Живая пробиотическая вакцина, содержащая консервативные эпитопы вируса гриппа а (lah+4m2e), для профилактики гриппозной инфекции

Изобретение относится к области медицины, вирусологии, микробиологии, молекулярной генетики и биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности при производстве живых вакцин для профилактики и лечения инфекций, вызванных вирусами гриппа. Разработана живая вакцина против вируса гриппа на основе биологически активного штамма Enterococcus faecium L3 за счет включения в структуру его пилей фрагмента гена, кодирующего консервативный участок молекулы гемагглютинина (LAH - long alpha helix from H1N1pdm09 virus) и четыре тандемных повтора эктодомена М2 белка вируса гриппа А. Задача решена путем введения единой ДНК, содержащей фрагменты гена LAH и гена М2е вируса гриппа, соединенных между собой гибким линкером, в хромосомную ДНК пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 для экспрессии в пилях. Для получения необходимой конструкции lah+4m2e были взяты две плазмиды, одна из которых несла полноразмерный ген гемагглютинина (НА) штамма A/California/07/09 (H1N1), а другая - кассету из 4-х эпитопов М2е различной природы. В результате проведения нескольких последовательных ПЦР получен амплифицированный фрагмент ДНК, содержащий фрагменты lah и 4m2е, соединенные между собой гибким линкером. Клонирование амплифицированного фрагмента ДНК осуществляли с использованием плазмиды pJET1.2. В результате была получена плазмидная ДНК с нужной вставкой. Она была переклонирована из плазмиды pJET1.2 в суицидную плазмиду pT7ERMB с геном устойчивости к эритромицину. В результате клонирования была получена плазмида pentF-(lah+4m2e) с ожидаемой вставкой и геном устойчивости к эритромицину. В результате электропорации энтерококков созданной интегративной плазмидой pentF-(lah+4m2e) получен клон энтерококков, экспрессирующий ген LAH+4M2e белка, клон L3-(LAH+4M2e). Этот клон энтерококков выбран в качестве вакцинного препарата. Вакцинный препарат Enterococcus faecium L3-(LAH+4M2e) способен вызывать синтез анти-(LAH+4М2е) IgG антител, которые обладают протективными свойствами в отношении вируса гриппа. 2 н.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл., 4 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, вирусологии, микробиологии, молекулярной генетики и биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности при производстве живых вакцин для профилактики и лечения инфекций, вызванных вирусами гриппа. Возбудитель гриппа является одним из самых изученных вирусов на сегодняшний день, так как за ним пристально наблюдают ученые по всему миру. Однако, это до сих пор не приблизило человечество к управлению гриппозной инфекцией, что связано с невероятной изменчивостью ее возбудителя. Вирус гриппа относится к семейству Orthomyxoviridae и подразделяется на 4 типа: тип А - встречается у людей и животных, наиболее часто вызывает массовые вспышки болезни, тип В - человеческий, на его долю приходится менее 20% случаев болезни, тип С - человеческий, обнаруживается не более, чем в 5% случаев, тип D - встречается, в основном, у крупного рогатого скота и мелких жвачных животных.

Вирусы гриппа типа А, в свою очередь, подразделяются на подтипы в зависимости от белков наружной оболочки - гемагглютинина и нейраминидазы. Например, вирус типа А, несущий на себе гемагглютинин 1-го вида и нейраминидазу 1-го вида, кратко обозначается, как подтип H1N1. На сегодняшний день от человека выделены вирусы с антигенами H1, Н2, Н3 и N1, N2, остальные виды антигенов встречаются у возбудителей гриппа животных и птиц. На рубеже второго и третьего тысячелетий произошли кардинальные изменения эпидемического процесса при гриппе. Более 40 лет в мире наблюдается одновременная циркуляция двух подтипов вируса гриппа типа А. Кроме эпидемических штаммов вируса гриппа А подтипов А(H1N1) и A(H3N2), которые циркулируют в человеческой популяции, большую угрозу для людей представляют вирусы гриппа птиц, способные преодолевать межвидовой барьер - это высокопатогенные штаммы A(H5N1) и A(H7N9) [Bui С.et al. Transbound Emerg Dis. 12327(10):102-111, (2015)]. Заболевания, вызванные вирусами гриппа А, по распространению, показателям заболеваемости и смертности относятся к социально значимым для населения Российской Федерации. Ежегодно от гриппа умирает от 291 000 до 646 000 человек во всем мире.

