания FcR. Такие вставки обычно располагаются в петле Fc-области.

В одном варианте осуществления вариант Fc-области, который опосредует зависимую от антитела опосредуемую клеткой цитотоксичность (ADCC) более эффективно и/или связывается с Fcγ-рецептором (FcγR) с более высокой аффинностью по сравнению с рекомбинантным белком, содержащим природную Fc-область, в присутствии человеческих эффекторных клеток, может быть получен путем введения соответствующей модификации аминокислотной последовательности в природную Fc-область. Вариант Fc-области в соответствии с настоящим изобретением обычно содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию в Fc-области. Предпочтительно объединяют множество аминокислотных модификаций. Например, вариант Fc-области может содержать 2, 3, 4, 5 или больше замен аминокислотных остатков, например, в идентифицированном специфическом сайте связывания FcR.

Природной Fc-областью предпочтительно является человеческая Fc-область, такая как природная последовательность Fc-области человеческого IgG1 (изотипа A или отличного от A), IgG2, IgG3 или IgG4.

В одном варианте осуществления «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» и «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» являются гетеродимеризированными посредством «выступов-во-впадины». Например, «выступы-во-впадины» представляют собой выступающие «выступы», образованные с помощью мутации T366W, и полые «впадины», образованные с помощью одной аминокислотной мутации (Y407V) или трех аминокислотных мутаций (T366S, L368A и Y407V). Мутация следует схеме нумерации согласно Kabat [Eu numbering scheme of Kabat et al. (1991)] с указанием исходного аминокислотного остатка, сайта мутации и замены аминокислотного остатка соответственно слева направо, например, в T366W T представляет собой исходный аминокислотный остаток, 366 представляет собой сайт мутации, а W представляет собой аминокислотный остаток для замены Т.

В одном варианте осуществления «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» представляет собой полуантитело, специфическое по отношению к мишени, выбранной из группы, состоящей из 5T4, AGS-16, ALK1, ANG-2, B7-H3, B7-H4, c-fms, c-Met, CA6, CD123, CD19, CD20, CD22, EpCAM, CD30, CD32b, CD37, CD38, CD40, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD98, CEA, CEACAM5, CLDN18.2, CLDN6, CS1, CXCR4, DLL-4, EGFR, EGP-1, ENPP3, EphA3, ETBR, FGFR2, FN, FR-α, GCC, GD2, GPC-3, GPNMB, HER2, HER3, HLA-DR, ICAM-1, IGF-1R, IL-3R, LIV-1, MSLN, MUC16, MUC1, NaPi2b, нектина-4, Notch 2, Notch 1, PD-L1, PD-L2, PDGFR-α, PS, PSMA, SLTRK6, STEAP1, TEM1, VEGFR, CD25, CD27L, DKK-1, CSF-1R, MSB0010718C, BCMA и CD138, предпочтительно полуантитело из антитела IgG1, необязательно химерное полуантитело с человеческими и мышиными последовательностями, гуманизированное полуантитело, полностью человеческое полуантитело; более предпочтительно гуманизированное или полностью человеческое полуантитело из антитела IgG1.

В одном варианте осуществления «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из b1), b2), b3) и b4): b1) SEQ ID No: 26; b2) SEQ ID No: 27; b3) SEQ ID No: 28; b4) аминокислотная последовательность, полученная путем осуществления вставки, делеции, модификации и/или консервативной замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка, например, 1-5 аминокислотных остатков, любой из аминокислотных последовательностей, описанных выше, где аффинность связывания ее гомодимера с CD47 не превышает аффинность связывания гомодимера b1), b2) или b3) с CD47. Последовательность области сигнального пептида, адапторная последовательность, последовательность шарнирной области, последовательность Fc-области и/или связывающая последовательность, содержащиеся в упомянутых выше последовательностях, могут быть произвольно заменены согласно способам, хорошо известным специалистам в данной области, или общими последовательностями области сигнального пептида, адапторными последовательностями, последовательностями шарнирной области, последовательностями Fc-области и/или связывающими последовательностями.

В одном варианте осуществления биспецифический рекомбинантный белок содержит следующую последовательность:

если высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо нацеливается на CD20, то высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо содержит SEQ ID No: 16 и SEQ ID No: 17, «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» содержит SEQ ID No: 26, SEQ ID No: 27 или SEQ ID No: 28;

если высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо нацеливается на EGFR, то высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо содержит SEQ ID No: 19 и SEQ ID No: 8, «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» содержит SEQ ID No: 26, SEQ ID No: 27 или SEQ ID No: 28;

если высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо нацеливается на Her2, то высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо содержит SEQ ID No: 20 и SEQ ID No: 21 или SEQ ID No: 22 и SEQ ID No: 23, «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» содержит SEQ ID No: 26, SEQ ID No: 27 или SEQ ID No: 28; или

если высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо нацеливается на PD-L1, то высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо содержит SEQ ID No: 24 и SEQ ID No: 13, «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» содержит SEQ ID No: 26, SEQ ID No: 27 или SEQ ID No: 28.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей биспецифический рекомбинантный белок. Предпочтительно молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо», и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα», представлены вместе в одной и той же нити ДНК, или молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо», и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα», представлены в разных нитях ДНК.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к вектору экспрессии, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к клетке, содержащей вектор экспрессии.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения биспецифического рекомбинантного белка, предусматривающему: 1) обеспечение «высокоаффинного нацеливающегося на опухоль плеча»; 2) обеспечение «слитого белка с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα»; 3) приведение в контакт «высокоаффинного нацеливающегося на опухоль плеча» и «слитого белка с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» с образованием рекомбинантного белка.

В одном варианте осуществления способ получения рекомбинантного белка предусматривает обеспечение экспрессии рекомбинантного белка в клетке-хозяине, содержащей вектор экспрессии, где вектор экспрессии содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую рекомбинантный белок.

В другом аспекте настоящее изобретение также относится к способу осуществления нацеленной на опухоль терапии.

В одном варианте осуществления опухоль является гематологической опухолью или солидной опухолью, выбранной из группы, состоящей из рака молочной железы, колоректального рака, рака легкого, рака поджелудочной железы, рака пищевода, рака эндометрия, рака яичника, рака желудка, рака предстательной железы, рака почки, рака шейки матки, миеломы, лимфомы, лейкоза, рака щитовидной железы, рака матки, рака мочевого пузыря, нейроэндокринного рака, рака головы и шеи, рака печени, карциномы носоглотки, рака яичка, мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, меланомы, базально-клеточного рака кожи, плоскоклеточного рака кожи, возвышающейся дерматофибросаркомы, карциномы из клеток Меркеля, глиобластомы, глиомы, саркомы, мезотелиомы, миелодиспластического синдрома и т.п.

В другом аспекте настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей рекомбинантный белок или слитый белок в соответствии с настоящим изобретением и необязательные адъювант, вспомогательное средство или фармацевтически приемлемый носитель. Композиция может содержать фармацевтически приемлемый носитель. Композиция может быть представлена в любой форме фармацевтического препарата, в том числе без ограничения инъекции, порошка, лиофилизированного порошка и т.д. Фармацевтическая композиция в форме фармацевтического препарата может быть получена согласно традиционным фармацевтическим методикам, включая смешивание смеси фармацевтически активного ингредиента, такого как рекомбинантный белок или слитый белок в соответствии с настоящим изобретением, и фармацевтического носителя с образованием желаемой лекарственной формы согласно традиционным фармацевтическим методикам.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую рекомбинантный белок или слитый белок в соответствии с настоящим изобретением, и необязательный фармацевтически приемлемый носитель.

В другом аспекте настоящее изобретение также относится к способу лечения опухоли, предусматривающему введение пациенту или субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением. Опухоль экспрессирует дополнительную молекулу-мишень, которая включает без ограничения 5T4, AGS-16, ALK1, ANG-2, B7-H3, B7-H4, c-fms, c-Met, CA6, CD123, CD19, CD20, CD22, EpCAM, CD30, CD32b, CD37, CD38, CD40, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD98, CEA, CEACAM5, CLDN18.2, CLDN6, CS1, CXCR4, DLL-4, EGFR, EGP-1, ENPP3, EphA3, ETBR, FGFR2, FN, FR-α, GCC, GD2, GPC-3, GPNMB, HER2, HER3, HLA-DR, ICAM-1, IGF-1R, IL-3R, LIV-1, MSLN, MUC16, MUC1, NaPi2b, нектин-4, Notch 2, Notch 1, PD-L1, PD-L2, PDGFR-α, PS, PSMA, SLTRK6, STEAP1, TEM1, VEGFR, CD25, CD27L, DKK-1, CSF-1R, MSB0010718C, BCMA, CD138.

В другом аспекте настоящее изобретение также относится к способу генной терапии in vivo, предусматривающему введение терапевтически эффективного количества молекулы нуклеиновой кислоты или ее производного, кодирующих рекомбинантный белок или слитый белок в соответствии с настоящим изобретением, пациенту или субъекту.

В другом аспекте настоящее изобретение также относится к способу ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела, которые нацеливаются на CD47 и обладают ADCC-активностью in vitro, где способ предусматривает: a) обеспечение рекомбинантного белка/антитела (в том числе моновалентного или поливалентного), которые нацеливаются и обладают ADCC-активностью; b) выявление ADCC-активности рекомбинантного белка/антитела и c) проведение ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела (в том числе моновалентного или поливалентного).

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела, которые нацеливаются на CD47 и обладают ADCC-активностью in vitro, где способ предусматривает: a) получение эффекторной клетки (такой как человеческая эффекторная клетка NK92MI-CD16a); b) приведение в контакт эффекторной клетки и рекомбинантного белка/антитела; c) выявление ADCC-активности рекомбинантного белка/антитела и d) проведение ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела на основании ADCC-активности.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу оценки ранней иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела, которые нацеливаются на CD47 и обладают ADCC-активностью in vitro, где способ предусматривает: a) сбор хорошо растущих человеческих эффекторных клеток NK92MI-CD16a, повторное суспендирование собранных эффекторных клеток до плотности клеток от 1×10⁵ клеток/мл до 5×10⁶ клеток/мл; b) инкубирование рекомбинантного белка/антитела при градиенте концентрации с эффекторными клетками, полученными на стадии a), в течение 0,5-5 ч; c) определение активности LDH и расчет степени лизиса клеток после завершения инкубации; и d) проведение ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела на основании степени лизиса клеток, при этом рекомбинантный белок/антитело с более низкой степенью лизиса клеток характеризуется более высокой иммунологической безопасностью.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела (в том числе моновалентного или поливалентного), нацеливающегося на CD47 in vivo, где способ предусматривает: a) обеспечение белка/антитела (в том числе моновалентного или поливалентного), нацеливающегося на CD47; b) обеспечение мыши Hu-NSG; c) приведение в контакт рекомбинантного белка/антитела и мыши Hu-NSG и d) проведение ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела у мыши Hu-NSG.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела (в том числе моновалентного или поливалентного), нацеливающегося на CD47 in vivo, где способ предусматривает: a) обеспечение мыши Hu-NSG; b) введение рекомбинантного белка/антитела (в том числе моновалентного или поливалентного); c) через 24-96 ч. после введения осуществление отбора венозной крови у мыши, лизирование RBC, инкубирование оставшихся клеток и флуоресцентно меченого антитела к человеческому CD45, антитела к человеческому CD19 или антитела к человеческому CD3 в течение 15-60 мин. и выявление с помощью проточной цитометрии; и d) проведение ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела на основании уровня клиренса клеток, где рекомбинантные белки/антитело с более низким уровнем клиренса клеток (за исключением клеток-мишеней) характеризуются более высокой иммунологической безопасностью.

Преимущественными эффектами в соответствии с настоящим изобретением являются следующие.

Рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением могут достигать более высокой безопасности (например, предотвращение анемии, агглютинации RBC, цитотоксичности CD47-положительных неопухолевых клеток-мишеней, вызванной антителами к CD47/рекомбинантными белками (такими как Hu5F9-G4), снижение угрозы в отношении потенциальной безопасности, иммуногенности, стабильности и других неопределенных аспектов, что обеспечивается высокоаффинными мутантами слитого белка SIRPα-Fc и т.д.) за счет «слитого белка с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα», который снижает связывание рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением с CD47 на неопухолевых клетках (таких как RBC, NK-клетки, T-клетки и т.д.).

Согласно настоящему изобретению неожиданно обнаружено, что аффинность связывания рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением с опухолевыми клетками может быть значительно улучшена с помощью «высокоаффинного нацеливающегося на опухоль плеча» и «слитого белка с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» с опосредованием тем самым эффективного уничтожения опухолевых клеток (в том числе без ограничения эффекторной функции антител при специфическом связывании с антигеном-мишенью на поверхности опухолевых клеток, нацеленного фагоцитоза макрофагов).

Рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением могут обеспечивать эффект двойных мишеней за счет «высокоаффинного нацеливающегося на опухоль плеча» (такого как без ограничения полуантитело) и «слитого белка с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα», и результаты в соответствии с настоящим изобретением демонстрируют, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением проявляют противоопухолевые эффекты посредством ряда механизмов с помощью нескольких функций «высокоаффинного нацеливающегося на опухоль плеча» и «слитого белка с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» с достижением тем самым более высокой эффективности.

По сравнению с комбинированным средством терапии на основе двух отдельных нацеливающихся антител, рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением обладают такими преимуществами, как более низкая стоимость и более удобное использование, и, таким образом, могут обеспечивать решение проблемы плохого соблюдения пациентом режима лечения и высокой стоимости, связанных с комбинированной терапией на основе антител.

Рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением обладают более высокой проницаемостью в ткани и эффективностью, чем классические биспецифические антитела (состоящие из двух полуантител), поскольку «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» имеет меньшую молекулярную массу, чем одно плечо классических биспецифических антител (полуантитело).

«Слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» в соответствии с настоящим изобретением включает в себя внеклеточные усеченные варианты SIRPα различной длины, которые можно быстро оптимизировать для спаривания с «высокоаффинным нацеливающимся на опухоль плечом» (таким как полуантитело), что тем самым позволяет избежать ситуации, когда одновременное связывание традиционных бифункциональных антител с двумя антигенами-мишенями может зависеть от пространственной структуры двух антигенов-мишеней (в частности, когда сайты распознавания антител двух антигенов-мишеней сильно отличаются по расстоянию до клеточной мембраны, сложно одновременно связывать как нацеливающий на опухоль антиген, так и антиген CD47), и обеспечивает улучшенное связывание полученных рекомбинантных белков с опухолевыми клетками и лучшее уничтожение опухолевых клеток.

Настоящее изобретение относится к новому способу оценки безопасности иммунотерапевтических лекарственных средств, нацеливающихся на CD47 in vitro. Традиционное проведение ранней оценки безопасности антител к CD47 обычно выполняют путем определения эффекта лекарственных средств в отношении агглютинации RBC. Ввиду видоспецифического связывания человеческого SIRPα с человеческим CD47 кровь человека следует использовать при оценке того, обладает ли рекомбинантный белок/антитело, нацеливающиеся на CD47, проблему безопасности в отношении агглютинации RBC в организме человека, однако применение человеческой крови ограничено этикой и доступностью генетических ресурсов. Кроме того, эксперименты по агглютинации RBC не могут быть применены для ранней оценки иммунологической безопасности лекарственных средств. В настоящем изобретении применяется оптимизированный способ определения ADCC-активности (эксперименты по ранней оценке in vitro иммунологической безопасности) вместо традиционного эксперимента с применением агглютинации RBC человека для ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантных белков/антител (в том числе моновалентных или поливалентных), которые нацеливаются на CD47 и обладают ADCC-активностью. Способ является простым, быстрым и не ограничен ресурсами крови.

Настоящее изобретение относится к новому способу in vivo оценки безопасности иммунотерапевтических лекарственных средств, нацеливающихся на CD47. При доклинической оценке in vivo иммунологической безопасности лекарственных средств обычно используются отличные от человека приматы, что требует большего количества образца и, следовательно, увеличивает сложность и стоимость ранней подготовки образца. Пока еще не существует готового способа ранней оценки иммунологической безопасности на других видах in vivo, что влечет за собой большие риски безопасности в будущих клинических исследованиях и растрате инвестиций в исследование и разработку. Настоящее изобретение относится к мыши Hu-NSG, при этом эксперимент по ранней оценке безопасности, выполняемый на Hu-NSG, может имитировать условие безопасности лекарственного средства в иммунной системе человека, обеспечить снижение сложности и стоимости препарата, получить преимущества, заключающиеся в низкой стоимости выявления и высокой эффективности выявления, а также обеспечить снижение риска в исследовании и разработке иммунных терапевтических лекарственных средств против рака по сравнению с доклиническими или клиническими исследованиями.

Настоящее изобретение относится к рекомбинантным белкам, которые достигают высокой аффинности и специфической нацеливаемости на опухоль посредством «высокоаффинного нацеливающегося на опухоль плеча» и блокирования взаимодействия CD47-SIRPα с помощью «слитого белка с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα».

Рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением обеспечивают решение технических проблем, связанных с низким выходом и трудностями очистки продукта, характерных для традиционных бифункциональных антител. В одном варианте осуществления настоящего изобретения в случае рекомбинантных белков, имеющих одноцепочечный белок в качестве правого плеча (мутация Fc по типу выступа), если все из легкой цепи левого плеча, тяжелой цепи левого плеча (мутация Fc по типу впадины) и правого плеча (мутация Fc по типу выступа) экспрессированы в клетках, более чем 80% экспрессируемых продуктов составляют белки-мишени при очистке с помощью белка A, то выход экспрессируемого продукта эффективно повышается. Хотя имеется небольшое количество димеров левого плеча, димеров правого плеча, мономера левого плеча и мономера правого плеча, они существенно отличаются от желаемого продукта по таким свойствам, как молекулярная масса, распределение заряда, и, таким образом, могут быть легко удалены традиционными способами очистки, такими как ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия, эксклюзионная хроматография, аффинная хроматография, способ высаливания (такой как способ осаждения сульфатом аммония), поэтому способ в соответствии с настоящим изобретением подходит для получения в промышленных масштабах.

«Слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» в соответствии с настоящим изобретением и «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» (такое как без ограничения полуантитело) обычно способны образовывать рекомбинантный белок, который способен обеспечивать антагонистическое действие в отношении иммуносупрессивного эффекта CD47.

Настоящее изобретение обсепечивает преодоление недостатков низкой фармакологической эффективности слитых белков SIRPα-Fc из известного уровня техники вследствие их низкой аффинности к CD47 и предотвращение неблагоприятных эффектов вследствие высокой иммуногенности и высокой специфичности в отношении неопухолевых мишеней высокоаффинных вариантов SIRPα. Между тем, рекомбинантный белок в соответствии с настоящим изобретением обладает слабой аффинностью связывания с CD47, экспрессируемым на поверхности нормальных клеток (таких как RBC), поэтому побочные эффекты, такие как агглютинация RBC и анемия, вызванные лечением традиционными антителами к CD47, могут быть уменьшены или устранены.

Специалистам в данной области должно быть понятно, что объем настоящего изобретения не должен быть неправомерно ограничен одним определенным техническим решением настоящего изобретения, которое может достигать одного определенно выраженного или подразумеваемого полезного эффекта в соответствии с настоящим изобретением, но не может достигать или полностью достичь другого полезного эффекта. Специалистам в данной области должно быть понятно, что любой продукт, способ или применение в объеме настоящего изобретения считается решающим техническую проблему настоящего изобретения и достигающим соответствующего технического эффекта, поскольку он достигает любого из явных или подразумеваемых полезных эффектов настоящего изобретения или их произвольную комбинацию.

В частности, настоящее изобретение относится к следующим вариантам осуществления.

Вариант осуществления 1. Биспецифический рекомбинантный белок, где биспецифический рекомбинантный белок содержит «нацеливающееся на опухоль плечо» и «слитый белок для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα».

Вариант осуществления 2. Биспецифический рекомбинантный белок по варианту осуществления 1, где «слитый белок для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» содержит внеклеточный усеченный вариант SIRPα (в том числе внеклеточный усеченный вариант человеческого SIRPα дикого типа или его вариант с невысокой аффинностью по отношению к CD47).

Вариант осуществления 3. Биспецифический рекомбинантный белок по варианту осуществления 2, где внеклеточный усеченный вариант SIRPα содержит всю аминокислотную последовательность внеклеточного домена SIRPα или ее часть.

Вариант осуществления 4. Биспецифический рекомбинантный белок по любому из вариантов осуществления 1-3, где «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» не связывается с CD47, и отношение аффинности связывания, характеризующего антитело, соответствующее «высокоаффинному нацеливающемуся на опухоль плечу», с антигеном-мишенью на опухолевой клетке к аффинности связывания гомодимера мономерного слитого белка, соответствующего «слитому белку с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα», с CD47 на опухолевой клетке составляет по меньшей мере 6.

Вариант осуществления 5. Биспецифический рекомбинантный белок по любому из вариантов осуществления 1-4, где внеклеточный усеченный вариант SIRPα содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из a1), a2), a3) и a4):

a1) SEQ ID No: 30;

a2) SEQ ID No: 31;

a3) SEQ ID No: 32;

a4) аминокислотная последовательность, полученная путем осуществления вставки, делеции, модификации и/или консервативной замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка, например, 1-5 аминокислотных остатков, любой из аминокислотной последовательности, описанной выше, где аффинность связывания ее мономера с CD47 не превышает аффинность связывания мономера a1), a2) или a3) с CD47.

Вариант осуществления 6. Биспецифический рекомбинантный белок по любому из вариантов осуществления 1-5, где биспецифический рекомбинантный белок имеет конфигурацию, предусматривающую левое плечо и правое плечо, которые расположены симметрично, при этом «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» расположено в левом плече, а «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» расположен в правом плече.

Вариант осуществления 7. Биспецифический рекомбинантный белок по варианту осуществления 6, где левое плечо имеет форму Fab или Fab' иммуноглобулина, правое плечо представляет собой внеклеточный усеченный вариант SIRPα.

Вариант осуществления 8. Биспецифический рекомбинантный белок по варианту осуществления 7, где длина правого плеча сконфигурирована так, чтобы соответствовать расстоянию от эпитопа, с которым связывается левое плечо, до поверхности мембраны клетки-мишени.

Вариант осуществления 9. Биспецифический рекомбинантный белок по варианту осуществления 8, где если «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» сконфигурировано для связывания проксимального по отношению к мембране эпитопа клетки-мишени, то внеклеточный усеченный вариант SIRPα выбран из более короткой аминокислотной последовательности среди a1), a2), a3) и a4).

Вариант осуществления 10. Биспецифический рекомбинантный белок по любому из вариантов осуществления 1-9, где нацеливающееся на опухоль плечо является специфическим в отношении мишени, выбранной из группы, состоящей из 5T4, AGS-16, ALK1, ANG-2, B7-H3, B7-H4, c-fms, c-Met, CA6, CD123, CD19, CD20, CD22, EpCAM, CD30, CD32b, CD37, CD38, CD40, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD98, CEA, CEACAM5, CLDN18.2, CLDN6, CS1, CXCR4, DLL-4, EGFR, EGP-1, ENPP3, EphA3, ETBR, FGFR2, FN, FR-α, GCC, GD2, GPC-3, GPNMB, HER2, HER3, HLA-DR, ICAM-1, IGF-1R, IL-3R, LIV-1, MSLN, MUC16, MUC1, NaPi2b, нектина-4, Notch 2, Notch 1, PD-L1, PD-L2, PDGFR-α, PS, PSMA, SLTRK6, STEAP1, TEM1, VEGFR, CD25, CD27L, DKK-1, CSF-1R, MSB0010718C, BCMA и CD138.

Вариант осуществления 11. Биспецифический рекомбинантный белок по варианту осуществления 10, где, если мишенью является CD20, EGFR или PD-L1, то внеклеточный усеченный вариант SIRPα представляет собой a1); если мишенью является HER2, то внеклеточный усеченный вариант SIRPα представляет собой a1) и a2).

Вариант осуществления 12. Биспецифический рекомбинантный белок по любому из вариантов осуществления 1-11, где «нацеливающееся на опухоль плечо» связывается со «слитым белком, блокирующим взаимодействие между CD47 и SIRPα» посредством двух или трех из следующих видов связывания: силы межмолекулярного взаимодействия, ковалентной связи (такой как межцепочечная дисульфидная связь) и солевой связи.

