Способ культивирования пурпурных несерных бактерий с высоким содержанием бактериохлорофилла а

Изобретение относится к области биотехнологии. Разработан способ получения бактериохлорофилла а, который предусматривает культивирование нового штамма бактерий Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D, обладающего повышенной скоростью роста и способного расти в широком диапазоне концентраций компонентов среды, в том числе: молочной кислоты, уксусной кислоты, аммония, фосфатов и их смесей, в количестве, которое является эффективным. Дополнительное повышение эффективности способа основано на том, что культивирование проводят в три стадии: на первой стадии происходит адаптация культуры к условиям внутри реактора с понижением рО₂ до уровня 5-20% от насыщения воздухом, при этом поддерживают минимальную скорость вращения перемешивающего устройства и минимальную скорость подачи воздуха; при достижении уровня рО₂ 5-20% от насыщения воздухом осуществляют переход на вторую стадию, в которой за счет автоматического изменения скорости подачи воздуха и скорости вращения перемешивающего устройства осуществляют поддержание уровня рО₂ в пределах от 5 до 20% для наращивания биомассы бактерий, и дополнительно контролируют значение концентрации биомассы; при достижении значений концентрации биомассы 15-50% от желаемой конечной концентрации культуру переводят в третью стадию, в которой проводят доращивание биомассы при лимитировании концентрацией кислорода в пределах от 0,01 до 0,5% от насыщения воздухом, что приводит к синтезированию основного количества Бхл а. 4 ил., 4 табл.

 

Область техники.

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Предложен способ, который может применяться в промышленности для культивирования пурпурных несерных бактерий с целью получения бактериохлорофилла a.

Уровень техники.

Бактериохлорофилл a (Бхл a) является основой для синтеза фотосенсибилизаторов для терапии рака, поэтому его получение важно для фотодинамической терапии. Его использование обусловлено тем, что он поглощает свет в ближней ИК области, обеспечивая наиболее глубокое проникновение возбуждающего света в ткани. В природе Бхл a встречается у пурпурных бактерий, эритробактерий и у отдельных представителей филы Chloroflexi, причем пурпурные бактерии синтезируют его в больших количествах. Пурпурные бактерии разделяются на серные и несерные бактерии. Пурпурные несерные бактерии обладают удивительной подвижностью метаболизма и способны расти в фотогетеротрофных, фотоавтотрофных анаэробных условиях, хемогетеротрофных и хемоавтотрофных аэробных условиях в широком диапазоне концентраций растворенного кислорода, а также в хемогетеротрофных анаэробных условиях за счет брожения. При этом многие их представители способны расти с одинаковой скоростью роста как на свету, так и в темновых аэробных условиях. Именно поэтому пурпурные несерные бактерии являются наиболее предпочтительными продуцентами Бхл a.

У пурпурных бактерий Бхл a является важным компонентом фотосинтетического аппарата и входит в состав как реакционных центров, так и светособирающего аппарата (антенн). Максимальное содержание Бхл a в клетках пурпурных бактерий наблюдается в фототрофных анаэробных условиях при лимитировании роста светом. К сожалению, вследствие особенностей распространения света в поглощающих средах, интенсивное выращивание пурпурных бактерий на свету приводит лишь к концентрациям клеток до 3,5 г сухой биомассы в литре [1]. Поэтому интерес представляет хемогетеротрофное аэробное культивирование пурпурных бактерий.

Кислород подавляет синтез Бхл a. При выращивании в хемогетеротрофных условиях в присутствии кислорода содержание Бхл a зависит от парциального давления растворенного кислорода (рО₂) в среде. Со снижением рО₂ содержание Бхл a в биомассе растет. Например, клетки Rhodobacter capsulatus содержали максимальное количество Бхл a при лимитировании роста концентрацией кислорода [1]. Таким образом, интенсивное выращивание пурпурных бактерий для получения Бхл a в хемогетеротрофных условиях возможно, но требуется лимитирование культуры в процессе выращивания концентрацией кислорода.

Для промышленного производства Бхл a важно подобрать штамм с высокой скоростью роста и подобрать условия культивирования, позволяющие синтезировать высокие концентрации Бхл a.

Известен способ получения Бхл a, основанный на выращивании пурпурной несерной бактерии Rhodobacter capsulatus в хемогетеротрофных условиях в режиме хемостата с лимитированием концентрацией кислорода с использованием ацетата или лактата [1]. При этом равновесная концентрация биомассы достигала при использовании ацетата 3 г на литр, а лактата - 22 г на литр, т.е. лактат является более предпочтительным субстратом для указанной бактерии. К сожалению, непрерывное культивирование микроорганизмов требует высочайшей квалификации обслуживающего персонала и в производстве практически не используется.

