Способ диагностики наследственных мутаций в генах sdhx при каротидных параганглиомах

Изобретение относится к области медицины, а именно к молекулярно-генетическому тестированию. Для диагностики наследственных мутаций в генах SDHx при каротидных параганглиомах проводят иммуногистохимический анализ экспрессии субъединицы SDHB сукцинатдегидрогеназы. Выявление на гистологических препаратах гранулярного цитоплазматического окрашивания опухолевых клеток той же интенсивности по сравнению с окрашиванием эндотелиальных клеток оценивается как положительное. Полное отсутствие цитоплазматического окрашивания по сравнению с интенсивным окрашиванием эндотелиальных клеток оценивается как отрицательное. Равномерное цитоплазматическое окрашивание без определенной зернистости, контрастирующее с сильным зернистым окрашиванием эндотелиальных клеток, оценивается как слабое диффузное. При этом отрицательное или слабое диффузное окрашивание субъединицы SDHB указывает на наличие наследственной мутации в одном из генов SDHx. Способ позволяет диагностировать наследственные каротидные параганглиомы (в том числе, развивающиеся как наследственные синдромы параганглиом), а также выявлять злокачественный потенциал заболевания. 4 пр., 4 ил.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу диагностики каротидных параганглиом, и основано на определении мутационного статуса генов SDHx (SDHA, SDHB, SDHC и SDHD), кодирующих соответствующие субъединицы сукцинатдегидрогеназы (митохондриальный комплекс II, SDH комплекс), посредством иммуногистохимиии (ИГХ) субъединицы SDHB. Предлагаемое изобретение может найти применение в медицине, в частности для диагностики наследственных опухолей и синдромов параганглиом, а также для прогнозирования склонности к метастазированию.

Уровень техники

Каротидные параганглиомы (КПГ) - это редкие нейроэндокринные опухоли, образующиеся из каротидного гломуса, располагающегося в области бифуркации сонной артерии. КПГ составляют около 60% всех параганглиом головы и шеи (А.K. El-Naggar, J.K.С. Chan, J.R. Grandis, Т. Takata, P.J. Slootweg. Who Classification of Head and Neck Tumours. International Agency for Research on Cancer, 2017). Эти опухоли имеют высокую степень наследственности и связаны с терминальными мутациями в ряде генов, таких как SDHx, SDHAF2, VHL, RET, NF1, ТМЕМ127, MAX, FH, MEN2 и SLC25A11. Наличие мутаций в этих генах показывает предрасположенность к различным формам параганглиом: ранним, синдромным, множественным и злокачественным. Наследственные параганглиомы головы и шеи часто образуются в рамках наследственных синдромов параганглиом 1-5 типа (PGL1-5), которые ассоциированы с мутациями в генах SDHx и гене SDHAF2, кодирующем фактор сборки SDH комплекса: SDHD (PGL1), SDHAF2 (PGL2), SDHC (PGL3), SDHB (PGL4) и SDHA (PGL5) (С.С. Boedeker, Е.F. Hensen, Н.P. Neumann, W. Maier, F.Н. van Nederveen, С. Suarez, H.P. Kunst, J.P. Rodrigo, R.P. Takes, P.K. Pellitteri, A. Rinaldo, A. Ferlito. Genetics of Hereditary Head and Neck Paragangliomas. Head Neck 36, no. 6 (Jun 2014): 907-16. http://dx.doi.org/10.1002/hed.23436). Множественные параганглиомы развиваются только в 1% спорадических случаев, в то время как при наследственных опухолях вероятность их развития значительно увеличивается (A. Ikram, A. Rehman. Paraganglioma. In Statpearls. Treasure Island (FL), 2020). При множественных параганглиомах часто выявляются терминальные мутации в гене SDHD (А.V. Snezhkina, D.V. Kalinin, V.S. Pavlov, E.N. Lukyanova, A.L. Golovyuk, M.S. Fedorova, E.A. Pudova, M.V. Savvateeva, O.A. Stepanov, A.A. Poloznikov, Т.B. Demidova, N.V. Melnikova, A.A. Dmitriev, G.S. Krasnov, A.V. Kudryavtseva. Immunohistochemistry and Mutation Analysis of Sdhx Genes in Carotid Paragangliomas. Int J Mol Sci 21, no. 18 (Sep 22 2020): 6950. http://dx.doi.org/10.3390/ijms21186950). Злокачественные формы опухолей составляют до 19% всех параганглиом головы и шеи и характеризуются наличием метастазов в регионарных лимфоузлах и/или отдаленных метастазов (J.Н. Lee, F. Barich, L.Н. Karnell, R.A. Robinson, W.K. Zhen, B.J. Gantz, H.T. Hoffman, Cancer American College of Surgeons Commission on, Society American Cancer. National Cancer Data Base Report on Malignant Paragangliomas of the Head and Neck. Cancer 94, no. 3 (Feb 1 2002): 730-7. http://dx.doi.org/10.1002/cncr.10252). Показано, что метастатические параганглиомы ассоциированы с наличием мутаций в гене SDHB, при этом риск метастазирования варьирует от 34 до 70% (V. Kantorovich, K.S. King, K. Pacak. Sdh-Related Pheochromocytoma and Paraganglioma. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 24, no. 3 (Jun 2010): 415-24). Мутации в гене SDHB рассматриваются как один из основных молекулярных м. http://dx.doi.Org/10.1016/j.beem.2010.04.001аркеров, предсказывающих агрессивное течение заболевания и повышенный риск метастазирования (Н. Turkova, Т. Prodanov, М. Maly, V. Martucci, K. Adams, J. Widimsky, Jr., С.С. Chen, A. Ling, E. Kebebew, C.A. Stratakis, T. Fojo, K. Pacak. Characteristics and Outcomes of Metastatic Sdhb and Sporadic Pheochromocytoma/Paraganglioma: An National Institutes of Health Study. Endocr Pract 22, no. 3 (Mar 2016): 302-14. http://dx.doi.org/10.4158/EP15725.OR).