Вариант осуществления 13. Биспецифический рекомбинантный белок по любому из вариантов осуществления 1-12, где «нацеливающееся на опухоль плечо» и/или «слитый белок для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» дополнительно содержат Fc-область.

Вариант осуществления 14. Биспецифический рекомбинантный белок по варианту осуществления 13, где Fc-область содержит природную последовательность Fc-области или неприродную последовательность Fc-области.

Вариант осуществления 15. Биспецифический рекомбинантный белок по варианту осуществления 14, где Fc-область является человеческой Fc-областью.

Вариант осуществления 16. Биспецифический рекомбинантный белок по варианту осуществления 15, где «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» и «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» являются гетеродимеризированными посредством «выступов-во-впадины».

Вариант осуществления 17. Биспецифический рекомбинантный белок по любому из вариантов осуществления 1-16, где «нацеливающееся на опухоль плечо» представляет собой полуантитело, специфическое по отношению к мишени, выбранной из группы, состоящей из 5T4, AGS-16, ALK1, ANG-2, B7-H3, B7-H4, c-fms, c-Met, CA6, CD123, CD19, CD20, CD22, EpCAM, CD30, CD32b, CD37, CD38, CD40, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD98, CEA, CEACAM5, CLDN18.2, CLDN6, CS1, CXCR4, DLL-4, EGFR, EGP-1, ENPP3, EphA3, ETBR, FGFR2, FN, FR-α, GCC, GD2, GPC-3, GPNMB, HER2, HER3, HLA-DR, ICAM-1, IGF-1R, IL-3R, LIV-1, MSLN, MUC16, MUC1, NaPi2b, нектина-4, Notch 2, Notch 1, PD-L1, PD-L2, PDGFR-α, PS, PSMA, SLTRK6, STEAP1, TEM1, VEGFR, CD25, CD27L, DKK-1, CSF-1R, MSB0010718C, BCMA и CD138, предпочтительно полуантитело из антитела IgG1, необязательно химерное полуантитело с человеческими и мышиными последовательностями, гуманизированное полуантитело, полностью человеческое полуантитело; более предпочтительно гуманизированное или полностью человеческое полуантитело из антитела IgG1.

Вариант осуществления 18. Биспецифический рекомбинантный белок по любому из вариантов осуществления 1-17, где «слитый белок для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» представляет собой слитый белок, содержащий внеклеточный усеченный вариант SIRPα и связывающую последовательность для связывания плеча, при этом внеклеточный усеченный вариант SIRPα и связывающая последовательность для связывания плеча необязательно соединены адапторной последовательностью, связывающая последовательность для связывания плеча необязательно содержит Fc-область.

Вариант осуществления 19. Биспецифический рекомбинантный белок по любому из вариантов осуществления 1-18, где «слитый белок для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из b1), b2), b3) и b4):

b1) SEQ ID No: 26;

b2) SEQ ID No: 27;

b3) SEQ ID No: 28;

b4) аминокислотная последовательность, полученная путем осуществления вставки, делеции, модификации и/или консервативной замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка, например, 1-5 аминокислотных остатков, любой аминокислотной последовательности, описанной выше, где аффинность связывания ее гомодимера с CD47 не превышает аффинность связывания гомодимера b1), b2) или b3) с CD47.

Вариант осуществления 20. Биспецифический рекомбинантный белок по варианту осуществления 19, где, если «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» нацеливается на CD20, то «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» содержит SEQ ID No: 16 и SEQ ID No: 17, «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» содержит SEQ ID No: 26; если «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» нацеливается на EGFR, то «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» содержит SEQ ID No: 19 и SEQ ID No: 8, «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» содержит SEQ ID No: 26, SEQ ID No: 27 или SEQ ID No: 28; если «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» нацеливается на Her2, то «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» содержит SEQ ID No: 20 и SEQ ID No: 21 или SEQ ID No: 22 и SEQ ID No: 23, «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» содержит SEQ ID No: 26 или SEQ ID No: 27; или если «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» нацеливается на PD-L1, то «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» содержит SEQ ID No: 24 и SEQ ID No: 13, и «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» содержит SEQ ID No: 26.

Вариант осуществления 21. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая биспецифический рекомбинантный белок по любому из вариантов осуществления 1-20.

Вариант осуществления 22. Молекула нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 21, где молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо», и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα», представлены на одной и той же нити ДНК, или представлены на отдельных нитях ДНК.

Вариант осуществления 23. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по вариантам осуществления 21 или 22.

Вариант осуществления 24. Клетка, содержащая вектор экспрессии по варианту осуществления 23.

Вариант осуществления 25. Способ получения биспецифического рекомбинантного белка, предусматривающий:

1) обеспечение «нацеливающегося на опухоль плеча»;

2) обеспечение «слитого белка для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα»;

3) приведение в контакт «нацеливающегося на опухоль плеча» и «слитого белка для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» с образованием рекомбинантного белка.

Вариант осуществления 26. Способ по варианту осуществления 25, где обеспечивают экспрессию рекомбинантного белка в клетке по варианту осуществления 24.

Вариант осуществления 27. Способ по варианту осуществления 25, где приведение в контакт предусматривает связывание посредством двух или трех из следующих видов связывания: силы межмолекулярного взаимодействия, ковалентной связи (такой как межцепочечная дисульфидная связь) и солевой связи.

Вариант осуществления 28. Способ по любому из вариантов осуществления 25-27, где приведение в контакт предусматривает связывание посредством методики «выступов-во-впадины».

Вариант осуществления 29. Слитый белок, где слитый белок содержит внеклеточный усеченный вариант SIRPα и связывающую последовательность для связывания другого полипептида.

Вариант осуществления 30. Слитый белок по варианту осуществления 29, где связывающая последовательность для связывания другого полипептида необязательно представляет собой Fc-область; необязательно Fc-область содержит мутацию(-и) по типу впадин и/или мутацию(-и) по типу выступов.

Вариант осуществления 31. Слитый белок по вариантам осуществления 29 или 30, где внеклеточный усеченный вариант SIRPα содержит всю аминокислотную последовательность внеклеточного домена человеческого SIRPα дикого типа или его высокоаффинного варианта или ее часть.

Вариант осуществления 32. Слитый белок по варианту осуществления 31, где внеклеточный усеченный вариант SIRPα содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из a1), a2), a3) и a4):

a1) SEQ ID No: 30;

a2) SEQ ID No: 31;

a3) SEQ ID No: 32;

a4) аминокислотная последовательность, полученная путем осуществления вставки, делеции, модификации и/или консервативной замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка, например, 1-5 аминокислотных остатков, любой из аминокислотной последовательности, описанной выше, где аффинность связывания ее мономера с CD47 не превышает аффинность связывания мономера a1), a2) или a3) с CD47.

Вариант осуществления 33. Слитый белок по любому из вариантов осуществления 29-31, где слитый белок выбран из группы, состоящей из b1), b2), b3) и b4):

b1) SEQ ID No: 26;

b2) SEQ ID No: 27;

b3) SEQ ID No: 28;

b4) аминокислотная последовательность, полученная путем осуществления вставки, делеции, модификации и/или консервативной замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка, например, 1-5 аминокислотных остатков, любой аминокислотной последовательности, описанной выше, где аффинность связывания ее гомодимера с CD47 не превышает аффинность связывания гомодимера b1), b2) или b3) с CD47.

Вариант осуществления 34. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая биспецифический рекомбинантный белок по любому из вариантов осуществления 29-33.

Вариант осуществления 35. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 34.

Вариант осуществления 36. Клетка, содержащая вектор экспрессии по варианту осуществления 35.

Вариант осуществления 37. Способ получения биспецифического рекомбинантного белка по любому из вариантов осуществления 29-33, где способ предусматривает:

1) обеспечение внеклеточного усеченного варианта SIRPα;

2) обеспечение связывающей последовательности для связывания другого полипептида;

3) приведение в контакт внеклеточного усеченного варианта SIRPα и связывающей последовательности для связывания другого полипептида с образованием биспецифического рекомбинантного белка.

Вариант осуществления 38. Способ получения биспецифического рекомбинантного белка по любому из вариантов осуществления 29-33, где способ предусматривает обеспечение экспрессии биспецифического рекомбинантного белка в клетке по варианту осуществления 32.

Вариант осуществления 39. Фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный белок по любому из вариантов осуществления 1-20 или слитый белок по любому из вариантов осуществления 29-33 и необязательные адъювант, вспомогательное средство или фармацевтически приемлемый носитель.

Вариант осуществления 40. Фармацевтическая композиция по варианту осуществления 39, которая находится в форме инъекции или лиофилизированного порошка.

Вариант осуществления 41. Фармацевтическая композиция, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую рекомбинантный белок по любому из вариантов осуществления 1-20 или слитый белок по любому из вариантов осуществления 29-33, и необязательный фармацевтически приемлемый носитель.

Вариант осуществления 42. Применение слитого белка по любому из вариантов осуществления 29-33 в получении рекомбинантного белка по любому из вариантов осуществления 1-20.

Вариант осуществления 43. Применение рекомбинантного белка по любому из вариантов осуществления 1-20 или слитого белка по любому из вариантов осуществления 29-33 в изготовлении лекарственного препарата для лечения опухоли.

Вариант осуществления 44. Применение по варианту осуществления 43, где опухоль является гематологической опухолью или солидной опухолью, выбранной из группы, состоящей из рака молочной железы, колоректального рака, рака легкого, рака поджелудочной железы, рака пищевода, рака эндометрия, рака яичника, рака желудка, рака предстательной железы, рака почки, рака шейки матки, миеломы, лимфомы, лейкоза, рака щитовидной железы, рака матки, рака мочевого пузыря, нейроэндокринного рака, рака головы и шеи, рака печени, карциномы носоглотки, рака яичка, мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, меланомы, базально-клеточного рака кожи, плоскоклеточного рака кожи, возвышающейся дерматофибросаркомы, карциномы из клеток Меркеля, глиобластомы, глиомы, саркомы, мезотелиомы, миелодиспластического синдрома и т.п.

Вариант осуществления 45. Применение рекомбинантного белка по любому из вариантов осуществления 1-20 или слитого белка по любому из вариантов осуществления 29-33 в изготовлении лекарственного препарата для генной терапии in vivo.

Вариант осуществления 46. Способ ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела, которые нацеливаются на CD47 и обладают ADCC-активностью in vitro, где способ предусматривает:

a) обеспечение рекомбинантного белка/антитела (в том числе моновалентного или поливалентного), который нацеливается и обладает ADCC-активностью;

b) выявление ADCC-активности рекомбинантного белка/антитела и

c) проведение ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела.

Вариант осуществления 47. Способ ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела, которые нацеливаются на CD47 и обладают ADCC-активностью in vitro, где способ предусматривает:

a) получение эффекторной клетки, например, без ограничения человеческой эффекторной клетки NK92MI-CD16a;

b) приведение в контакт эффекторной клетки и рекомбинантного белка/антитела;

c) выявление ADCC активности рекомбинантного белка/антитела и

d) проведение ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела на основании ADCC-активности.

Вариант осуществления 48. Способ по варианту осуществления 47, предусматривающий:

a) сбор хорошо растущих человеческих эффекторных клеток NK92MI-CD16a, повторное суспендирование собранных эффекторных клеток до плотности клеток от 1×10⁵ клеток/мл до 5×10⁶ клеток/мл;

b) инкубирование рекомбинантного белка/антитела при градиенте концентрации с эффекторными клетками, полученными на стадии a), в течение 0,5-5 часов;

c) определение активности LDH и расчет степени лизиса клеток после завершения инкубирования; и

d) проведение ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела на основании степени лизиса клеток, при этом рекомбинантный белок/антитело с более низкой степенью лизиса клеток характеризуется более высокой иммунологической безопасностью.

Вариант осуществления 49. Способ ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела (в том числе моновалентного или поливалентного), нацеливающегося на CD47 in vivo, где способ предусматривает:

a) обеспечение белка/антитела (в том числе моновалентного или поливалентного), нацеливающегося на CD47;

b) обеспечение мыши Hu-NSG;

c) приведение в контакт рекомбинантного белка/антитела и мыши Hu-NSG; и

d) проведение ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела у мыши Hu-NSG.

Вариант осуществления 50. Способ ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела (в том числе моновалентного или поливалентного), нацеливающегося на CD47 in vivo, где способ предусматривает:

a) обеспечение мыши Hu-NSG;

b) введение рекомбинантного белка/антитела (в том числе моновалентного или поливалентного);

c) через 24-96 часов после введения осуществление отбора венозной крови у мыши, лизирование RBC, инкубирование оставшихся клеток и флуоресцентно меченого антитела к человеческому CD45, антитела к человеческому CD19 или антитела к человеческому CD3 в течение 15-60 мин. и выявление с помощью проточной цитометрии; и

d) проведение ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела на основании уровня клиренса клеток, где рекомбинантные белки/антитело с более низким уровнем клиренса клеток (за исключением клеток-мишеней) характеризуются более высокой иммунологической безопасностью.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 показана структура вставки в соответствии с настоящим изобретением, вставляемой в вектор экспрессии.

На фиг. 2 показана плазмидная карта иллюстративного вектора экспрессии pCHO-TE2 в соответствии с настоящим изобретением.

На фиг. 3 показана структура иллюстративного варианта осуществления рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением.

На фиг. 4A-4B показана электрофореграмма SDS-PAGE рекомбинантных белков, очищенных с помощью белка A. Дорожки 1-6 на фиг. 4A показывают образцы в восстанавливающих условиях, где 1: маркер; 2: mAb к CD20 (офатумумаб); 3: mAb к CD47 (Hu5F9-G4); 4: D1 SIRPα-Fc; 5: Ofa-Fc1-D1-Fc2; 6: Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2. Дорожки 7-12 на фиг. 4A показывают образцы в невосстанавливающих условиях, где 7: маркер; 8: mAb к CD20 (офатумумаб); 9: mAb к CD47 (Hu5F9-G4); 10: D1 SIRPα-Fc; 11: Ofa-Fc1-D1-Fc2; 12: Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2. Дорожка 1 на фиг. 4B: образец в невосстанавливающих условиях Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2; дорожка 2 на фиг. 4B: маркер; дорожка 3 на фиг. 4B: образец в восстанавливающих условиях Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2.

На фиг. 5 показаны результаты выявления с помощью ELISA аффинности связывания рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением с человеческим CD47 (белковый уровень).

На фиг. 6 показаны результаты проточной цитометрии аффинности связывания рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением с человеческим CD47 (клеточный уровень).

На фиг. 7 показаны результаты проточной цитометрии аффинности связывания рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением с мишенью, соответствующей левому плечу. Hu5F9-G4, Ofa-Fc1-D1-Fc2 и D1 SIRPα-Fc относятся к средней интенсивности флуоресценции после связывания образцов Hu5F9-G4, Ofa-Fc1-D1-Fc2 и D1 SIRPα-Fc с клетками Raji, которые не блокированы антителом к CD47 Hu5F9-G4(Fab)2. Hu5F9-G4 (b), Ofa-Fc1-D1-Fc2(b) и D1 SIRPα-Fc(b) относятся к средней интенсивности флуоресценции после связывания Hu5F9-G4, Ofa-Fc1-D1-Fc2 и D1 SIRPα-Fc с клетками Raji, которые блокированы антителом к CD47 Hu5F9-G4(Fab)2.

На фиг. 8 показаны результаты проточной цитометрии аффинности связывания рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением с клетками, экспрессирующими как CD47, так и мишень, соответствующую левому плечу. Фиг. 8A соответствует клеткам Raji (CD20+CD47); фиг. 8B соответствует клеткам SKBR-3 (Her2+CD47); фиг. 8C соответствует клеткам A431 (EGFR+CD47); фиг. 8D соответствует клеткам NCI-H441 (PD-L1+CD47).

На фиг. 9 показаны результаты ELISA конкурентного связывания рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением с SICRα D1-Fc и антител к CD47 с CD47.

На фиг. 10 показаны результаты проточной цитометрии аффинности связывания рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением и их высокоаффинных вариантов с CD47, антител к CD47 и антител к CD20 с человеческим CD47.

На фиг. 11 показаны результаты анализа оценки иммунологической безопасности рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением in vitro.

На фиг. 12 показаны результаты фармакодинамического анализа рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением на мышиной модели NSG подкожно трансплантированной лимфомы Raji.

На фиг. 13 показаны результаты выявления содержания B-клеток через 96 часов после обработки мышей Hu-NSG различными образцами при одной и той же дозе. При этом фиг. 13A соответствует 0,9% физиологическому солевому раствору; фиг. 13B соответствует Hu5F9-G4 (6,7 мкг/мышь); фиг. 13C соответствует Ofa-Fc1-D1-Fc2 (5 мкг/мышь).

На фиг. 14 показаны результаты анализа ранней оценки иммунологической безопасности Ofa-Fc1-D1-Fc2 и Ofa-Fc1-D1m-Fc2 у мышей Hu-NSG (анализ FACS типов иммунных клеток) in vivo. Фиг. 14A-D соответствуют Ofa-Fc1-D1-Fc2 (1 мкг/мышь), при этом на фиг. 14A и 14B показаны результаты выявления перед введением, а на фиг. 14C и 14D показаны результаты выявления через 72 часа после введения. Фиг. 14E-H соответствуют Ofa-Fc1-D1^m-Fc2 (1 мкг/мышь), при этом на фиг. 14E и фиг. 14F показаны результаты выявления перед введением, на фиг. 14G и фиг. 14H показаны результаты выявления через 72 часа после введения.

На фиг. 15 показан анализ иммунофенотипирования с помощью FACS через 96 часов после обработки мышей Hu-NSG различными образцами при высокой дозе. На фиг. 15A-B показаны результаты через 96 часов после введения, при этом фиг. A соответствует Hu5F9-G4 (200 мкг/мышь), а фиг. 15B соответствует Ofa-Fc1-D1-Fc2 при высокой дозе (150 мкг/мышь). На фиг. 15C-D показаны результаты через 14 часов после введения, при этом фиг. 15С соответствует Hu5F9-G4 (200 мкг/мышь), а фиг. 15D соответствует Ofa-Fc1-D1-Fc2 при высокой дозе (150 мкг/мышь).

На фиг. 16 показаны результаты связывания рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением с двойными мишенями (Her2, CD47) в SKBR-3. На фиг. 16A показаны результаты выявления антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2 и антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2; и на фиг. 16B показаны результаты выявления антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2 и антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2.

На фиг. 17A-E показаны аминокислотные последовательности и последовательности ДНК, соответствующие иллюстративным белкам в соответствии с настоящим изобретением.

На фиг. 18A показан эффект Ofa-Fc1-D1-Fc2 в отношении числа RBC яванских макаков при двух дозах; на фиг. 18B показан эффект Ofa-Fc1-D1-Fc2 в отношении гемоглобина яванских макаков при двух дозах.

На фиг. 19 показаны результаты выявления Ofa-Fc1-D1-Fc2 по содержанию B-клеток яванских макаков при двух дозах.

На фиг. 20 показан эффект Ofa-Fc1-D1-Fc2 и Rituxan® в отношении роста подкожных ксенотрансплантатов человеческой В-клеточной лимфомы Daudi.

На фиг. 21 показан эффект Ofa-Fc1-D1-Fc2 и Rituxan® в отношении массы тела несущих опухоль мышей.

На фиг. 22 показан эффект Ofa-Fc1-D1-Fc2 и Rituxan® в отношении подкожных ксенотрансплантатов человеческой В-клеточной лимфомы Daudi.

Подробное описание предпочтительного варианта осуществления

Для обеспечения понимания настоящего изобретения оно будет иллюстрировано с помощью ссылки на некоторые примеры и некоторые специфические термины, описанные ниже. Однако следует учитывать, что эти конкретные примеры не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения, любые изменения и дополнительные модификации описанных примеров, а также любые дополнительные пути применения настоящего изобретения будут очевидны специалистам в данной области.

Рекомбинантный белок

Используемый в настоящем документе термин «рекомбинантный белок» относится к белку, который искусственно создан методом генной инженерии/сконструирован, а не к встречающемуся в природе белку. «Рекомбинантный», содержащийся в термине «рекомбинантный белок» в соответствии с настоящим изобретением, не обозначает способ получения и используется исключительно для указания того, что «рекомбинантный белок» не встречается в природе. Рекомбинантный белок в соответствии с настоящим изобретением может быть экспрессированным белком, а может быть собранным белком.

Необязательно биспецифический рекомбинантный белок в соответствии с настоящим изобретением содержит «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» и «слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα».

Используемый в настоящем документе термин «высокоаффинное нацеливание на опухоль» относится к тому, что аффинность связывания рекомбинантного белка в соответствии с настоящим изобретением с опухолью выше или по существу эквивалентна аффинности связывания связывающихся с опухолью лекарственных средств на основе антител из известного уровня техники с опухолью, при этом аффинность связывания связывающихся с опухолью лекарственных средств на основе антител из известного уровня техники с опухолью обычно имеет EC50 на уровне нМ или пМ. Предпочтительно отношение аффинности связывания, характеризующей антитело, соответствующее «высокоаффинному нацеливающемуся на опухоль плечу», с антигеном-мишенью на опухолевой клетке к аффинности связывания гомодимера мономерного слитого белка, соответствующего «слитому белку с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα», с CD47 на опухолевой клетке составляет по меньшей мере 6, необязательно 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или больше или любое значение между ними. Необязательно в рекомбинантном белке в соответствии с настоящим изобретением отношение аффинности связывания, характеризующей антитело, соответствующее «высокоаффинному нацеливающемуся на опухоль плечу», с антигеном-мишенью на опухолевой клетке к аффинности связывания гомодимера SIRPα-Fc, соответствующего «слитому белку с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα», с CD47 на опухолевой клетке составляет по меньшей мере 6, необязательно 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или больше или любое значение между ними.

При использовании в настоящем документе «низкая аффинность для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» относится к тому, что рекомбинантный белок в соответствии с настоящим изобретением способен блокировать взаимодействие между CD47 и SIRPα с низкой аффинностью. Предпочтительно аффинность связывания «слитого белка с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» с CD47 не превышает аффинность связывания «гомодимера мономерного слитого белка, содержащего внеклеточный усеченный вариант SIRPα» с CD47. Более предпочтительно аффинность его связывания не превышает аффинность связывания гуманизированного слитого белка SIRPα-Fc с CD47.

Биспецифический рекомбинантный белок, описанный в настоящем документе, может значительно увеличивать относительное содержание рекомбинантного белка, обеспечивающее его насыщающее связывание с нацеливанием на опухоль, с эффектом модулирования функции макрофагов и снижения нецелевых побочных эффектов в отношении опухоли, при условии, что отношение аффинности связывания, характеризующей антитело, соответствующее «высокоаффинному нацеливающемуся на опухоль плечу», с антигеном-мишенью на опухолевой клетке к аффинности связывания гомодимера мономерного слитого белка, соответствующего «слитому белку с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα с CD47» на опухолевой клетке составляет по меньшей мере 6.

Способ выявления аффинности связывания, применяемый в настоящем документе, хорошо известен специалистам в данной области, в том числе без ограничения ELISA и/или проточная цитометрия.

Необязательно слитый белок внеклеточного усеченного варианта сигнального регуляторного белка альфа α (в том числе усеченного варианта дикого типа и его невысокоаффинного варианта) и Fc, описанный в настоящем изобретении, и полуантитело могут образовывать гетеродимер за счет модификации тяжелой цепи антитела, в частности, могут быть гетеродимеризированы с помощью «выступов-во-впадины», и/или посредством межцепочечной дисульфидной связи, и/или солевой связи с образованием рекомбинантного белка.