В последние годы наблюдается усиление активности вирусов гриппа типа В. Однако, по сравнению с гриппом А грипп В обычно вызывает не такие массовые вспышки, и заболевание протекает легче. По-видимому, это связано с тем, что гемагглютинин и нейраминидаза вируса гриппа В подвергаются изменениям реже и в меньшей степени. Вирус гриппа С редко вызывает заболевание у людей, однако антитела к нему обнаруживаются часто. Очевидно, достаточно распространен бессимптомный грипп С. С каждым годом появляется все больше новых лекарственных препаратов, обладающих противовирусными и другими свойствами, способными предупреждать заболевания гриппом. Но, несмотря на значительные успехи медицинской науки, грипп по-прежнему остается мало контролируемой инфекцией, способной вызывать ежегодные эпидемии, а при появлении нового варианта возбудителя - и пандемии [Ерофеева М.К., Никоноров И.Ю., Terra medica nova. 2 (2009)].

Основные антигены вируса гриппа - это поверхностные гликопротеины - гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA). Постоянная эволюция этих антигенов приводит к почти ежегодному обновлению состава вакцин против гриппа. Отбор штаммов гриппа для предстоящего сезона - это очень сложный процесс, включающий скоординированный сбор и анализ огромного количества изолятов гриппа из многочисленных центров сотрудничества ВОЗ по всему миру. Однако довольно часто при циркуляции вируса возникает изменение антигенной структуры гемагглютинина, реже нейраминидазы, то есть вирус гриппа подвергается антигенному дрейфу и антигенно отличается от вакцинного штамма, что значительно снижает эффективность вакцинации [Belongia, Е.А., et al, J Infect Dis. 199(2): p.159-67, (2009); Erbelding, E.J., et al., J Infect Dis, 218 (3): p.347-3541, 2 (2018)]. Кроме того, при приготовлении вакцинного штамма могут возникнуть точечные мутации гена гемагглютинина, что также может снизить защитный потенциал вакцины [Belongia, E.A. and H.Q. McLean, Clin Infect Dis, 69(10): p.1817-1823, (2019)].

В настоящее время для специфической профилактики гриппа применяются инактивированные (убитые) или живые аттенуированные (ослабленные) гриппозные вакцины [Sridhar, S., K.А. Brokstad, and R.J. Сох, Vaccines (Basel), 3(2): 373-89, (2015)].

Инактивированные вакцины - цельновирионные вакцины из инактивированных цельных вирусов; расщепленные вакцины, или сплит-вакцины; субъединичные вакцины - вакцины, содержащие вирусные субъединицы [Rajao, D.S. and D.R. Perez, Front Microbiol, 9:123, (2018)]. Живые гриппозные вакцины, содержащие аттенуированные вирусы, полученные методом генетической реассортации, разработаны в России и США [Belshe, R.B., et al. N Engl J Med, 356(7): 685-96, (2007); Rudenko L. In proceedings of the international conference on options for the control of influenza VI, Toronto, Ontario, Canada. Jun 17-23, 122-124 (2007)]. Живые гриппозные вакцины обеспечивают не только общий гуморальный, но и местный иммунитет за счет синтеза секреторных IgA, вводятся естественным путем - распылением в нос, что в значительной мере облегчает их применение. Современные трехвалентные гриппозные вакцины включают штаммы вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В. В последние несколько лет появились четырехвалентные гриппозные вакцины, включающие два вируса гриппа В - В/Виктория и В/Ямагата [Desheva YA, Smolonogina ТА, Doroshenko ЕМ, Rudenko LG. VoprVirusol, 61(1): 16-20, (2016)].

Однако такие классические гриппозные вакцины обычно индуцируют нейтрализующие антитела, нацеленные на иммунодоминантные, но сильно вариабельные участки глобулярного головного домена молекулы НА, в результате чего дрейфовый вариант вируса может легко уйти от действия этих антител [Petrie, J.G., et al, Clin Infect Dis. 65(10): p.1644-1651, (2017); Yamayoshi, S. and Y. Kawaoka, Nat Med,. 25(2): p.212-220, (2019)].

