Моющие композиции, содержащие липазы

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой водорастворимое изделие с разовой дозой для стирки ткани, содержащее водорастворимую пленку и жидкую моющую композицию для стирки, причем жидкая моющая композиция для стирки содержит вариант родительской липазы, который обладает липазной активностью, последовательность которого по меньшей мере на 70% идентична последовательности с SEQ ID NO: 2, содержит замены в положениях, соответствующих положениям F51I,L, T231R и N233R, и необязательно одну или более замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, E56R, D57N, V60E,K, K98I, N101D, R118F, G163S, Y220F, T244E и P256T; и вспомогательный компонент моющего средства; при этом жидкая моющая композиция для стирки покрыта водорастворимой пленкой; при этом водорастворимая пленка содержит полимерный материал, выбранный из поливиниловых спиртов, поливинилпирролидона, полиалкиленоксидов, акриламида, акриловой кислоты, целлюлозы, простых эфиров целлюлозы, сложных эфиров целлюлозы, амидов целлюлозы, поливинилацетатов, поликарбоновых кислот и солей, полиаминокислот или пептидов, полиамидов, полиакриламида, сополимеров малеиновой/акриловой кислот, полисахаридов, включая крахмал и желатин, природных камедей, таких как ксантановая камедь и карраген и их смесей. Изобретение позволяет эффективно осуществлять способ стирки тканей с использованием водорастворимого изделия с разовой дозой согласно изобретению. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 табл., 13 пр.

 

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Данная заявка содержит перечень последовательностей в машиночитаемом виде, который включен в настоящий документ путем ссылки.

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к моющим композициям и водорастворимым изделиям с разовой дозой, содержащим моющие композиции, содержащие ферменты липазы, а также к способам получения и применения таких композиций. Изобретение также относится к жидким продуктам, моющим композициям и водорастворимым изделиям с разовой дозой, содержащим моющие композиции, в которых вариант липазы инкапсулирован в микрокапсулу. Такие композиции и изделия предпочтительно представляют собой продукты для ухода за тканью и уборки дома, наиболее предпочтительно продукты для стирки.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Производители моющих средств все еще пытаются создать очищающие композиции, в частности, композиции для стирки и мытья посуды, которые представляют собой самые надежные чистящие системы. Липазы представляют собой важные биокатализаторы, которые, как показано, являются очень полезными в моющих композициях, способствуя удалению масляных загрязнений и пятен путем гидролиза триглицеридов с образованием жирных кислот. После гидролиза гидролизованные загрязнения проще удалять с поверхностей ткани в процессе мытья в присутствии других моющих компонентов. Многие известные липазы обеспечивают хорошую эффективность мытья, однако они также могут быть склонны к образованию короткоцепочечных жирных кислот с запахом во время мытья и/или иметь низкую стабильность при хранении.

Стабильность может быть особенной проблемой, например, при контакте с несовместимыми компонентами моющей композиции или при воздействии значительно больших или меньших температур, чем температура окружающей среды, либо во время хранения, либо во время этапа мытья или обработки. Если стабильность не является достаточно высокой, это приводит к снижению активности или эффективности композиции в целом и, в частности, к потере ферментативной активности. Липаза Thermomyces lanuginosus (другое наименование Humicola lanuginosa), продаваемая под торговым названием LIPOLASE™, и ее варианты выпущены на рынок в качестве активных ингредиентов в моющих композициях для удаления жирных пятен путем гидролиза триглицеридов с образованием жирных кислот. Однако по-прежнему существует потребность в композициях, содержащих липазы, которые обеспечивают хорошую эффективность мытья, уменьшают образование запаха и/или улучшают стабильность при хранении, обеспечивают более длительный срок хранения/повышенную термостабильность.

ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к моющей композиции, содержащей вариант родительской липазы, имеющий липазную активность, причем указанный вариант имеет последовательность, по меньшей мере на 60%, но менее 100%, идентичную последовательности с SEQ ID NO: 2, и содержащий (i) одну или более замен в положениях, соответствующих положениям 40, 118, T244E и V60E; и (ii) одну или более замен в положениях, соответствующих T231R и N233R. Вариант липазы предпочтительно содержит замены в положениях, соответствующих обоим положениям 40 и 118, более предпочтительно одну или более замен в положениях, соответствующих A40I и R118F.

Настоящее изобретение также относится к моющей композиции, содержащей вариант родительской липазы, имеющий липазную активность, причем указанный вариант имеет последовательность, по меньшей мере на 60%, но менее 100%, идентичную последовательности с SEQ ID NO: 2, и содержащий одну или более замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, F51I,L, E56R, D57N, V60E,K, K98I, N101D, R118F, G163S, T231R, N233R, Y220F, T244E и P256T; и вспомогательный компонент моющего средства. Предпочтительно моющая композиция представлена в форме жидкости, предпочтительно содержащей менее 20 мас.% воды.

В дополнительном аспекте изобретение также относится к моющей композиции, содержащей вариант родительской липазы, имеющий липазную активность, причем указанный вариант имеет последовательность, по меньшей мере на 60%, но менее 100%, идентичную последовательности с SEQ ID NO: 2, и содержащий (i) одну или более замен в положениях, соответствующих положению 23, 51 и 56, предпочтительно одну или более замен в положениях, соответствующих G23S, F51I, L и E56R; и (ii) одну или более замен в положениях, соответствующих T231R и N233R; и предпочтительно (iii) одну или более замен в положениях, соответствующих 27, 40, 57, 60, 98, 101, 118, 163, 220, 244 и 256, предпочтительно одну или более замен в положениях, соответствующих D27N, A40I, D57N, V60E,K, K98I, N101D, R118F, G163S, Y220F, T244E и P256T.

В изобретении также предложено водорастворимое изделие с разовой дозой, содержащее водорастворимую пленку и моющую композицию, содержащую вариант липазы, как описано выше; и вспомогательный компонент моющего средства. Вариант липазы может присутствовать в водорастворимом изделии с разовой дозой в жидкой композиции или в твердой композиции. Предпочтительно моющая композиция, содержащая вариант липазы, представляет собой жидкую композицию.

Настоящее изобретение также относится к способу получения моющей композиции, содержащей вариант липазы, причем способ включает первый этап смешивания вспомогательного компонента моющего средства и варианта липазы с образованием моющей композиции. Предпочтительно моющая композиция затем формируется в форму с разовой дозой, необязательно путем покрытия моющей композиции пленкой, предпочтительно водорастворимой пленкой. Вариант липазы предпочтительно присутствует в моющей композиции, описанной в настоящем документе, содержащей менее 20 мас.% воды. Водорастворимое изделие с разовой дозой может содержать одно отделение или более одного отделения. Водорастворимое изделие с разовой дозой содержит вариант липазы в одном или более отделениях, наиболее предпочтительно в одном отделении моющего средства с разовой дозой, содержащего несколько отделений.

Настоящее изобретение также относится к способу стирки ткани, включающему следующие этапы:

(i) формирование водного моющего раствора, содержащего воду и моющую композицию, как описано в настоящем документе;

(ii) (ii) очистку поверхности моющим водным моющим раствором, предпочтительно при температуре 60°C или менее, или предпочтительно ниже 40°C или менее, или предпочтительно при температуре 30°C или менее; и

(iii) (iii) ополаскивание поверхности. В предпочтительном способе водорастворимое изделие с разовой дозой в соответствии с изобретением объединяют с достаточным количеством воды для растворения водорастворимой пленки и разбавления моющей композиции для стирки предпочтительно в пределах от 300 до 3000 раз с образованием водного моющего раствора.

Последовательность варианта липазы предпочтительно по меньшей мере на 60%, но менее 100%, идентична последовательности с SEQ ID NO: 2, и содержит одну или более замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, F51I,L, E56R, D57N, V60E,K, K98I, N101D, R118F, G163S, Y220F, T244E и P256T, и одну или предпочтительно обе замены в положениях, соответствующих T231R и N233R.

Предпочтительный вариант содержит замену в положении, соответствующем F51I,L. Предпочтительный вариант содержит замену в положении, соответствующем E56R. Предпочтительный вариант содержит замену в положении, соответствующем R118F. Предпочтительный вариант содержит одну или более замен в положениях, соответствующих F51I,L, E56R и/или R118F. Предпочтительный вариант содержит замену в положении, соответствующем P256T. Предпочтительный вариант содержит замену в положении, соответствующем D27N. Предпочтительный вариант содержит замену в положении, соответствующем G23S. Предпочтительный вариант содержит замену в положении, соответствующем T244E. Предпочтительный вариант содержит замену в положении, соответствующем A40I. Предпочтительный вариант содержит замену в положении, соответствующем K98I. Предпочтительный вариант содержит замену в положении, соответствующем D57N. Предпочтительный вариант содержит замену в положении, соответствующем Y220F. Предпочтительный вариант содержит замену в положении, соответствующем G163S.

В одном аспекте изобретение относится к моющей композиции, содержащей фермент липазы, предпочтительно вариант липазы, инкапсулированный в микрокапсулу. В соответствии с одним предпочтительным аспектом мембрану микрокапсулы получают путем поперечного сшивания полиразветвленного полиамина с молекулярной массой более 1 кДа. В дополнительном аспекте моющая композиция содержит состав микрокапсул с вариантом липазы изобретения, предпочтительно заключенный в отделение, образованное мембраной, причем мембрана получена путем поперечного сшивания (a) полиразветвленного полиамина с молекулярной массой более 800 Да и (b) алифатического или ароматического амина с молекулярной массой менее 300 Да; причем массовое отношение (a)/(b) находится в диапазоне от 0,1 до 1000.

Липаза. Термины «липаза», «фермент липазы», «липолитический фермент», «липидная эстераза», «липолитический полипептид» и «липолитический белок» обозначают фермент класса EC3.1.1, как определено в номенклатуре ферментов. Он может иметь липазную активность (триацилглицероллипаза, EC 3.1.1.3), кутиназную активность (EC 3.1.1.74), стеролэстеразную активность (EC 3.1.1.13) и/или гидролазную активность в отношении восковых эфиров (EC 3.1.1.50). Для целей настоящего изобретения активность липазы определяют в соответствии с процедурой, описанной в разделе, посвященном примерам. В одном аспекте варианты настоящего изобретения имеют по меньшей мере 20%, например по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или 100% липазной активности полипептида SEQ ID NO: 2.

В одном аспекте изобретение относится к водорастворимому изделию с разовой дозой, содержащему водорастворимую пленку и моющую композицию, содержащую вариант липазы и вспомогательный компонент моющего средства, содержащий состав микрокапсул, причем мембрана микрокапсулы получена путем поперечного сшивания полиразветвленного полиамина с молекулярной массой более 1 кДа, при этом микрокапсула содержит вариант липазы настоящего изобретения.

Аллельный вариант. Термин «аллельный вариант» означает любую из двух или более альтернативных форм гена, занимающего один и тот же хромосомный локус. Аллельные варианты формируются естественным образом посредством мутации и могут приводить к полиморфизму в популяциях. Генные мутации могут быть неактивными (без изменений в кодируемом полипептиде) или могут кодировать полипептиды, имеющие измененные аминокислотные последовательности. Аллельный вариант полипептида представляет собой полипептид, кодируемый аллельным вариантом гена.

кДНК. Термин «кДНК» означает молекулу ДНК, которую можно получить путем обратной транскрипции из зрелой сплайсированной молекулы мРНК, полученной из эукариотической или прокариотической клетки. кДНК не имеет интронных последовательностей, которые могут присутствовать в соответствующей геномной ДНК. Первичный РНК-транскрипт является предшественником мРНК, который проходит ряд этапов, включающих объединение до превращения в зрелую сплайсированную молекулу мРНК.

Кодирующая последовательность. Термин «кодирующая последовательность» означает полинуклеотид, который непосредственно указывает на аминокислотную последовательность варианта. Границы кодирующей последовательности, как правило, определяются открытой рамкой считывания, которая начинается со стартового кодона, такого как ATG, GTG или TTG, и заканчивается стоп-кодоном, таким как TAA, TAG или TGA. Кодирующая последовательность может представлять собой геномную ДНК, кДНК, синтетическую ДНК или их комбинацию.

Контрольные последовательности. Термин «контрольные последовательности» означает нуклеотидные последовательности, необходимые для экспрессии полинуклеотида, кодирующего вариант настоящего изобретения. Каждая контрольная последовательность может быть нативной (т.е. от того же гена) или чужеродной (т.е. от другого гена) по отношению к полинуклеотиду, кодирующему вариант, или нативной или чужеродной друг другу. Такие контрольные последовательности включают в себя, без ограничений, лидерную последовательность, последовательность полиаденилирования, пропептидную последовательность, промотор, последовательность сигнального пептида и терминатор транскрипции. Как минимум контрольные последовательности включают в себя промотор, а также сигналы остановки транскрипции и трансляции. Контрольные последовательности могут быть обеспечены линкерами для введения специфических сайтов рестрикции, облегчающих лигирование контрольных последовательностей с кодирующим регионом полинуклеотида, кодирующего вариант.

Вспомогательный компонент моющего средства. Термин означает любой жидкий, твердый или газообразный материал, выбранный для конкретного типа желаемой моющей композиции и формы продукта (например, композиция в форме жидкости, гранулы, порошка, бруска, пасты, спрея, таблетки, геля или пены).

Моющая композиция. Термины «моющая композиция» и «моющий состав» используются в отношении смесей, которые предназначены для применения в процессе мытья для очистки загрязненных объектов. Термин используется, в частности, применительно к стирке тканей и/или предметов одежды (например, «моющие средства для стирки»). Если не указано иное, они могут включать гранулированные или порошковые универсальные или высокопроизводительные моющие средства, особенно очищающие средства; жидкие, гелевые или пастообразные универсальные моющие средства, особенно так называемые высокоэффективные жидкие средства (HDL); жидкие моющие средства для тонких тканей; средства для ручного мытья посуды или низкоэффективные средства для мытья посуды, в частности, моющие средства с высоким пенообразованием; средства для посудомоечных машин, включая различные типы таблетированных, гранулированных, жидких средств и ополаскивателей для применения в быту и в учреждениях; жидкие очищающие и дезинфицирующие агенты, а также чистящие вспомогательные вещества, такие как отбеливающие добавки и «карандаши-пятновыводители» или средства для предварительного обработки. В альтернативных аспектах термин относится к другим моющим средствам, таким как используемые для мытья посуды, ножей и т.д. (например, «моющие средства для мытья посуды»). Термин «моющая композиция» не ограничен композициями, которые содержат поверхностно-активные вещества. Предполагается, что в дополнение к вариантам, необходимым для изобретения, термин включает моющие средства, которые могут содержать любой вспомогательный компонент моющего средства, например поверхностно-активные вещества, модификаторы, хелатирующие агенты, отбеливающую систему или отбеливающие компоненты, полимеры, кондиционеры для ткани, пенообразователи, подавители пенообразования, красители, ароматические вещества, ингибиторы потускнения, оптические осветлители, бактерицидные агенты, фунгициды, агенты для суспендирования загрязнений, антикоррозионные агенты, ингибиторы или стабилизаторы ферментов, активаторы ферментов, трансферазы (трансфераз), гидролитические ферменты, оксидоредуктазы, средства для воронения и флуоресцентные красители, антиоксиданты, солюбилизаторы и растворители. Моющие композиции также можно применять для обработки ткани либо на этапе стирки, либо на этапе обработки ткани, например, они могут обеспечивать освежение ткани, умягчение ткани, и/или на этапе восстановления цвета. Моющие композиции, описанные в настоящем документе, в частности, входят в состав водорастворимого изделия с разовой дозой.

Экспрессия. Термин «экспрессия» включает в себя любой этап, связанный с получением варианта, включая, без ограничений, транскрипцию, посттранскрипционную модификацию, трансляцию, посттрансляционную модификацию и секрецию.

Экспрессионный вектор. Термин «экспрессионный вектор» означает линейную или круговую молекулу ДНК, которая содержит полинуклеотид, кодирующий вариант, а также функционально связан с контрольными последовательностями, обеспечивающими экспрессию.

Фрагмент. Термин «фрагмент» означает полипептид, в котором на аминокислотном и/или карбоксильном конце полипептида отсутствует одна или более (например, несколько) аминокислот; причем фрагмент имеет активность липазы. В одном аспекте фрагмент содержит по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95%, но менее 100% аминокислот 1-269 последовательности SEQ ID NO: 2.

Условия высокой жесткости. Термин «условия высокой жесткости» означает зонды длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов, предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограмм/мл дегидратированной в результате гидродинамического сдвига и денатурированной ДНК спермы лосося и формамид 50% с последующим выполнением стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Затем материал-носитель промывают три раза по 15 минут с использованием 2X SSC, 0,2% SDS при 65°C.

Клетка-хозяин. Термин «клетка-хозяин» означает любой тип клеток, который подвержен трансформации, трансфекции, трансдукции или т.п. с конструктом нуклеиновой кислоты или экспрессионным вектором, содержащим полинуклеотид настоящего изобретения. Термин «клетка-хозяин» включает в себя любое потомство родительской клетки, которое не идентично родительской клетке из-за мутаций, происходящих в процессе репликации.

Улучшенное свойство. Термин «улучшенное свойство» означает характеристику, связанную с вариантом, которая была улучшена по сравнению с «родительской липазой». Такие улучшенные свойства включают, без ограничений, стабильность моющего средства, стабильность моющего средства в присутствии протеазы, стабильность протеазы, химическую стабильность, окислительную стабильность, стабильность pH, стабильность в условиях хранения и термостабильность.

Выделенный. Термин «выделенный» означает вещество в форме или среде, которое не встречается в природе. Не имеющие ограничительного характера примеры выделенных веществ включают в себя: (1) любое вещество неприродного происхождения, (2) любое вещество, включая, без ограничений, любой фермент, вариант, нуклеиновую кислоту, белок, пептид или кофактор, которое по меньшей мере частично удалено из одного или более или всех компонентов природного происхождения, с которыми оно связано в природе; (3) любое вещество, модифицированное человеком по отношению к тому же веществу, находящемуся в природе; или (4) любое вещество, модифицированное путем увеличения количества вещества относительно других компонентов, с которыми оно естественным образом связано (например, множество копий гена, кодирующего вещество; применение более сильного промотора по сравнению с промотором, естественным образом связанным с геном, кодирующим вещество). Выделенное вещество может присутствовать в образце ферментационного бульона.

Условия низкой жесткости. Термин «условия низкой жесткости» означает зонды длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов, предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограмм/мл дегидратированной в результате гидродинамического сдвига и денатурированной ДНК спермы лосося и формамид 25% с последующим выполнением стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Затем материал-носитель промывают три раза по 15 минут с использованием 2X SSC, 0,2% SDS при 50°C.

Зрелый полипептид. Термин «зрелый полипептид» означает полипептид в его конечной форме после трансляции и любые посттрансляционные модификации, такие как N-концевая обработка, усечение C-конца, гликозилирование, фосфорилирование и т.п. В одном аспекте зрелый полипептид представляет собой аминокислоты 1-269 с SEQ ID NO: 2. В данной области известно, что клетка-хозяин может продуцировать смесь двух или более различных зрелых полипептидов (т.е. с другой C-концевой и/или N-концевой аминокислотой), экспрессируемых одним и тем же полинуклеотидом.

Кодирующая последовательность зрелого полипептида. Термин «кодирующая последовательность зрелого полипептида» означает полинуклеотид, который кодирует зрелый полипептид, имеющий активность липазы. В одном аспекте зрелая полипептидная кодирующая последовательность представляет собой нуклеотиды 1-807 SEQ ID NO: 1.

Условия средней жесткости. Термин «условия средней жесткости» означает зонды длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов, предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограмм/мл дегидратированной в результате гидродинамического сдвига и денатурированной ДНК спермы лосося и формамид 35% с последующим выполнением стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Затем материал-носитель промывают три раза по 15 минут с использованием 2X SSC, 0,2% SDS при 55°C.

Условия средне-высокой жесткости. Термин «условия средне-высокой жесткости» означает зонды длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов, предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограмм/мл дегидратированной в результате гидродинамического сдвига и денатурированной ДНК спермы лосося и формамид 35% с последующим выполнением стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Затем материал-носитель промывают три раза по 15 минут с использованием 2X SSC, 0,2% SDS при 60°C.

Мутант. Термин «мутант» означает полинуклеотид, кодирующий вариант.

Конструкт нуклеиновой кислоты. Термин «конструкт нуклеиновой кислоты» означает молекулу нуклеиновой кислоты, либо одноцепочечную, либо двухцепочечную, которая выделена из гена природного происхождения или модифицирована так, чтобы содержать сегменты нуклеиновых кислот таким образом, что она в ином случае не существовала бы в природе, или которая является синтетической, причем она содержит одну или более контрольных последовательностей.

Функционально связанный. Термин «функционально связанный» означает конфигурацию, в которой контрольная последовательность расположена в соответствующем положении относительно кодирующей последовательности полинуклеотида так, что контрольная последовательность направляет экспрессию кодирующей последовательности.

Родитель или родительская липаза. Термин «родитель» или «родительская липаза» означает липазу, в которую внесено изменение для получения вариантов фермента настоящего изобретения. Родительская липаза может представлять собой полипептид природного происхождения (дикого типа) или его вариант или фрагмент.

Идентичность последовательности. Сходство между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя нуклеотидными последовательностями описывается параметром «идентичность последовательности».

Для целей настоящего изобретения идентичность последовательности между двумя аминокислотными последовательностями определяют с помощью алгоритма Нидлмана - Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), реализованного в программе Needle из пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), предпочтительно версия 5.0.0 или более новая. К параметрам относится штраф за открытие гэпа, составляющий 10, штраф за продление гэпа, составляющий 0,5, и матрица замен EBLOSUM62 (версия BLOSUM62 пакета EMBOSS). Выходной параметр программы Needle, помеченный как «самая длинная идентичность» (получаемый с помощью опции nobrief), используют в качестве процента идентичности и рассчитывают следующим образом:

(идентичные остатки x 100)/(длина выравниваемого участка - общее число гэпов в выравниваемом участке).

Для целей настоящего изобретения идентичность двух дезоксирибонуклеотидных последовательностей определяют с применением алгоритма Нидлмана - Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, см. выше), реализованного в программе Needle пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, см. выше), предпочтительно версии 5.0.0 или более новой. К параметрам относится штраф за открытие гэпа, составляющий 10, штраф за продление гэпа, составляющий 0,5, и матрица замен EDNAFULL (версия NCBI NUC4.4 пакета EMBOSS). Выходной параметр программы Needle, помеченный как «самая длинная идентичность» (получаемый с помощью опции nobrief), используют в качестве процента идентичности и рассчитывают следующим образом:

(идентичные дезоксирибонуклеотиды x 100)/(длина выравниваемого участка - общее число гэпов в выравниваемом участке).

Устойчивость. Стабильность варианта липазы настоящего изобретения можно выразить в виде остаточной активности или остаточной эффективности указанной липазы во время или после воздействия различных условий испытаний, таких как, например, хранение в моющей композиции, при различных температурах, при различных значениях pH, в присутствии различных компонентов, таких как протеаза, химические вещества и/или окислительные вещества (условия стресса), или при использовании в процессе стирки. Стабильность варианта липазы можно измерить относительно известной активности или эффективности родительской липазы, например липазы, показанной как SEQ ID NO: 2, или в альтернативном варианте осуществления известной активности или эффективности варианта липазы при первоначальном добавлении к моющей композиции, необязательно хранящегося в холодном или замороженном состоянии, или относительно варианта липазы, хранящегося в холодном или замороженном состоянии (условия без нагрузки).

Подпоследовательность. Термин «подпоследовательность» означает полинуклеотид, в котором с 5'- и/или 3'-конца кодирующей последовательности зрелого полипептида отсутствует один или более (например, несколько) нуклеотидов; причем подпоследовательность кодирует фрагмент, имеющий активность липазы. В одном аспекте последовательность содержит по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95%, но менее 100% нуклеотидов 1-807 последовательности SEQ ID NO: 1.