Необязательно, если «нацеливающееся на опухоль плечо», или «полуантитело», или «левое плечо», или «структура полуантитела», или «молекулярный мономер Ig» и «CD47-нацеливающееся плечо», или «правое плечо», или «слитый белок усеченного варианта сигнального регуляторного белка α и Fc», или «SIRPα-Fc» гетеродимеризированы с помощью «выступов-во-впадины» с образованием рекомбинантного белка, то структура полученного рекомбинантного белка такая, как показано на фиг. 3. При этом левое плечо представляет собой нацеливающееся на опухоль полуантитело, в том числе без ограничения полуантитело к 5T4, полуантитело к AGS-16, полуантитело к ALK1, полуантитело к ANG-2, полуантитело к B7-H3, полуантитело к B7-H4, полуантитело к c-fms, полуантитело к c-Met, полуантитело к CA6, полуантитело к CD123, полуантитело к CD19, полуантитело к CD20, полуантитело к CD22, полуантитело к EpCAM, полуантитело к CD30, полуантитело к CD32b, полуантитело к CD37, полуантитело к CD38, полуантитело к CD40, полуантитело к CD52, полуантитело к CD70, полуантитело к CD74, полуантитело к CD79b, полуантитело к CD98, полуантитело к CEA, полуантитело к CEACAM5, полуантитело к CLDN18.2, полуантитело к CLDN6, полуантитело к CS1, полуантитело к CXCR4, полуантитело к DLL-4, полуантитело к EGFR, полуантитело к EGP-1, полуантитело к ENPP3, полуантитело к EphA3, полуантитело к ETBR, полуантитело к FGFR2, полуантитело к FN, полуантитело к FR-α, полуантитело к GCC, полуантитело к GD2, полуантитело к GPC-3, полуантитело к GPNMB, полуантитело, антитело к HER2, полуантитело, антитело к HER3, полуантитело к HLA-DR, полуантитело к ICAM-1, полуантитело к IGF-1R, полуантитело к IL-3R, полуантитело к LIV-1, полуантитело к MSLN, полуантитело к MUC16, полуантитело к MUC1, полуантитело к NaPi2b, полуантитело к нектина-4, полуантитело к Notch 2, полуантитело к Notch 1, полуантитело, антитело к PD-L1, полуантитело, антитело к PD-L2, полуантитело, антитело к PDGFR-α, полуантитело к PS, полуантитело к PSMA, полуантитело к SLTRK6, полуантитело к STEAP1, полуантитело к TEM1, полуантитело к VEGFR, полуантитело к CD25, полуантитело к CD27L, полуантитело к DKK-1, полуантитело к CSF-1R, полуантитело к MSB0010718C, полуантитело к BCMA, полуантитело к CD138. Правое плечо представляет собой слитый белок, образованный путем соединения внеклеточного усеченного варианта SIRPα (в том числе человеческого SIRPα дикого типа и его невысокоаффинного мутанта), а также шарнирной области и Fc-области антитела IgG. Если Fc-область правого плеча является мутантом по типу «впадины», то соответствующая Fc-область левого плеча является мутантом по типу «выступа»; или если правое плечо является мутантом по типу «выступа», то соответствующая Fc-область левого плеча является мутантом по типу «впадины». Как известно специалистам в данной области, Fc-область также может содержать множество мутаций по типу «впадин» и/или «выступов» одновременно.

В таблице 1 показана конфигурация молекул иллюстративных рекомбинантных белков.

Таблица 1. Молекулы иллюстративных рекомбинантных белков

Примечание: D1^m представляет собой высокоаффинный мутант внеклеточного усеченного варианта D1 SIRPα; D1 представляет собой внеклеточный D1 домен человеческого SIRPα дикого типа или его невысокоаффинного мутанта; Fc представляет собой Fc-область дикого типа; Fc1 представляет собой Fc-область, имеющую мутацию по типу «впадины» или «впадин», Fc2 представляет собой Fc-область, имеющую мутацию по типу «выступа» или «выступов».

Соответствующая аминокислотная последовательность и последовательность ДНК рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением показаны на фиг. 17A-E и в файле перечня последовательностей в соответствии с настоящим изобретением.

Антитело

Используемый в настоящем документе термин «антитело» или «иммуноглобулин» представляет собой гетеротетрамерный гликопротеин приблизительно 150000 дальтон, обладающий сходной структурной особенностью, состоящий из двух идентичных легких цепей (L) и двух идентичных тяжелых цепей (H). Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью ковалентной дисульфидной связью(-ями), в то время как число межцепочечных дисульфидных связей тяжелых цепей варьируется в различных изотипах иммуноглобулинов. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеет регулярно расположенные внутрицепочечные дисульфидные связи. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (V_H), за которым следует ряд константных доменов. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен на одном конце (V_L) и константный домен на другом конце; константный домен легкой цепи выровнен с первым константным доменом тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи выровнен с вариабельным доменом тяжелой цепи. Считается, что конкретные аминокислотные остатки образуют границу между вариабельными доменами легкой и тяжелой цепей.

Нацеливающееся на опухоль плечо

Используемые в настоящем документе термины «нацеливающееся на опухоль плечо», или «полуантитело», или «левое плечо», или «структура полуантитела», или «молекулярный мономер Ig» относятся к гетеродимерному гликопротеину, состоящему из легкой цепи (L) и тяжелой цепи (H) антитела, что является основной структурой молекулы иммуноглобулина, и данные термины могут использоваться в настоящем документе взаимозаменяемо. Его молекулярная масса равняется половине молекулярной массы соответствующего антитела, приблизительно 75000 дальтон, при этом легкая цепь связана с тяжелой цепью ковалентной дисульфидной связью. Тяжелая и легкая цепь также имеют регулярно расположенные внутрицепочечные дисульфидные связи. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (V_H), за которым следует ряд константных доменов. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен на одном конце (V_L) и константный домен на другом конце; константный домен легкой цепи выровнен с первым константным доменом тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи выровнен с вариабельным доменом тяжелой цепи. Считается, что конкретные аминокислотные остатки образуют границу между вариабельными доменами легкой и тяжелой цепей.

Используемые в настоящем документе термины «нацеливающееся на опухоль плечо», «полуантитело», или «левое плечо», или «структура полуантитела», или «молекулярный мономер Ig» могут представлять собой белок IgG, нацеливающийся на различные опухоли. Молекулы-мишени включают в себя без ограничения 5T4, AGS-16, ALK1, ANG-2, B7-H3, B7-H4, c-fms, c-Met, CA6, CD123, CD19, CD20, CD22, EpCAM, CD30, CD32b, CD37, CD38, CD40, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD98, CEA, CEACAM5, CLDN18.2, CLDN6, CS1, CXCR4, DLL-4, EGFR, EGP-1, ENPP3, EphA3, ETBR, FGFR2, FN, FR-α, GCC, GD2, GPC-3, GPNMB, HER2, HER3, HLA-DR, ICAM-1, IGF-1R, IL-3R, LIV-1, MSLN, MUC16, MUC1, NaPi2b, нектин-4, Notch 2, Notch 1, PD-L1, PD-L2, PDGFR-α, PS, PSMA, SLTRK6, STEAP1, TEM1, VEGFR, CD25, CD27L, DKK-1, CSF-1R, MSB0010718C, BCMA и CD138.

Последовательность Fc «нацеливающегося на опухоль плеча», «полуантитела», или «левого плеча», или «структуры полуантитела», или «молекулярного мономера Ig» может предусматривать мутацию по типу «впадины» или «впадин» и/или мутацию по типу «выступа» или «выступов».

CD47-нацеливающееся плечо

Используемые в настоящем документе термины «CD47-нацеливающееся плечо», или «правое плечо», или «слитый белок усеченного варианта сигнального регуляторного белка α и Fc», или «SIRPα-Fc», или «слитый белок для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» могут использоваться в настоящем документе взаимозаменяемо. Как известно специалистам в данной области, «CD47-нацеливающееся плечо», или «правое плечо», или «слитый белок усеченного варианта сигнального регуляторного белка α и Fc», или «SIRPα-Fc», или «слитый белок, блокирующий взаимодействие между CD47 и SIRPα» характеризуются варьирующей длиной молекулы. Необязательно «CD47-нацеливающееся плечо», или «правое плечо», или «слитый белок усеченного сигнального регуляторного белка α и Fc», или «SIRPα-Fc», или «слитый белок, блокирующий взаимодействие между CD47 и SIRPα» с множеством различных длин молекулы могут быть образованы путем связывания внеклеточного усеченного варианта SIRPα (в том числе человеческого SIRPα дикого типа и его невысокоаффинного мутанта) с шарнирной областью и Fc-областью антитела IgG1. IgG1 может быть человеческим IgG1.

Fc из «CD47-нацеливающегося плеча», или «правого плеча», или «слитого белка усеченного сигнального регуляторного белка α и Fc», или «SIRPα-Fc», или «слитого белка для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» предусматривать мутацию по типу «впадины» или «впадин» и/или мутацию по типу «выступа» или «выступов».

Как известно специалистам в данной области, «нацеливающееся на опухоль плечо», или «полуантитело», или «левое плечо», или «структура полуантитела», или «молекулярный мономер Ig» и «CD47-нацеливающееся плечо», или «правое плечо», или «слитый белок усеченного сигнального регуляторного белка α и Fc», или «SIRPα-Fc», или «слитый белок для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα» могут образовывать гетеродимерный рекомбинантный белок путем модификации фрагмента (области) Fc. В частности, рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены посредством двух или трех из следующих видов связывания: силы межмолекулярного взаимодействия, ковалентной связи (такой как межцепочечная дисульфидная связь) и солевой связи. Необязательно рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением получают с помощью методики «выступов-во-впадины».

Методика «выступы-во-впадины»

Используемый в настоящем документе термин «методика выступы-во-впадины» или «выступы-во-впадины» означает применение методик генной инженерии для индуцирования различных мутаций в двух доменах CH3 тяжелой цепи с обеспечением тем самым гетеродимеризации тяжелой цепи. В данной технологии «выступ» выполняется на одной тяжелой цепи, а «впадина» выполняется на другой тяжелой цепи, затем две тяжелые цепи преимущественно соединяют вместе с образованием асимметричного антитела (Ridgway JB, et al. Методика конструирования «выступов-во-впадины» доменов CH3 антитела для гетеродимеризации тяжелых цепей. Protein Engineering, 1996, 9(7): 617-621). Как известно специалистам в данной области, множество «выступов» и/или «впадин» могут быть выполнены на одной тяжелой цепи, и, соответственно, множество «впадин» и/или «впадины» также могут быть выполнены на другой тяжелой цепи.

SIRPα

Используемый в настоящем документе термин «SIRPα» означает сигнальный регуляторный белок α, также известный как CD172a. Сигнальный регуляторный белок (SIRP) является трансмембранным гликопротеином, включающим в себя трех представителей семейства, SIRPα (CD172a), SIRPβ (CD172b) и SIRPγ (CD172g). Эти три представителя имеют сходную внемембранную область и отличающуюся внутримембранную область. Внемембранная область содержит три подобных иммуноглобулину (Ig) области, из которых первая область принадлежит области IgV, а вторая и третья области принадлежат области IgC. Внутримембранная область SIRPα (CD172a) содержит два ингибирующих сигнальных домена, которые передают ингибирующий сигнал и подавляют соответствующую функцию клетки. Внутримембранная область SIRPβ (CD172b) и SIRPγ (CD172g) является короткой и не имеет области передачи сигнала, но SIRPβ (CD172b) может передавать сигнал активации посредством адапторного белка (такого как DAP12). Белки SIRP главным образом экспрессируются в макрофагах (Mϕ), дендритных клетках (DC) и нейронных клетках. Это конкретно относится к человеческому SIRPα дикого типа и его мутанту с невысокой аффинностью в отношении CD47.

Внеклеточный усеченный вариант SIRPα

Термин «внеклеточный усеченный вариант» используют в отношении белка, который обладает трансмембранной функцией. Используемый в настоящем документе «внеклеточный усеченный вариант SIRPα» относится ко всей аминокислотной последовательности внемембранной области человеческого SIRPα дикого типа и его мутанта с невысокой аффинностью по отношению к CD47, которая была избирательно усечена, или ее части.

Используемые в настоящем документе термины «D1», «D2» и «D3» относятся к трем подобным Ig внеклеточным доменам SIRPα, которые последовательно представляют собой домен D1 (подобный вариабельной области Ig домен, область IgV), домен D2 (подобный константной области Ig домен, область IgC) и домен D3 (подобный константной области Ig домен, область IgC), начиная от N-конца белка (Lee WY, et al. The Role of cis Dimerization of Signal Regulatory Protein α (SIRPα) in Binding to CD47. J Biol Chem, 2010, 285 (49): 37953-37963).

Слитый белок SIRPα-Fc

Используемый в настоящем документе термин «слитый белок SIRPα-Fc» относится к слитому белку, содержащему внеклеточный усеченный вариант SIRPα, адапторную последовательность и Fc-область. Адапторная последовательность и/или Fc-область, содержащиеся в упомянутых выше последовательностях, могут быть произвольно замещены согласно способам, хорошо известным специалистам в данной области, или обычными адапторными последовательностями и/или Fc-областями.

Во избежание влияния гликозилирования в соответствии с настоящим изобретением осуществляют мутацию замены аспарагина на аланин в D1 (Reference: Lee WY, et al. Novel Structural Determinants on SIRP α that Mediate Binding to CD47. Journal of Immunology, 2007, 179(11): 7741-7750).

D1, D2 и D3 в соответствии с настоящим изобретением также включают в себя соответствующую адапторную последовательность.

Адапторная последовательность

Используемый в настоящем документе термин «адапторная последовательность» относится к аминокислотной последовательности, соединяющей внеклеточный усеченный вариант SIRPα и связывающую последовательность, адапторная последовательность необязательно является шарнирной областью антитела IgG, необязательно содержащего шарнирную область и домен CH1 тяжелой цепи IgG. Адапторная последовательность или последовательность шарнирной области, содержащаяся в упомянутых выше последовательностях, может быть произвольно замещена согласно способам, хорошо известным специалистам в данной области, или обычными адапторными последовательностями или последовательностями шарнирной области.

Связывающая последовательность

Используемый в настоящем документе термин «связывающая последовательность» относится к последовательности, которая связывает «высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо» с «белком слияния с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα», при этом связывающая последовательность необязательно содержит шарнирную область и Fc-область; более необязательно Fc-область содержит мутацию(-ии) по типу «выступа» или «выступов» и/или мутацию(-ии) по типу «впадины» или «впадин». Связывающая последовательность, последовательность шарнирной области или последовательность Fc-области, содержащиеся в упомянутых выше последовательностях, могут быть произвольно замещены согласно способам, хорошо известным специалистам в данной области, или обычными связывающими последовательностями, последовательностями шарнирной области или последовательностями Fc-области.

CD47

CD47 представляет собой трансмембранный гликопротеин, принадлежащий суперсемейству иммуноглобулинов и экспрессируемый на клеточной поверхности почти всех клеток, в том числе RBC. Лиганды для CD47 включают в себя интегрин, тромбоспондин-1 и сигнальный регуляторный белок (SIRP). CD47 обладает рядом биологических функций, в том числе клеточной миграции, активации Т-клеток, активации дендритных клеток, аксонального развития и т.п. Кроме того, CD47 может подавлять фагоцитоз макрофагов путем взаимодействия с SIRPα. Таким образом, CD47 передает так называемый сигнал «не ешь меня», который защищает нормальные клетки, такие как RBC, B-клетки и T-клетки, от фагоцитоза макрофагами.

Ofa

Используемые в настоящем документе термины «Ofa», «офатумумаб» и «антитело к CD20 (офатумумаб)» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к антителу к CD20 офатумумабу.

Obi

Используемые в настоящем документе термины «Obi», «обинутузумаб» и «антитело к CD20 (обинутузумаб)» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к антителу к CD20 обинутузумабу.

Hu5F9-G4

Используемые в настоящем документе термины «mAb к CD47», «антитело к CD47» и «Hu5F9-G4» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к антителу к CD47 Hu5F9-G4.

mAb к EGFR

Используемые в настоящем документе термины «mAb к EGFR» и «JMT101» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к антителу к EGFR JMT101. JMT101 представляет собой гуманизированное моноклональное антитело к EGFR, см. BA03 в патентном документе ZL201210406288.3.

Трастузумаб

Используемые в настоящем документе термины «трастузумаб», «Трастузумаб», «mAb к Her2(T)» и «герцептин» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к антителу к Her2 трастузумабу.

Пертузумаб

Используемые в настоящем документе термины «патезумаб», «пертузумаб», «mAb к Her2(Р)» и «перьета» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к антителу к Her2 пертузумабу.

Атезолизумаб

Используемые в настоящем документе термины «тецентрик» и «атезолизумаб» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к антителу к PD-L1 атезолизумабу.

D1 SIRPα-Fc

Используемые в настоящем документе термины «D1 SIRPα-Fc» и «D1-Fc» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к димеру одноцепочечного слитого белка SIRPα. D1-Fc.

Ofa-Fc1

Ofa-Fc1 относится к полуантителу офатумумаба, имеющему Fc-область с мутацией по типу «впадины».

Антитело-к-Her2(T)-Fc1

Антитело-к-Her2(T)-Fc1 относится к полуантителу трантузумаба, имеющему Fc-область с мутацией по типу «впадины».

Антитело-к-Her2(P)-Fc1

Антитело-к-Her2(P)-Fc1 относится к полуантителу пертузумаба, имеющему Fc-область с мутацией по типу «впадины».

Антитело-к-EGFR-Fc1

Антитело-к-EGFR-Fc1 относится к полуантителу к EGFR, имеющему Fc-область с мутацией по типу «впадины».

D1-Fc2

D1-Fc2 относится к слитому белку, содержащему усеченный домен D1 из внеклеточного домена SIRPα и Fc-область, имеющую мутацию по типу «выступа».

D1-D2-Fc2

D1-D2-Fc2 относится к слитому белку, содержащему усеченные домены D1 и D2 из внеклеточного домена SIRPα и Fc-область с мутацией по типу «выступа».

D1-D2-D3-Fc2

D1-D2-D3-Fc2 относится к слитому белку, содержащему усеченные домены D1, D2 и D3 из внеклеточного домена SIRPα и Fc-область с мутацией по типу «выступа».

Лечение

Используемые в настоящем документе термины «осуществление лечения», «терапия» и «лечение» используются взаимозаменяемо. Термин «осуществление лечения» включает в себя контроль прогрессирования заболевания, нарушения и состояния, а также связанных симптомов, предпочтительно снижение или ослабление влияния одного или более симптомов заболевания, нарушения и состояния. Данный термин включает излечение заболевания или полное устранение симптома. Данный термин включает ремиссию симптома. Данный термин также включает без ограничения не излечивающее паллиативное лечение. Термин «осуществление лечения» включает в себя введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей рекомбинантный белок или слитый белок в соответствии с настоящим изобретением, для предотвращения или замедления, ослабления или облегчения прогрессирования заболевания, нарушения, состояния или влияния одного или более симптомов заболевания, нарушения и состояния.

Введение

Используемый в настоящем документе термин «введение» относится к доставке терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей рекомбинантный белок или слитый белок в соответствии с настоящим изобретением, субъекту. Введение может быть системным или местным. Введение может быть выполнено с помощью устройства доставки, такого как шприц. Способ введения включает без ограничения заливку, втягивание носом, распыление, инъецирование и т.п. Путь введения включает в себя ингаляционное, интраназальное, пероральное, внутривенное, подкожное или внутримышечное введение и т.п.

Таблица 2-1. Соответствие между названием последовательности и номером последовательности

Таблица 2. Соответствие между рекомбинантными белками и последовательностями

Пример 1. Конструкция вектора экспрессии

На основании разработанной молекулярной структуры аминокислотные последовательности каждого компонента подвергали сплайсингу вместе. В соответствии с предпочтительностью в отношении кодонов у китайских хомячков (Cricetulus griseus) разрабатывали оптимальную кодирующую последовательность ДНК и исключали сайты распознавания рестрикции эндонуклеазой для последующего применения в операции клонирования генов. Затем последовательно добавляли сайт клонирования, последовательность Козака и последовательность, кодирующую сигнальный пептид, на 5'-конце последовательности и последовательно добавляли стоп-кодон и сайт клонирования на 3'-конце последовательности, как показано на фиг. 1.

Осуществляли синтез всего гена и весь ген направленно клонировали между соответствующими сайтами клонирования вектора экспрессии pCHO-TE2 (приобретенного у Thermo Fisher) с применением сайтов клонирования на 5'-конце и 3'-конце. После проверки правильности последовательности получали плазмиду экспрессии. Все сайты клонирования, применяемые на 5'-конце и 3'-конце, являются сайтами EcoRV и PacI соответственно. На фиг. 2 показана карта плазмиды вектора экспрессии pCHO-TE2.

Пример 2. Получение плазмиды экспрессии, клеточная трансфекция, экспрессия и очистка белка-мишени

Получение плазмиды экспрессии

Исходный раствор в глицерине без бактерий, содержащий плазмиду экспрессии (1 мл раствора Escherichia coli, содержащего плазмиду экспрессии, тщательно смешивали с 0,5 мл 60% стерилизованного раствора глицерина) инокулировали в жидкую среду LB при отношении 1:1000. Через 16 часов культивирования на шейкере при 37°C, 220 об/мин, бактерии собирали центрифугированием. Плазмиду экспрессии получали с применением наборов для получения плазмид без эндотоксина (DP117, приобретенных у Tiangen Biotech (Beijing) Co., Ltd.) согласно стандартной процедуре, представленной в инструкциях к набору.

Трансфекция клеток и экспрессия белка

После того как полученную плазмиду экспрессии фильтровали через микрофильтрационную мембрану 0,22 мкм 3 мг раствора плазмиды (где продукт представлял собой типичную молекулу антитела, а соотношение плазмид экспрессии легкой цепи и тяжелой цепи составляло 1:1 (молярное соотношение), при этом продукт представлял собой рекомбинантный белок, соотношение плазмид экспрессии легкой цепи, тяжелой цепи и правого плеча составляло 1:1:1 (молярное соотношение), как показано в таблице 3), пипеткой вносили в 50 мл среды с пониженным содержанием сыворотки Opti MEM I (приобретенной у GIBCO), затем тщательно перемешивали. Переносили 6 мг полиэфиримидного реагента для трансфекции (PEI, приобретенного у Polysciences, растворенного в стерильной сверхчистой воде в концентрации 1 мг/мл) в 50 мл среды с пониженным содержанием сыворотки Opti MEM I, затем тщательно перемешивали. Полученный раствор PEI добавляли в раствор среды с пониженным содержанием сыворотки Opti MEM I, содержащий плазмиду, и тщательно перемешивали. Обеспечивали отстаивание смеси плазмиды и PEI при комнатной температуре в течение 15 минут, а затем медленно и равномерно добавляли в 1 л суспензии клетки-хозяина CHO-S (приобретенной у Thermo Fisher) с плотностью клеток 3×10⁶ клеток/мл. Клетки культивировали в инкубаторе, содержащем 5% CO₂, при 37°C. Через 4 часа к ним добавляли питательную среду (питательную среду получали путем растворения 80 г CD Efficient Feed C AGT (приобретенной у Gibco) и 75 г 5×00483 (приобретенной у Kerry) в 1 л воды) объемом, эквивалентным 7% от начального объема. Температуру культуры понижали до 33°C и клетки собирали после 6 дней культивирования. Клеточную суспензию центрифугировали при 10000 g, 10°C, в течение 30 минут и использовали надосадочную жидкость (т.e. раствор после сбора клеточной культуры) для очистки белка-мишени.

Очистка белка

В следующем способе использовали Ofa-Fc1-D1-Fc2 в качестве примера с применением белка A для аффинного захвата продукта.

Упомянутый выше раствор после сбора клеточной культуры центрифугировали при 10000 об/мин в течение 30 мин для удаления клеток и их фрагментов, затем загружали в колонку для аффинной хроматографии с белком A (№ по каталогу 17-5438-02, GE Healthcare) и элюировали для сбора белка-мишени. Чистоту белка-мишени определяли с помощью SDS-PAGE.

Способ очистки с помощью белка A является традиционным способом очистки белка, хорошо известным специалистам в данной области, и подробная процедура исследования может относиться к описанию продукта белка A GE Healthcare и справочнику по очистке антител GE.

Теоретическая молекулярная масса четырех белков D1 SIRPα-Fc, Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2 и Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 составляет 37,8 кДа, 110,7 кДа, 121,7 кДа и 131,4 кДа соответственно. Результаты SDS-PAGE показаны на фиг. 4A и фиг. 4B.

Электрофорез белка (SDS-PAGE): Результаты показывают (фиг. 4A и фиг. 4B), что белки-мишени в каждой дорожке эффективно экспрессированы и очищены, при этом Ofa-Fc1-D1-Fc2 (фиг. 4A, дорожка 11), Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2 (фиг. 4A, дорожка 1) и Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 (фиг. 4A, дорожка 12) демонстрируют разные степени содержания димера левого плеча (Ofa-Fc1-Ofa-Fc1), димера правого плеча (SIRPα-Fc2) и/или мультимера.