Для предсказания течения заболевания и риска метастазирования используют следующие методы:

1. Высокопроизводительное секвенирование (NGS) высокотехнологический метод для определения мутаций в генах SDHx посредством расшифровки нуклеотидной последовательности ДНК (генома, экзома и целевых областей). Однако из-за высокой стоимости оборудования, расходных материалов и необходимости высокой квалификации персонала его применение в рутинной лабораторной диагностике ограничено.

2. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (NMR) высокого разрешения с вращением под магическим углом (HR-MAS) - новый метод, который можно использовать для детекции мутаций в генах SDHx на основе анализа метаболического профиля in vivo и ex vivo. Этот метод является дорогостоящим и трудоемким.

3. Жидкостная хроматография с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС). Это метод позволяет определять отношение сукцината к фумарату в опухолевых образцах и выявлять терминальные мутации в генах SDHx. Для проведения метода ВЭЖХ-МС/МС необходимо наличие специализированного оборудования в патологоанатомической лаборатории. Также этот имеет более низкий показатель чувствительности для детекции мутаций в генах SDHx при параганглиомах головы и шеи.

В международном патенте Джудит Фавьер с коллегами (WO/2020/104482) с целью поиска биомаркеров для прогнозирования метастатического потенциала параганглиом с мутацией в гене SDHB был проведен консенсусный кластерный анализ изменений экспрессии длинных некодирующих РНК (днРНК). Выявлено четыре подтипа опухолей, которые сильно коррелировали с кластерами экспрессии мРНК. Идентифицирована днРНК (GenBank: ВС063866), уровень экспрессии которой позволяет точно отличить метастазирующие опухоли от неместазирующих у пациентов с параганглиомами. Изменение экспрессии этого транскрипта подтверждено с помощью количественной ПЦР (кПЦР). Выявленная днРНК предлагается в качестве нового биомаркера, который может быть использован для определения потенциально метастатических опухолей у пациентов с мутациями в генах SDHx. Эффективность метода проверялась только на совместной выборке феохромоцитом (82%) и параганглиом (18%). При работе с каротидными параганглиомами эффективность метода не исследовалась.

В международной патентной заявке Ромеро Марии Долорес Кьяра с соавторами (WO 2020225331 А1) предложен способ прогноза метастазирования параганглиом. Метод основан на обнаружении гиперметилирования гена PCDHGC3 у пациентов с мутациями в гене SDHB, которое связано с повышением клеточной пролиферации, миграции клеток и инвазивности. Также в этом исследовании было идентифицировано около 70% генов, характеризующихся гиперметилированием, ассоциированным с мутациями в генах SDHx. Полученные результаты позволяют предположить, что выявленные гены могут быть специфически связаны с метастатическим процессом и вовлечены в механизмы метастазирования, опосредуемые нарушениями в гене SDHB. Этот метод без сопутствующего прямого секвенирования не позволяет оценить наличие патогенных мутаций в генах SDHx, приводящих к нарушению функции SDH комплекса.

В международном патенте Енг Чарис (US 20100092961 А1) описан способ диагностики синдрома Коудена и подобных ему синдромов, основанный на обнаружении мутаций в генах SDHB и SDHD с помощью прямого секвенирования продуктов ПЦР с последующим их подтверждением методом иммуноблотинга. Присутствие мутаций в этих генах у пациента свидетельствует о наличие синдромов или о предрасположенности к ним. Подтверждены мутации Ala3Gly и Ser163Pro в гене SDHB и их комбинации, а также мутации Gly12Ser, His50Arg и His145Asn в гене SDHD и их комбинации, которые связаны с проявлением этих синдромов. В патенте не рассматривалась возможность использования данной методики для диагностики параганглиом.