Вариант. Термин «вариант» означает полипептид, обладающий активностью липазы, содержащий изменение, т.е. замену, вставку и/или делецию в одном или более (например, нескольких) положениях. Замена означает замену аминокислоты, занимающей положение, другой аминокислотой; делеция означает удаление аминокислоты, занимающей положение; а вставка означает добавление аминокислоты в положение, смежное с положением, занимаемым аминокислотой, и непосредственно следующим за этим положением. Варианты настоящего изобретения имеют по меньшей мере 20%, например по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 100% активности липазы полипептида с SEQ ID NO: 2.

Условия очень высокой жесткости. Термин «условия очень высокой жесткости» означает зонды длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов, предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограмм/мл дегидратированной в результате гидродинамического сдвига и денатурированной ДНК спермы лосося и формамид 50% с последующим выполнением стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Затем материал-носитель промывают три раза по 15 минут с использованием 2X SSC, 0,2% SDS при 70°C.

Условия очень низкой жесткости. Термин «условия очень низкой жесткости» означает зонды длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов, предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограмм/мл дегидратированной в результате гидродинамического сдвига и денатурированной ДНК спермы лосося и формамид 25% с последующим выполнением стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Затем материал-носитель промывают три раза по 15 минут с использованием 2X SSC, 0,2% SDS при 45°C.

Липаза дикого типа. Термин липаза «дикого типа» означает липазу, экспрессируемую микроорганизмом природного происхождения, таким как бактерия, дрожжи или мицелиальные грибы, существующие в природе.

Условные обозначения для обозначения вариантов

Для целей настоящего изобретения полипептид, описанный в SEQ ID NO: 2, используют для определения соответствующего аминокислотного остатка в другой липазе. Аминокислотную последовательность другой липазы выравнивают с SEQ ID NO: 2 и по результатам выравнивания номер положения аминокислоты, соответствующий любому аминокислотному остатку в полипептиде, описанном в SEQ ID NO: 2, определяют с помощью алгоритма Нидлмана - Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), реализованного в программе Needle из пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), предпочтительно версия 5.0.0 или более новая. К параметрам относится штраф за открытие гэпа, составляющий 10, штраф за продление гэпа, составляющий 0,5, и матрица замен EBLOSUM62 (версия BLOSUM62 пакета EMBOSS).

Идентификацию соответствующего аминокислотного остатка в другой липазе можно осуществлять путем выравнивания множества полипептидных последовательностей с использованием нескольких компьютерных программ, включая, без ограничений, MUSCLE (сравнение множественных последовательностей по Log-Expectation); версия 3.5 или более новая; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (версия 6.857 или более новая; Katoh and Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh and Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh and Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900) и EMBOSS EMMA с использованием ClustalW (версия 1.83 или более новая; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), с использованием их соответствующих параметров по умолчанию.

Когда другой фермент отличается от полипептида с SEQ ID NO: 2 так, что традиционное сравнение на основе последовательности не выявляет их сходства (Lindahl and Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615), можно использовать другие алгоритмы попарного сравнения последовательностей. Более высокую чувствительность поиска на основе последовательностей можно обеспечить с помощью поисковых программ, использующих вероятностные представления семейств полипептидов (профили) для поиска в базах данных. Например, программа PSI-BLAST генерирует профили с помощью итерационного процесса поиска в базе данных и может обнаруживать далекие гомологи (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Еще более высокую чувствительность можно обеспечить, если в базах данных белковых структур содержится один или более представителей семейства или суперсемейства полипептидов. Такие программы, как GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881), используют информацию из множества источников (PSI-BLAST, данные прогнозирования вторичной структуры, профили структурного выравнивания и потенциалы сольватации) в качестве входных данных для нейронной сети, прогнозирующей структурную укладку представляющей интерес последовательности. Аналогичным образом способ, описанный в публикации Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919, можно использовать для выравнивания последовательности с неизвестной структурой с моделями суперсемейства, присутствующими в базе данных SCOP. Эти выравнивания в свою очередь можно применять для создания гомологичных моделей для полипептида, а точность таких моделей можно оценивать с помощью различных инструментов, разработанных для этой цели.

Для белков с известной структурой доступно несколько инструментов и ресурсов для выявления и создания структурных выравниваний. Например, суперсемейства белков SCOP структурно выровнены, и эти выравнивания доступны, в том числе для загрузки. Для выравнивания двух или более структур белка можно применять различные алгоритмы, такие как выравнивание на основе матрицы расстояний (Holm and Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) или комбинаторное удлинение (Shindyalov and Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), и эти алгоритмы можно дополнительно применять для поиска представляющей интерес структуры в базах данных структур для выявления возможных структурных гомологов (например, Holm and Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).

В описании вариантов настоящего изобретения описанная ниже номенклатура адаптирована для удобства пользования. Используют принятые IUPAC однобуквенные или трехбуквенные сокращения для аминокислот.

Замены. В отношении замены аминокислот используют следующую номенклатуру: исходная аминокислота, положение, замещающая аминокислота. Соответственно, например, замену треонина на аланин в положении 226 обозначают как Thr226Ala или Т226А. Множественные мутации отделены друг от друга знаками сложения (+), например, Gly205Arg + Ser411Phe или G205R + S411F, что означает замены в положениях 205 и 411 глицина (G) на аргинин (R) и серина (S) на фенилаланин (F) соответственно.

Делеции. В отношении делеции аминокислот используют следующую номенклатуру: исходная аминокислота, положение, *. Соответственно, делецию глицина в положении 195 обозначают как Gly195* или G195*. Множественные делеции отделены друг от друга знаками сложения (+), например, Gly195* + Ser411* или G195* + S411*.

Вставки. В отношении аминокислотной вставки используют следующую номенклатуру: исходная аминокислота, положение, исходная аминокислота, вставленная аминокислота. Соответственно, вставку лизина после глицина в положение 195 обозначают как Gly195GlyLys или G195GK. Вставку множества аминокислот обозначают так: [исходная аминокислота, положение, исходная аминокислота, вставленная аминокислота №1, вставленная аминокислота № 2; и т.д.]. Например, вставку лизина и аланина после глицина в положение 195 обозначают как Gly195GlyLysAla или G195GKA.

В таких случаях вставленный(-ые) аминокислотный(-ые) остаток(остатки) нумеруют путем добавления строчных букв к номеру положения аминокислотного остатка перед вставленным(-ыми) аминокислотным(-ыми) остатком(остатками). Таким образом, в приведенном выше примере последовательность должна быть такой, как представлена ниже.

Множественные изменения. Варианты, содержащие множественные изменения, отделены друг от друга знаками сложения (+), например, Arg170Tyr + Gly195Glu или R170Y + G195E, что означает замену аргинина и глицина на тирозин и глутаминовую кислоту в положениях 170 и 195 соответственно.

Различные изменения. Там, где в одно положение можно включать различные изменения, эти различные изменения разделены запятой, например, Arg170Tyr,Glu или R170Y,E означает замену аргинина на тирозин или глутаминовую кислоту в положении 170. Таким образом, Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala подразумевает следующие варианты:

Tyr167Gly+Arg170Gly, Tyr167Gly+Arg170Ala, Tyr167Ala+Arg170Gly и Tyr167Ala+Arg170Ala.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем документе описаны композиции, содержащие варианты родительской липазы, которые имеют липазную активность, последовательности которых по меньшей мере на 60%, но менее 100%, идентичны последовательности с SEQ ID NO: 2, например, полученные от Thermomyces lanuginosus.

На фиг. 1 показано водорастворимое изделие с разовой дозой в соответствии с настоящим изобретением.

На фиг. 1 описано водорастворимое изделие (1) с разовой дозой в соответствии с настоящим изобретением. Водорастворимое изделие (1) с разовой дозой содержит первую водорастворимую пленку (2) и вторую водорастворимую пленку (3), которые спаяны друг с другом в области (4) спайки. Моющая композиция (5) для стирки содержится внутри водорастворимого растворимого изделия (1) с разовой дозой.

Варианты

В настоящем изобретении предложена моющая композиция и водорастворимое изделие с разовой дозой, содержащее моющую композицию, содержащую вариант родительской липазы, который обладает липазной активностью, последовательность которого по меньшей мере на 60%, но менее 100%, идентична последовательности с SEQ ID NO: 2 и который содержит одну или более (например, несколько) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, F51I,L, E56R, D57N, V60E,K, K98I, N101D, R118F, G163S, T231R, N233R, Y220F, T244E и P256T.

Последовательность варианта липазы предпочтительно по меньшей мере на 60%, но менее 100%, идентична последовательности с SEQ ID NO: 2 и содержит одну или более замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, F51I,L, E56R, D57N, E и P256T. Предпочтительно вариант дополнительно содержит одну или обе замены в положениях, соответствующих T231R и/или N233R.

Предпочтительный вариант содержит замену в положении, соответствующем G23S. Предпочтительный вариант содержит замену в положении, соответствующем D27N. Предпочтительный вариант содержит замену в положении, соответствующем A40l. Предпочтительный вариант содержит замену в положении, соответствующем F51I,L. Предпочтительный вариант содержит замену в положении, соответствующем E56R. Предпочтительный вариант содержит замену в положении, соответствующем D57N. Предпочтительный вариант содержит замену в положении, соответствующем V60E,K. Предпочтительный вариант содержит замену в положении, соответствующем K98I. Предпочтительный вариант содержит замену в положении, соответствующем N101D. Предпочтительный вариант содержит замену в положении, соответствующем R118F. Предпочтительный вариант содержит замену в положении, соответствующем G163S. Предпочтительный вариант содержит замену в положении, соответствующем Y220F. Предпочтительный вариант содержит замену в положении, соответствующем T244E. Предпочтительный вариант содержит замену в положении, соответствующем P256T.

Предпочтительный вариант содержит одну или более замен в положениях, соответствующих F51I,L, E56R и/или R118F.

В предпочтительном варианте осуществления вариант изобретения содержит любую из следующего набора замен:

.

В одном варианте осуществления вариант содержит замены в положениях, соответствующих T231R+N233R, и одну или более (например, несколько) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, F51I,L, E56R, D57N, V60E,K, K98I, N101D, R118F, G163S, Y220F, T244E и P256T.

В предпочтительном варианте осуществления вариант содержит замены, соответствующие E56R+T231R+N233R, и одну или более (например, несколько) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, F51I,L, D57N, V60E,K, K98I, N101D, R118F, G163S, Y220F, T244E и P256T.

В предпочтительном варианте осуществления вариант содержит замены в положениях, соответствующих R118F+T231R+N233R, и одну или более (например, несколько) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, F51I,L, E56R, D57N, V60E,K, K98I, N101D, G163S, Y220F, T244E и P256T.

В более предпочтительном варианте осуществления вариант содержит замены в положениях, соответствующих E56R+R118F+T231R+N233R, и одну или более (например, несколько) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, F51I,L, D57N, V60E,K, K98I, N101D, G163S, Y220F, T244E и P256T.

В еще более предпочтительном варианте осуществления вариант содержит замены в положениях, соответствующих E56R+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или более (например, несколько) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, F51I,L, D57N, V60E,K, K98I, N101D, G163S, Y220F и T244E.

В еще более предпочтительном варианте осуществления вариант содержит замены в положениях, соответствующих F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R, и одну или более (например, несколько) замен в положениях, соответствующих GG23S, D27N, A40I, D57N, V60E,K, K98I, N101D, G163S, Y220F, T244E и P256T.

В еще более предпочтительном варианте осуществления вариант содержит замены в положениях, соответствующих F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или более (например, несколько) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, D57N, V60E,K, K98I, N101D, G163S, Y220F и T244E.

В другом более предпочтительном варианте осуществления вариант содержит замены в положениях, соответствующих G23S+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R, и одну или более (например, несколько) замен в положениях, соответствующих D27N, A40I, D57N, V60E,K, K98I, N101D, G163S, Y220F, T244E и P256T.

В другом более предпочтительном варианте осуществления вариант содержит замены в положениях, соответствующих G23S+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или более (например, несколько) замен в положениях, соответствующих D27N, A40I, D57N, V60E,K, K98I, N101D, G163S, Y220F и T244E.

В дополнительном еще более предпочтительном варианте осуществления вариант содержит замены в положениях, соответствующих D27N+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или более (например, несколько) замен в положениях, соответствующих G23S, A40I, D57N, V60E,K, K98I, N101D, G163S, Y220F и T244E.

В дополнительном еще более предпочтительном варианте осуществления вариант содержит замены в положениях, соответствующих A40I+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R, и одну или более (например, несколько) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, D57N, V60E,K, K98I, N101D, G163S, Y220F, T244E и P256T.

В другом еще более предпочтительном варианте осуществления вариант содержит замены в положениях, соответствующих D27N+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R, и одну или более (например, несколько) замен в положениях, соответствующих G23S, A40I, D57N, V60E,K, K98I, N101D, G163S, Y220F, T244E и P256T.

В дополнительном еще более предпочтительном варианте осуществления вариант содержит замены в положениях, соответствующих D27N+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или более (например, несколько) замен в положениях, соответствующих G23S, A40I, D57N, V60E,K, K98I, N101D, G163S, Y220F и T244E.

В дополнительном еще более предпочтительном варианте осуществления вариант содержит замены в положениях, соответствующих A40I+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или более (например, несколько) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, D57N, V60E,K, K98I, N101D, G163S, Y220F и T244E.

В другом еще более предпочтительном варианте осуществления вариант содержит замены в положениях, соответствующих F51I,L+E56R+D57N+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или более (например, несколько) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, V60E,K, K98I, N101D, G163S, Y220F и T244E.

В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления вариант содержит замены в положениях, соответствующих F51I,L+E56R+D57N+K98I+R118F+T231R+N233R, и одну или более (например, несколько) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, V60E,K, N101D, G163S, Y220F, T244E и P256T.

В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления вариант содержит замены в положениях, соответствующих F51I,L+E56R+D57N+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или более (например, несколько) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, V60E,K, N101D, G163S, Y220F и T244E.

В дополнительном более предпочтительном варианте осуществления вариант содержит замены в положениях, соответствующих F51I,L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R, и одну или более (например, несколько) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, V60EK, N101D, Y220F, T244E и P256T.

В дополнительном более предпочтительном варианте осуществления вариант содержит замены в положениях, соответствующих F51I,L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+P256T, и одну или более (например, несколько) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, V60EK, N101D, Y220F и T244E.

В дополнительном еще более предпочтительном варианте осуществления вариант содержит замены в положениях, соответствующих F51I,L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+T244E, и одну или более (например, несколько) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, V60E,K, N101D, Y220F и +P256T.

В дополнительном еще более предпочтительном варианте осуществления вариант содержит замены в положениях, соответствующих F51I,L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+T244E+P256T, и одну или более (например, несколько) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I,V60E,K, N101D и Y220F.

В дополнительном еще более предпочтительном варианте осуществления вариант содержит замены в положениях, соответствующих F51I,L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+T244E+P256T, и одну или более (например, несколько) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, V60E,K, N101D и Y220F.

В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления вариант содержит замены в положениях, соответствующих F51I,L+E56R+D57N+V60E,K+K98I+R118F+T231R+N233R, и одну или более (например, несколько) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, N101D, G163S, Y220F, T244E и P256T.

В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления вариант содержит замены в положениях, соответствующих F51I,L+E56R+D57N+V60E,K+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или более (например, несколько) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, N101D, G163S, Y220F и T244E.

В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления вариант содержит замены в положениях, соответствующих F51I,L+E56R+D57N+V60E,K+K98I+N101D+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или более (например, несколько) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, G163S, Y220F и T244E.

В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления вариант содержит замены в положениях, соответствующих F51I,L+E56R+D57N+N101D+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или более (например, несколько) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, V60E,K, N101D, G163S, Y220F и T244E.

В частности, предпочтительные варианты осуществления включают варианты, содержащие замены в положениях, соответствующих одному из следующих наборов замен:

R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+R118F+T231R+N233R;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+E56R+R118F+T231R+N233R;

E56R+D57N+R118F+T231R+N233R;

E56R+V60K+R118F+T231R+N233R;

G23S+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+E56R+R118F+T231R+N233R;

D57N+E56R+R118F+T231R+N233R;

K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51L+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+P256T;

A40I+E56R+R118F+T231R+N233R;

E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+A40I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+A40I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+A40I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E:

G23S+D27N+A40I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+K98I+N101D+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+E56R+R118F+T231R+N233R;

K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+K98I+R118F+Y220F+T231R+N233R+T244E+P256T.

Последовательность варианта липазы предпочтительно по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, но менее чем на 100%, идентична последовательности родительской липазы.

Последовательность варианта предпочтительно по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, но менее чем на 100%, идентична последовательности SEQ ID NO: 2.

Вариант может иметь 1-40, 1-30, 1-20, например 1-12, например 1-11, например 1-10, например 1-9, например 1-8, например 1-7, например 1-6, например 1-5, например 1-4, например 1-3 или например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 замен.

По сравнению с родительской липазой вариант может обладать одним или более из следующих свойств: повышенная эффективность мытья, пониженное образование запаха, улучшенная стабильность при хранении, более длительный срок хранения и/или повышенная термостабильность.

Вариант липазы может дополнительно содержать одну или более дополнительных замен в одном или более (например, нескольких) других положениях.

Изменения в аминокислотах могут иметь незначительный характер, т.е. представлять собой консервативные аминокислотные замены или вставки, которые не оказывают существенного влияния на сворачивание и/или активность белка; небольшие делеции, как правило, длиной 1-30 аминокислот; небольшие удлинения на амино- или карбоксильном конце, например аминоконцевой метиониновый остаток; низкомолекулярный линкерный пептид, содержащий до 20-25 остатков; или небольшое удлинение, которое облегчает очистку путем изменения суммарного заряда или за счет другой функции, например, полигистидиновый тракт, антигенный эпитоп или связывающий домен.

Примеры консервативных замен находятся в пределах групп основных аминокислот (аргинин, лизин и гистидин), кислых аминокислот (глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота), полярных аминокислот (глутамин и аспарагин), гидрофобных аминокислот (лейцин, изолейцин и валин), ароматических аминокислот (фенилаланин, триптофан и тирозин) и малых аминокислот (глицин, аланин, серин, треонин и метионин). Аминокислотные замены, которые по существу не изменяют специфическую активность, известны в данной области и описаны, например, в публикации H. Neurath and R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York. Распространенными заменами являются Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly.

В альтернативном варианте осуществления изменения в аминокислотах имеют такой характер, который приводит к изменениям физико-химических свойств полипептидов. Например, изменения в аминокислотах могут улучшать термостабильность полипептида, изменять специфичность субстрата, изменять оптимальный уровень pH и т.п.

Незаменимые аминокислоты в полипептиде можно идентифицировать с использованием процедур, известных в данной области, таких как сайт-направленный мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). В последней технологии в каждый остаток молекулы вводят единичные мутации аланина и полученные мутантные молекулы тестируют на активность липазы для идентификации аминокислотных остатков, которые критичны для активности молекулы. См. также Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. Активный сайт фермента или иное биологическое взаимодействие можно также определять с помощью физического анализа структуры, т.е. таких технологий, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография, электрографический анализ или фотоаффинное мечение, при взаимосвязи с мутацией предполагаемого контактирующего сайта аминокислот. См., например de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. Идентификацию незаменимых аминокислот также можно проводить путем выравнивания с родственным полипептидом.

Варианты могут содержать или состоять из по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% аминокислот последовательности SEQ ID NO: 2.

Родительские липазы

Родительская липаза может быть выбрана из группы, состоящей из следующих элементов:

a) полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 2;

b) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который гибридизируется в условиях низкой жесткости, условиях средней жесткости, условиях средне-высокой жесткости, условиях высокой жесткости или условиях очень высокой жесткости с (i) кодирующей полипептид последовательностью SEQ ID NO: 1 или (ii) полноразмерной последовательностью, комплементарной (i);

c) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, последовательность которого по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 1, и

d) фрагмент полипептида SEQ ID NO: 2.

В одном аспекте изобретения родительская липаза характеризуется идентичностью последовательности с полипептидом с SEQ ID NO: 2 по меньшей мере 60%, например по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%, который обладает липазной активностью.

В одном аспекте аминокислотная последовательность родителя отличается от полипептида SEQ ID NO: 2 на 40 аминокислот или менее, например на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40.

В другом аспекте родитель состоит из или содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 2.

В другом аспекте родитель представляет собой фрагмент полипептида с SEQ ID NO: 2, содержащий по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% аминокислот последовательности SEQ ID NO: 2.

В другом варианте осуществления родитель представляет собой аллельный вариант полипептида с SEQ ID NO: 2.

В другом аспекте родительская липаза кодируется полипептидом, который гибридизируется в условиях очень низкой жесткости, в условиях низкой жесткости, условиях средней жесткости, условиях средне-высокой жесткости, условиях высокой жесткости или условиях очень высокой жесткости с (i) кодирующей полипептид последовательностью SEQ ID NO: 1, (ii) полноразмерной последовательностью, комплементарной (i) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York).

Полинуклеотид с SEQ ID NO: 1 или подпоследовательность, а также полипептид с SEQ ID NO: 2 или фрагмент можно применять для разработки зондов нуклеиновой кислоты для идентификации и клонирования ДНК, кодирующей родительскую молекулу, из штаммов различных родов или видов в соответствии со способами, хорошо известными в данной области. В частности, такие зонды можно использовать для гибридизации с геномной ДНК или кДНК интересующей клетки, по стандартным методикам Саузерн-блоттинга для идентифицирования и выделения из нее соответствующего гена. Такие зонды могут быть значительно короче, чем полная последовательность, но их длина должна составлять по меньшей мере 15, например по меньшей мере 25, по меньшей мере 35 или по меньшей мере 70 нуклеотидов. Длина зонда нуклеиновой кислоты предпочтительно составляет по меньшей мере 100 нуклеотидов, например по меньшей мере 200 нуклеотидов, по меньшей мере 300 нуклеотидов, по меньшей мере 400 нуклеотидов, по меньшей мере 500 нуклеотидов, по меньшей мере 600 нуклеотидов, по меньшей мере 700 нуклеотидов, по меньшей мере 800 нуклеотидов или по меньшей мере 900 нуклеотидов. Можно использовать как ДНК-, так и РНК-зонды. Как правило, зонды для определения соответствующего гена имеют метки (например, с помощью 32P, 3H, 35S, биотина или авидина). Такие зонды входят в объем настоящего изобретения.

Можно подвергать скринингу библиотеку геномной ДНК или кДНК, полученную из таких других штаммов, для поиска ДНК, гибридизирующейся с описанными выше зондами и кодирующей родителя. Геномную или иную ДНК из таких других штаммов можно разделять методом электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле или другими способами разделения. ДНК из библиотек или выделенную ДНК можно переносить и иммобилизовывать на нитроцеллюлозе или другом подходящем материале носителя. Для идентификации клона или ДНК, которые гибридизируются с SEQ ID NO: 1 или ее подпоследовательностью, в Саузерн-блоттинге используется материал-носитель.

Для целей настоящего изобретения гибридизация означает, что полинуклеотид гибридизуется с меченым зондом нуклеиновой кислоты, соответствующим (i) SEQ ID NO: 1, (ii) кодирующей последовательности полипептида с SEQ ID NO: 1, (iii) полноразмерной комплементарной последовательности; или (iv) подпоследовательности; в условиях от очень низкой до очень высокой жесткости. Молекулы, с которыми зонд нуклеиновой кислоты гибридизируется при таких условиях, можно обнаруживать, например, с помощью рентгеновской пленки или любого другого способа определения, известного в данной области.

В одном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой кодирующую последовательность полипептида с SEQ ID NO: 1. В другом аспекте зонд нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% нуклеотидов последовательности SEQ ID NO: 1. В другом аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой полинуклеотид, который кодирует полипептид с SEQ ID NO: 2; его полипептид; или фрагмент. В другом аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой SEQ ID NO: 1.

В другом варианте осуществления родитель кодируется полинуклеотидом, последовательность которого идентична кодирующей полипептид последовательности SEQ ID NO: 1 по меньшей мере на 60%, например по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или 100%.

Полипептид может представлять собой гибридный полипептид, в котором область одного полипептида слита с N-концевой или C-концевой частью области другого полипептида.

