Диагностический тест для распознавания статуса курения субъекта

Группа изобретений относится к определению статуса курения. Раскрыто устройство для определения статуса курения субъекта, где указанное устройство содержит несколько разных молекул для специфического связывания, нанесенных на твердую фазу, для обнаружения присутствия двух или трех биомаркеров воздействия табачного дыма в биологическом образце, причем указанные биомаркеры воздействия табачного дыма состоят из котинина и общего 4–(метилнитрозамино)–1–(3–пиридил)–1–бутанола (NNAL); или котинина и N–ацетил–S–[2–карбоксиэтил]–L–цистеина (CEMA); или котинина, и общего NNAL, и CEMA; где указанное устройство способно отличать курильщиков традиционных сигарет в текущий момент времени от тех, кто перешел на бездымную альтернативу, где табак нагревается, а не сжигается, или от тех, кто отказался от курения. Также раскрыты устройство для определения статуса курения, содержащее резервуар для размещения указанного устройства; система для определения статуса курения; наборы для определения статуса курения и способ определения статуса курения. Группа изобретений обеспечивает возможность отличать курильщиков традиционных сигарет от тех, кто перешел на бездымную альтернативу, или от тех, кто отказался от курения. 6 н. и 10 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл., 1 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится, в целом, к области биологической диагностики. В частности, настоящее изобретение относится к способам, устройствам, системам и наборам для определения или распознавания статуса курения субъекта.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В уровне техники был предложен ряд изделий, генерирующих аэрозоль, в которых табак нагревается, а не сгорает. В нагреваемых изделиях, генерирующих аэрозоль, аэрозоль генерируется при нагревании субстрата, такого как табак. Многочисленные исследования показали, что нагревание табака до температур ниже температур пиролиза и горения может снижать уровень некоторых токсических веществ, содержащихся в сигаретном дыме, или устранять их. Нагревания табака, как правило, при температурах ниже 300°C, вместо его сжигания, достаточно для выделения никотина, но недостаточно для того, чтобы вызвать значительный пиролиз. При таких температурах состав аэрозоля становится проще, по сравнению с составом сигаретного дыма. Многие вредные и потенциально вредные составляющие (HPHC) в сигаретном дыме образуются вследствие сгорания табака. Таким образом, снижение температуры и нагревание табака вместо его сжигания могут существенно снижать уровни или устранить HPHC. Известные нагреваемые изделия, генерирующие аэрозоль, включают, например, электрически нагреваемые изделия, генерирующие аэрозоль, и изделия, генерирующие аэрозоль, в которых аэрозоль генерируется в результате передачи тепла от горючего тепловыделяющего элемента или источника тепла к физически отделенному материалу, образующему аэрозоль. Во время курения летучие соединения высвобождаются из субстрата, образующего аэрозоль, в результате теплопередачи от тепловыделяющего элемента и захватываются воздухом, втягиваемым через изделие, генерирующее аэрозоль. По мере охлаждения высвобождаемых соединений они конденсируются с образованием аэрозоля, который вдыхается потребителем. Также известны изделия, генерирующие аэрозоль, в которых никотиносодержащий аэрозоль генерируется из табачного материала, табачного экстракта или другого источника никотина без сгорания и, в некоторых случаях, без нагревания, например, за счет химической реакции.

Такие бездымные альтернативы (например, продукты, нагреваемые без сжигания), в которых табак нагревается, а не сгорает, могут предлагать курильщикам альтернативу традиционным сигаретам, что может снижать уровни вредных химических веществ, выделяемых из табака, при этом обеспечивая доставку никотина.

В данной области техники существует потребность в быстром, экономически эффективном и простом в применении диагностическом тесте для распознавания или определения статуса курения субъекта. Например, в данной области техники существует потребность в распознавании или определении курильщиков традиционных сигарет в текущий момент времени и тех, которые перешли на бездымную альтернативу или которые отказались от курения. Такой тест будет иметь множество путей применения. Например, тест можно будет применять в клинических испытаниях для выявления и скрининга субъектов на основании их статуса курения. В качестве дополнительного примера тест можно будет применять для целей страхования в качестве теста на соблюдение режима для отслеживания перехода на бездымную альтернативу и соблюдение режима перехода. Настоящее изобретение направлено на удовлетворение данных и других потребностей.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе раскрыты способы, устройства, системы и наборы, с помощью которых обнаруживают по меньшей мере два метаболита для распознавания или определения статуса курения субъекта. Метаболиты могут применяться в качестве биомаркеров воздействия табачного дыма. Например, можно распознавать курильщика традиционных сигарет в текущий момент времени и субъекта, который перешел на бездымную альтернативу (например, продукт, нагреваемый без сжигания) или который отказался от курения. В качестве дополнительного примера можно распознавать курильщика, который использует бездымную альтернативу, и субъекта, который отказался от курения. В дополнение к котинину, который больше не поддается обнаружению в моче, слюне или крови после приблизительно двух дней отказа от курения, но который все еще будет присутствовать у людей, перешедших на бездымную альтернативу, один или два других биомаркера воздействия табачного дыма можно обнаруживать в моче. Один из таких метаболитов представляет собой 4–(метилнитрозамино)–1–(3–пиридил)–1–бутанол (NNAL), являющийся метаболитом никотинпроизводного нитрозаминкетона (NNK) (также известного как 4–(метилнитрозамино)–1–(3–пиридил)–1–бутанон, специфический для табака нитрозамин), который обычно измеряют в моче при расчетном периоде полувыведения, составляющем 17 часов. Другой метаболит представляет собой 2–цианоэтилмеркаптуровую кислоту (CEMA), которая является метаболитом акрилонитрила (летучего соединения из сгораемых табачных продуктов). В определенных вариантах осуществления измеряют только котинин и общий NNAL. Другими словами, в качестве биомаркеров воздействия табачного дыма измеряют исключительно котинин и общий NNAL. Общий NNAL означает NNAL и NNAL–Gluc. В определенных вариантах осуществления измеряют только котинин и CEMA. Другими словами, в качестве биомаркеров воздействия табачного дыма измеряют исключительно котинин и CEMA. В определенных вариантах осуществления измеряют (исключительно) только котинин и общий NNAL и CEMA. Другими словами, в качестве биомаркеров воздействия табачного дыма измеряют исключительно общий NNAL и CEMA. Соответственно, в состав метаболитов, подлежащих обнаружению в качестве биомаркеров воздействия табачного дыма, входят только котинин и общий NNAL и/или CEMA. Другими словами, метаболиты, подлежащие обнаружению в качестве биомаркеров воздействия табачного дыма, представляют собой исключительно котинин и общий NNAL и/или CEMA. Данные метаболиты являются показателями статуса курения индивидуума и исчезают из мочи со временем при переходе на бездымный продукт, в то время как метаболиты никотина остаются. В одном варианте осуществления в диагностическом тесте используют мочу, такую как суточная моча. Предпочтительно диагностический тест предусматривает два или три измеряемых значения для котинина и общего NNAL и/или CEMA. Предпочтительно диагностический тест предусматривает три или четыре измеряемых значения: два или три измеряемых значения для котинина; общего NNAL и/или CEMA; а также положительный контроль для демонстрации того, что тест работает в случае субъектов, у которых в моче нет ни одного метаболита табака. Положительный контроль может представлять собой, например, креатинин или альбумин или белок, специфический для мочи, такой как белок Тамма–Хорсфолла (THP). Могут быть добавлены или включены другие формы контроля, такие как виды контроля для измерения целостности, в частности, отсутствия фальсификации образца, подлежащего тестированию, описанному в данном документе.

В одном аспекте описано устройство для определения статуса курения субъекта, где указанное устройство содержит несколько разных молекул для специфического связывания, нанесенных на твердую фазу, для обнаружения присутствия двух или трех биомаркеров воздействия табачного дыма в биологическом образце, причем указанные биомаркеры воздействия табачного дыма состоят из: (i) котинина и общего 4–(метилнитрозамино)–1–(3–пиридил)–1–бутанола (NNAL); или (ii) котинина и N–ацетил–S–[2–карбоксиэтил]–L–цистеина (CEMA); или (iii) котинина, и NNAL, и CEMA.

Предпочтительно устройство представляет собой портативное устройство для иммунного анализа с латеральным потоком, предпочтительно экспресс–тест, выполненное с возможностью осуществления конкурентного иммунного анализа.

Предпочтительно портативное устройство для иммунного анализа с латеральным потоком содержит: (i) прокладку для образца; (ii) прокладку для конъюгата и (iii) по меньшей мере одну зону обнаружения.

Предпочтительно прокладка для конъюгата содержит или состоит из меченых средств для специфического связывания, каждое из которых способно индивидуально связывать: (i) котинин и NNAL; или (ii) котинин и CEMA; или (iii) котинин, и NNAL, и CEMA, при этом предпочтительно каждое из меченых средств для специфического связывания представляет собой антитело или его фрагмент, аптамер, фотоаптамер, аффимер, белок, пептид, пептидомиметик или малую молекулу.

Предпочтительно (а) прокладка для конъюгата содержит или состоит из меченых средств для специфического связывания, нанесенных на нее, каждое из которых способно индивидуально связывать метаболиты: (i) котинин и NNAL; или (ii) котинин и CEMA; или (iii) котинин, и NNAL, и CEMA, и они способны образовывать конъюгаты из меченого средства для специфического связывания и метаболита; и (b) зона обнаружения содержит или состоит из иммобилизированных средств для специфического связывания, каждое из которых способно индивидуально связывать метаболиты.

Предпочтительно (а) прокладка для конъюгата содержит или состоит из меченого метаболита(–ов), нанесенного на нее, причем указанный меченый метаболит(–ы) состоит из: (i) меченого котинина или его аналога и меченого NNAL или его аналога; или (ii) меченого котинина или его аналога и меченого CEMA или его аналога; или (iii) меченого котинина или его аналога, и меченого NNAL или его аналога, и меченого CEMA или его аналога; и (b) зона обнаружения содержит или состоит из иммобилизированных средств для специфического связывания, каждое из которых способно индивидуально связывать: (i) меченый котинин или его аналог, и меченый NNAL или его аналог, и котинин и NNAL, которые могут присутствовать в образце; или (ii) меченый котинин или его аналог, и меченый CEMA или его аналог, и котинин и CEMA, которые могут присутствовать в образце; или (iii) меченый котинин или его аналог, и меченый NNAL или его аналог, и меченый CEMA или его аналог, и котинин, и NNAL, и CEMA, которые могут присутствовать в образце.

Предпочтительно молекулы для специфического связывания помечены окрашенными частицами, предпочтительно наночастицами золота, и где необязательно метки для каждой из молекул для специфического связывания являются одинаковыми или разными.

Предпочтительно пороговое значение составляет: (i) больше или равно приблизительно 200 нг/мл котинина в суточной моче, и больше или равно приблизительно 10 пг/мл общего NNAL в суточной моче, или больше или равно приблизительно 5 нг/мл CEMA в суточной моче; или (ii) больше или равно приблизительно 200 нг/мл котинина в суточной моче, и больше или равно приблизительно 10 пг/мл общего NNAL в суточной моче, и больше или равно приблизительно 5 нг/мл для CEMA в суточной моче.

Предпочтительно устройство приспособлено для обнаружения: (i) котинина в суточной моче в количестве приблизительно 200–800 нг/мл; или (ii) общего NNAL в суточной моче в количестве приблизительно 10–125 пг/мл в суточной моче; или (iii) CEMA в суточной моче в количестве приблизительно 5–80 нг/мл; или (iv) комбинации по меньшей мере двух из (i), (ii) и (iii).

Предпочтительно (i) видимая отметка на тестовой линии(–ях) (i) котинина и NNAL, или (ii) котинина и CEMA, или (iii) котинина, и NNAL, и CEMA в устройстве указывает на то, что порог обнаружения не превышен, и это является показателем некурящего субъекта; (ii) отсутствие видимой отметки на тестовой линии (i) котинина и NNAL, или (ii) котинина и CEMA, или (iii) котинина, и NNAL, и CEMA в устройстве указывает на то, что порог обнаружения превышен, и видимая отметка на тестовой линии (i) котинина и NNAL, или (ii) котинина и CEMA; или (iii) котинина, и NNAL, и CEMA в устройстве указывает на то, что порог обнаружения не превышен, и это является показателем того, что субъект подвергался воздействию нагретого табака; (iii) отсутствие видимой отметки на тестовой линии (i) котинина и NNAL, или (ii) котинина и CEMA, или (iii) котинина, и NNAL, и CEMA в устройстве указывает на то, что порог обнаружения превышен, и это является показателем того, что субъект подвергался воздействию сгоревшего табака.

В другом аспекте раскрыто устройство для определения статуса курения субъекта, содержащее: (а) резервуар, приспособленный для размещения устройства, описанного в данном документе; (b) устройство формирования изображения, приспособленное для получения по меньшей мере одного цифрового изображения устройства; и (c) процессор, приспособленный для обработки по меньшей мере одного цифрового изображения.

В другом аспекте раскрыта система, содержащая: (a) компьютерное хранилище данных, которое содержит или состоит из эталонного значения или значения на исходном уровне для содержания котинина и одного или более из общего NNAL и CEMA, причем указанные эталонное значение или значение на исходном уровне отражают известное содержание метаболита для определения статуса курения субъекта; и (b) компьютерную систему, запрограммированную для доступа к хранилищу данных и для применения информации из хранилища данных в комбинации с информацией о содержании метаболитов в образце от субъекта, для определения статуса курения субъекта.

В другом аспекте раскрыт набор, содержащий устройство, описанное в данном документе, и необязательно комплект инструкций по работе с набором, и необязательно комплект инструкций для определения статуса курения субъекта.

В другом аспекте раскрыт способ определения статуса курения субъекта, предусматривающий применение устройства, описанного в данном документе.

В другом аспекте раскрыт способ определения статуса курения субъекта, причем указанный способ предусматривает: (а) определение количеств (i) котинина и NNAL, или (ii) котинина и CEMA, или (iii) котинина, и NNAL, и CEMA в образце, где указанные метаболиты состоят из котинина, и NNAL, и CEMA, предусматривающее приведение образца в контакт со средством для специфического связывания котинина, NNAL и CEMA и обнаружение связывания; и (b) определение статуса курения субъекта; где если количество котинина составляет от приблизительно 10,6 до 41,5 нг/мл в суточной моче в день 5 периода исследования, то это является показателем человека, отказавшегося от курения; и если количество общего NNAL составляет от приблизительно 37,7 пг/мл до 115 пг/мл в суточной моче, а количество CEMA составляет от приблизительно 31,1 нг/мл до 90 нг/мл в суточной моче в день 5 периода исследования, то это является показателем того, что субъект подвергался воздействию сгоревшего табака; и если количество котинина составляет от приблизительно 652,5 до 1115 нг/мл или более в суточной моче в день 5 периода исследования, то это является показателем того, что субъект подвергался воздействию нагретого табака.

Также раскрыт способ отслеживания прогресса в изменении статуса курения у субъекта, предусматривающий: (i) осуществление способа, описанного в данном документе, в отношении по меньшей мере двух биологических образцов от субъекта, где каждый образец отобран в разные моменты времени; и (ii) сравнение измерений, выполненных в каждый из разных моментов времени, где изменение в измерениях с течением времени указывает на то, что статус курения субъекта изменился с течением времени.

Также раскрыт способ определения статуса курения субъекта, предусматривающий: (i) получение данных, отражающих значения содержания двух или трех метаболитов в образце от субъекта, причем указанные метаболиты состоят из котинина и одного или более из общего NNAL и CEMA; (ii) осуществление доступа к хранилищу данных на компьютере, причем указанное хранилище данных содержит эталонное значение или значение на исходном уровне для содержания котинина и общего NNAL и/или CEMA, которые являются диагностическими для определения статуса курения субъекта; и (iii) сравнение данных, полученных на (i), с эталонным значением или значением на исходном уровне в хранилище данных на компьютере, упомянутом в (ii), с определением тем самым статуса курения субъекта.

Также раскрыт способ распознавания или определения статуса курения субъекта, причем указанный способ предусматривает: (i) получение или обеспечение образца от субъекта; (ii) определение количеств двух или трех метаболитов в образце, где указанные метаболиты состоят из котинина и общего NNAL и/или CEMA, путем приведения образца в контакт с антителом к котинину и антителом к общему NNAL и/или антителом к CEMA или их фрагментом, и обнаружение связывания между котинином и общим NNAL и/или CEMA и антителами и (iii) определение статуса курения субъекта на основании обнаружения присутствия котинина и общего NNAL и/или CEMA в образце.

Дополнительный аспект относится к способу определения статуса курения субъекта и введению одного или более видов терапии для сокращения курения традиционных сигарет, причем указанный способ предусматривает: (i) получение или обеспечение образца от субъекта; (ii) определение того, присутствуют ли в образце два или три метаболита, причем указанные метаболиты состоят из котинина и общего NNAL и/или CEMA; (iii) определение статуса курения субъекта и, (iv) в зависимости от результата, полученного на (iii), введение эффективного количества одного или более видов терапии для сокращения курения традиционных сигарет.

Дополнительный аспект относится к способу диагностики и сокращения курения традиционных сигарет у субъекта, причем указанный способ предусматривает: (i) получение образца от субъекта; (ii) обнаружение того, присутствует ли котинин и одно или более из общего NNAL и CEMA в образце; и (iii) введение субъекту, который диагностирован как «курильщик», эффективного количества одного или более видов терапии для сокращения курения традиционных сигарет у субъекта.

Соответствующим образом, способы по настоящему изобретению можно квалифицировать как служащие для in vitro или ex vivo применения, поскольку в них используются конкретные стадии in vitro или ex vivo обработки и анализа образца, полученного от субъекта.

Способ можно осуществлять в отношении субъекта в двух или более последовательных моментах времени, и можно сравнивать соответствующие результаты в указанных последовательных моментах времени, посредством чего можно определять присутствие или отсутствие изменения между обнаружением котинина, общего NNAL и/или CEMA в указанных последовательных моментах времени. При таком использовании способ можно применять для отслеживания изменения в обнаружении котинина, общего NNAL и/или CEMA у субъекта с течением времени. Например, отклонение в содержании метаболита(–ов) в образце от субъекта по сравнению с исходным или эталонным значением может являться показателем статуса курения субъекта.

В определенных вариантах осуществления определение того, какое действие должно предприниматься, например, врачом или компанией, с учетом указанного обнаружения, осуществляется с помощью компьютера. В определенных вариантах осуществления компьютер может применяться для сообщения результатов и/или действия, которое должно предприниматься.

В определенных вариантах осуществления может быть разработан алгоритм, основанный на сумме индивидуальных оценок от 0 до 1, присваиваемых уровню каждого конкретного метаболита, измеренного в образце от субъекта. Если указанная сумма превышает определенный порог, тогда можно предсказывать статус курения. В некоторых вариантах осуществления вес оценки каждого индивидуального метаболита можно корректировать для улучшения производительности алгоритма.

Также предусмотрен набор для определения статуса курения субъекта, содержащий или состоящий из: (i) первого устройства, приспособленного для обнаружения присутствия биомаркера воздействия табачного дыма в биологическом образце, где указанный биомаркер воздействия табачного дыма состоит из котинина;(ii) второго устройства, приспособленного для обнаружения присутствия биомаркера воздействия табачного дыма в биологическом образце, где указанный биомаркер воздействия табачного дыма состоит из NNAL; и/или (iii) третьего устройства, приспособленного для обнаружения присутствия биомаркера воздействия табачного дыма в биологическом образце, где указанный биомаркер воздействия табачного дыма состоит из CEMA; и необязательно комплекта инструкций для работы с набором и необязательно комплекта инструкций для определения статуса курения субъекта.

НЕКОТОРЫЕ ПРЕИМУЩЕСТВА

В настоящем изобретении предусмотрен быстрый, экономически эффективный и простой в применении диагностический тест для определения, расшифровки или распознавания статуса курения субъекта.

Настоящее изобретение может характеризоваться улучшенной дискриминационной способностью по сравнению с другими тестами для определения статуса курения субъекта.

Настоящее изобретение может характеризоваться улучшенной дискриминационной способностью для определения статуса курения у определенных видов субъектов в популяции. Например, дискриминационная способность может быть более высокой в определенных этнических группах или у людей определенного возраста.

Преимущественно, настоящее изобретение может обеспечивать одновременное обнаружение общего NNAL в моче, CEMA в моче и котинина в моче. В частности, настоящее изобретение может обеспечивать одновременное обнаружение общего NNAL в моче в количестве приблизительно 10–125 пг/мл в суточной моче, и CEMA в моче в количестве приблизительно 5–80 нг/мл в суточной моче и котинина в моче в количестве приблизительно 200–800 нг/мл для определения или распознавания статуса курения субъекта. Настоящее изобретение может характеризоваться улучшенной дискриминационной способностью для определения статуса курения субъекта, который использует курительные продукты, содержащие и не содержащие ментол. Ментоловые сигареты обычно изготавливают аналогично сигаретам, не содержащим ментол, при этом ментол добавляют на любой из нескольких стадий в процессе производства. Например, ментол может быть получен из дистиллированного масла мяты полевой или получен синтетическим путем. Ментоловая сигарета, как правило, характеризуется содержанием ментола, составляющим по меньшей мере 0,3% по весу. Ментоловые сигареты с более низким содержанием смол могут иметь уровни ментола до 2%. По сравнению с табачными смесями для сигарет, не содержащих ментол, ментоловая сигарета чаще всего будет содержать больше табака огневой сушки, чем табака Берлей, и меньше табака восточного типа.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фигура 1. CEMA: нижняя часть прямоугольника представляет собой первый квартиль (значение, ниже которого лежат 25% наблюдений), верхняя часть представляет собой третий квартиль (значение, ниже которого лежат 75% наблюдений), а средняя полоса представляет собой медиану наблюдений. Усы продолжаются до минимального наблюдаемого значения и максимального наблюдаемого значения, соответственно.

Фигура 2. Общий NNAL: нижняя часть прямоугольника представляет собой первый квартиль (значение, ниже которого лежат 25% наблюдений), верхняя часть представляет собой третий квартиль (значение, ниже которого лежат 75% наблюдений), а средняя полоса представляет собой медиану наблюдений. Усы продолжаются до минимального наблюдаемого значения и максимального наблюдаемого значения, соответственно.

Фигура 3. Свободный котинин: нижняя часть прямоугольника представляет собой первый квартиль (значение, ниже которого лежат 25% наблюдений), верхняя часть представляет собой третий квартиль (значение, ниже которого лежат 75% наблюдений), а средняя полоса представляет собой медиану наблюдений. Усы продолжаются до минимального наблюдаемого значения и максимального наблюдаемого значения, соответственно.