Международный патент Илана Садех (US 20140303901 A1) описывает метод оценки вероятности развития онкологического заболевания. Метод включает определение набора последовательностей генов, ассоциированных с заболеванием, и последовательности ДНК пациента. Проводится поиск повторений последовательности гена по последовательности ДНК и вычисление среднего расстояния повторений между соседними повторениями. На основе расчетов проводится оценка вероятности развития заболевания.

В международном патенте Джареда Руттера с коллегами (US 20110165560 A1) предложен метод определения риска развития различных заболеваний, ассоциированных с нарушением функции сукцинатдегидрогеназы, на основе определения мутаций в гене HSDH5 (SDHAF2). Данный метод включает получение биологического материала от тестируемого пациента, определение мутаций в гене hSDH5 и исследование изменения уровня флавинирования сукцинатдегидрогеназы у тестируемого пациента по сравнению со здоровым субъектом.

Недостатками вышеперечисленных решений являются дороговизна использования методов, высокая трудоемкость и низкая специфичность при прогнозе течения заболевания.

КПГ наиболее часто ассоциированы с терминальными мутациями в генах SDHx, которые являются драйверным событием, индуцирующим рост и развитие опухоли. Патогенные мутации в любом из генов SDHx приводят к нарушению стабильности SDH комплекса или препятствуют его формированию, при этом происходит высвобождение субъединицы SDHB в цитоплазму, где она быстро деградирует (A.J. Gill. Succinate Dehydrogenase (Sdh)-Deficient Neoplasia. Histopathology 72, no. 1 (Jan 2018): 106-16. http://dx.doi.org/10.1111/his.13277). Потерю экспрессии субъединицы SDHB можно детектировать с помощью иммуногистохимического анализа по характерному отрицательному или слабому диффузному окрашиванию этого белка. Исследование репрезентативной выборки 42 российских пациентов с КПГ показало, что нарушение экспрессии SDHB часто встречается в опухолях, несущих патогенные и вероятно патогенные варианты в генах SDHx. Метод ИГХ анализа субъединицы SDHB имеет высокую чувствительность (94%), специфичность (58%) и диагностическую эффективность (71%) для предсказания наличия мутаций в генах SDHx при каротидных параганглиомах (А.V. Snezhkina, D.V. Kalinin, V.S. Pavlov, E.N. Lukyanova, A.L. Golovyuk, M.S. Fedorova, E.A. Pudova, M.V. Sawateeva, O.A. Stepanov, A.A. Poloznikov, Т.B. Demidova, N.V. Melnikova, A.A. Dmitriev, G.S. Krasnov, A.V. Kudryavtseva. Immunohistochemistry and Mutation Analysis of Sdhx Genes in Carotid Paragangliomas. Int J Mol Sci 21, no. 18 (Sep 22 2020): 6950). http://dx.doi.org/10.3390/ijms21186950). Кроме того, в недавнем обзоре литературных данных, Линдси Аудейк с соавторами (L. Oudijk, J. Gaal, R.R. de Krijger. The Role of Immunohistochemistry and Molecular Analysis of Succinate Dehydrogenase in the Diagnosis of Endocrine and Non-Endocrine Tumors and Related Syndromes. Endocrine Pathology 30 (March 2019): 64-73. https://doi.org/10.1007/s12022-018-9555-2) отмечают высокую эффективность применения метода ИГХ SDHB для определения наследственных мутаций в генах SDHA, SDHB, SDHC, SDHD и SDHAF2 при параганглиомах разных локализаций, ссылаясь на первоисточник - работу, выполненную группой из семи экспертов - патологоанатомов в области эндокринологии с использованием виртуальной микроскопии (Т.G. Papathomas, L. Oudijk, A. Persu, A.J. Gill, F. van Nederveen, A.S. Tischler, F. Tissier, M. Volante, X. Matias-Guiu, M. Smid, J. Favier, E. Rapizzi, R. Libe, M. Curras-Freixes, S. Aydin, T. Huynh, U. Lichtenauer, A. van Berkel, L. Canu, R. Domingues, R.J. Clifton-Bligh, M. Bialas, M. Vikkula, G. Baretton, M. Papotti, G. Nesi, C. Badoual, K. Pacak, G. Eisenhofer, H.J. Timmers, F. Beuschlein, J. Bertherat, M. Mannelli, M. Robledo, A-P. Gimenez-Roqueplo, W. NM. Dinjens, E. Korpershoek, R.R. de Krijger. SDHB/SDHA immunohistochemistry in pheochromocytomas and paragangliomas: a multicenter interobserver variation analysis using virtual microscopy: a Multinational Study of the European Network for the Study of Adrenal Tumors (ENS@T). Modern Pathology 28 (February 2015): 807-821. https://doi.org/10.1038/modpathol.2015.41). Согласно исследованию, средняя чувствительность данного подхода составила 94,23%, средняя специфичность - 84,35%. Однако эти результаты были получены для общей выборки параганглиом и феохромоцитом, в которой доля каротидных параганглиом составляла 10,5%, т.е. на его основе нельзя сделать вывод о применимости данного подхода для диагностики SDHx мутаций при КПГ.