Родительская липаза может представлять собой слитый полипептид или расщепляемый слитый полипептид, в котором другой полипептид слит с N-концевой или C-концевой частью полипептида настоящего изобретения. Слитый полипептид получают путем слияния полинуклеотида, кодирующего другой полипептид, с полинуклеотидом настоящего изобретения. Технологии получения слитых полипептидов в данной области известны и включают лигирование кодирующих последовательностей, кодирующих полипептиды, так, чтобы они были в рамке и чтобы экспрессия слитого полипептида была под контролем одного (одних) и того (тех) же промотора(-ов) и терминатора. Слитые полипептиды могут также быть сконструированы с использованием технологии, в которой слитые полипептиды создаются посттрансляционно (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

Слитый полипептид может дополнительно содержать сайт расщепления, расположенный между двумя полипептидами. После секреции гибридного белка сайт расщепляется, при этом высвобождаются два полипептида. Примеры сайтов расщепления включают в себя, без ограничений, сайты, описанные в публикациях Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; и Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; и Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

Родительскую липазу можно получать из микроорганизмов любого рода. Для целей настоящего изобретения термин «полученный из», который используют в настоящем документе применительно к заданному источнику, означает, что родительская форма, кодируемая полинуклеотидом, продуцируется источником или штаммом, в который был вставлен полинуклеотид из источника. В одном аспекте родительская форма секретируется внеклеточным путем.

Родитель может представлять собой бактериальную липазу. Например, родитель может представлять собой грамположительный бактериальный полипептид, такой как липаза Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces или Thermobifida, или грамотрицательный бактериальный полипептид, такой как липаза Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella или Ureaplasma.

В одном аспекте родителем является липаза Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis или Bacillus thuringiensis.

В другом аспекте родителем является липаза Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis или Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

В другом аспекте родителем является липаза Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus или Streptomyces lividans.

В другом аспекте родитель представляет собой липазу Thermobifida alba или Thermobifida fusca (ранее известную как Thermomonaspora fusca).

Родитель может представлять собой грибную липазу. Например, родитель может представлять собой дрожжевую липазу, например липазу Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces или Yarrowia; или липазу мицелиального гриба, например липазу Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella или Xylaria.

В другом аспекте родитель представляет собой липазу Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis или Saccharomyces oviformis.

В другом аспекте родитель представляет собой липазу Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia setosa, Thielavia spededonium, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei или Trichoderma viride.

В другом аспекте родитель представляет собой липазу Thermomyces lanuginosus, например, в частности, липазу с SEQ ID NO: 2.

Следует понимать, что для вышеупомянутых видов варианты, используемые в изобретении, охватывают как совершенные, так и несовершенные стадии, а также другие таксономические эквиваленты, например анаморфы, независимо от названия вида, под которым они известны. Специалисты в данной области смогут легко распознавать идентичность соответствующих эквивалентов.

Штаммы этих видов можно свободно приобретать в ряде коллекций культур, таких как American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) и Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

Родительская липаза может быть идентифицирована и получена из других источников, включая микроорганизмы, выделенные из природных источников (например, почвы, компоста, воды и т.п.), или образцы ДНК, полученные непосредственно из природных материалов (например, почвы, компоста, воды и т.п.), с применением вышеупомянутых зондов. Технологии выделения микроорганизмов и ДНК непосредственно из природных сред обитания хорошо известны в данной области. Затем полинуклеотид, кодирующий родителя, можно получать путем аналогичного скрининга библиотеки геномной ДНК или кДНК, полученной из других организмов, или смешанного образца ДНК. После обнаружения полинуклеотида, кодирующего родителя, с помощью зонда(-ов) полинуклеотид можно выделять или клонировать с использованием технологий, хорошо известных специалистам в данной области (см., например, Sambrook et al., 1989, см. выше).

Получение вариантов

Вариант, подходящий для настоящего изобретения, можно получать способами получения вариантов липазы, включающими: (a) введение замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, F51I,L, E56R, D57N, K98I, R118F, G163S, T231R, N233R, Y220F, T244E и P256T; (b) выбор варианта, который обладает липазной активностью и по сравнению с родительской липазой имеет одно из перечисленных выше желаемых свойств; и (c) выделение варианта.

Варианты можно получать с использованием любой известной в данной области процедуры мутагенеза, такой как сайт-направленный мутагенез, конструирование синтетических генов, конструирование полусинтетических генов, случайный мутагенез, перестановка и т.п.

Сайт-направленный мутагенез представляет собой методику, в которой на одном или более определенных сайтах в полинуклеотиде, кодирующем родительскую липазу, выполняются одна или более (например, несколько) мутаций.

Сайт-направленный мутагенез можно реализовать in vitro посредством ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров, содержащих требуемую мутацию. Сайт-направленный мутагенез можно также реализовать in vitro методом кассетного мутагенеза, который включает расщепление рестрикционным ферментом на сайте в плазмиде, содержащей полинуклеотид, кодирующий родительскую липазу, и последующее лигирование олигонуклеотида, содержащего мутацию, с полинуклеотидом. Как правило, и плазмида, и олигонуклеотид расщепляются одним и тем же рестрикционным ферментом, что позволяет лигировать плазмиду и вставку друг с другом. См., например, Scherer and Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955; и Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966.

Сайт-направленный мутагенез можно также осуществлять in vivo известными в данной области способами. См., например, US2004/0171154. Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776; Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290; и Calissano and Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16.

В настоящем изобретении можно использовать любые процедуры сайт-направленного мутагенеза. В продаже доступно множество наборов, которые можно использовать для получения вариантов.

Конструирование синтетических генов влечет за собой синтез in vitro заданной молекулы полинуклеотида для кодирования нужного полипептида. Синтез генов можно осуществлять с применением ряда технологий, таких как мультиплексная технология на основе микрочипов, описанная в публикации Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054), и аналогичные технологии, в которых олигонуклеотиды синтезируются и собираются на фотопрограммируемые микрожидкостные чипы.

Можно осуществлять одиночные или множественные замены, делеции и/или вставки аминокислот и тестировать их с применением известных способов мутагенеза, рекомбинации и/или перестановки с последующим выполнением подходящей процедуры скрининга, как описано в публикации Reidhaar Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO95/17413 или WO95/22625 Другие возможные способы включают ПЦР сниженной точности, фаговый дисплей (например, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; патент США №5,223,409; WO 92/06204) и мутагенез, целенаправленно воздействующий на область (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

Способы мутагенеза/перестановки можно комбинировать с высокопроизводительными автоматизированными методами скрининга для выявления активности клонированных, подвергнутых мутагенезу полипептидов, экспрессируемых клетками-хозяевами (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Подвергнутые мутагенезу молекулы ДНК, которые кодируют активные полипептиды, можно выделять из клеток-хозяев и быстро секвенировать с применением стандартных способов, известных в данной области. Эти способы позволяют быстро определять значение отдельных аминокислотных остатков в полипептиде.

Конструирование полусинтетических генов осуществляют путем комбинирования аспектов конструирования синтетических генов, и/или сайт-направленного мутагенеза, и/или случайного мутагенеза, и/или перестановки. Типичным способом полусинтетического конструирования является применение полинуклеотидных фрагментов, синтезированных в комбинации с технологиями ПЦР. Таким образом, определенные участки генов можно синтезировать de novo, тогда как другие участки можно амплифицировать с помощью праймеров для сайт-направленного мутагенеза, тогда как другие участки можно подвергать амплификации методом ПЦР сниженной точности или ПЦР иного типа. После этого полинуклеотидные подпоследовательности можно подвергать перестановке.

Вариант липазы можно получать с помощью способа, включающего: (a) культивирование клетки-хозяина в условиях, подходящих для экспрессии варианта; и (b) выделение варианта.

Конструкты нуклеиновой кислоты

Настоящее изобретение также относится к конструктам нуклеиновой кислоты, содержащим полинуклеотид, кодирующий вариант настоящего изобретения, функционально связанный с одной или более контрольными последовательностями, которые направляют экспрессию кодирующей последовательности, в подходящей клетке-хозяине в условиях, подходящих для функционирования контрольных последовательностей.

Манипуляции с полинуклеотидом можно осуществлять различными способами, обеспечивающим экспрессию варианта. Манипуляция с полинуклеотидом до его вставки в вектор может быть желательной или необходимой в зависимости от экспрессионного вектора. Способы модификации полинуклеотидов с использованием технологии рекомбинантной ДНК хорошо известны в данной области.

Контрольная последовательность может представлять собой промотор, полинуклеотид, который распознается клеткой-хозяином для экспрессии полинуклеотида. Промотор содержит транскрипционные контрольные последовательности, которые опосредуют экспрессию варианта. Промотор может представлять собой любой полинуклеотид, который демонстрирует транскрипционную активность в клетке-хозяине, включая мутантные, усеченные и гибридные промоторы, и может быть получен из генов, кодирующих внеклеточные или внутриклеточные полипептиды, гомологичные или гетерологичные клетке-хозяину.

Примеры подходящих промоторов для направления транскрипции конструктов нуклеиновой кислоты настоящего изобретения в бактериальной клетке-хозяине представляют собой промоторы, полученные из гена альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), гена альфа-амилазы Bacillus licheniformis (amyL), гена пенициллиназы Bacillus licheniformis (penP), гена мальтогенной амилазы Bacillus stearothermophilus (amyM), гена левансахаразы Bacillus subtilis (sacB), генов Bacillus subtilis xylA и xylB, гена Bacillus thuringiensis cryIIIA (Agaisse and Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), оперона E. coli lac, промотора E. coli trc (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), гена агаразы Streptomyces coelicolor (dagA) и гена прокариотической бета-лактамазы (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), а также tac-промотора (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Дополнительные промоторы описаны в публикации Useful proteins from recombinant bacteria, Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; И Sambrook et al., 1989, см. выше. Примеры тандемных промоторов описаны в WO 99/43835.

Примеры подходящих промоторов для направления транскрипции конструктов нуклеиновой кислоты настоящего изобретения в мицелиальной грибной клетке-хозяине представляют собой промоторы, полученные из генов ацетамидазы Aspergillus nidulans, нейтральной альфа-амилазы Aspergillus niger, кислотоустойчивой альфа-амилазы Aspergillus niger гликоамилазы Aspergillus niger или Aspergillus awamori (glaA), амилазы TAKA Aspergillus oryzae, щелочной протеазы Aspergillus oryzae, триозофосфатизомеразы Aspergillus oryzae, трипсиноподобной протеазы Fusarium oxysporum (WO96/00787), амилоглюкозидазы Fusarium venenatum (WO00/56900), Daria Fusarium venenatum (WO00/56900), Quinn Fusarium venenatum (WO00/56900), липазы Rhizomucor miehei, аспарагиновой протеиназы Rhizomucor miehei, бета-глюкозидазы Trichoderma reesei, целлобиогидролазы I Trichoderma reesei, целлобиогидролазы II Trichoderma reesei, эндоглюканазы I Trichoderma reesei, эндоглюканазы II Trichoderma reesei, эндоглюканазы III Trichoderma reesei, эндоглюканазы IV Trichoderma reesei, эндоглюканазы V Trichoderma reesei, ксиланазы I Trichoderma reesei, ксиланазы II Trichoderma reesei, бета-ксилозидазы Trichoderma reesei, а также промотора NA2-tpi (модифицированный промотер из гена нейтральной альфа-амилазы Aspergillus, в котором нетранслируемая лидерная последовательность замещена нетранслируемой лидерной последовательностью из гена триозофосфатизомеразы Aspergillus; не имеющие ограничительного характера примеры включают в себя модифицированные промоторы из гена нейтральной альфа-амилазы Aspergillus niger, в котором нетранслируемая лидерная последовательность замещена нетранслируемой лидерной последовательностью из гена триозофосфатизомеразы Aspergillus nidulans или Aspergillus oryzae); и их мутантные, усеченные и гибридные промоторы.

В дрожжевых организмах-хозяевах возможные промоторы получают из генов енолазы Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), галактокиназы Saccharomyces cerevisiae (GAL1), алкогольдегидрогеназы/глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP), триозофосфатизомеразы Saccharomyces cerevisiae (TPI), металлотионеина Saccharomyces cerevisiae (CUP1) и 3-фосфоглицераткиназы Saccharomyces cerevisiae. Другие полезные промоторы для дрожжевых организмов-хозяев описаны в публикации Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

Контрольная последовательность может также представлять собой терминатор транскрипции, который распознается клеткой-хозяином для терминации транскрипции. Терминирующая последовательность функционально связана с 3'-концевой частью полинуклеотида, кодирующего вариант. Можно использовать любой терминатор, который будет функциональным в клетке-хозяине.

Предпочтительные терминаторы для бактериальных клеток-хозяев получены из генов щелочной протеазы Bacillus clausii (aprH), альфа-амилазы Bacillus licheniformis (amyL) и рибосомальной РНК Escherichia coli (rrnB).

Терминаторы, предпочтительные для клеток-хозяев, представляющих собой мицелиальные грибы, получают из генов антранилатсинтазы Aspergillus nidulans, глюкоамилазы Aspergillus niger, альфа-глюкозидазы Aspergillus niger, амилазы TAKA Aspergillus oryzae и трипсиноподобной протеазы Fusarium oxysporum.

Предпочтительные терминаторы для дрожжевых клеток-хозяев получают из генов енолазы Saccharomyces cerevisiae, цитохрома C (CYC1) Saccharomyces cerevisiae и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Saccharomyces cerevisiae. Другие терминаторы, подходящие для дрожжевых клеток-хозяев, описаны Romanos et al., 1992, см. выше.

Контрольная последовательность может также представлять собой стабилизирующую область мРНК, расположенную ниже от промотора и выше от кодирующей последовательности гена, которая увеличивает экспрессию гена.

Примеры подходящих стабилизирующих областей мРНК получены из гена Bacillus thuringiensis cryIIIA (WO94/25612) и гена SP82 Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).

Контрольная последовательность может также представлять собой лидера, нетранслируемую область мРНК, которая необходима для трансляции клеткой-хозяином. Лидерная последовательность функционально связана с 5'-концом полинуклеотида, кодирующего вариант. Возможно использование любого лидера, который функционален в клетке-хозяине.

Лидеры, предпочтительные для клеток-хозяев, представляющих собой мицелиальные грибы, получают из генов амилазы TAKA Aspergillus oryzae и триозофосфатизомеразы Aspergillus nidulans.

Лидеры, которые являются предпочтительными для дрожжевых клеток-хозяев, получают из генов енолазы Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), 3-фосфоглицераткиназы Saccharomyces cerevisiae, альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae и алкогольдегидрогеназы/глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).

Контрольная последовательность может также представлять собой последовательность полиаденилирования, т.е. последовательность, функционально связанную с 3'-концом вариант-кодирующей последовательности и распознаваемую клеткой-хозяином в процессе транскрипции как сигнал к добавлению полиаденозина к транскрибируемой мРНК. Можно использовать любую последовательность полиаденилирования, которая будет функциональной в клетке-хозяине.

Последовательности полиаденилирования, предпочтительные для клеток-хозяев, представляющих собой мицелиальные грибы, получают из генов антранилатсинтазы Aspergillus nidulans, глюкоамилазы Aspergillus niger, альфа-глюкозидазы Aspergillus niger, амилазы TAKA Aspergillus oryzae и трипсиноподобной протеазы Fusarium oxysporum.

Последовательности полиаденилирования, которые можно использовать для дрожжевых клеток-хозяев, описаны в Guo and Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.

Контрольная последовательность может также представлять собой область, кодирующую сигнальный пептид, т.е. область, которая кодирует сигнальный пептид, связанный с N-концевой частью варианта, и направляет вариант в секреторный путь клетки. 5'-конец кодирующей последовательности полинуклеотида может наследственно содержать последовательность, кодирующую сигнальный пептид, которая естественным образом связана в трансляционной рамке считывания с сегментом кодирующей последовательности, которая кодирует вариант. В альтернативном варианте осуществления 5'-конец кодирующей последовательности может содержать последовательность, кодирующую сигнальный пептид, которая является чужеродной по отношению к кодирующей последовательности. Чужеродная последовательность, кодирующая сигнальный пептид, может потребоваться, когда кодирующая последовательность не имеет собственной последовательности, кодирующей сигнальный пептид. В альтернативном варианте осуществления чужеродная последовательность, кодирующая сигнальный пептид, может просто заменять собственную последовательность, кодирующую сигнальный пептид, для усиления секреции варианта. Однако можно использовать любую последовательность, кодирующую сигнальный пептид, которая направляет экспрессируемый вариант в секреторный путь клетки-хозяина.

Эффективные последовательности, кодирующие сигнальный пептид, для бактериальных клеток-хозяев представляют собой последовательности, кодирующие сигнальный пептид, полученные из генов мальтогенной амилазы Bacillus NCIB 11837, субтилизина Bacillus licheniformis, бета-лактамазы Bacillus licheniformis, альфа-амилазы Bacillus stearothermophilus, нейтральных протеаз Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) и prsA Bacillus subtilis. Дополнительные сигнальные пептиды описаны в Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

Эффективные последовательности, кодирующие сигнальный пептид, для клеток-хозяев, представляющих собой мицелиальные грибы, представляют собой последовательности, кодирующие сигнальный пептид, полученные из генов нейтральной амилазы Aspergillus niger, глюкоамилазы Aspergillus niger, амилазы TAKA Aspergillus oryzae, целлюлазы Humicola insolens, эндоглюканазы V Humicola insolens, липазы Humicola lanuginosa и аспарагиновой протеиназы Rhizomucor miehei.

Полезные сигнальные пептиды для дрожжевых клеток-хозяев получают из генов альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae и инвертазы Saccharomyces cerevisiae. Другие последовательности, кодирующие сигнальный пептид, которые можно использовать, описаны Romanos et al., 1992, см. выше.

Контрольная последовательность может также представлять собой последовательность, кодирующую пропептид, который кодирует пропептид, расположенный на N-концевой части варианта. Полученный в результате полипептид известен как профермент или прополипептид (или в некоторых случаях зимоген). Прополипептид по существу неактивен, и его можно преобразовывать в активный полипептид с помощью каталитического или автокаталитического расщепления пропептида от прополипептида. Последовательность, кодирующая пропептид, может быть получена из генов щелочной протеазы Bacillus subtilis (aprE), нейтральной протеазы Bacillus subtilis (nprT), лакказы Myceliophthora thermophila (WO95/33836), аспарагиновой протеиназы Rhizomucor miehei и альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae.

При наличии как последовательности сигнального пептида, так и пропептида, последовательность пропептида расположена рядом с N-концом варианта, а последовательность сигнального пептида расположена рядом с N-концом последовательности пропептида.

Кроме того, может быть желательным добавление регуляторных последовательностей, которые регулируют экспрессию варианта относительно роста клетки-хозяина. Примерами регуляторных систем являются системы, которые вызывают включение или выключение экспрессии гена в ответ на химический или физический стимул, включая присутствие регуляторного соединения. Регуляторные системы в прокариотических системах включают в себя системы операторов lac, tac и trp. В дрожжах можно применять систему ADH2 или систему GAL1. В мицелиальных грибах можно применять глюкоамилазный промотор Aspergillus niger, промотор альфа-амилазы TAKA Aspergillus oryzae и глюкоамилазный промотор Aspergillus oryzae. Другими примерами регуляторных последовательностей являются те, что позволяют амплифицировать ген. В эукариотических системах эти регуляторные последовательности включают в себя ген дигидрофолатредуктазы, который амплифицируется в присутствии метотрексата, и гены металлотионеина, которые амплифицируются с тяжелыми металлами. В таких случаях полинуклеотид, кодирующий вариант, будет функционально связан с регуляторной последовательностью.

Экспрессионные векторы

В заявке также описаны рекомбинантные экспрессионные векторы, содержащие полинуклеотид, кодирующий вариант, используемый в настоящем изобретении, промотор и сигналы остановки транскрипции и трансляции. Различные нуклеотидные и контрольные последовательности можно объединять вместе для получения рекомбинантного экспрессионного вектора, который может включать в себя один или более подходящих рестрикционных сайтов для обеспечения на таких сайтах вставки или замены полинуклеотида, кодирующего вариант. В альтернативном варианте осуществления полинуклеотид может экспрессироваться путем вставки полинуклеотида или конструкта нуклеиновой кислоты, содержащего полинуклеотид, в соответствующий вектор для экспрессии. При создании экспрессионного вектора кодирующая последовательность располагается в векторе так, что кодирующая последовательность функционально связана с соответствующими контрольными последовательностями для экспрессии.

Рекомбинантный экспрессионный вектор может представлять собой любой вектор (например, плазмидный или вирусный), который можно легко подвергать процедурам рекомбинантной ДНК и который способен осуществлять экспрессию полинуклеотида. Выбор вектора, как правило, зависит от совместимости вектора с клеткой-хозяином, в которую необходимо ввести вектор. Вектор может представлять собой линейную или замкнутую кольцевую плазмиду.

Вектор может представлять собой автономно реплицирующийся вектор, т.е. вектор, который существует как внехромосомный объект, репликация которого не зависит от хромосомной репликации, примеры включают, например, плазмиду, внехромосомный элемент, минихромосому или искусственную хромосому. Вектор может содержать любые средства, обеспечивающие саморепликацию. В альтернативном варианте осуществления вектор может представлять собой вектор, который при введении в клетку-хозяина интегрируется в геном и реплицируется вместе с хромосомой(-ами), в которую(-ые) он интегрирован. Кроме того, можно использовать один вектор или плазмиду или два или более вектора или плазмиды, которые вместе содержат полную ДНК для введения в геном клетки-хозяина, или транспозон.

Вектор предпочтительно содержит один или более селективных маркеров, которые позволяют легко выбирать трансформированные, трансфицированные, трансдуцированные или т.п. клетки. Селективный маркер представляет собой ген, продукт которого обеспечивает резистентность к биоцидам или вирусам, резистентность к тяжелым металлам, прототрофность к ауксотрофам и т.п.

Примерами бактериальных селектируемых маркеров являются гены Bacillus licheniformis или Bacillus subtilis dal, или маркеры, обеспечивающие резистентность к антибиотикам, например резистентность к ампициллину, хлорамфениколу, канамицину, неомицину, спектиномицину или тетрациклину. Подходящие маркеры для дрожжевых клеток-хозяев включают в себя, без ограничений ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 и URA3. Селектируемые маркеры для применения в мицелиальной грибной клетке-хозяине включают в себя, без ограничений, amdS (ацетамидазу), argB (орнитинкарбамоилтрансферазу), bar (фосфинотрицинацетилтрансферазу), hph (гигромицинфосфотрансферазу), niaD (нитратредуктазу), pyrG (оротидин-5'-фосфатдекарбоксилазу), sC (сульфатаденилтрансферазу) и trpC (антранилатсинтазу), а также их эквиваленты. Предпочтительными для применения в клетке Aspergillus являются гены amdS и pyrG Aspergillus nidulans или Aspergillus oryzae и ген Streptomyces hygroscopicus bar.

Вектор предпочтительно содержит элемент(-ы), который(-ые) позволяет(-ют) интегрировать вектор в геном клетки-хозяина или осуществлять автономную репликацию вектора в клетке независимо от генома.

Для интеграции в геном клетки-хозяина вектор может опираться на полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариант, или на любой другой элемент вектора для интеграции в геном путем гомологичной или негомологичной рекомбинации. В альтернативном варианте осуществления вектор может содержать дополнительные полинуклеотиды для направления интеграции путем гомологичной рекомбинации в геном клетки-хозяина в точно определенное(-ые) место(-а) в хромосоме(-ах). Для повышения вероятности интеграции в точно определенное место интеграционные элементы должны содержать достаточное число нуклеиновых кислот, например 100-10000 пар нуклеотидов, 400-10000 пар нуклеотидов и 800-10000 пар нуклеотидов, которые имеют высокую степень идентичности последовательности с соответствующей целевой последовательностью для повышения вероятности гомологичной рекомбинации. Интеграционные элементы могут представлять собой любую последовательность, гомологичную целевой последовательности в геноме клетки-хозяина. Кроме того, интеграционные элементы могут представлять собой некодирующие или кодирующие полинуклеотиды. С другой стороны, вектор можно интегрировать в геном клетки-хозяина посредством негомологичной рекомбинации.