Известен способ получения фотосинтетических биомембран и Бхл a, основанный на периодическом культивировании Rhodospirillum rubrum [2]. Культуры указанной пурпурной бактерии выращивали в периодическом режиме при постоянной подаче небольшого количества воздуха и неизменном перемешивании. При этом использовали смесь органических соединений (фруктоза и сукцинат), пропорции которых подобраны таким образом, чтобы рН среды практически не изменялся при культивировании. В процессе культивирования рО₂ снижалось и достигало почти нулевых значений. В конце культивирования биомасса составляла 9,1 г сырой биомассы на 1 л среды при высоком содержании фотосинтетических мембран и Бхл a. Однако это значение биомассы соответствует примерно 2 г сухой биомассы в 1 л среды, что ниже, чем описано для фотогетеротрофно выросших культур Rhodobacter capsulatus [1].

Известен также способ интенсификации хемогетеротрофного роста Rhodospirillum rubrum, основанный на продленном периодическом культивировании [3]. При этом способе культивирования в растущую культуру подавали концентрированную среду со скоростью, определяемой в соответствии с параметрами разработанной модели. Рост культур происходил в 4 фазы. В первой фазе (40 часов) культура росла в периодическом режиме без добавок среды. На второй фазе включали подачу субстратов со скоростью в соответствии с моделью. К 67-71 часу ручное определение содержания сукцината и фруктозы показало, что их содержание в биореакторе превышало допустимую концентрацию, и культуру переводили в третью фазу с коррекцией в подаваемой среде концентрации сукцината и фруктозы. Дополнительно было скорректировано содержание сульфата магния. Четвертая фаза отличалась от третьей фазы измененным рН подаваемой среды, а также наряду с подачей углеродных субстратов дополнительно вводили источник азота и фосфора. На протяжении всего культивирования поддерживали рО₂ равным 5%. Через 107 часов культивирования содержание биомассы составляло 59 г сухой биомассы в литре. К сожалению, содержание Бхл a и фотосинтетических мембран было очень низким. Кроме того, в конце культивирования, судя по содержанию белка в среде, значительное число клеток было лизированным. Таким образом, описанный способ интенсивного культивирования пурпурных бактерий имеет низкий выход Бхл a. К недостаткам также следует отнести то, что в процессе выращивания необходимо постоянно измерять содержание основных компонентов и производить корректировку подаваемой среды вручную.

Наиболее близким к предлагаемому по достигаемому эффекту и совокупности существенных признаков является способ, описанный в патенте РФ № RU 2671158 (17.04.2017) [4]. Согласно этому способу используется пурпурная несерная бактерия Rhodovulum sulfidofilum, у которой синтез Бхл a незначительно зависит от концентрации кислорода, и клетки производят этот пигмент при рО₂ в среде до 10% от насыщения воздухом. Бактерия выращивается в продленном периодическом режиме, причем используется неорганическая форма азота, а в качестве органических соединений используются сахара и/или органические кислоты (малат, сукцинат в виде кислоты и соли, глицерин, лимонная кислота и любая их комбинация). Культивирование начинают при невысоком содержании всех компонентов. В процессе роста в реактор подаются из отдельных сосудов органическое соединение, неорганическая форма азота, раствор фосфатов, пеногаситель, титрант, что требует подсоединения к реактору 5 дополнительных сосудов (для органического соединения, неорганической формы азота, раствора фосфатов, щелочи и пеногасителя) и насосов для их подачи. Подача осуществляется вручную в соответствии с результатами измерений остаточных концентраций в ростовой среде сукцината, аммония и фосфатов. Таким образом, проведение культивирования требует не только сложного приготовления нескольких растворов, но и постоянного измерения содержания различных компонентов с участием высококвалифицированного персонала и высокотехнологичного оборудования. В случае неожиданного исчерпания какого-то компонента на период от его окончания до его подачи в реактор культура останавливается в развитии, что замедляет процесс выращивания. Кроме того, периодическая подача приводит к тому, что концентрации веществ в реакторе изменяются от очень низкого до очень высокого уровня, что также может приводить к замедлению роста продуцента вследствие ингибирования роста каким-то компонентом. При выращивании в продленном периодическом режиме авторам удавалось получать до 600 мг Бхл a в литре суспензии. Однако вследствие невысокой скорости роста штамма-продуцента (Rhodovulum sulfidofilum) для достижения указанной концентрации Бхл a в среде необходимо было проводить культивирование более 100 часов.