Фигура 4. Пример экспресс–теста, содержащего тестовую полоску с латеральным потоком, для определения статуса курения субъекта. В этом иллюстративном варианте осуществления для определения трех разных статусов курения субъекта применяют три разных экспресс–теста. В одном варианте осуществления экспресс–тест является достаточно чувствительным для обнаружения общего NNAL в моче в количестве 10–125 пг/мл в суточной моче и CEMA в моче в количестве 5–80 нг/мл в суточной моче. В другом варианте осуществления экспресс–тест является достаточно чувствительным для обнаружения общего NNAL в моче в количестве 10–125 пг/мл в суточной моче, и CEMA в моче в количестве 5–80 нг/мл в суточной моче, и котинина в моче в количестве приблизительно 200–800 нг/мл. О статусе курения можно сделать заключение с применением экспресс–теста.

Фигура 5. Пример экспресс–теста, содержащего тестовую полоску с латеральным потоком, для определения статуса курения субъекта. В этом иллюстративном варианте осуществления для определения трех разных статусов курения субъекта применяют единый экспресс–тест. Единый экспресс–тест содержит пористый элемент в форме прокладки для образца и пористый элемент в форме одной или более абсорбирующих прокладок на противоположных концах тестовой полоски с латеральным потоком, содержащейся в устройстве. Кроме того, он включает пористый элемент в форме прокладки для конъюгата, смежный и расположенный ниже по ходу потока (в направлении потока образца) от пористого элемента для образца, содержащий конъюгат коллоидного золота (CGC) и котинина, CGC и общего NNAL и CGC и CEMA. При необходимости могут применяться другие типы меток. Зона обнаружения, расположенная смежно и ниже по ходу потока от пористого элемента, включает три последовательно расположенные тестовые линии. Одна первая тестовая линия 1 может содержать моноклональное антитело к котинину или его фрагмент. Такая тестовая линия может быть выполнена так, чтобы указывать на то, что порог обнаружения превышен (например, исчезает или появляется в зависимости от формата анализа) при пороговом количестве, которое больше или равно приблизительно 200 нг/мл. Одна следующая вторая тестовая линия 2 может содержать моноклональное антитело к NNAL или его фрагмент. Такая тестовая линия может быть выполнена так, чтобы указывать на то, что порог обнаружения превышен (например, исчезает или появляется в зависимости от формата анализа) при пороговом количестве, которое больше или равно приблизительно 10 нг/мл. Одна третья тестовая линия 3 может содержать моноклональное антитело к CEMA или его фрагмент. Такая тестовая линия может быть выполнена так, чтобы указывать на то, что порог обнаружения превышен (например, исчезает или появляется в зависимости от формата анализа) при пороговом количестве, которое больше или равно приблизительно 5 нг/мл. При необходимости также может быть включена контрольная линия. При необходимости можно применять другие типы средств для специфического связывания.

Фигура 6. Пример результатов интерпретации теста, которые можно получить с применением экспресс–теста на фиг. 5 в конкурентном формате. Иллюстративные примеры интерпретации, которые могут быть связаны со статусом курения субъекта, являются следующими: прямоугольник с надписью «Отрицательный» = видимые отметки на тестовых линиях котинина, тестовых линиях NNAL, тестовых линиях CEMA указывают на то, что порог обнаружения не превышен, и это является показателем субъекта, который отказался от курения; прямоугольник с надписью «Положительный по котинину» = отсутствие видимой отметки на линии котинина указывает на то, что порог обнаружения превышен; видимая отметка на линии NNAL, видимая отметка на линии CEMA указывает на то, что порог обнаружения не превышен, и это является показателем того, что субъект подвергался воздействию только нагретого табака (аэрозоля); прямоугольник с надписью «Положительный по котинину и общему NNAL и/или положительный по котинину, общему NNAL и CEMA» = отсутствие видимых отметок на линии котинина и общего NNAL указывает на то, что порог обнаружения превышен, или отсутствие видимых отметок на линии котинина, и общего NNAL, и CEMA указывает на то, что порог обнаружения превышен, и это является показателем того, что субъект подвергался воздействию сгоревшего табака.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Заголовки разделов, используемые в настоящем изобретении, служат для организационных целей и не предусматриваются как ограничивающие. Если не определено иное, то все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, какое обычно понимает средний специалист в данной области техники. В случае противоречий данный документ, включая определения, будет иметь преимущественную силу. Предпочтительные способы и материалы описаны ниже, хотя способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в данном документе, могут быть применены при осуществлении настоящего изобретения на практике или его тестировании. Материалы, способы и примеры, раскрытые в данном документе, являются лишь иллюстративными и не предусматриваются как ограничивающие. В контексте данного описания формы единственного числа распространяются на формы единственного и множественного числа, если из контекста явно не следует иное.

Термин «и/или» означает (а) или (b) или и (а), и (b).

Термины «содержащий», «содержит» и «в состав входят», используемые в данном документе, являются синонимами «включающий», «включает» или «содержащий в себе», «содержит в себе» и являются включающими или неограничивающими и не исключают дополнительных, не перечисленных представителей, элементов или стадий способа. Термин «состоящий из» означает, что дополнительные компоненты исключены и имеются только упомянутые элементы и ничего больше.

Упоминание числовых диапазонов с помощью конечных точек включает все числа и дробные значения, включенные в соответствующие диапазоны, а также упомянутые конечные точки.

Предусматривается, что термин «приблизительно», используемый в данном документе в отношении измеряемого значения, такого как параметр, количество, временной срок и т. п., охватывает изменчивость указанного значения и отклонения от него, в частности отклонения на +/–10% или менее, предпочтительно на +/–5% или менее, более предпочтительно на +/–1% или менее и еще более предпочтительно на +/–0,1% или менее от указанного значения, если такие изменения являются допустимыми при осуществлении настоящего изобретения. Следует понимать, что значение, к которому относится модификатор «приблизительно», также конкретно и предпочтительно раскрыто само по себе.

Принимая во внимание, что термин «один или более», как, например, один или более членов из группы членов, является ясным per se, с целью дополнительного пояснения термин охватывает, inter alia, ссылку на любой из указанных членов или на любые два или более из указанных членов, как, например, любые ≥3, ≥4, ≥5, ≥6 или ≥7 и т. д. из указанных членов и вплоть до всех указанных членов.

Термин «курильщик» является показателем того, что субъект курит табачные продукты в течение последних 5 лет. Курильщик обычно будет курильщиком, который курит в текущий момент времени. Предпочтительно человек, который курит, выкурил по меньшей мере 100 табачных продуктов в течение его/ее жизни и может курить табак каждый день или в некоторые дни (не ежедневно) в текущий момент времени.

Используемый в данный момент термин «некурящий человек» обозначает субъекта, который ранее был курильщиком, но не курил табачные продукты в течение последних 5 лет. Будет считаться, что некурящий человек отказался от курения.

Термин «метаболит» является широко распространенным в данной области техники и в широком смысле может обозначать любое вещество, образующееся в результате метаболизма или метаболического процесса. Иными словами, метаболит представляет собой конечный продукт, образуемый в ходе метаболизма. Термин также охватывает обнаруживаемую порцию метаболита, качественная и/или количественная оценка которого у субъекта, отдельно или в комбинации с другими данными, является информативной с точки зрения статуса субъекта, касающегося соблюдения режима перехода. Как правило, метаболиты представляют собой малые молекулы, происходящие из сгораемых табачных продуктов. Отслеживание метаболитов с течением времени inter alia может позволить определять прогресс соблюдения режима перехода у субъекта с течением времени.

Используемый в данном документе термин «субъект», как правило, обозначает людей, но может также охватывать ссылку на животных, отличных от человека, предпочтительно теплокровных животных, более предпочтительно живородящих животных, еще более предпочтительно млекопитающих, таких как, например, приматы, отличные от человека, грызуны, псовые, кошачьи, лошади, овцы, свиньи и т. п.

Используемые в данном документе термины «образец» или «биологический образец» включают любую биологическую пробу, полученную от субъекта. Образцы могут включать без ограничения цельную кровь, плазму, сыворотку, эритроциты, лейкоциты (например, мононуклеарные клетки периферической крови), слюну, мочу, стул (т. е. фекалии), слезы, пот, кожное сало, аспират из соска, смыв протоков, экссудаты опухолей, синовиальную жидкость, спинномозговую жидкость, лимфу, тонкоигольный пунктат, амниотическую жидкость, любую другую биологическую жидкость, обрезки ногтей, клеточные лизаты, продукты клеточной секреции, воспалительную жидкость, вагинальные выделения или типы биопсии, такие как предпочтительно типы биопсии плаценты. Предпочтительные образцы могут включать образцы, содержащие любой один или более метаболитов, изложенных в данном документе, в обнаруживаемых количествах. В одном варианте осуществления образец может представлять собой цельную кровь или ее фракционированный компонент, такой как, например, плазма, сыворотка или клеточный осадок. Предпочтительно образец можно легко получить с помощью минимально инвазивных способов, позволяющих обнаружить, удалить или выделить указанный образец из субъекта. Образцы также могут включать образцы тканей и типы биопсии, гомогенаты тканей и т. п. Термин «плазма» обычно обозначает практически бесцветную водянистую жидкость крови, которая не содержит клеток, а в которой клетки крови (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты и т. д.) в норме суспендированы, содержащую питательные вещества, сахара, белки, минеральные вещества, ферменты и т. д. В наиболее подходящем варианте осуществления образец представляет собой мочу, такую как суточная моча, поскольку ее легко получать с помощью неинвазивного способа. Сбор суточной мочи осуществляется путем сбора мочи субъекта в контейнер в течение полного 24–часового периода.

Молекулу, такую как метаболит, «измеряют» в образце в том случае, когда присутствие или отсутствие и/или содержание указанной молекулы или указанной группы молекул обнаруживают или определяют в образце, предпочтительно фактически ч исключением других молекул. Например, метаболит можно измерять с помощью лабораторных тестов, описанных в данном документе.

Термины «содержание», «количество» и «уровень» являются синонимами и в целом хорошо известны в данной области техники. Что касается метаболитов, молекул или аналитов, в частности, термины могут относиться к определению абсолютного содержания метаболита, молекулы или аналита в образце или к определению относительного содержания метаболита, молекулы или аналита в образце, т. е. относительно другого значения, такого как значение на исходном уровне или эталонное значение, изложенные в данном документе, или диапазон значений, являющийся показателем экспрессии метаболита, молекулы или аналита на исходном уровне. Такие значения или диапазоны могут быть получены на основе измерений у одного субъекта или группы субъектов. Абсолютное содержание метаболита, молекулы или аналита в образце преимущественно может быть выражено в виде массы или в виде молярного количества, или чаще в виде концентрации, например, масса на объем или моль на объем.

Термин «пороговое значение» в контексте обнаружения означает точку, при которой некоторое или определенное количество, или содержание, или концентрация достигаются или превышаются. Например, тестовая линия на устройстве для иммунного анализа может быть выполнена с возможностью продуцирования визуального изменения при достижении или превышении порогового количества, или содержания или концентрации.

Термин «малая молекула» относится к соединениям, предпочтительно органическим соединениям, размер которых сопоставим с размерами органических молекул, обычно используемых в фармацевтических препаратах. Термин исключает биологические макромолекулы (например, белки, нуклеиновые кислоты и т. д.). Размер предпочтительных малых органических молекул составляет до приблизительно 5000 Да, например до приблизительно 4000, предпочтительно до 3000 Да, более предпочтительно до 2000 Да, еще более предпочтительно до приблизительно 1000 Да, например, до приблизительно 900, 800, 700, 600 или приблизительно до 500 Да.

Используемый в данном документе термин «выделенный» предпочтительно может также охватывать термин «очищенный». Используемый в данном документе термин «очищенный» по отношению к метаболиту не требует абсолютной чистоты. Вместо этого, это означает, что такой метаболит(–ы) находится (находятся) в дискретном окружении, в котором его количество (в целях удобства выраженное в виде массы, веса или концентрации) относительно других молекул больше, чем в биологическом образце. Дискретное окружение обозначает единую среду, такую как, например, единый раствор, гель, осадок, лиофилизат и т. д. Очищенные метаболиты можно получать с помощью известных способов, в том числе, например, хроматографии, препаративного электрофореза, центрифугирования, осаждения, аффинной очистки и т. д.

Термин «специфически связывать», используемый на протяжении всей настоящей заявки, означает, что средство (обозначенное в данном документе также как «средство для специфического связывания») связывается с одной или более требуемыми молекулами с фактическим исключением других молекул, которые являются случайными или неродственными, и необязательно с фактическим исключением других молекул, которые являются родственными по структуре. Термин «специфически связывать» не обязательно подразумевает, что средство связывается исключительно с его предусматриваемой мишенью(–ями). Например, можно сказать, что средство специфически связывается с представляющей интерес мишенью(–ями), если его аффинность в отношении такой предусматриваемой мишени(–ей) в условиях связывания в по меньшей мере приблизительно 2 раза больше, предпочтительно в по меньшей мере приблизительно 5 раз больше, более предпочтительно в по меньшей мере приблизительно 10 раз больше, еще более предпочтительно в по меньшей мере приблизительно 25 раз больше, еще более предпочтительно в по меньшей мере приблизительно 50 раз больше и еще более предпочтительно в по меньшей мере приблизительно 100 раз или больше, чем его аффинность в отношении нецелевой молекулы. Примером средства для специфического связывания является антитело или его фрагмент, аптамер, аффимер, фотоаптамер, белок, пептид, пептидомиметик или малая молекула. Предпочтительными средствами для специфического связывания являются антитела или их фрагменты, аптамеры или аффимеры.

Используемый в данном документе термин «антитело» используется в его самом широком смысле и обычно относится к любому средству для иммунологического связывания. Термин охватывает интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, поливалентные (например, 2–валентные, 3–валентные или антитела с большим числом валентностей) и/или мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела или антитела с большим числом специфичностей), образованные из по меньшей мере двух интактных антител, и фрагменты антител, если они проявляют требуемую биологическую активность (в частности, способность к специфическому связыванию представляющего интерес антигена), а также поливалентные и/или мультиспецифические комплексы из таких фрагментов. Термин «антитело» включает не только антитела, полученные с помощью способов, предусматривающих иммунизацию, но также подразумевает любой полипептид, например полипептид, полученный за счет рекомбинантной экспрессии, разработанный, чтобы охватывать по меньшей мере одну область, определяющую комплементарность (CDR), способную специфически связываться с эпитопом на представляющем интерес антигене. Следовательно, термин применяется к таким молекулам независимо от того, получены ли они in vitro или in vivo.

Термин «аптамер» относится к однонитевой или двухнитевой олиго–ДНК, олиго–РНК или олиго–ДНК/РНК или любому их аналогу, которые могут специфически связываться с молекулой–мишенью, такой как пептид. Преимущественно, аптамеры могут демонстрировать довольно высокую специфичность и аффинность (например, K_A составляет примерно 1×10⁹ M^–1) в отношении своих мишеней. Получение аптамеров описано inter alia в патенте США № 5270163; Ellington & Szostak 1990 (Nature 346: 818–822); Tuerk & Gold 1990 (Science 249: 505–510); или «The Aptamer Handbook: Functional Oligonucleotides and Their Applications», Klussmann, ed., Wiley–VCH 2006, ISBN 3527310592. Термин «фотоаптамер» относится к аптамеру, который содержит одну или более фотореактивных функциональных групп, которые могут ковалентно связываться или сшиваться с молекулой–мишенью.

Что касается «периода исследования», измерения на исходном уровне проводят, разрешая субъекту курить выбранную им марку традиционных сигарет в течение 2 дней. По истечении данного 2–дневного периода следующим шагом субъект принимает решение продолжать курить традиционные сигареты, перейти на бездымную альтернативу или отказаться от курения. Затем начинается период исследования. Термин «аффимер» относится к высокостабильному белку, который связывает свою молекулу–мишень со специфичностью и аффинностью, аналогичным таковым у антител. Они представляют собой сконструированные, отличные от антител связывающие белки, разработанные для имитации способностей к распознаванию, свойственных моноклональным антителам. Например, размер этих сконструированных белков может составлять около 12–14 кДа, и они основаны на консенсусной последовательности цистатина А из растений (Avacta, Кембридж, Великобритания). См., например, Tiede et al., eLife (2017) 6: e24903; WO2006/131749, WO2009/136182 and WO2014/125290.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Заголовки разделов, используемые в настоящем изобретении, служат для организационных целей и не предусматриваются как ограничивающие.

Метаболиты

Соответствующее содержание или измерения для метаболитов, применяемых в качестве биомаркеров воздействия табачного дыма, описанных в данном документе, можно оценивать одновременно, отдельно или индивидуально. Предпочтительно метаболиты, описанные в данном документе, оценивают фактически одновременно или одновременно. Предпочтительно метаболиты, описанные в данном документе, оценивают одновременно в один и тот же момент времени. Количества метаболита(–ов) могут применяться для установления того, является ли субъект курильщиком традиционных сигарет в текущий момент времени. Количества метаболита(–ов) могут применяться для установления того, является ли субъект потребителем бездымной альтернативы. Количества метаболита(–ов) могут применяться для установления того, отказался ли субъект от курения. В целях удобства это может выполняться в едином тесте. В конкретном варианте осуществления количества метаболитов преимущественно могут применяться для установления профиля перехода для субъекта, чтобы распознавать курильщиков традиционных сигарет в текущий момент времени и людей, которые перешли на бездымную альтернативу или которые отказались от курения. Динамику соблюдения режима перехода можно оценивать с течением времени для отслеживания прогресса динамики перехода.

Метаболиты могут содержать, или состоять, или состоять практически изкотинина и общего NNAL, или котинина и CEMA, или котинина, и общего NNAL, и CEMA. Предпочтительно метаболитами могут быть исключительно котинин и общий NNAL, или исключительно котинин и CEMA, или исключительно котинин, и общий NNAL, и CEMA. В соответствии с этим, метаболиты состоят из котинина и общего NNAL, или состоят из котинина и CEMA, или состоят из котинина, и общего NNAL, и CEMA. В определенных варианты осуществления предусматривается, что охватываются изомерные формы (такие как стереоизомеры, и/или геометрические, и/или оптические изомеры и их смеси), химические производные, миметики, варианты, сольваты и соли этих метаболитов.

В дополнение к обнаружению метаболитов, которые используются в качестве биомаркеров воздействия табачного дыма, более общие характеристики образца можно оценивать одновременно, отдельно и/или индивидуально. Например, некоторые характеристики можно определять для тестирования фальсификации или разбавления образца. Например, в случае образца мочи можно измерять такие характеристики, как одно или более из pH, удельного веса, уровней окислителей, нитритов, глутаральдегида и креатинина. Эти более общие характеристики можно обнаруживать с помощью устройства для определения статуса курения субъекта, например, путем введения в устройство дополнительной тестовой полоски с латеральным потоком и т. п.

Котинин

Никотин представляет собой третичный амин, который состоит из пиридинового и пирролидинового кольца. Он в большой степени подвергается эффекту «первого прохождения», при котором печень метаболизирует 80–90% вдыхаемого количества. Основным метаболитом никотина является котинин; при этом никотин–1'–N–оксид представляет собой второстепенный метаболит (только 4–7% никотина усваивается курильщиками). Превращение никотина в котинин включает две стадии: 1) активацию за счет CYP2A6 и 2) окисление под действием цитоплазматической альдегидоксидазы. Котинин также интенсивно метаболизируется до транс–3'–гидроксикотинина. Наиболее распространенным метаболитом у мышей является транс–3'–гидроксикотинин, на долю которого приходится 40–60%, тогда как на сам котинин приходится только около 15% дозы никотина. Он также представляет собой основной метаболит никотина, обнаруживаемый в моче курильщиков. Уровни котинина в различных биологических жидкостях широко используются для оценки потребления никотина у потребителей табака. Практическая значимость котинина в качестве количественного маркера потребления никотина ограничивается индивидуальной изменчивостью в процентной доле превращения никотина в котинин и в скорости выведения котинина.

Общая скорость клиренса никотина составляет около 1200 мл мин–1. Метаболизм котинина происходит намного медленнее, при этом общий клиренс составляет в среднем 45 мл мин–1. Общий клиренс транс–3’–гидроксикотинина также довольно медленный, составляющий приблизительно 82 мл мин–1. Внутривенная инфузия никотина у взрослых курильщиков, которые отказались от курения, показала, что период полувыведения составляет 2,3 часа для никотина, 17,5 часа для котинина и 6,6 часа для транс–3’–гидроксикотинина.

Котинин имеет период полувыведения in vivo около 20 часов и может быть обнаружен в течение нескольких дней после употребления табака. Уровень котинина в крови, слюне и моче пропорционален величине воздействия табачного дыма. Уровни котинина <10 нг/мл являются показателем отсутствия активного курения. Значения от 10 нг/мл до 100 нг/мл являются показателем легкого курения или умеренного воздействия. Уровни выше 300 нг/мл являются показателем статуса заядлого курильщика, потребляющего более 20 сигарет в день. В моче значения от 11 нг/мл до 30 нг/мл являются показателем легкого или умеренного курения, а уровни у активных курильщиков составляют приблизительно 500 нг/мл или более. В слюне значения от 1 нг/мл до 30 нг/мл являются показателем легкого или умеренного курения, а уровни у активных курильщиков составляют приблизительно 100 нг/мл или более. Способы обнаружения котинина включают колориметрические способы, газовую хроматографию (GC) и газовую хроматографию–масс–спектрометрию (GC–MS), высокоэффективную жидкостную хроматографию и радиоиммунный анализ (RIA). При выполнении измерений эквивалента котинина можно применять цианид и реагент, образующий хромофор, для определения пиридиновых производных (в частности, метаболитов никотина). Другие способы обнаружения котинина включают применение антитела к котинину или его фрагмента, которые могут быть преобразованы в различные форматы, в том числе биспецифическое антитело. Антитело к котинину или его фрагмент можно приспособить к различным форматам, в том числе использовать в иммуноблоттинге, иммуноферментном анализе, иммуноаффинной очистке и иммуносцинтиграфии in vivo и т. п., как описано в данном документе. Способы измерения котинина хорошо описаны в уровне техники, например, в BMB Rep. (2014) Mar; 47(3): 130–134; J Clin Diagn Res. (2016) Mar; 10(3): ZE04–ZE06 и Ther Drug Monit. (2009) Feb; 31(1): 14–30.

Предпочтительно устройства и способы по настоящему изобретению выполнены с возможностью обнаружения котинина в моче в диапазоне от приблизительно 11 нг/мл до приблизительно 500 нг/мл, соответственно, в суточной моче через 5 дней.