В связи с этим в последние десятилетия во всем мире ведутся работы по созданию универсальной вакцины против гриппа, то есть вакцины с широким спектром действия, способной обеспечить долговременную защиту не только от дрейфовых вариантов вирусов гриппа А одного подтипа, но и от вирусов других подтипов.

Одним из подходов к расширению спектра защитного действия гриппозных вакцин является усиление индукции перекрестно реагирующих факторов иммунного ответа, нацеленных на высоко консервативные антигены, присутствующие в вирусах гриппа различных подтипов [Krammer, F., Biotechnol J, 10(5): p.690-701, (2015); Krammer, F. and P. Palese, Nat Rev DrugDiscov, 14(3): p.167-82, (2015)].

Одним из альтернативных подходов к созданию вакцин против гриппа является встраивание консервативных последовательностей вирусных белков в пробиотические векторы. То есть, альтернативой использованию химических адъювантов для вакцинации является применение так называемых живых вакцин на основе пробиотиков. Живые вакцины применяют, как правило, однократно, вводят подкожно, накожно или внутримышечно, а некоторые вакцины перорально и ингаляционно. Главным преимуществом живых вакцин является то, что они активируют все компоненты иммунной системы, вызывая сбалансированный прочный иммунный ответ.

Пробиотики - препараты, оказывающие общее благотворное влияние на организм человека (чаще всего молочнокислые бактерии). Установлено, что некоторые пробиотики являются эффективными неспецифическими стимуляторами выработки специфических иммуноглобулинов против различных инфекций [Vintini Е.О., Medina M.S., ВМС Immunol. 12: 46 (2011), Bermudez-Hurnarun L.G., Kharrat P., Chatel J.M., Microb. Cell. Fact. 10: 17-24 (2011)]. Пробиотики стали использоваться в качестве векторов, в часть из которых успешно внесены плазмидные конструкции, обеспечивающие экспрессию антигенов патогенных бактерий [ME Y, Luo Y., Huang X., SongF., Liu G. Microbiology, 158: 498-504 (2012); De Azevedo M., Karczzewski J., Lefeure F. Et al. BMC Microbiol. 12: 299 (2011)].

Персистенция подобных вариантов пробиотиков в организме способна не только стимулировать выработку протективных иммуноглобулинов, специфичных в отношении целевых антигенов возбудителя, но и обеспечить благоприятный фон для борьбы с инфекцией за счет усиления защитных реакций врожденного иммунитета.

Пробиотические микроорганизмы рассматриваются в настоящее время как хорошая основа для получения рекомбинантных живых вакцин, экспрессирующих вакцинные антигены возбудителей актуальных инфекций [Vintini Е.О., Medina M.S., ВМС Immunol., 12: 46 (2011); Bermudez-Hurnarun L.G., KharratP., ChatelJ.M., Microb. Cell. Fact. 10: 17-24 (2011); ME Y, Luo Y, Huang X., Song F., Liu G. Microbiology, 158: 498-504 (2012), De Azevedo M., Karczzewski J., Lefeure F. et al BMC Microbiol. 12: 299 (2011); Lei H. et al Virology. T. 476: 189-195 (2015)].

В 2015 г. Хан Л. со своими коллегами создали химерную конструкцию на основе бактерии Lactococcus lactis, содержащую на своей поверхности NA вируса гриппа А, и показали, что она способна защищать мышей от инфекции вирусами гриппа [Lei Н et al. Virology. Т. 476: 189-195, (2015)]. Таким образом, они показали, что такая химерная конструкция может быть кандидатом для создания универсальной противогриппозной вакцины.

Описано создание живой вакцины на основе штамма пробиотика Enterococcus faecium L3 для профилактики вагинальной инфекции, вызванной Streptococcus agalactiae (СГВ). На основе штамма пробиотика Enterococcus faecium L3 сконструирована первая генно-инженерная живая вакцина со встроенным в хромосому участком гена белка патогенного СГВ. [Гупалова Т.В., с соавт., 2013].