Кен Такешима с коллегами сообщают о случае каротидной параганглиомы, которая характеризовалась слабым диффузным окрашиванием субъединицы SDHB, что было ассоциировано с наличием наследовенной мутации в соответствующем гене (K. Takeshima, Н. Ariyasu, S. Uraki, С.Kitahara, S. Morita, H. Inaba, H. Iwakura, К. Warigaya, S. Murata, Y. Yamazaki, H. Sasano, T. Akamizu. Head and Neck Paraganglioma Atypically Carrying a Succinate Dehydrogenase Subunit В Mutation (L157X). Intern Med 59, no. 9 (May 2020): 1167-1171. https://doi.org/10.2169/internalmedicine.3607-19). Это исследование касается единичного случая и также не является полноценным исследованием по оценке применимости метода ИГХ SDHB для диагностики наследственных мутаций в генах SDHx при КПГ.

В исследовании Мелани Менары с коллегами (М. Menara, L. Oudijk, С. Badoual, J. Bertherat, С. Lepoutre-Lussey, L. Amar, X. Iturrioz, M. Sibony, F. Zinzindohoue, R. de Krijger, A-P. Gimenez-Roqueplo, J. Favier. SDHD immunohistochemistry: a new tool to validate SDHx mutations in pheochromocytoma/paraganglioma J Clin Endocrinol Metab 100, no. 2, (February 2015): E287-91. https://doi.org/10.1210/ic.2014-1870) показано, что ИГХ субъединицы SDHD сукцинатдегидрогеназы демонстрирует положительное окрашивание в SDHx-мутантных параганглиомах и отрицательное в опухолях с отсутствием мутаций в генах SDHx. Возможным объяснением этому может быть то, что эпитоп SDHD маскируется в трансмембранном домене белка в нормальном состоянии, однако при нарушении SDH комплекса происходит высвобождение эпитопа, что делает его доступным для иммуногистохимического окрашивания. При этом полученные результаты справедливы для феохромоцитом и симпатических экстра-адреналовых параганглиом; КПГ не были включены в исследуемую выборку. Кроме того, для КПГ применимость метода ИГХ SDHD для предсказания мутаций в генах SDHx не подтвердилась (А.V. Snezhkina, D.V. Kalinin, V.S. Pavlov, E.N. Lukyanova, A.L. Golovyuk, M.S. Fedorova, E.A. Pudova, M.V. Savvateeva, O.A. Stepanov, A.A. Poloznikov, Т.B. Demidova, N.V. Melnikova, A.A. Dmitriev, G.S. Krasnov, A.V. Kudryavtseva. Immunohistochemistry and Mutation Analysis of Sdhx Genes in Carotid Paragangliomas. Int J Mol Sci 21, no. 18 (Sep 22 2020): 6950). http://dx.doi.org/10.3390/iims21186950).

Таким образом, иммуногистохимия SDHB может быть использована для первичной идентификации пациентов с КПГ, имеющих терминальные мутации в генах SDHx, которых рекомендуется направлять на генетическое тестирование. В том числе, этот метод выявляет патогенные мутации в гене SDHB, которые часто ассоциированы с агрессивным течением заболевания. Выявление мутаций в генах SDHx позволяет диагностировать наследственные синдромы, определять злокачественный потенциал опухоли, информация о наличии терминальных мутаций необходима для своевременного лечения других членов семьи и для планирования семьи. Кроме того, иммуногистохимический анализ является рутинным методом исследования онкологических пациентов и широко используется в клинической практике, следовательно, предлагаемый метод обладает неоспоримыми преимуществами перед остальными методиками.

Раскрытие сущности изобретения

Данное изобретение предполагает способ диагностики наследственных мутаций в генах SDHx при каротидных параганглиомах. Предложенный способ позволяет проводить диагностику наследственных мутаций в генах SDHx при КПГ, а также осуществлять прогноз течения заболевания с помощью определения патогенных мутаций в гене SDHB. Заявленный способ определения мутационного статуса генов SDHA, SDHB, SDHC и SDHD основан на иммуногистохимическом анализе экспрессии субъединицы SDHB сукцинатдегидрогеназы.