Таблица 3. Соотношение плазмиды экспрессии

Примечание: D1^m представляет собой высокоаффинный мутант внеклеточного усеченного варианта D1 SIRPα; D1 представляет собой внеклеточный домен D1 человеческого SIRPα дикого типа и его невысокоаффинного мутанта; Fc представляет собой Fc-область дикого типа; Fc1 представляет собой Fc-область, имеющую мутацию(-ии) по типу «впадины» или «впадин», и Fc2 представляет собой Fc-область, имеющую мутацию(-ии) по типу «выступа» или «выступов».

Пример 3. Определение аффинности, активности конкурентного связывания с мишенью

1. Способ выявления аффинности мишеней CD47, CD20, EGFR и Her2

Аффинность связывания рекомбинантных белков Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1^m-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1^m-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1^m-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1^m-D2-Fc и Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 с мишенями CD47 и CD20 определяли с помощью ELISA и/или проточной цитометрии. При использовании Ofa-Fc1-D1-Fc2 в качестве примера следующий способ выявления подходит для рекомбинантных белков с левым плечом, нацеливающимся на CD20.

Аффинность связывания рекомбинантных белков антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1^m-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1^m-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1^m-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1^m-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1^m-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1^m-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1^m-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1^m-D2-Fc2 и антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 с мишенями CD47 и Her2 определяли с помощью ELISA и/или проточной цитометрии. При использовании антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2 в качестве примера следующий способ выявления подходит для рекомбинантных белков с левым плечом, нацеливающимся на Her2.

Аффинность связывания рекомбинантных белков антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1^m-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1^m-D2-Fc2 и антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 с мишенями CD47 и EGFR определяли с помощью ELISA и/или проточной цитометрии. При использовании антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc в качестве примера следующий способ выявления подходит для рекомбинантных белков с левым плечом, нацеливающимся на EGFR.

Аффинность связывания рекомбинантных белков антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1^m-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1^m-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1^m-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1^m-D2-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1^m-Fc2, антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1^m-D2-Fc2 и антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 с мишенями CD47 и PD-L1 определяли с помощью ELISA. При использовании антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2 в качестве примера следующий способ выявления подходит для рекомбинантных белков с левым плечом, нацеливающимся на PD-L1.

Определение аффинности Ofa-Fc1-D1-Fc2 и антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2 к мишени CD47 с помощью ELISA

Планшет для ELISA (№ по каталогу 9018, Corning) покрывали 100 мкл 1 мкг/мл CD47-His (12283-H08H-200, Sino Biological) и помещали при 4°C в течение ночи. Планшет промывали раствором PBST (PBS, содержащим 0,1% Tween 20), а затем блокировали с помощью PBS + 1% BSA в течение 2 часов при комнатной температуре. После промывания 100 мкл разбавленного Ofa-Fc1-D1-Fc2 и антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2 (2,5-кратные серийные разведения, начиная от 1000 нг/мл, 11 разведений) добавляли в каждую лунку покрытого планшета, затем инкубировали в течение 1 часа при 25°C. После отбрасывания образца и промывания планшета три раза раствором PBST добавляли 100 мкл разбавленного мышиного антитела к человеческому Fc IgG-HRP (1:10000) (Ab7499, abcam), затем инкубировали при 25°C в течение 1 часа. После отбрасывания раствора и промывания планшета три раза раствором PBST добавляли TMB (P0209, Beyotime), обеспечивали протекание реакции в планшете и защищали его от света в течение приблизительно 20 минут. Реакцию останавливали с помощью H₂SO₄ и считывали значение OD при 450-650 нм на устройстве для считывания микропланшетов.

Результаты исследования продемонстрировали, что все антитела к CD47, Hu5F9-G4, D1 SIRPα-Fc, Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1^m-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1^m-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1^m-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1^m-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1^m-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1^m-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, были способны связываться с CD47; аффинность связывания Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 с CD47 была слегка слабее, чем аффинность связывания антитела к CD47 Hu5F9-G4 и/или D1 SIRPα-Fc с CD47.

Упомянутые выше результаты исследования продемонстрировали, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением способны специфически нацеливаться на антиген CD47 на опухолевых клетках на белковом уровне, и их аффинность связывания с CD47 не превышает аффинность связывания слитого белка D1 SIRPα-Fc с CD47. Рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением могут обеспечивать снижение побочных эффектов или избежание побочных эффектов, таких как агглютинация RBC, анемия, вызванная лечением с помощью антитела к CD47, и/или уничтожение неопухолевых клеток-мишеней, вызванное лечением с помощью высокоаффинного мутанта SIRPα (Petrova PS, et al. TTI-621 (SIRPα Fc): A CD47-Blocking Innate Immune Checkpoint Inhibitor with Broad Antitumor Activity and Minimal Erythrocyte Binding. Clin Cancer Res, 2017, 23(4): 1068-1079).

Например, как показано на фиг. 5, за исключением того, что антитело к CD20 офатумумаб и антитело к EGFR JMT101 не могут связываться с CD47, все из антител к CD47, Hu5F9-G4, D1 SIRPα-Fc, OFa-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, были способны связываться с CD47. Однако аффинность связывания Ofa-Fc1-D1-Fc2 и антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2 (EC₅₀ = 52,57 нг/мл, EC₅₀ = 93,86 нг/мл), у которого только правое плечо может связываться с антигеном CD47, меньше, чем у антитела к CD47 (EC₅₀ = 5,439 нг/мл) и D1 SIRPα-Fc (EC₅₀ = 6,118 нг/мл).

Определение аффинности Ofa-Fc1-D1-Fc2 в отношении мишени CD47 с помощью ELISA и проточной цитометрии

Хорошо растущие клетки A431 (человеческая эпидермальная раковая клетка) собирали и подсчитывали, центрифугировали и повторно суспендировали до концентрации 3×10⁶ клеток/мл с PBS + 2% FBS (приобретенным у Gibco). Аликвотировали 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного U-образного планшета (№ по каталогу 3799, Corning) и обеспечивали отстаивание в течение по меньшей мере 15 минут. Надосадочную жидкость отбирали пипеткой и отбрасывали после центрифугирования, затем добавляли 9 серийных разведений Ofa-Fc1-D1-Fc2 (5-кратных серийных разведений, начиная от 15000 нг/мл, всего 9 концентраций) и инкубировали в холодильнике при 4°C в течение 1 часа. После промывания с помощью PBS + 2% FBS добавляли антитело козы к человеческому Fc IgG-FITC (F9512-2ML, Sigma) и инкубировали в течение 1 часа при 4°C. После промывания и повторного суспендирования с помощью PBS + 2% FBS определяли значение флуоресценции с помощью проточного цитометра (Accuri C6, BD).

Поскольку клетки A431 не экспрессируют антиген CD20 и не могут связываться с офатумумабом и обинутузумабом, клетки A431 могут быть использованы для проведения оценки аффинности связывания Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1^m-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1^m-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1^m-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1^m-D2-Fc2 и Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc с CD47 на клеточном уровне.

Результаты исследования продемонстрировали, что за исключением того, что антитела к CD20 офатумумаб и обинутузумаб не могут связываться с клетками A431, все из антител к CD47, Hu5F9-G4, D1 SIRPα-Fc, Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1^m-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1^m-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1^m-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1^m-D2-Fc2 и Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, были способны связываться с клетками A431. Аффинность связывания Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2 и Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 с CD47 была слегка слабее, чем аффинность связывания антитела к CD47 и/или D1 SIRPα-Fc с CD47, что соответствует тенденции данных ELISA.

Упомянутые выше результаты исследования продемонстрировали, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением способны специфически нацеливаться на антиген CD47 на опухолевых клетках на белковом уровне, и аффинность связывания с CD47 не превышает аффинность связывания слитого белка D1 SIRPα-Fc с CD47. Рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением могут обеспечивать снижение побочных эффектов или избежание побочных эффектов, таких как агглютинация RBC, анемия, вызванная лечением с помощью антитела к CD47, и/или уничтожение неопухолевых клеток-мишеней, вызванное лечением с помощью высокоаффинного мутанта SIRPα.

Например, как показано на фиг. 6, все из антител к CD47, Hu5F9-G4, D1 SIRPα-Fc и Ofa-Fc1-D1-Fc2, были способны связываться с клетками A431. В частности, аффинность связывания Ofa-Fc1-D1-Fc2 слегка слабее таковой антитела к CD47 и/или D1 SIRPα-Fc, что соответствует тенденции данных ELISA.

Определение аффинности Ofa-Fc1-D1-Fc2 в отношении мишени CD20 с помощью проточной цитометрии

Хорошо растущие клетки Raji (человеческой B-клеточной лимфомы, приобретенные в Банке клеток китайской академии наук, Шанхай) собирали и подсчитывали, центрифугировали и повторно суспендировали до концентрации 3×10⁶ клеток/мл с PBS + 2% FBS. Аликвотировали 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного U-образного планшета (№ по каталогу 3799, Corning) и обеспечивали отстаивание в течение по меньшей мере 15 минут. Надосадочную жидкость отбирали пипеткой и отбрасывали после центрифугирования, затем добавляли 100 мкл PBS + 2% FBS (контрольная группа) или 1,5 мкг/мл антитела к CD47 Hu5F9-G4 (Fab)2 (группа обработки) (вырезание Fc пепсином, набор Thermo Fisher, 44988) и инкубировали при 4°C в течение 1 часа. После промывания с помощью PBS + 2% FBS добавляли 7 серийных разведений Ofa-Fc1-D1-Fc2, Hu5F9-G4 или D1 SIRPα-Fc (4-кратные серийные разведения, начиная от 6250 нг/мл, всего 7 разведений, и молярная концентрация после превращения показана на фиг. 7) соответственно, а затем инкубировали при 4°C в течение 1 часа. После промывания с помощью PBS + 2% FBS добавляли антитело козы к человеческому Fc IgG-FITC (F9512-2ML, Sigma) и инкубировали в течение 1 часа при 4°C. После промывания и повторного суспендирования с помощью PBS + 2% FBS определяли значение флуоресценции с помощью проточного цитометра (Accuri C6, BD).

Результаты исследования продемонстрировали, что антитело к CD47, Hu5F9-G4(Fab)2, эффективно блокировало связывание антитела к CD47, Hu5F9-G4, и/или D1 SIRPα-Fc с CD47 в клетках Raji. Однако эффект блокирования Hu5F9-G4(Fab)2 в отношении антигена CD47 не значительно подавлял связывание Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi Fc1-D1-D2-Fc2 и Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 с клетками Raji.

Упомянутые выше результаты исследования продемонстрировали, что в случае если антиген CD47 на поверхности опухолевых клеток экранируется и связывание с SIRPα-CD47 блокируется, то рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением все еще способны специфически связываться с соответствующим антигеном на опухолевых клетках посредством левого плеча, и на аффинность левого плеча не влияет в значительной степени блокирование связывания правого плеча.

Например, как показано на фиг. 7, антитело к CD47, Hu5F9-G4(Fab)2, эффективно блокирует связывание антитела к CD47, Hu5F9-G4, и/или D1 SIRPα-Fc с CD47 на клетках Raji. Однако блокирующий эффект Hu5F9-G4(Fab)2 в отношении антигена CD47 незначительно подавляет связывание Ofa-Fc1-D1-Fc2 с клетками Raji, что указывает на то, что Ofa-Fc1-D1-Fc2 все еще способен специфически связываться с антигеном CD20 на клетках Raji с помощью своего левого плеча (полуантитела к CD20) после блокирования взаимной комбинации SIRPα-CD47, и на аффинность не влияет в значительной степени блокирование связывания правого плеча.

Определение активности биспецифического связывания с мишенями CD20 и CD47 с помощью проточной цитометрии

Хорошо растущие клетки Raji (человеческой B-клеточной лимфомы, приобретенные в Банке клеток китайской академии наук, Шанхай) собирали и подсчитывали, центрифугировали и повторно суспендировали до концентрации 3×10⁶ клеток/мл с PBS + 2% FBS. Аликвотировали 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного U-образного планшета (№ по каталогу 3799, Corning) и обеспечивали отстаивание в течение по меньшей мере 15 минут. Надосадочную жидкость отбирали пипеткой и отбрасывали после центрифугирования, затем добавляли 12 серийных разведений Ofa-Fc1-D1-Fc2, офатумумаба, Hu5F9-G4 или D1 SIRPα-Fc (50000 нг/мл, 25000 нг/мл, 6250 нг/мл и 4-кратные серийные разведения, начиная от 6250 нг/мл, всего 12 разведений, и молярная концентрация после превращения показана на фиг. 8A) соответственно, и инкубировали при 4°C в течение 1 часа. После промывания с помощью PBS + 2% FBS добавляли антитело козы к человеческому Fc IgG-FITC (F9512-2ML, Sigma) и инкубировали в течение 1 часа при 4°C. После промывания и повторного суспендирования с помощью PBS + 2% FBS определяли значение флуоресценции с помощью проточного цитометра (Accuri C6, BD).

Поскольку на поверхности клеток Raji одновременно экспрессируются антигены CD20 и CD47, все антитела к CD20 офатумумаб, обинутузумаб, антитело к CD47 Hu5F9-G4 и D1 SIRPα-Fc способны специфически связываться с клетками Raji, но их значения максимальной средней интенсивности флуоресценции не идентичны друг другу.

Результаты исследования продемонстрировали, что Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1^m-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1^m-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1^m-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1^m-D2-Fc2 и Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 были способны связываться с клетками Raji и достигали более высокого значения максимальной средней интенсивности флуоресценции.

Упомянутые выше результаты исследования продемонстрировали, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением по сравнению с антителами к CD20 офатумумабом, обинутузумабом, и/или антителом к CD47 Hu5F9-G4, и/или D1 SIRPα-Fc способны специфически связываться с опухолевыми клетками и демонстрируют существенное преимущество в количестве молекул в среде с одинаковой перенасыщенной концентрацией белка. Предпочтительно относительное содержание рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением, обеспечивающее насыщающее связывание с опухолевыми клетками, превышает сумму значений относительного содержания антитела к CD20 и D1 SIRPα-Fc, обеспечивающего насыщающее связывание с опухолевыми клетками, в среде с одинаковой сверхнасыщенной концентрацией белка.

Таблица 4. Максимальная средняя интенсивность флуоресценции и EC₅₀ (нМ) связывания антител/рекомбинантных белков с клетками Raji

Например, как показано на фиг. 8A и в таблице 4, все из антитела к CD20 офатумумаба, антитела к CD47 Hu5F9-G4 и D1 SIRPα-Fc способны специфически связываться с клетками Raji, но их значения максимальной средней интенсивности флуоресценции являются разными; при этом Ofa-Fc1-D1-Fc2 также способен связываться с клетками Raji и обладает более высоким значением максимальной средней интенсивностью флуоресценции, что указывает на то, что в условиях одной и той же перенасыщенной концентрации белка количество молекул Ofa-Fc1-D1-Fc2, специфически связывающихся с клетками Raji, существенно превышает количество молекул антитела к CD20 офатумумаба, или антитела к CD47 Hu5F9-G4, или D1 SIRPα-Fc, превышает сумму молекул антитела к CD20 офатумумаба или антитела к CD47 Hu5F9-G4 и превышает сумму молекул антитела офатумумаба и D1 SIRPα-Fc.

Как известно специалистам в данной области, упомянутые выше результаты исследования указывают на то, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением, которые способны одновременно связываться как с нацеливающим на опухоль антигеном, так и с CD47, могут в большей степени связываться с опухолевыми клетками и, таким образом, обеспечивать более значительный противоопухолевый эффект по сравнению с комбинированным средством терапии на основе антитела к CD47 или D1 SIRPα-Fc с другим нацеливающимся на опухоль терапевтическим антителом.

Определение биспецифической активности связывания с мишенями Her2 и CD47 с помощью проточной цитометрии

Хорошо растущие клетки SKBR-3 (человеческая клетка рака молочной железы, приобретенная в Банке клеток китайской академии наук, Шанхай) собирали и подсчитывали, центрифугировали и повторно суспендировали до концентрации 2×10⁶ клеток/мл с PBS + 2% FBS. Аликвотировали 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного U-образного планшета (№ по каталогу 3799, Corning) и обеспечивали отстаивание в течение по меньшей мере 15 минут. Надосадочную жидкость отбирали пипеткой и отбрасывали после центрифугирования, затем добавляли 10 разведений антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, трастузумаба или Hu5F9-G4 (4-кратных серийных разведений, начиная от 433,2 нМ, всего 10 разведений) соответственно и инкубировали при 4°C в течение 1 часа. После промывания с помощью PBS + 2% FBS добавляли антитело козы к человеческому Fc IgG-FITC (F9512-2ML, Sigma) и инкубировали в течение 1 часа при 4°C. После промывания и повторного суспендирования с помощью PBS + 2% FBS определяли значение флуоресценции с помощью проточного цитометра (Accuri C6, BD).

Поскольку на поверхности клеток SKBR-3 одновременно экспрессируются антигены Her2 и CD47, все из антител к Her2 трастузумаба, пертузумаба, антитела к CD47 Hu5F9-G4 и D1 SIRPα-Fc способны специфически связываться с клетками SKBR-3, но их значения максимальной средней интенсивности флуоресценции различны.

Результаты исследования продемонстрировали, что антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1^m-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1^m-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1^m-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1^m-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1^m-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1^m-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1^m-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1^m-D2-Fc2 и антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 были способны связываться с клетками SKBR-3 и достигали более высокого значения максимальной средней интенсивности флуоресценции.

Упомянутые выше результаты исследования продемонстрировали, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением способны специфически связываться с опухолевыми клетками и демонстрируют значительное преимущество в количестве молекул в условиях одинаковой перенасыщенной концентрации белка по сравнению с антителами к Her2 трастузумабом, пертузумабом, и/или антителом к CD47 Hu5F9-G4, и/или D1 SIRPα-Fc. Предпочтительно относительное содержание рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением, обеспечивающее насыщающее связывание с опухолевыми клетками, превышает сумму значений относительного содержания антитела к Her2 и D1 SIRPα-Fc, обеспечивающего насыщающее связывание с опухолевыми клетками, в среде с одинаковой сверхнасыщенной концентрацией белка.

Таблица 5. Максимальная средняя интенсивность флуоресценции и EC₅₀ (нМ) связывания антител/рекомбинантных белков с клетками SKBR-3

Например, как показано на фиг. 8В и в таблице 5, и антитело к Her2 трастузумаб, и антитело к CD47 Hu5F9-G4 способны специфически связываться с клетками SKBR-3, но их значения максимальной средней интенсивности флуоресценции не идентичны друг другу; при этом антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2 также способен связываться с клетками SKBR-3 и обладает более высоким значением максимальной средней интенсивности флуоресценции, что указывает на то, что в условиях одной и той же перенасыщенной концентрацией белка количество молекул антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, специфически связывающихся с клетками SKBR-3, существенно превышает количество молекул антитела к Her2 трастузумаба или антитела к CD47 Hu5F9-G4 и превышает сумму молекул антитела к Her2 трастузумаба и антитела к CD47 Hu5F9-G4.

Как известно специалистам в данной области, упомянутые выше результаты исследования указывают на то, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением, которые способны одновременно связываться как с нацеливающим на опухоль антигеном, так и с CD47, могут в большей степени связываться с опухолевыми клетками и, таким образом, обеспечивать более значительный противоопухолевый эффект по сравнению с одновременным применением антитела к CD47 или D1 SIRPα-Fc с другим нацеливающимся на опухоль терапевтическим антителом.

Определение биспецифической активности связывания с мишенями EGFR и CD47 с помощью проточной цитометрии

Хорошо растущие клетки A431 (человеческая эпидермальная раковая клетка, приобретенная в Институте основных медицинских наук, Академия медицинских наук Китая) собирали и подсчитывали, центрифугировали и повторно суспендировали до концентрации 2×10⁶ клеток/мл с PBS + 2% FBS. Аликвотировали 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного U-образного планшета (№ по каталогу 3799, Corning) и обеспечивали отстаивание в течение по меньшей мере 15 минут. Надосадочную жидкость отбирали пипеткой и отбрасывали после центрифугирования, затем добавляли 11 серийных разведений антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, JMT101, D1 SIRPα-Fc или Hu5F9-G4 (4-кратных серийных разведений, начиная от 216,6 нМ, всего 11 разведений) соответственно и инкубировали при 4°C в течение 1 часа. После промывания с помощью PBS + 2% FBS добавляли антитело козы к человеческому Fc IgG-FITC (F9512-2ML, Sigma) и инкубировали в течение 1 часа при 4°C. После промывания и повторного суспендирования с помощью PBS + 2% FBS определяли значение флуоресценции с помощью проточного цитометра (Accuri C6, BD).

Поскольку на поверхности клеток A431 одновременно экспрессируются антигены EGFR и CD47, все из антитела к EGFR JMT101, антитела к CD47 Hu5F9-G4 и D1 SIRPα-Fc способны специфически связываться с клетками A431, но их значения максимальной средней интенсивности флуоресценции различны.

Результаты исследования продемонстрировали, что все из антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1^m-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1^m-D2-Fc2 и антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 были способны связываться с клетками A431 и достигали более высокого значения максимальной средней интенсивности флуоресценции.

Упомянутые выше результаты исследования продемонстрировали, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением способны специфически связываться с опухолевыми клетками и демонстрируют значительное преимущество в количестве молекул в условиях одинаковой перенасыщенной концентрации белка по сравнению с антителом к EGFR JMT101, и/или антителом к CD47 Hu5F9-G4, и/или D1 SIRPα-Fc. Предпочтительно относительное содержание рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением, обеспечивающее насыщающее связывание с опухолевыми клетками, превышает сумму значений относительного содержания соответствующего антитела к EGFR и D1 SIRPα-Fc, обеспечивающего насыщающее связывание с опухолевыми клетками в условиях одинаковой перенасыщенной концентрации белка.

Таблица 6. Максимальная средняя интенсивность флуоресценции и EC₅₀ (нМ) связывания антител/рекомбинантных белков с клетками A431

Например, как показано на фиг. 8C и в таблице 6, все из антитела к EGFR JMT101, антитела к CD47 Hu5F9-G4 и D1 SIRPα-Fc способны специфически связываться с клетками A431, но их значения максимальной средней интенсивности флуоресценции не идентичны друг другу; и EC₅₀ (JMT101) = 0,598 нМ, EC₅₀ (D1 SIRPα-Fc) = 3,677 нМ, EC₅₀ (Hu5F9-G4) = 0,865 нМ. Можно видеть, что аффинность связывания JMT101 с клетками A431 более чем в 6 раз превышает аффинность связывания D1 SIRPα-Fc с клетками A431. При этом антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2 также способен связываться с клетками A431 и обладает более высоким значением максимальной средней интенсивности флуоресценции, что указывает на то, что в условиях одинаковой перенасыщенной концентрации белка количество молекул антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, специфически связывающихся с клетками A431, существенно превышает количество молекул антитела к EGFR JMT101, или D1 SIRPα-Fc, или антитела к CD47 Hu5F9-G4, а также превышает сумму молекул антитела к EGFR JMT101 и D1 SIRPα-Fc.

Как известно специалистам в данной области, упомянутые выше результаты исследования указывают на то, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением, которые способны одновременно связываться как с нацеливающим на опухоль антигеном, так и с CD47, могут в большей степени связываться с опухолевыми клетками и, таким образом, обеспечивать более значительный противоопухолевый эффект по сравнению с одновременным применением антитела к CD47 или D1 SIRPα-Fc с другим нацеливающимся на опухоль терапевтическим антителом.

Определение биспецифической активности связывания с мишенями PD-L1 и CD47 с помощью проточной цитометрии

2×10⁷ клеток NCI-H441 (человеческая клетка аденокарциномы легкого, приобретенных у BeinaChuanglian Biotechnology Research Institute Co., Ltd, Пекин) стимулировали с помощью 10 нг/мл hIFN-γ (BD, № по каталогу 554616), затем расщепляли, собирали, подсчитывали, центрифугировали и повторно суспендировали до концентрации 3×10⁶ клеток/мл с PBS + 2% FBS. Аликвотировали 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного U-образного планшета (№ по каталогу 3799, Corning) и обеспечивали отстаивание в течение по меньшей мере 15 минут. Надосадочную жидкость отбирали пипеткой и отбрасывали после центрифугирования, затем добавляли 12 серийных разведений антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2 или атезолизумаба (433,2 нМ, 216,6 нМ, 4-кратных серийных разведений, начиная от 216,6 нМ, всего 12 концентраций) соответственно и инкубировали при 4°C в течение 1 часа. После промывания с помощью PBS + 2% FBS добавляли антитело козы к человеческому Fc IgG-FITC (F9512-2ML, Sigma) и инкубировали в течение 1 часа при 4°C. После промывания и повторного суспендирования с помощью PBS + 2% FBS определяли значение флуоресценции с помощью проточного цитометра (Accuri C6, BD).