Запатентован подход, основанный на введении bac гена патогенных СГВ в хромосомную ДНК в области кодирования белков пилей пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 с последующей экспрессией белка Вас в пилях. Пили энтерококков выступают за пределы бактериальных клеток и способны проникать сквозь капсулу, которая экранирует большинство бактериальных белков-антигенов. Пили состоят из белковых мономеров, способных к агрегации. За счет этого процесса может увеличиваться доза чужеродного антигена, встроенного в белок пилей. Последнее должно способствовать увеличению титров антител, специфичных к встраиваемому в структуру поверхностного белка энтерококка полипептидного фрагмента штамма патогенного СГВ.

Принцип введения гена патогенных стрептококков в пили пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 интересен тем, что рекомбинантный белок экспрессируется не в цитоплазме, а на поверхности бактерии [Суворов А.Н., с соавт. патент №RU 2640250].

Штамм Enterococcus faecium L3 обладает выраженной антагонистической активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, способностью восстанавливать микробиоценоз кишечника на фоне дисбиотических состояний [Yermolenko Е., Suvorov А., Chernush A., et al. International Congress Series, 1289: 363-366 (2006)], а также оказывать иммуномодулирующее действие на организм хозяина [Tarasova Е., et. al, 2010]. Осуществлено физическое картирование штамма Enterococcus faecium L3 [Suvorov A., Simanenkov V., Gromova L. et al. Prebiotics and probiotics potencial for human health, 104-112, (2011)]. В экспериментах на здоровых самках мышей показано, что интравагинальное введение высоких доз штамма Enterococcus faecium L3 не только не оказывает токсического действия на организм, но не влияет на состояние слизистой оболочки влагалища [Суворов А., Алехина Г.Г., Пигаревский П.В. и др. Гастробюллетень, 4: 29-31, (2001)] и способствует экспрессии IL-10 клетками слизистой оболочки влагалища крыс с экспериментальным вагинитом, вызванном S.agalactiae и Staphylococcus aureus [Tarasova Е., Yermolenko Е., Donets V. et al. Beneficial Microbs, 1: 265-270, (2010)].

В штамме Enterococcus faecium L3, как и у других грамположительных бактерий, имеются пили, которые представляют собой фимбрии длиной 0,3-3 μm и диаметром 2-10nm [Telford JL, Barocchi MA, Margarit I et al. Nature Reviews Microbiology 4: 509-519, (2006)]. Это длинные белок-подобные полимеры, тянущиеся на поверхности бактерий, представляют собой субъединицы белка пилина, соединенные ковалентной связью. Они играют большую роль в адгезии колонизации хозяина. Пили являются высокоиммуногенными структурами, которые находятся под селективным давлением иммунных реакций хозяина [Camille Danne, Shaynoor Dramsi.

Research in Microbiology, 163: 645-658, (2012)]. Принцип модификации пилей энтерококков вакцинными антигенами является идеальным подходом при создании эффективных живых вакцин благодаря экспозиции целевого антигена на поверхности энтерококка.

Настоящее исследование представляет собой интеграцию участка ДНК, кодирующего антигенный фрагмент вируса гриппа, в структуру хромосомной ДНК энтерококка. При этом задача генетической части работы состояла в осуществлении интеграции гетерологичного участка ДНК в структуру гена поверхностного белка пробиотика без нарушения открытой рамки считывания и повреждения участков кодирования компонентов, участвующих в процессинге поверхностного белка PilF.

В данном исследовании в качестве бактерии-реципиента использовался хорошо изученный пробиотический штамм Enterococcus faecium L3.

Способ введения генов патогенных стрептококков в хромосомную ДНК пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 для экспрессии в пилях, описанный в этом патенте, был использован для создания живой вакцины на основе штамма пробиотиков Enterococcus faecium L3 для профилактики инфекции, вызванной Streptococcus pneumonie [Суворов А.Н., Гупалова Т.В., Кулешевич Е.В., Леонтьева Г.Ф., Крамская Т.А, Патент №2701733.(2019)].

Авторами данного изобретения на основе штамма пробиотика сконструирована генно-инженерная живая вакцина со встроенным в хромосому участком гена pspf патогенного Streptococcus pneumoniae. Интраназальное введение вакцины Enterococcus faecium L3-PSPF+ стимулировало развитие специфического системного и местного иммунного ответа. На модели интраназальной летальной пневмококковой инфекции у мышей линии СВА было показано, что трехкратная интраназальная вакцинация созданной живой пробиотической вакциной повышала защиту от летальной пневмококковой инфекции. Эта живая вакцина принята в качестве прототипа заявляемого изобретения.