Предпочтительно устройства, способы и наборы по настоящему изобретению выполнены с возможностью обнаружения (свободного) котинина в диапазоне от приблизительно 459 нг/мл до приблизительно 1350 нг/мл или приблизительно 339–959 нг/мл или приблизительно 546–1160 нг/мл. Предпочтительно эти значения определяют в моче, предпочтительно в суточной моче. Предпочтительно устройства, способы и наборы по настоящему изобретению выполнены с возможностью обнаружения (свободного) котинина в диапазоне от приблизительно 200 нг/мл до приблизительно 800 нг/мл. Предпочтительно эти значения определяют в моче, предпочтительно в суточной моче.

Предпочтительно устройства, способы и наборы по настоящему изобретению выполнены с возможностью обнаружения (свободного) котинина в диапазоне от приблизительно 11 нг/мл до приблизительно 30 нг/мл. Предпочтительно эти значения определяют в моче, предпочтительно в суточной моче.

Предпочтительно устройства, способы и наборы по настоящему изобретению выполнены с возможностью визуального отображения результата. Результат может определяться с применением прибора или визуально. В определенных вариантах осуществления результат определяют визуально. В одном варианте осуществления устройства, способы и наборы выполнены с возможностью визуального отображения результата, когда превышен пороговый уровень котинина в суточной моче, то есть уровень больше или равен 200 нг/мл. В другом варианте осуществления устройства, способы и наборы выполнены с возможностью визуального отображения результата, когда превышен пороговый уровень котинина в суточной моче, то есть уровень больше или равен 300 нг/мл, или 400 нг/мл, или 500 нг/мл, или 600 нг/мл.

NNAL

NNAL представляет собой метаболит 4–(метилнитрозамино)–1–(3–пиридил)–1–бутанона (NNK). Исходные уровни экскретируемого общего NNAL (NNAL и NNAL–Gluc) в суточной моче курильщиков, как правило, находятся в диапазоне 1,1–2,9 нмоль/сутки (т. е. 230–607 нг/сутки). Ни NNAL, ни NNN в принципе не поддаются обнаружению в моче некурящих людей, кроме тех случаев, когда они используют другие табачные продукты, никотинзаместительные продукты или подвергаются воздействию дыма при пассивном курении, в этих случаях уровни находятся в диапазоне 0,1 нмоль.

В исследовании с участием курильщиков, потребляющих 20 CPD или более, они должны были выкуривать ровно 20, 15, 5 или 0 CPD в течение 5–дневного периода изоляции. Результаты показали дозозависимое соотношение между числом сигарет и уровнями NNAL в моче (т. е. 624, 549, 422 и 311 нг/сутки, соответственно).

Вследствие длительного периода полувыведения NNAL, который, по оценкам, составляет от 10 до 45 дней, уровни NNAL в краткосрочных исследованиях по прекращению курения/отказу от курения не достигают уровней некурящих людей и уменьшаются примерно в 3–4 раза в исследованиях, длящихся от 3 до 8 дней. В исследовании по прекращению курения, длившемся до 56 дней, уровни общего NNAL достигли уровней, описанных для некурящих людей, в конце исследования (т. е. 0,13 нмоль/сутки в день 56 по сравнению с 2,70 нмоль/сутки на исходном уровне) и, по–видимому, оставались выше этих уровней через 28 и 42 дня (т. е. 0,26 и 0,2 нмоль/сутки, соответственно).

NNAL может быть обнаружен с применением любых традиционных способов, известных из уровня техники, в том числе LC–MS/MS или GC/MS и т. п. Кроме того, NNAL может быть обнаружен с применением антитела или его фрагмента, которые специфически связываются с NNAL, необязательно связанным с иммуногенным носителем. Такие антитела описаны в WO2009/010296.

В Haziza et al. (2017) Data in Brief 10, 283–293, описаны уровни общего NNAL в суточной моче. Измерения на исходном уровне проводят, позволяя субъекту курить выбранную им марку традиционных сигарет в течение 2 дней. По истечении данного 2–дневного периода затем субъект принимает решение: (i) продолжать курить традиционные сигареты, (ii) перейти на бездымную альтернативу или (iii) отказаться от курения. После 5 дней периода исследования затем собирают суточную мочу для измерения уровня метаболита в ней. У потребителей традиционных сигарет общий NNAL на исходном уровне составляет 84–131 пг/мг креатинина (105 пг/мг креатинина). В день 5 он увеличивается до 85–133 пг/мг креатинина (107 пг/мг креатинина). Это отражает изменение от –2,8% до 10,5% (среднее увеличение на 3,9%) по сравнению исходным уровнем.

У потребителей бездымных альтернатив общий NNAL на исходном уровне составляет 95–129 пг/мг креатинина (111 пг/мг креатинина). В день 5 он уменьшается до 42–58 пг/мг креатинина (49 пг/мг креатинина). Это отражает изменение от –57% до –51% (среднее уменьшение на –54%) по сравнению с исходным уровнем.

У людей, отказавшихся от курения, общий NNAL на исходном уровне составляет 94–150 пг/мг креатинина (119 пг/мг креатинина). В день 5 он уменьшается до 31–54 пг/мг креатинина (41 пг/мг креатинина). Это отражает уменьшение от –67% до –61% (среднее уменьшение на –63,9%) по сравнению с исходным уровнем.

Предпочтительно устройства, способы и наборы по настоящему изобретению выполнены с возможностью обнаружения общего NNAL в диапазоне от приблизительно 10 пг/мл до приблизительно 125 пг/мл.

Предпочтительно устройства, способы и наборы по настоящему изобретению выполнены с возможностью обнаружения общего NNAL в диапазоне от приблизительно 30 пг/мг креатинина до приблизительно 160 пг/мг креатинина.

Предпочтительно устройства, способы и наборы по настоящему изобретению выполнены с возможностью обнаружения общего NNAL в диапазоне от приблизительно 85–133 пг/мг креатинина или приблизительно 85–125 пг/мг креатинина. Предпочтительно устройства, способы и наборы по настоящему изобретению выполнены с возможностью обнаружения общего NNAL в количестве приблизительно 107 пг/мг креатинина. Эти количества являются диагностическими для потребителей традиционных сигарет.

Предпочтительно устройства, способы и наборы по настоящему изобретению выполнены с возможностью обнаружения общего NNAL в диапазоне приблизительно 42–58 пг/мг креатинина. Предпочтительно устройства, способы и наборы по настоящему изобретению выполнены с возможностью обнаружения общего NNAL в количестве 49 пг/мг креатинина. Эти количества являются диагностическими для потребителей бездымных альтернатив.

Предпочтительно устройства, способы и наборы по настоящему изобретению выполнены с возможностью обнаружения общего NNAL в диапазоне приблизительно 31–54 пг/мг креатинина. Предпочтительно устройства, способы и наборы по настоящему изобретению выполнены с возможностью обнаружения общего NNAL в количестве 41 пг/мг креатинина. Эти количества являются диагностическими для тех, кто отказался от курения.

Предпочтительно устройства, способы и наборы по настоящему изобретению выполнены с возможностью обнаружения общего NNAL в диапазоне от приблизительно 33 нг/мл до приблизительно 132 пг/мл, или от приблизительно 33 нг/мл до приблизительно 125 пг/мл, или от приблизительно 2,5 до 46 пг/мл, или от приблизительно 10 до 46 пг/мл, или от приблизительно 37 до 115 нг/мл, или от приблизительно 17–41 нг/мл. Предпочтительно эти значения определяют в моче, предпочтительно в суточной моче. Предпочтительно устройства, способы и наборы по настоящему изобретению выполнены с возможностью визуального отображения результата. Результат может определяться с применением прибора или визуально. В определенных вариантах осуществления результат определяют визуально.

В определенных вариантах осуществления результат определяют визуально. В одном варианте осуществления устройства, способы и наборы выполнены с возможностью визуального отображения результата, когда превышен пороговый уровень NNAL в суточной моче, то есть уровень больше или равен 10 пг/мл. В другом варианте осуществления устройства, способы и наборы выполнены с возможностью визуального отображения результата, когда превышен пороговый уровень NNAL в суточной моче, то есть уровень больше или равен 10 пг/мл, или 20 пг/мл, или 30 пг/мл, или 40 пг/мл.

CEMA

CEMA представляет собой специфический биомаркер воздействия акролеина в моче. Основным путем, с помощью которого акролеин выводится из организма человека, является конъюгация с глутатионом (GSH) в печени с последующим ферментативным расщеплением и N–ацетилированием с образованием S–(3–оксопропил)–N–ацетилцистеина (OPMA) в почке. Восстановление альдегидной группы OPMA приводит к образованию 3HPMA, основного метаболита воздействия акролеина в моче, а окисление альдегидной группы OPMA приводит к образованию N–ацетил–S–[2–карбоксиэтил]–L–цистеина (CEMA) в качестве второстепенного метаболита.

Было показано, что экскреция CEMA в моче систематически выше у курильщиков, чем у некурящих людей. Диапазоны содержания у некурящих людей обычно ниже 2 нг/мл, а у курильщиков повышены до уровней от 20 до 205 нг/мл. В исследовании у курильщиков наблюдали экскрецию 187 ± 181 мкг/л CEMA (среднее значение ± стандартное отклонение) или 184 мкг/л CEMA, в то время как у некурящих людей наблюдали экскрецию только 4,6 ± 35 мкг/л или 1,9 мкг/л.

У курильщиков, потребляющих 20 CPD или более, которые должны были выкуривать ровно 20, 15, 5 или 0 CPD в течение 5–дневного периода изоляции, показано дозозависимое соотношение между количеством сигарет и уровнем CEMA в моче (т. е. 218,0, 168,0, 93,2 и 38,3 мкг/сутки, соответственно). Исследования по прекращению курения в течение 5–8 дней показали значимое снижение уровни CEMA в моче в приблизительно 7–10 раз.

Из уровня техники известны различные способы измерения CEMA, такие как ультравысокоэффективная жидкостная хроматография, сопряженная с тандемной масс–спектрометрией с ионизацией электрораспылением. Определение CEMA в моче также было описано в Anal. Bioanal. Chem. (2009) 393:969–981 и Anal Biochem. (2012) 430(1):75–82. Кроме того, CEMA можно обнаруживать с применением антитела, такого как моноклональное антитело, или его фрагмента, которые специфически связываются с CEMA, необязательно связанным с иммуногенным носителем. Например, можно применять способы, описанные в WO2009/010296.

В Haziza et al. (2017) В Data in Brief 10, 283–293 описаны уровни CEMA в суточной моче. Измерения на исходном уровне проводят, позволяя субъекту курить выбранную им марку традиционных сигарет в течение 2 дней. По истечении данного 2–дневного периода затем субъект должен принять решение продолжать курить традиционные сигареты, перейти на бездымную альтернативу или отказаться от курения. После 5 дней периода исследования затем собирают суточную мочу для измерения уровня метаболита в ней.

У потребителей традиционных сигарет общий CEMA на исходном уровне составляет 83–115 нг/мг креатинина (98 нг/мг креатинина). В день 5 он увеличивается до 85–115 нг/мг креатинина (99,5 нг/мг креатинина). Это отражает изменение от –4% до 12% (среднее увеличение на 4,2%) по сравнению исходным уровнем.

У потребителей бездымных альтернатив CEMA на исходном уровне составляет 85–112 нг/мг креатинина (98 нг/мг креатинина). В день 5 он уменьшается до 11–15 нг/мг креатинина (13 нг/мг креатинина). Это отражает изменение от –87% до –85% (среднее уменьшение на –86%) по сравнению с исходным уровнем.

У людей, отказавшихся от курения, CEMA на исходном уровень составляет 89–119 нг/мг креатинина (103 нг/мг креатинина). В день 5 он уменьшается до 10–15 нг/мг креатинина (12 нг/мг креатинина). Это отражает уменьшение от –88% до –85% (среднее уменьшение на –86%) по сравнению с исходным уровнем.

Предпочтительно устройства и способы по настоящему изобретению выполнены с возможностью обнаружения CEMA в диапазоне от приблизительно 11 нг/мг креатинина до приблизительно 120 нг/мг креатинина.

Предпочтительно устройства и способы по настоящему изобретению выполнены с возможностью обнаружения CEMA в диапазоне от приблизительно 11 нг/мг креатинина до приблизительно 80 нг/мг креатинина.

Предпочтительно устройства и способы по настоящему изобретению выполнены с возможностью обнаружения CEMA в диапазоне от приблизительно 5 нг/мг креатинина до приблизительно 80 нг/мг креатинина.

Эти количества являются диагностическими для потребителей традиционных сигарет, и измеряемые значения получают на основе суточной мочи после 5 дней периода исследования.

Предпочтительно устройства, способы и наборы по настоящему изобретению выполнены с возможностью обнаружения CEMA в диапазоне приблизительно 11–15 пг/мг креатинина. Предпочтительно устройства, способы и наборы по настоящему изобретению выполнены с возможностью обнаружения CEMA в количестве 13 нг/мг креатинина. Эти количества являются диагностическими для потребителей бездымных альтернатив, и измеряемые значения получают на основе суточной мочи после 5 дней периода исследования.

Предпочтительно устройства, способы и наборы по настоящему изобретению выполнены с возможностью обнаружения CEMA в диапазоне приблизительно 10–15 пг/мг креатинина. Предпочтительно устройства, способы и наборы по настоящему изобретению выполнены с возможностью обнаружения CEMA в количестве 12 нг/мг креатинина. Эти количества являются диагностическими для тех, кто отказался от курения, и измеряемые значения получают на основе суточной мочи после 5 дней периода исследования.

Предпочтительно устройства, способы и наборы по настоящему изобретению выполнены с возможностью обнаружения CEMA в диапазоне от приблизительно 32 нг/мл до приблизительно 98 нг/мл, или приблизительно 7–17 нг/мл, или приблизительно 31–90 нг/мл, или приблизительно 5–12 нг/мл. Предпочтительно эти значения определяют в моче, предпочтительно в суточной моче.

Предпочтительно устройства, способы и наборы по настоящему изобретению выполнены с возможностью визуального отображения результата. Результат может определяться с применением прибора или визуально. В определенных вариантах осуществления результат определяют визуально.

В определенных вариантах осуществления результат определяют визуально. В одном варианте осуществления устройства, способы и наборы выполнены с возможностью визуального отображения результата, когда превышен пороговый уровень CEMA в суточной моче, то есть уровень больше или равен 10 пг/мл. В другом варианте осуществления устройства, способы и наборы выполнены с возможностью визуального отображения результата, когда превышен пороговый уровень CEMA в суточной моче, то есть уровень больше или равен 20 пг/мл, 30 пг/мл, 40 пг/мл или 50 пг/мл.

Количества метаболитов

Как описано в данном документе, количества метаболитов можно измерять, чтобы расшифровать статус курения субъекта, с применением данных, представленных в таблице 1, например, в день 5.

Например, если количество общего NNAL в суточной моче составляет приблизительно 37–115 пг/мл в день 5 периода исследования, и/или количество CEMA в суточной моче составляет приблизительно 31–90 нг/мл в день 5 периода исследования, и/или количество котинина в суточной моче составляет приблизительно 456–1300 нг/мл в день 5 периода исследования, то это является показателем того, что субъект является потребителем традиционных сигарет. Измерения на исходном уровне проводят, позволяя субъекту курить выбранную им марку традиционных сигарет в течение 2 дней. По истечении данного 2–дневного периода затем субъект принимает решение продолжать курить традиционные сигареты, перейти на бездымную альтернативу или отказаться от курения согласно своим предпочтениям. После 5 дней периода исследования затем собирают суточную мочу для измерения уровня метаболитов в ней.

В качестве дополнительного примера, если количество общего NNAL в суточной моче составляет приблизительно 17–40 пг/мл в день 5 периода исследования, и/или количество CEMA в суточной моче составляет приблизительно 5–11 нг/мл в день 5 периода исследования, и/или количество котинина в суточной моче составляет приблизительно 10–42 нг/мл в день 5 периода исследования, то это является показателем того, что субъект является потребителем бездымных альтернатив. Измерения на исходном уровне проводят, позволяя субъекту курить выбранную им марку традиционных сигарет в течение 2 дней. По истечении данного 2–дневного периода затем субъект принимает решение продолжать курить традиционные сигареты, перейти на бездымную альтернативу или отказаться от курения согласно своим предпочтениям. После 5 дней периода исследования затем собирают суточную мочу для измерения уровня метаболитов в ней.

В качестве дополнительного примера, если количество общего NNAL в суточной моче составляет приблизительно 17–40 пг/мл в день 5 периода исследования, и/или количество CEMA в суточной моче составляет приблизительно 4–15 нг/мл в день 5 периода исследования, и/или количество котинина в суточной моче составляет приблизительно 10–42 нг/мл в день 5 периода исследования, то это является показателем того, что субъект отказался от курения. Измерения на исходном уровне проводят, позволяя субъекту курить выбранную им марку традиционных сигарет в течение 2 дней. По истечении данного 2–дневного периода затем субъект принимает решение продолжать курить традиционные сигареты, перейти на бездымную альтернативу или отказаться от курения согласно своим предпочтениям. После 5 дней периода исследования затем собирают суточную мочу для измерения уровня метаболитов в ней.

С учетом указанных выше количеств метаболитов, которые являются диагностическими для статуса курения, способы, устройства и наборы выполнены так, чтобы можно было измерять такие диагностические уровни. Предпочтительно способы, устройства и наборы выполнены таким образом, чтобы такие диагностические уровни можно было измерять в быстром и простом в применения формате. В определенных вариантах осуществления способы, устройства и наборы выполнены с возможностью указывать, что количество общего NNAL в суточной моче составляет приблизительно 37–115 пг/мл в день 5 периода исследования, и/или количество CEMA в суточной моче составляет приблизительно 31–90 нг/мл в день 5 периода исследования, и/или количество котинина в суточной моче составляет приблизительно 456–1300 нг/мл в день 5 периода исследования, поскольку это будет диагностическим для субъекта, являющегося потребителем традиционных сигарет.

В определенных вариантах осуществления способы, устройства и наборы выполнены с возможностью указывать, что количество общего NNAL в суточной моче составляет приблизительно 17–40 пг/мл в день 5 периода исследования, и/или количество CEMA в суточной моче составляет приблизительно 5–11 нг/мл в день 5 периода исследования, и/или количество котинина в суточной моче составляет приблизительно 10–42 нг/мл в день 5 периода исследования, это указывает на то, что субъект является потребителем бездымных альтернатив.

В определенных вариантах осуществления способы, устройства и наборы выполнены с возможностью указывать, что количество общего NNAL в суточной моче составляет приблизительно 17–40 пг/мл в день 5 периода исследования, и/или количество CEMA в суточной моче составляет приблизительно 4–15 нг/мл в день 5 периода исследования, и/или количество котинина в суточной моче составляет приблизительно 10–42 нг/мл в день 5 периода исследования, поскольку это будет диагностическим для субъекта, который отказался от курения.

В одном иллюстративном формате анализа могут быть выполнены три индивидуальных теста, соответствующие одному тесту, который является диагностическим для субъекта, являющегося потребителем традиционных сигарет, одному тесту, который является диагностическим для субъекта, являющегося потребителем бездымных альтернатив, и одному тесту, который является диагностическим для субъекта, который отказался от курения. Одним иллюстративным форматом теста является портативное устройство для иммунного анализа с латеральным потоком, такое как экспресс–тест, в котором образец, подлежащий тестированию, проверяют с помощью трех различных портативных устройств для иммунного анализа с латеральным потоком, каждое из которых выполнено с возможностью диагностирования каждого из трех разных статусов курения. В качестве альтернативы, все три теста могут быть объединены на одном портативном устройстве для иммунного анализа с латеральным потоком.

В предпочтительном варианте осуществления CEMA и котинин могут гарантировать разграничение курильщиков традиционных сигарет и людей, отказавшихся от курения, после 2 дней, при этом специфичность и чувствительность составляют по меньшей мере 75%.

В день 2 уровни CEMA предпочтительно в моче, более предпочтительно в суточной моче у курильщиков традиционных сигарет составляют от приблизительно 32 нг/мл до приблизительно 98 нг/мл.

В день 2 уровни котинина у курильщиков традиционных сигарет составляют от приблизительно 459 нг/мл до приблизительно 1350 нг/мл. Общий NNAL обеспечивает такой же уровень дискриминации от дня 5 до дня 30. От дня 5 до дня 30 уровни общего NNAL предпочтительно в моче, более предпочтительно в суточной моче у курильщиков традиционных сигарет составляют от приблизительно 33 пг/мл до приблизительно 132 пг/мл.

В день 2 уровни CEMA предпочтительно в моче, более предпочтительно в суточной моче у людей, отказавшихся от курения, составляют приблизительно 7–17 нг/мл.

В день 2 уровни котинина предпочтительно в моче, более предпочтительно в суточной моче у людей, отказавшихся от курения, составляют приблизительно 339–959 нг/мл.

От дня 5 до дня 30 уровни общего NNAL предпочтительно в моче, более предпочтительно в суточной моче у людей, отказавшихся от курения, составляют приблизительно 2,5–46 пг/мл.

Распознавание потребителей бездымных альтернатив и курильщиков традиционных сигарет можно осуществлять на основании CEMA и общего NNAL после дня 5, при этом специфичность и чувствительность составляют по меньшей мере 75%.

В день 5 уровни CEMA предпочтительно в моче, более предпочтительно в суточной моче у курильщиков традиционных сигарет составляют от приблизительно 31 до 90 нг/мл.

В день 5 уровни общего NNAL предпочтительно в моче, более предпочтительно в суточной моче у курильщиков традиционных сигарет составляют от приблизительно 37 до 115 нг/мл.

В день 5 уровни CEMA предпочтительно в моче, более предпочтительно в суточной моче у потребителей бездымных альтернатив составляют приблизительно 5–12 нг/мл.

В день 5 уровни общего NNAL предпочтительно в моче, более предпочтительно в суточной моче у потребителей бездымных альтернатив составляют приблизительно 17–41 нг/мл.

Распознавание потребителей бездымных альтернатив и людей, отказавшихся от курения, можно осуществлять на основании свободного котинина после 2 дней (при этом специфичность и чувствительность составляют по меньшей мере 75%).

В день 2 свободный котинин предпочтительно в моче, более предпочтительно в суточной моче у потребителей бездымных альтернатив составляет приблизительно 546–1160 нг/мл.

В день 2 свободный котинин предпочтительно в моче, более предпочтительно в суточной моче у людей, отказавшихся от курения, составляет приблизительно 128–313 нг/мл.