В первом аспекте способ характеризуется тем, что при диагностике наследственных мутаций в генах SDHx проводят иммуногистохимическое окрашивание субъединицы SDHB сукцинатдегидрогеназы при каротидных параганглиомах.

Во втором аспекте способ характеризуется тем, что прогнозирование течения заболевания осуществляется с помощью определения патогенных мутаций в гене SDHB, часто ассоциированных с метастазированием, методом ИГХ субъединицы SDHB с последующим генетическим тестированием на наличие мутаций в этом гене при каротидных параганглиомах.

Далее изобретение будет раскрыто подробнее со ссылками на фигуры и примеры, которые приводятся исключительно с целью иллюстрации и пояснения сущности заявленного изобретения, но которые не предназначены для ограничения объема притязаний.

Краткое описание фигур

Фигура 1. Пример окрашивания тканей каротидных параганглиом гематоксилин-эозином (увеличение 400х). На микроскопических препаратах видны гнезда опухолевых клеток (структура «zellballen»), отграниченные фиброзно-васкулярной стромой.

Фигура 2. Пример отрицательного окрашивания субъединицы SDHB, инкубированной без первичных антител, в препаратах каротидных параганглиом (негативный контроль, увеличение 400х).

Фигура 3. Примеры положительного (+), отрицательного (-) и слабого диффузного окрашивания субъединицы SDHB в препаратах каротидных параганглиом (увеличение 400х).

Фигура 4. Окрашивание субъединицы SDHB при наличии терминальной мутации в генах SDHx:

А - Негативное окрашивание субъединицы SDHB при наличии терминальной мутации в гене SDHA у больного КПГ (Пример 1). Препарат каротидной параганглиомы (увеличение 400х);

Б - Негативное окрашивание субъединицы SDHB при наличии терминальной мутации в гене SDHB у больного КПГ (Пример 2). Препарат каротидной параганглиомы (увеличение 400х);

В - Слабое диффузное окрашивание субъединицы SDHB при наличии терминальной мутации в гене SDHC у больного КПГ (Пример 3). Препарат каротидной параганглиомы (увеличение 400х);

Г - Слабое диффузное окрашивание субъединицы SDHB при наличии терминальной мутации в гене SDHD у больного КПГ (Пример 4). Препарат каротидной параганглиомы (увеличение 400х).

Осуществление изобретения

Целью данного изобретения являлось создание способа диагностики терминальных мутаций в генах SDHx при каротидных параганглиомах. Наличие мутаций определяют посредством проведения процедуры иммуногистохимического окрашивания субъединицы SDHB образцов опухолевых тканей, заключенных в парафиновые блоки, включающего стандартные этапы подготовки гистологических образцов. Отрицательное или слабое диффузное окрашивание субъединицы SDHB является индикатором наличия терминальной мутации в одном из генов SDHx.

Образцы тканей

Операционные образцы опухолевых тканей каротидных параганглиом подвергают обработке 10% раствором формалина, забуференным до рН 7-7,2, на протяжении 12-16 часов. Далее кусочки опухолевых тканей помещают в кассеты для гистологической проводки и обезвоживают в спиртах восходящей концентрации, что является стандартным этапом подготовки гистологических срезов, по следующей схеме: 1) водопроводная вода - комнатная температура (20-22°С), 30 мин., 2) изопропанол 50% - комнатная температура, 30 мин., 3) изопропанол 99,7% - комнатная температура, 30 мин., 4) изопропанол 99,7% - комнатная температура, 2 часа, 5) изопропанол 99,7% - комнатная температура, 2,5 часа, 6) изопропанол 99,7%-комнатная температура, 3 часа, 7) изопропанол 99,7% - комнатная температура, 3 часа. Этапы 3-7 проводят со сменой раствора изопропанола после каждого цикла инкубации. Обезвоженные блоки заливают парафином в два этапа: первый - в течение 2,5 часов при 60°С, и второй - в течение 5 часов при 60°С.

Для гистологической проводки используют автоматический аппарат карусельного типа STP 120 Spin Tissue Processor (Thermo Fisher Scientific, США). С фиксированных образцов опухолевых тканей подготавливают гистологические срезы толщиной 3-5 мкм с использованием роторного микротома НМ 355 S (Thermo Fisher Scientific) и помещают на предметные стекла. Срезы окрашивают гематоксилин-эозином (Н&Е) для морфологического анализа опухоли (Фигура 1.).