Поскольку на поверхности клеток NCI-H441 одновременно экспрессируются антигены PD-L1 и CD47, все из антитела к PD-L1 атезолизумаба, 13G4, 12A4, антитела к CD47 Hu5F9-G4, SIRPαD1-Fc способны специфически связываться с клетками NCI-H441.

Результаты исследования продемонстрировали, что все из антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1^m-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1^m-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1^m-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1^m-D2-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1^m-Fc2, антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1^m-D2-Fc2 и антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 были способны связываться с клетками NCI-H441 и достигали более высокого значения максимальной средней интенсивности флуоресценции.

Упомянутые выше результаты исследования продемонстрировали, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением по сравнению с антителом к PD-L1 атезолизумабом, 13G4 и 12A4 способны специфически связываться с опухолевыми клетками и демонстрируют значительное преимущество в количестве молекул в условиях одинаковой перенасыщенной концентрации белка. Например, в среде с одинаковой перенасыщенной концентрацией белка рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением связываются в большей степени с опухолевыми клетками и демонстрируют значительное преимущество в количестве молекул, чем антитело к PD-L1 атезолизумаб.

Таблица 7. Максимальная средняя интенсивность флуоресценции и EC₅₀ (нМ) связывания антител/рекомбинантных белков с клетками NCI-H441

Например, как показано на фиг. 8D и в таблице 7, антитело к PD-L1 атезолизумаб способно специфически связываться с клетками NCI-H441; при этом антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2 также способен связываться с клетками NCI-H441 и обладает более высоким значением максимальной средней интенсивности флуоресценции, что указывает на то, что в условиях одной и той же перенасыщенной концентрации белка количество молекул антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, специфически связывающихся с клетками NCI-H441, существенно превышает количество молекул антитела к PD-L1 атезолизумаба. EC₅₀ (атезолизумаб) = 0,2006 нМ, EC₅₀ (D1 SIRPα-Fc) = 1,643 нМ, EC₅₀ (Hu5F9-G4) = 0,3865 нМ. Можно видеть, что аффинность связывания атезолизумаба с клетками NCI-H441 более чем в 6 раз превышает аффинность связывания D1 SIRPα-Fc с клетками NCI-H441.

Как известно специалистам в данной области, упомянутые выше результаты исследования указывают на то, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением, которые способны одновременно связываться как с нацеливающим на опухоль антигеном, так и с CD47, могут в большей степени связываться с опухолевыми клетками и, таким образом, обеспечивать более значительный противоопухолевый эффект по сравнению с одновременным применением антитела к CD47 или D1 SIRPα-Fc с другим нацеливающимся на опухоль терапевтическим антителом.

2. Определение активности конкурентного связывания с мишенью

В следующем способе используют Ofa-Fc1-D1-Fc2 или антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2 в качестве примера с применением ELISA для определения активности конкурентного связывания с мишенями CD47 и SIRPα.

Определение активности конкурентного связывания Ofa-Fc1-D1-Fc2 и антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2 с помощью ELISA

Планшет для ELISA (9018, Corning) покрывали 100 мкл 1 мкг/мл CD47-His (12283-H08H-200, Sino Biological) и помещали при 4°C в течение ночи. Планшет промывали с помощью PBST, а затем блокировали с помощью PBS + 1% BSA в течение 2 часов при комнатной температуре. После промывания аликвотировали 100 мкл смеси разбавленного Ofa-Fc1-D1-Fc2 или антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2 (3-кратные серийные разведения, начиная от 1000 нг/мл, всего 11 разведений) и меченного биотином D1 SIRPα-Fc (набор для мечения биотином, 21925, Thermo, концентрация для добавления составляла 100 нг/мл) в каждую лунку покрытого планшета, затем инкубировали в течение 1 часа при 25°C. После отбрасывания образца и промывания планшета три раза раствором PBST добавляли 100 мкл разбавленного стрептавидин-HRP (1:10000) (ML-0437P-HRP, ZI501-1, Yanyu Chemical Reagent Co., Ltd), затем инкубировали при 25°C в течение 1 часа. После отбрасывания раствора и промывания планшета три раза раствором PBST добавляли TMB (P0209, Beyotime), обеспечивали протекание реакции в планшете в течение приблизительно 20 минут и помещали в недоступное для света место. Реакцию останавливали с помощью H₂SO₄ и считывали значение OD при 450-650 нм на устройстве для считывания микропланшетов.

Результаты исследования продемонстрировали, что все из антитела к CD47 Hu5F9-G4, D1 SIRPα-Fc, Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2 и антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 были способны конкурировать с меченным биотином D1 SIRPα-Fc за связывание с антигеном CD47 с различной степенью, проявляя активность конкурентного связывания.

Например, как показано на фиг. 9, все из антитела к CD47 Hu5F9-G4, D1 SIRPα-Fc, OFa-Fc1-D1-Fc2 и антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2 способны конкурировать с меченным биотином D1 SIRPα-Fc за связывание с антигеном CD47, проявляя активность конкурентного связывания; при этом способность к конкурентному связыванию у Ofa-Fc1-D1-Fc2 или антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2 с CD47 слабее, чем таковая у антитела к CD47 Hu5F9-G4 или D1 SIRPα-Fc соответственно, что согласуется с результатами исследований в отношении аффинности, описанных в упомянутых выше примерах.

Пример 4. Проведение ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантных белков in vitro

Раннее исследование иммунологической безопасности рекомбинантных белков Ofa-Fc1-D1^m-Fc2, Ofa-Fc1-D1^m-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1^m-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1^m-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1^m-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1^m-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1^m-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1^m-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1^m-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1^m-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1^m-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1^m-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1^m-Fc2 и антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1^m-D2-Fc2 проводили, соответственно, in vitro. При использовании Ofa-Fc1-D1^m-Fc2 в качестве примера следующий способ подходит для рекомбинантных белков, содержащих высокоаффинный мутант внеклеточного усеченного варианта SIRPα в правом плече.

Раннее исследование иммунологической безопасности рекомбинантных белков Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2 и антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 проводили, соответственно, in vitro. При использовании Ofa-Fc1-D1-Fc2 в качестве примера следующий способ подходит для рекомбинантных белков, содержащих внеклеточный усеченный вариант SIRPα в правом плече.

Определение специфического связывания биспецифических антител с мишенью CD47 до и после осуществления мутации в правом плече с помощью проточной цитометрии

Клетки NCI-H441 (человеческая клетка аденокарциномы легкого, приобретенная у BeinaChuanglian Biotechnology Research Institute Co., Ltd, Пекин) расщепляли, собирали, подсчитывали, центрифугировали, а затем повторно суспендировали до концентрации 3×10⁶ клеток/мл с PBS + 2% FBS. Аликвотировали 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного U-образного планшета (№ по каталогу 3799, Corning) и обеспечивали отстаивание в течение по меньшей мере 15 минут. Надосадочную жидкость отбирали пипеткой и отбрасывали после центрифугирования, затем добавляли 12 серийных разведений Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1^m-Fc2, Hu5F9-G4 или офатумумаба (433,2 нМ, 216,6 нМ, 4-кратных серийных разведений, начиная от 216,6 нМ, всего 12 концентраций) соответственно и инкубировали при 4°C в течение 1 часа. После промывания с помощью PBS + 2% FBS добавляли антитело козы к человеческому IgG Fc-FITC (F9512-2ML, Sigma) и инкубировали в течение 1 часа при 4°C. После промывания и повторного суспендирования с помощью PBS + 2% FBS определяли значение флуоресценции с помощью проточного цитометра (Accuri C6, BD).

Таблица 8. Специфическое связывание биспецифических антител с мишенью CD47 до и после осуществления мутации в правом плече с помощью проточной цитометрии

Например, как показано на фиг. 10 и в таблице 8, за исключением того, что антитело к CD20 офатумумаб не способно связываться с CD47, все из антитела к CD47 Hu5F9-G4, Ofa-Fc1-D1-Fc2 и Ofa-Fc1-D1^m-Fc2 способны связываться с CD47, и аффинность связывания Ofa-Fc1-D1^m-Fc2 (EC₅₀ = 0,529 нМ) с клетками NCI-H441 выше, чем у OFa-Fc1-D1-Fc2 (EC₅₀ = 8,68 нМ), где D1^m представляет собой высокоаффинный мутант в области D1 SIRPα (т.e. Seq ID No: 10 в CN106519036A).

In vitro анализ ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантных белков

(1) Получение суспензии человеческих эффекторных клеток

Хорошо растущие человеческие эффекторные клетки NK92MI-CD16a со стабильной и высокой экспрессией CD16a (приобретенные у Huabo Biotech Co., Ltd) центрифугировали (201 g, 5 мин) с отбрасыванием надосадочной жидкости и повторно суспендировали в 5 мл основной среды (без фенолового красного) MEM (приобретенной у Gibco, 51200-038). После подсчитывания клеточную суспензию доводили до плотности клеток 2,4×10⁶ клеток/мл основной средой MEM (без фенолового красного), которую применяли в качестве суспензии человеческих эффекторных клеток.

(2) Инкубация эффекторных клеток и антител

Аликвотировали 50 мкл основной среды MEM (без фенолового красного) в каждую лунку 96-луночного черного планшета с прозрачным дном, затем 25 мкл каждого разведения биспецифического антитела Ofa-Fc1-D1-Fc2 или Ofa-Fc1-D1^m-Fc2 аликвотировали в каждую лунку планшета, соответственно, в двух повторностях. Добавляли 25 мкл суспензии человеческих эффекторных клеток, полученную на стадии (1) (60000 клеток/лунка). После тщательного перемешивания биспецифическое антитело Ofa-Fc1-D1-Fc2 или Ofa-Fc1-D1m-Fc2 характеризовалось конечной серийной концентрацией (4-кратные серийные разведения, начиная от 433,2 нМ, всего 10 разведений). Обеспечивали реагирование смеси при 37°C в течение 5,5 часа, затем добавляли буфер для лизиса (полученный из набора Promega, G7891) в контрольную группу и инкубировали в течение 0,5 часа.

(3) Выявление ADCC-активности

После инкубации непокрытый планшет помещали в безопасное помещение и охлаждали естественным путем до комнатной температуры в течение приблизительно 15 минут. 100 мкл реакционного раствора субстрата LDH (полученного из набора Promega, G7891), уравновешенного при комнатной температуре в течение 30 минут, аликвотировали в каждую лунку планшета, осторожно перемешивали, а затем инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре. Немедленно добавляли 50 мкл стоп-раствора (полученного из набора Promega, G7891) в каждую лунку и тщательно перемешивали, затем определяли значение флуоресценции на устройстве для считывания микропланшетов.

Результаты исследования продемонстрировали, что ADCC-положительные рекомбинантные белки и/или антитела, нацеливающиеся на CD47, приводили к взаимному уничтожению NK-клеток вследствие экспрессии антигена CD47 на NK-клетках. Поэтому, по сравнению с Ofa-Fc1-D1^m-Fc2, или Ofa-Fc1-D1^m-D2-Fc2, или антитело-к-EGFR-Fc1-D1^m-Fc2, или антитело-к-EGFR -Fc1-D1^m-D2-Fc2, или антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1^m-Fc2, или антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1^m-D2-Fc2, или антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1^m-Fc2, или антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1^m-D2-Fc2, или антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1^m-Fc2, или антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1^m-D2-Fc2, или антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1^m-Fc2, или антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1^m-D2-Fc2, или антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1^m-Fc2, или антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1^m-D2-Fc2, каждое из которых содержало высокоаффинный мутант внеклеточного усеченного варианта SIRPα, рекомбинантный белок Ofa-Fc1-D1-Fc2, или Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, или Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, или Obi-Fc1-D1-Fc2, или Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, или Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, или антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, или антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, или антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, или антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, или антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, или антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, или антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, или антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, или антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, или антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, или антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, или антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, или антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, или антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, или антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, или антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, или антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, или антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, или антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, или антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2, или антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 существенно снижали токсические побочные эффекты, вызванные NK-клетками, в по меньшей мере 1000 раз благодаря своей слабой аффинности в отношении CD47.

Например, как показано на фиг. 11, если концентрация антитела/рекомбинантного белка достигала 10^-1 нМ, то начинался клеточный лизис, и если концентрация антитела/рекомбинантного белка достигала 10³ нМ, то степень лизиса клеток достигала 15,25% в группе обработки Ofa-Fc1-D1m-Fc2, тогда как клеточный лизис не наблюдали в группе обработки Oba-Fc1-D1-Fc2 при концентрации 10³ нМ.

Как известно специалистам в данной области, упомянутые выше результаты исследования указывают на то, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением, обладающие ADCC-активностью и низкой аффинностью в отношении антигена CD47, имеют более высокую иммунологическую безопасность.

Как известно специалистам в данной области, упомянутых выше результаты исследования указывают на то, что оптимизированный способ выявления ADCC-активности (т. e. анализ ранней оценки иммунологической безопасности in vitro), описанный в настоящем изобретении, можно применять для ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантных белков (в том числе моновалентных или поливалентных) или антител (в том числе моновалентных или поливалентных), нацеливающихся на CD47 и обладающих ADCC-активностью. Способ является простым, быстрым и не ограничен ресурсами крови.

Пример 5. Подавление роста опухолевых клеток с помощью рекомбинантного белка in vivo

Подавление роста опухолевых клеток с помощью рекомбинантных белков Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 проводили, соответственно, in vivo. При использовании Ofa-Fc1-D1-Fc2 в качестве примера следующий способ применим для выявления рекомбинантных белков, содержащих внеклеточный усеченный вариант SIRPα в правом плече.

Самцам мышей NSG (приобретенным у Beijing Idmo Co., Ltd) подкожно инокулировали клетки Raji B-клеточной лимфомы человека. После того, как объем опухоли достигал 80 мм³ - 150 мм³, мышей делили на 2 следующие группы (6 мышей на группу, в каждой группе мышей внутрибрюшинно вводили данные средства): 1) контрольная группа, получавшая среду-носитель (Tris-цитрат, pH 6,5); 2) группа, получавшая Ofa-Fc1-D1-Fc2 (150 мкг/мышь); дважды в неделю в течение 2 недель. Наблюдали рост опухоли и измеряли объем опухоли перед введением (0 день) и в 3^ий день, 5^ый день, 7^ой день, 10^ый день, 12^ый день и 14^ый день после введения для проведения оценки противоопухолевого эффекта Ofa-Fc1-D1-Fc2.

Результаты исследования продемонстрировали, что в модели мыши NSG с подкожно трансплантированной лимфомой Raji рекомбинантные белки Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2 и антитело к PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 блокировали путь передачи сигнала CD47-SIRPα и, таким образом, активировали нацеленный фагоцитоз макрофагами и/или антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP), опосредованный макрофагами, с демонстрацией тем самым значительного эффекта подавления опухоли.

Например, как показано на фиг. 12, на оси абсцисс представлено время (дни) от момента получения мышами NSG с подкожно трансплантированной лимфомой Raji обработки лекарственным средством, а на оси ординат представлен объем опухоли (мм³). На фиг. 12 показано, что после периода обработки лекарственным средством Ofa-Fc1-D1-Fc2 получавшая Ofa-Fc1-D1-Fc2 группа демонстрировала тенденцию значительного подавления опухоли по сравнению с контрольной группой, получавшей среду-носитель, и степень подавления опухоли у получавшей Ofa-Fc1-D1-Fc2 группы в 14^ый день достигала 63,14%.

Как известно специалистам в данной области, упомянутые выше результаты исследования, указывают на то, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением, которые способны одновременно связываться как с антигеном-мишенью, так и с антигеном CD47 на опухолевых клетках, могут достигать значительного эффекта подавления опухоли у мышей NSG с подкожно трансплантированными опухолевыми клетками.

Пример 6. Анализ ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантных белков in vitro

Раннюю оценку иммунологической безопасности рекомбинантных белков Ofa-Fc1-D1^m-Fc2, Ofa-Fc1-D1^m-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1^m-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1^m-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1^m-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1^m-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1^m-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1^m-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1^m-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1^m-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1^m-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1^m-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1^m-Fc2 и антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1^m-D2-Fc2 проводили, соответственно, in vitro. При использовании Ofa-Fc1-D1^m-Fc2 в качестве примера следующий способ применим для рекомбинантных белков, содержащих высокоаффинный мутант внеклеточного усеченного варианта SIRPα в правом плече.

Раннюю оценку иммунологической безопасности рекомбинантных белков Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2 и антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 проводили, соответственно, in vitro. При использовании Ofa-Fc1-D1-Fc2 в качестве примера следующий способ применим для выявления рекомбинантных белков, содержащих внеклеточный усеченный вариант SIRPα в правом плече.

Поскольку B-клетки в высокой степени экспрессируют антиген CD20, в данном эксперименте оценивали уничтожение опухолевых клеток путем определения содержания B-клеток. В анализе ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантных белков, нацеливающихся на другой опухолевый антиген и антиген CD47, in vitro экспериментальным мышам в данном примере нужно было подкожно трансплантировать соответствующие опухолевые клетки.

Специфический эффект нацеливания на опухоль

Самок мышей NSG (Hu-NSG) (приобретенных у Beijing Idmo Co., Ltd) с трансплантированными человеческими CD34⁺ HSC отбирали и делили на следующие 3 группы (3 мыши в каждой группе, мышам в каждой группе внутривенно вводили данные средства): 1) получавшая 0,9% солевой раствор контрольная группа; 2) получавшая Hu5F9-G4 группа (6,7 мкг/мышь); 3) получавшая Ofa-Fc1-D1-Fc2 группа (5 мкг/мышь). Мышам осуществляли введение один раз. Через 96 часов после введения собирали 80 мкл крови из хвостовой вены мышей и добавляли в пробирку с антикоагулянтом, содержащую гепарин натрия. RBC лизировали свежеприготовленной смесью буфера для лизиса (BD Pharm Lyse™, № по каталогу 555899) и дважды дистиллированной воды в объемном соотношении 1:1, а оставшиеся клетки промывали и повторно суспендировали с PBS + 2% FBS, а затем инкубировали с флуоресцентным антителом (антителом PE к человеческому CD45 (№ по каталогу 304039), антителом FITC к человеческому CD19 (№ по каталогу 302206), антителом APC к человеческому CD3 (№ по каталогу 300312), все из которых приобретены у BioLegend) в течение 30 минут. После промывания и повторного суспендирования с помощью PBS + 2% FBS образец подвергали выявлению с помощью проточного цитометра (Accuri™ C6, BD).

Результаты исследования продемонстрировали, что, если мышам Hu-NSG вводили одну и ту же дозу Ofa-Fc1-D1-Fc2 или антитела к CD47 Hu5F9-G4, то через 96 часов после введения Ofa-Fc1-D1-Fc2 обеспечивал преимущественный клиренс B-клеток, экспрессирующих антиген CD20 (т. e. клетки-мишени), тогда как антитело к CD47 Hu5F9-G4 обеспечивало преимущественный клиренс нецелевых клеток с высокой относительной интенсивностью экспрессии CD47 (таких как T-клетки) по причине своей высокой аффинности в отношении антигена CD47.

Например, как показано на фиг. 13, получавшая антитело к CD47 Hu5F9-G4 группа (фиг. 13B) демонстрировала существенное выведение нецелевых клеток с высокой относительной интенсивностью экспрессии CD47 (таких как T-клетки) по сравнению с получавшей 0,9% нормальный солевой раствор группой (фиг. 13A) (доля B-клеток (т.e. клеток-мишеней с антигеном CD20) среди всех выявляемых клеток повышалась от 40,9% до 73,5% через 96 часов после введения); тогда как получавшая рекомбинантный белок Ofa-Fc1-D1-Fc2 группа (фиг. 13C) демонстрировала существенный клиренс В-клеток (т.e. клеток-мишеней с антигеном CD20) по сравнению с получавшими 0,9% нормальный солевой раствор (фиг. 13A), т.e. Ofa-Fc1-D1-Fc2 обеспечивал преимущественный клиренс B-клеток через 96 часов после введения (доля B-клеток среди всех выявляемых клеток снижалась от 40,9% до 3,7% через 96 часов после введения).

Как известно специалистам в данной области, упомянутые выше результаты исследования указывают на то, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением, которые способны одновременно связываться как с нацеливающим на опухоль антигеном, так и с антигеном CD47, обеспечивают преимущественный клиренс клеток и/или опухолевых клеток с нацеливающим на опухоль антигеном в условиях одной и той же дозы.

Иммунологическая безопасность при низкой дозе

Самок мышей NSG (Hu-NSG) (приобретенных у Beijing Idmo Co., Ltd) с трансплантированными человеческими CD34⁺ HSC отбирали и делили на следующие 2 группы (3 мыши в каждой группе, мышам в каждой группе внутривенно вводили данные средства): 1) получавшая Ofa-Fc1-D1-Fc2 группа (1 мкг/мышь); 3) получавшая Ofa-Fc1-D1^m-Fc2 группа (1 мкг/мышь). Мышам осуществляли введение один раз. Через 72 часов после введения собирали 80 мкл крови из хвостовой вены мышей и добавляли в пробирку с антикоагулянтом, содержащую гепарин натрия. RBC лизировали свежеприготовленной смесью буфера для лизиса (BD Pharm Lyse™, № по каталогу 555899) и дважды дистиллированной воды в объемном отношении 1:1, а оставшиеся клетки промывали и повторно суспендировали с PBS + 2% FBS, а затем инкубировали с флуоресцентным антителом (антителом PE к человеческому CD45 (№ по каталогу 304039), антителом FITC к человеческому CD19 (№ по каталогу 302206), антителом APC к человеческому CD3 (№ по каталогу 300312), все из которых приобретены у BioLegend) в течение 30 минут. После промывания и повторного суспендирования с помощью PBS + 2% FBS образец от получавшей Ofa-Fc1-D1-Fc2 группы (1 мкг/мышь) выявляли с помощью проточного цитометра (Accuri™ C6, BD), и образец от получавшей Ofa-Fc1-D1^m-Fc2 группы (1 мкг/мышь) выявляли с помощью проточного цитометра (NovoCyte™ 3130, ACEA).

Результаты исследования продемонстрировали, что в случае если мышам Hu-NSG вводили рекомбинантные белки при низкой дозе, то через 72 часа после однократного введения Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2 или антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 клетки-мишени, которые экспрессировали антиген, на который нацеливалось левое плечо, (такие как опухолевые клетки), в значительной степени были устранены, тогда как клетки, которые не экспрессировали антиген, на который нацеливалось левое плечо (такие как T-клетки, другие иммунные клетки), не подвергались существенному влиянию; однако через 72 часа после однократного введения рекомбинантного белка, содержащего высокоаффинный мутант внеклеточного усеченного варианта SIRPα, Ofa-Fc1-D1^m-D2-Fc2, или антитело-к-EGFR-Fc1-D1^m-Fc2, или антитела к EGFR -Fc1-D1^m-D2-Fc2, или антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1^m-Fc2, или антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1^m-D2-Fc2, или антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1^m-Fc2, или антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1^m-D2-Fc2, или антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1^m-Fc2, или антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1^m-D2-Fc2, или антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1^m-Fc2, или антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1^m-D2-Fc2, или антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1^m-Fc2, или антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1^m-D2-Fc2, хотя целевые клетки, которые экспрессировали антиген, на который нацеливалось левое плечо, (такие как опухолевые клетки), в значительной степени устранялись, клетки, которые не экспрессировали антиген, на который нацеливалось левое плечо (такие как T-клетки, другие иммунные клетки) также устранялись в значительной степени.

Например, как показано на фиг. 14, через 72 часа после однократного введения Ofa-Fc1-D1-Fc2B (фиг. 14C, фиг. 14D) B-клетки (клетка-мишень с антигеном CD20) в значительной степени были устранены (почти полностью устранены), тогда как клетки, которые на экспрессировали антиген CD20 (такие как T-клетки, другие иммунные клетки) не подвергались существенному влиянию по сравнению с состоянием до введения (фиг. 14A, фиг. 14B). Через 72 часа после однократного введения Ofa-Fc1-D1^m-Fc2 (фиг. 14G, фиг. 14H) по сравнению с состоянием до введения (фиг. 14E, фиг. 14F), несмотря на то, что B-клетки (клетки-мишени с антигеном CD20) в значительной степени были устранены, клетки, которые не экспрессировали антиген CD20 (T-клетки и другие иммунные клетки), также в значительной степени были устранены.