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, заключается в получении нового высокоактивного штамма-продуцента для промышленного производства Бхл a. Другой задачей является повышение выхода Бхл a в условиях культивирования, позволяющих синтезировать высокие концентрации Бхл a.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в обеспечении высокого уровня активности нового штамма Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D, обладающего повышенной скоростью роста и способного расти в широком диапазоне концентраций компонентов среды, в том числе: молочной кислоты, уксусной кислоты, аммония, фосфатов и их смесей, в количестве, которое является эффективным, при производстве Бхл a в промышленных условиях, и повышении выхода Бхл a в усовершенствованном способе культивирования.

Перечень фигур

Фиг. 1. Графики роста Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D (фиг. А) в присутствии разных концентраций молочной и уксусной кислот по сравнению с типовым штаммом Rhodobacter capsulatus В10 (фиг. Б).

Фиг. 2. Конечная оптическая плотность культур Cereibacter sphaeroides ВКМ В-3534D в присутствии разных концентраций аммония по сравнению с типовым штаммом Rhodobacter capsulatus B10.

Фиг. 3. Кривая роста Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D при аэробном темновом культивировании в полулогарифмических координатах.

Фиг. 4. Рост Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D в трехстадийном режиме при продленно-периодическом культивировании.

Описание изобретения

При совершенствовании промышленной технологии получения бактериохлорофилла a технические задачи решались в области повышения эффективности способа продленного периодического культивирования на основе нового штамма-продуцента.

Штамм Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D был получен из пробы воды, отобранной из прибрежных вод Желтого моря, на юго-восточном побережье полуострова Шаньдун в районе горы Лаошань, Китай.

Штамм Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D обладает повышенной скоростью роста и способен расти в широком диапазоне концентраций компонентов среды, в том числе: молочной кислоты, уксусной кислоты, аммония, фосфатов и их смесей, в количестве, которое является эффективным. Штамм Cereibacter sphaeroides ВКМ В-3534D депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН под регистрационным номером ВКМ B-3534D.

Условия хранения: штамм может храниться при температуре -80°С в 30% глицерине с периодом обновления 1 раз в год.

Штамм Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D имеет следующие характеристики.

Культурально-морфологические признаки

При анаэробном росте на свету - цвет культуры может варьироваться от зеленовато-коричневого до темно-коричневого. При росте в присутствии кислорода, цвет культуры - красный. При росте на агаризованной среде YPS, культура образует красные колонии. Края колоний ровные, рост обильный.

Клетки грамотрицательные, сферические с тенденцией к овалу 2,0-2,5 мкм. Клетки могут образовывать короткие цепочки. Клетки подвижные с полярным жгутиком. Физиологические и биохимические характеристики

Растет как анаэробно на свету, так и микроаэробно и аэробно в темноте при температуре - 30-34°С, рН - 7,0.

Может использовать в качестве доноров электронов и источников углерода ацетат, пропионат, бутират, изо-бутират, валерат, капроат, каприлат, пеларгонат, лактат, пируват, малат, сукцинат, фумарат, цитрат, тартрат, глутамат, глюконат, фруктозу, глюкозу, маннозу, маннитол, сорбитол, глицерин, этанол, водород, сульфид. Ассимилирует сульфат. Способен к азотфиксации. Для роста необходимы тиамин, биотин и никотиновая кислота в качестве ростовых факторов.

Хемотаксономические характеристики

Фотосинтетическими пигментами бактерии являются Бхл a и каротиноиды сфероиденового ряда. В качестве главного хинона - убихинон 10 (Q-10). Главным образом присутствуют насыщенные жирные кислоты С16 и С18, а также мононенасыщенные кислоты С18:1. В качестве запасных веществ - полисахариды, поли-β-гидроксибутират и полифосфаты. Липополисахариды содержат глюкозамин в качестве единственного аминосахара в своих липидных А-фрагментах, имеют фосфатное, амидное связывание 3-ОН-14:0 и/или 3-оксо-14:0 и сложноэфирное связывание 3-ОН-10:0.