Для автономной репликации вектор может дополнительно содержать точку начала репликации, позволяющую вектору автономно реплицироваться в представляющей интерес клетке-хозяине. Точкой начала репликации может являться любой плазмидный репликатор, который функционирует в клетке и опосредует автономную репликацию. Термин «точка начала репликации» или «плазмидный репликатор» означает полинуклеотид, который обеспечивает репликацию in vivo плазмиды или вектора.

Примерами бактериальных участков начала репликации являются участки начала репликации плазмид pBR322, pUC19, pACYC177 и pACYC184, позволяющие выполнять репликацию в E. coli, и pUB110, pE194, pTA1060 и pAMβ1, позволяющие выполнять репликацию в Bacillus.

Примерами участков начала репликации для применения в клетке-хозяине дрожжей являются участки начала репликации размером 2 мкм, ARS1, ARS4, комбинация ARS1 и CEN3 и комбинация ARS4 и CEN6.

Примерами участков начала репликации, подходящих для мицелиальной грибной клетки, являются AMA1 и ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). Выделение гена AMA1 и конструирование плазмид или векторов, содержащих ген, можно осуществлять в соответствии со способами, описанными в WO 00/24883.

В клетку-хозяина можно вставлять более одной копии полинуклеотида настоящего изобретения для увеличения продукции варианта. Увеличения числа копий полинуклеотида можно достигнуть путем интеграции по меньшей мере одной дополнительной копии последовательности в геном клетки-хозяина или путем включения способного к амплификации гена-селективного маркера с полинуклеоитидом, где клетки, содержащие амплифицированные копии гена-селективного маркера и, соответственно, дополнительные копии полинуклеотида, могут быть селектированы путем культивирования клеток в присутствии подходящего селективного агента.

Процедуры, применяемые для лигирования описанных выше элементов с конструктом рекомбинантных экспрессионных векторов настоящего изобретения, хорошо известны специалистам в данной области (см., например, Sambrook et al., 1989, см. выше).

Клетки-хозяева

В настоящей заявке также описаны рекомбинантные клетки-хозяева, содержащие полинуклеотид, кодирующий вариант настоящего изобретения, функционально связанный с одной или более контрольными последовательностями, которые направляют продуцирование варианта настоящего изобретения. Конструкт или вектор, содержащий полинуклеотид, вводят в клетку-хозяина так, чтобы конструкт или вектор сохранялся в форме хромосомного компонента или самореплицирующегося внехромосомного вектора, как описано выше. Термин «клетка-хозяин» охватывает любое потомство родительской клетки, которое не идентично родительской клетке вследствие мутаций, которые происходят во время репликации. Выбор клетки-хозяина в значительной степени будет зависеть от гена, кодирующего вариант, и его источника.

Клетка-хозяин может представлять собой любую клетку, подходящую для рекомбинантного продуцирования варианта, например, прокариот или эукариот.

Прокариотическая клетка-хозяин может представлять собой любую грамположительную или грамотрицательную бактерию. Грамположительные бактерии включают в себя, без ограничений, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus и Streptomyces. Грамотрицательные бактерии включают в себя, без ограничений, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella и Ureaplasma.

Бактериальная клетка-хозяин может представлять собой любую клетку Bacillus, включая, без ограничений, клетки Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis и Bacillus thuringiensis.

Бактериальная клетка-хозяин может также представлять собой любую клетку Streptococcus, включая, без ограничений, клетки Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis и Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

Бактериальная клетка-хозяин может также представлять собой любую клетку Streptomyces, включая, без ограничений, клетки Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus и Streptomyces lividans.

Введение ДНК в клетку Bacillus можно осуществлять путем трансформации протопластов (см., например, Chang and Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), трансформации компетентных клеток (см., например, Young and Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, или Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), электропорации (см., например, Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), или конъюгации (см., например, Koehler and Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). Введение ДНК в клетку E. coli можно осуществлять путем трансформации протопластов (см., например, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) или электропорации (см., например, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). Введение ДНК в клетку Streptomyces можно осуществлять путем трансформации протопластов, электропорации (см., например, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), конъюгации (см., например, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585) или трансдукции (см., например, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). Введение ДНК в клетку Pseudomonas можно осуществлять путем электропорации (см., например, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) или конъюгации (см., например, Pinedo and Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). Введение ДНК в клетку Streptococcus можно осуществлять, используя естественную компетентность (см., например, Perry and Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), трансформации протопластов (см., например, Catt and Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207, электропорации (см., например, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) или конъюгации (см., например, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). Однако для введения ДНК в клетку-хозяина можно использовать любой известный в данной области способ.

Клетка-хозяин может также представлять собой эукариот, такой как клетка млекопитающих, насекомых, растений или гриба.

Клетка-хозяин может представлять собой грибную клетку. В контексте настоящего документа термин «грибы» включает в себя типы Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota и Zygomycota, а также Oomycota и все митоспоровые грибы (как определено в Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, г. Кембридж, Великобритания).

Грибная клетка-хозяин может представлять собой дрожжевую клетку. В контексте настоящего документа термин «дрожжи» включает в себя аскоспорогенные дрожжи (эндомицетовые), базидиоспорогенные дрожжи и дрожжи, принадлежащие несовершенным грибам (бластомицеты). Поскольку классификация дрожжей может изменяться в будущем, для целей настоящего изобретения дрожжи определяются, как описано в издании Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, and Davenport, editors, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

Дрожжевая клетка-хозяин может представлять собой клетку Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces или Yarrowia, например Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis или Yarrowia lipolytica.

Грибная клетка-хозяин может представлять собой мицелиальную грибную клетку. «Мицелиальные грибы» включают в себя все мицелиальные формы подотдела Eumycota и Oomycota (как определено Hawksworth et al., 1995, см. выше). Мицелиальные грибы по существу характеризуются мицелиальной стенкой, состоящей из хитина, целлюлозы, глюкана, хитозана, маннана и других сложных полисахаридов. Вегетативный рост осуществляется путем гифального удлинение, а катаболизм углерода является облигатно аэробным. Напротив, вегетативный рост дрожжей, таких как Saccharomyces cerevisiae, происходит за счет почкования одноклеточного таллома, а катаболизм углерода может быть ферментативным.

Мицелиальная грибная клетка-хозяин может представлять собой клетку Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes или Trichoderma.

Например, мицелиальная грибная клетка-хозяин может представлять собой клетку Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei или Trichoderma viride.

Грибные клетки можно трансформировать с помощью существу известного способа, включающего образование протопластов, трансформацию протопластов и регенерацию клеточной стенки. Подходящие способы трансформации клеток-хозяев Aspergillus и Trichoderma описаны в патенте EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474, а также Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Подходящие способы трансформации видов Fusarium описаны в публикации Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, и WO96/00787. Дрожжи можно трансформировать с использованием процедур, описанных в Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153; 163; и Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.

Способы продуцирования

В настоящей заявке также описаны способы получения варианта липазы настоящего изобретения, включающие: (a) культивирование клетки-хозяина настоящего изобретения в условиях, подходящих для экспрессии варианта; и (b) выделение варианта.

Клетки-хозяева культивируются в питательной среде, подходящей для получения варианта, известными в данной области способами. Например, клетку можно культивировать путем культивирования во встряхиваемой колбе или с помощью мелкомасштабной или крупномасштабной ферментации (включая непрерывную, полунепрерывную, периодическую или твердофазную ферментации) в лабораторных или промышленных ферментерах, осуществляемой в подходящей среде при условиях, подходящих для экспрессии и/или выделения варианта. Культивирование проводят в подходящей питательной среде, содержащей источники углерода и азота и неорганические соли, известными в данной области способами. Подходящие среды можно приобрести у коммерческих поставщиков или получить в соответствии с опубликованными композициями (например, в каталогах American Type Culture Collection). При секретировании варианта с использованием питательной среды такой вариант можно выделять непосредственно из среды. Помимо секретирования вариант можно выделять из клеточных лизатов.

Вариант может быть обнаружен способами, известными в данной области, которые специфичны для конкретных вариантов. Данные способы обнаружения включают, без ограничений, применение специфических антител, образование продукта фермента или исчезновение субстрата фермента. Например, для определения активности вариантов, таких как описанные в примерах, можно применять ферментный анализ.

Вариант можно выделять, используя способы, известные в данной области. Например, вариант можно выделять из питательной среды обычными способами, включая, без ограничений, сбор, центрифугирование, фильтрацию, экстракцию, распылительную сушку, выпаривание или осаждение.

Вариант можно очищать разнообразными способами, известными в данной области, включая, без ограничений, хроматографию (например, ионообменную, аффинную, гидрофобную, эксклюзионную и хроматофокусирование), процедуры электрофореза (например, препаративное изоэлектрическое фокусирование), дифференциальную растворимость (например, осаждение сульфатом аммония), SDS-PAGE или экстракцию (см., например, Protein Purification, Janson and Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989), для получения по существу чистых вариантов.

В альтернативном варианте осуществления вариант не извлекают, а в качестве источника варианта используют клетку-хозяина настоящего изобретения, экспрессирующую вариант.

Состав микрокапсул

В настоящем изобретении липаза, предпочтительно вариант липазы, необязательно инкапсулирована в микрокапсулу. Мембрану микрокапсулы предпочтительно получают путем поперечного сшивания полиразветвленного полиамина с молекулярной массой более 1 кДа. Мембрана, образованная путем поперечной сшивки полиразветвленного полиамина, способна отделять фермент от поверхностно-активных веществ, в частности анионных поверхностно-активных веществ, в моющем средстве, которые, как известно, отрицательно влияют на стабильность ферментов.

Предпочтительно при использовании инкапсулированных ферментов в моющем средстве капсулы способны высвобождать фермент по существу сразу же после разведения моющего средства в воде, например, для стирки или мытья посуды. Предпочтительные микрокапсулы обладают отличными свойствами в этом отношении и предпочтительно способны высвобождать весь инкапсулированный фермент в течение одной минуты.

Предпочтительные микрокапсулы не требуют наличия полимера в сердцевине для высвобождения фермента при разведении в воде. Кроме того, в изобретении не требуется, чтобы фермент(-ы) находился(-ись) в осажденном виде в сердцевине микрокапсулы для предотвращения преждевременного высвобождения, как описано в WO 97/24177.

При инкапсуляции варианта липазы, как определено в настоящем документе, и необязательно других ферментов в микрокапсулу с полупроницаемой мембраной и при наличии активности воды внутри этих капсул (перед добавлением к жидкому моющему средству), превышающей активность в жидком моющем средстве, при добавлении к моющему средству (вода выделяется наружу) капсулы будут подвергаться (частичному) разрушению, таким образом, оставляя более концентрированный и более вязкий фермент, содержащийся внутри капсул. Разрушение мембраны также может приводить к снижению проницаемости. В такой ситуации можно дополнительно добавлять стабилизаторы/полимеры, особенно те, которые не способны проникать через мембрану. Разрушение и итоговое увеличение вязкости будут уменьшать диффузию/препятствовать диффузии нежелательных компонентов (например, поверхностно-активных веществ или секвестрантов) в капсулы и, таким образом, повышать стабильность при хранении фермента в жидком моющем средстве. Компоненты в жидком моющем средстве, которые чувствительны к ферменту (например, компоненты, которые выступают в роли субстрата для фермента), также защищены от разложения ферментом. Во время мытья жидкое моющее средство разбавляют водой, таким образом увеличивая активность воды. После этого вода будет диффундировать в капсулы (осмос). Капсулы будут набухать, и мембрана либо станет проницаемой для фермента, чтобы он мог выйти из капсул, либо капсулы просто лопнут, и таким образом произойдет высвобождение фермента. Эта концепция очень эффективна в отношении защиты ферментов от агрессивных компонентов в жидком моющем средстве, и наоборот, а также защищает чувствительные к ферменту компоненты в жидком моющем средстве от ферментов.

Примеры компонентов моющего средства, которые являются чувствительными к ферментам и могут подвергаться разложению, включают (соответствующий фермент в скобках): ксантановую камедь (ксантаназа), полимеры со сложноэфирными связями (липаза), гидрогенизированное касторовое масло (липаза), ароматическое вещество (липаза), поверхностно-активные вещества на основе сульфоната сложного метилового эфира (липаза), целлюлозу и производные целлюлозы (например, КМЦ) (целлюлаза), декстрин и циклодекстрин (амилаза).

Кроме того, чувствительные ингредиенты моющего средства можно инкапсулировать и, таким образом, стабилизировать в микрокапсулах, описанных в настоящем документе. Чувствительные ингредиенты моющего средства подвержены разложению во время хранения. Такие ингредиенты моющего средства включают отбеливающие соединения, активаторы отбеливателя, ароматические вещества, полимеры, модификаторы, поверхностно-активные вещества и т.д.

Как правило, микрокапсулы, описанные в настоящем документе, можно применять для отделения несовместимых/чувствительных компонентов/соединений в моющей композиции.

Добавление микрокапсул к моющей композиции может быть использовано для изменения внешнего вида моющей композиции или изделия с разовой дозой, например, за счет обеспечения эффекта непрозрачности (с использованием мелких микрокапсул) или эффекта отчетливо видимых частиц (с использованием больших микрокапсул). Микрокапсулы могут быть необязательно окрашены.

Микрокапсулы можно использовать для снижения количеств ферментативной пыли во время манипуляций и обработки ферментных продуктов.

Если не указано иное, все процентные доли во всех случаях приведены в процентах по массе (мас.%) в настоящем документе.

Получение микрокапсулы

Предпочтительные микрокапсулы, как правило, получают путем формирования капель воды в сплошную среду, которая не смешивается с водой (т.е., как правило, путем получения эмульсии вода в масле), и последующего формирования мембраны с использованием межфазной полимеризации посредством добавления сшивающего агента. После конечного отверждения капсулы собирают и дополнительно ополаскивают и формируют известными в данной области способами. Впоследствии состав капсул добавляют в моющее средство.

Активное вещество, основные составляющие мембраны и возможный дополнительный компонент, которые должны быть инкапсулированы, находятся в водной фазе. В сплошной среде находятся компоненты, которые стабилизируют капли воды в отношении слипания (эмульгаторы, стабилизаторы эмульсии, поверхностно-активные вещества и т.д.), и через сплошную среду также добавляют сшивающий агент.

Эмульсию можно получить любыми известными в данной области способами, например путем механического перемешивания, капельных способов, эмульгирования мембраны, микрожидкостных методов, обработки ультразвуком и т.д. В некоторых случаях простое смешивание фаз автоматически приведет к эмульгированию, часто называемому самоэмульгированием. Предпочтительным является использование способов, приводящих к распределению по размерам в узком диапазоне.

Затем, как правило, в эмульсию добавляют сшивающий(-ие) агент(-ы), либо непосредственно, либо чаще путем получения раствора сшивающего агента в растворителе, который растворим в непрерывной фазе. Эмульсию и сшивающий агент или его раствор можно смешивать стандартными способами, используемыми в данной области, например, путем простого смешивания или путем тщательного контроля потоков эмульсии и раствора сшивающего агента через встроенный смеситель.

В некоторых случаях для завершения формирования мембраны может потребоваться отверждение капсул. Отверждение можно проводить путем простого перемешивания капсул в течение некоторого времени для того, чтобы завершилась реакция межфазной полимеризации. В других случаях формирование мембраны можно остановить путем добавления гасителя реакции.

Капсулы можно подвергать последующей модификации, например, с помощью реагирующих компонентов на мембране для предотвращения или уменьшения флокуляции частиц в моющем средстве, как описано в WO 99/01534.

Полученные капсулы могут быть выделены или сконцентрированы с помощью способов, известных в данной области, например, путем фильтрации, центрифугирования, дистилляции или декантации дисперсии капсул.

Состав полученных капсул может быть дополнительно изменен, например, путем добавления поверхностно-активных веществ для придания продукту желаемых свойств для хранения, транспортировки и последующей обработки и добавления в моющее средство. Другие агенты, которые могут входить в состав микрокапсул, включают модификаторы реологии, биоциды (например, Proxel), кислоту/основание для регулирования pH (которые также регулируют рН внутри микрокапсул) и воду для коррекции активности воды.

Способ формирования капсулы может включать следующие этапы:

- получение первоначальных водной и масляной фаз;

- образование эмульсии вода в масле;

- формирование мембраны посредством межфазной полимеризации;

- необязательную последующую модификацию;

- необязательную изоляцию и/или дополнение состава;

- добавление в моющее средство.

Способ может представлять собой либо периодический процесс, либо непрерывный, либо полунепрерывный процесс.

Как описано в настоящем документе, микрокапсула представляет собой небольшую водную сферу, причем вокруг нее обеспечена по существу однородная мембрана. Материал внутри микрокапсулы обозначается как сердцевина, внутренняя фаза или наполнитель, тогда как мембрану иногда называют оболочкой, покрытием или стенкой. Предпочтительные микрокапсулы, описанные в настоящем документе, имеют диаметры от 0,5 мкм до 2 миллиметров. Предпочтительно средний диаметр микрокапсул находится в диапазоне от 1 мкм до 1000 мкм, более предпочтительно в диапазоне от 5 мкм до 500 мкм, еще более предпочтительно в диапазоне от 10 мкм до 500 мкм, еще более предпочтительно в диапазоне от 50 мкм до 500 мкм, а наиболее предпочтительно в диапазоне от 50 мкм до 200 мкм. В альтернативном варианте осуществления диаметр микрокапсул находится в диапазоне от 0,5 мкм до 30 мкм; или в диапазоне от 1 мкм до 25 мкм. Диаметр микрокапсулы измеряют в масляной фазе после завершения полимеризации. Диаметр капсулы может изменяться в зависимости от активности воды в окружающей химической среде.

Микроинкапсуляцию ферментов, которую можно использовать в настоящем изобретении, можно проводить посредством межфазной полимеризации, при которой два реагента в реакции полимеризации встречаются на поверхности раздела фаз и быстро вступают в реакцию друг с другом. Основой этого способа является реакция полиамина с производным кислоты, обычно с галогенангидридом, выступающим в роли сшивающего агента. Полиамин предпочтительно является по существу водорастворимым (когда находится в форме свободного основания). В подходящих условиях на поверхности раздела фаз быстро образуются тонкие гибкие мембраны. Одним из способов проведения полимеризации является использование водного раствора фермента и полиамина, которые эмульгируются с помощью неводного растворителя (и эмульгатора), и добавление раствора, содержащего производное кислоты. В растворе ферментов может присутствовать щелочной агент для нейтрализации кислоты, образующейся во время реакции. Мембраны полимера (полиамида) образуются сразу же на границе раздела эмульсионных капель. Полимерная мембрана микрокапсулы, как правило, имеет катионный характер и, таким образом, связывается/образует комплекс с соединениями анионного типа.

Диаметр микрокапсул определяется размером капель эмульсии, который контролируется, например, с помощью скорости перемешивания.

Эмульсия

Эмульсия представляет собой временную или постоянную дисперсию одной жидкой фазы внутри второй жидкой фазы. Вторая жидкость по существу называется диспергирующей фазой. Поверхностно-активные вещества обычно используются для облегчения образования и стабилизации эмульсий. Не все поверхностно-активные вещества обладают одинаковой способностью к стабилизации эмульсии. Тип и количество поверхностно-активного вещества необходимо выбирать так, чтобы обеспечить оптимальную эффективность эмульсии, особенно в отношении приготовления и физической стабильности эмульсии, а также стабильности при разбавлении и дополнительной обработке. Физическая стабильность относится к поддержанию эмульсии в форме дисперсии. Такие процессы, как слипание, агрегирование, адсорбция на стенках контейнера, осаждение и расслоение, являются формами физической нестабильности, и их необходимо избегать. Примеры подходящих поверхностно-активных веществ описаны в WO 97/24177, стр. 19-21; и в WO 99/01534.

Эмульсии можно дополнительно разделять на простые эмульсии, в которых диспергированная жидкая фаза представляет собой простую однородную жидкость, или более сложные эмульсии, в которых диспергированная жидкая фаза представляет собой гетерогенную комбинацию жидкой или твердой фаз, такие как двойная эмульсия или множественная эмульсия. Например, можно образовать двойную эмульсию или множественную эмульсию вода в масле, в которой сама водная фаза дополнительно содержит эмульгированную масляную фазу; эмульсию такого типа можно обозначить как эмульсию масло в воде в масле (м/в/м). В альтернативном варианте осуществления можно образовать эмульсию вода в масле, в которой водная фаза содержит диспергированную твердую фазу и которая часто называется суспензией-эмульсией. Могут быть описаны другие более сложные эмульсии. Из-за сложности описания таких систем термин «эмульсия» используется для описания как простых, так и более сложных эмульсий без обязательного ограничения формы эмульсии или типа и количества присутствующих фаз.

Полиамин

Жесткость/гибкость и проницаемость мембраны в основном зависит от выбора полиамина. Предпочтительный полиамин, используемый для инкапсуляции, как описано в настоящем документе, содержит полиразветвленный полиамин. Каждая ветвь, предпочтительно оканчивающаяся основной аминокислотой, выступает в качестве точки крепления в мембраной сети, тем самым обеспечивая благоприятные свойства изобретения. Полиразветвленный полиамин, как описано в настоящем документе, предпочтительно содержит полиамин, имеющий более двух точек ветвления и более двух реакционноспособных аминогрупп (способных взаимодействовать со сшивающим агентом, т.е. первичных и вторичных аминогрупп). Для получения предпочтительных микрокапсул полиразветвленный полиамин используют в качестве исходного материала при приготовлении эмульсии, т.е. он не образуется in situ из других исходных материалов. Для обеспечения привлекательных свойств предпочтительных микрокапсул в качестве исходного материала нужно использовать полиразветвленную структуру полиамина.

Существует тесная связь между числом точек ветвления и числом первичных аминов, поскольку первичные амины всегда будут расположены в конце ветки: линейный амин может содержать только два первичных амина. Каждая точка ветвления, которая гипотетически вводится в такой линейный диамин, позволит вводить один или более первичных аминов в конце введенной(-ых) ветви(-ей). В этом контексте подразумевается, что главная аминогруппа является частью ветви, т.е. конечной точкой ветви. Например, следует понимать, что трис(2-аминоэтил)амин и 1,2,3-пропантриамин являются молекулами с одной точкой ветвления. В предпочтительных микрокапсулах полиамин имеет по меньшей мере четыре первичных амина. Точки ветвления могут быть введены от алифатической углеводородной цепи, как в предыдущих примерах, или из ненасыщенных углеродных связей, таких как, например, 3,3'-диаминобензидин, или из третичных аминогрупп, таких как N,N,N',N'-тетракис-(2-аминоэтил)этилендиамин.

Предпочтительно полиразветвленный полиамин не является пептидом или белком. Предпочтительно реакционноспособные аминогруппы составляют по меньшей мере 15% молекулярной массы полиразветвленного полиамина, например, более 20% или более 25%. Предпочтительно молекулярная масса полиразветвленного полиамина составляет по меньшей мере 1 кДа; более предпочтительно молекулярная масса полиразветвленного полиамина составляет по меньшей мере 1,3 кДа. Предпочтительно полиразветвленный полиамин представляет собой полиэтиленимин (PEI) и его модификации, имеющий более двух точек ветвления и более двух реакционноспособных аминогрупп; причем реакционноспособные аминогруппы составляют по меньшей мере 15% молекулярной массы PEI, например, более 20% или более 25%. Предпочтительно молекулярная масса PEI составляет по меньшей мере 1 кДа. Для получения микрокапсулы можно использовать комбинации различных полиразветвленных полиаминов.

Преимущественные свойства (например, стабильность фермента при хранении, сниженное подтекание фермента, сниженное попадание внутрь капсулы ингредиентов моющего средства) микрокапсулы можно улучшить путем добавления одного или более мелких аминов с молекулярной массой менее 1 кДа. Низкомолекулярный амин предпочтительно является по существу растворимым в воде (когда находится в форме свободного основания) и может представлять собой такой материал, как этилендиамин, гексаметилендиамин, гександиамин, диэтилентетрамин, этилентетрамин, диаминбензол, пиперазин, тетраметиленпентамин или предпочтительно диэтилентриамин (DETA). Низкомолекулярные амины можно добавлять в количестве до 50%, предпочтительно до 40%, до 30%, до 20%, до 10% или до 5 мас.% от общего содержания низкомолекулярного амина и полиразветвленного полиамина при получении микрокапсулы изобретения.