Как известно специалистам в данной области, упомянутые выше результаты указывают на то, что рекомбинантные белки, содержащие внеклеточный усеченный вариант SIRPα в правом плече, обладают более высоким эффектом специфического нацеливания на опухоль и демонстрируют более высокую иммунологическую безопасность, чем рекомбинантные белки, содержащие высокоаффинный мутант внеклеточного усеченного варианта SIRPα в правом плече, при одной и той же дозе.

Восстановление иммунитета при высокой дозе

Самок мышей NSG (Hu-NSG) (приобретенных у Beijing Idmo Co., Ltd) с трансплантированными человеческими CD34⁺ HSC отбирали и делили на следующие 2 группы (3 мыши в каждой группе, мышам в каждой группе внутривенно вводили данные средства): 1) получавшая Hu5F9-G4 группа (200 мкг/мышь); 3) получавшая Ofa-Fc1-D1-Fc2 группа (150 мкг/мышь). Мышам осуществляли введение один раз. Через 4 дня и 14 дней после введения собирали 80 мкл крови из хвостовой вены мышей и добавляли в пробирку с антикоагулянтом, содержащую гепарин натрия. RBC лизировали свежеприготовленной смесью буфера для лизиса (BD Pharm Lyse™, № по каталогу 555899) и дважды дистиллированной воды в объемном отношении 1:1, а оставшиеся клетки промывали и повторно суспендировали с PBS + 2% FBS, а затем инкубировали с флуоресцентным антителом (антителом PE к человеческому CD45 (№ по каталогу 304039), антителом FITC к человеческому CD19 (№ по каталогу 302206), антителом APC к человеческому CD3 (№ по каталогу 300312), все из которых приобретены у BioLegend) в течение 30 минут. После промывания и повторного суспендирования с помощью PBS + 2% FBS образец подвергали выявлению с помощью проточного цитометра (Accuri™ C6, BD).

Результаты исследования продемонстрировали, что в случае если мышам Hu-NSG вводили рекомбинантные белки при высокой дозе, то через 96 часов после однократного введения Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 или антитела к CD47 Hu5F9-G4 B-клетки (клетка-мишень с антигеном CD20) и нецелевые клетки (такие как T-клетки, другие иммунные клетки) были устранены в значительной степени в каждой группе. Через 14 дней после введения в получавших Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2 или антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 группах B-клетки (клетка-мишень с антигеном CD20) все еще находились в состоянии устранения, тогда как другие нецелевые клетки, экспрессирующие CD47 (такие как T-клетки) в значительной степени восстанавливались; однако в получавшей антитело к CD47 Hu5F9-G4 группе ни B-клетки (клетка-мишень с антигеном CD20), ни нецелевые клетки, экспрессирующие CD47, не восстанавливались.

Например, как показано на фиг. 15, через 96 часов после введения высокой дозы антитела к CD47 Hu5F9-G4 (фиг. 15A) или Ofa-Fc1-D1-Fc2 (фиг. 15B) и B-клетки (клетка-мишень с антигеном CD20), и нецелевые клетки, экспрессирующие CD47 (такие как T-клетки) устранялись в значительной степени; но через 14 дней после введения B-клетки (клетка-мишень с антигеном CD20) все еще находились в состоянии устранения, тогда как нецелевые клетки, экспрессирующие CD47 (такие как T-клетки), в отличие от B-клеток (клетка-мишень с антигеном CD20), в значительной степени восстанавливались в получавшей Ofa-Fc1-D1-Fc2 группе (фиг. 15D); однако ни B-клетки (клетка-мишень с антигеном CD20), ни нецелевые клетки, экспрессирующие CD47 (такие как T-клетки) не проявляли признака восстановления в получавшей антитело к CD47 Hu5F9-G4 группе (фиг. 15C).

Как известно специалистам в данной области, упомянутые выше результаты исследования указывают на то, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением, которые способны одновременно связываться как с нацеливающим на опухоль антигеном, так и с антигеном CD47, характеризуются более высокой иммунологической безопасностью, поскольку нецелевые клетки, экспрессирующие CD47 (такие как иммунные клетки, например, T-клетки) могут быть восстановлены при обработке высокой дозой данных рекомбинантных белков.

Как известно специалистам в данной области, упомянутые выше результаты исследования, указывают на то, что способ ранней оценки иммунологической безопасности in vitro, описанный в настоящем изобретении, можно применять для ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантных белков (в том числе моновалентных или поливалентных) или антител (в том числе моновалентных или поливалентных).

Пример 7. Влияние различных усечений на аффинность связывания с мишенью

Из рекомбинантных белков в качестве примеров применяли Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2 и антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2 и антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, и следующий способ применим для рекомбинантных белков, имеющих одинаковое левое плечо и различную длину внеклеточных усеченных вариантов SIRPα.

Определение биспецифической активности связывания с мишенями Her2 и CD47 с помощью проточной цитометрии

Хорошо растущие клетки SKBR-3 (человеческая клетка рака молочной железы, приобретенная в Банке клеток китайской академии наук, Шанхай) собирали, подсчитывали, центрифугировали и повторно суспендировали до концентрации 2×10⁶ клеток/мл с PBS + 2% FBS. Аликвотировали 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного U-образного планшета (№ по каталогу 3799, Corning) и обеспечивали отстаивание в течение по меньшей мере 15 минут. Надосадочную жидкость отбирали пипеткой и отбрасывали после центрифугирования, затем добавляли 11 разведений антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2 или антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2 (4-кратных серийных разведений, начиная от 433,2 нМ, всего 11 разведений) соответственно и инкубировали при 4°C в течение 1 часа. После промывания с помощью PBS + 2% FBS добавляли антитело козы к человеческому IgG Fc-FITC (F9512-2ML, Sigma) и инкубировали в течение 1 часа при 4°C. После промывания и повторного суспендирования с помощью PBS + 2% FBS определяли значение флуоресценции с помощью проточного цитометра (Accuri C6, BD).

Поскольку трастузумаб и пертузумаб действуют на разные эпитопы антигена Her2, и существует большая разница в расстояниях от двух эпитопов до клеточной мембраны, следовательно, все их рекомбинантных белков антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2 и антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2 способны специфически связываться с клетками SKBR-3, но их аффинности связывания и их значения максимальной средней интенсивности флуоресценции являются разными.

Результаты исследования продемонстрировали, что, поскольку эпитопы трастузумаба и Her2 (Pedersen M W, et al. Targeting Three Distinct HER2 Domains with a Recombinant Antibody Mixture Overcomes Trastuzumab Resistance. Molecular Cancer Therapeutics, 2015, 14(3): 669-680) расположены относительно ближе к поверхности клеточной мембраны, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2 обладает лучшей аффинностью в отношении клеток SKBR-3, чем антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2. Поскольку эпитопы пертузумаба и Her2 (внеклеточного домена II Her2) раположены относительно дальше от поверхности клеточной мембраны, следовательно, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2 обладает эквивалентной аффинностью в отношении клеток SKBR-3 по сравнению с антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2 SKBR-3.

Упомянутые выше результаты исследования демонстрируют, что правое плечо с разными значениями длины усечения будет влиять на аффинность рекомбинантных белков в отношении клеток-мишеней. Для левого плеча, которое связывается с проксимальным по отношению к мембране эпитопом, правое плечо с более коротким усечением SIRPα может обеспечивать сильное усиление связывания рекомбинантных белков с двумя мишенями. Однако в случае левого плеча, которое связывается с дистальным по отношению к мембране эпитопом, правое плечо с более коротким усечением SIRPα может утратить свое преимущество. Чем дальше антиген, на который нацеливается левое плечо, удален от клеточной мембраны, тем длиннее должно быть усечение варианта SIRPα в правом плече, чтобы достичь оптимального соответствия.

Например, как показано на фиг. 16, способность связывания антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2 (EC₅₀ = 2,04 нМ) с клетками SKBR-3 значительно выше, чем способность антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2 (EC₅₀ = 25,95 нМ) (фиг. 16A). Способность связывания антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2 с клетками SKBR-3 (EC₅₀ = 15,22 нМ) эквивалентна таковой антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2 (EC₅₀ = 11,03 нМ) (фиг. 16B).

Как известно специалистам в данной области, упомянутые выше результаты исследования указывают на то, что на основании расстояния между эпитопом антигена-мишени и поверхностью мембраны клетки-мишени внеклеточный усеченный вариант человеческого SIRPα с подходящей длиной для правого плеча может обеспечивать эффективное усиление способности связывания рекомбинантных белков с клеткой-мишенью.

Пример 8. Исследование острой цитотоксичности рекомбинантных белков

В данном варианте осуществления представлено исследование острой цитотоксичности рекомбинантных белков Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2 и антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2. В следующем способе используют Ofa-Fc1-D1-Fc2 в качестве примера, который также применим для рекомбинантных белков с внеклеточным усеченным вариантом SIRPα в правом плече.

Соответствующее количество раствора Ofa-Fc1-D1-Fc2 (4,02 мг/мл) разбавляли до 0,25 мг/мл и 2,5 мг/мл с помощью буфера (Tris-цитрат, pH 6,5) для инъекции и применяли для введения экспериментальным животным группы 1 и группы 2 соответственно.

Четыре здоровые самки яванского макака возрастом 4 года приобретали у Guangxi Guidong Primates Development и Experiment Co., Ltd. Получение экспериментальных животных одобрено Департаментом науки и технологии Гуанси-Чжуанской автономной области и имеет лицензионный номер SCXK Gui2016-0001. Экспериментальных животных тщательно клинически обследовали и взвешивали перед введением, и патологий обнаружено не было. Масса тела составляла 2,47-2,85 кг в день первоначального введения.

Таблица 9. Экспериментальная схема

Примечание: * внутривенная инъекция.

Четыре самки яванского макака делили на две группы по две обезьяны в каждую группу. Животным внутривенно вводили дозу 0,5 мг/кг и 5 мг/кг соответственно, и объем вводимой дозы составлял 2 мл/кг. Схема эксперимента показана в таблице 9. Животным осуществляли однократное введение, а затем постоянно наблюдали на протяжении 28 дней после введения. Яванских макаков содержали в подвижных клетках из нержавеющей стали с одним животным в каждой клетке. Ежедневно на примерно 12 часов свет включали и на 12 часов выключали. Корм для животных приобретали у Beijing KeaoXieli Feed Co., Ltd., и животные имели свободный доступ к корму на протяжении эксперимента за исключением определенного периода голодания. Партию корма проверяли с помощью Shanghai Pony Testing Technology Co., Ltd. (PONY) на наличие определенных микроорганизмов, тяжелых металлов и остатков пестицидов. Во время эксперимента все животные имели свободный доступ к питьевой воде с помощью бутылок с водой. Питьевую воду очищали фильтрацией и стерилизацией воды с помощью системы обратного осмоса. Уровень pH, жесткость, содержание тяжелых металлов и микроорганизмов питьевой воды определяли с помощью датчика.

Всех животных осматривали дважды в день (один раз утром и один раз во второй половине дня) возле клетки на протяжении эксперимента, и наблюдения включали в себя без ограничения заболеваемость, повреждение, смерть и получение корма и воды. Всех животных подробно клинически обследовали один раз перед экспериментом. Всех животных подробно клинически обследовали по меньшей мере один раз в день после введения на протяжении эксперимента. Клинические обследования включали в себя без ограничения заболеваемость, смертность, повреждение и получение корма и воды, кожу, шерсть, глаза, уши, нос, рот, грудь, живот, наружные половые органы, конечности, органы дыхания и кровообращения, вегетативные эффекты (такие как слюноотделение), нервную систему (например, дрожание, судороги, стрессовая реакция и аномальное поведение). Массу тела животных измеряли в D-1 (перед введением), D1, D4, D8, D11, D15, D18, D22, D25 и перед вскрытием. Потребление пищи животными на протяжении 24 часов (24 часа ± 1 час) измеряли в D2, D4, D8, D11, D15, D18, D22, D25 соответственно. Электрокардиограмму контролировали в D-1, D2, D14 и D28 с использованием стандартного отведения II (8 отведений) при скорости регистрации 50 мм/секунда.

Клинико-патологические образцы собирали и определяли параметры гематологии, коагуляции крови, показатели биохимии крови и типирование лимфоцитов перед введением (D-1) и в D2, D7, D14 и D28 после введения. Образцы мочи собирали и анализировали перед введением и в день 28 после введения.

Перед забором образца всех животных не кормили, за исключением свободного доступа к воде на протяжении ночи (по меньшей мере 10 часов). Образцы крови (4,5-6 мл) собирали из бедренной вены, при этом приблизительно 1,8 мл цельной крови использовали для анализа коагуляции крови в пробирке с антикоагулянтом, содержащей цитрат натрия; приблизительно 1 мл цельной крови использовали для гематологического анализа в пробирке с антикоагулянтом, содержащей K3-EDTA, приблизительно 2 мл цельной крови использовали для биохимического анализа крови в пробирке для сбора крови (без антикоагулянта) с разделительным гелем, а сыворотку крови выделяли центрифугированием в соответствии со стандартными рабочими процедурами. Между тем выделенные образцы сыворотки крови в D-1 перед введением и в D2 после введения использовали для типирования T/B-клеток с помощью проточной цитометрии.

Животных умерщвляли в D29, собирали и консервировали ткани сердца, печени, селезенки, легких и почек, а также взвешивали печень, легкое (включая главный бронх), почку, селезенку, сердце, надпочечник, гипофиз, щитовидную железу и околощитовидную железу, тимус, яичник, матку (включая шейку матки) и головной мозг.

Результаты показали, что после однократного внутривенного введения Ofa-Fc1-D1-Fc2 при дозе 0,5 мг/кг и 5 мг/кг соответственно, при этом за животными постоянно наблюдали в течение 28 дней после введения, существенных патологий, связанных с лекарственным средством, у животных не наблюдали, потребление пищи и масса тела колебались в пределах нормального диапазона; по сравнению с данными перед введением показатели коагуляции крови, мочи и данные электрокардиограммы животных после введения не имели существенных изменений; после вскрытия животных наблюдалось, что все органы находились в пределах нормального диапазона, а масса органов, висцеральный коэффициент и отношение висцеральной области мозга к головному мозгу также находились в пределах нормального диапазона.

В D2 после введения количество лимфоцитов и доля лимфоцитов в получавших низкую и высокую дозу группах демонстрировали значительное снижение и возвращались к нормальному уровню после D7. Это изменение может быть связано с действием лекарственного средства.

Рекомбинантные белки Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2 и антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 имели результат, сходный с упомянутыми выше результатами для Ofa-Fc1-D1-Fc2 при той же дозе.

Таблица 10. Эффект рекомбинантного белка в отношении количества RBC (10¹² клеток/л) у яванских макаков

Как показано на фиг. 18A и в таблице 10, Ofa-Fc1-D1-Fc2 не влияет на количество RBC у яванских макаков как при дозе 0,5 мг/кг, так и 5 мг/кг; как показано на фиг. 18B и в таблице 10, Ofa-Fc1-D1-Fc2 не влияет на уровень гемоглобина у яванских макаков как при дозе 0,5 мг/кг, так и 5 мг/кг.

Таблица 11. Эффект рекомбинантного белка в отношении уровня гемоглобина (г/л) у яванских макаков

Рекомбинантные белки Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело к PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2 и антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 характеризовались сходным эффектом в отношении количества RBC и уровня гемоглобина у яванских макаков по сравнению с упомянутыми выше результатами для Ofa-Fc1-D1-Fc2 при той же дозе.

Как показано на фиг. 19, на основании результатов исследования типирования T/B-клеток Ofa-Fc1-D1-Fc2 может в значительной степени устранять B-клетки (клетка-мишень с антигеном CD20) у животных как при дозе 0,5 мг/кг, так и 5 мг/кг.

Как известно специалистам в данной области, упомянутые выше результаты исследования указывают на то, что после однократного введения рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением, которые способны одновременно связываться с антигеном-мишенью и антигеном CD47, существенных патологий, связанных с лекарственным средством, у животных не наблюдали, потребление пищи и масса тела колебались в пределах нормального диапазона; по сравнению с данными перед введением параметры коагуляции крови, мочи и данные электрокардиограммы животных после введения не имели существенных изменений; после вскрытия животных наблюдалось, что все органы находились в пределах нормального диапазона, а масса органов, висцеральный коэффициент и отношение висцеральной области мозга к головному мозгу также находились в пределах нормального диапазона.

Как известно специалистам в данной области, упомянутые выше результаты исследования, указывают на то, что однократное введение рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением, которые способны одновременно связываться с антигеном-мишенью и антигеном CD47, не влияло на количество RBC и уровень гемоглобина у животного.

Как известно специалистам в данной области, упомянутые выше результаты исследования, указывают на то, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением, которые способны одновременно связываться с антигеном-мишенью и антигеном CD47, обеспечивают преимущественный клиренс клеток и/или опухолевых клеток с нацеливающим на опухоль антигеном при условии одной и той же дозы.

Пример 9. Подавление роста опухоли с помощью рекомбинантных белков in vivo

Эксперименты с рекомбинантными белками Ofa-Fc1-D1-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антителом к PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 по подавлению роста опухоли проводили, соответственно, in vivo. Ofa-Fc1-D1-Fc2 использовали в качестве примера, и следующий способ применим для рекомбинантных белков, содержащих внеклеточный усеченный вариант SIRPα в правом плече.

Ofa-Fc1-D1-Fc2: бесцветную прозрачную жидкость с концентрацией 1,14-4,02 мг/мл аликвотировали и хранили при -80°C; Rituxan® (ритуксимаб для инъекции): бесцветную прозрачную жидкость, 100 мг/10 мл, № по каталогу H0205, хранили при 2-8°C и защищали от света. Буфер для получения (Tris-цитрат, pH 6,5): бесцветную прозрачную жидкость хранили при 2-8°C. Составление: Ofa-Fc1-D1-Fc2 и Rituxan® разбавляли буфером для получения; буфер для получения непосредственно вводили в качестве растворителя.

Клетка: CD20-положительные клетки Daudi человеческой B-клеточной лимфомы приобретали в Клеточном банке Китайской Академии наук и культивировали со средой RPMI 1640, дополненной 10% эмбриональной бычьей сыворотки, пенициллином и стрептомицином, в инкубаторе, содержащем 5% CO₂, при 37°C. Клетки пересевали дважды в неделю и клетки в экспоненциальной фазе роста собирали, подсчитывали и инокулировали.

Экспериментальные животные: самок мышей NOD-SCID, 6-7 недель, приобретали у Shanghai Lingchang Biotech Co., Ltd.; лицензионный номер: SCXK (Hu) 2013-0018. Номер сертификата животных: 2013001829463, 2013001827545. Кормовая среда: уровень SPF. Использование и благополучие экспериментальных животных должны соответствовать положениям Ассоциации по оценке и аккредитации по уходу за лабораторными животными (AAALAC). Состояние здоровья и смертность животных контролировали ежедневно. Обычный мониторинг включал в себя наблюдение влияния исследуемых веществ и лекарственных средств на ежедневное поведение животных, такое как поведенческая активность, на изменения массы и внешний вид.

Каждой мыши подкожно инокулировали 1,5×10⁷ клеток Daudi, и когда на 18-й день после инокуляции средний объем опухоли достигал 100-150 мм³, животных делили на разные группы и осуществляли введение (D0). Мышам внутривенно (IV) инъецировали лекарственные средства; мышам в контрольной группе инъецировали такой же объем растворителя; объем инъекции составлял 0,1 мл на 10 г массы тела. Доза и схема введения дозы представлены в таблице 12.

Диаметр опухоли измеряли два раза в неделю с помощью штангенциркуля с нониусом. Объем опухоли (V) рассчитывали по следующей формуле:

Объем опухоли (V) рассчитывали по следующей формуле:

V = 1/2×a×b²;

где a и b представляют собой длину и ширину соответственно.

T/C(%) = (T-T0)/(C-C0) × 100;

где T и C представляют собой опухоли в конце эксперимента; T0 и C0 представляют собой объем опухоли в начале эксперимента; T представляет собой группу обработки, а C представляет собой контрольную группу.

Степень подавления опухоли: (TGI) (%) = 100-T/C(%).

При регрессии опухоли степень подавления опухоли (TGI) (%) = 100-(T-T0)/T0×100.

Если объем опухоли меньше первоначального объема, т.e. T<T0 или C<C0, это определяют как частичную регрессию опухоли (PR); если опухоль полностью исчезает, это определяют как полную регрессию опухоли (CR).

Когда эксперимент завершен, или когда объем опухоли животного достигал конечной точки для эвтаназии, составляющей 1500 мм³, животных подвергали эвтаназии с помощью анестезии углекислым газом, а затем опухоль отбирали путем вскрытия и фотографировали.

Сравнение объема опухоли и массы между двумя группами проводили с помощью двустороннего критерия Стьюдента и P<0,05 определяли как статистически значимое различие.

Ofa-Fc1-D1-Fc2 (5 мг/кг, IV, дважды в неделю 5 раз) обеспечивал значительное подавление роста подкожно трансплантированной опухоли из Daudi со степенью подавления 80,8% и частичной регрессией опухоли у 1/6 мышей. Rituxan® (7 мг/кг, IV, дважды в неделю 5 раз) характеризовался степенью подавления опухоли 24,5% в отношении подкожно трансплантированной опухоли из Daudi. Несущие опухоль мыши обычно хорошо переносили упомянутые выше лекарственные средства (таблица 12, фиг. 20, 21, 22).

Таблица 12. Эффективность Ofa-Fc1-D1-Fc2 и Rituxan® в отношении подкожно трансплантированной опухоли человеческой B-клеточной лимфомы из Daudi

Примечание: случайное деление на группы, момент времени первого введения - D0; IV: внутривенная инъекция.

Можно видеть, что и Ofa-Fc1-D1-Fc2, и Rituxan® подавляли рост подкожного ксенотрансплантата опухоли CD20-положительной человеческой B-клеточной лимфомы из Daudi при различных степенях, при этом Ofa-Fc1-D1-Fc2 существенно превосходил Rituxan®; мыши обычно хорошо переносили упомянутые выше лекарственные средства.

Противоопухолевый эффект рекомбинантных белков Ofa-Fc1-D1-D2-Fc2, Ofa-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, Obi-Fc1-D1-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-Fc2, Obi-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(P)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-Her2(T)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-EGFR-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-Fc2, антитело-к-PD-L1(13G4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-Fc2, антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-Fc2 и антитело-к-PD-L1(12A4)-Fc1-D1-D2-D3-Fc2 в отношении трансплантированной опухоли у мышей NOD-SCID при той же дозе и переносимость мышами рекомбинантных белков были сходными с упомянутыми выше результатами для Ofa-Fc1-D1-Fc2.

Как известно специалистам в данной области, упомянутые выше результаты исследования указывают на то, что рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением, которые способны одновременно связываться с нацеливающим на опухоль антигеном и антигеном CD47, обладают неожиданно значительным противоопухолевым эффектом по сравнению с нацеливающимся на опухоль антителом при условии одной и той же дозы.

Использование и благополучие экспериментальных животных должны соответствовать положениям Ассоциации по оценке и аккредитации по уходу за лабораторными животными (AAALAC). Состояние здоровья и смертность животных контролировали ежедневно. Обычный мониторинг включал в себя наблюдение влияния исследуемых веществ и лекарственных средств на ежедневное поведение животных, такое как поведенческая активность, на изменения массы и внешний вид.

Применение любого и всех примеров или иллюстративной фразы (например, «такой как»), представленных в настоящем документе, предназначено исключительно для лучшего объяснения настоящего изобретения и не предполагает ограничения объема настоящего изобретения, если не заявлено иное. Ни одна фраза в настоящем описании не должна быть истолкована как указывающая на какой-либо не заявленный элемент как существенный для осуществления настоящего изобретения.