Выращивание штамма

Штамм Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D культивируют в фотогетеротрофных анаэробных условиях при температуре 30°С на питательной среде Ормеруда, содержащей на 1 л: 1,25 г (NH₄)₂SO₄; 900 мг K₂НРO₄; 600 мг KН₂РO₄; 200 мг MgSO₄⋅7Н₂O; 11,8 мг FeSO₄⋅7Н₂O; 7,5 мг СаСl₂; 20 мг ЭДТА; 2,8 мг Н_{3 В}O₃; 0,75 мг Na₂MoO₄⋅2Н₂O; 2,1 мг MnSO₄⋅4Н₂O; 0,24 мг ZnSO₄⋅7Н₂O; 0,04 мг CuSO₄⋅5Н₂O; 4-6 г лактата или малата; 100 мг дрожжевого экстракта. Фосфаты стерилизовать отдельно, рН перед посевом 6,7-7,0.

Срок культивирования активной культуры - 1-3 дня в зависимости от интенсивности света и толщины слоя культуры в сосуде.

Способ получения Бхл a с помощью штамма бактерии Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D включает подготовку инокулята, стерилизацию реактора с установленными датчиками рН, температуры, рO₂ и датчика пены, приготовление стартового питательного раствора, среды-титранта, щелочи, раствора пеногасителя, а также бутыли для приема продукта культивирования с последующей стерилизацией, подсоединение к реактору стерильных растворов среды-титранта, стартового питательного раствора, щелочи и раствора пеногасителя, а также бутыли для приема продукта культивирования, загрузку реактора стартовым питательным раствором, подсоединение к реактору газовой линии для подачи стерильного воздуха, установление необходимых температуры и рН стартового питательного раствора в реакторе, калибровке датчика рO₂, засеве инокулята в реактор и последующем культивировании.

При этом:

- в качестве продуцента Бхл α используют штамм Cereibacter sphaeroides ВКМ В-3534D, обладающий высокой скоростью роста (время удвоения составляет от 2,7 до 2,9 часа в хемогетеротрофных условиях) с использованием дешевых органических субстратов (молочная и уксусная кислоты), способный расти в широком диапазоне концентраций компонентов среды, в том числе: молочной кислоты, уксусной кислоты, аммония, фосфатов и их смесей, в количестве, которое является эффективным.

- для выращивания бактерии в качестве стартовой используют синтетическую питательную среду Ормеруда [5], а культивирование проводят в продленном периодическом режиме, причем в качестве подаваемой среды используют один концентрированный раствор (титрант), сбалансированный по всем компонентам и имеющий низкое значение рН (не более 4,5);

- в качестве косвенного показателя остаточной концентрации органических соединений используют значение рН внутри реактора, с увеличением которого происходит автоматическая подача питательного раствора. Причем для повышения точности регулирования и удешевления производства Бхл a, в качестве источников углерода и энергии используют органические кислоты и их соли, например, молочную кислоту, уксусную кислоту и их смеси;

- продленное периодическое культивирование проводят в три стадии: на первой стадии происходит адаптация культуры к условиям внутри реактора с понижением рO₂ до уровня 5-20% от насыщения воздухом, при этом поддерживают минимальную скорость вращения перемешивающего устройства и минимальную скорость подачи воздуха; при достижении уровня рO₂ 5-20% от насыщения воздухом осуществляют переход на вторую стадию, в которой за счет автоматического изменения скорости подачи воздуха и скорости вращения перемешивающего устройства осуществляют поддержание уровня рO₂ в пределах от 5 до 20% для наращивания биомассы бактерий, и дополнительно контролируют значение концентрации биомассы; при достижении значений концентрации биомассы 15-50% от желаемой конечной концентрации, культуру переводят в третью стадию, в которой проводят доращивание биомассы при лимитировании концентрацией кислорода в пределах от 0,01 до 0,5% от насыщения воздухом, что приводит к синтезированию основного количества Бхл a.

При составлении питательной среды, используемой в виде титранта, учитывают потребление основных минеральных компонентов пурпурной бактерией и составляют среду в виде одного общего раствора, сбалансированного по всем компонентам, чтобы избежать лимитирования или ингибирования роста культуры вследствие исчерпания или накопления какого-то компонента. Для того, чтобы в этом растворе не происходило выпадения осадков, и чтобы его добавление приводило к понижению рН культуральной жидкости, рН поддерживают кислым.

Известно, что поддержание уровня рO₂ в среде от 5 до 20% при продленном периодическом культивировании приводит к получению большого количества биомассы. Однако эта биомасса будет содержать очень мало Бхл a вследствие репрессии синтеза Бхл a кислородом. Для получения большого количества Бхл a культивирование проводят при продленном периодическом режиме в три стадии.

На первой стадии происходит адаптация культуры к условиям внутри реактора с понижением рO₂ до уровня 5-20% от насыщения воздухом за счет потребления кислорода размножающимися бактериями. При этом поддерживают минимальную скорость вращения перемешивающего устройства и минимальную скорость подачи воздуха.