В одном варианте осуществления, если количество котинина составляет от приблизительно 10,6 до 41,5 нг/мл в суточной моче день в 5 периода исследования, то это является показателем человека, отказавшегося от курения; и, если количество общего NNAL составляет от приблизительно 37,7 пг/мл до 115 пг/мл в суточной моче, а количество CEMA составляет от приблизительно 31,1 нг/мл до 90 нг/мл в суточной моче в день 5 периода исследования, то это является показателем того. что субъект подвергался воздействию сгоревшего табака; и если количество котинина составляет от приблизительно 652,5 до 1115 нг/мл или более в суточной моче в день 5 периода исследования, то это является показателем того, что субъект подвергался воздействию нагретого табака.

Эти значения можно оценить на основании данных, представленных в таблице 1 и на фигурах 1–3.

Эталонные значения метаболитов

Эталонные значения могут быть использованы для сравнения количеств одного или более метаболитов, обнаруженных у субъекта, с известными эталонными значениями для определения статуса курения субъекта. Значение выше или ниже эталонного значения или такое же как эталонное значение может указывать на то, что пороговое значение превышено. Например, значение выше или ниже значения на исходном уровне может указывать на то, что пороговое значение превышено.

Изменение от –2,8% до 10,5% (среднее увеличение на 3,9%) общего NNAL в суточной моче после 5 дней периода исследования по сравнению с исходным уровнем является показателем потребителя традиционных сигарет.

Изменение от –57% до –51% (среднее уменьшение на –54%) общего NNAL в суточной моче после 5 дней периода исследования по сравнению с исходным уровнем является показателем потребителя бездымных альтернатив.

Уменьшение от –67% до –61% (среднее уменьшение на –63,9%) общего NNAL в суточной моче после 5 дней периода исследования по сравнению с исходным уровнем является показателем человека, отказавшегося от курения.

Изменение от –4% до 12% (среднее увеличение на 4,2%) уровней CEMA в суточной моче после 5 дней периода исследования по сравнению с исходным уровнем является показателем потребителя традиционных сигарет.

Изменение от –87% до –85% (среднее уменьшение на –86%) уровней CEMA в суточной моче после 5 дней периода исследования по сравнению с исходным уровнем является показателем потребителя бездымных альтернатив.

Уменьшение от –88% до –85% (среднее уменьшение на –86%) уровней CEMA в суточной моче после 5 дней периода исследования по сравнению с исходным уровнем является показателем человека, отказавшегося от курения.

Эталонные значения могут устанавливаться либо в рамках (т. е их установление составляет стадию), либо отдельно (т. е. их установление не составляет стадию) способов и путей применения, изложенных в данном документе. Соответственно, любой из способов или путей применения, изложенных в данном документе, может предусматривать стадию установления необходимого эталонного значения. Уменьшение на 1,5–18% уровней CEMA предпочтительно в моче, более предпочтительно в суточной моче в день 2 по сравнению с исходным уровнем является показателем курильщика традиционных сигарет.

От уменьшения на 16% до увеличения на 6% уровней свободного котинина предпочтительно в моче, более предпочтительно в суточной моче в день 2 по сравнению с исходным уровнем является показателем курильщика традиционных сигарет.

От уменьшения на 20% до увеличения на 6% общего NNAL предпочтительно в моче, более предпочтительно в суточной моче в день 5 по сравнению с исходным уровнем является показателем курильщика традиционных сигарет. От уменьшения на 29% до увеличения на 17,5% общего котинина, предпочтительно в моче, более предпочтительно в суточной моче в день 30 по сравнению с исходным уровнем является показателем курильщика традиционных сигарет.

Уменьшение на 79–80% уровней CEMA предпочтительно в моче, более предпочтительно в суточной моче в день 2 по сравнению с исходным уровнем является показателем человека, отказавшегося от курения.

Уменьшение на 74–78% уровней котинина предпочтительно в моче, более предпочтительно в суточной моче в день 2 по сравнению с исходным уровнем является показателем человека, отказавшегося от курения.

Уменьшение на 56–67% общего NNAL в день 5 по сравнению с исходным уровнем является показателем человека, отказавшегося от курения. Уменьшение на 68–72% общего NNAL предпочтительно в моче, более предпочтительно в суточной моче в день 30 по сравнению с исходным уровнем является показателем человека, отказавшегося от курения.

Уменьшение на 9,5% – 20,6% уровня CEMA предпочтительно в моче, более предпочтительно в суточной моче в день 5 по сравнению с исходным уровнем является показателем потребителя традиционных сигарет.

От уменьшения на 19% до увеличения на 5% уровней общего NNAL предпочтительно в моче, более предпочтительно в суточной моче в день 5 по сравнению с исходным уровнем является показателем курильщика традиционных сигарет.

Уменьшение на 83% – 84% уровней CEMA предпочтительно в моче, более предпочтительно в суточной моче в день 5 по сравнению с исходным уровнем является показателем потребителя бездымных альтернатив.

Уменьшение на 55% – 58% уровней общего NNAL предпочтительно в моче, более предпочтительно в суточной моче в день 5 по сравнению с исходным уровнем является показателем потребителя бездымных альтернатив.

Уменьшение на 74–77% свободного котинина предпочтительно в моче, более предпочтительно в суточной моче в день 2 по сравнению с исходным уровнем является показателем человека, отказавшегося от курения.

Уменьшение на 0,3% – 4% свободного котинина предпочтительно в моче, более предпочтительно в суточной моче в день 2 по сравнению с исходным уровнем является показателем потребителя бездымных альтернатив.

Уменьшение на 74–78% свободного котинина предпочтительно в моче, более предпочтительно в суточной моче в день 2 по сравнению с исходным уровнем является показателем человека, отказавшегося от курения.

Эти значения рассчитывают на основании данных, представленных в таблице 1 и на фигурах 1–3.

Нормализация по креатинину

В некоторых вариантах осуществления, например, если требуется количественный результат, а также для обеспечения контроля нормальной функции почек, способ по настоящему изобретению может предусматривать измерения креатинина, и значения метаболитов, таких как NNAL и CEMA, нормализуют по отношению к креатинину в моче. Такая нормализация не требуется для полуколичественного или качественного теста. Поскольку портативное устройство для иммунного анализа с латеральным потоком, такое как экспресс–тест, как правило, сообщает полуколичественный или качественный результат, то в этих вариантах осуществления настоящего изобретения нормализация по креатинину не будет требоваться. Более того, даже если требуется количественный результат, применение креатининового контроля не всегда является существенно важным или необходимым, поскольку были получены эталонные значения креатинина в образцах мочи (см., например, Occupational Medicine (2011), том 61, выпуск 5, стр. 349–353).

Обнаружение метаболитов

Количество, или содержание, или уровни метаболита(–ов) можно измерять с помощью любой подходящей методики, например, которая может быть из уровня техники и описана в данном документе. Например, можно использовать связывающие средства, способные специфически связываться с соответствующими метаболитами. Связывающие средства могут представлять собой inter alia антитело или его фрагмент, аптамер, аффимер, фотоаптамер, белок, пептид, пептидомиметик или малую молекулу. Например, можно использовать технологию иммунного анализа, или способ на основе масс–спектрометрического анализа, или способ на основе хроматографии, или комбинацию указанных способов.

В определенных вариантах осуществления присутствие и/или содержание любого одного или более метаболитов можно измерять с применением технологии иммунного анализа. Из уровня техники известны различные виды технологии иммунного анализа. В одном формате метаболит(–ы) можно конъюгировать с меченым реагентом для обнаружения, и он конкурирует за специфическое связывание со средством для специфического связывания. Присутствие или отсутствие метаболита(–ов) в образце определяют по отсутствию или отсутствию видимого (или измеримого) сигнала, соответственно. В другом формате меченый реагент для обнаружения связывается с метаболитом(–ами), образуя комплекс, и комплекс иммобилизируется на твердой подложке с помощью средства для специфического связывания. Присутствие или отсутствие метаболита(–ов) в жидком образце определяют по присутствию или отсутствию видимого (или измеряемого) сигнала. Различные устройства хорошо известны из уровня техники и дополнительно описаны в данном документе. Такие устройства обычно подходят для индивидуального и домашнего применения, поскольку они просты в применении и быстро обеспечивают результаты, которые могут быть видны невооруженным глазом.

При некоторых обстоятельствах для определения присутствия и/или содержания метаболита(–ов) могут потребоваться более сложные устройства, например, если интерпретация с помощью невооруженного глаза либо невозможна, либо порождает неопределенность. Такие устройства могут включать резервуар, приспособленный для размещения иммунохроматографического устройства, устройство формирования изображения, приспособленное для получения по меньшей мере одного цифрового изображения зоны выявления устройства, процессор, приспособленный для обработки по меньшей мере одного цифрового изображения, и средства для сообщения результата качественной и/или количественной оценки. Такое устройство описано в WO2016/075405, где раскрыта система для качественной и/или количественной оценки по меньшей мере одного метаболита, который, вероятно, содержится в жидком образце, нанесенном на иммунохроматографическое устройство. Система оценки содержит считывающее устройство и устройство для анализа, которые могут быть структурно отделены друг от друга. Считывающее устройство содержит резервуар, приспособленный для размещения иммунохроматографического устройства, и устройство формирования изображения для получения по меньшей мере одного цифрового изображения его области отображения. Устройство для анализа может дополнительно содержать процессор, приспособленный для обработки по меньшей мере одного цифрового изображения, и который подходит для качественной и/или количественной оценки по меньшей мере одного метаболита, который может содержаться в жидком образце. Устройство для анализа может дополнительно содержать средства для вывода результата оценки. Система оценки может дополнительно содержать устройство, приспособленное для передачи по меньшей мере одного цифрового изображения, полученного от считывающего устройства, на удаленное устройство для анализа, например, через телекоммуникационную сеть. Считывающее устройство может представлять собой портативное устройство. Устройство формирования изображения может содержать оптический (или фотографический) датчик, аналого–цифровой преобразователь и модуль обработки, содержащий процессор и компьютерную программу, которая может быть приспособлена для получения цифрового изображения из данных, поступающих из преобразователя. Оптический датчик может представлять собой светочувствительный электронный компонент для преобразования электромагнитного излучения в аналоговый электрический сигнал. Полученный сигнал может быть оцифрован аналого–цифровым преобразователем, а затем обработан модулем обработки с получением цифрового изображения, соответствующего зоне выявления иммунохроматографического устройства. Устройство, приспособленное для передачи по меньшей мере одного цифрового изображения, может содержать проводные или беспроводные средства, которые способны передавать по меньшей мере одно цифровое изображение от считывающего устройства. Цифровое изображение, полученное с помощью считывающего устройства, может быть передано на удаленное устройство для анализа, такое как специализированный компьютерный сервер. Во время работы считывающее устройство может быть сопряжено с передающим устройством для обеспечения обмена данными между ними. Образец, подлежащий анализу, можно наносить на иммунохроматографическое устройство и инкубировать в течение достаточного периода времени. Затем считывающее устройство может получать цифровое изображение от иммунохроматографического устройства для передачи на передающее устройство. Затем цифровое изображение может быть передано с помощью передающего устройства на устройство для анализа. Каждое цифровое изображение, которое получено устройством для анализа, может быть обработано для анализа.

В неограничивающих примерах в технологии иммунного анализа используются технологии твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), радиоиммунного анализа (RIA), флуоресцентного иммунного анализа, хемилюминесцентного иммунного анализа, иммунного анализа DRI, количественного иммунного анализа, иммунного анализа с латеральным потоком, микрофлюидного иммунного анализа, иммунного анализа с агглютинацией, предпочтительно используется ELISA. В одном варианте осуществления предпочтительным является применение иммунного анализа с латеральным потоком. В другом варианте предпочтительным является применение иммунного анализа с латеральным потоком в конкурентном формате. В качестве альтернативы или дополнения присутствие и/или содержание любого одного или более метаболитов, изложенных в данном документе, можно измерять с применением методик, основанных на антителах или хроматографии, с применением анализов конкурентного связывания и/или с применением дериватизирующих и/или содержащих краситель средств. В предпочтительных вариантах осуществления присутствие и/или содержание любого одного или более метаболитов, изложенных в данном документе, можно измерять с применением связывающего средства, способного специфически связываться с соответствующими маркерами, в предпочтительных, но не ограничивающих примерах, с применением аптамера, антитела или его фрагмента, аффимера, фотоаптамера, белка, пептида, пептидомиметика или малой молекулы, предпочтительно с применением аптамера, аффимера или антитела, более предпочтительно с применением антитела или его фрагмента, или аффимера.

Связывающее средство

Предпочтительно средство для специфического связывания может связываться с его предполагаемой мишенью(–ями), при этом константа аффинности (K_A) такого связывания K_A≥ 1×10⁶ M^–1, более предпочтительно K_A≥ 1×10⁷ M^–1, еще более предпочтительно K_A≥ 1×10⁸ M^–1, даже более предпочтительно K_A≥ 1×10⁹ M^–1 и предпочтительней всего K_A≥ 1×10¹⁰ M^–1 или K_A≥ 1×10¹¹ M^–1, где K_A = [SBA_T]/[SBA][T], SBA обозначает средство для специфического связывания, T обозначает предполагаемую мишень. Определение K_A можно выполнять с помощью способов, известных из уровня техники, таких как, например, применение равновесного диализа и анализа с использованием графика Скэтчарда.

Антитела

Антитела можно применять для обнаружения одного или более метаболитов, описанных в данном документе. Антитело может представлять собой антитело, принадлежащее к любому из классов IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и предпочтительно является антителом из класса IgG. Антитело может представлять собой поликлональное антитело, например, антисыворотку или иммуноглобулины, очищенные из нее (например, аффинно–очищенные). Антитело может представлять собой моноклональное антитело или смесь моноклональных антител. Моноклональные антитела могут нацеливаться на конкретный антиген или конкретный эпитоп в пределах антигена с большей селективностью и воспроизводимостью. В качестве примера, а не ограничения, моноклональные антитела могут быть получены с помощью способа на основе гибридомы, впервые описанного Kohler et al. 1975 (Nature 256: 495), или могут быть получены с помощью способов на основе рекомбинантной ДНК (например, описанных в патенте США № 4816567). Моноклональные антитела также могут быть выделены из фаговых библиотек антител, например, с применением методик, описанных Clackson et al. 1991 (Nature 352: 624–628) и Marks et al. 1991 (J Mol Biol 222: 581–597).

Антитела могут представлять собой фрагменты антител. «Фрагменты антител» содержат часть интактного антитела, содержащую его антигенсвязывающую или вариабельную область. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2, Fv и scFv; диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител и мультивалентные и/или полиспецифические антитела, образованные из фрагмента(–ов) антител, например, диатела, триатела и мультитела. Предусматривается, что вышеуказанные обозначения Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv и т. д. употребляются в их общепризнанном значении.

Термин «антитело» включает антитела, происходящие от любого вида животных, предпочтительно вида позвоночных животных, в том числе, например, птиц и млекопитающих, или содержащие одну или более частей, полученных от таких видов. Без ограничения антитела могут быть получены от курицы, индейки, гуся, утки, цесарки, перепела или фазана. Также без ограничения антитела могут быть получены от человека, грызунов (например, мыши, крысы и т. д.), осла, кролика, козы, овцы, морской свинки, верблюда (например, Camelus bactrianus и Camelus dromaderius), ламы (например, Lama paccos, Lama glama или Lama vicugna) или лошади.

Специалисту в данной области будет понятно, что антитело может включать одну или более аминокислотных делеций, добавок и/или замен (например, консервативных замен), если при таких изменениях сохраняется его связывание с соответствующим антигеном. Антитело может также включать одну или более нативных или искусственных модификаций (например, гликозилирование и т. д.) аминокислотных остатков, составляющих его.

Способы получения поликлональных и моноклональных антител, а также их фрагментов хорошо известны из уровня техники, как и способы получения рекомбинантных антител или их фрагментов (см., например, Harlow and Lane, «Antibodies: A Laboratory Manual», Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1988; Harlow and Lane, «Using Antibodies: A Laboratory Manual», Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1999, ISBN 0879695447; «Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques», под ред. Zola, CRC Press 1987, ISBN 0849364760; «Monoclonal Antibodies: A Practical Approach», под ред. Dean & Shepherd, Oxford University Press 2000, ISBN 0199637229; Methods in Molecular Biology, vol. 248: «Antibody Engineering: Methods and Protocols», Lo, ed., Humana Press 2004, ISBN 1588290921).

Связывающая молекула может быть помечена меткой, которая позволяет обнаруживать ее с помощью другого средства (например, партнера по связыванию для зонда). Такие метки могут представлять собой, например, биотин, стрептавидин, гистидиновую метку, myc–метку, мальтозу, мальтозосвязывающий белок или метку любого другого типа, известную из уровня техники, которая имеет партнера по связыванию. Может использоваться любая из ассоциаций, в которую входят комбинация зонд:партнер по связыванию, и она включает, например, биотин:стрептавидин, гистидиновую метку/ион металла (например, Ni²⁺), мальтозу/мальтозосвязывающий белок.

Для облегчения обнаружения связывающая молекула или конъюгат связывающей молекулы могут быть ассоциированы со средством для обнаружения или присоединены к нему. Примеры лабораторных средств для обнаружения включают без ограничения люминесцентные метки; колориметрические метки, такие как красители; флуоресцентные метки или химические метки, такие как электроактивные средства (например, ферроцианид); ферменты; радиоактивные метки или радиочастотные метки. Чаще всего средство для обнаружения представляет собой частицу. Примеры частиц, применимых при осуществлении настоящего изобретения на практике, включают без ограничения коллоидные частицы золота; коллоидные частицы серы; коллоидные частицы селена; коллоидные частицы сульфата бария; коллоидные частицы сульфата железа; частицы иодата металла; частицы галогенида серебра; частицы кремнезема; коллоидные частицы (водного) оксида металла; коллоидные частицы сульфида металла; коллоидные частицы селенида свинца; коллоидные частицы селенида кадмия; коллоидные частицы фосфата металла; коллоидные частицы феррита металла; любые из вышеупомянутых коллоидных частиц, покрытые органическими или неорганическими слоями; белковые или пептидные молекулы; липосомы или частицы органического полимерного латекса, такие как гранулы полистирольного латекса. Предпочтительными частицами являются коллоидные частицы золота. Коллоидное золото можно получать с помощью любых общепринятых средств, таких как способы, описанные в G. Frens, 1973 Nature Physical Science, 241:20 (1973). Альтернативные способы могут быть описаны в патентах США №№ 5578577, 5141850, 4775636, 4853335, 4859612, 5079172, 5202267, 5514602, 5616467, 5681775.

Антитела к CEMA

Как обсуждалось в данном документе, CEMA можно обнаруживать с применением антитела, такого как моноклональное антитело, или его фрагмента, которые специфически связываются с CEMA, необязательно связанным с иммуногенным носителем. Например, можно использовать способы, описанные в данном документе или в WO2009/010296. Дополнительный аспект относится к конъюгату, содержащему CEMA, сопряженную с иммуногенным носителем. Также раскрывается конъюгат, который можно получить путем сопряжения CEMA с иммуногенным носителем. Иммуногенный носитель может представлять собой, например, белок, пептид, олигонуклеотид или полимер. Также раскрыт способ получения конъюгата, предусматривающий: (а) активацию иммуногенного носителя; и (b) сопряжение активированного иммуногенного носителя, полученного на стадии а), с CEMA. Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к антителу к CEMA или его фрагменту, способным специфически связываться с CEMA. Также раскрыт способ получения такого антитела или его фрагмента, предусматривающий иммунизацию животного, отличного от человека, посредством конъюгата, описанного в данном документе. Также раскрыта фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат, и способ обнаружения CEMA в образце, предусматривающий обработку образца антителом к CEMA или его фрагментом и обнаружение связывания антитела или его фрагмента с CEMA. Связывание указывает на присутствие CEMA в образце. Также описан способ обнаружения специфичных для CEMA антител или их фрагментов, предусматривающий обработку образца от субъекта конъюгатом, описанным в данном документе, и обнаружение связывания конъюгата с антителом или его фрагментом.

Один из способов получения антител к CEMA включает применение гибридом. Беспатогенных мышей BALB/c можно примировать с помощью конъюгата CEMA с применением полного адъюванта Фрейнда (Sigma). Бустерные дозы можно вводить мышам через желудочный зонд в день 14, 16, 28, 30, 42 и 44 в виде такой же дозы антигена в присутствии холерного токсина (Sigma). Сыворотку можно отбирать в день 0, 14, 28, 42, 55 и 84, а титр антитела к CEMA можно измерить с помощью прямого ELISA. За три дня до проведения гибридомного слияния можно осуществлять введение конечной бустерной дозы с неполного адъювантом Фрейнда (Sigma) мышам с самыми высокими титрами CEMA–специфических антител. Гибридомы можно получать с применением полного набора ClonaCell™–HY (StemCell Technologies). Вкратце, спленоциты, полученные из селезенки иммунизированных мышей, промывают и инкубируют в среде, содержащей PEG, с исходными клетками миеломы. После выращивания в течение 24 часов клетки смешивают с селективной средой для гибридом, представляющей собой HAT (гипоксантин, аминоптерин и тимин) на основе метилцеллюлозы. Смесь высевают на чашки и инкубируют при 37°С, обеспечивая рост слитых клеток в течение 14 дней. Затем колонии гибридом можно собирать и переносить в 96–луночные планшеты с питательной средой. После 4 дней выращивания при 37°С каждый супернатант можно тестировать на присутствие специфических [NNK–C2]–антител с помощью прямого ELISA. Положительные клоны дополнительно адаптировали к среде RPMI–1640, дополненной HyClone HyQ PF–Mab (Perbio Sciences), безбелковой питательной добавкой для получения mAb.

Обнаружение

Любые существующие, доступные или общепринятые способы разделения, обнаружения и количественного определения можно применять в данном документе для определения, или обнаружения, или измерения присутствия или отсутствия (например, данные о присутствии или отсутствие, или обнаруживаемое количество в противовес необнаруживаемому количеству) и/или содержания (например, данные об абсолютном или относительном содержании, такие как, например, абсолютная или относительная концентрация) соответствующих метаболитов в образцах (любые представляющие интерес молекулы или аналиты, подлежащие такому измерению в образцах, в том числе любой один или более метаболитов, изложенных в данном документе, могут обозначаться в данном документе ниже совокупно как метаболиты).

Например, такие способы могут включать способы на основе биохимических анализов, способы на основе иммунных анализов, анализы конкурентного связывания, анализы связывания по типу сэндвич, способы масс–спектрометрического анализа или хроматографические способы или их комбинации.