Все публикации и заявки на выдачу патентов, упомянутые в настоящем описании, включены в настоящий документ посредством ссылки во всей их полноте в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или заявка на выдачу патента конкретно и индивидуально указывалась включенной в качестве ссылки. Кроме того, любые теория, механизм, доказательство или результат, изложенные в настоящем документе, предназначены для дальнейшего улучшения понимания настоящего изобретения и не предназначены для ограничения изобретений каким-либо образом такими теорией, механизмом, доказательством или результатом. Хотя настоящее изобретение было проиллюстрировано и подробно описано в графических материалах и в приведенном выше описании, такие иллюстрация и описание следует рассматривать как иллюстративные, а не ограничивающие.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ШАНХАЙ ДжиЭмТИ-БИО ТЕКНОЛОДЖИ КО., ЛТД.

<120> БИСПЕЦИФИЧЕСКИЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ БЕЛОК И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

<130> P19413573RU

<150> CN201710317926.7

<151> 08-05-2017

<150> CN201711269620.5

<151> 05-12-2017

<160> 44

<170> PatentIn, версия 3.5

<210> 1

<211> 471

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи Ofa

<400> 1

Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Asn Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys

85 90 95

Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met

115 120 125

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

130 135 140

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

145 150 155 160

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

165 170 175

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

180 185 190

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

195 200 205

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

210 215 220

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu

225 230 235 240

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

245 250 255

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

260 265 270

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

275 280 285

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

290 295 300

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

305 310 315 320

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

325 330 335

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

340 345 350

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

355 360 365

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

370 375 380

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

385 390 395 400

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

405 410 415

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

420 425 430

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

435 440 445

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

450 455 460

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 2

<211> 234

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность легкой цепи Ofa

<400> 2

Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr

1 5 10 15

Asp Ala Arg Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

50 55 60

Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser

100 105 110

Asn Trp Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 3

<211> 468

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи Obi

<400> 3

Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe

35 40 45

Ser Tyr Ser Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn

65 70 75 80

Gly Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

130 135 140

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

145 150 155 160

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

165 170 175

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

180 185 190

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

195 200 205

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

210 215 220

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

225 230 235 240

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

245 250 255

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

260 265 270

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

275 280 285

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

290 295 300

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

305 310 315 320

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

325 330 335

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

340 345 350

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

355 360 365

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

370 375 380

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

385 390 395 400

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

405 410 415

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

420 425 430

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

435 440 445

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

450 455 460

Ser Pro Gly Lys

465

<210> 4

<211> 239

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность легкой цепи Obi/Obi-Fc1

<400> 4

Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr

1 5 10 15

Asp Ala Arg Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro

20 25 30

Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser

35 40 45

Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys

50 55 60

Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val

65 70 75 80

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

85 90 95

Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr

100 105 110

Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

115 120 125

Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

130 135 140

Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu

145 150 155 160

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp

165 170 175

Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp

180 185 190

Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys

195 200 205

Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln

210 215 220

Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 5

<211> 461

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи Hu5F9-G4

<400> 5

Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu

1 5 10 15

Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly

20 25 30

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn

35 40 45

Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp

50 55 60

Met Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys

65 70 75 80

Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala

85 90 95

Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

100 105 110

Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

115 120 125

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

130 135 140

Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly

145 150 155 160

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

165 170 175

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

180 185 190

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

195 200 205

Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser

210 215 220

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

225 230 235 240

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

245 250 255

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

260 265 270

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln

275 280 285

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

290 295 300

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

305 310 315 320

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

325 330 335

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

340 345 350

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

355 360 365

Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

370 375 380

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

385 390 395 400

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

405 410 415

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

420 425 430

Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

435 440 445

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

450 455 460

<210> 6

<211> 236

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность легкой цепи Hu5F9-G4

<400> 6

Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro

20 25 30

Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr

35 40 45

Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gly Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

85 90 95

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln

100 105 110

Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

115 120 125

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

130 135 140

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

145 150 155 160

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

165 170 175

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

180 185 190

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

195 200 205

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

210 215 220

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 7

<211> 466

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи JMT101

<400> 7

Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu

1 5 10 15

Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser

20 25 30

Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn

35 40 45

Tyr Asp Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

50 55 60

Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe

65 70 75 80

Thr Ser Arg Leu Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

85 90 95

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

100 105 110

Ala Arg Ala Leu Asp Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

130 135 140

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

145 150 155 160

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

165 170 175

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

180 185 190

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

195 200 205

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

210 215 220

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

225 230 235 240

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

275 280 285

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

355 360 365

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

370 375 380

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

385 390 395 400

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

405 410 415

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

Gly Lys

465

<210> 8

<211> 231

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность легкой цепи JMT101/Anti-EGFR-Fc1

<400> 8

Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu

1 5 10 15

Ala Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro

20 25 30

Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr

35 40 45

Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu

50 55 60

Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser

65 70 75 80

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu

85 90 95

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Glu Trp Pro

100 105 110

Thr Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

115 120 125

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

130 135 140

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

145 150 155 160

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

165 170 175

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

180 185 190

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

195 200 205

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

210 215 220

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 9

<211> 468

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи трастузумаба

<400> 9

Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu

1 5 10 15

Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

20 25 30

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp

35 40 45

Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

50 55 60

Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser

65 70 75 80

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala

85 90 95

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

100 105 110

Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

130 135 140

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

145 150 155 160

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

165 170 175

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

180 185 190

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

195 200 205

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

210 215 220

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Pro Lys Ser

225 230 235 240

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

245 250 255

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

260 265 270

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

275 280 285

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

290 295 300

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

305 310 315 320

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

325 330 335

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

340 345 350

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

355 360 365

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

370 375 380

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

385 390 395 400

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

405 410 415

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

420 425 430

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

435 440 445

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

450 455 460

Ser Pro Gly Lys

465

<210> 10

<211> 231

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность легкой цепи трастузумаба

<400> 10

Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

20 25 30

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr

35 40 45

Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu

50 55 60

Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

65 70 75 80

Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

85 90 95

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro

100 105 110

Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

115 120 125

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

130 135 140

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

145 150 155 160

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

165 170 175

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

180 185 190

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

195 200 205

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

210 215 220

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 11

<211> 359

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность SIRP D1-Fc

<400> 11

Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val

20 25 30

Ser Val Ala Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser

35 40 45

Leu Ile Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala

50 55 60

Arg Glu Leu Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr

65 70 75 80

Thr Val Ser Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser

85 90 95

Ile Ser Ala Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys

100 105 110

Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr

115 120 125

Glu Leu Ser Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

130 135 140

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

145 150 155 160

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

165 170 175

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

180 185 190

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

195 200 205

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

210 215 220

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

225 230 235 240

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

245 250 255

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

260 265 270

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

275 280 285

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

290 295 300

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

305 310 315 320

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

325 330 335

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

340 345 350

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

355

<210> 12

<211> 467

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи атезолизумаба

<400> 12

Met Glu Phe Trp Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Asp Ser Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn

85 90 95

Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

130 135 140

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

145 150 155 160

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

165 170 175

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

180 185 190

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

195 200 205

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

210 215 220

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

225 230 235 240

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

245 250 255

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

260 265 270

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

275 280 285

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

290 295 300

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr

305 310 315 320

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

325 330 335

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

340 345 350

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

355 360 365

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

370 375 380

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

385 390 395 400

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

405 410 415

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

420 425 430

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

435 440 445

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

450 455 460

Pro Gly Lys

465

<210> 13

<211> 233

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность легкой цепи атезолизумаба/антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1

<400> 13

Met Glu Phe Trp Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala

20 25 30

Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val

35 40 45

Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

50 55 60

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

85 90 95

Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr

100 105 110

His Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

115 120 125

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

130 135 140

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

145 150 155 160

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

165 170 175

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

180 185 190

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

195 200 205

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

210 215 220

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 14

<211> 1092

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность ДНК D1-Fc2

<400> 14

atggaatgga gctgggtgtt cctgttcttt ctgtccgtga ccacaggcgt gcattctgaa 60

gaggagctgc aggtcatcca gcccgataag agcgtgtccg tggccgcagg agaatctgcc 120

atcctgcatt gcaccgtgac ctctctgatc cccgtgggcc caatccagtg gttcagagga 180

gccggaccag ctagagagct gatctacaac cagaaggagg gccacttccc cagagtgaca 240

accgtgtccg agtctaccaa gcgggagaac atggacttct ccatctccat ctccgccatc 300

acaccagccg acgccggcac ctactattgc gtgaagttcc ggaagggctc cccagatacc 360

gagtttaaga gcggcgccgg aacagagctg agcgtgcggg ctaagcctga caagacccac 420

acctgtcccc cttgtcctgc ccctgaactg ctgggcggac cttccgtgtt cctgttcccc 480

ccaaagccca aggacaccct gatgatctcc cggacccccg aagtgacctg cgtggtggtg 540

gatgtgtccc acgaggaccc tgaagtgaag ttcaattggt acgtggacgg cgtggaagtg 600

cacaacgcca agaccaagcc tagagaggaa cagtacaact ccacctaccg ggtggtgtcc 660

gtgctgaccg tgctgcacca ggattggctg aacggcaaag agtacaagtg caaggtgtcc 720

aacaaggccc tgcctgcccc catcgaaaag accatctcca aggccaaggg ccagccccgg 780

gaaccccagg tgtacacact gccccctagc agggacgagc tgaccaagaa ccaggtgtcc 840

ctgtggtgtc tcgtgaaagg cttctacccc tccgacattg ccgtggaatg ggagtccaac 900

ggccagcctg agaacaacta caagaccacc ccccctgtgc tggactccga cggctcattc 960

ttcctgtaca gcaagctgac agtggacaag tcccggtggc agcagggcaa cgtgttctcc 1020

tgctccgtga tgcacgaggc cctgcacaac cactacaccc agaagtccct gtccctgagc 1080

cccggcaaat ga 1092

<210> 15

<211> 1389

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность ДНК D1-D2-Fc2

<400> 15

atggaatgga gctgggtgtt cctgttcttt ctgtccgtga ccacaggcgt gcattctgaa 60

gaggagctgc aggtcatcca gcccgataag agcgtgtccg tggccgcagg agaatctgcc 120

atcctgcatt gcaccgtgac ctctctgatc cccgtgggcc caatccagtg gttcagagga 180

gccggaccag ctagagagct gatctacaac cagaaggagg gccacttccc cagagtgaca 240

accgtgtccg agtctaccaa gcgggagaac atggacttct ccatctccat ctccgccatc 300

acaccagccg acgccggcac ctactattgc gtgaagttcc ggaagggctc cccagatacc 360

gagtttaaga gcggcgccgg aacagagctg agcgtgcggg ctaagccttc tgctccagtg 420

gtgtcaggac cagcagctag agctacccct cagcacaccg tgtccttcac ctgcgagtct 480

cacggcttct cccctagaga catcaccctc aagtggttca agaacggcaa cgagctgtcc 540

gacttccaga ccaacgtgga tccagtgggc gagagcgtgt cttactccat ccactccacc 600

gccaaggtgg tgctgacaag ggaggacgtg cactcccagg tcatttgcga ggtggcacac 660

gtgacattgc agggcgaccc cctgagggga accgccaact tgagtgacaa gacccacacc 720

tgtccccctt gtcctgcccc tgaactgctg ggcggacctt ccgtgttcct gttcccccca 780

aagcccaagg acaccctgat gatctcccgg acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat 840

gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac 900

aacgccaaga ccaagcctag agaggaacag tacaactcca cctaccgggt ggtgtccgtg 960

ctgaccgtgc tgcaccagga ttggctgaac ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac 1020

aaggccctgc ctgcccccat cgaaaagacc atctccaagg ccaagggcca gccccgggaa 1080

ccccaggtgt acacactgcc ccctagcagg gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg 1140

tggtgtctcg tgaaaggctt ctacccctcc gacattgccg tggaatggga gtccaacggc 1200

cagcctgaga acaactacaa gaccaccccc cctgtgctgg actccgacgg ctcattcttc 1260

ctgtacagca agctgacagt ggacaagtcc cggtggcagc agggcaacgt gttctcctgc 1320

tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac tacacccaga agtccctgtc cctgagcccc 1380

ggcaaatga 1389

<210> 16

<211> 471

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи Ofa-Fc1

<400> 16

Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Asn Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys

85 90 95

Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met

115 120 125

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

130 135 140

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

145 150 155 160

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

165 170 175

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

180 185 190

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

195 200 205

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

210 215 220

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu

225 230 235 240

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

245 250 255

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

260 265 270

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

275 280 285

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

290 295 300

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

305 310 315 320

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

325 330 335

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

340 345 350

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

355 360 365

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

370 375 380

Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

385 390 395 400

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

405 410 415

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser

420 425 430

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

435 440 445

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

450 455 460

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 17

<211> 234

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность легкой цепи Ofa-Fc1

<400> 17

Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr

1 5 10 15

Asp Ala Arg Cys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

50 55 60

Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser

100 105 110

Asn Trp Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 18

<211> 468

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи Obi-Fc1

<400> 18

Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys

20 25 30

Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu

35 40 45

Ser Asn Tyr Asp Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr

65 70 75 80

Pro Phe Thr Ser Arg Leu Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln

85 90 95

Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Asp Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

130 135 140

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

145 150 155 160

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

165 170 175

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

180 185 190

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

195 200 205

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

210 215 220

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

225 230 235 240

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

245 250 255

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

260 265 270

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

275 280 285

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

290 295 300

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

305 310 315 320

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

325 330 335

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

340 345 350

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

355 360 365

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

370 375 380

Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

385 390 395 400

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

405 410 415

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr

420 425 430

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

435 440 445

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

450 455 460

Ser Pro Gly Lys

465

<210> 19

<211> 468

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитело-к-EGFR-Fc1

<400> 19

Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys

20 25 30

Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu

35 40 45

Ser Asn Tyr Asp Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr

65 70 75 80

Pro Phe Thr Ser Arg Leu Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln

85 90 95

Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Asp Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

130 135 140

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

145 150 155 160

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

165 170 175

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

180 185 190

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

195 200 205

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

210 215 220

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

225 230 235 240

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

245 250 255

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

260 265 270

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

275 280 285

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

290 295 300

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

305 310 315 320

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

325 330 335

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

340 345 350

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

355 360 365

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

370 375 380

Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

385 390 395 400

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

405 410 415

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr

420 425 430

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

435 440 445

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

450 455 460

Ser Pro Gly Lys

465

<210> 20

<211> 469

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитело-к-Her2(T)-Fc1

<400> 20

Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile

35 40 45

Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn

85 90 95

Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

130 135 140

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

145 150 155 160

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

165 170 175

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

180 185 190

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

195 200 205

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

210 215 220

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

225 230 235 240

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

245 250 255

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

260 265 270

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

275 280 285

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

290 295 300

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

305 310 315 320

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

325 330 335

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

340 345 350

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

355 360 365

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

370 375 380

Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

385 390 395 400

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

405 410 415

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu

420 425 430

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

435 440 445

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

450 455 460

Leu Ser Pro Gly Lys

465

<210> 21

<211> 234

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность легкой цепи антитело-к-Her2(T)-Fc1

<400> 21

Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr

1 5 10 15

Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp

35 40 45

Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr

100 105 110

Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 22

<211> 468

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитело-к-Her2(P)-Fc1

<400> 22

Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Thr Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

130 135 140

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

145 150 155 160

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

165 170 175

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

180 185 190

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

195 200 205

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

210 215 220

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

225 230 235 240

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

245 250 255

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

260 265 270

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

275 280 285

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

290 295 300

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

305 310 315 320

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

325 330 335

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

340 345 350

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

355 360 365

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

370 375 380

Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

385 390 395 400

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

405 410 415

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr

420 425 430

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

435 440 445

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

450 455 460

Ser Pro Gly Lys

465

<210> 23

<211> 234

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность легкой цепи антитело-к-Her2(P)-Fc1

<400> 23

Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr

1 5 10 15

Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp

35 40 45

Val Ser Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr

100 105 110

Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 24

<211> 467

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1

<400> 24

Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Asp Ser Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn

85 90 95

Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

130 135 140

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

145 150 155 160

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

165 170 175

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

180 185 190

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

195 200 205

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

210 215 220

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

225 230 235 240

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

245 250 255

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

260 265 270

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

275 280 285

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

290 295 300

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

305 310 315 320

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

325 330 335

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

340 345 350

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

355 360 365

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

370 375 380

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

385 390 395 400

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

405 410 415

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

420 425 430

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

435 440 445

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

450 455 460

Pro Gly Lys

465

<210> 25

<211> 1641

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность ДНК D1-D2-D3-Fc2

<400> 25

atggaatgga gctgggtgtt cctgttcttt ctgtccgtga ccacaggcgt gcattctgaa 60

gaggagctgc aggtcatcca gcccgataag agcgtgtccg tggccgcagg agaatctgcc 120

atcctgcatt gcaccgtgac ctctctgatc cccgtgggcc caatccagtg gttcagagga 180

gccggaccag ctagagagct gatctacaac cagaaggagg gccacttccc cagagtgaca 240

accgtgtccg agtctaccaa gcgggagaac atggacttct ccatctccat ctccgccatc 300

acaccagccg acgccggcac ctactattgc gtgaagttcc ggaagggctc cccagatacc 360

gagtttaaga gcggcgccgg aacagagctg agcgtgcggg ctaagccttc tgctccagtg 420

gtgtcaggac cagcagctag agctacccct cagcacaccg tgtccttcac ctgcgagtct 480

cacggcttct cccctagaga catcaccctc aagtggttca agaacggcaa cgagctgtcc 540

gacttccaga ccaacgtgga tccagtgggc gagagcgtgt cttactccat ccactccacc 600

gccaaggtgg tgctgacaag ggaggacgtg cactcccagg tcatttgcga ggtggcacac 660

gtgacattgc agggcgaccc cctgagaggc acagcaaact tgagcgagac aattagagtg 720

ccccccaccc tggaagttac acagcagccc gttagagccg agaaccaggt caacgtcacc 780

tgccaggtca gaaagtttta tccacagaga ctgcagctga cctggctcga gaacggaaac 840

gtgagcagaa cagagaccgc cagcaccgtg acagagaaca aggacgggac ctacaactgg 900

atgagttggc tgctggtgaa cgtcagcgcc cacagagacg acgtcaagct gacctgcgac 960

aagacccaca cctgtccccc ttgtcctgcc cctgaactgc tgggcggacc ttccgtgttc 1020

ctgttccccc caaagcccaa ggacaccctg atgatctccc ggacccccga agtgacctgc 1080

gtggtggtgg atgtgtccca cgaggaccct gaagtgaagt tcaattggta cgtggacggc 1140

gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagcct agagaggaac agtacaactc cacctaccgg 1200

gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gattggctga acggcaaaga gtacaagtgc 1260

aaggtgtcca acaaggccct gcctgccccc atcgaaaaga ccatctccaa ggccaagggc 1320

cagccccggg aaccccaggt gtacacactg ccccctagca gggacgagct gaccaagaac 1380

caggtgtccc tgtggtgtct cgtgaaaggc ttctacccct ccgacattgc cgtggaatgg 1440

gagtccaacg gccagcctga gaacaactac aagaccaccc cccctgtgct ggactccgac 1500

ggctcattct tcctgtacag caagctgaca gtggacaagt cccggtggca gcagggcaac 1560

gtgttctcct gctccgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg 1620

tccctgagcc ccggcaaatg a 1641

<210> 26

<211> 363

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность D1-Fc2

<400> 26

Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val

20 25 30

Ser Val Ala Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser

35 40 45

Leu Ile Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala

50 55 60

Arg Glu Leu Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr

65 70 75 80

Thr Val Ser Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser

85 90 95

Ile Ser Ala Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys

100 105 110

Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr

115 120 125

Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

130 135 140

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

145 150 155 160

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

165 170 175

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

180 185 190

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

195 200 205

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

210 215 220

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

225 230 235 240

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

245 250 255

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

260 265 270

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe

275 280 285

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

290 295 300

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

305 310 315 320

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

325 330 335

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

340 345 350

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

355 360

<210> 27

<211> 462

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность D1-D2-Fc2

<400> 27

Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val

20 25 30

Ser Val Ala Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser

35 40 45

Leu Ile Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala

50 55 60

Arg Glu Leu Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr

65 70 75 80

Thr Val Ser Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser

85 90 95

Ile Ser Ala Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys

100 105 110

Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr

115 120 125

Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro

130 135 140

Ala Ala Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser

145 150 155 160

His Gly Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly

165 170 175

Asn Glu Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser

180 185 190

Val Ser Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu

195 200 205

Asp Val His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln

210 215 220

Gly Asp Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Asp Lys Thr His Thr

225 230 235 240

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

245 250 255

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

260 265 270

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

275 280 285

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

290 295 300

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

305 310 315 320

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

325 330 335

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

355 360 365

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val

370 375 380

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

385 390 395 400

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

405 410 415

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

420 425 430

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

435 440 445

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<210> 28

<211> 546

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность D1-D2-D3-Fc2

<400> 28

Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val

20 25 30

Ser Val Ala Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser

35 40 45

Leu Ile Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala

50 55 60

Arg Glu Leu Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr

65 70 75 80

Thr Val Ser Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser

85 90 95

Ile Ser Ala Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys

100 105 110

Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr

115 120 125

Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro

130 135 140

Ala Ala Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser

145 150 155 160

His Gly Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly

165 170 175

Asn Glu Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser

180 185 190

Val Ser Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu

195 200 205

Asp Val His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln

210 215 220

Gly Asp Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val

225 230 235 240

Pro Pro Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln

245 250 255

Val Asn Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln

260 265 270

Leu Thr Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser

275 280 285

Thr Val Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu

290 295 300

Leu Val Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Asp

305 310 315 320

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

325 330 335

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

340 345 350

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

355 360 365

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

370 375 380

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

385 390 395 400

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

405 410 415

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

420 425 430

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

435 440 445

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

450 455 460

Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

465 470 475 480

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

485 490 495

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

500 505 510

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

515 520 525

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

530 535 540

Gly Lys

545

<210> 29

<211> 369

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность D1m-Fc2

<400> 29

Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val

20 25 30

Ser Val Ala Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser

35 40 45

Leu Phe Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala

50 55 60

Arg Val Leu Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr

65 70 75 80

Thr Val Ser Glu Thr Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser

85 90 95

Ile Ser Asn Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys

100 105 110

Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr

115 120 125

Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys

130 135 140

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

145 150 155 160

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

165 170 175

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

180 185 190

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

195 200 205

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

210 215 220

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

225 230 235 240

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

245 250 255

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

260 265 270

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp

275 280 285

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

290 295 300

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

305 310 315 320

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

325 330 335

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

340 345 350

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

355 360 365

Lys

<210> 30

<211> 117

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность D1

<400> 30

Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Ala

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser

100 105 110

Val Arg Ala Lys Pro

115

<210> 31

<211> 216

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность D1-D2

<400> 31

Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Ala

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser

100 105 110

Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg

115 120 125

Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe

130 135 140

Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu

145 150 155 160

Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr

165 170 175

Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His

180 185 190

Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro

195 200 205

Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser

210 215

<210> 32

<211> 300

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность D1-D2-D3

<400> 32

Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Glu Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Ala

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser

100 105 110

Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg

115 120 125

Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe

130 135 140

Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu

145 150 155 160

Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr

165 170 175

Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His

180 185 190

Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro

195 200 205

Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr

210 215 220

Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val

225 230 235 240

Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp

245 250 255

Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr

260 265 270

Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn

275 280 285

Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys

290 295 300

<210> 33

<211> 123

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность D1m

<400> 33

Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Glu Thr Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser

100 105 110

Val Arg Ala Lys Pro Ser Glu Pro Lys Ser Ser

115 120

<210> 34

<211> 1416

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность ДНК тяжелой цепи Ofa-Fc1