Предпочтительный сшивающий агент содержит молекулу, имеющую по меньшей мере две группы/сайта, способных взаимодействовать с аминами с образованием ковалентных связей. Сшивающий агент предпочтительно является растворимым в масле и может находиться в форме ангидрида кислоты или галогенангидрида, предпочтительно хлорангидрида. Например, он может представлять собой адипоилхлорид, себакоилхлорид, хлорид додекандиоевой кислоты, фталоилхлорид, терефталоилхлорид, изофталоилхлорид или тримезоилхлорид; но предпочтительно сшивающий агент представляет собой терефталоилхлорид или тримезоилхлорид.

В специально предусмотренном варианте осуществления состав микрокапсул изобретения представляет собой состав, описанный в публикации WO 2014/177709 (включенной в настоящий документ путем ссылки), с вариантом липазы изобретения. Как также указано выше, микрокапсулы могут дополнительно включать в себя спирт, такой как полиол. В предпочтительных микрокапсулах (a) используют полиэтиленимин. В предпочтительной микрокапсуле (b) используют этиленамин или алканоламин. В предпочтительном варианте осуществления (b) выбран из группы, состоящей из этилендиамина, диэтилентриамина, триэтилентетрамина, бис(3-аминопропил)амина, моноэтаноламина, диэтаноламина, триэтаноламина, гексаметилендиамина, диаминобензола, пиперазина и тетраэтиленпентамина, более предпочтительно (b) выбран из группы, состоящей из диэтилентриамина, триэтилентетрамина, бис(3-аминопропил)амина, моноэтаноламина и диэтаноламина. Микрокапсула предпочтительно содержит источник ионов Mg2+, Ca2 + или Zn2 +, такой как слаборастворимая соль Mg2+, Ca2+ или Zn2+. В качестве сшивающего агента предпочтительно используют хлорангидрид, такой как изофталоилхлорид, терефталоилхлорид или тримезоилхлорид. В предпочтительном варианте осуществления мембрану получают путем межфазной полимеризации.

Подходящие микрокапсулы описаны в WO 2015/1144784 (включенной в настоящий документ путем ссылки) с вариантом липазы, как описано в настоящем документе.

Моющая композиция

Предпочтительными моющими композициями являются моющие композиции для стирки, предназначенные для очистки и/или обработки ткани. Предпочтительные моющие композиции находятся в жидкой форме. Настоящее изобретение, в частности, относится к водорастворимому изделию с разовой дозой, содержащему водорастворимую пленку и моющую композицию, предпочтительно жидкую моющую композицию для стирки.

Водорастворимое изделие с разовой дозой

Водорастворимая пленка и жидкая моющая композиция более подробно описаны ниже.

Водорастворимое изделие с разовой дозой содержит водорастворимую пленку, имеющую такую форму, что изделие с разовой дозой содержит по меньшей мере одно внутреннее отделение, окруженное водорастворимой пленкой. Изделие с разовой дозой может содержать первую водорастворимую пленку и вторую водорастворимую пленку, герметично соединенные друг с другом для формирования внутреннего отделения. Водорастворимое изделие с разовой дозой выполнено таким образом, чтобы моющая композиция не вытекала из отделения во время хранения. Однако при добавлении водорастворимого изделия с разовой дозой в воду водорастворимая пленка растворяется и высвобождает содержимое внутреннего отделения в моющий раствор.

Под отделением следует понимать замкнутое внутреннее пространство внутри изделия с разовой дозой, которое вмещает моющую композицию. В процессе производства первая водорастворимая пленка может иметь форму с открытым отделением, в которое добавляют моющую композицию. Затем поверх первой пленки наносят вторую водорастворимую пленку таким образом, чтобы закрыть отверстие отделения. После этого первую и вторую пленки герметично скрепляют вместе вдоль области герметизации.

Изделие с разовой дозой может содержать более одного отделения, даже по меньшей мере два отделения или даже по меньшей мере три отделения. Отделения могут быть выполнены с наложением друг на друга, т.е. одно отделение расположено поверх другого. В такой ориентации изделие с разовой дозой будет содержать три пленки: верхнюю, среднюю и нижнюю. В альтернативном варианте осуществления отделения могут быть расположены бок о бок, т.е. ориентированы рядом друг с другом. Отделения могут даже иметь ориентацию «шина и обод», т.е. первое отделение расположено рядом со вторым отделением, однако первое отделение по меньшей мере частично окружает второе отделение, но при этом не полностью закрывает второе отделение. В альтернативном варианте осуществления одно отделение может быть полностью окружено другим отделением.

Если изделие с разовой дозой содержит по меньшей мере два отделения, одно из отделений может быть меньше другого. Если изделие с разовой дозой содержит по меньшей мере три отделения, два отделения могут быть меньше третьего отделения, и предпочтительно отделения меньшего размера накладывают на отделения большего размера. Наложенные отделения предпочтительно ориентируют бок о бок.

В конфигурации с множеством отделений моющая композиция в соответствии с настоящим изобретением может содержаться в по меньшей мере одном из отделений. Она может, например, содержаться лишь в одном отделении или может содержаться в двух отделениях или даже в трех отделениях.

Все отделения могут содержать одинаковые или разные композиции. Разные композиции могут иметь одну и ту же форму или же они могут иметь разные формы.

Водорастворимое изделие с разовой дозой может содержать по меньшей мере два внутренних отделения, причем жидкая моющая композиция для стирки содержится в по меньшей мере одном из отделений, предпочтительно при этом изделие с разовой дозой содержит по меньшей мере три отделения, причем моющая композиция содержится в по меньшей мере одном из отделений.

На фиг. 1 описано водорастворимое изделие (1) с разовой дозой в соответствии с настоящим изобретением. Водорастворимое изделие (1) с разовой дозой содержит первую водорастворимую пленку (2) и вторую водорастворимую пленку (3), которые спаяны друг с другом в области (4) спайки. Жидкая моющая композиция (5) для стирки содержится внутри водорастворимого растворимого изделия (1) с разовой дозой.

Водорастворимая пленка

Пленка, используемая в настоящем изобретении, является растворимой или диспергируемой в воде. Водорастворимая пленка предпочтительно имеет толщину от 20 до 150 мкм, предпочтительно от 35 до 125 мкм, еще более предпочтительно от 50 до 110 мкм, наиболее предпочтительно около 76 мкм.

Пленка предпочтительно имеет растворимость в воде по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 75% или даже по меньшей мере 95%, измеряемую способом, изложенным в настоящем документе, после применения стеклянного фильтра с максимальным размером пор 20 мкм:

5 грамм ± 0,1 грамма материала пленки добавляют в предварительно взвешенный 3 л мерный стакан и добавляют 2 л ± 5 мл дистиллированной воды. Его энергично размешивают в магнитной мешалке, модель Labline №1250 или эквивалентная, и 5-сантиметровой магнитной мешалке, установленной на 600 об/мин, в течение 30 минут при 30°C. Затем смесь фильтруют через сложенный качественный фильтр из пористого стекла с размером пор, который определен выше (макс. 20 мкм). Высушивают воду из собранного фильтрата любым стандартным способом и определяют массу оставшегося материала (который представляет собой растворенную или дисперсную фракцию). Затем можно рассчитать процентную растворимость или диспергируемость.

Предпочтительные пленочные материалы представляют собой полимерные материалы. Пленочный материал можно получать, например, путем литья, формования с раздувом, экструзии или экструзии с раздувом полимерного материала, как известно в данной области.

Предпочтительные полимеры, сополимеры или их производные, подходящие для использования в качестве материала пакетика, выбраны из поливиниловых спиртов, поливинилпирролидона, полиалкиленоксидов, акриламида, акриловой кислоты, целлюлозы, простых эфиров целлюлозы, сложных эфиров целлюлозы, амидов целлюлозы, поливинилацетатов, поликарбоновых кислот и солей, полиаминокислот или пептидов, полиамидов, полиакриламида, сополимеров малеиновой/акриловой кислот, полисахаридов, включая крахмал и желатин, природных камедей, таких как ксантановая камедь и карраген. Более предпочтительные полимеры выбраны из полиакрилатов и водорастворимых акрилатных сополимеров, метилцеллюлозы, натрийкарбоксиметилцеллюлозы, декстрина, этилцеллюлозы, гидроксиэтилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, мальтодекстрина, полиметакрилатов, а наиболее предпочтительно выбраны из поливиниловых спиртов, сополимеров поливинилового спирта и гидроксипропилметилцеллюлозы (ГПМЦ) и их комбинаций. Уровень полимера в материале пакетика, таком как полимер ПВС, предпочтительно составляет по меньшей мере 60%. Полимер может иметь любую средневесовую молекулярную массу, предпочтительно от около 1000 до 1000000, более предпочтительно от около 10000 до 300000, еще более предпочтительно от около 20000 до 150000.

Предпочтительно водорастворимая пленка содержит полимер или сополимер поливинилового спирта, предпочтительно смесь полимеров поливинилового спирта и/или сополимеров поливинилового спирта, предпочтительно выбранных из сульфонированных и карбоксилированных анионных сополимеров поливинилового спирта, особенно карбоксилированных анионных сополимеров поливинилового спирта, наиболее предпочтительно смесь гомополимера поливинилового спирта и карбоксилированного анионного сополимера поливинилового спирта.

Предпочтительные пленки обладают хорошей растворимостью в холодной воде, а именно в ненагретой дистиллированной воде. Предпочтительно такие пленки обладают хорошей растворимостью при температурах 24°C, еще более предпочтительно при 10°C. Под хорошей растворимостью подразумевают, что пленка демонстрирует растворимость в воде по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 75% или даже по меньшей мере 95%, измеряемую способом, изложенным в настоящем документе, после применения стеклянного фильтра с максимальным размером пор 20 мкм, описанного выше.

Предпочтительными являются пленки, поставляемые компанией Monosol под торговыми наименованиями M8630, M8900, M8779, M8310.

Пленка может быть непрозрачной, прозрачной или полупрозрачной. Пленка может содержать печатную область.

Область печати может быть изготовлена с использованием стандартных методик, таких как флексографическая печать или струйная печать.

Пленка может содержать создающее отвращение средство, например создающее горький вкус средство. Подходящие создающие горький вкус средства включают в себя, без ограничений, нарингин, октаацетат сахарозы, гидрохлорид хинина, бензоат денатония или их смеси. В пленке можно использовать создающее отвращение средство в любой подходящей концентрации. Подходящие значения концентрации включают, без ограничений, от 1 до 5000 ч/млн, или даже от 100 до 2500 ч/млн, или даже от 250 до 2000 ч/млн.

Моющая композиция

Водорастворимое изделие с разовой дозой содержит моющую композицию, предпочтительно жидкую моющую композицию для стирки. Термин «жидкая моющая композиция для стирки» относится к любой моющей композиции для стирки, содержащей жидкость, способную смачивать и обрабатывать ткань, и включает, без ограничений, жидкости, гели, пасты, дисперсии и т.п. Жидкая композиция может включать твердые вещества или газы в соответствующим образом разделенной форме, но жидкая композиция исключает формы, которые в целом не относятся к жидкостям, такие как таблетки или гранулы.

Без стремления к ограничению какой-либо теорией предпочтительно, чтобы необязательно инкапсулированные варианты липазы были получены в виде жидкого моющего средства для стирки, так как это обеспечивает более быстрое высвобождение в моющий раствор. Это является особенно предпочтительным в циклах быстрого и холодного мытья, в которых минимизируется риск застревания в нерастворенной порошковой пастообразной фазе.

Жидкую моющую композицию можно использовать в операции ручной стирки ткани или можно применять в операции стирки ткани в автоматической машине.

Вспомогательный компонент моющего средства

Моющая композиция, предпочтительно жидкая моющая композиция для стирки, содержит вспомогательный компонент моющего средства, например, выбранный из поверхностно-активных веществ, полимеров, модификаторов, ингибирующих перенос красителей агентов, диспергирующих средств, ферментов, стабилизаторов фермента, каталитических материалов, отбеливателей, активаторов отбеливателя, перекиси водорода, источников перекиси водорода, предварительно образованных перкислот, полимерных диспергирующих агентов, препятствующих повторному осаждению агентов, осветлителей, подавителей пенообразования, косметических красителей, красящих пигментов, замутняющих агентов, ароматических веществ, систем доставки ароматических веществ, структурообразующих средств, гидротропов, технологических добавок, растворителей, пигментов, флокулирующих добавок, хелатирующих агентов и их смесей.

Вспомогательный компонент моющего средства предпочтительно содержит поверхностно-активное вещество, в частности, в случае очищающей композиции поверхностно-активное вещество предпочтительно содержит анионные и/или неионные поверхностно-активные вещества, предпочтительно в массовом отношении от 50:1 до 1:10 или более предпочтительно от 20:1 до 1:2.

Моющая композиция предпочтительно содержит до 50%, предпочтительно от 5% до 50%, более предпочтительно от 7,5% до 45%, еще более предпочтительно от 10% до 40% или еще более предпочтительно от 12% до 37%, наиболее предпочтительно от 15% до 30% непенящегося анионного поверхностно-активного вещества от массы моющей композиции. Предпочтительно непенящееся анионное поверхностно-активное вещество содержит линейный алкилбензолсульфонат, алкоксилированный алкилсульфат или их смесь. Более предпочтительно непенящееся анионное поверхностно-активное вещество представляет собой смесь линейного алкилбензолсульфоната и алкоксилированного алкилсульфата, более предпочтительно смесь линейного алкилбензолсульфоната и этоксилированного алкилсульфата.

Массовое отношение линейного алкилбензолсульфоната к алкоксилированному алкилсульфату, более предпочтительно линейного алкилбензолсульфоната к этоксилированному алкилсульфату, составляет от 1:2 до 20:1, предпочтительно от 1,1:1 до 15:1, более предпочтительно от 1,2:1 до 10:1, еще более предпочтительно от 1,3:1 до 5:1, наиболее предпочтительно от 1,4:1 до 3:1.

Массовое отношение линейного алкилбензолсульфоната к этоксилированному алкилсульфату составляет от 1:10 до 20:1, предпочтительно от 1:7 до 3:1, более предпочтительно от 1:5 до 1,5:1.

Предпочтительно массовое отношение общего анионного поверхностно-активного вещества (т.е. всего анионного поверхностно-активного вещества, присутствующего в жидкой композиции) к неионному поверхностно-активному веществу в жидкой композиции составляет от 5:1 до 23:1.

Предпочтительно непенящееся анионное поверхностно-активное вещество нейтрализуют амином, предпочтительно выбранным из моноэтаноламина, диэтаноламина, триэтаноламина или их смеси, более предпочтительно моноэтаноламина.

Моющая композиция предпочтительно содержит от 0% до 40%, предпочтительно от 0,01% до 30%, более предпочтительно от 0,1% до 20%, наиболее предпочтительно от 0,15% до 15% неионного поверхностно-активного вещества от массы жидкой моющей композиции для стирки. Предпочтительно неионогенное поверхностно-активное вещество выбрано из алкоксилатов спирта, полученного оксосинтезом алкоксилата спирта, алкоксилатов спирта Гербе, алкоксилатов алкилфенолового спирта или их смеси.

Моющая композиция предпочтительно содержит от 1,5% до 20%, более предпочтительно от 2% до 15%, еще более предпочтительно от 3% до 10%, наиболее предпочтительно от 4% до 8% мыла от массы жидкой моющей композиции, предпочтительно соли жирной кислоты, более предпочтительно нейтрализованной амином соли жирной кислоты, причем предпочтительно амин представляет собой алканоламин, более предпочтительно выбранный из моноэтаноламина, диэтаноламина, триэтаноламина или их смеси, более предпочтительно моноэтаноламина.

Моющая композиция предпочтительно содержит катионный полисахарид, предпочтительно выбранный из катионно-модифицированной гидроксиэтилцеллюлозы, катионно-модифицированной гидроксипропилцеллюлозы, катионно- и гидрофобно-модифицированной гидроксиэтилцеллюлозы, катионно- и гидрофобно-модифицированной гидроксипропилцеллюлозы или их смеси, более предпочтительно катионно-модифицированной гидроксиэтилцеллюлозы, катионно- и гидрофобно-модифицированной гидроксиэтилцеллюлозы или их смеси. Катионный полисахарид предпочтительно присутствует в количестве от 0,05% до 3%, предпочтительно от 0,1% до 2%, более предпочтительно от 0,2% до 1%, наиболее предпочтительно от 0,25% до 0,75% от массы жидкой моющей композиции для стирки.

Моющая композиция предпочтительно содержит алкоксилированный полиэтиленимин, предпочтительно этоксилированный полиэтиленимин. Жидкая моющая композиция для стирки предпочтительно содержит от 0,1% до 10%, предпочтительно от 0,5% до 7%, более предпочтительно от 1% до 5% этоксилированного полиэтиленимина от массы жидкой моющей композиции для стирки.

Водорастворимое изделие с разовой дозой предпочтительно содержит 20% или менее или более предпочтительно 15% или менее воды от массы изделия с разовой дозой, предпочтительно от 0,1% до 15%, более предпочтительно от 1% до 12,5% воды от массы изделия с разовой дозой.

Предпочтительно водорастворимое изделие с разовой дозой содержит от 10% до 60%, предпочтительно от 12% до 50%, наиболее предпочтительно от 15% до 40% неводного растворителя от массы жидкой моющей композиции для стирки, причем предпочтительно неводный растворитель выбран из 1,2-пропандиола, глицерина, сорбита, дипропиленгликоля, трипропиленгликоля или их смеси.

Ферменты. Композиция может содержать один или более ферментов, необязательно инкапсулированных в микрокапсулы, как описано в настоящем документе, которые улучшают очищающие характеристики и/или уход за тканью. К примерам подходящих ферментов относятся, без ограничений, гемицеллюлазы, пероксидазы, протеазы, целлюлазы, ксиланазы, липазы, фосфолипазы, эстеразы, кутиназы, пектиназы, манназы, пектатлиазы, кератиназы, редуктазы, оксидазы, фенолоксидазы, липоксигеназы, лигниназы, пуллуланазы, танназы, пентозаназы, маланазы, β-глюканазы, арабинозидазы, гиалуронидаза, хондроитиназа, лакказа, хлорфиллазы, амилазы или их смеси. Типичная комбинация представляет собой смесь ферментов, которая может содержать, например, протеазу и липазу в сочетании с амилазой. При наличии в композиции упомянутые выше дополнительные ферменты могут присутствовать в количестве от 0,00001 до 2 мас.%, от 0,0001 до 1 мас.% или от 0,001 до 0,5 мас.% белка фермента от массы композиции.

В общем случае свойства выбранного(-ых) фермента(-ов) должны быть совместимы с выбранным моющим средством (т.е. оптимальный pH, совместимость с другими ферментными и неферментными ингредиентами и т.п.), и фермент(-ы) должен (должны) присутствовать в эффективных количествах.

Вариант липазы может быть необязательно инкапсулирован в микрокапсулу. Кроме того, моющая композиция изобретения может дополнительно содержать один или более дополнительных ферментов в инкапсулированной форме. Примеры подходящих ферментов выбраны из группы, состоящей из протеазы, амилазы, дополнительной липазы, целлюлазы, манназы, пектиназы, ДНКазы, лакказы, пероксидазы, галопероксидазы, пергидролазы и их комбинаций.

Фермент(-ы) в композиции может (могут) включать в себя один или более ферментов, подходящих для включения в моющее средство для стирки или мытья посуды (ферменты моющего средства), таких как протеаза (например, субтилизин или металлопротеаза), липаза, кутиназа, амилаза, карбогидраза, целлюлаза, пектиназа, манназа, арабиназа, галактаназа, ксантаза, ксиланаза, ДНКаза, пергидролаза, оксидоредуктаза (например, лакказа, пероксидаза, пероксигеназа и/или галопероксидаза). Предпочтительные ферменты моющего средства представляют собой протеазу (например, субтилизин или металлопротеазу), липазу, амилазу, лиазу, целлюлазу, пектиназу, маннаназу, ДНКазу, пергидролазу и окислоргидазы (например, лакказу, пероксидазу, пероксигеназу и/или галопероксидазу); или их комбинации. Более предпочтительные ферменты моющего средства представляют собой протеазу (например, субтилизин или металлопротеазу), липазу, амилазу, целлюлазу, пектиназу и маннаназу; или их комбинации.

Композиция или состав микрокапсул может включать в себя более 0,1% (мас.) белка активного фермента, в частности, варианта липазы изобретения; предпочтительно более 0,25%, более предпочтительно более 0,5%, более предпочтительно более 1%, более предпочтительно более 2,5%, более предпочтительно более 5%, более предпочтительно более 7,5%, более предпочтительно более 10%, более предпочтительно более 12,5%, более предпочтительно более 15%, еще более предпочтительно более 20% и наиболее предпочтительно более 25% (мас.) белка активного фермента.

В одном аспекте предпочтительные ферменты будут включать в себя целлюлазу. Подходящие целлюлазы включают в себя ферменты бактериального или грибного происхождения. Они также включают в себя химически модифицированные или сконструированные белковые мутанты. Подходящие целлюлазы включают целлюлазы родов Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, e.g., например грибные целлюлазы, полученные из Humicola insolens, Myceliophthora thermophila и Fusarium oxysporum, описанные в US4435307, US5648263, US5691178, US5776757 и WO89/09259.

Особенно подходящими целлюлазами являются щелочные или нейтральные целлюлазы, имеющие преимущества, относящиеся к уходу за цветными тканями. Примерами таких целлюлаз являются целлюлазы, описанные в EP0495257, EP0531372, WO96/11262, WO96/29397, WO98/08940. Другие примеры представляют собой варианты целлюлазы, например описанные в WO94/07998, EP0531315, US5457046, US5686593, US5763254, WO95/24471, WO98/12307 и PCT/DK98/00299

Коммерчески доступные целлюлазы включают в себя Celluzyme™ и Carezyme™ (Novozymes A/S), Clazinase™ и Puradax HA™ (Genencor International Inc.) и KAC-500(B)™ (Kao Corporation).

В одном аспекте предпочтительные ферменты будут включать протеазу. Подходящие протеазы включают протеазы бактериального, грибного, растительного, вирусного или животного происхождения, например растительного или микробного происхождения. Предпочтительным является микробное происхождение. Они также включают в себя химически модифицированные или сконструированные белковые мутанты. Она может представлять собой щелочную протеазу, такую как сериновая протеаза или металлопротеаза. Сериновая протеаза может, например, принадлежать к семейству S1, например трипсин, или к семейству S8, например субтилизин. Металлопротеаза может представлять собой, например, термолизин, например, семейства M4, или иную металлопротеазу, например, из семейств M5, M7 или M8.

Термин «субтилазы» относится к подгруппе сериновой протеазы в соответствии с данными публикаций Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737, а также Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523. Сериновые протеазы представляют собой подгруппу протеаз, характеризующуюся наличием серина в активном центре, который образует ковалентный аддукт с субстратом. Субтилазы можно разделить на 6 подгрупп, т.е. семейство субтилизина, семейство термитазы, семейство протеиназы K, семейство лантибиотической пептидазы, семейство кексина и семейство пиролизина.

Примеры субтилаз представляют собой описанные бактерии рода Bacillus, например Bacillus lentus, B. alkalophilus, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, Bacillus pumilus и Bacillus gibsonii, описанные в US7262042 и WO09/021867, и subtilisin lentus, subtilisin Novo, subtilisin Carlsberg, Bacillus licheniformis, subtilisin BPN', subtilisin 309, subtilisin 147 и subtilisin 168, описанные в WO89/06279, и протеаза PD138, описанная в (WO93/18140). Другие подходящие протеазы могут представлять собой протеазы, описанные в WO92/175177, WO01/016285, WO02/026024 и WO02/016547. Примеры трипсиноподобных протеаз представляют собой трипсин (например, свиного или коровьего происхождения) и протеазу Fusarium, описанную в WO89/06270, WO94/25583 и WO05/040372, и химотрипсиновые протеазы, полученные из Cellumonas, описанные в WO05/052161 и WO05/052146.

Дополнительая предпочтительная протеаза представляет собой щелочную протеазу из Bacillus lentus DSM 5483, как описано, например, в WO95/23221, и ее варианты, описанные в WO92/21760, WO95/23221, EP1921147 и EP1921148.