Анализы конкурентного связывания и иммунные анализы

Анализы конкурентного связывания и иммунные анализы можно применять для обнаружения одного или более метаболитов, описанных в данном документе. Такие способы, известные в таком качестве для обнаружения одного или более представляющих интерес метаболитов в образце, при этом специфичность анализа в отношении представляющих интерес метаболитов обеспечивается специфическим связыванием между средством для специфического связывания, обычно антителом, и представляющими интерес метаболитами. Количественные анализы применяют для измерения количества специфических объектов в биологическом матриксе, таком как плазма или сыворотка. Технологии иммунного анализа включают без ограничения прямой ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), непрямой ELISA, сэндвич–ELISA, конкурентный ELISA, мультиплексный ELISA, радиоиммунный анализ (RIA) и другие аналогичные методики, известные из уровня техники. Принципы этих способов иммунного анализа известны из уровня техники, например, John R. Crowther, «The ELISA Guidebook», 1–е изд., Humana Press 2000, ISBN 0896037282.

В виде дополнительного объяснения, а не ограничения, в прямом ELISA используют меченое первичное антитело или его фрагмент для связывания и, тем самым, количественного определения целевого антигена в образце, иммобилизированном на твердой подложке, такой как луночный микропланшет. В непрямом ELISA используется немеченое первичное антитело, которое связывается с целевым антигеном, и вторичное меченое антитело, которое распознает и позволяет количественно определять связанное с антигеном первичное антитело. В сэндвич–ELISA целевой антиген захватывается из образца с применением иммобилизированного антитела «захвата», которое связывается с одним антигенным сайтом в пределах антигена, и, после удаления несвязанных метаболитов, антиген, захваченный таким образом, обнаруживают с применением антитела «обнаружения», которое связывается с другим антигенным сайтом в пределах указанного антигена, где антитело «обнаружения» можно непосредственно метить или обнаруживать опосредованно, как описано выше. В конкурентном ELISA применяется меченый «конкурент», которым может быть либо первичное антитело, либо целевой антиген. В одном примере немеченое иммобилизированное первичное антитело инкубируют с образцом, причем обеспечивают достижение равновесия в данной реакции и затем добавляют меченый целевой антиген. Последний будет связываться с первичным антителом там, где его сайты связывания еще не заняты немеченым целевым антигеном из образца. Таким образом, обнаруженное количество связанного меченого антигена обратно коррелирует с количеством немеченого антигена в образце. Мультиплексный ELISA позволяет одновременно обнаруживать два или более метаболитов в пределах одного компартмента (например, лунка микропланшета) обычно при реакциях с несколькими матрицами (см., например, Nielsen & Geierstanger 2004. J Immunol Methods 290: 107–20 и Ling et al. 2007. Expert Rev Mol Diagn 7: 87–98 для дальнейшего руководства). Понятно, что мечение в технологиях ELISA обычно осуществляется за счет конъюгирования фермента (такого как, например, пероксидаза хрена), а на конце обычно располагается колориметрическая, хемилюминесцентная или флуоресцентная, магнитная, пьезоэлектрическая, пироэлектрическая метка и т. д.

Радиоиммунный анализ

Радиоиммунный анализ (RIA) можно применять для обнаружения одного или более метаболитов, описанных в данном документе. Эта методика основана на конкуренции и предусматривает смешивание известных количеств целевого антигена с радиоактивной меткой (например, ¹²⁵I или ¹³¹I) с антителом к указанному антигену или его фрагментом, затем добавление немеченого или «холодного» антигена из образца и измерение количества вытесненного меченого антигена (см., например, «An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques», Chard T, ed., Elsevier Science 1995, ISBN 0444821198 для руководства).

Микрофлюидные системы

Микрофлюидные системы можно применять для обнаружения одного или более метаболитов, описанных в данном документе. Их получают с применением технологии микроэлектромеханических систем (MEMS) и обычно называют «лаборатория на чипе» (LOC), «биочипы» или «система полного микроанализа». Зачастую они рассматриваются как миниатюрные версии своих крупномасштабных аналогов. Такие миниатюрные системы могут выполнять целые протоколы, обычно осуществляемые в лаборатории. Все из предварительной обработки образца, транспортировки образца/реагента, смешивания, осуществления реакции, разделения, обнаружения и сбора продукта могут выполняться автоматически в единой системе LOC. Функциональные микрофлюидные устройства, такие как микронасосы, микроклапаны, микрофильтры, микрореакторы и микросепараторы, могут быть изготовлены микротехнологическими способами и даже интегрированы для осуществления специфического анализа. Преимущества таких разработанных систем LOC включают меньший расход образца/реагента, сниженный риск загрязнения, повышенную чувствительность, меньшую удельную стоимость, более низкое энергопотребление, а также более высокую надежность и функциональность. Что еще более важно, портативность, возникающая благодаря их компактной форме, является ключевым фактором для путей применения в местах оказания медицинской помощи (POC).

Иммунные анализы с агглютинацией

Иммунный анализ с агглютинацией можно применять для обнаружения одного или более метаболитов, описанных в данном документе. В таких анализах используют связывание и агглютинацию (слипание) антител или их фрагментов с конъюгатами антиген–ДНК, что обеспечивает лигирования нитей ДНК, и проведение последующего количественного определения с помощью способов, включающих количественную полимеразную цепную реакцию (qPCR). ПЦР с агглютинацией (ADAP) представляет собой сверхчувствительный способ в жидкой фазе для обнаружения такого связывания антител. Подобно другим способам обнаружения на основе иммунной ПЦР (IPCR) ADAP сочетает специфичность распознавания антитело–антиген и чувствительность ПЦР. ADAP обнаруживает от зептомольных до аттомольных количеств антител в 2 мкл образца с динамическим диапазоном, охватывающим 5–6 порядков. Например, ADAP позволяет обнаруживать аутоантитела к тиреоглобулину в плазме пациента–человека с чувствительностью, увеличенной в 1000 раз по сравнению с одобренным FDA радиоиммунным анализом. ADAP также позволяет одновременно обнаруживать несколько антител в одном эксперименте.

Технология DRI

Технологию DRI можно применять для обнаружения одного или более метаболитов, описанных в данном документе. Примером технологии DRI является предлагаемая компанией Thermo Scientific™, и она основана на конкуренции между лекарственным средством или метаболитом лекарственного средства, помеченными с помощью фермента глюкозо–6–фосфатдегидрогеназа (G6PDH), и свободным лекарственным средством из образца за фиксированное количество участков связывания специфического антитела. В отсутствие свободного лекарственного средства из образца специфическое антитело связывается с лекарственным средством, помеченным G6PDH. В результате этого активность фермента подавляется. Если лекарственное средство присутствует в образце, оно конкурирует с конъюгатом фермент–лекарственное средство за ограниченное число сайтов связывания антитела, что приводит к больней активности фермента. Данное явление обусловливает прямую взаимосвязь между концентрацией лекарственного средства в моче и активностью фермента. Активность фермента G6PDH определяют с помощью спектрофотометрии при 340 нм путем измерения его способности превращать никотинамидадениндинуклеотид (NAD) в NADH.

Имуннохроматография

Иммунохроматографию можно применять для обнаружения одного или более метаболитов, описанных в данном документе, и она является предпочтительным способом обнаружения по настоящему изобретению. Она также известна как иммунохроматографический анализ с латеральным потоком. Иммунохроматографический анализ может быть интегрирован в простые устройства, предназначенные для обнаружения присутствия (или отсутствия) аналита в образце, как, например, в моче, без необходимости в специальном и дорогостоящем оборудовании. Иммунохроматографический анализ также может быть интегрирован в портативные устройства для иммунного анализа с латеральным потоком, как обсуждается ниже.

Общий принцип иммунохроматографического анализа основан на жидком образце, содержащем подлежащий обнаружению метаболит(–ы), который движется за счет капиллярного эффекта без участия внешних сил через различные зоны тестовой полоски с латеральным потоком. Тестовая полоска с латеральным потоком может представлять собой полимерную полоску, на которой прикреплены молекулы, которые могут взаимодействовать с метаболитом(–ами). Типичная тестовая полоска с латеральным потоком состоит из перекрывающихся мембран, которые смонтированы на опорной подложке для обеспечения стабильности и удобства манипулирования. Такая тестовая полоска с латеральным потоком может содержать один или более пористых элементов, которые будучи увлажненными образцом, обеспечивают визуальное изменение в присутствии метаболита(–ов) и/или указывают на концентрацию метаболита(–ов) в указанном образце. Образец наносят на один конец полоски на адсорбирующую прокладку для образца, и он мигрирует через тестовую полоску с латеральным потоком. Смежный пористый элемент представляет собой прокладку для конъюгата, которая, как правило, содержит средства для специфического связывания, которые являются специфическими в отношении метаболита(–ов), подлежащего обнаружению, и являются меченными. Вместе они могут образовывать конъюгат из меченого средства для специфического связывания и метаболита. Способы ассоциирования или прикрепления метки к средству для специфического связывания хорошо известны из уровня техники и описаны, например, в EP007654. Конъюгат мигрирует вдоль полоски в следующий смежный пористый элемент, называемый зоной обнаружения. Он представляет собой пористую мембрану, такую как нитроцеллюлоза, со специфическими биологическими компонентами, такими как иммобилизированные на ней средства для специфического связывания, которые выполнены с возможностью связывания метаболита(–ов), присутствующего в конъюгате. Предпочтительно связывание происходит в одной или более тестовых линиях зоны обнаружения. Распознавание метаболита(–ов) приводит к ответу на тестовой линии(–ях) в зоне обнаружения. Результаты, отраженные на тестовых линиях, можно оценивать визуально или с применением специализированного устройства для считывания. Жидкость протекает через тестовую полоску с латеральным потоком за счет капиллярных сил материала полоски, и для поддержания данного перемещения движения необязательно присутствует еще один пористый элемент, смежный с зоной обнаружения, называемый абсорбирующей прокладкой. Он расположен на конце полоски для впитывания излишка реагентов и предотвращения обратного потока жидкости. Для одновременного тестирования нескольких метаболитов в одинаковых условиях можно иммобилизировать в формате матрицы средства для специфического связывания различных метаболитов, образующие дополнительные тестовые линии. Такая конфигурация особенно применима в настоящем изобретении, поскольку обнаруживают более одного метаболита.

Более подробно, тестовая полоска с латеральным потоком обычно содержит: (i) прокладку для образца; (ii) прокладку для конъюгата; (iii) зону обнаружения и (iv) необязательно абсорбирующую прокладку. Прокладка для образца и необязательная абсорбирующая прокладка расположены на противоположных концах тестовой полоски с латеральным потоком. Как правило, прокладка для конъюгата является смежной с прокладкой для образца, зона обнаружения является смежной с прокладкой для конъюгата, а необязательная абсорбирующая прокладка является смежной с зоной обнаружения.

Первый элемент тестовой полоски с латеральным потоком представляет собой пористый элемент для образца, который в данном документе называется прокладкой для образца. Она действует как губка и удерживает избыток жидкости образца. Как правило, она изготовлен из целлюлозы или стекловолокна или их комбинации. Ее функция заключается в транспортировке образца к другим компонентам тестовой полоски с латеральным потоком. Прокладка для образца должна обладать способностью транспортировать образец плавным, непрерывным и однородным образом. При необходимости, прокладка для образца может быть пропитана растворами, такими как буферные соли и поверхностно–активные вещества. После насыщения жидкость мигрирует во второй элемент тестовой полоски с латеральным потоком.

Второй элемент тестовой полоски с латеральным потоком представляет собой пористый элемент для конъюгата и называется в данном документе прокладкой для конъюгата. Именно в ней расположены молекулы меченого средства(средств) для специфического связывания, каждая из которых способна индивидуально связывать метаболиты (или в определенных форматах анализа аналоги метаболитов). Стекловолокно, целлюлоза и сложные полиэфиры являются типичными примерами материалов, применяемых для изготовления прокладки для конъюгата. Меченое средство для специфического связывания может присутствовать в высушенном формате в матрице, например, в матрице из соли–сахара, в прокладке для конъюгата. Меченое средство для специфического связывания может представлять собой меченое антитело или его фрагмент, или аптамер, или аффимер и т. п. Обычно по меньшей мере два разных средства для специфического связывания (например, три средства для специфического связывания) будут применять для обнаружения каждого из метаболитов, описанных в данном документе. При необходимости их количества можно регулировать, чтобы обеспечить точную настройку чувствительности анализа для каждого метаболита. Как правило, количество каждого применяемого средства для специфического связывания будет различным. При необходимости средства для специфического связывания могут быть помечены одной и той же или отличающейся меткой. Жидкость образца солюбилизирует средство(–а) для специфического связывания и в одном комбинированном с транспортом движении образец и средство(–а) для специфического смешиваются при прохождении через прокладку для конъюгата с образованием конъюгата из меченого средства для специфического связывания и метаболита.

В одном варианте осуществления прокладка для конъюгата содержит или состоит из меченых средств для специфического связывания, каждое из которых способно индивидуально связывать: (i) котинин и NNAL; или (ii) котинин и CEMA; или (iii) котинин, и NNAL, и CEMA, при этом предпочтительно каждое из меченых средств для специфического связывания представляет собой антитело или его фрагмент, аптамер, фотоаптамер, аффимер, белок, пептид, пептидомиметик или малую молекулу.

Тестовая полоска с латеральным потоком будет иметь одну или более зон обнаружения, таких как тестовые линий, на которых иммобилизирована другая молекула(–ы). Как правило, зоной обнаружения будет представлять собой нитроцеллюлозную мембрану. Как правило, предусматриваются по меньшей мере две тестовые линии, каждая из которых будет содержать средство для специфического связывания, которое способно захватывать конъюгат из меченого средства для специфического связывания и метаболита или конкурировать за связывание с ним. Также может быть включена дополнительная контрольная линия. Точная конфигурация зоны обнаружения будет зависеть от формата анализа, такого как сэндвич–формат или конкурентный формат анализа, как описано ниже.

В одном аспекте раскрыто устройство для определения статуса курения субъекта, где указанное устройство содержит несколько разных молекул для специфического связывания, нанесенных на твердую фазу, для обнаружения присутствия двух или трех биомаркеров воздействия табачного дыма в биологическом образце, причем указанные биомаркеры воздействия табачного дыма состоят из: (i) котинина и общего 4–(метилнитрозамино)–1–(3–пиридил)–1–бутанола (NNAL); или (ii) котинина и N–ацетил–S–[2–карбоксиэтил]–L–цистеина (CEMA); или (iii) котинина, и NNAL, и CEMA. Устройство может быть выполнено с возможностью применения в сэндвич–формате или конкурентном формате. В определенных вариантах осуществления применение конкурентного формата является предпочтительным.

В случае анализа в сэндвич–формате по мере миграции образец сначала встречается с прокладкой для конъюгата. Если метаболит(–ы) присутствует в образце, средство(–а) для специфического связывания в прокладке для конъюгата связывается с метаболитом(–ами) с образованием конъюгата из меченого средства для специфического связывания и метаболита, который мигрирует и впоследствии достигает зоны обнаружения. Зона обнаружения также содержит средство(–а) для специфического связывания с метаболитом(–ами). Как только образец достигает зоны обнаружения, конъюгат из меченого средства для специфического связывания и метаболита может захватываться средством для специфического связывания с метаболитом, но оно связывается с другим сайтом или эпитопом относительно сайта или эпитопа, с которым связывается средство для специфического связывания из прокладки для конъюгата. Метаболит оказывается зажатым между антителами с образованием комплекса. Это приводит к визуальному изменению, обычно появлению линии, позволяющей сделать вывод о том, что пороговое значение превышено. Большинство анализов по типу сэндвича также имеют контрольную линию, которая будет появляться независимо от того, присутствует ли метаболит(–ы) или нет. При необходимости, избыток меченого антитела может захватываться вторичным антителом.

В одном варианте осуществления устройства, выполненного с возможностью применения в сэндвич–формате, (а) прокладка для конъюгата содержит или состоит из меченых средств для специфического связывания, нанесенных на нее, каждое из которых способно индивидуально связывать метаболиты: (i) котинин и NNAL; или (ii) котинин и CEMA; или (iii) котинин, и NNAL, и CEMA, и они способны образовывать конъюгаты из меченого средства для специфического связывания и метаболита; и (b) зона обнаружения содержит или состоит из иммобилизированных средств для специфического связывания, каждое из которых способно индивидуально связывать метаболиты.

В одном иллюстративном формате невидимая отметка на тестовой линии(–ях) (i) котинина и NNAL, или (ii) котинина и CEMA, или (iii) котинина, и NNAL, и CEMA в устройстве указывает на то, что порог обнаружения не превышен, и это является показателем некурящего субъекта; видимая отметка на тестовой линии(–ях) (i) котинина и NNAL, или (ii) котинина и CEMA, или (iii) котинина, и NNAL, и CEMA в устройстве указывает на то, что порог обнаружения превышен, и невидимая отметка на тестовой линии(–ях) (i) котинина и NNAL, или (ii) котинина и CEMA; или (iii) котинина, и NNAL, и CEMA в устройстве указывает на то, что порог обнаружения не превышен, и это является показателем того, что субъект подвергался воздействию нагретого табака; и видимая отметка на тестовой линии(–ях) (i) котинина и NNAL, или (ii) котинина и CEMA, или (iii) котинина, и NNAL, и CEMA в устройстве указывает на то, что порог обнаружения превышен, и это является показателем того, что субъект подвергался воздействию сгоревшего табака. Устройство может быть выполнено таким образом, чтобы тестовая линия(–и) была выполнена с возможностью отображения этих результатов с применением данных, представленных в таблице 1, например, с применением результатов, полученных в день 5.

В случае конкурентного формата по мере миграции образца внутри устройства он сначала встречается с прокладкой для конъюгата, которая содержит меченые конъюгаты, то есть меченый метаболит(–ы) или меченый аналог метаболита(–ов). Как правило, метка ассоциирована или прикреплена к метаболиту(–ам) или его аналогу за счет применения средства для специфического связывания, такого как антитело или его фрагмент. Меченые конъюгаты солюбилизируются в присутствии образца с образованием смеси метаболита(–ов), содержащихся в образце, и меченого метаболита(–ов) или их аналогов.

В зоне обнаружения иммобилизировано с образованием тестовой линии другое средство для специфического связывания с метаболитом(–ами). Когда мигрирующая жидкость образца перетекает в зону обнаружения, между метаболитом(–ами) образца и мечеными конъюгатами происходит конкуренция за связывание с иммобилизированным средством для конкурентного связывания. Иммобилизированное средство для специфического связывания в зоне обнаружения связывается с другим сайтом на метаболите относительно сайта, с которым связано меченое средство для специфического связывания.

В одном варианте осуществления устройство выполнено с возможностью применения в конкурентном формате: (а) прокладка для конъюгата содержит или состоит из меченого метаболита(–ов), нанесенного на нее, причем указанный меченый метаболит(–ы) состоит из: (i) меченого котинина или его аналога и меченого NNAL или его аналога; или (ii) меченого котинина или его аналога и меченого CEMA или его аналога; или (iii) меченого котинина или его аналога, и меченого NNAL или его аналога, и меченого CEMA или его аналога; и (b) зона обнаружения содержит или состоит из иммобилизированных средств для специфического связывания, каждое из которых способно индивидуально связывать: (i) меченый котинин или его аналог, и меченый NNAL или его аналог, и котинин и NNAL, которые могут присутствовать в образце; или (ii) меченый котинин или его аналог, и меченый CEMA или его аналог, и котинин и CEMA, которые могут присутствовать в образце; или (iii) меченый котинин или его аналог, и меченый NNAL или его аналог, и меченый CEMA или его аналог, и котинин, и NNAL, и CEMA, которые могут присутствовать в образце.

В одном иллюстративном варианте осуществления конкурентного формата (i) видимая отметка на тестовой линии(–ях) (i) котинина и NNAL; или (ii) котинина и CEMA; или (iii) котинина, и NNAL, и CEMA в устройстве указывает на то, что порог обнаружения не превышен, и это является показателем некурящего субъекта; (ii) отсутствие видимой отметки на тестовой линии(–ях) (i) котинина и NNAL; или (ii) котинина и CEMA; или (iii) котинина, и NNAL, и CEMA в устройстве указывает на то, что порог обнаружения превышен, и видимая отметка на тестовой полоске(–ах) (i) котинина и NNAL; или (ii) котинина и CEMA; или (iii) котинина, и NNAL, и CEMA в устройстве указывает на то, что порог обнаружения не превышен, и это является показателем того, что субъект подвергался воздействию нагретого табака; (iii) отсутствие видимого показателя на тестовой линии (i) котинина и NNAL; или (ii) котинина и CEMA; или (iii) котинина, и NNAL, и CEMA в устройстве указывает на то, что порог обнаружения превышен, и это является показателем того, что субъект подвергался воздействию сгоревшего табака. Устройство может быть выполнено таким образом, чтобы тестовая линия(–и) была выполнена с возможностью отображения этих результатов с применением данных, представленных в таблице 1, например, с применением результатов, полученных в день 5. Этот конкурентный формат обычно подходит для низкомолекулярных соединений, с которыми одновременно не могут связываться два средства для специфического связывания. Отсутствие сигнала на тестовой линии является показателем присутствия метаболита, а появление сигнала является показателем отрицательного результата. В определенных вариантах осуществления конкурентный формат является предпочтительным для применения в настоящем изобретении.

При обнаружении более одного метаболита с помощью одной полоски также можно применять мультиплексный формат Мультиплексный формат обнаружения можно создавать различными способами, например, за счет увеличения длины тестовой полоски с латеральным потоком или длины зоны обнаружения. Мультиплексный формат можно применять в виде сэндвич–формата или конкурентного формата. В некоторых вариантах предпочтительным является мультиплексный конкурентный формат.

После прохождения через прокладку для конъюгата и зон обнаружения жидкость может попадать в конечный пористый элемент, который в данном документе называется абсорбирующей прокладкой. Она функционирует в качестве контейнера для отходов и является необязательной признаком.

Различные части тестовой полоски с латеральным потоком закреплены или смонтированы над опорной подложкой, которая служит в качестве опоры и облегчает манипулирование с полоской.

Чтобы получить качественный или полуколичественный результат, при котором сигнал образуется, если уровень метаболита(–ов) в образце превышает определенный заранее заданный пороговый уровень, или эталонное значение, или значение на исходном уровне, в зоне обнаружения может присутствовать заранее заданное количество фиксированного средство(средств) для специфического связывания. Это позволяет захватывать определенное количество метаболита(–ов), присутствующего в образце, которое соответствует заранее заданным пороговым уровню или значению. Остальное количество подлежащего связыванию метаболита(–ов) (если оно имеется), затем может продолжать миграцию в необязательную дополнительную зону обнаружения, в которой, соответственно, обнаруживаемый сигнал производиться только в том случае, если уровень метаболита(–ов) в образце выше, чем заранее заданные пороговые уровень или значение.