При достижении уровня рO₂ 5-20% от насыщения воздухом осуществляют переход на вторую стадию, в которой за счет автоматического изменения скорости подачи воздуха и скорости вращения перемешивающего устройства осуществляют поддержание уровня рO₂ в пределах от 5 до 20% для наращивания биомассы бактерий, и дополнительно контролируют значение концентрации биомассы.

При достижении значений концентрации биомассы 15-50% от желаемой конечной концентрации, культуру переводят в третью стадию, в которой проводят доращивание биомассы при лимитировании концентрацией кислорода в пределах от 0,01 до 0,5% от насыщения воздухом, что приводит к синтезированию основного количества Бхл a. Для этого в третьей стадии выключают автоматическое регулирование концентрации кислорода и фиксируют количество оборотов перемешивающего устройства в минуту и скорость подачи воздуха на тех уровнях, которые были достигнуты к этому моменту выращивания. За счет активного роста бактерий их биомасса (и скорость потребления кислорода) возрастает. Поскольку рO₂ определяется динамической разницей между скоростью поступления кислорода (определяемой скоростью перемешивания и скоростью подачи воздуха в реактор) и скоростью его потребления, такая фиксация приводит к снижению рO₂ в среде вплоть до лимитирующих концентраций.

При этом стремятся к поддержанию максимально возможной скорости роста культуры при лимитирующей концентрации кислорода, поскольку содержание Бхл a в биомассе определяется не только концентрацией кислорода, но и скоростью потока электронов по электронтранспортной дыхательной цепи, который выше при большей скорости роста [6]. Это достигается тем, что переход в третью стадию осуществляют при концентрации биомассы в реакторе, равной от 15 до 50% от желаемой.

При использовании известных штаммов пурпурных бактерий в зависимости от состояния инокулята может меняться скорость роста культуры в начальный момент времени, включая и возможный несбалансированный рост. Вследствие этой неопределенности возможны колебания в составе биомассы пурпурных бактерий и, как результат, накопление различных компонентов среды к концу культивирования. Эти компоненты могут ингибировать рост пурпурной бактерии. Чтобы избежать этого, в новом способе культивирования используют штамм пурпурной несерной бактерии Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D, способный расти в широком диапазоне концентраций компонентов среды, в том числе: молочной кислоты, уксусной кислоты, аммония, фосфатов и их смесей, в количестве, которое является эффективным.

Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Устойчивость Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D к высоким концентрациям различных соединений и определение его скорости роста.

А. Рост Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D в присутствии разных концентраций молочной и уксусной кислот и сравнение с типовым штаммом Rhodobacter capsulatus B10.

Для выращивания инокулята использовали питательную среду Ормеруда [5], так как известно, что пурпурные несерные бактерии хорошо растут на этой среде как в фотогетеротрофных анаэробных, так и хемогетеротрофных аэробных условиях [7].

В полученный раствор добавляли 2 г на литр уксусной и 2 г на литр молочной кислот, доводили рН до 6,7 и стерилизовали при 1 атм (121°С) в течение 20 мин.

Стерильную среду добавляли в стерильный прозрачный сосуд объемом 75 мл, и добавляли Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D или Rhodobacter capsulatus В10 в количестве 1%. Сосуд заполняли полностью, герметично закрывали и устанавливали в люминостат при температуре 30°С и освещении лампами накаливания (100 Вт на м²). Через 36-48 часов полученную культуру использовали для инокуляции экспериментальных сосудов, в качестве которых использовались пробирки диаметром 13 мм с завинчивающейся крышкой (Bellco Glass SKU: 2012-01310).

Питательную среду для экспериментов готовили как указано выше, но концентрацию уксусной и молочной кислоты варьировали в диапазоне от 20 мМ молочной кислоты с 20 мМ уксусной кислоты до 60 мМ молочной кислоты с 60 мМ уксусной кислоты. В среду добавляли 1% Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D или Rhodobacter capsulatus В10, разливали по пробиркам. Пробирки устанавливали в люминостат при температуре 30°С и освещении лампами накаливания (100 Вт на м²). В процессе роста культур при разных концентрациях молочной и уксусной кислот периодически измеряли оптическую плотность суспензии при длине волны 650 нм на спектрофотометре. Полученные данные представлены на фиг. 1.