Иммуногистохимия

Иммуногистохимическое окрашивание осуществляют на серийных парафиновых срезах опухолевых тканей. Предварительно проводят депарафинизацию срезов ксилолом с дальнейшей регидратацией при уменьшении концентрации этилового спирта (абсолютный, 90%, 70% и 50%) и промывкой в дистиллированной воде. ИГХ субъединицы SDHB проводят минимум в трех повторах с использованием первичных моноклональных антител к SDHB - клон 21А11АЕ7 фирмы Abeam (Великобритания) на приборе Lab Vision Autostainer 360-2D (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с инструкциями производителя. Далее проводят окрашивание универсальными вторичными антителами, меченными хромогеном (3,3'-диаминобензидин, DAB) Histofine DAB-2V (Nichirei Biosciences, Япония). Дополнительно образцы окрашивают гематоксилином Майера. В качестве отрицательного контроля используют образцы, инкубированные без первичных антител (Фигура 2.). В качестве положительного внутреннего контроля используют гранулярное цитоплазматическое окрашивание субъединицы SDHB в эндотелиальных клетках. Изображения визуализируют с помощью Axio Imager 2 (Carl Zeiss Microscopy, Германия).

ИГХ окрашивание субъединицы SDHB оценивают следующим образом (Фигура 3.):

(+) положительное - гранулярное цитоплазматическое окрашивание опухолевых клеток, сравнимое с окрашиванием такой же интенсивности внутреннего положительного контроля (эндотелиальные клетки);

(-) отрицательное - полное отсутствие цитоплазматического окрашивания по сравнению с интенсивным окрашиванием внутреннего положительного контроля;

(*) слабое диффузное - равномерное цитоплазматическое окрашивание без определенной зернистости, контрастирующее с сильным зернистым окрашиванием внутреннего положительного контроля.

Опухолевые образцы, характеризующиеся отрицательным или слабым диффузным окрашиванием субъединицы SDHB, рекомендуют отправлять на генетическое тестирование. В частности, анализ мутаций в гене SDHB можно использовать для прогнозирования метастатического потенциала опухоли.

Генетический анализ мутаций в генах SDHx может быть проведен с помощью секвенирования и анализа экзома. Для этого проводят выделение ДНК из опухолевых и нормальных тканей (например, лимфатические узлы или кровь), полученных от одного и того же пациента. Для выделения ДНК из образцов, заключенных в парафиновые блоки, используют High Pure FFPET DNA Isolation Kit (Roche, Швейцария), ДНК из крови выделяют с помощью автоматической системы для выделения нуклеиновых кислот MagNA Pure Compact System (Roche) с использованием набора MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I - Large Volume (Roche) в соответствии с инструкциями производителя.

Из выделенных образцов ДНК проводят подготовку экзомных библиотек с помощью набора TruSeq Exome Library Prep Kit (Illumina, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Затем проводят высокопроизводительное секвенирование полученных библиотек на приборе NextSeq 500 System (Illumina, США) в режиме парных прочтений диной 76x2 нуклеотидов с покрытием не менее 300х для каждого образца. Далее выполняют биоинформатический анализ данных секвенирования, который включает следующие этапы: 1) оценка качества полученных прочтений с помощью FASTQC, 2) удаление последовательностей адаптеров и нуклеотидов с низким качеством с использованием Trimmomatic, 3) картирование последовательностей на референсный геном человека с использованием BWA, 4) сортировка и процессирование файлов с помощью SAMtools и picard-tools, 5) рекалибровка качества оснований с помощью GATK4 и dbSNP, 6) идентификация вариантов с использованием GATK HaplotypeCaller, 7) аннотация вариантов с помощью Annovar. Патогенность вариантов оценивают согласно критериям Американского колледжа медицинской генетики и геномики и Ассоциации молекулярной патологии (ACMG-AMP) (S. Richards, N. Aziz, S. Bale, D. Bick, S. Das, J. Gastier-Foster, W.W. Grody, M. Hegde, E. Lyon, E. Spector, K. Voelkerding, H.L. Rehm, Acmg Laboratory Quality Assurance Committee. Standards and Guidelines for the Interpretation of Sequence Variants: A Joint Consensus Recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med 17, no. 5 (May 2015): 405-24. http://dx.doi.org/10.1038/gim.2015.30).

Ниже приведены примеры определения терминальных мутаций в каждом из генов SDHx (SDHA, SDHB, SDHC и SDHD) с использованием ИГХ анализа субъединицы SDHB сукцинатдегидрогеназы у больных каротидной параганглиомой. На Фигурах 4 (А-Г) приведены микроскопические фотографии ИГХ окрашивания белка SDHB в препаратах параганглиом. Приведенные примеры предназначены для обеспечения лучшего понимания сущности заявленного изобретения, но не должны рассматриваться как ограничивающие данное изобретение.