В зависимости от формата анализа интенсивность цвета или сигнала можно сравнивать с эталонной шкалой цвета или сигнала. В качестве альтернативы количество или интенсивность цвета или сигнала можно измерять с помощью электронного устройства, содержащего, например, датчик светопоглощения или измеритель излучения света, дающего числовое значение полученных интенсивности сигнала или поглощения цвета. Этот вариант осуществления может иметь особое значение для отслеживания уровня указанного метаболита(–ов) у субъекта в течение определенного периода времени.

В дополнительном варианте осуществления интенсивность цвета или сигнала в зоне обнаружения можно сравнивать с одной из эталонных шкал цвета или сигнала, указывающих то, что интенсивность сигнала выше или ниже определенного порогового сигнала, и указывающих то, что тест является положительным. В качестве альтернативы, как обсуждалось выше, количество или интенсивность цвета или сигнала могут измеряться с помощью электронного устройства, дающего числовое значение полученной интенсивности сигнала или поглощения цвета, которое затем может отображаться для субъекта в форме отрицательного результата или положительного результата.

Типичные стадии проведения иммунохроматографического анализа представляют собой: (а) получение меченого средства для специфического связывания и захват меченого средства для специфического связывания с метаболитом(–ами); (b) нанесение меченого средства для специфического связывания на прокладку для конъюгата на тестовой полоске с латеральным потоком и иммобилизация средства для специфического связывания в зоне обнаружения тестовой полоски с латеральным потоком; (iii) сборка компонентов на тестовой полоске с латеральным потоком; (iv) добавление образца, подлежащего тестированию, на прокладку образца вместе с необязательным буфером; (v) ожидание, пока образец протечет через тестовую полоску с латеральным потоком, и (vi) считывание результата в зоне обнаружения.

Тестовая полоска с латеральным потоком может быть выполнена с возможностью обнаружения общего NNAL или CEMA и котинина, или она может быть выполнена с возможностью обнаружения общего NNAL, и CEMA, и котинина. Тестовую полоску с латеральным потоком можно выполнять с возможностью включения положительного контроля, чтобы продемонстрировать то, что тест работает и в случае субъектов, у которых в моче отсутствует какой–либо метаболит табака (с применением в качестве маркера(–ов), например, креатина, альбумина или белка, специфического для мочи, такого как белок Тамма–Хорсфолла (THP)). Таким образом, в другом варианте осуществления тестовая полоска с латеральным потоком выполнена с возможностью обнаружения общего NNAL или CEMA, а также котинина и положительного контроля, или она может быть выполнена с возможностью обнаружения общего NNAL, и CEMA, и котинина, и положительного контроля.

Тестовую полоску с латеральным потоком можно применять непосредственно в качестве устройства или, при необходимости, она может быть интегрирована в корпус. Таким образом, также раскрыто устройство, содержащее тестовую полоску с латеральным потоком.

Большинство иммунохроматографических тестов работают исключительно как качественный тест. Тем не менее, возможно измерять интенсивность в зоне обнаружения для определения количества метаболита в образце. Портативные диагностические устройства, известные как устройства для считывания латерального потока, применяются несколькими компаниями для получения полностью количественного результата анализа. Используя уникальные длины волн света для облучения в сочетании с технологией обнаружения CMOS (комплементарный металло–оксидный полупроводник) или CCD (устройство с зарядовой связью), для фактических тестовых линий можно получать изображение с интенсивным сигналом. Путем применения алгоритмов обработки изображений, специально разработанных для конкретных типов теста и среды, затем показатели интенсивности тестовых линий можно соотносить с концентрациями аналита. Одна такая платформа на основе ручного устройства с латеральным потоком изготовлена компанией Detekt Biomedical LLC. С помощью альтернативных методик, отличных от оптических, также могут сообщаться результаты количественных анализов. Одним из таких примеров является магнитный иммунный анализ (MIA). Снижение изменчивости в капиллярной перекачке жидкости образца является еще одним подходом к переходу от качественных к количественным результатам.

Антитела и их фрагменты, описанные в данном документе, обычно применяют в качестве средств для специфического связывания в зоне обнаружения, где они специфически связываются с метаболитом за счет иммунохимических взаимодействий. Аптамеры или аффимеры иногда предпочтительнее антител, вследствие простоты их производства, простого связывания с метками, повышенной стабильности, улучшенной воспроизводимости и улучшенной универсальности.

Средства для специфического связывания являются мечеными, и целый ряд таких меток хорошо известны из уровня техники. Они могут включать наночастицы золота, наночастицы селена, квантовые точки, цветные латексные шарики, магнитные частицы, углеродные наночастицы, наночастицы серебра, преобразующие люминофоры, органические флуорофоры, текстильные красители, липосомы и ферменты. Коллоидные наночастицы золота являются одними из наиболее широко используемых меток. Коллоидное золото является инертным и дает почти идеальные сферические частицы. Эти частицы характеризуются очень высокой аффинностью в отношении биомолекул, и их можно легко функционализировать. Оптические свойства наночастиц золота, как правило, повышают чувствительность. При необходимости, оптический сигнал наночастиц золота можно усиливать путем нанесения серебра, наночастиц золота и ферментов. При применении наночастиц золота качественный или полуколичественный анализ может проводиться путем визуального осмотра зоны обнаружения. Основным преимуществом визуального осмотра является то, что можно получать быстрые качественные ответы, что упрощает применение устройства и позволяет принимать немедленное решение. Для количественного определения можно применять оптические устройства для считывания полосок.

Дополнительную информацию о практической иммунохроматографии можно найти в справочнике «Lateral flow immunochromatography assays» от P. J. Davies et al., опубликованном 15 марта 2008 г., Wiley Online Library.

Портативное устройство для иммунного анализа с латеральным потоком

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено портативное устройство для иммунного анализа с латеральным потоком, такое как экспресс–тест, для обнаружения одного или более метаболитов, описанных в данном документе. В устройство могут применяться принципы иммунохроматографии, и оно может содержать или состоять из тестовой полоски с латеральным потоком, как обсуждалось выше.

Далее описана тестовая полоска с латеральным потоком для применения в портативном устройстве для иммунного анализа с латеральным потоком в сэндвич–формате в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения. Тестовая полоска с латеральным потоком содержит: (i) прокладку для образца; (ii) прокладку для конъюгата; (iii) зону обнаружения и (iv) необязательно абсорбирующую прокладку. Прокладка для образца и необязательная абсорбирующая прокладка расположены на противоположных концах тестовой полоски с латеральным потоком. Как правило, прокладка для конъюгата является смежной с прокладкой для образца, зона обнаружения является смежной с прокладкой для конъюгата, а необязательная абсорбирующая прокладка является смежной с зоной обнаружения.

Первым элементом тестовой полоски с латеральным потоком является прокладка для образца. После пропитывания образцом, таким как моча, жидкость мигрирует в прокладку для конъюгата. Здесь присутствует меченое средство(–а) для специфического связывания, каждое из которых способно индивидуально связываться с метаболитами. Так, например, будет присутствовать меченое средство(–а) для специфического связывания, такое как антитела или их фрагменты, аффимеры или аптамеры, каждое из которых способно индивидуально связываться с (i) котинином и общим NNAL; (ii) котинином и CEMA; или (iii) котинином, и NNAL, и CEMA. При необходимости их количества можно регулировать, чтобы обеспечить точную настройку чувствительности анализа для каждого метаболита. Как правило, количество каждого применяемого средства для специфического связывания будет различным.

Зона обнаружения будет включать по меньшей мере две тестовые линии, каждая из которых содержит средство для специфического связывания, которое способно индивидуально захватывать: (i) комплексы котинина и общего NNAL с меченым антителом; или (ii) комплексы котинина и CEMA с меченым антителом; или (iii) комплексы котинина, и NNAL, и CEMA с меченым антителом. Точная конфигурация зоны обнаружения будет зависеть от формата анализа, такого как сэндвич–формат или конкурентный формат анализа, как обсуждалось выше. В одном варианте осуществления пороговое значение в зоне обнаружения: (i) больше или равно приблизительно 200 нг/мл котинина в суточной моче, и пороговое значение больше или равно приблизительно 10 пг/мл общего NNAL в суточной моче, или пороговое значение больше или равно приблизительно 5 нг/мл CEMA в суточной моче, и обнаруживаемый сигнал генерируется при превышении порога обнаружения; или (ii) пороговое значение больше или равно приблизительно 200 нг/мл котинина в суточной моче, и пороговое значение больше или равно приблизительно 10 пг/мл общего NNAL в суточной моче, и пороговое значение больше или равно приблизительно 5 нг/мл CEMA в суточной моче, и обнаруживаемый сигнал генерируется при превышении порога обнаружения.

Портативное устройство для иммунного анализа с латеральным потоком, как правило, будет содержать тестовую полоску с латеральным потоком, находящуюся в корпусе, например в герметичном или непроницаемом корпусе, для обеспечения возможности погружения устройства в образец и для обеспечения смачивания только необходимых элементов тестовой полоски с латеральным потоком. Устройство обычно имеет продолговатую форму, размеры которой могут варьироваться в зависимости от фактического применения устройства; иллюстративные размеры составляют от 6 до 8 см в длину и от 3 до 6 мм в ширину.

Еще один пример портативного устройства для иммунного анализа с латеральным потоком описан в WO2007/023372, где раскрыто устройство для определения метаболита в жидком образце, содержащее средства для капиллярной диффузии, реализованные в виде: а) прокладки для образца; b) расположенной выше по ходу потока зоны высвобождения, содержащей специфический для метаболита реагент обнаружения, конъюгированный с визуально различимым и/или измеряемым маркером, который может свободно мигрировать посредством капиллярной диффузии во влажном состоянии в средствах для капиллярной диффузии; и с) по меньшей мере двух расположенных ниже по ходу потока прокладок для конъюгата, содержащих последовательно в направлении капиллярной диффузии, с одной стороны, средство(–а) для специфического связывания метаболита и, с другой стороны, метаболит(–ы) или аналог метаболита(–ов), которые являются иммобилизированными. Реагент(–ы) обеспечивают определение метаболита(–ов) в образце в сэндвич–формате.

Другой пример портативного устройства для иммунного анализа с латеральным потоком, которое рассматривается для применения в данном документе, также описан в WO2007/023372, где раскрыто устройство для определения метаболита в жидком образце, содержащее средства для капиллярной диффузии, реализованные в виде: а) прокладки для образца; b) расположенной выше по ходу потока зоны высвобождения, содержащей специфический для метаболита реагент обнаружения, конъюгированный с визуально различимым и/или измеряемым маркером, который может свободно мигрировать посредством капиллярной диффузии во влажном состоянии в средствах для капиллярной диффузии; и с) по меньшей мере двух расположенных ниже по ходу потока прокладках для конъюгата, содержащих последовательно в направлении капиллярной диффузии, с одной стороны, средство(–а) для специфического связывания специфическое для метаболита и, с другой стороны, метаболит(–ы) или аналог метаболита(–ов), которые являются иммобилизированными. Реагент(–ы) для обнаружения и метаболит(–ы), или аналог(–и) метаболитов обеспечивают определение представляющего интерес метаболита(–ов) в образце в конкурентном формате. Реагент(–ы) для обнаружения может быть нанесен в избытке в зоне обнаружения, которая сформирована выше по ходу потока от прокладок для конъюгата.

Другим примером портативного устройства для иммунного анализа с латеральным потоком, которое рассматривается для применения в данном документе, является устройство, предназначенное для одновременного определения двух или более (например, нескольких) метаболитов, описанное, например, в EP1657550. Устройство содержит средства для капиллярной диффузии, реализованные в виде: а) прокладки для образца; б) расположенной выше по ходу потока прокладки для конъюгата, содержащей смесь реагентов для обнаружения, каждый из которых является специфическим для одного из метаболитов, конъюгированных с визуально различимым и/или измеряемым маркером, которые могут свободно перемещаться путем капиллярной диффузии во влажном состоянии в средствах для капиллярной диффузии; и с) расположенных ниже по ходу потока прокладках для конъюгата, каждая из которых содержит средство для специфического связывания, которое является специфическим для одного из метаболитов, причем указанные расположенные ниже по ходу потока прокладки для конъюгата распределяются последовательно в соответствии с направлением миграции.

Другой пример портативного устройства для иммунного анализа с латеральным потоком, которое рассматривается для применения в данном документе, описан в US2015/168397. В ней раскрыто устройство для определения присутствия и/или количества по меньшей мере одного (или двух или более) метаболита, который может содержаться в жидком образце, при этом оно содержит средства для капиллярной диффузии, предусматривающие миграцию жидкого образца в латеральном направлении в соответствии с направлением и способом капиллярной миграции. Средства для капиллярной диффузии содержат прокладку для образца, служащую для нанесения образца, расположенную выше по ходу потока прокладку для конъюгата, которая содержит по меньшей мере один (или два или более) реагент для обнаружения, который способен перемещаться в результате миграции жидкого образца в средствах для капиллярной диффузии, и по меньшей мере две прокладки для конъюгата, каждая из которых может содержать по меньшей мере одно (или два или более) средство для специфического связывания, иммобилизированное на средствах для капиллярной диффузии. Устройство может дополнительно включать по меньшей мере одну расположенную ниже по ходу потока зону обнаружения, которая образована на средствах для капиллярной диффузии и которая расположена ниже по ходу потока от по меньшей мере одной из прокладок для конъюгата. Расположенная ниже по ходу потока зона обнаружения может содержать по меньшей мере один (два или более) реагент для обнаружения, который способен перемещаться в результате миграции жидкого образца в средствах для капиллярной диффузии. Затем реагент для обнаружения и/или средство для специфического связывания способны специфически связываться с метаболитом(–ами) и/или специфически связываться друг с другом, с образованием комплекса, обеспечивающего определение метаболита(–ов) в жидком образце в указанной комплементарной зоне(–ах) захвата.

Обращаясь к фиг. 4 настоящей заявки, на ней описан другой пример портативного устройства для иммунного анализа с латеральным потоком в форме экспресс–теста для определения или распознавания статуса курения субъекта. Представлены результаты для различных статусов курения. В одном варианте осуществления экспресс–тест является достаточно чувствительным для обнаружения общего NNAL в моче в количестве 10–125 пг/мл в суточной моче и CEMA в моче в количестве 5–80 нг/мл в суточной моче. В другом варианте осуществления экспресс–тест является достаточно чувствительным для обнаружения общего NNAL в моче в количестве 10–125 пг/мл в суточной моче, и CEMA в моче в количестве 5–80 нг/мл в суточной моче, и котинина в моче в количестве приблизительно 200–800 нг/мл. О статусе курения можно сделать заключение с применением экспресс–теста.

На фиг. 5 проиллюстрирован другой пример портативного устройства для иммунного анализа с латеральным потоком в форме экспресс–теста для определения статуса курения субъекта. В этом примере экспресс–тест применяют для распознавания трех возможных разных статусов курения субъекта. Экспресс–тест содержит прокладку для образца и необязательную абсорбирующую прокладку на противоположных концах тестовой полоски с латеральным потоком, которая содержится в устройстве. Он дополнительно включает прокладку для конъюгата, смежную с прокладкой для образца, содержащую три различных средства для специфического связывания, таких как меченное коллоидным золотом средство для специфического связывания котинина, меченное коллоидным золотом средство для специфического связывания общего NNAL, меченное средство для специфического связывания CEMA. Каждое из трех различных средств для специфического связывания может присутствовать в концентрациях, требуемых для них. В случае каждого метаболита концентрацию каждого из средств для специфического связывания можно регулировать для точной настройки чувствительности анализа в отношении данного метаболита (например, для изменения порога обнаружения), что является обычным экспериментом для среднего специалиста в данной области.

Зона обнаружения, содержащая три последовательно расположенных тестовых линии, присутствует в положении, смежном с прокладкой для конъюгата. Может быть включена необязательная контрольная тестовая линия. Экспресс–тест выполнен с возможностью применения в конкурентном формате. Одна тестовая линия может содержать средства для обнаружения котинина, такие как моноклональное антитело к котинину или его фрагмент. Такая тестовая линия может быть выполнена с возможностью исчезновения при достижении порогового значения, составляющего больше или равно приблизительно 200 нг/мл. Одна тестовая линия может содержать средства для обнаружения общего NNAL, такие как моноклональное антитело к общему NNAL или его фрагмент. Такая тестовая линия может быть выполнена с возможностью исчезновения при достижении порогового значения, составляющего больше или равно приблизительно 10 пг/мл. Одна тестовая линия может содержать средства для обнаружения CEMA, такие как моноклональное антитело к CEMA или его фрагмент. Такая тестовая линия может быть выполнена с возможностью исчезновения при достижении порогового значения, составляющего больше или равно приблизительно 5 нг/мл. Пример результатов интерпретации теста, которые можно получить с применением экспресс–теста, можно увидеть на фиг. 6.

В одном варианте осуществления устройство представляет собой устройство для тестирования в конкурентном формате для качественного определения биомаркеров воздействия табачного дыма. Такой пример можно увидеть на фиг. 5. Устройство содержит тестовую полоску с латеральным потоком, помещенную в герметичный или непроницаемый корпус, позволяющий погружать устройство в образец. Корпус может содержать пластик или состоять из него. Образец может представлять собой жидкий образец, такой как моча. Тестовая полоска с латеральным потоком может быть изготовлена из различных наложенных друг на друга пористых элементов, которые собраны вместе на подложке, такой как подложка из пластика или PVC, для придания полоске жесткости. Полоска может иметь продолговатую форму, размеры которой могут варьироваться в зависимости от фактического применения устройства; иллюстративные размеры составляют от 6 до 8 см в длину и от 3 до 6 мм в ширину. Прокладка для образца может быть изготовлена из различных абсорбирующих материалов, таких как целлюлозно–бумажный материал. Прокладка для конъюгата может быть изготовлена из различных материалов, таких как стекловолокно. Другие прокладки, образующие часть тестовой полоски с латеральным потоком, могут быть изготовлены из нитроцеллюлозы. При необходимости, перед сборкой прокладок одну или более из них можно обрабатывать химическим и/или биохимическим путем или модифицировать для обеспечения проницаемости для образца и/или миграции образца под действием капиллярных сил. Перенос или поток может происходить по всей и вдоль всей тестовой полоски с латеральным потоком. Если необходимо, аналогичные обработки можно осуществлять до или после нанесения реагента(–ов) на прокладки, например, для обеспечения требуемого иммунохимического взаимодействия(–ий) с полоской, в частности, на тестовой линии(–ях) зоны обнаружения. Иллюстративные средства для обнаружения представляют собой окрашенные частицы, такие как коллоидное золото. Такие частицы доступны в разных размерах (как правило, от приблизительно 40 до приблизительно 100 нанометров) и в разных цветах. Различные конъюгаты с окрашенными частицами (например, коллоидным золотом) и одним или более, или двумя или более, или тремя или более из котинина, общего NNAL и CEMA, можно смешивать вместе в жидкой фазе, наносить и высушивать на прокладке для конъюгата. Три средства для специфического связывания котинина, общего NNAL и CEMA, такие как моноклональные антитела, можно наносить и иммобилизировать на нитроцеллюлозной мембране тестовой полоски с латеральным потоком в пределах или вдоль трех различных поперечных тестовых линий в зоне обнаружения. Также на устройство для тестирования можно наносить соответствующий специфический реагент для образования контрольной линии на расположенном ниже по ходу потока конце полоски в зоне обнаружения. Средство для специфического связывания THP или креатинина, такое как моноклональное антитело или соответствующая пара его фрагментов, может применяться на тестовой полоске с латеральным потоком для получения линии положительного контроля мочи, также на расположенном ниже по ходу потока конце полоски в зоне обнаружения.

Также раскрыт набор для определения статуса курения субъекта, содержащий: портативное устройство для иммунного анализа с латеральным потоком, такое как экспресс–тест с по меньшей мере двумя разные прокладками для конъюгата, расположенными на экспресс–тесте, и отдельное средство для специфического связывания, нанесенное на каждую прокладку для конъюгата, при этом каждое средство для специфического связывания способно захватывать отельный метаболит из описанных в данном документе. Необязательно, в набор может быть включен комплект инструкций для определения статуса курения субъекта.

Также раскрыто портативное устройство для иммунного анализа с латеральным потоком, такое как экспресс–тест, для определения статуса курения субъекта, содержащее по меньшей мере две разные прокладки для конъюгата, расположенные на устройстве, и отдельное средство для специфического связывания, нанесенное на каждую прокладку для конъюгата, при этом каждое средство для специфического связывания способно индивидуально связываться с отдельным метаболитом из описанных в данном документе.

Также раскрыты применение набора или устройства для определения статуса курения субъекта.

Портативное устройство для домашнего, клинического или лабораторного применения

Также в данном документе раскрыты портативные устройства, такие как, например, устройства для применения в домашних условиях или в клинических или лабораторных условиях, и наборы, содержащие их, для определения статуса курения субъекта.

Таким образом, в родственном аспекте предусмотрено портативное тестирующее устройство, способное измерять присутствие и/или содержание метаболитов, изложенных в данном документе, в образце от субъекта, содержащее: (i) средства для получения образца от субъекта, (ii) средства для измерения содержания метаболитов в указанном образце и (iii) средства для визуализации содержания указанных метаболитов в образце.

В варианте осуществления указанные средства для визуализации способны указывать, отклоняется ли (например, ниже или выше) содержание метаболитов у субъекта от определенного эталонного значения или значения на исходном уровне. Следовательно, портативное тестирующее устройство предпочтительно также может предусматривать указанное эталонное значение или значение на исходном уровне или средства для установления таких значений.

Относительное содержание молекулы или аналита в образце может выражаться как увеличение или уменьшение или как кратное увеличение или уменьшение относительно указанного другого значения, как, например, относительно эталонного значения. Для осуществления относительного сравнения первой и второй переменных (например, первого и второго содержания) сначала может, но необязательно, потребоваться определение абсолютных значений указанных первой и второй переменных. Например, способ измерения может приводить к количественно выраженным результатам (таким как, например, интенсивности сигналов) для указанных первой и второй переменных, при этом указанные результаты являются функцией значения указанных переменных, и при этом указанные результаты можно сравнивать непосредственно с получением значения первой переменной относительно второй переменной, без фактической потребности в первоначальном преобразовании результатов в абсолютные значения соответствующих переменных.

Любые метаболиты можно измерять совместно, вследствие чего измеренное содержание соответствует сумме количеств соединений, измеренных совместно. В другом примере каждый из метаболитов можно измерять индивидуально.