Из фиг. 1 следует, что при содержании в среде 20 мМ молочной кислоты и 20 мМ уксусной кислоты обе культуры развивались без лаг-периода и достигали одинаковой конечной плотности. Однако, при 40 мМ молочной кислоты и 40 мМ уксусной кислоты в среде оба штамма имели лаг-период около 1 суток, хотя достигали близких конечных значений оптической плотности. При 50 мМ молочной кислоты и 50 мМ уксусной кислоты культура Rhodobacter capsulatus В10 уже не росла, тогда как Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D была способна расти и при 60 мМ молочной кислоты и 60 мМ уксусной кислоты, хотя рост начинался после лаг-периода. Таким образом, Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D способен выдерживать более высокие концентрации уксусной и молочной кислот.

Б. Рост Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D в присутствии разных концентраций аммония по сравнению с типовым штаммом Rhodobacter capsulatus В10.

Инокулят для экспериментов выращивали как описано в примере 1 А. Питательную среду для экспериментов готовили как в примере 1А, но использовали 20 мМ молочной кислоты с 20 мМ уксусной кислоты, а концентрацию сульфата аммония варьировали от 10 мМ до 130 мМ (от 20 до 260 мМ NH₄⁺). В среду добавляли 1% Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D или Rhodobacter capsulatus В10, разливали по пробиркам. Пробирки устанавливали в люминостат при температуре 30°С и освещении лампами накаливания (100 Вт на м²). Измеряли конечную оптическую плотность суспензии с разными концентрациями сульфата аммония при длине волны 650 нм на спектрофотометре. На фиг. 2 приведены эти данные, выраженные в единицах оптической плотности. Типовой штамм Rhodobacter capsulatus В10 не способен к росту уже при концентрации аммония 60 мМ, тогда как штамм Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D способен расти и в присутствии 260 мМ ионов аммония. Таким образом, Cereibacter sphaeroides ВКМ В-3534D значительно устойчивее типового штамма по отношению к ионам аммония в среде.

В. Рост Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D в присутствии разных концентраций фосфатов по сравнению с типовым штаммом Rhodobacter capsulatus В10.

Инокулят для экспериментов выращивали как описано в примере 1 А. Питательную среду для экспериментов готовили как в примере 1А, но использовали 20 мМ молочной кислоты с 20 мМ уксусной кислоты, а концентрацию фосфатов в среде варьировали от 1,2 до 27 г на литр. В среду добавляли 1% Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D или Rhodobacter capsulatus В10, разливали по пробиркам. Пробирки устанавливали в люминостат при температуре 30°С и освещении лампами накаливания (100 Вт на м). Проводили качественную оценку роста культур с разными концентрациями фосфатов. Данные представлены в таблице 3. Типовой штамм Rhodobacter capsulatus В10 не способен к росту при концентрации фосфатов 27 г на литр, тогда как штамм Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D способен расти в присутствии такого количества фосфатов. Таким образом, Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D устойчивее, чем типовой штамм по отношению к высоким концентрациям фосфатов в среде.

Г. Определение скорости роста Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D и сравнение со скоростью роста Rhodobacter capsulatus В10.

Инокулят для эксперимента выращивали как описано в примере 1 А.

Было проведено аэробное культивирование штамма Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D при температуре 30°С и рН, равном 7,0, с измерением оптической плотности культуры при длине волны 650 нм каждые 15 мин. На фиг. 3 приведен график полученной кривой роста культуры в полулогарифмических координатах. Скорость роста считают по линейному участку в полулогарифмических координатах. В данном случае линейный участок начинается с 9 часов и заканчивается в 13,75 часа. Этим временам соответствуют следующие значения оптической плотности при длине волны 650 нм - 0,0177 и 0,0565. Скорость роста можно рассчитать по следующей формуле:

где μ - скорость роста культуры,

X₁ и Х₀ - оптическая плотность культуры при длине волны 650 нм в момент времени T₁ и Т₀ соответственно,

T₁-Т₀ - время роста культуры.

При подставлении в формулу имеющихся данных, скорость роста культуры Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D получается равной 0,244 в час.

На основании литературных данных можно видеть, что скорость роста типового штамма пурпурной несерной бактерии Rhodobacter capsulatus В10 составляет 0,226 в час [8].

Перевести скорость роста штаммов во времена удвоения культуры можно по следующей формуле:

где Т _удв. - время удвоения культуры,

μ - скорость роста культуры.

Время удвоения культуры Rhodobacter capsulatus В10 составляет 3,07 ч, в то время как у Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D этот показатель равен 2,84 ч. Таким образом, штамм Cereibacter sphaeroides имеет более высокую скорость роста.

Пример 2. Рост Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D при продленном периодическом культивировании в реакторе.

Инокулят для эксперимента выращивали как описано в примере 1А, но использовали стерильный сосуд объемом 250 мл.