Пример 1 - Случай каротидной параганглиомы с терминальной мутацией в гене SDHA

Женщина возрастом 40 лет обратилась в медучреждение с жалобой на наличие объемного образования шеи справа. По результатам обследования с помощью компьютерной томографии (КТ) и ультразвукового исследования (УЗИ) поставили диагноз - параганглиома головы и шеи. Во время операции опухоль локализировалась в месте бифуркации сонной артерии и была определена как каротидная параганглиома. Операционный материал отправили на гистологическое исследование, включающее ИГХ анализ экспрессии субъединицы SDHB. Опухолевую ткань и кровь передали на генетическое тестирования методом секвенирования экзома для анализа наличия наследственного варианта в генах SDHx.

Для проведения ИГХ анализа субъединицы SDHB, из опухолевых тканей, заключенных в парафиновые блоки, подготавливали серийные срезы (3-5 мкм) и размещали их на предметных стеклах с использованием роторного микротома НМ 355 S. Часть срезов окрашивали гематоксилин-эозином и проводили морфологический анализ опухоли. Затем проводили депарафинизацию неокрашенных срезов с использованием ксилола с последующей регидратацией в снижающейся концентрации этилового спирта (абсолютный, 90%, 70% и 50%) и отмывку срезов в дистиллированной воде. ИГХ осуществляли с использованием первичных моноклональных антител к субъединице SDHB (клон 21 A11AE7) с использованием Lab Vision Autostainer 360-2D. Далее проводили окрашивание вторичными антителами Histofine DAB-2V. Для окраски ядер использовали гематоксилин Майера. Слайды визуализировали с помощью микроскопа Axio Imager 2.

Результатом ИГХ исследования явилось отрицательное окрашивание субъединицы SDHB на фоне интенсивного положительного окрашивания эндотелиальных клеток, свидетельствующее о потере ее экспрессии и вероятному наличию патогенной наследственной мутации в одном из генов SDHx (Фигура 4А).

Для выявления терминальной мутации выполнили анализ экзома. Выделение ДНК проводили из опухолевой ткани и из крови. ДНК из опухоли выделяли с использованием набора High Pure FFPET DNA Isolation Kit в соответствии с инструкциями производителя. ДНК из крови выделяли с помощью автоматической системы для выделения нуклеиновых кислот MagNA Pure Compact System с использованием набора MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I - Large Volume. Количественный анализ выделенной ДНК выполняли с помощью флуориметра Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific, США). Качество ДНК оценивали методом кПЦР с использованием набора QuantumDNA Kit (Евроген, Россия).

Далее осуществляли подготовку экзомных библиотек из ДНК, выделенной из опухолевой ткани и крови, с помощью набора TruSeq Exome Library Prep Kit согласно протоколу производителя. Концентрацию подготовленных библиотек измеряли на флуориметре Qubit 2.0, оценку качества проводили на Agilent 2100 Bioanalyzer. Длина библиотек составила ~300 пар нуклеотидов.

Высокопроизводительное секвенирование экзомных библиотек проводили на приборе NextSeq 500 System в режиме парных прочтений длиной 76x2 нуклеотидов и покрытием не менее 300х. Далее выполняли биоинформатический анализ данных секвенирования. С помощью программы FASTQC проводили оценку качества полученных прочтений. Программу Trimmomatic использовали для удаления последовательностей адаптеров и нуклеотидов с качеством ниже Q20. Затем последовательности картировали на референсный геном человека GRCh37.75/hg19 с использованием программного пакета BWA. С помощью набора утилит SAMtools проводили сортировку ВАМ файлов с дальнейшим процессированием файлов с помощью инструмента picard-tools. Рекалибровку качества оснований выполняли с помощью GATK4 и dbSNP. Идентификацию вариантов проводили с использованием GATK HaplotypeCaller, аннотацию вариантов - с помощью Annovar. В VCF файлы добавляли данные о популяционной частоте (1000 Genomes Project, ЕхАС, gnomAD, Kaviar и ESP-6500), клинической значимости (ClinVar, dbSNP и COSMIC), консервативности позиции (PhastCons и PhyloP), локализации в домене белка (InterPro), а также данные предсказательных алгоритмов (SIFT, PolyPhen2, MutationTaster и LRT). Для дальнейшего анализа использовали варианты с популяционной частотой не более 1%. Патогенность вариантов оценивали согласно критериям ACMG-AMP.

В результате анализа экзома идентифицировали терминальный потенциально патогенный миссенс-вариант NM 004168: с. 792С>А, p.Phe264Leu (chr5:231012) в гене SDHA.

Таким образом, отрицательное окрашивание субъединицы SDHB явилось предиктором наличия наследственной мутации в гене SDHA.