Примеры металлопротеаз представляют собой нейтральную металлопротеазу, описанную в WO07/044993 (Genencor Int.), например, полученную из Bacillus amyloliquefaciens.

Примерами подходящих протеаз являются варианты, описанные в: WO92/19729, WO96/034946, WO98/20115, WO98/20116, WO99/011768, WO01/44452, WO03/006602, WO04/03186, WO04/041979, WO07/006305, WO11/036263, WO11/036264, особенно варианты с заменами в одном или более из следующих положений: 3, 4, 9, 15, 27, 36, 57, 68, 76, 87, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 118, 120, 123, 128, 129, 130, 160, 167, 170, 194, 195, 199, 205, 206, 217, 218, 222, 224, 232, 235, 236, 245, 248, 252 и 274, используя нумерацию BPN'. Более предпочтительно варианты субтилазы могут содержать мутации: S3T, V4I, S9R, A15T, K27R, *36D, V68A, N76D, N87S,R, *97E, A98S, S99G,D,A, S99AD, S101G,M,R S103A, V104I,Y,N, S106A, G118V,R, H120D,N, N123S, S128L, P129Q, S130A, G160D, Y167A, R170S, A194P, G195E, V199M, V205I, L217D, N218D, M222S, A232V, K235L, Q236H, Q245R, N252K, T274A (используя нумерацию BPN').

Подходящие присутствующие на рынке протеазные ферменты включают в себя протеазы, продаваемые под торговыми наименованиями Alcalase®, Blaze®; Duralase™, Durazym™, Relase®, Relase® Ultra, Savinase®, Savinase® Ultra, Primase®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liquanase® Ultra, Ovozyme®, Coronase®, Coronase® Ultra,Neutrase®, Everlase® и Esperase®, все из которых могут продаваться как Ultra® или Evity® (Novozymes A/S), протеазы, продаваемые под торговыми наименованиями Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Purafect®, Purafect Prime®, Preferenz™, Purafect MA®, Purafect Ox®, Purafect OxP®, Puramax®, Properase®, Effectenz™, FN2®, FN3®, FN4®, Excellase®, Opticlean® и Optimase® (Danisco/DuPont), Axapem™ (Gist-Brocases N.V.), BLAP® (последовательность показана на фиг. 29 в US5352604), а также их варианты (Henkel AG) и KAP (субтилизин Bacillus alkalophilus) компании Kao.

В одном аспекте предпочтительные ферменты будут включать амилазу. Подходящие амилазы могут представлять собой альфа-амилазу или глюкоамилазу и могут иметь бактериальное или грибное происхождение. Они также включают в себя химически модифицированные или сконструированные белковые мутанты. Амилазы включают, например, альфа-амилазы, полученные из Bacillus, например из специального штамма Bacillus licheniformis, более подробно описанного в GB1296839.

Подходящие амилазы включают амилазы с SEQ ID NO: 3, WO95/10603, или варианты, последовательность которых на 90% идентична SEQ ID NO: 3. Предпочтительные варианты описаны в WO94/02597, WO94/18314, WO97/43424 и SEQ ID NO: 4 в WO99/019467, например, варианты с заменами в одном или более из следующих положений: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 178, 179, 181, 188, 190, 197, 201, 202, 207, 208, 209, 211, 243, 264, 304, 305, 391, 408 и 444.

Различные подходящие амилазы включают амилазы с SEQ ID NO: 6 в WO02/010355 или варианты, последовательность которых на 90% идентична SEQ ID NO: 6. Предпочтительными вариантами SEQ ID NO: 6 являются варианты, имеющие делеции в положениях 181 и 182 и замену в положении 193.

Другие подходящие амилазы представляют собой гибридную альфа-амилазу, содержащую остатки 1-33 альфа-амилазы, полученной из B. amyloliquefaciens, показанной в SEQ ID NO: 6 WO2006/066594, и остатки 36-483 альфа-амилазы B. licheniformis, показанные в SEQ ID NO: 4 WO2006/066594, или варианты, последовательность которых идентична на 90%. Предпочтительными вариантами такой гибридной альфа-амилазы являются те, которые имеют замену, делецию или вставку в одном или более из следующих положений: G48, T49, G107, H156, A181, N190, M197, I201, A209 и Q264. Наиболее предпочтительные варианты гибридной альфа-амилазы, содержащие остатки 1-33 альфа-амилазы, полученной из B. amyloliquefaciens, как показано в SEQ ID NO: 6 WO2006/066594, и остатки 36-483 последовательности SEQ ID NO: 4, представляют собой варианты, имеющие замены:

M197T;

H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S или

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S.

Другие подходящие амилазы представляют собой амилазы, имеющие SEQ ID NO: 6 в WO99/019467, или варианты, последовательность которых на 90% идентична SEQ ID NO: 6. Предпочтительными вариантами SEQ ID NO: 6 являются те, которые имеют замену, делецию или вставку в одном или более из следующих положений: R181, G182, H183, G184, N195, I206, E212, E216 и K269. Особенно предпочтительными амилазами являются те, которые имеют делецию в положениях R181 и G182 или положениях H183 и G184.

Можно использовать дополнительные амилазы, которые имеют SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7 WO96/023873, или варианты, последовательность которых на 90% идентична SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 7. Предпочтительными вариантами SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 7 являются те, которые имеют замену, делецию или вставку в одном или более из следующих положений: 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 212, 243, 260, 269, 304 и 476. Более предпочтительными вариантами являются варианты, имеющие делецию в положениях 181 и 182 или положениях 183 и 184. Наиболее предпочтительными вариантами SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7 являются варианты, имеющие делецию в положениях 183 и 184 и замену в одном или более из положений 140, 195, 206, 243, 260, 304 и 476.

Можно использовать другие амилазы, которые имеют SEQ ID NO: 2, WO08/153815, SEQ ID NO: 10, WO01/66712, или варианты, последовательность которых на 90% идентична SEQ ID NO: 2 в WO08/153815, или последовательность которых на 90% идентична таковой SEQ ID NO: 10 в WO01/66712. Предпочтительными вариантами SEQ ID NO: 10 в WO01/66712 являются те, которые имеют замену, делецию или вставку в одном или более из следующих положений: 176, 177, 178, 179, 190, 201, 207, 211 и 264.

Другие подходящие амилазы представляют собой амилазы, имеющие SEQ ID NO: 2 в WO09/061380, или варианты, последовательность которых на 90% идентична SEQ ID NO: 2. Предпочтительными вариантами SEQ ID NO: 2 являются те, которые имеют усечение на С-конце и/или замену, делецию или вставку в одном или более из следующих положений: Q87, Q98, S125, N128, T131, T165, K178, R180, S181, T182, G183, M201, F202, N225, S243, N272, N282, Y305, R309, D319, Q320, Q359, K444 и G475. Более предпочтительными вариантами SEQ ID NO: 2 являются те, которые имеют замену в одном или более из следующих положений: Q87E,R, Q98R, S125A, N128C, T131I, T165I, K178L, T182G, M201L, F202Y, N225E,R, N272E,R, S243Q,A,E,D, Y305R, R309A, Q320R, Q359E, K444E и G475K, и/или делецию в положении R180 и/или S181 или T182 и/или G183. Наиболее предпочтительными вариантами SEQ ID NO: 2, являются варианты, имеющие замены:

N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K;

N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K;

S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K или

S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K, причем варианты являются усеченными на C-конце и необязательно дополнительно содержат замену в положении 243 и/или делецию в положении 180 и/или положении 181.

Другие подходящие амилазы представляют собой альфа-амилазу с SEQ ID NO: 12 в WO01/66712, или вариант, последовательность которого по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 12. Предпочтительными вариантами амилазы являются те, которые имеют замену, делецию или вставку в одном или более из следующих положений SEQ ID NO: 12 в WO01/66712: R28, R118, N174; R181, G182, D183, G184, G186, W189, N195, M202, Y298, N299, K302, S303, N306, R310, N314; R320, H324, E345, Y396, R400, W439, R444, N445, K446, Q449, R458, N471, N484. К конкретным предпочтительным амилазам относятся варианты, имеющие делецию D183 и G184 и имеющие замены R118K, N195F, R320K и R458K, и вариант, дополнительно имеющий замены в одном или более положениях, выбранных из группы: M9, G149, G182, G186, M202, T257, Y295, N299, M323, E345 и A339. Наиболее предпочтительным является вариант, который дополнительно имеет замены во всех этих положениях.

Другими примерами являются варианты амилазы, такие как описанные в WO2011/098531, WO2013/001078 и WO2013/001087.

На рынке присутствуют амилазы Duramyl™, Termamyl™, Termamyl Ultra™, Fungamyl™, Ban™, Stainzyme™, Stainzyme Plus™, Amplify®, Supramyl™, Natalase™, Liquozyme X и BAN™ (компании Novozymes A/S), KEMZYM® AT 9000 Biozym Biotech Trading GmbH Wehlistrasse 27b A-1200 Wien, Австрия, и Rapidase™, Purastar™/Effectenz™, Powerase, Preferenz S100, Preferenx S110, ENZYSIZE®, OPTISIZE HT PLUS® и PURASTAR OXAM® (Danisco/DuPont) и KAM® (Kao).

Подходящие дополнительные липазы и кутиназы включают в себя ферменты бактериального или грибного происхождения. Они также включают в себя химически модифицированные или сконструированные белковые мутантные ферменты. Примеры включают липазу из Thermomyces, например из T. lanuginosus (предыдущее наименование Humicola lanuginosa), как описано в EP258068 и EP305216, кутиназу из Humicola, например H. insolens (WO96/13580), липазу из штаммов Pseudomonas (некоторые из них впоследствии переименованы в Burkholderia), например P. alcaligenes или P. pseudoalcaligenes (EP218272), P. cepacia (EP331376), P. sp. штамма SD705 (WO95/06720 и WO96/27002), P. wisconsinensis (WO96/12012), липазы GDSL-типа Streptomyces (WO10/065455), кутиназу из Magnaporthe grisea (WO10/107560), кутиназу из Pseudomonas mendocina (US5,389,536), липазу из Thermobifida fusca (WO11/084412, WO13/033318), липазу Geobacillus stearothermophilus (WO11/084417), липазу из Bacillus subtilis (WO11/084599) и липазу из Streptomyces griseus (WO11/150157) и S. pristinaespiralis (WO12/137147).

Другие примеры представляют собой варианты липазы, такие как описанные в EP407225, WO92/05249, WO94/01541, WO94/25578, WO95/14783, WO95/30744, WO95/35381, WO95/22615, WO96/00292, WO97/04079, WO97/07202, WO00/34450, WO00/60063, WO01/92502, WO07/87508 и WO09/109500.

Предпочтительные коммерческие препараты липазы включают Lipolase™, Lipex™; Lipolex™; Lipolase Ultra™; Lipex Evity 100L; Lecitase™; Lipoprime™ и Lipoclean™ (Novozymes A/S), Lumafast (изначально от компании Genencor) и Lipomax (изначально от компании Gist-Brocades) и Bacillus sp., Solvay.

Другие примеры представляют собой липазы, иногда называемые ацилтрансферазами или пергидролазами, например, ацилтрансферазы, гомологичные липазе А Candida antarctica (WO10/111143), ацилтрансферазу из Mycobacterium smegmatis (WO05/56782), пергидролазы из семейства CE 7 (WO09/67279) и варианты пергидролазы M. smegmatis, в частности вариант S54V, используемый в коммерческом препарате Gentle Power Bleach от компании Huntsman Textile Effects Pte Ltd (WO10/100028).

В одном аспекте другие предпочтительные ферменты включают эндоглюканазы микробного происхождения, демонстрирующие эндо-бета-1,4-глюканазную активность (EC3.2.1.4), включая бактериальный полипептид, эндогенный члену рода Bacillus, последовательность которого по меньшей мере на 90%, 94%, 97% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 в US7141403, и их смеси. Подходящие эндоглюканазы присутствуют на рынке под торговыми наименованиями Celluclean® и Whitezyme® (Novozymes).

Другие предпочтительные ферменты включают пектатлиазы, доступные в продаже под торговыми наименованиями Pectawash®, Pectaway®, Xpect®, и манназы, доступные в продаже под торговыми наименованиями Mannaway® (Novozymes) и Purabrite® (Danisco/DuPont).

Фермент(-ы) моющего средства можно включать в моющую композицию путем добавления отдельных добавок, содержащих один или более ферментов, или путем добавления комбинированной добавки, содержащей все эти ферменты. Добавка моющего средства изобретения, т.е. отдельная добавка или комбинированная добавка, может находиться в виде сформированной смеси, например в виде гранулята, жидкости, суспензии и т.п. Предпочтительные составы добавки моющего средства представляют собой грануляты, в частности непылящие грануляты, жидкости, в частности стабилизированные жидкости, или суспензии.

Непылящие грануляты могут быть получены, например, как описано в патентах US4106991 и US4661452, и их можно необязательно покрыть оболочкой известными в данной области способами. Примеры восковых материалов покрытия представляют собой поли(этиленоксид)ные продукты (полиэтиленгликоль, ПЭГ) со средними молярными массами от 1000 до 20000; этоксилированные нонилфенолы, имеющие от 16 до 50 этиленоксидных единиц; этоксилированные жирные спирты, в которых спирт содержит от 12 до 20 атомов углерода и в которых присутствуют от 15 до 80 этиленоксидных единиц; жирные спирты; жирные кислоты; и моно-, ди- и триглицериды жирных кислот. Примеры пленкообразующих покровных материалов, подходящих для нанесения с использованием методик кипения в псевдоожиженном слое, приведены в патенте GB1483591. Жидкие ферментные препараты можно, например, стабилизировать путем добавления полиола, такого как пропиленгликоль, сахар или сахароспирт, молочная кислота или борная кислота, в соответствии с установленными способами. Защищенные ферменты могут быть получены в соответствии со способом, описанным в EP238216.

В целом свойства выбранного(-ых) фермента(-ов) должны быть совместимы с выбранным моющим средством (т.е. необходимы оптимальный pH, совместимость с другими ферментными и неферментными ингредиентами и т.п.), и фермент(-ы) должен (должны) присутствовать в эффективных количествах.

Полимеры

Предпочтительно вспомогательный компонент моющего средства представляет собой полимер или смесь полимеров. Моющая композиция может содержать 0-10 мас.%, например 0,5-5%, 2-5%, 0,5-2% или 0,2-1% полимера. Можно использовать любой известный в данной области полимер, подходящий для применения в моющих средствах. Полимер может функционировать в качестве дополнительного модификатора, как упомянуто выше, или может препятствовать повторному осаждению, обеспечивать защиту волокон, высвобождение грязи, ингибирование переноса красителя, очистку жира и/или противовспенивающие свойства. Некоторые полимеры могут иметь более одного из вышеупомянутых свойств и/или более одного из приведенных ниже мотивов. Примеры полимеров включают (карбоксиметил)целлюлозу (КМЦ), поли(виниловый спирт) (ПВС), поли(винилпирролидон) (ПВП), поли(этиленгликоль) или поли(этиленоксид) (ПЭГ), этоксилированный поли(этиленимин), карбоксиметилинулин (CMI) и поликарбоксилаты, такие как PAA, PAA/PMA, полиаспарагиновая кислота, и сополимеры лаурилметакрилата/акриловой кислоты, гидрофобно модифицированная КМЦ (ГМ-КМЦ) и силиконы, сополимеры терефталевой кислоты и олигомерных гликолей, сополимеры поли/этилентерефталата) и поли(оксиэтентерефталата) (PET-POET), ПВП, поли(винилимидазол) (PVI), поли(винилпиридин-N-оксид) (PVPO или PVPNO) и поливинилпирролидонвинилимидазол (PVPVI). Дополнительные примеры полимеров включают сульфонированные поликарбоксилаты, полиэтиленоксид и полипропиленоксид (PEO-PPO) и этоксисульфат дикватерния.

Примеры модификаторов включают цитрат, хелатирующие вещества, такие как аминокарбоксилаты, аминополикарбоксилаты и фосфонаты, и алкил- или алкенилянтарную кислоту. Дополнительные конкретные примеры включают 2,2',2''-нитрилотриуксусную кислоту (NTA), этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA), диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA), иминодиянтарную кислоту (IDS), этилендиамин-N,N'-диянтарную кислоту (EDDS), метилглицин-N,N-диуксусную кислоту (MGDA), глутамат-N,N-диуксусную кислоту (GLDA), 1-гидроксиэтан-1,1-дифосфоновую кислоту, N-(2-гидроксиэтил)иминодиуксусную кислоту (EDG), аспартат-N-моноуксусную кислоту (ASMA), аспартат-N,N-диуксусную кислоту (ASDA), аспартат-N-монопропионовую кислоту (ASMP), иминодиянтарную кислоту (IDA), N-(сульфометил)аспарагиновую кислоту (SMAS), N-(2-сульфоэтил)аспарагиновую кислоту (SEAS), N-(сульфометилглутаминовую кислоту (SMGL), N-(2-сульфоэтил)-глутаминовую кислоту (SEGL), N-метилимидодиуксусную кислоту (MIDA), серин-N,N-диуксусную кислоту (SEDA), изосерин-N,N-диуксусную кислоту (ISDA), фенилаланин-N,N-диуксусную кислоту (PHDA), антранилат-N,N-диуксусную кислоту (ANDA), сульфанилат-N,N-диуксусную кислоту (SLDA), таурин-N,N-диуксусную кислоту (TUDA) и N'-(2-гидроксиэтил)этилендиамин-N,N,N'-триуксусную кислоту (HEDTA), диэтанолглицин (DEG) и их комбинации и соли. Фосфонаты, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают 1-гидроксиэтан-1,1-дифосфоновую кислоту (HEDP), этилендиаминтетракис(метиленфосфоновую кислоту) (EDTMPA), диэтилентриаминпентакис(метиленфосфоновую кислоту) (DTMPA, или DTPMPA, или DTPMP), нитрилотрис(метиленфосфоновую кислоту) (ATMP или NTMP), 2-фосфонобутан-1,2,4-трикарбоновую кислоту (PBTC), гексаметилендиаминтетракис(метиленфосфоновую кислоту) (HDTMP).

Композиция может также содержать 0-50 мас.%, например от около 5% до около 30%, дополнительного модификатора моющего средства. Не имеющие ограничительного характера примеры дополнительных модификаторов включают гомополимеры полиакрилатов или их сополимеры, такие как поли(акриловая кислота) (PAA) или сополимер (акриловая кислота/малеиновая кислота) (PAA/PMA) или полиаспарагиновая кислота.

Окрашивающие средства для ткани

Моющая композиция настоящего изобретения может также включать окрашивающие ткань средства, такие как красители или пигменты, которые при включении в состав моющих композиций могут осаждаться на ткани при контакте указанной ткани с моющим раствором, содержащим указанные моющие композиции, и, таким образом, изменять оттенок указанной ткани за счет поглощения/отражения видимого света. Флуоресцентные отбеливающие агенты испускают по меньшей мере в некоторой степени видимое излучение. Напротив, окрашивающие ткань средства изменяют оттенок поверхности, поскольку они поглощают по меньшей мере часть спектра видимого излучения. Подходящие окрашивающие ткань средства включают в себя красители, конъюгаты красителя с глиной, а также они могут включать пигменты. К подходящим красителям относятся низкомолекулярные красители и полимерные красители. К подходящим низкомолекулярным красителям относятся низкомолекулярные красители, выбранные из группы, состоящей из красителей, которые согласно классификации по цветовому индексу (C.I.) входят в состав таких групп, как прямой синий, прямой красный, прямой фиолетовый, кислотный синий, кислотный красный, кислотный фиолетовый, основной синий, основной фиолетовый и основной красный или их смеси, например, как описано в WO 2005/03274, WO 2005/03275, WO 2005/03276 и EP 1876226 (включенных в настоящий документ путем ссылки). Моющая композиция предпочтительно содержит от около 0,00003 мас.% до около 0,2 мас.%, от около 0,00008 мас.% до около 0,05 мас.% или даже от около 0,0001 мас.% до около 0,04 мас.% окрашивающего ткань средства. Композиция может содержать от 0,0001 до 0,2 мас.% окрашивающего ткань средства, и это может быть особенно предпочтительным вариантом, если композиция представлена в форме мешочка с разовой дозой. Подходящие окрашивающие средства также описаны, например, в WO 2007/087257 и WO 2007/087243.

Диспергирующие агенты

Моющие композиции настоящего изобретения также могут содержать диспергаторы. В частности, порошковые моющие средства могут содержать диспергаторы. Подходящие водорастворимые органические материалы включают гомо- или сополимерные кислоты или их соли, причем поликарбоновая кислота содержит по меньшей мере два карбоксильных радикала, отделенных друг от друга не более чем двумя атомами углерода. Подходящие диспергаторы описаны, например, в Powdered Detergents, Surfactant science series volume 71, Marcel Dekker, Inc.

Ингибиторы переноса красителей

Моющие композиции настоящего изобретения могут также включать в себя один или более ингибиторов переноса красителей. Подходящие полимерные ингибиторы переноса красителей включают в себя, без ограничений, полимеры поливинилпирролидона, полимеры полиамин-N-оксида, сополимеры N-винилпирролидона и N-винилимидазола, поливинилоксазолидоны и поливинилимидазолы или их смеси. При использовании в заявленной композиции ингибиторы переноса красителей могут присутствовать в концентрациях от около 0,0001 до около 10%, от около 0,01 до около 5% или даже от около 0,1 до около 3 мас.% композиции.

Флуоресцентный отбеливающий агент

Моющая композиция может предпочтительно также содержать дополнительные компоненты, которые могут изменять цвет очищаемых изделий, такие как флуоресцентный отбеливающий агент или оптические осветлители. Осветлитель, при его наличии, предпочтительно содержится в концентрации от около 0,01% до около 0,5%. В композиции настоящего изобретения можно использовать любой флуоресцентный отбеливающий агент, подходящий для применения в моющей композиции для стирки. Чаще всего используемые флуоресцентные отбеливающие агенты представляют собой вещества, принадлежащие к классам производных диаминостильбен-сульфоновой кислоты, производных диарилпиразолина и производных бисфенил-дистирила. Примеры флуоресцентных отбеливающих агентов на основе производных диаминостильбен-сульфоновой кислоты включают натриевые соли: 4,4'-бис-(2-диэтаноламино-4-анилино-s-триазин-6-иламино)стильбен-2,2'-дисульфоната, 4,4'-бис-(2,4-дианилино-s-триазин-6-иламино)стильбен-2.2'-дисульфоната, 4,4'-бис-(2-анилино-4-(N-метил-N-2-гидроксиэтиламино)-s-триазин-6-иламино)стильбен-2,2'-дисульфоната, 4,4'-бис-(4-фенил-1,2,3-триазол-2-ил)стильбен-2,2'-дисульфоната и 5-(2H-нафто[1,2-d][1,2,3]триазол-2-ил)-2-[(E)-2-фенилвинил]бензолсульфоната натрия. Предпочтительные флуоресцентные отбеливающие агенты представляют собой Tinopal DMS и Tinopal CBS, поставляемые компанией Ciba-Geigy AG, г. Базель, Швейцария. Tinopal DMS представляет собой динатриевую соль 4,4'-бис-(2-морфолино-4-анилино-s-триазин-6-иламино)стильбен-2,2'-дисульфоната. Tinopal CBS представляет собой динатриевую соль 2,2'-бис-(фенилстирил)-дисульфоната. Предпочтительным флуоресцентным отбеливающим агентом также является присутствующий на рынке Parawhite KX, поставляемый компанией Paramount Minerals and Chemicals, г. Мумбаи, Индия. Tinopal CBS-X представляет собой 4.4'-бис-(сульфостирил)-бифенил динатриевую соль, также известную как динатрия дистирилбифенилдисульфонат. Другие флуоресцентные средства, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают в себя 1-3-диарилпиразолины и 7-алкиламинокумарины.

Подходящими концентрациями флуоресцентного осветлителя являются более низкие концентрации от около 0,01, от 0,05, от около 0,1 или даже от около 0,2 мас.% до более высоких концентраций 0,5 или даже 0,75 мас.%.