Методики масс–спектрометрии

Такую методику также можно применять для обнаружения одного или более метаболитов, описанных в данном документе. В целом, в данном документе применимы любые методики масс–спектрометрии (МS), с помощью которых можно получить точную информацию о массе молекул. Подходящие методики и системы MS и MS/MS хорошо известны per se (см., например, LC/MS: A Practical User's Guide by Marvin C. McMaster ISBN: 9780471655312; Methods in Molecular Biology, vol. 146: «Mass Spectrometry of Proteins and Peptides», под ред. Chapman, Humana Press 2000, ISBN 089603609x; Biemann 1990. Methods Enzymol 193: 455–79; или Methods in Enzymology, vol. 402: «Biological Mass Spectrometry», Burlingame, ed., Academic Press 2005, ISBN 9780121828073), и они могут применяться в данном документе. Комплексы, приборы и системы для MS, подходящие для анализа химических или биологических соединений, могут предусматривать без ограничения: времяпролетную MS с матрично–активированной лазерной ионизацией и десорбцией (MALDI–TOF); MALDI–TOF с распадом за пределами источника (PSD); MALDI–TOF/TOF; времяпролетную масс–спектрометрию MS с поверхностно–улучшенной лазерной десорбцией/ионизацией (SELDI–TOF); масс–спектрометрию с электрораспылительной ионизацией (ESI–MS); ESI–MS/MS; ESI–MS/(MS)ⁿ (n составляет целое число больше нуля); MS с ESI и 3D или линейной (2D) ионной ловушкой; MS с ESI и тройным квадрупольным детектором; TOF масс–спектрометрию с ESI и квадрупольным ортогональным детектором (Q–TOF); системы MS с ESI и преобразованием Фурье; десорбцию/ионизацию на кремнии (DIOS); масс–спектрометрию вторичных ионов (SIMS); масс–спектрометрию с химической ионизацией при атмосферном давлении (APCI–MS); APCI–MS/MS; APCI–(MS)ⁿ; масс–спектрометрию с фотоионизацией при атмосферном давлении (APPI–MS); APPI–MS/MS и APPI–(MS)ⁿ. Обнаружение и количественное определение химических соединений с помощью масс–спектрометрии может предусматривать мониторинг множественных реакций (MRM), например, как описано в Roepstorff & Fohlman (Biomed. Mass Spectrom. (1984) 11, 601). Преимущественно способы MS–анализа можно объединять с расположенными выше в технологическом потоке способами разделения или фракционирования химических соединений, такими как, например, хроматографические и другие способы, описанные в данном документе ниже.

Хроматография

Хроматографию также можно применять для измерения химических соединений, в том числе метаболитов, описанных в данном документе. Термин «хроматография» охватывает способы разделения химических соединений, которые упоминаются в данном качестве и широко доступны из уровня техники. В предпочтительном подходе хроматография относится к процессу, при котором смесь химических веществ, переносимых движущимся потоком жидкости или газа («подвижная фаза»), разделяется на компоненты в результате дифференциального распределения метаболитов, когда они протекают через неподвижную жидкую или твердую фазу («стационарная фаза») или над ней, между подвижной фазой и стационарной фазой. Стационарная фаза обычно может представлять собой мелкодисперсное твердое вещество, лист фильтрующего материала или тонкую пленку жидкости на поверхности твердого вещества и т. п.

Хроматография, применяемая в данном документе, предпочтительно может представлять собой колоночную (т. е., при которой стационарная фаза внесена или упакована в колонку), предпочтительно жидкостную хроматографию и еще более предпочтительно HPLC. Хотя особенности хроматографии хорошо известны из уровня техники, для дальнейшего руководства см., например, Meyer M., 1998, ISBN: 047198373X, и «Practical HPLC Methodology and Applications», Bidlingmeyer, B. A., John Wiley & Sons Inc., 1993. Иллюстративные типы хроматографии включают без ограничения высокоэффективную жидкостную хроматографию (HPLC), HPLC с нормальной фазой (NP–HPLC), HPLC с обращенной фазой (RP–HPLC), ионообменную хроматографию (IEC), такую как катионообменная или анионообменная хроматография, хроматографию гидрофильных взаимодействий (HILIC), хроматографию гидрофобных взаимодействий (HIC), эксклюзионную хроматографию (SEC), в том числе гель–фильтрационную хроматографию или гель–проникающую хроматографию, хроматофокусирование, аффинную хроматографию, такую как иммуноаффинная хроматография, аффинная хроматография с иммобилизированным металлом и т. п.

Наборы

В настоящем изобретении дополнительно предусмотрены наборы для обнаружения метаболитов, изложенных в данном документе, содержащие средства для определения уровня одного или более метаболитов, изложенных в данном документе, в образце от субъекта. В предпочтительном варианте осуществления в идеальном случае такой набор или наборы разработаны для применения в домашних условиях или врачом в условиях общей практики.

Дополнительно раскрыт набор, в частности, набор для определения статуса курения субъекта, изложенного в данном документе, у субъекта, причем указанный набор содержит: (i) средства для измерения метаболитов, изложенных в данном документе, в частности, в образце от субъекта и (ii) необязательно эталонное значение для метаболита или метаболитов, или средства для установления указанного эталонного значения, где указанное эталонное значение отражает обнаружения метаболитов.

Набор для тестирования в домашних условиях может предоставить субъекту результаты, которые он/она может сообщить практикующему врачу, после чего может быть предпринято соответствующее действие. Неограничивающими примерами являются системы, содержащие молекулы для специфического связывания требуемого метаболита(–ов), прикрепленные к твердой фазе, например, портативное устройство для иммунного анализа с латеральным потоком, такое как экспресс–тест. Одним неограничивающим примером является применение тестовой полоски с латеральным потоком и меченого средства для специфического связывания (например, в сэндвич–формате), причем для данной комбинации не требуется никакая промывка мембраны. Тестовая полоска с латеральным потоком хорошо известна, например, в области наборов для тестирования беременности, в которых на подложке присутствует первое антитело к hCG, и оно переносится в комплексе с hCG потоком мочи на иммобилизированное второе антитело к hCG, которое, в свою очередь, обеспечивает визуализацию. Другие неограничивающие примеры таких устройств, систем или наборов для тестирования в домашних условиях можно найти, например, в следующих патентах США: 6107045, 6974706, 5108889, 6027944, 6482156, 6511814, 5824268, 5726010, 6001658 или публикациях заявок на патент США: 2008/0090305 или 2003/0109067.

Средства для измерения присутствия и/или содержания метаболитов в наборах могут содержать одно или более средств для специфического связывания, способных специфически связываться с указанным метаболитом(–ами). Одно или более средств для специфического связывания могут представлять собой inter alia антитело или его фрагмент, аптамер, аффимер, фотоаптамер, белок, пептид, пептидомиметик или малую молекулу. Наборы по настоящему изобретению могут содержать один или более аптамеров, аффимеров или антител или их фрагментов, более предпочтительно одно или более антител или их фрагментов, способных специфически связываться с указанными одним или более метаболитами, изложенными в данном документе. Преимущественно связывающее средство может быть нанесено или иммобилизировано на твердой фазе или подложке. В наборах может использоваться технология на основе иммунного анализа, или технология на основе масс–спектрометрического анализа, или технология на основе хроматографии, или комбинация указанных технологий. Предпочтительно в наборах используется технология на основе иммунного анализа, в предпочтительных, но неограничивающих примерах, технологии на основе иммуноферментного анализа (ELISA), радиоиммунного анализа (RIA), флуоресцентного иммунного анализа, хемилюминесцентного иммунного анализа, иммунного анализа DRI, количественного иммунного анализа, иммунного анализа с латеральным потоком, микрофлюидного иммунного анализа и иммунного анализа с агглютинацией, предпочтительно применяется ELISA. В качестве альтернативы или дополнения присутствие и/или содержание любого одного или более метаболитов, изложенных в данном документе, может измеряться с применением методик, основанных на антителах или хроматографии, с применением анализов связывания в конкурентном формате или в сэндвич–формате, и/или с применением дериватизирующих и/или содержащих краситель средств. Предпочтительно средствами для измерения содержания маркера(–ов) могут быть иммунный анализ, например, иммунный анализ с использованием антитела(антител) или его фрагментов, или аптамеров, или аффимеров, либо по отдельности, либо в комбинации, например, анализ ELISA или RIA.

Соответственно, раскрыт набор, в частности, набор для обнаружения метаболитов, изложенных в данном документе, у субъекта, причем набор содержит: (i) одно или более средств для специфического связывания, способных специфически связываться с метаболитами, описанными в данном документе, в частности, в образце от субъекта, (ii) предпочтительно, известное содержание или концентрацию указанных метаболитов (например, для применения в качестве контролей, стандартов и/или калибраторов), (iii) необязательно и предпочтительно эталонное значение для метаболита или метаболитов или средства для установления упомянутого эталонного значения, где указанное эталонное значение отражает обнаружение метаболитов. Указанные компоненты под (i) и/или (ii) предпочтительно могут быть помечены, как описано в данном документе.

Также раскрыт набор для определения статуса курения субъекта, содержащий или состоящий из: (i) первого устройства, приспособленного для обнаружения присутствия биомаркера воздействия табачного дыма в биологическом образце, где указанный биомаркер состоит из котинина;(ii) второго устройства, приспособленного для обнаружения присутствия биомаркера воздействия табачного дыма в биологическом образце, где указанный биомаркер состоит из NNAL; и/или (iii) третьего устройства, приспособленного для обнаружения присутствия биомаркера воздействия табачного дыма в биологическом образце, где указанный биомаркер состоит из CEMA; и необязательно комплекта инструкций для определения статуса курения субъекта. Каждое устройство, как правило, будет содержать молекулы для специфического связывания котинина, или общего NNAL, или CEMA, прикрепленные к твердой фазе, при этом предпочтительно устройство представляет собой портативное устройство для иммунного анализа с латеральным потоком, такое как экспресс–тест. Как правило, молекулы для специфического связывания из первого устройства приспособлены для обнаружения котинина в моче в количестве приблизительно 200–800 нг/мл. Как правило, молекулы для специфического связывания из второго устройства приспособлены для обнаружения общего NNAL в моче в количестве 10–125 пг/мл в суточной моче. Как правило, молекулы для специфического связывания из третьего устройства приспособлены для обнаружения CEMA в моче в количестве 5–80 нг/мл в суточной моче. Количества метаболитов можно измерять с применением иммунного анализа, предпочтительно твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), радиоиммунного анализа (RIA), флуоресцентного иммунного анализа, хемилюминесцентного иммунного анализа, иммунного анализа DRI, количественного иммунного анализа, иммунного анализа с латеральным потоком, микрофлюидного иммунного анализа, иммунного анализа с агглютинацией, ELISA или методик на основании антител или хроматографии, предпочтительно анализов конкурентного связывания или анализов с использованием дериватизирующих и/или содержащих краситель средств. Молекулы для специфического связывания могут быть выбраны из группы, состоящей из антитела или его фрагмента, аптамера, фотоаптамера, белка, пептида, пептидомиметика или малой молекулы или комбинации двух или более из них. Каждое устройство может представлять собой иммунохроматографическое устройство, предпочтительно иммунохроматографическое устройство с латеральным потоком. Дополнительно раскрыто применение набора, описанного в данном документе, для обнаружения метаболитов, изложенных в данном документе.

Также раскрыты матрица или микроматрица из связывающих средств, содержащие одно или более связывающих средств, способных специфически связываться с метаболитами, изложенными в данном документе, предпочтительно известное количество или концентрацию указанных связывающих средств. Такие связывающие средства могут быть такими, как подробно описано в данном документе.

Метки

В некоторых вариантах осуществления реагенты, раскрытые в данном документе, могут содержать обнаруживаемую метку. Термин «метка» относится к любому атому, молекуле, фрагменту или биомолекуле, которые можно применять для обеспечения обнаруживаемого и предпочтительно количественно выраженного результата или свойства, и которые могут быть присоединены или включены в состав представляющего интерес объекта, такого как метаболит или средство для специфического связывания. Предпочтительно метки могут поддаваться обнаружению с помощью масс–спектрометрических, спектроскопических, оптических, колориметрических, магнитных, фотохимических, биохимических, иммунохимических или химических средств. Метки включают без ограничения красители; радиоактивные метки, такие как ³²P, ³³P, ³⁵S, ¹²⁵I, ¹³¹I; электронно–плотные реагенты; ферменты (например, фосфатазу хрена или щелочную фосфатазу, которые обычно используются в иммунных анализах); связывающие фрагменты, такие как биотин–стрептавидин; гаптены, такие как дигоксигенин; люминогенные, фосфоресцентные или флуорогенные фрагменты; массовые метки и флуоресцентные красители по отдельности или в комбинации с фрагментами, которые могут подавлять или сдвигать спектры излучения посредством резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET). В данном документе также описаны другие виды меток, такие как окрашенные частицы, например, наночастицы золота.

Например, метка может представлять собой метку, изменяющую массу. Предпочтительно метка, изменяющая массу, может предусматривать присутствие особого стабильного изотопа в одном или более химических фрагментах метаболита в сравнении с соответствующим ему немеченым метаболитом. Фрагменты с массовой меткой особенно применимы в качестве положительных контролей, стандартов и калибраторов в путях применения на основе масс–спектрометрии. В частности, молекулы, включающие один или более особых изотопов, являются химически подобными, разделяются с помощью хроматографии и электрофореза аналогичным образом, а также ионизируются и фрагментируются одинаково. Однако в подходящем масс–анализаторе такие молекулы будут проявлять соотношения масса/заряд, делающие возможным их распознавание, и, тем самым, могут поддаваться различению. Примеры пар стабильных изотопов, которые возможно распознавать, включают H и D, ¹²C и ¹³C, ¹⁴N и ¹⁵N или ¹⁶O и ¹⁸O.

Также рассматривается применение метаболитов, изложенных в данном документе, необязательно содержащих обнаруживаемую метку, в качестве (положительных) контролей, стандартов или калибраторов в качественных или количественных анализах обнаружения (способах измерения) указанных метаболитов и, в частности, в таких способах обнаружения метаболитов, изложенных в данном документе, у субъектов. Метаболиты могут обеспечиваться в любой форме, inter alia в виде осадка, в растворе в виде жидкости или в замороженном виде, или в виде ковалентно или нековалентно иммобилизированном на твердой фазе, как, например, на твердой хроматографической матрице или на стекле, пластике или других подходящих поверхностях (например, в виде части матрицы или микроматрицы).

Отклонение

«Отклонение» первого значения от второго значения обычно может охватывать любое направление (например, увеличение: первое значение> второе значение или уменьшение: первое значение <второе значение) и любую степень изменения. Например, отклонение может охватывать уменьшение первого значения без ограничения на по меньшей мере приблизительно 10% (в приблизительно 0,9 раза или менее), или на по меньшей мере приблизительно 20% (в приблизительно 0,8 раза или менее), или на по меньшей мере приблизительно 30% (в приблизительно 0,7 раза или менее), или на по меньшей мере приблизительно 40% (в приблизительно 0,6 раза или менее), или на по меньшей мере приблизительно 50% (в приблизительно 0,5 раза или менее), или на по меньшей мере приблизительно 60% (в приблизительно 0,4 раза или менее), или на по меньшей мере приблизительно 70% (в приблизительно 0,3 раза или менее), или на по меньшей мере приблизительно 80% (в приблизительно 0,2 раза или менее), или на по меньшей мере приблизительно 90% (в приблизительно 0,1 раза или менее) относительно второго значения, с которым проводится сравнение.

Например, отклонение может охватывать увеличение первого значения без ограничения на по меньшей мере приблизительно 10% (в приблизительно 1,1 раза или более), или на по меньшей мере приблизительно 20% (в приблизительно 1,2 раза или более), или на по меньшей мере приблизительно 30% (в приблизительно 1,3 раза или более), или на по меньшей мере приблизительно 40% (в приблизительно 1,4 раза или более), или на по меньшей мере приблизительно 50% (в приблизительно 1,5 раза или более), или на по меньшей мере приблизительно 60% (в приблизительно 1,6 раза или более), или на по меньшей мере приблизительно 70% (в приблизительно 1,7 раза или более), или на по меньшей мере приблизительно 80% (в приблизительно 1,8 раза или более), или на по меньшей мере приблизительно 90% (в приблизительно 1,9 раза или более), или на по меньшей мере приблизительно 100% (в приблизительно 2 раза или более), или на по меньшей мере приблизительно 150% (в приблизительно 2,5 раза или более), или на по меньшей мере приблизительно 200% (в приблизительно 3 раза или более), или на по меньшей мере приблизительно 500% (в приблизительно 6 раз или более), или на по меньшей мере приблизительно 700% (в приблизительно 8 раз или более) и т. п. относительно второго значения, с которым проводится сравнение.

Предпочтительно отклонение может относиться к статистически значимому наблюдаемому изменению. Например, отклонение может относиться к наблюдаемому изменению, которое выходит за пределы допустимых отклонений эталонных значений в данной совокупности (как выражено, например, в виде стандартного отклонения или стандартной ошибки, или их заранее заданного кратного значения, например, ±1xSD или ±2xSD, или ±1xSE или ±2xSE). Отклонение также может относиться к значению, выходящему за пределы эталонного диапазона, определяемого значениями в данной совокупности (например, за пределами диапазона, который составляет ≥40%,≥50%, ≥60%, ≥70%, ≥75%, или ≥80%, или ≥85%, или ≥90%, или ≥95%, или даже ≥100% значений в указанной совокупности).

Вывод о наличии отклонения может быть сделан, если наблюдаемое изменение превышает заданное пороговое или граничное значение. Такое пороговое или граничное значение можно выбирать, как это общеизвестно в данной области техники, для обеспечения выбранной чувствительности и/или специфичности способов обнаружения, например, чувствительности и/или специфичности, составляющих по меньшей мере 50%, или по меньшей мере 60%, или по меньшей мере 70%, или по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95%.

Дополнительные способы

Присутствие и/или концентрацию метаболита(–ов) в образце можно измерять с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с применением чипа, содержащего связывающую молекулу для указанного метаболита(–ов), резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET), резонансный перенос энергии биолюминесценции (BRET), гашение флуоресценции, измерение поляризации флуоресценции или другие способы, известные из уровня техники. Для определения присутствия и/или концентрации любого метаболита(–ов) в образце может применяться любой из описанных анализов связывания. Для осуществления этого связывающие молекулы для метаболита(–ов) приводят в реакцию с образцом, и концентрацию метаболита(–ов) измеряют в соответствии с применяемым анализом связывания. Для проверки и калибровки анализа, следовательно, можно осуществлять контрольные реакции с применением разных концентраций стандартного метаболита(–ов) и/или связывающей молекулы. В случае использования твердофазных анализов после инкубации осуществляют стадию промывки для удаления несвязанных метаболитов. Связанный метаболит измеряют в соответствии с данной меткой (например, сцинтилляционный счет, флуоресценция, антитело–краситель и т. д.). Если требуется качественный результат, контрольные и другие концентрации могут не потребоваться. Конечно, роли указанного метаболита(–ов) и связывающей молекулы можно переключать; специалист в данной области может приспосабливать этот способ так, чтобы связывающая молекула применялась в отношении образца при различных концентрациях образца.

Для измерения метаболитов в настоящем изобретении можно применять дополнительные способы разделения, идентификации или количественного определения химических соединений, необязательно в сочетании с любым из вышеописанных способов анализа. Такие способы включают без ограничения разделение с помощью химической экстракции, изоэлектрическое фокусирование (IEF), в том числе капиллярное изоэлектрическое фокусирование (CIEF), капиллярный изотахофорез (CITP), капиллярную электрохроматографию (CEC) и т. п., одномерный электрофорез в полиакриламидном геле (PAGE), двумерный электрофорез в полиакриламидном геле (2D–PAGE), капиллярный гель–электрофорез (CGE), капиллярно–зональный электрофорез (CZE), мицеллярную электрокинетическую хроматографию (MEKC), электрофорез в свободном потоке (FFE) и т. д.

Стереоизомеры и геометрические изомеры

Метаболиты, раскрытые в данном документе, могут существовать в виде стереоизомеров и/или геометрических изомеров. Они могут иметь один или более центров асимметрии и/или геометрических центров и, следовательно, могут существовать в двух или более стереоизомерных и/или геометрических формах. В настоящем изобретении предусматривается применение всех индивидуальных стереоизомеров и их геометрических изомеров, а также их смесей.

Сокращение курения традиционных сигарет

Если будет сделано заключение, что субъект, который прошел тестирование, является потребителем традиционных сигарет, тогда субъекту может быть назначен один или более видов терапии для сокращения курения традиционных сигарет на основании вышеуказанного результата теста.

Было разработано множество видов терапии, цель которых заключалась в содействии сокращению курения традиционных сигарет у курильщиков, при этом преобладающими являются виды никотинзаместительной терапии. Никотинзаместительная терапия предусматривает введение никотина посредством подходящей системы доставки. Никотинзаместительные продукты, которые в настоящее время представлены на рынке, включают: (1) никотиновые трансдермальные пластыри, такие как NicoDerm® CQ® (GlaxoSmithKline), Habitrol® (Novartis Consumer Health) и Nicotrol® (Pharmacia Consumer Healthcare); (2) никотиновую жевательную резинку, такую как Nicorette® (GlaxoSmithKline); (3) никотиновый назальный спрей, такой как Nicotrol NS® (Pharmacia Consumer Healthcare) и (4) никотиновый ингалятор (система ингаляции никотина Nicotrol® (Pharmacia Consumer Healthcare). Также в качестве терапии для прекращения курения были разработаны или предложены антидепрессанты. Одним из таких антидепрессантов является бупропион. Другие антидепрессанты, предлагаемые для терапии по прекращению курения, включают доксепин, имипрамин. В качестве терапии для прекращения курения также были исследованы или предложены анксиолитики, которые включают, например, изовалерамид, диазепам, мепробамат, метопролол, ондансетрон и окспренолол. Другим классом средств, которые исследовали в качестве терапии для прекращения курения, являются антагонисты никотиновых рецепторов, примеры которых включают мекамиламин, гексаметоний, дигидро–бета–эритроидин и d–тубокурарин. Еще одним классом средств являются антагонисты опиоидных реепторов, такие как налтрексон (также известный как 17–(циклопропилметил)–4,5–эпокси–3,14–дигидроксимохинан–6–он), налоксон (также известный как 4,5–эпокси–3,14–дигидрокси–17–(2–пропенил)морфинан–6–он) и налмефен (также известный как 5–альфа–17–(циклопропилметил)–4,5–эпокси–6–метиленморфинан–3,14–диол).

Страхование

Настоящее изобретение может найти применение при определении соответствия требованиям страхования или при расчете страховых взносов на основании статуса курения субъекта. Таким образом, в дополнительном аспекте предусмотрен способ определения соответствия требованиям страхования или расчета страховых взносов на основе статуса курения субъекта, предусматривающий: (i) измерение в биологическом образце от субъекта количества двух или трех метаболитов в образце, причем указанные метаболиты состоят из котинина и одного или более из общего NNAL и CEMA: (ii) на основании измерений на (i) определение статуса курения субъекта; и (iii) на основании определения статуса курения на (ii) определение соответствия субъекта требованиям страхования или расчета страхового взноса на основании статуса курения субъекта.