Пример 2 - Случай каротидной параганглиомы с терминальной мутацией в гене SDHB

Мужчина возрастом 40 лет обратился в медучреждение с жалобами на головокружение, головные боли, шум в ушах, покалывание в височной области справа и наличие новообразования на шее. По результатам обследования с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ) и УЗИ поставили диагноз - параганглиома головы и шеи. Во время операции опухоль располагалась в области бифуркации сонной артерии и была определена как каротидная параганглиома. Операционный материал отправили на гистологическое исследование, включающее ИГХ анализ экспрессии субъединицы SDHB, проведенный как описано в Примере 1. Опухолевую ткань и кровь передали на генетическое тестирование методом секвенирования экзома для анализа наличия наследственного варианта в генах SDHx по методике, приведенной в Примере 1.

С помощью ИГХ исследования выявили отрицательное окрашивание субъединицы SDHB, свидетельствующее о вероятном наличии наследственной патогенной мутации в одном из генов SDHx (Фигура 4Б). С помощью анализа экзома, у этого пациента подтвердили наличие терминального патогенного варианта (донор сплайс-сайта) NC_000001.10: g.17359554C>T (chr11:17359554, rs786201063) в гене SDHB.

Пример 3 - Случай каротидной параганглиомы с терминальной мутацией в гене SDHC

Женщина возрастом 39 лет обратилась в медучреждение с жалобой на наличие объемного образования на шеи справа. По результатам обследования с помощью МРТ и УЗИ поставили диагноз - параганглиома головы и шеи. Во время операции опухоль локализировалась в месте бифуркации сонной артерии и была определена как каротидная параганглиома. Операционный материал отправили на гистологическое исследование, включающее ИГХ анализ экспрессии субъединицы SDHB, проведенный как описано в Примере 1. Опухолевую ткань и кровь передали на генетическое тестирования методом секвенирования экзома для анализа наличия наследственного варианта в генах SDHx, по аналогии с методом приведенном в Примере 1.

Методом ИГХ выявили слабое диффузное окрашивание субъединицы SDHB, свидетельствующее о вероятном наличии наследственной патогенной мутации в одном из генов SDHx (Фигура 4 В), что было подтверждено с помощью секвенирования экзома. На основе данных секвенирования, идентифицировали терминальный потенциально патогенный нонсенс-вариант NM 003001.3: c.183G>A, р.(Trp61*) (chr1:161310387) в гене SDHC.

Пример 4 - Случай каротидной параганглиомы с терминальной мутацией в гене SDHD

Женщина возрастом 50 лет обратилась в медучреждение с жалобой на наличие опухолевидных образований с обеих сторон шеи. По результатам обследования с помощью КТ и УЗИ поставили диагноз - множественная параганглиома. Опухоли удаляли в два этапа: сперва была удалена опухоль с левой стороны, которая располагалась в области бифуркации сонной артерии - каротидная параганглиома, далее были удалены две опухоли с правой стороны, локализирующиеся в области разветвления сонной артерии (каротидная параганглиома) и вдоль блуждающего нерва (вагальная параганглиома). Операционный материал отправили на гистологическое исследование, включающее ИГХ анализ экспрессии субъединицы SDHB, проведенный как описано в Примере 1. Опухолевую ткань и кровь передали на генетическое тестирования методом секвенирования экзома для анализа наличия наследственного варианта в генах SDHx, по методике, приведенной в Примере 1.

С использованием ИГХ анализа, выявили слабое диффузное окрашивание субъединицы SDHB во всех трех опухолях, свидетельствующее о вероятном наличии патогенной наследственной мутации в одном из генов SDHx (Фигура 4Г). На основе исследования экзома, идентифицировали терминальный потенциально патогенный миссенс-вариант NM 003002.3: c.305A>G, p.H102R (chr11:111959726, rs104894302) в гене SDHD.

Способ диагностики наследственных мутаций в генах SDHx при каротидных параганглиомах на основе проведения иммуногистохимического анализа экспрессии субъединицы SDHB сукцинатдегидрогеназы, включающий следующие этапы:

а) получают операционный образец опухолевой ткани от пациента;

б) фиксируют кусочки опухоли, обезвоживают и уплотняют материал для получения блока из парафина с заключенным в него образцом;

в) приготавливают срезы опухолевых тканей на предметных стеклах с помощью микротома;

г) проводят иммуногистохимию (ИГХ) субъединицы SDHB на серийных срезах опухолевых тканей;

д) интерпретируют результаты ИГХ;

- гранулярное цитоплазматическое окрашивание опухолевых клеток той же интенсивности по сравнению с окрашиванием эндотелиальных клеток оценивается как положительное;

- полное отсутствие цитоплазматического окрашивания по сравнению с интенсивным окрашиванием эндотелиальных клеток оценивается как отрицательное;

- равномерное цитоплазматическое окрашивание без определенной зернистости, контрастирующее с сильным зернистым окрашиванием эндотелиальных клеток, оценивается как слабое диффузное;

е) анализируют результаты ИГХ: отрицательное или слабое диффузное окрашивание субъединицы SDHB указывает на наличие наследственной мутации в одном из генов SDHx.