Высвобождающие грязь полимеры

Моющие композиции также могут включать в себя один или более высвобождающих грязь полимеров, которые способствуют удалению загрязнений из тканей, таких как ткани на основе хлопка и полиэфира, в частности удалению гидрофобных загрязнений из тканей на основе полиэфира. Высвобождающие грязь полимеры могут представлять собой, например, неионные или анионные терефталатные полимеры, поливинилкапролактам и родственные сополимеры, виниловые привитые сополимеры, полиэфирполиамиды, см., например, главу 7 в Powdered Detergents, Surfactant science series volume 71, Marcel Dekker, Inc.

Предпочтительно вспомогательный компонент моющего средства содержит полиэфиртерефталат. Предпочтительно полиэфиртерефталат содержит каркас, привитый с помощью одной или более анионных групп, более предпочтительно содержащий анионный полиэфир пропилентерефталата.

Подходящими анионными полиэфирами являются полиэфиры, полученные из терефталевой кислоты, 5-сульфоизофталевой кислоты или соли 5-сульфоизофталевой кислоты, из этиленгликоля или полиэтиленгликоля, пропиленгликоля или полипропиленгликоля и полиалкиленгликоля моноалкилэфира и необязательно из других дополнительных мономеров.

Другой тип высвобождающих грязь полимеров представляет собой амфифильные алкоксилированные удаляющие жир полимеры, содержащие сердцевинную структуру и множество алкоксилатных групп, прикрепленных к этой сердцевинной структуре. Сердцевинная структура может содержать полиалкилениминовую структуру или полиалканоламиновую структуру, как подробно описано в WO 2009/087523 (включенной в настоящий документ путем ссылки). Кроме того, статистические привитые сополимеры являются подходящими высвобождающими грязь полимерами. Подходящие привитые сополимеры более подробно описаны в WO 2007/138054, WO 2006/108856 и WO 2006/113314 (включены в настоящий документ путем ссылки).

Предпочтительно вспомогательный компонент моющего средства содержит амфифильный привитый полимер, предпочтительно на основе полиалкиленоксидов и сложных виниловых эфиров, предпочтительно на основе водорастворимых полиалкиленоксидов в качестве основы для прививки и боковых цепей с образованием путем полимеризации винилэфирного компонента, причем указанный полимер имеет в среднем < 1 участка прививки на 50 алкиленоксидных групп, при этом более предпочтительно молярное отношение привитых алкиленоксидных групп к непривитым составляет от 0,002 до 0,05, предпочтительно от 0,002 до 0,035, более предпочтительно от 0,003 до 0,025, наиболее предпочтительно от 0,004 до 0,02. Предпочтительные привитые полимеры имеют среднюю молекулярную массу Mw от 3000 до 100000. Предпочтительные полимеры содержат от 20 до 70%, предпочтительно от 25 до 60 мас.% полимера полиалкиленоксида, предпочтительно водорастворимого полиалкиленоксида в качестве основы для прививки. Предпочтительно полиалкиленоксидная основа для прививки представляет собой полиэтиленгликоль.

Полимер предпочтительно содержит от 30 до 80 мас.% винилэфирного компонента, причем предпочтительно винилэфирный компонент содержит винилацетат, винилпропионат или их смесь и необязательно C1-C8-алкилакрилат, более предпочтительно от 70% до 100 мас.% винилацетата и от 0 до 30 мас.% C1-C8-алкилакрилата.

Другие высвобождающие грязь полимеры представляют собой замещенные полисахаридные структуры, особенно замещенные целлюлозные структуры, такие как модифицированные производные целлюлозы, такие как описанные в EP 1867808 или WO 2003/040279 (включены в настоящий документ путем ссылки). Подходящие целлюлозные полимеры включают в себя целлюлозу, простые эфиры целлюлозы, сложные эфиры целлюлозы, амиды целлюлозы и их смеси. Подходящие целлюлозные полимеры включают в себя анионно модифицированную целлюлозу, неионно модифицированную целлюлозу, катионно модифицированную целлюлозу, цвиттерионно модифицированную целлюлозу и их смеси. Подходящие целлюлозные полимеры включают метилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, этилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, сложный эфир карбоксиметилцеллюлозы и их смеси. Предпочтительно вспомогательный компонент моющего средства содержит карбоксиметилцеллюлозу или ее производное, предпочтительно выбранное из карбоксиметилцеллюлозы, гидрофобно модифицированных карбоксиметилцеллюлоз или их смеси, причем особенно предпочтительной является гидрофобно модифицированная карбоксиметилцеллюлоза.

Агенты, препятствующие повторному осаждению

Моющие композиции настоящего изобретения могут также включать в себя один или более препятствующих повторному осаждению агентов, таких как карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ), поливиниловый спирт (ПВС), поливинилпирролидон (ПВП), полиоксиэтилен и/или полиэтиленгликоль (ПЭГ), гомополимеры акриловой кислоты, сополимеры акриловой кислоты и малеиновой кислоты и этоксилированные полиэтиленимины. Полимеры на основе целлюлозы, описанные выше при описании высвобождающих грязь полимеров, также могут функционировать в качестве препятствующих повторному осаждению агентов.

Модификаторы реологии

Моющие композиции настоящего изобретения могут также включать в себя один или более модификаторов реологии, структурообразующих средств или загустителей, отличающихся от уменьшающих вязкость агентов. Модификаторы реологии выбраны из группы, состоящей из неполимерных кристаллических, гидроксифункциональных материалов, полимерных модификаторов реологии, которые придают водной жидкой матрице жидкой моющей композиции свойства разжижения при сдвиге. Реологические свойства и вязкость моющего средства можно модифицировать и скорректировать с помощью способов, известных в данной области, например, как показано в EP 2169040.

Другие подходящие вспомогательные компоненты включают, без ограничений, средства против усадки, препятствующие сминанию средства, бактерициды, связующие вещества, носители, красители, стабилизаторы ферментов, размягчители ткани, наполнители, регуляторы пенообразования, гидротропы, ароматические вещества, пигменты, подавители пенообразования, растворители и структурообразующие средства для жидких моющих средств и/или средства, обеспечивающие эластичность структуры.

Способ изготовления

Специалистам в данной области будет очевиден способ получения водорастворимого изделия с разовой дозой и жидкой моющей композиции настоящего изобретения для стирки с использованием общеизвестных методов изготовления.

Способ мытья

Дополнительный аспект настоящего изобретения представляет собой способ стирки тканей, включающий следующие этапы:

a. объединение водорастворимого изделия с разовой дозой в соответствии с настоящим изобретением с достаточным количеством воды для растворения водорастворимой пленки и разбавления моющей композиции для стирки, предпочтительно в пределах от 300 до 3000 раз, предпочтительно от 300 до 800 раз, с образованием моющего раствора;

b. объединение моющего раствора с по меньшей мере одной тканью, подлежащей мытью.

Стабилизаторы ферментов и/или модификаторы реологии

Композиции настоящего изобретения предпочтительно содержат стабилизаторы ферментов, например полиолы, полимеры, обратимые ингибиторы ферментов, двухвалентные катионы, субстраты ферментов, антиоксиданты и т.д. Предпочтительными являются водорастворимые стабилизаторы.

Для создания внутри капсулы локальной среды, которая является более «дружественной» по отношению к инкапсулированному ферменту/соединению, можно добавлять медленно растворяющиеся стабилизаторы, тем самым повышая стабильность во время хранения.

Примерами обратимых ингибиторов протеазы являются бороновые кислоты, пептидные альдегиды и их производные, а также высокомолекулярные белковые ингибиторы (такие как ингибиторы BASI/RASI, см. WO 2009/095425). Пример ингибиторов металлопротеазы описан в WO 2008/134343. Ингибиторы протеазы более подробно описаны ниже под заголовком «Ингибиторы протеазы».

Стабилизирующие полимеры могут быть основаны, например, на поливинилпирролидоне, поливинилацетате, поливиниловом спирте и их сополимерах. Стабилизирующие полиолы могут представлять собой меньшие молекулы, такие как глицерин, сорбит, пропиленгликоль и т.п., но также более крупные молекулы, такие как полиэтиленгликоль, полисахариды и т.п.

Стабилизирующие двухвалентные катионы Ca2+, Mg2+ и Zn2+ хорошо известны в данной области. Таким образом, в одном варианте осуществления композиция изобретения содержит источник ионов Ca2+, Mg2+ или Zn2+. Предпочтительно источник ионов Ca2+, Mg2+ или Zn2+ представляет собой слаборастворимую (медленно растворяющуюся) соль Ca2+, Mg2+ или Zn2+. Слаборастворимый означает, что растворимость в чистой воде при 20°C составляет менее 5 г/л, 2 г/л, 1 г/л, 0,5 г/л, 0,2 г/л, 0,1 г/л или 0,05 г/л. Предпочтительные соли Ca2+, Mg2+ или Zn2+ представляют собой карбонат кальция, карбонат магния, карбонат цинка, сульфат кальция, сульфит кальция, сульфит магния, сульфит цинка, фосфат кальция, дикальцийфосфат, фосфат магния, фосфат цинка, цитрат кальция, цитрат магния, цитрат цинка, оксалат кальция, оксалат магния, оксалат цинка, тартрат кальция, тартрат магния или тартрат цинка.

Кроме того, для создания локального pH внутри микрокапсулы можно использовать медленно растворяющиеся кислоты или основания, что является более «дружественными» по отношению к инкапсулированному ферменту/соединению.

В большинстве случаев ферменты стабилизируют путем добавления их субстратов (например, белка для протеаз, крахмала для амилаз и т.д.). Антиоксиданты или восстанавливающие агенты можно применять для уменьшения окисления ферментов, например, тиосульфат, аскорбат и т.п. Суммарная доза, необходимая для этих стабилизаторов на грамм моющего средства, значительно ниже, чем при добавлении стабилизаторов в сплошную фазу моющего средства, так как они концентрируются во внутренней фазе капсулы и во многих случаях либо не будут диффундировать наружу в процессе хранения, либо будут диффундировать медленно в зависимости от структуры и молекулярной массы стабилизатора. Особенно высокомолекулярные стабилизаторы (например, более 1 кДа или более 2 кДа, более предпочтительно более 5 кДа) будут обеспечивать лучшую суммарную эффективность. Таким образом, предпочтительными являются высокомолекулярные ингибиторы, полимеры, полиолы, катионы, субстраты ферментов и антиоксиданты.

Фермент может быть защищен путем добавления белка-«поглотителя». Таким образом, компоненты, дестабилизирующие фермент путем взаимодействия с аминокислотными группами (например, аминами) на белке, могут, следовательно, взаимодействовать с добавленным белком-поглотителем или жертвенным белком. Предпочтительным является белок-поглотитель с достаточно большой молекулярной массой, который остается внутри капсул.

Стабильность фермента можно дополнительно улучшить за счет добавления модифицирующего реологию компонента, тем самым увеличивая вязкость внутренней фазы капсулы. Повышенная внутренняя вязкость замедлит диффузию дестабилизаторов ферментов в капсулы (и/или замедлит диффузию стабилизаторов ферментов из капсулы) и, таким образом, продлит срок жизни фермента. Примерами таких модификаторов вязкости являются такие полимеры, как полиэтиленгликоль (ПЭГ), полиэтиленоксид (PEO), гидрофильный полиуретан, поливинилпирролидон (ПВП) и сополимеры ПВП и винилацетата, крахмал, гиалуроновая кислота, водорастворимые производные целлюлозы, такие как карбоксиметилцеллюлоза, водорастворимые камеди, такие как аравийская камедь, камедь бобов рожкового дерева, гуаровая камедь или ксантановая камедь и т.п., а также их комбинации или сополимеры. Наиболее предпочтительными являются неионные высокомолекулярные полимеры с молекулярной массой более 1 кДа или более 2 кДа, более предпочтительно более 5 кДа. Неионные полимеры являются предпочтительными, поскольку в большинстве случаев они лучше совместимы с реакционноспособным мембранным полимером, чем ионные полимеры.

Высокую вязкость можно обеспечить за счет получения капсул с использованием водной фазы с высокой вязкостью или (что является более современным методом) получения капсул, в которых увеличение вязкости происходит только после получения эмульсии/капсул. Такое «активированное» увеличение вязкости является предпочтительным, так как получение эмульсий с водной фазой с высокой вязкостью может быть сложной задачей. Активированное увеличение вязкости может быть выполнено in situ при добавлении к моющему средству, если внутренняя фаза капсулы имеет более высокую активность воды, чем моющее средство, к которому ее добавляют, в результате, вода (но не модификатор реологии) будет диффундировать из капсул, увеличивая вязкость внутренней фазы после добавления к моющему средству. Это также можно реализовать с применением диффузии соли или других низкомолекулярных компонентов, например с использованием компонента, который будет повышать вязкость при уменьшении концентрации соли путем добавления к моющему средству (например, полимер, который осаждается при исходном высоком содержании соли, но является растворимым, когда концентрация соли уменьшается из-за диффузии соли при добавлении к моющему средству). Другим способом активации увеличения вязкости является использование компонентов, в которых вязкость зависит от pH. Для некоторых способов межфазной полимеризации (например, реакция амин - галогенкислота) рН внутренней фазы будет меняться во время инкапсуляции, в случае уменьшения рН амина-галогенкислоты в ходе межфазной полимеризации. Это можно использовать для активации увеличения вязкости. Многие модификаторы реологии, такие как полиакрилаты, демонстрируют максимальное значение вязкости при конкретном значении или диапазоне pH. Carbopol 934 компании Lubrizol и Texipol 63-258 компании Scott Bader представляют собой примеры модификаторов реологии, в которых вязкость значительно увеличивается при уменьшении pH от 11 до 8 или при увеличении pH от 4 до 8. Другой тип полимера с различной вязкостью при низком pH и при высоком pH представляет собой частично гидролизованный полиакриламид. Еще одной возможностью является использование модификаторов реологии, которые зависят от температуры, в результате, при одной температуре обеспечивают эмульсию/инкапсуляцию, а впоследствии температура изменяется для повышения вязкости. Вязкость также может быть индуцирована светом или ультразвуком. Еще одним способом является использование модификаторов реологии, обеспечивающих разжижение при сдвиге, таким образом, что вязкость является низкой при высоком сдвиге при образовании эмульсии и высокой при уменьшении сдвига.

Другая методика стабилизации при инкапсуляции фермента заключается в осаждении фермента в капсулах во время хранения, например, путем добавления осаждающих веществ, таких как соль или полиэтиленгликоль (ПЭГ). Такую же «активированную стабилизацию», описанную выше, можно реализовать, например, путем добавления ПЭГ, который после добавления к моющему средству концентрируется в результате диффузии воды наружу до степени, при которой фермент будет осаждаться. Таким образом, фермент может находиться в растворе во время обработки капсул, но осаждаться при добавлении к моющему средству.

Ферменты также можно использовать в осажденной или кристаллической форме при получении микрокапсул.

Настоящее изобретение дополнительно описано с помощью следующих примеров, которые не следует рассматривать как ограничивающие объем настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Анализ п-нитрофенила (pNP)

Гидролитическую активность липазы можно определить с помощью кинетического анализа с использованием п-нитрофенилацильных сложных эфиров в качестве субстрата.

100 мМ стоковый раствор в DMSO каждого из субстратов п-нитрофенилбутирата (C4), п-нитрофенилкапроата (C6), п-нитрофенилкапрата (C10), п-нитрофениллаурата (C12) и п-нитрофенилпальмитата (C16) (все производства компании Sigma-Aldrich Danmark A/S, Kirkebjerg 84, 2605 № по кат. C3:N-9876, C6: N-0502, C10: N-0252, C12: N-2002, C16: N-2752) разводят до конечной концентрации 1 мМ 25 мМ в аналитическом буферном растворе (50 мМ Трис; pH 7,7; 0,4% Triton X-100).

Варианты липазы, родительская липаза и соответствующие контрольные вещества, например, Lipolase™ (SEQ ID NO: 2) в 50 мМ Hepes; pH 8,0; 10 ч/млн Triton X-100; +/-20 мМ CaCl2 добавляют к раствору субстрата в следующих конечных концентрациях белка: 0,01 мг/мл; 5 x 10-3 мг/мл; 2,5 x 10-4 мг/мл; и 1,25 x 10-4 мг/мл в 96-луночных планшетах NUNC (№ по кат. 260836, Kamstrupvej 90, DK-4000, Roskilde). Буферный раствор также используется в качестве отрицательного контроля. Высвобождение п-нитрофенола путем гидролиза п-нитрофенилацила можно контролировать при 405 нм в течение 5 минут с 10-секундными интервалами на спектрометре Spectra max 190 (Molecular Devices GmbH, Bismarckring 39, 88400 Biberach an der Riss, ГЕРМАНИЯ). Гидролитическую активность в отношении одного или более субстратов варианта можно сравнить с активностью родительской липазы.

Пример 2. Конструирование вариантов посредством сайт-направленного мутагенеза

Сайт-направленные варианты сконструировали из липазы Thermomyces lanuginosus (TLL) (SEQ ID NO: 2). Варианты получали путем стандартного клонирования фрагментов ДНК (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989) с применением ПЦР вместе с надлежащим образом сконструированными мутагенными олигонуклеотидами, которые вводят желаемые мутации в полученную последовательность.

Мутагенные олигонуклеотиды конструировали в соответствии с последовательностью ДНК, фланкирующей желаемый(-ые) сайт(-ы) мутации, отделенные друг от друга парами оснований ДНК, определяющими вставки/делеции/замены, приобретали у поставщика олигонуклеотидов, такого как Life Technologies.

Для проверки вариантов TLL мутированную ДНК, кодирующую вариант, интегрировали в компетентный штамм A. oryzae посредством гомологичной рекомбинации, ферментировали с использованием стандартных протоколов (среды на основе дрожжевого экстракта, 3-4 дня, 30°C) и очищали посредством хроматографии. Таким образом были сконструированы и изготовлены варианты, перечисленные в таблице ниже.

Варианты SEQ ID NO: 2

Пример 3. Относительная эффективность мытья (ОЭ(мытья))

Эксперименты в отношении мытья проводили с использованием автоматического анализа с механическим усилием (AMSA) для оценки эффективности мытья при стирке. Планшет для AMSA имеет ряд щелевых отверстий для исследуемых растворов и крышку, плотно прижимающую образец белья для стирки, что позволяет осуществлять стирку текстильного изделия через все щелевые отверстия. Во время стирки планшет, исследуемые растворы, текстильное изделие и крышку энергично встряхивают для приведения исследуемого раствора в контакт с текстильным изделием и прикладывают механическое усилие в форме регулярных периодических вибраций. Дополнительное описание см. в WO02/42740, особенно в разделе, посвященном специальным вариантам осуществления способа на стр. 23-24.

Эксперименты со стиркой проводили в описанных ниже экспериментальных условиях.

Моющее средство:	3,3 г/л моющего средства B или 0,8 г/л моющего средства J
Объем исследуемого раствора:	160 мкл
Время стирки:	20 минут
Температура:	30°C
Доза липазы:	0 ч/млн или 0,35 ч/млн
Испытуемый материал:	Хлопчатобумажное изделие EMPA221, окрашенное красителем Cream Annatto, получали, как описано в WO06/125437, за исключением замены куркумы аннато (Annatto: A-320-WS, Chr. Hansen A/S, Boege Alle' 10-12, DK-2970, г. Херсхольм, Дания, а также EMPA221: EMPA, Lerchenfeldstrasse 5, CH-9014, г. Санкт-Галлен, Швейцария)

Жесткость воды доводили до 15 Ж или 6 Ж путем добавления CaCl2, MgCl2 и NaHCO3 (Ca2+:Mg2+: HCO3-= 4:1:7,5 или 2:1:4,5).

После промывки текстильные изделия промывали в водопроводной воде и избыток воды удаляли из текстильных изделий с использованием фильтровальной бумаги и сразу после этого текстильные изделия высушивали при 100°C в течение 15 минут.

Эффективность мытья измеряли по изменению цвета загрязненного текстильного изделия после мытья. Загрязнение смешивали с аннато. Аннато содержит краситель норбиксин, который выступает в качестве индикатора pH с pH-зависимым изменением цвета. Активность липазы приводит к высвобождению свободных жирных кислот из ацилглицеринов сливок, что приводит к снижению pH и, в результате, к изменению цвета индикатора рН нормиксина. Таким образом, эффективность липазы для мытья можно выразить в виде степени изменения цвета отраженного-излученного света из загрязненного текстильного изделия после мытья при освещении белым светом.

Измерения цвета проводили на профессиональном планшетном сканере (EPSON EXPRESSION 11000XL, Atea A/S, Lautrupvang 6, 2750 г. Баллеруп, Дания), который использовали для получения изображения загрязненного текстильного изделия после мытья. Для получения значения интенсивности света на основе отсканированных изображений 24-битные значения пикселей изображения преобразовывали в значения для красного, зеленого и синего (RGB) цветов.

Изменение цвета из-за активности липазы было выполнено в виде изменения в отражении-излучении зеленого света (G) по сравнению со значением интенсивности света (Int), вычисленным следующим образом:

Относительную эффективность мытья (ОЭ(мытья)) липазы относительно эталонной липазы рассчитывали следующим образом:

ОЭ(мытья) = (G/Int(протестированная липаза) - G/Int(без фермента))/(G/Int (эт. липаза) - G/Int (без фермента)).

Считается, что липаза демонстрирует более высокую эффективность мытья, если она лучше, чем эффективность эталонного варианта (ОЭ(мытья) > 1). В контексте настоящего изобретения эталонный фермент представляет собой липазу, показанную как SEQ ID NO: 2.

Обнаружение запаха путем измерения на твердофазном микроэкстрационном газовом хроматографе

Высвобождение масляной кислоты (запаха) из вымытых липазой образцов измеряли посредством твердофазной микроэкстракционной газовой хроматографии (SPME-GC) с использованием следующего способа.

Окрашенное красителем Cream Annatto текстильное изделие EMPA221 промывали, как указано выше, и после промывки избыток воды удаляли из текстильного изделия, используя фильтровальную бумагу, после чего текстильное изделие высушивали при 25°C в течение 2 часов. Каждое измерение посредством SPME-GC проводили с четырьмя фрагментами вымытого и высушенного текстильного изделия (диаметром 5 мм), которые переносили во флакон газового хроматографа (ГХ), а затем закрывали флакон. Образцы инкубировали при 30°C в течение 24 часов и впоследствии нагревали до 140°C в течение 30 минут и хранили при 20-25°C в течение по меньшей мере 4 часов перед анализом. Анализы выполняли на колонке Varian 3800 GC, оснащенной Stabilwax- DA, lntegra-Guard column (30 м, вн. диам. 0,32 мм и 0,25 мкм df), и волокном Carboxen PDMS SPME (85 мкм). Отбор образцов из каждого флакона для GC выполняли при 50°C в течение 8 минут с волокном SPME в паровой фазе над кусочками текстильного изделия и отобранные соединения затем инъецировали на колонку (температура инжектора = 250°C). Поток колонки = 2 мл гелия/минуту. Градиент температуры термостата колонки: 0 минут = 50°C, 2 минуты = 50°C, 6 минут 45 секунд = 240°C, 11 минут 45 секунд = 240°C. Использовали пламенно-ионизационный детектор (FID) и время удерживания масляной кислоты определяли с использованием аутентичного стандарта.

Относительное высвобождение запаха (ОЭ(запаха)) липазы представляет собой соотношение между количеством высвобожденной масляной кислоты (площадь пика) из вымытого липазой образца и количеством высвобожденной масляной кислоты (площадь пика) из вымытого эталонной липазой образца, после чего оба значения корректировали на количество высвобожденной масляной кислоты (площадь пика) из не вымытого липазой образца (холостой образец). Относительную эффективность запаха (ОЭ(запаха)) полипептида рассчитывают в соответствии со следующей формулой:

ОЭ(запаха) = (запах(протестированная липаза) - запах(без фермента))/(запах(эт. липаза) - запах(без фермента)),

где запах представляет собой измеренную масляную кислоту (площадь пика), высвобожденную из поверхности текстильного изделия.