В собранный реактор объемом 3 л устанавливали предварительно откалиброванные датчики рН, температуры, а также датчики рО₂ и уровня пены. После проверки герметичности реактора, его стерилизовали в автоклаве в течение 20 минут при 120°С.

Состав стартовой среды приведен в Таблице 1 и Таблице 2, причем в нее добавляли 15 мМ молочной и 15 мМ уксусной кислот в качестве источников углерода, а рН доводили до 6,8. Состав среды-титранта для подпитки культуры приведен в Таблице 4.

Также готовили 2М раствор NaOH.

Готовили раствор пеногасителя путем растворения 7 г пеногасителя (Silicone anti-foaming emulsion 30, Carl Roth) в 693 мл дистиллированной воды. Готовили бутыль для приема продукта культивирования.

Стерилизация стартовой среды, бутыли для приема продукта культивирования, щелочи и раствора пеногасителя происходила в автоклаве в течение 20 минут при 120°С.

Среду-титрант стерилизовали отдельно в автоклаве в течение 20 минут при 120°С.

После стерилизации подсоединяли бутыль для приема продукта культивирования, бутыли со стартовой средой, со средой-титрантом, с щелочью и с раствором пеногасителя. Затем в реактор заливали стартовую среду (1 л), подсоединяли газовую линию для подачи стерильного воздуха, проверяли рН и доводили его до 7,0, доводили температуру до 31°С, калибровали датчик рO₂ при максимальном количестве оборотов перемешивающего устройства в минуту и максимальном расходе воздуха. После этого засевали в реактор инокулят (0,25 л на реактор). В реакторе поддерживалась температура равная 31°С и рН, равное 7,0.

В процессе культивирования объем суспензии в реакторе постоянно возрастал за счет добавления среды-титранта. Культивирование проводили до практически полного заполнения реактора. В конце процесса отбирали конечную точку, в которой измеряли оптическую плотность, вес высушенных клеток и содержание Бхл a.

Культивирование проводили в три стадии (фиг. 4). На первой стадии происходит адаптация культуры к условиям внутри реактора с понижением рO₂ до уровня 5-20% от насыщения воздухом. На этой стадии поддерживают минимальную скорость вращения перемешивающего устройства в пределах от 90 до 110 оборотов в минуту и минимальную скорость подачи воздуха в реактор в пределах от 0,25 до 0,35 л в минуту для 3 литрового реактора.

После того как рO₂ снижается до уровня 5-20% от насыщения воздухом (обычно от 2 до 8 часов после начала культивирования) осуществляют переход на вторую стадию для наращивания биомассы бактерий. В этой стадии за счет автоматического изменения скорости подачи воздуха и скорости вращения перемешивающего устройства осуществляют поддержание уровня рO₂ в пределах от 5 до 20%. При этом дополнительно контролируют значение концентрации биомассы. Эта стадия длится обычно до 22-28 часов от начала культивирования.

При достижении значений концентрации биомассы от 15 до 50% от желаемой конечной концентрации, культуру переводят в третью стадию, в которой проводят доращивание биомассы при лимитировании концентрацией кислорода в пределах от 0,01 до 0,5% от насыщения воздухом, что приводит к синтезированию основного количества Бхл a. Для этого выключают автоматическое регулирование рO₂ в среде и оставляют ту скорость вращения перемешивающего устройства и скорость подачи воздуха, которые к этому моменту были установлены системой автоматического регулирования. Культивирование прекращают, когда реактор практически полностью заполнялся культуральной суспензией. Обычно это составляло от 45 до 50 часов от начала культивирования. В примере 2 приведен эксперимент, в котором культивирование остановили на 47 часу (фиг. 4). В этом примере концентрация биомассы в реакторе составляла 49,5 г сухой биомассы в литре (201 единица оптической плотности при длине волны 650 нм), содержание Бхл a было 424 мг в литре культуры. В различных экспериментах содержание Бхл a варьировалось от 400 до 450 мг на литр.

Таким образом, за 47 часов средняя скорость производства Бхл a составляла 9,0 мг на литр в час, что выше чем описано у патента-прототипа (отношение 600 мг к 120 часам составляет 5,0 мг на литр в час).

Культуральную суспензию центрифугировали, сливали супернатант и концентрированную биомассу в виде пасты замораживали до использования (-20°С).

Бхл a можно выделять любым способом, например, описанным в патентах РФ №RU 2671158 [4], РФ №RU 2144085 [9].