<400> 34

atggaatgga gctgggtgtt cctgttcttt ctgtccgtga ccacaggcgt gcattctgaa 60

gtgcagctgg tggaatctgg cggcggactg gtgcagcctg gcagatccct gagactgtct 120

tgtgccgcct ccggcttcac cttcaacgac tacgccatgc actgggtgcg acaggcccct 180

ggcaaaggcc tggaatgggt gtccaccatc agctggaact ccggctccat cggctacgcc 240

gactccgtga agggccggtt caccatctcc cgggacaacg ccaagaagtc cctgtacctg 300

cagatgaact ccctgcgggc cgaggacacc gccctgtact actgtgccaa ggacatccag 360

tacggcaact actactacgg catggacgtg tggggccagg gcaccacagt gaccgtgtca 420

tctgcttcta ccaagggccc ctccgtgttt cctctggccc cttccagcaa gtccacctct 480

ggcggaacag ccgctctggg ctgcctcgtg aaggactact tccccgagcc tgtgaccgtg 540

tcctggaact ctggcgctct gacatccggc gtgcacacct tccctgctgt gctgcagtct 600

agcggcctgt actccctgtc ctccgtcgtg accgtgcctt ccagctctct gggcacccag 660

acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc tccaacacca aggtggacaa gaaggtggaa 720

cccaagtcct gcgacaagac ccacacctgt cccccttgtc ctgcccctga actgctgggc 780

ggaccttccg tgttcctgtt ccccccaaag cccaaggaca ccctgatgat ctcccggacc 840

cccgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg tcccacgagg accctgaagt gaagttcaat 900

tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacca agcctagaga ggaacagtac 960

aactccacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggattg gctgaacggc 1020

aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag gccctgcctg cccccatcga aaagaccatc 1080

tccaaggcca agggccagcc ccgggaaccc caggtgtaca cactgccccc tagcagggac 1140

gagctgacca agaaccaggt gtccctgagc tgtgcagtga aaggcttcta cccctccgac 1200

attgccgtgg aatgggagtc caacggccag cctgagaaca actacaagac caccccccct 1260

gtgctggact ccgacggctc attcttcctg gtgagcaagc tgacagtgga caagtcccgg 1320

tggcagcagg gcaacgtgtt ctcctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1380

acccagaagt ccctgtccct gagccccggc aaatga 1416

<210> 35

<211> 705

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность ДНК легкой цепи Ofa-Fc1

<400> 35

atgtctgtgc ctacccaggt gctgggactg ctgctgctgt ggctgacaga cgcccgctgt 60

gagatcgtgc tgacccagtc tcctgccacc ctgtctctga gccctggcga gagagctacc 120

ctgtcctgca gagcctccca gtccgtgtcc tcttacctgg cctggtatca gcagaagccc 180

ggccaggctc cccggctgct gatctacgat gcctccaata gagccaccgg catccctgcc 240

agattctccg gctctggctc tggcaccgac tttaccctga ccatctccag cctggaaccc 300

gaggacttcg ccgtgtacta ctgccagcag cggtccaact ggcccatcac ctttggccag 360

ggcacccggc tggaaatcaa gagaaccgtg gccgctccct ccgtgttcat cttcccacct 420

tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgct tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 480

ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag 540

gaatccgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc 600

ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 660

ctgtctagcc ccgtgaccaa gtctttcaac cggggcgagt gctga 705

<210> 36

<211> 1407

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность ДНК тяжелой цепи Obi-Fc1

<400> 36

atggaatgga gctgggtgtt cctgttcttt ctgtccgtga ccacaggcgt gcattctcag 60

gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaacccg gctcctccgt gaaggtgtcc 120

tgcaaggctt ccggctacgc cttctcctac tcctggatca actgggtgcg acaggcccct 180

ggacagggcc tggaatggat gggcagaatc ttccctggcg acggcgacac cgactacaac 240

ggcaagttca agggcagagt gaccatcacc gccgacaagt ccacctccac cgcctacatg 300

gaactgtcct ccctgcggag cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gaacgtgttc 360

gacggctact ggctggtgta ttggggccag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctctgcttct 420

accaagggcc cctccgtgtt tcctctggcc ccttccagca agtccacctc tggcggaaca 480

gccgctctgg gctgcctcgt gaaggactac ttccccgagc ctgtgaccgt gtcctggaac 540

tctggcgctc tgacatccgg cgtgcacacc ttccctgctg tgctgcagtc tagcggcctg 600

tactccctgt cctccgtcgt gaccgtgcct tccagctctc tgggcaccca gacctacatc 660

tgcaacgtga accacaagcc ctccaacacc aaggtggaca agaaggtgga acccaagtcc 720

tgcgacaaga cccacacctg tcccccttgt cctgcccctg aactgctggg cggaccttcc 780

gtgttcctgt tccccccaaa gcccaaggac accctgatga tctcccggac ccccgaagtg 840

acctgcgtgg tggtggatgt gtcccacgag gaccctgaag tgaagttcaa ttggtacgtg 900

gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcctagag aggaacagta caactccacc 960

taccgggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac 1020

aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgcct gcccccatcg aaaagaccat ctccaaggcc 1080

aagggccagc cccgggaacc ccaggtgtac acactgcccc ctagcaggga cgagctgacc 1140

aagaaccagg tgtccctgtc ctgtgctgtg aaaggcttct acccctccga cattgccgtg 1200

gaatgggagt ccaacggcca gcctgagaac aactacaaga ccaccccccc tgtgctggac 1260

tccgacggct cattcttcct ggtgagcaag ctgacagtgg acaagtcccg gtggcagcag 1320

ggcaacgtgt tctcctgctc cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 1380

tccctgtccc tgagccccgg caaatga 1407

<210> 37

<211> 1407

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность ДНК тяжелой цепи антитело-к-EGFR-Fc1

<400> 37

atggaatgga gctgggtgtt cctgttcttt ctgtccgtga ccacaggcgt gcattctcag 60

gtccagctcc aggaaagcgg ccccggcctc gtcaaaccct ccgagacact ctccctcaca 120

tgcacagtct ccggcttctc cctcagcaac tacgacgtcc actgggtcag acaggccccc 180

ggcaaaggac tggaatggct cggcgtcatc tggtccggcg gaaacaccga ctacaacacc 240

ccattcacct ccaggctcac catctccgtg gacacctcca agaaccagtt ctccctcaaa 300

ctgagctccg tgaccgccgc cgacaccgct gtctattatt gcgccagagc cctcgactac 360

tacgactacg aattcgccta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgtc atctgcttct 420

accaagggcc cctccgtgtt tcctctggcc ccttccagca agtccacctc tggcggaaca 480

gccgctctgg gctgcctcgt gaaggactac ttccccgagc ctgtgaccgt gtcctggaac 540

tctggcgctc tgacatccgg cgtgcacacc ttccctgctg tgctgcagtc tagcggcctg 600

tactccctgt cctccgtcgt gaccgtgcct tccagctctc tgggcaccca gacctacatc 660

tgcaacgtga accacaagcc ctccaacacc aaggtggaca agaaggtgga acccaagtcc 720

tgcgacaaga cccacacctg tcccccttgt cctgcccctg aactgctggg cggaccttcc 780

gtgttcctgt tccccccaaa gcccaaggac accctgatga tctcccggac ccccgaagtg 840

acctgcgtgg tggtggatgt gtcccacgag gaccctgaag tgaagttcaa ttggtacgtg 900

gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcctagag aggaacagta caactccacc 960

taccgggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac 1020

aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgcct gcccccatcg aaaagaccat ctccaaggcc 1080

aagggccagc cccgggaacc ccaggtgtac acactgcccc ctagcaggga cgagctgacc 1140

aagaaccagg tgtccctgag ctgtgcagtg aaaggcttct acccctccga cattgccgtg 1200

gaatgggagt ccaacggcca gcctgagaac aactacaaga ccaccccccc tgtgctggac 1260

tccgacggct cattcttcct ggtgagcaag ctgacagtgg acaagtcccg gtggcagcag 1320

ggcaacgtgt tctcctgctc cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 1380

tccctgtccc tgagccccgg caaatga 1407

<210> 38

<211> 1410

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность ДНК тяжелой цепи антитело-к-Her2(T)-Fc1

<400> 38

atggaatgga gctgggtgtt cctgttcttt ctgtccgtga ccacaggcgt gcattctgag 60

gtgcagttgg tggagagcgg gggggggctg gtgcagcctg gaggaagttt gaggttgagc 120

tgtgccgcaa gcgggttcaa cattaaggac acatacattc actgggtgag gcaggcaccc 180

ggaaagggac tggagtgggt ggctaggatc taccccacca acggctacac aaggtacgcc 240

gacagtgtga agggccggtt caccatttcc gccgacacct ccaagaacac cgcctacctg 300

cagatgaaca gcctgagggc cgaggacacc gccgtctact actgctccag gtggggagga 360

gacggattct atgctatgga ctactgggga cagggcaccc tggtgaccgt gtcatctgct 420

tctaccaagg gcccctccgt gtttcctctg gccccttcca gcaagtccac ctctggcgga 480

acagccgctc tgggctgcct cgtgaaggac tacttccccg agcctgtgac cgtgtcctgg 540

aactctggcg ctctgacatc cggcgtgcac accttccctg ctgtgctgca gtctagcggc 600

ctgtactccc tgtcctccgt cgtgaccgtg ccttccagct ctctgggcac ccagacctac 660

atctgcaacg tgaaccacaa gccctccaac accaaggtgg acaagaaggt ggaacccaag 720

tcctgcgaca agacccacac ctgtccccct tgtcctgccc ctgaactgct gggcggacct 780

tccgtgttcc tgttcccccc aaagcccaag gacaccctga tgatctcccg gacccccgaa 840

gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtcccac gaggaccctg aagtgaagtt caattggtac 900

gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccta gagaggaaca gtacaactcc 960

acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag 1020

tacaagtgca aggtgtccaa caaggccctg cctgccccca tcgaaaagac catctccaag 1080

gccaagggcc agccccggga accccaggtg tacacactgc cccctagcag ggacgagctg 1140

accaagaacc aggtgtccct gagctgtgca gtgaaaggct tctacccctc cgacattgcc 1200

gtggaatggg agtccaacgg ccagcctgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 1260

gactccgacg gctcattctt cctggtgagc aagctgacag tggacaagtc ccggtggcag 1320

cagggcaacg tgttctcctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1380

aagtccctgt ccctgagccc cggcaaatga 1410

<210> 39

<211> 705

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность ДНК легкой цепи антитело-к-Her2(T)-Fc1

<400> 39

atgtctgtgc ctacccaggt gctgggactg ctgctgctgt ggctgacaga cgcccgctgt 60

gacattcaga tgacccagag cccctcctcc ctctccgcct ccgtgggaga cagagttacc 120

atcacctgca gggcctccca ggacgtgaac accgccgtgg cctggtacca gcagaaaccc 180

ggcaaagccc ccaaactgct catctactcc gcctcatttc tgtacagcgg cgtgccctcc 240

cgcttctccg gttccagatc cggcaccgac ttcaccctga ctatctcctc cctccagccc 300

gaagacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccccccac cttcggccag 360

ggcacaaagg tcgaaatcaa gagaaccgtg gccgctccct ccgtgttcat cttcccacct 420

tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgct tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 480

ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag 540

gaatccgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc 600

ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 660

ctgtctagcc ccgtgaccaa gtctttcaac cggggcgagt gctga 705

<210> 40

<211> 1407

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность ДНК тяжелой цепи антитело-к-Her2(P)-Fc1

<400> 40

atggaatgga gctgggtgtt cctgttcttt ctgtccgtga ccacaggcgt gcattctgag 60

gtgcagttgg tggagagcgg gggggggctg gtgcagcctg gaggaagttt gaggttgagc 120

tgtgccgcaa gcgggttcac atttacagac tacacaatgg actgggtgag gcaggcaccc 180

ggaaagggac tggagtgggt ggctgatgtg aatcccaata gcggagggag catttacaac 240

cagagattca aggggcggtt caccttgtcc gtggacagga gcaagaacac actgtacctg 300

cagatgaaca gcctgagggc cgaggatacc gccgtctact attgcgccag gaacctcgga 360

ccctccttct attttgacta ctggggccag ggaaccctgg tgaccgtgtc atctgcttct 420

accaagggcc cctccgtgtt tcctctggcc ccttccagca agtccacctc tggcggaaca 480

gccgctctgg gctgcctcgt gaaggactac ttccccgagc ctgtgaccgt gtcctggaac 540

tctggcgctc tgacatccgg cgtgcacacc ttccctgctg tgctgcagtc tagcggcctg 600

tactccctgt cctccgtcgt gaccgtgcct tccagctctc tgggcaccca gacctacatc 660

tgcaacgtga accacaagcc ctccaacacc aaggtggaca agaaggtgga acccaagtcc 720

tgcgacaaga cccacacctg tcccccttgt cctgcccctg aactgctggg cggaccttcc 780

gtgttcctgt tccccccaaa gcccaaggac accctgatga tctcccggac ccccgaagtg 840

acctgcgtgg tggtggatgt gtcccacgag gaccctgaag tgaagttcaa ttggtacgtg 900

gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcctagag aggaacagta caactccacc 960

taccgggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac 1020

aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgcct gcccccatcg aaaagaccat ctccaaggcc 1080

aagggccagc cccgggaacc ccaggtgtac acactgcccc ctagcaggga cgagctgacc 1140

aagaaccagg tgtccctgag ctgtgcagtg aaaggcttct acccctccga cattgccgtg 1200

gaatgggagt ccaacggcca gcctgagaac aactacaaga ccaccccccc tgtgctggac 1260

tccgacggct cattcttcct ggtgagcaag ctgacagtgg acaagtcccg gtggcagcag 1320

ggcaacgtgt tctcctgctc cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 1380

tccctgtccc tgagccccgg caaatga 1407

<210> 41

<211> 705

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность ДНК легкой цепи антитело-к-Her2(P)-Fc1

<400> 41

atgtctgtgc ctacccaggt gctgggactg ctgctgctgt ggctgacaga cgcccgctgt 60

gacattcaga tgacccagag cccctcctcc ctctccgcct ccgtgggaga cagagttacc 120

atcacctgca aagccagcca ggacgtgagc atcggcgtgg cctggtacca gcagaaaccc 180

ggcaaagccc ccaaactgct catttactcc gcctcatacc gttacaccgg cgttccctcc 240

cgcttcagcg gatccggctc cggaaccgac ttcaccctga ctatctcctc cctccagccc 300

gaagacttcg ccacctacta ctgccagcag tactacattt acccctacac cttcggccag 360

ggcaccaagg tggaaatcaa gagaaccgtg gccgctccct ccgtgttcat cttcccacct 420

tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgct tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 480

ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag 540

gaatccgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc 600

ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 660

ctgtctagcc ccgtgaccaa gtctttcaac cggggcgagt gctga 705

<210> 42

<211> 1404

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность ДНК тяжелой цепи антитело-к-PD-L1(Ate)-Fc1

<400> 42

atggaatgga gctgggtgtt cctgttcttt ctgtccgtga ccacaggcgt gcattctgaa 60

gtgcagctgg tggaaagcgg cggcggcctg gtgcagccgg gcggcagcct gcgcctgagc 120

tgcgcggcga gcggctttac ctttagcgat agctggattc attgggtgcg ccaggcgccg 180

ggcaaaggcc tggaatgggt ggcgtggatt agcccgtatg gcggcagcac ctattatgcg 240

gatagcgtga aaggccgctt taccattagc gcggatacca gcaaaaacac cgcgtatctg 300

cagatgaaca gcctgcgcgc ggaagatacc gcggtgtatt attgcgcgcg ccgccattgg 360

ccgggcggct ttgattactg gggccagggc accctggtga ccgtgtcatc tgcttctacc 420

aagggcccct ccgtgtttcc tctggcccct tccagcaagt ccacctctgg cggaacagcc 480

gctctgggct gcctcgtgaa ggactacttc cccgagcctg tgaccgtgtc ctggaactct 540

ggcgctctga catccggcgt gcacaccttc cctgctgtgc tgcagtctag cggcctgtac 600

tccctgtcct ccgtcgtgac cgtgccttcc agctctctgg gcacccagac ctacatctgc 660

aacgtgaacc acaagccctc caacaccaag gtggacaaga aggtggaacc caagtcctgc 720

gacaagaccc acacctgtcc cccttgtcct gcccctgaac tgctgggcgg accttccgtg 780

ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatct cccggacccc cgaagtgacc 840

tgcgtggtgg tggatgtgtc ccacgaggac cctgaagtga agttcaattg gtacgtggac 900

ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cctagagagg aacagtacaa ctccacctac 960

cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggattggc tgaacggcaa agagtacaag 1020

tgcaaggtgt ccaacaaggc cctgcctgcc cccatcgaaa agaccatctc caaggccaag 1080

ggccagcccc gggaacccca ggtgtacaca ctgcccccta gcagggacga gctgaccaag 1140

aaccaggtgt ccctgagctg tgcagtgaaa ggcttctacc cctccgacat tgccgtggaa 1200

tgggagtcca acggccagcc tgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggactcc 1260

gacggctcat tcttcctggt gagcaagctg acagtggaca agtcccggtg gcagcagggc 1320

aacgtgttct cctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1380

ctgtccctga gccccggcaa atga 1404

<210> 43

<211> 1110

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность ДНК D1m-Fc2

<400> 43

atggagtgga gctgggtgtt cttgttcttc ttgtccgtga ccaccggggt gcacagcgag 60

gaggagttgc agatcatcca gcctgacaag agcgtgagcg tggccgccgg ggagagcgct 120

attctgcact gtaccatcac ctccctcttc cccgtgggcc ccattcagtg gttcagggga 180

gccgggcccg ccagagttct gatttacaac cagaggcagg gcccctttcc ccgggttacc 240

actgtctctg agaccaccaa gcgggagaac atggatttca gcatctccat cagcaacatt 300

actcccgccg acgccggcac ctactactgc atcaaattca gaaagggctc tcccgacacc 360

gaattcaaaa gcggcgccgg caccgaactg tccgtgcgag ctaagccctc cgagcccaaa 420

tcctcagaca agacccacac ctgtccccct tgtcctgccc ctgaactgct gggcggacct 480

tccgtgttcc tgttcccccc aaagcccaag gacaccctga tgatctcccg gacccccgaa 540

gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtcccac gaggaccctg aagtgaagtt caattggtac 600

gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccta gagaggaaca gtacaactcc 660

acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag 720

tacaagtgca aggtgtccaa caaggccctg cctgccccca tcgaaaagac catctccaag 780

gccaagggcc agccccggga accccaggtg tacacactgc cccctagcag ggacgagctg 840

accaagaacc aggtgtccct gtggtgtctc gtgaaaggct tctacccctc cgacattgcc 900

gtggaatggg agtccaacgg ccagcctgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 960

gactccgacg gctcattctt cctgtacagc aagctgacag tggacaagtc ccggtggcag 1020

cagggcaacg tgttctcctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1080

aagtccctgt ccctgagccc cggcaaatga 1110

<210> 44

<211> 462

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность D1m-D2-Fc2

<400> 44

Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val

20 25 30

Ser Val Ala Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser

35 40 45

Leu Phe Pro Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala

50 55 60

Arg Val Leu Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr

65 70 75 80

Thr Val Ser Glu Thr Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser

85 90 95

Ile Ser Asn Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys

100 105 110

Phe Arg Lys Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr

115 120 125

Glu Leu Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Glu Pro Lys Ser Ser Gly Pro

130 135 140

Ala Ala Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser

145 150 155 160

His Gly Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly

165 170 175

Asn Glu Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser

180 185 190

Val Ser Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu

195 200 205

Asp Val His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln

210 215 220

Gly Asp Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Asp Lys Thr His Thr

225 230 235 240

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

245 250 255

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

260 265 270

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

275 280 285

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

290 295 300

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

305 310 315 320

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

325 330 335

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

355 360 365

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val

370 375 380

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

385 390 395 400

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

405 410 415

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

420 425 430

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

435 440 445

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<---

1. Биспецифический рекомбинантный белок, где биспецифический рекомбинантный белок содержит высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо и слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα; где

высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо не связывается с CD47, и аффинность его связывания, характеризующая антитело, соответствующее высокоаффинному нацеливающемуся на опухоль плечу, с антигеном-мишенью на опухолевой клетке в по меньшей мере 6 раз превышает аффинность связывания гомодимера мономерного слитого белка, соответствующего слитому белку с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα, с CD47 на опухолевой клетке;

аффинность связывания слитого белка с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα с CD47 не превышает аффинность связывания гомодимера мономерного слитого белка, содержащего внеклеточный усеченный вариант SIRPα, с CD47; где внеклеточный усеченный вариант SIRPα включает внеклеточный усеченный вариант человеческого SIRPα дикого типа или внеклеточный усеченный вариант человеческого SIRPα с невысокой аффинностью в отношении CD47;

где биспецифический рекомбинантный белок имеет конфигурацию, предусматривающую левое плечо и правое плечо, которые расположены противоположно, при этом высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо расположено в качестве левого плеча, слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα расположен в качестве правого плеча;

где высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо является специфическим в отношении мишени, выбранной из группы, состоящей из CD20, EGFR, HER2 и PD-L1;

где слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα содержит внеклеточный усеченный вариант SIRPα, и внеклеточный усеченный вариант SIRPα содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из a1), a2), a3) и a4): a1) SEQ ID NO: 30; a2) SEQ ID NO: 31; a3) SEQ ID NO: 32; a4) аминокислотная последовательность, имеющая замену A80N по сравнению с а1), а2) или а3);

где биспецифический рекомбинантный белок дополнительно содержит Fc-область.

2. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 1, где левое плечо имеет форму Fab или Fab' иммуноглобулина, а правое плечо является внеклеточным усеченным вариантом SIRPα.

3. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 2, где длина правого плеча сконфигурирована так, чтобы соответствовать расстоянию от эпитопа, с которым связывается левое плечо, до поверхности мембраны клетки-мишени.

4. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 3, отличающийся тем, что если высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо сконфигурировано для связывания проксимального по отношению к мембране эпитопа клетки-мишени, то внеклеточный усеченный вариант SIRPα выбран из более короткой аминокислотной последовательности среди a1), a2), a3) и a4).

5. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 1, отличающийся тем, что если мишенью является CD20, EGFR или PD-L1, то внеклеточный усеченный вариант SIRPα представляет собой a1); если мишенью является HER2, то внеклеточный усеченный вариант SIRPα представляет собой a1) или a2).

6. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 1, где высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо и слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα объединены посредством одного, двух или трех из следующих видов связывания: силы межмолекулярного взаимодействия, ковалентной связи, такой как межцепочечная дисульфидная связь, и солевой связи.

7. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 6, где Fc-область содержит природную последовательность Fc-области или неприродную последовательность Fc-области.

8. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 7, где Fc-область является человеческой Fc-областью.

9. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 8, где высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо и слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα являются гетеродимеризированными посредством «выступов-во-впадины».

10. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 9, где высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо представляет собой полуантитело из антитела IgG1, необязательно химерное полуантитело с человеческими и мышиными последовательностями, гуманизированное полуантитело, полностью человеческое полуантитело.

11. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 10, где высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо представляет собой гуманизированное или полностью человеческое полуантитело из антитела IgG1.

12. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 7, где слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из b1), b2), b3) и b4): b1) SEQ ID NO: 26; b2) SEQ ID NO: 27; b3) SEQ ID NO: 28; b4) аминокислотная последовательность, имеющая замену A80N по сравнению с b1), b2) или b3).

13. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 12, где

если высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо нацеливается на CD20, то высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо содержит SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17, при этом слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα содержит SEQ ID NO: 26;

если высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо нацеливается на EGFR, то высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо содержит SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 8, при этом слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα содержит SEQ ID NO: 26;

если высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо нацеливается на Her2, то высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо содержит SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23, при этом слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα содержит SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 27; или

если высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо нацеливается на PD-L1, то высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо содержит SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 13, при этом слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα содержит SEQ ID NO: 26.

14. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая биспецифический рекомбинантный белок по п. 1.

15. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 14, где молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо, и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα, представлены вместе в одной и той же нити ДНК, или молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо, и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα, представлены в разных нитях ДНК.

16. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 14.

17. Клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии по п. 16.

18. Способ получения биспецифического рекомбинантного белка, где способ предусматривает клетку по п. 17 для экспрессии рекомбинантного белка путем культивирования клетки.

19. Применение биспецифического рекомбинантного белка по п. 1 в изготовлении лекарственного препарата для лечения опухоли.

20. Применение по п. 19, где опухоль является гематологической опухолью или солидной опухолью, выбранной из группы, состоящей из рака молочной железы, колоректального рака, рака легкого, рака поджелудочной железы, рака пищевода, рака эндометрия, рака яичника, рака желудка, рака предстательной железы, рака почки, рака шейки матки, миеломы, лимфомы, лейкоза, рака щитовидной железы, рака матки, рака мочевого пузыря, нейроэндокринного рака, рака головы и шеи, рака печени, карциномы носоглотки, рака яичка, мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, меланомы, базально-клеточного рака кожи, плоскоклеточного рака кожи, возвышающейся дерматофибросаркомы, карциномы из клеток Меркеля, глиобластомы, глиомы, саркомы, мезотелиомы и миелодиспластического синдрома, и где опухоль является положительной для мишени, выбранной из группы, состоящей из CD20, EGFR, HER2 и PD-L1.