Показатель пользы/риска (ОЭ(мытья)/ОЭ(запаха))

Показатель пользы/риска (BRF), описывающий эффективность мытья (польза) в сравнении с высвобождением запаха (риск), можно определить как ОЭ(мытья)/ОЭ(запаха). Если показатель пользы/риска для липазы выше 1, липаза имеет более высокую эффективность мытья относительно высвобождения запаха по сравнению с эталонной липазой (SEQ ID NO: 2).

Пример 4. Анализ термического разворачивания белка (TSA, анализ теплового сдвига)

Термическое разворачивание вариантов SEQ ID NO: 1 контролировали с помощью красителя Sypro Orange (Invitrogen, S-6650) с использованием ПЦР-анализатора в реальном времени (Applied Biosystems; Step-One-Plus).

В 96-луночном белом планшете для ПЦР 15 мкл образца (очищенный фермент, разведенный в 100 мМ EPPS, 0,01% Troton-X-100; pH 8,0) смешивали (1:1) с Sypro Orange (конц. = 10X; стоковый раствор от поставщика = 5000X) в воде.

Планшет герметично закрывали оптической ПЦР-крышкой. ПЦР-анализатор устанавливали на скорость сканирования 76°C в час, начиная с 25°C и заканчивая 96°C.

Флуоресценцию контролировали каждые 20 секунд, используя встроенный синий светодиод для возбуждения и фильтр ROX (610 нм, эмиссионный). Значения Tm рассчитывали как максимальное значение первого производного (dF/dK) (Gregory et al., 2009, J. Biomol. Screen. 14: 700).

Пример 5. Конструирование вариантов посредством сайт-направленного мутагенеза

Сайт-направленные варианты сконструировали из липазы Thermomyces lanuginosus (TLL) (SEQ ID NO: 2). Варианты получали путем стандартного клонирования фрагментов ДНК (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989) с применением ПЦР вместе с надлежащим образом сконструированными мутагенными олигонуклеотидами, которые вводят желаемые мутации в полученную последовательность.

Мутагенные олигонуклеотиды конструировали в соответствии с последовательностью ДНК, фланкирующей желаемый(-ые) сайт(-ы) мутации, отделенные друг от друга парами оснований ДНК, определяющими вставки/делеции/замены, приобретали у поставщика олигонуклеотидов, такого как Life Technologies. Для проверки вариантов TLL мутированную ДНК, кодирующую вариант, интегрировали в компетентный штамм A. oryzae посредством гомологичной рекомбинации, ферментировали с использованием стандартных протоколов (среды на основе дрожжевого экстракта, 3-4 дня, 30°C) и очищали посредством хроматографии. Таким образом были сконструированы и изготовлены варианты, перечисленные в таблице ниже.

Пример 6. Относительная эффективность мытья (ОЭ(мытья))

Эксперименты в отношении мытья проводили с использованием автоматического анализа с механическим усилием (AMSA) для оценки эффективности мытья при стирке. Планшет для AMSA имеет ряд щелевых отверстий для исследуемых растворов и крышку, плотно прижимающую образец белья для стирки, что позволяет осуществлять стирку текстильного изделия через все щелевые отверстия. Во время стирки планшет, исследуемые растворы, текстильное изделие и крышку энергично встряхивают для приведения исследуемого раствора в контакт с текстильным изделием и прикладывают механическое усилие в форме регулярных периодических вибраций. Дополнительное описание см. в WO 02/42740, особенно в разделе, посвященном специальным вариантам осуществления способа на стр. 23-24.

Эксперименты со стиркой проводили в описанных ниже экспериментальных условиях.

Моющее средство:	3,3 г/л моющего средства А или 0,8 г/л моющего средства В
Объем исследуемого раствора:	160 мкл
Время стирки:	20 минут
Температура:	30°C
Доза липазы:	0 ч/млн или 0,35 ч/млн
Испытуемый материал:	Хлопчатобумажное изделие EMPA221, окрашенное красителем Cream Annatto, получали, как описано в WO 06/125437, за исключением замены куркумы аннато (Annatto: A-320-WS, Chr. Hansen A/S, Boege Alle' 10-12, DK-2970, г. Херсхольм, Дания, а также EMPA221: EMPA, Lerchenfeldstrasse 5, CH-9014, г. Санкт-Галлен, Швейцария)

Жесткость воды доводили до 15 °Ж или 6 °Ж путем добавления CaCl2, MgCl2 и NaHCO3 (Ca2+:Mg2+:HCO3- = 4:1:7,5 или 2:1:4,5).

После промывки текстильные изделия промывали в водопроводной воде и избыток воды удаляли из текстильных изделий с использованием фильтровальной бумаги и сразу после этого текстильные изделия высушивали при 100°C в течение 15 минут.

Эффективность мытья измеряли по изменению цвета загрязненного текстильного изделия после мытья. Загрязнение смешивали с аннато. Аннато содержит краситель норбиксин, который выступает в качестве индикатора pH с pH-зависимым изменением цвета. Активность липазы приводит к высвобождению свободных жирных кислот из ацилглицеринов сливок, что приводит к снижению pH и, в результате, к изменению цвета индикатора рН нормиксина. Таким образом, эффективность липазы для мытья можно выразить в виде степени изменения цвета отраженного-излученного света из загрязненного текстильного изделия после мытья при освещении белым светом.

Измерения цвета проводили на профессиональном планшетном сканере (EPSON EXPRESSION 11000XL, Atea A/S, Lautrupvang 6, 2750 г. Баллеруп, Дания), который использовали для получения изображения загрязненного текстильного изделия после мытья. Для получения значения интенсивности света на основе отсканированных изображений 24-битные значения пикселей изображения преобразовывали в значения для красного, зеленого и синего (RGB) цветов.

Изменение цвета из-за активности липазы было выполнено в виде изменения в отражении-излучении зеленого света (G) по сравнению со значением интенсивности света (Int), вычисленным следующим образом:

Относительную эффективность мытья (ОЭ(мытья)) липазы относительно эталонной липазы рассчитывали следующим образом:

ОЭ(мытья) = (G/Int(протестированная липаза) - G/Int(без фермента))/(G/Int (эт. липаза) - G/Int (без фермента)).

Считается, что липаза демонстрирует более высокую эффективность мытья, если она лучше, чем эффективность эталонного варианта (ОЭ(мытья) > 1). В контексте настоящего изобретения эталонный фермент представляет собой липазу, показанную как SEQ ID NO: 2.

Обнаружение запаха путем измерения на твердофазном микроэкстрационном газовом хроматографе

Высвобождение масляной кислоты (запаха) из вымытых липазой образцов измеряли посредством твердофазной микроэкстракционной газовой хроматографии (SPME-GC) с использованием следующего способа.

Окрашенное красителем Cream Annatto текстильное изделие EMPA221 промывали, как указано выше, и после промывки избыток воды удаляли из текстильного изделия, используя фильтровальную бумагу, после чего текстильное изделие высушивали при 25°C в течение 2 часов. Каждое измерение посредством SPME-GC проводили с четырьмя фрагментами вымытого и высушенного текстильного изделия (диаметром 5 мм), которые переносили во флакон газового хроматографа (ГХ), а затем закрывали флакон. Образцы инкубировали при 30°C в течение 24 часов и впоследствии нагревали до 140°C в течение 30 минут и хранили при 20-25°C в течение по меньшей мере 4 часов перед анализом. Анализы выполняли на колонке Varian 3800 GC, оснащенной Stabilwax- DA, lntegra-Guard column (30 м, вн. диам. 0,32 мм и 0,25 мкм df), и волокном Carboxen PDMS SPME (85 мкм). Отбор образцов из каждого флакона для GC выполняли при 50°C в течение 8 минут с волокном SPME в паровой фазе над кусочками текстильного изделия и отобранные соединения затем инъецировали на колонку (температура инжектора = 250°C). Поток колонки = 2 мл гелия/минуту. Градиент температуры термостата колонки: 0 минут = 50°C, 2 минуты = 50°C, 6 минут 45 секунд = 240°C, 11 минут 45 секунд = 240°C. Использовали пламенно-ионизационный детектор (FID) и время удерживания масляной кислоты определяли с использованием аутентичного стандарта.

Относительное высвобождение запаха (ОЭ(запаха)) липазы представляет собой соотношение между количеством высвобожденной масляной кислоты (площадь пика) из вымытого липазой образца и количеством высвобожденной масляной кислоты (площадь пика) из вымытого эталонной липазой образца, после чего оба значения корректировали на количество высвобожденной масляной кислоты (площадь пика) из не вымытого липазой образца (холостой образец). Относительную эффективность запаха (ОЭ(запаха)) рассчитывают в соответствии со следующей формулой:

ОЭ(запаха) = (запах(протестированная липаза) - запах(без фермента))/(запах(эт. липаза) - запах(без фермента)),

где запах представляет собой измеренную масляную кислоту (площадь пика), высвобожденную из поверхности текстильного изделия.

Показатель пользы/риска (ОЭ(мытья)/ОЭ(запаха))

Показатель пользы/риска (BRF), описывающий эффективность мытья (польза) в сравнении с высвобождением запаха (риск), можно определить как ОЭ(мытья)/ОЭ(запаха). Если показатель пользы/риска для липазы выше 1, липаза имеет более высокую эффективность мытья относительно высвобождения запаха по сравнению с эталонной липазой (SEQ ID NO: 2).

Пример 7. Анализ термического разворачивания белка (TSA, анализ теплового сдвига)

Термическое разворачивание вариантов SEQ ID NO: 2 контролировали с помощью красителя Sypro Orange (Invitrogen, S-6650) с использованием ПЦР-анализатора в реальном времени (Applied Biosystems; Step-One-Plus).

В 96-луночном белом планшете для ПЦР 15 мкл образца (очищенный фермент, разведенный в 100 мМ EPPS, 0,01% Troton-X-100; pH 8,0) смешивали (1:1) с Sypro Orange (конц. = 10X; стоковый раствор от поставщика = 5000X) в воде.

Планшет герметично закрывали оптической ПЦР-крышкой. ПЦР-анализатор устанавливали на скорость сканирования 76°C в час, начиная с 25°C и заканчивая 96°C.

Флуоресценцию контролировали каждые 20 секунд, используя встроенный синий светодиод для возбуждения и фильтр ROX (610 нм, эмиссионный). Значения Tm рассчитывали как максимальное значение первого производного (dF/dK) (Gregory et al., 2009, J. Biomol. Screen. 14: 700).

ПРИМЕРЫ МОЮЩИХ СРЕДСТВ

Примеры 1-5

Моющая композиция для стирки с одной дозой. Такие однодозовые составы могут содержать одно или множество отделений.

Пример 6. Однодозовая композиция с множеством отделений

Ниже представлены однодозовые составы моющих средств для стирки настоящего изобретения с множеством отделений. В этих примерах одна доза имеет три отделения, но аналогичные композиции могут подразумевать наличие двух, четырех или пяти отделений. Пленка, используемая для заключения в капсулу отделений, представляет собой поливиниловый спирт.

Сырье и примечания для примеров моющих средств 1-7

Линейный алкилбензолсульфонат со средней длиной алифатической углеродной цепи C11-C18

C12-18 Хлорид диметилгидроксиэтиламмония

AE3S представляет собой C12-15 алкилэтокси (3)сульфат

AE7 представляет собой C12-15 этоксилат спирта со средней степенью этоксилирования 7

AE9 представляет собой C12-16 этоксилат спирта со средней степенью этоксилирования 9

HSAS представляет собой разветвленный в середине цепи первичный алкилсульфат с длиной углеродной цепи около 16-17, как описано в патентах US 6,020,303 и US 6,060,443

Полиакрилат MW 4500 поставляется компанией BASF

Карбоксиметилцеллюлоза представляет собой Finnfix® V, поставляемый компанией CP Kelco, г. Арнем, Нидерланды

CHEC представляет собой катионно-модифицированный полимер гидроксиэтилцеллюлозы.

Фосфонатные хелатирующие средства представляют собой, например, диэтилентетрааминпентауксусную кислоту (DTPA) гидроксиэтандифосфонат (HEDP)

S-ACMC представляет собой карбоксиметилцеллюлозу, конъюгированную с C.I. Reactive Blue 19, название продукта AZO-CM-CELLULOSE

Высвобождающий грязь агент представляет собой Repel-o-tex® PF

Сополимер акриловой кислоты и малеиновой кислоты имеет молекулярную массу 70000 и соотношение акрилат:малеат 70:30

Красящий пигмент представляет собой полимерный красящий пигмент Liquitint® Violet CT, поставляемый компанией Milliken, г. Спартанберг, штат Южная Каролина, США.

Амфифильный статистический привитый сополимер представляет собой привитый поливинилацетатом полиэтиленоксидный сополимер, имеющий полиэтиленоксидный каркас и множество поливинилацетатных боковых цепей. Молекулярная масса полиэтиленоксидного каркаса составляет около 6 000, а массовое соотношение полиэтиленоксида к поливинилацетату составляет от около 40 до 60 при не более 1 точки прививания на 50 этиленоксидных звеньев.

2 Полиэтиленимин (MМ = 600) с 20 этоксилатными группами на группу -NH.

3 Амфифильный алкоксилированный полимер представляет собой полиэтиленимин (ММ 600), полученный из полимера, дериватизированного так, чтобы он содержал 24 этоксилатные группы на группу -NH и 16 пропоксилатных групп на группу -NH.

4липаза и амилаза показаны в виде миллиграммов активного фермента на 100 г моющего средства.

a Proxel GXL, 20% водный дипропиленгликолевый раствор 1,2-бензизотиазолин-3-она, поставляемый компанией Lonza.

b Сложный эфир жирной кислоты и N,N-бис(гидроксиэтил)-N,N-диметиламмония хлорида. Иодное число данного материала в родительской жирной кислоте составляет от 18 до 22. Материал, полученный от компании Evonik, содержит примеси в виде свободной жирной кислоты, моноэфирной формы сложного эфира жирной кислоты и N,N-бис(гидроксиэтил)-N,N-диметиламмония хлорида и сложных эфиров жирной кислоты и N,N-бис(гидроксиэтил)-N-метиламина.

c MP10®, поставляемый компанией Dow Corning, активность 8%

d как описано в US 8,765,659, выражено в виде 100% инкапсулированного ароматического масла

e Rheovis® CDE, катионный полимерный загуститель, поставляемый компанией BASF

f N,N-диметилоктанамид и N,N-диметилдеканамид в массовом отношении около 55:45, торговое наименование Steposol® M-8-10, компания Stepan Company

Размеры и величины, описанные в настоящем документе, не следует понимать как строго ограниченные перечисленными точными числовыми значениями. Напротив, если не указано иное, каждый такой размер должен обозначать как указанное значение, так и функционально эквивалентный диапазон, в который входит это значение. Например, размер, описанный как «40 мм», подразумевает «около 40 мм».

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ДЗЕ ПРОКТЕР ЭНД ГЭМБЛ КОМПАНИ

<120> МОЮЩИЕ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ЛИПАЗЫ

<130> CM04876MX

<160> 2

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 807

<212> ДНК

<213> Thermomyces lanuginosus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(807)

<220>

<221> зрел._пептид

<222> (1)..()

<400> 1

gag gtc tcg cag gat ctg ttt aac cag ttc aat ctc ttt gca cag tat 48

Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr

1 5 10 15

tct gca gcc gca tac tgc gga aaa aac aat gat gcc cca gct ggt aca 96

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Thr

20 25 30

aac att acg tgc acg gga aat gcc tgc ccc gag gta gag aag gcg gat 144

Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp

35 40 45

gca acg ttt ctc tac tcg ttt gaa gac tct gga gtg ggc gat gtc acc 192

Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr

50 55 60

ggc ttc ctt gct ctc gac aac acg aac aaa ttg atc gtc ctc tct ttc 240

Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe

65 70 75 80

cgt ggc tct cgt tcc ata gag aac tgg atc ggg aat ctt aac ttc gac 288

Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp

85 90 95

ttg aaa gaa ata aat gac att tgc tcc ggc tgc agg gga cat gac ggc 336

Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Asp Gly

100 105 110

ttc act tcg tcc tgg agg tct gta gcc gat acg tta agg cag aag gtg 384

Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys Val

115 120 125

gag gat gct gtg agg gag cat ccc gac tat cgc gtg gtg ttt acc gga 432

Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly

130 135 140

cat agc ttg ggt ggt gca ttg gca act gtt gcc gga gca gac ctg cgt 480

His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg

145 150 155 160

gga aat ggg tat gat atc gac gtg ttt tca tat ggc gcc ccc cga gtc 528

Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val

165 170 175

gga aac agg gct ttt gca gaa ttc ctg acc gta cag acc ggc gga aca 576

Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly Thr

180 185 190

ctc tac cgc att acc cac acc aat gat att gtc cct aga ctc ccg ccg 624

Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro

195 200 205

cgc gaa ttc ggt tac agc cat tct agc cca gag tac tgg atc aaa tct 672

Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys Ser

210 215 220

gga acc ctt gtc ccc gtc acc cga aac gat atc gtg aag ata gaa ggc 720

Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly

225 230 235 240

atc gat gcc acc ggc ggc aat aac cag cct aac att ccg gat atc cct 768

Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile Pro

245 250 255

gcg cac cta tgg tac ttc ggg tta att ggg aca tgt ctt 807

Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu

260 265

<210> 2

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Thermomyces lanuginosus

<400> 2

Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr

1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Thr

20 25 30

Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp

35 40 45

Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr

50 55 60

Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe

65 70 75 80

Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp

85 90 95

Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Asp Gly

100 105 110

Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys Val

115 120 125

Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly

130 135 140

His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg

145 150 155 160

Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val

165 170 175

Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly Thr

180 185 190

Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro

195 200 205

Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys Ser

210 215 220

Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly

225 230 235 240

Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile Pro

245 250 255

Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu

260 265

<---

1. Водорастворимое изделие с разовой дозой для стирки ткани, содержащее водорастворимую пленку и жидкую моющую композицию для стирки, причем жидкая моющая композиция для стирки содержит вариант родительской липазы, который обладает липазной активностью, последовательность которого по меньшей мере на 70% идентична последовательности с SEQ ID NO: 2, содержит замены в положениях, соответствующих положениям F51I,L, T231R и N233R, и необязательно одну или более замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, E56R, D57N, V60E,K, K98I, N101D, R118F, G163S, Y220F, T244E и P256T; и вспомогательный компонент моющего средства; при этом жидкая моющая композиция для стирки покрыта водорастворимой пленкой; при этом водорастворимая пленка содержит полимерный материал, выбранный из поливиниловых спиртов, поливинилпирролидона, полиалкиленоксидов, акриламида, акриловой кислоты, целлюлозы, простых эфиров целлюлозы, сложных эфиров целлюлозы, амидов целлюлозы, поливинилацетатов, поликарбоновых кислот и солей, полиаминокислот или пептидов, полиамидов, полиакриламида, сополимеров малеиновой/акриловой кислот, полисахаридов, включая крахмал и желатин, природных камедей, таких как ксантановая камедь и карраген и их смесей.

2. Водорастворимое изделие с разовой дозой по п. 1, в котором указанный вариант липазы содержит одну или более замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, E56R, D57N, V60E,K, K98I, N101D, R118F, G163S, Y220F, T244E и P256T.

3. Водорастворимое изделие с разовой дозой по п. 1 или 2, в котором вариант содержит F51I,L и замены, соответствующие любому из следующих наборов замен:

.

4. Водорастворимое изделие с разовой дозой по любому предшествующему пункту,

в котором вариант содержит замены, соответствующие E56R+T231R+N233R, и одну или более замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, D57N, V60E,K, K98I, N101D, R118F, G163S, Y220F, T244E и P256T; или

в котором вариант содержит замены в положениях, соответствующих R118F+T231R+N233R, и одну или более замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, E56R, D57N, V60E,K, K98I, N101D, G163S, Y220F, T244E и P256T; или

в котором вариант содержит замены в положениях, соответствующих E56R+R118F+T231R+N233R, и одну или более замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, D57N, V60E,K, K98I, N101D, G163S, Y220F, T244E и P256T; или

в котором вариант содержит замены в положениях, соответствующих E56R+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или более замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, D57N, V60E,K, K98I, N101D, G163S, Y220F и T244E; или

в котором вариант содержит замены в положениях, соответствующих G23S+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R, и одну или более замен в положениях, соответствующих D27N, A40I, D57N, V60E,K, K98I, N101D, G163S, Y220F, T244E и P256T.

5. Водорастворимое изделие с разовой дозой по любому предшествующему пункту, в котором вариант дополнительно содержит P256T.

6. Водорастворимое изделие с разовой дозой по любому предшествующему пункту,

в котором вариант содержит замены в положениях, соответствующих G23S+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или более замен в положениях, соответствующих D27N, A40I, D57N, V60E,K, K98I, N101D, G163S, Y220F и T244E; или

в котором вариант содержит замены в положениях, соответствующих D27N+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или более замен в положениях, соответствующих G23S, A40I, D57N, V60E,K, K98I, N101D, G163S, Y220F и T244E; или

в котором вариант содержит замены в положениях, соответствующих A40I+F51I,L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или более замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, D57N, V60E,K, K98I, N101D, G163S, Y220F и T244E; или

в котором вариант содержит замены в положениях, соответствующих F51I,L+E56R+D57N+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или более замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, V60E,K, K98I, N101D, G163S, Y220F и T244E; или

в котором вариант содержит замены в положениях, соответствующих F51I,L+E56R+D57N+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или более замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, V60E,K, N101D, G163S, Y220F и T244E; или

в котором вариант содержит замены в положениях, соответствующих F51I,L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+P256T, и одну или более замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, V60E,K, N101D, Y220F и T244E; или

в котором вариант содержит замены в положениях, соответствующих F51I,L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+T244E+P256T, и одну или более замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, V60E,K, N101D и Y220F; или

в котором вариант содержит замены в положениях, соответствующих F51I,L+E56R+D57N+V60E,K+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или более замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, N101D, G163S, Y220F и T244E; или

в котором вариант содержит замены в положениях, соответствующих F51I,L+E56R+D57N+N101D+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или более замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, V60E,K, N101D, G163S, Y220F и T244E; или

в котором вариант содержит замены в положениях, соответствующих F51I,L+E56R+D57N+V60E,K+K98I+N101D+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или более замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, G163S, Y220F и T244E.

7. Водорастворимое изделие с разовой дозой по любому предшествующему пункту, в котором вариант содержит замены в положениях, соответствующих одному из следующих наборов замен:

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51L+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51L+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+P256T;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+K98I+N101D+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+K98I+R118F+Y220F+T231R+N233R+T244E+P256T.

8. Водорастворимое изделие с разовой дозой по любому предшествующему пункту, в котором один или более ферментов липазы инкапсулированы в микрокапсулу, причем предпочтительно мембрану микрокапсулы получают путем поперечного сшивания полиразветвленного полиамина с молекулярной массой более 1 кДа.

9. Водорастворимое изделие с разовой дозой по любому предшествующему пункту, в котором моющая композиция находится в форме жидкости, предпочтительно содержащей менее 20 мас.% воды.

10. Водорастворимое изделие с разовой дозой по любому предшествующему пункту, в котором моющая композиция содержит полимер, выбранный из карбоксиметилцеллюлозы, гидрофобно модифицированной карбоксиметилцеллюлозы или их смеси.

11. Водорастворимое изделие с разовой дозой по любому предшествующему пункту, в котором непенящееся анионное поверхностно-активное вещество содержит линейный алкилбензолсульфонат, алкоксилированный алкилсульфат или их смесь.

12. Водорастворимое изделие с разовой дозой по любому предшествующему пункту, в котором жидкая моющая композиция для стирки содержит:

a. катионный полисахарид, выбранный из катионно модифицированной гидроксиэтилцеллюлозы, катионно модифицированной гидроксипропилцеллюлозы, катионно и гидрофобно модифицированной гидроксиэтилцеллюлозы, катионно и гидрофобно модифицированной гидроксипропилцеллюлозы или их смеси;

b. алкоксилированный полиэтиленимин;

c. их смесь.

13. Способ стирки тканей, включающий следующие этапы:

a. объединение водорастворимого изделия с разовой дозой по любому предшествующему пункту с количеством воды, достаточным для растворения водорастворимой пленки и разбавления моющей композиции для стирки с образованием моющего раствора;

b. приведение моющего раствора в контакт с по меньшей мере одной тканью, подлежащей мытью.