Клинические испытания

Настоящее изобретение может найти применение в клинических испытаниях. Например, если для соблюдения режима клинического испытания требуется, чтобы субъект имел определенный статус курения, то настоящее изобретение можно применять для отслеживания или проверки такого статуса курения. Таким образом, в дополнительном аспекте предусмотрен способ определения соблюдения субъектом режима клинического испытания, предусматривающий: (i) измерение в биологическом образце от субъекта количества двух или трех метаболитов в образце, причем указанные метаболиты состоят из котинина и одного или более из общего NNAL и CEMA: (ii) на основании измерений на (i) определение статуса курения субъекта и (iii) на основании определения статуса курения на (ii) определение соблюдения субъектом режима клинического испытания.

Если будет установлено, что субъект не соблюдает требования клинического испытания, то субъект может быть удален из клинического испытания.

Если будет установлено, что субъект не соблюдал требования клинического испытания, то данные, полученные от этого субъекта, могут быть удалены из клинического испытания.

В родственном аспекте может быть определено, что субъект не соблюдал статус курения в клиническом исследовании, и в таком случае субъект, не соблюдающий режим, может быть удален из испытания, или данные от субъекта, не соблюдающего режим, могут быть удалены из клинического испытания.

Обработка данных с помощью компьютера

В данном документе также описана система, содержащая компьютерное хранилище данных, которое содержит или состоит из эталонного значения или содержания котинина и одного или более из общего NNAL и CEMA, причем указанное эталонное значение отражает известное содержание метаболита для определения статуса курения субъекта; и компьютерную систему, запрограммированную для доступа к хранилищу данных и применения информации из хранилища данных в комбинации с информацией о содержании метаболитов в образце от субъекта, для определения статуса курения субъекта. Также раскрыт способ определения статуса курения субъекта, предусматривающий применение системы и применение системы для определения статуса курения. Методики и устройства могут быть реализованы на любом подходящем аппаратном оборудовании, в том числе в программируемой вычислительной системе. Настоящее изобретение является рабочим во многих средам или конфигурациям вычислительных систем общего или специального назначения. Примеры хорошо известных вычислительных систем, сред и/или конфигураций, которые могут подходить для применения, могут включать без ограничения персональные компьютеры, серверные компьютеры, переносные или компактные устройства, мультипроцессорные системы, микропроцессорные системы, телевизионные приставки, программируемую потребительскую электронику, сетевые ПК, мини–компьютеры, универсальные вычислительные машины, распределенные вычислительные среды или облачные вычислительные среды, которые включают любые из перечисленных выше систем или устройств и т. п. Вычислительная среда может выполнять исполнимые компьютером инструкции, такие как программные модули. Как правило, программные модули включают процедуры, программы, объекты, компоненты, структуры данных и т. д., которые осуществляют конкретные задачи или реализуют конкретные типы абстрактных данных. Настоящее изобретение также можно применять на практике в распределенных вычислительных средах, где задачи выполняются удаленными устройствами обработки, которые связаны через сеть передачи данных. В распределенной вычислительной среде программные модули могут быть расположены как на локальных, так и на удаленных компьютерных носителях данных, в том числе запоминающих устройствах. Компоненты системы для применения в настоящем раскрытии могут включать без ограничения блок обработки, системную память и системную шину, которая соединяет различные компоненты системы, в том числе системную память, с блоком обработки. Системная шина может представлять собой любой из нескольких типов шинных структур, в том числе шину памяти или контроллер памяти, периферийную шину и локальную шину, использующих любую из множества шинных архитектур. В качестве примера, а не ограничения, такие архитектуры включают шину промышленной стандартной архитектуры (ISA), шину микроканальной архитектуры (MCA), шину усовершенствованной ISA (EISA), локальную шину ассоциации по стандартам в области видеоэлектроники (VESA) и шину взаимодействия периферийных компонентов (PCI), также известную как шина расширения. Как правило, компьютер включает множество машиночитаемых носителей, которые хорошо известны в данной области техники.

При необходимости, тест может быть ассоциирован с мобильным устройством для считывания, которое позволяет автоматически передавать результаты теста, необязательно в режиме реального времени.

Дополнительные аспекты настоящего изобретения изложены ниже в следующих пронумерованных пунктах.

1. Способ определения статуса курения субъекта, предусматривающий: (i) измерение в биологическом образце от субъекта количества двух или трех метаболитов в образце, причем указанные метаболиты состоят из котинина и одного или более из общего NNAL и CEMA: и (ii) на основе измерений на (i) определение статуса курения субъекта.

2. Способ определения статуса курения субъекта, предусматривающий: (i) измерение содержания двух или трех метаболитов в образце от субъекта, причем указанные метаболиты состоят из котинина и одного или более из общего NNAL и CEMA; (ii) сравнение содержания метаболитов, измеренного на стадии (i), с эталонным значением или значением на исходном уровне, отражающими известное количество котинина и общего NNAL и/или CEMA; (iii) обнаружение отклонения или отсутствия отклонения количества котинина и общего NNAL и/или CEMA, измеренного на (i), от эталонного значения или значения на исходном уровне и (iv) соотнесение указанного обнаружения отклонения или отсутствия отклонения со статусом курения субъекта.

3. Способ отслеживания прогресса в изменении статуса курения у субъекта, предусматривающий: (i) осуществление способа по пункту 1 или пункту 2 в отношении по меньшей мере двух биологических образцов от субъекта, где каждый образец отобран в разные моментах времени; и (ii) сравнение измерений, выполненных в каждый из разных моментов времени, где изменение в измерениях с течением времени указывает на то, что статус курения субъекта изменился с течением времени.

4. Способ определения статуса курения субъекта, предусматривающий: (i) получение данных, отражающих значения содержания двух или трех метаболитов в образце от субъекта, причем указанные метаболиты состоят из котинина и одного или более из общего NNAL и CEMA; (ii) осуществление доступа к хранилищу данных на компьютере, причем указанное хранилище данных содержит эталонное значение или значение на исходном уровне для содержания котинина и общего NNAL и/или CEMA, которые являются диагностическими для определения статуса курения субъекта; и (iii) сравнение данных, полученных на (i), с эталонным значением или значением на исходном уровне в хранилище данных на компьютере, упомянутом в (ii), с определением тем самым статуса курения субъекта.

5. Способ распознавания статуса курения субъекта, причем указанный способ предусматривает: (i) получение или обеспечение образца от субъекта; (ii) определение количеств двух или трех метаболитов в образце, где указанные метаболиты состоят из котинина и общего NNAL и/или CEMA, путем приведения образца в контакт с антителом к котинину и антителом к общему NNAL и/или антителом к CEMA, и обнаружение связывания между котинином и общим NNAL и/или CEMA и антителами и (iii) определение статуса курения субъекта на основании обнаружения присутствия котинина и общего NNAL и/или CEMA в образце.

6. Способ определения статуса курения субъекта и введения одного или более видов терапии для сокращения курения традиционных сигарет, причем указанный способ предусматривает: (i) получение или обеспечение образца от субъекта; (ii) определение того, присутствуют ли в образце два или три метаболита, причем указанные метаболиты состоят из котинина и общего NNAL и/или CEMA; (iii) определение статуса курения субъекта и, (iv) в зависимости от результата, полученного на (iii), введение эффективного количества одного или более видов терапии для сокращения курения традиционных сигарет.

7. Способ диагностики и сокращения курения традиционных сигарет у субъекта, причем указанный способ предусматривает: (i) получение образца от субъекта; (ii) обнаружение того, присутствует ли котинин и одно или более из общего NNAL и CEMA в образце; и (iii) введение субъекту, который диагностирован как «курильщик», эффективного количества одного или более видов терапии для сокращения курения традиционных сигарет у субъекта.

8. Способ по любому из предыдущих пунктов, где биологический образец представляет собой мочу, предпочтительно суточную мочу.

9. Способ по любому из предыдущих пунктов, где количества метаболитов измеряют на основании количества генерируемого сигнала.

10. Способ по любому из предыдущих пунктов, где количества метаболитов измеряют с применением иммунного анализа, предпочтительно твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), радиоиммунного анализа (RIA), флуоресцентного иммунного анализа, хемилюминесцентного иммунного анализа, иммунного анализа DRI, количественного иммунного анализа, иммунного анализа с латеральным потоком, микрофлюидного иммунного анализа, иммунного анализа с агглютинацией, ELISA или методик на основании антител или хроматографии, предпочтительно анализов конкурентного связывания или анализов с применением дериватизирующих и/или содержащих краситель средств.

11. Способ по любому из предыдущих пунктов, где количества метаболитов измеряют после 2 и/или 5 дней периода исследования в суточной моче, при этом предпочтительно количества метаболитов сравнивают со значением на исходном уровне для каждого из метаболитов.

12. Устройство для определения статуса курения субъекта, где указанное устройство приспособлено для обнаружения присутствия двух или трех метаболитов в биологическом образце, причем указанные метаболиты состоят из котинина и общего NNAL и/или CEMA.

13. Устройство по пункту 12, содержащее молекулы для специфического связывания котинина и общего NNAL и/или CEMA, прикрепленные к твердой фазе, при этом предпочтительно устройство представляет собой полоску с латеральным потоком или устройство для экспресс–теста.

14. Система, содержащая: (i) компьютерное хранилище данных, которое содержит или состоит из эталонного значения или значения на исходном уровне для содержания котинина и одного или более из общего NNAL и CEMA, причем указанные эталонное значение или значение на исходном уровне отражают известное содержание метаболита для определения статуса курения субъекта; и (ii) компьютерную систему, запрограммированную для доступа к хранилищу данных и применения информации из хранилища данных в комбинации с информацией о содержании метаболитов в образце от субъекта, для определения статуса курения субъекта.

Настоящее изобретение дополнительно описано в примере ниже, который предусмотрен для более подробного описания настоящего изобретения. Этот пример, в котором изложен предпочтительный вариант, предполагаемый в настоящее время для осуществления настоящего изобретения, предназначен для иллюстрации, а не для ограничения настоящего изобретения.

ПРИМЕР

Данный пример представляет собой рандомизированное, контролируемое, открытое, мультицентровое, групповое исследование на 3 параллельных группах, предусмотренное для демонстрации снижения воздействия выбранных компонентов дыма в традиционных сигаретах (СС). В исследовании принимали участие здоровые курильщики, перешедшие на продукт, нагреваемый без сжигания (бездымная альтернатива (SW)), или те, кто отказался от курения (SA), в сравнении с продолжающими использовать CC в течение 5 дней в условиях изоляции и с пролонгированием на 85 дней в амбулаторных условиях. Это было исследование курения ad libitum. Измерения на исходном уровне проводят, позволяя субъекту курить выбранную им марку традиционных сигарет в течение 2 дней. По истечении данного 2–дневного периода затем субъект должен принять решение продолжать курить традиционные сигареты, перейти на бездымную альтернативу или отказаться от курения. Затем начинается период исследования. Способы измерения каждого из метаболитов описаны в Haziza et al. (2017) Data in Brief 10, 283–293.

Во время периода изоляции соблюдение распределения в группу продукта/схемы (исключительное использование бездымной альтернативы и CC в группах SW и CC, соответственно, и полный отказ от курения в группе SA) гарантировали за счет строгого распределения каждой табачной палочки/CC по запросу субъекта. Во время амбулаторного периода субъектов, рандомизированных в группу SW, предписывали использовать исключительно продукты HNB, а субъектам, рандомизированным в группу SA, предписывали отказ от курения.

Общий NNAL (пг/мл), CEMA (нг/мл) и свободный котинин (нг/мл) измеряли в моче, и межквартильный размах (IQR = [1^–й квартиль; 3^–й квартиль]) представлен в таблице ниже. Кроме того, данные отражены в виде коробчатых диаграмм на фигурах ниже. Нижняя часть прямоугольника представляет собой первый квартиль (значение, ниже которого лежат 25% наблюдений), верхняя часть представляет собой третий квартиль (значение, ниже которого лежат 75% наблюдений), а средняя полоса представляет собой медиану наблюдений. Усы продолжаются до минимального наблюдаемого значения и максимального наблюдаемого значения, соответственно.

Как можно видеть на фиг. 1–3 и в таблице 1, CEMA и котинин могут обеспечивать разделения субъектов из групп CC и SA после 2 дней, при этом специфичность и чувствительность составляют не менее 75%, тогда как общий NNAL обеспечивает такие же уровни дискриминации от дня 5 до дня 30. Распознавание субъектов в группе SW и субъектов в группе CC можно осуществлять на основе CEMA и общего NNAL после дня 5, при этом специфичность и чувствительность составляют не менее 75%. Наконец, распознавание субъектов в группе SW и субъектов в группе SA можно осуществлять на основе свободного котинина после 2 дней (при этом специфичность и чувствительность составляют не менее 75%).

Любая публикация, цитируемая или описанная в данном документе, предоставляет соответствующую информацию, раскрытую до даты подачи настоящей заявки. Заявления, сделанные в данном документе, не должны быть истолкованы как признание того, что авторы настоящего изобретения не имеют оснований для его противопоставления таким раскрытиям как более раннего. Все публикации, упомянутые в вышеприведенном описании, включены в данный документ посредством ссылки. Различные модификации и варианты настоящего изобретения будут очевидны специалистам в данной области техники без отступления от объема и сущности настоящего изобретения. Несмотря на то, что настоящее изобретение описано применительно к конкретным предпочтительным вариантам осуществления, следует понимать, что заявленное изобретение не должно неправомерно ограничиваться такими конкретными вариантами осуществления. В действительности подразумевается, что различные модификации описанных вариантов осуществления изобретения, которые очевидны специалистам в клеточной, молекулярной биологии и биологии растений или в смежных областях, находятся в пределах объема прилагаемой формулы изобретения.

ТАБЛИЦА 1

Межквартильные размахи для CEMA, котинина и общего NNAL в каждой группе для каждого момента времени отбора образцов (IQR = [1^–й квартиль; 3^–й квартиль])

1. Устройство для определения статуса курения субъекта, где указанное устройство содержит несколько разных молекул для специфического связывания, нанесенных на твердую фазу, для обнаружения присутствия двух или трех биомаркеров воздействия табачного дыма в биологическом образце, причем указанные биомаркеры воздействия табачного дыма состоят из:

(i) котинина и общего 4–(метилнитрозамино)–1–(3–пиридил)–1–бутанола (NNAL); или

(ii) котинина и N–ацетил–S–[2–карбоксиэтил]–L–цистеина (CEMA); или

(iii) котинина, и общего NNAL, и CEMA;

где указанное устройство способно отличать курильщиков традиционных сигарет в текущий момент времени от тех, кто перешел на бездымную альтернативу, где табак нагревается, а не сжигается, или от тех, кто отказался от курения.

2. Устройство по п. 1, где устройство представляет собой портативное устройство для иммунного анализа с латеральным потоком, предпочтительно экспресс–тест, выполненное с возможностью осуществления конкурентного иммунного анализа.

3. Устройство по п. 2, где портативное устройство для иммунного анализа с латеральным потоком содержит: (i) прокладку для образца; (ii) прокладку для конъюгата и (iii) по меньшей мере одну зону обнаружения.

4. Устройство по п. 3, где прокладка для конъюгата содержит или состоит из меченых средств для специфического связывания, каждое из которых способно индивидуально связывать: (i) котинин и общий NNAL; или (ii) котинин и CEMA; или (iii) котинин, и общий NNAL, и CEMA, при этом предпочтительно каждое из меченых средств для специфического связывания представляет собой антитело или его фрагмент, аптамер, фотоаптамер, аффимер, белок, пептид, пептидомиметик или малую молекулу.

5. Устройство по п. 3 или 4, где:

(a) прокладка для конъюгата содержит или состоит из меченых средств для специфического связывания, нанесенных на нее, каждое из которых способно индивидуально связывать: (i) котинин и общий NNAL; или (ii) котинин и CEMA; или (iii) котинин, и общий NNAL, и CEMA, и способно образовывать конъюгаты из меченого средства для специфического связывания с ними; и

(b) зона обнаружения содержит или состоит из иммобилизированных средств для специфического связывания, каждое из которых способно индивидуально связываться с (i) котинином и общим NNAL; или (ii) котинином и CEMA; или (iii) котинином, и общим NNAL, и CEMA.

6. Устройство по п. 3 или 4, где:

(a) прокладка для конъюгата содержит или состоит из: (i) меченого котинина или его аналога и меченого общего NNAL или его аналога, нанесенных на нее; или (ii) меченого котинина или его аналога и меченого CEMA или его аналога, нанесенных на нее; или (iii) меченого котинина или его аналога, и меченого общего NNAL или его аналога, и меченого CEMA или его аналога, нанесенных на нее; и

(b) зона обнаружения содержит или состоит из иммобилизированных средств для специфического связывания, каждое из которых способно индивидуально связывать: (i) меченый котинин или его аналог, и меченый общий NNAL или его аналог, и котинин и общий NNAL, которые могут присутствовать в образце; или (ii) меченый котинин или его аналог, и меченый CEMA или его аналог, и котинин и CEMA, которые могут присутствовать в образце; или (iii) меченый котинин или его аналог, и меченый общий NNAL или его аналог, и меченый CEMA или его аналог, и котинин, и общий NNAL, и CEMA, которые могут присутствовать в образце.

7. Устройство по любому из пп. 4–6, где молекулы для специфического связывания помечены окрашенными частицами, предпочтительно наночастицами золота, и где необязательно метки для каждой из молекул для специфического связывания являются одинаковыми или разными.

8. Устройство по любому из пп. 3-7, где в зоне обнаружения присутствует заранее определенное количество иммобилизованных средств для специфического связывания, способных формировать сигнал, как только уровень биомаркеров воздействия табачного дыма в образце превысит заданное пороговое значение.

9. Устройство по п.8, где пороговое значение: (i) больше или равно 200 нг/мл +/-10% котинина в суточной моче, и больше или равно 10 пг/мл +/-10% общего NNAL в суточной моче, или больше или равно 5 нг/мл +/-10% CEMA в суточной моче; или (ii) больше или равно 200 нг/мл +/-10% котинина в суточной моче, и больше или равно 10 пг/мл +/-10% общего NNAL в суточной моче, и больше или равно 5 нг/мл CEMA +/-10% в суточной моче.

10. Устройство по любому из предыдущих пунктов, где устройство приспособлено для обнаружения: (i) котинина в суточной моче в количестве 200–800 нг/мл +/-10%; или (ii) общего NNAL в суточной моче в количестве 10–125 пг/мл +/-10% в суточной моче; или (iii) CEMA в суточной моче в количестве 5–80 нг/мл +/-10% или (iv) комбинации по меньшей мере двух из (i), (ii) и (iii).

11. Устройство по любому из пп. 8-10, где

(i) видимая отметка на тестовой линии(–ях) котинина, и общего NNAL, и CEMA в устройстве указывает на то, что порог обнаружения не превышен, и это является показателем субъекта, который отказался от курения;

(ii) отсутствие видимой отметки на тестовой линии в устройстве указывает на то, что порог обнаружения превышен, и видимая отметка на тестовой линии NNAL, и CEMA в устройстве указывает на то, что порог обнаружения не превышен, и это является показателем того, что субъект подвергался воздействию нагретого табака;

(iii) отсутствие видимой отметки на тестовой линии (i) котинина и общего NNAL на тестовой линии в устройстве указывает на то, что порог обнаружения превышен, и видимая отметка CEMA на тестовой линии в устройстве указывает на то, что порог обнаружения не превышен, или (ii) отсутствие видимой отметки котинина, и общего NNAL, и CEMA в устройстве указывает на то, что порог обнаружения превышен, и это является показателем того, что субъект подвергался воздействию сгоревшего табака.

12. Устройство для определения статуса курения субъекта, содержащее:

(a) резервуар, приспособленный для размещения устройства по любому из пп. 1-11;

(b) устройство формирования изображения, приспособленное для получения по меньшей мере одного цифрового изображения устройства; и

(c) процессор, приспособленный для обработки по меньшей мере одного цифрового изображения.

13. Система для определения статуса курения субъекта, содержащая:

(a) компьютерное хранилище данных, которое содержит или состоит из эталонного значения или значения на исходном уровне для содержания котинина и одного или более из общего NNAL и CEMA, причем указанные эталонное значение или значение на исходном уровне отражают известное содержание котинина и одного или более из общего NNAL и CEMA для определения статуса курения субъекта; и

(b) компьютерную систему, запрограммированную для доступа к хранилищу данных и применения информации из хранилища данных в комбинации с информацией о содержании котинина и одного или более из общего NNAL и CEMA в образце от субъекта, для определения статуса курения субъекта,

где указанная система способна отличать курильщиков традиционных сигарет в текущий момент времени от тех, кто перешел на бездымную альтернативу, где табак нагревается, а не сжигается, или от тех, кто отказался от курения.

14. Набор для определения статуса курения субъекта, где указанный набор содержит устройство по любому из пп. 1-11 и комплект инструкций по работе с набором.

15. Набор для определения статуса курения субъекта, где указанный набор содержит устройство по любому из пп. 1-11 и комплект инструкций для определения статуса курения субъекта.

16. Способ определения статуса курения субъекта, предусматривающий применение устройства по любому из пп. 1-9 или включающий

(a) приведение образца в контакт со средством для специфического связывания котинина и средством для специфического связывания общего NNAL, или со средством для специфического связывания котинина и средством для специфического связывания CEMA, или со средством для специфического связывания котинина и средством для специфического связывания общего NNAL и средством для специфического связывания CEMA и обнаружение связывания; и

(b) определение статуса курения субъекта; где:

если количество котинина составляет от 10,6+/-10% до 41,5 +/-10% нг/мл в суточной моче в день 5 периода исследования, то это является показателем человека, отказавшегося от курения; и

если количество общего NNAL составляет от 37,7 +/-10% пг/мл до 115 +/-10% пг/мл в суточной моче в день 5 периода исследования; или количество CEMA составляет от 31,1+/-10% нг/мл до 90+/-10% нг/мл в суточной моче в день 5 периода исследования; или если количество общего NNAL составляет от 37,7+/-10% пг/мл до 115 +/-10% пг/мл в суточной моче и количество CEMA составляет от 31,1 +/-10% нг/мл до 90 +/-10% нг/мл в суточной моче в день 5 периода исследования, то это является показателем того, что субъект подвергался воздействию сгоревшего табака; и

если количество котинина составляет от 652,5 +/-10% нг/мл до 1115 +/-10% нг/мл или более в суточной моче в день 5 периода исследования, то это является показателем того, что субъект подвергался воздействию нагретого табака.