Для проверки возможности масштабируемости процесса получения Бхл a описанным способом проводили выращивание в 15 л реакторе. Через 48-60 часов культивирования содержание Бхл a в реакторе составляло от 300 до 350 мг в литре культуры при концентрации сухой биомассы от 48 до 52 г на литр.

Промышленная применимость

В настоящем изобретении описан новый способ получения бактериохлорофилла a, в котором с целью увеличения выхода целевого продукта используют новый штамм Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D, обладающий повышенной скоростью роста и способный расти в широком диапазоне концентраций компонентов среды, в том числе: молочной кислоты, уксусной кислоты, аммония, фосфатов и их смесей, в количестве, которое является эффективным. Применение нового штамма Cereibacter sphaeroides в усовершенствованном способе культивирования позволяет добиться синергетического эффекта от применения нового штамма и усовершенствованного способа культивирования продуцента Бхл a. Предлагаемый способ позволяет увеличить выход Бхл a в процессе продленного периодического культивирования с использованием концентрированной среды для подпитки культуры.

Список использованной литературы

1. Патрушева Е.В. Синтез бактериохлорофилла а пурпурной несерной бактерией Rhodobacter capsulatus / Е.В. Патрушева, А.А. Цыганков, В.Ю. Белера, А.С.Федоров // Микробиология. - 2007. - Т. 43 - С. 208-212.

2. Ghosh, R. Optimization of the Sistrom Culture Medium for Large-Scale Batch Cultivation of Rhodospirillum rubrum under Semiaerobic Conditions with Maximal Yield of Photosynthetic Membranes/ R. Ghosh, A. Hardmeyer, I. Thoenen, R. Bachofen// Applied And Environmental Microbiology. - 1994. - Vol.60 - P. 1698-1700.

3. Zeiger, L. Model-based high cell density cultivation of Rhodospirillum rubrum under respiratory dark conditions/ L. Zeiger, H. Grammel// Biotechnology and Bioengineering. - 2010. - Vol. 105-P. 729-739.

4. Ерен Д., Мазор К, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИОХЛОРОФИЛЛА А. Патент РФ № RU 2671158 (17.04.2017).

5. Ormerod G.J. Light-dependent utilization of organic compounds and photoproduciton of molecular hydrogen by photosynthetic bacteria: Relationships with nitrogen metabolism / J. G. Ormerod, S. K. Ormerod, H. Gest // Archives of Biochemistry and Biophysics. - 1961. - Vol.64 -P. 449-463.

6. Dierstein, R. Nitrogen-limited continuous culture of Rhodopseudomonas capsulata growing photosynthetically or heterotrophically under low oxygen tensions/ R. Dierstein, G. Drews // Archives of Microbiology. - 1974. - Vol.99. - P. 117-128.

7. Кондратьева E.H. Автотрофные прокариоты, Издательство МГУ, Москва, 1996, стр. 16-74.

8. Цыганков, А.А. Получение биомассы пурпурных бактерий / А.А. Цыганков, И.Н. Гоготов // Прикладная Биохимия и Микробиология. - 1990. - Т. 26. - С. 819-824.

9. Миронов А.Ф., Ефремов А.В. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИОХЛОРОФИЛЛА А, Патент РФ № RU 2144085 (10.01.2000).

Способ получения бактериохлорофилла а путем продленного периодического культивирования в реакторе, отличающийся тем, что в качестве штамма-продуцента используют штамм Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D, обладающий повышенной скоростью роста и способный расти в широком диапазоне концентраций компонентов среды, в том числе: молочной кислоты, уксусной кислоты, аммония, фосфатов и их смесей, в количестве, которое является эффективным, при этом культивирование проводится в три стадии: на первой стадии происходит адаптация культуры к условиям внутри реактора с понижением рО₂ до уровня 5-20% от насыщения воздухом, при этом поддерживают минимальную скорость вращения перемешивающего устройства и минимальную скорость подачи воздуха; при достижении уровня рО₂ 5-20% от насыщения воздухом осуществляют переход на вторую стадию, в которой за счет автоматического изменения скорости подачи воздуха и скорости вращения перемешивающего устройства осуществляют поддержание уровня рО₂ в пределах от 5 до 20% для наращивания биомассы бактерий, и дополнительно контролируют значение концентрации биомассы; при достижении значений концентрации биомассы 15-50% от желаемой конечной концентрации культуру переводят в третью стадию, в которой проводят доращивание биомассы при лимитировании концентрацией кислорода в пределах от 0,01 до 0,5% от насыщения воздухом, что приводит к синтезированию основного количества бактериохлорофилла а.