В работе использовался адаптированный к мышам штамм пандемического вируса гриппа A/California/7/2009 (H1N1) (Са109 МА).

Внеклеточный домен матриксного белка 2 (М2е) и длинная альфа-спираль (long alpha helix, LAH) из стеблевого домена молекулы НА вируса гриппа являются одними из наиболее консервативных антигенов вируса гриппа [Lu, I.N., et al, PLoS One, 13(9): p.e0204776. (2018); Kolpe, A., et al., 158: p., 244-254, (2018); Zheng, D., et al, Vaccine, 34(51): p.6464-64718-10, (2016)]. Однако эти антигены сами по себе являются слабыми иммуногенами из-за их небольшого размера (LAH составляет всего 72 а.а. М2е - 23 а.а.).

Многими научными группами используются различные носители для увеличения презентации данного участка иммунной системе. Показано, что создание вирусоподобных частиц с использованием корового фрагмента вируса гепатита В (LAH-HBc) привело к усилению специфического иммунного ответа к LAH белку и полностью защитило мышей от различных гетерологичных вирусов (H7N9, H3N2 and H1N1) [Zheng D., Chen S., Qu D., Chen J., WangF., Zhang R. and Chen Z. Vaccine 34(51):6464-6471, (2016).

Также многообещающие данные были получены в результате использования в качестве носителя гемоцианина лимфы улитки (KLH). И такой прототип (LAH-KLH) также обеспечил защиту против гетерологичного челлендж вируса [Wang Т.Т., Tan G.S., Hai R., Pica N., Ngai L., Ekiert D.C., Wilson I.A., Garcia-Sastre A., Moran T.M. and Palese P. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107(44):18979-18984, (2010)].

Были разработаны различные стратегии для индукции более мощного иммунного ответа с более широкой реактивностью при соответствующей презентации целевых консервативных белков вируса гриппа иммунной системе хозяина [Mezhenskaya, D., I. Isakova-Sivak, and L. Rudenko. J Biomed Sci,. 26(1): p.76, (2019); Zhang, H, et al. 6(5): p.1974-91, (2014); Jang, Y.H. and B.L. Seong, Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 9, (2019).

Задачей настоящего изобретения явилось создание живой вакцины на основе биологически активного штамма Enterococcus faecium L3 за счет включения в структуру его пилей фрагмента гена, кодирующего консервативный участок молекулы гемагглютинина (LAH - long alpha helix от штамма H1N1pdm09) и четыре тандемных повтора эктодомена М2 белка вируса гриппа A. LAH является консервативным участком второй субъединицы молекулы гемагглютинина (аминокислотные остатки 59-130) -большая альфа-спираль, к которой вырабатываются кросс-реактивные антитела. Эктодомен М2 белка является консервативным среди всех вирусов гриппа А, однако он слабо иммуногенен ввиду своего маленького размера (23 аминокислоты) и экранирующего действия других более крупных вирусных белков. Для увеличения иммуногенности этого участка используют разные стратегии. Мы присоединили четыре тандемных повтора М2е белка к LAH домену молекулы гемагглютинина вируса гриппа.

Задача решена путем введения единой ДНК, содержащей фрагменты гена LAH и гена 4×М2е вируса гриппа, соединенные между собой гибким линкером, в хромосомную ДНК пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 для экспрессии в пилях, для чего осуществляли следующую последовательность действий:

а) получение единой ДНК, содержащей фрагменты гена lah и четырех копий гена т2е вируса гриппа;

б) получение слитого гена entF- (lah+4m2e) и его клонирование;

в) выявление бактериальных клонов, экспрессирущих ген слитого белка LAH+4М2е в пилях;

в) пероральная вакцинация мышей живой пробиотической вакциной;

г) определение LAH- и М2е-специфических антител в сыворотках крови;

д) исследование протективной эффективности вакцинации живой пробиотической вакциной в отношении летальной гриппозной инфекции

Авторами заявляемого изобретения на основе штамма пробиотика Enterococcus faecium L3 сконструирована генно-инженерная живая вакцина со встроенным в хромосому участком гена lah+4m2e. Пероральное введение вакцины Enterococcus faecium L3-(LAH+4M2e) стимулировало развитие специфического системного и местного иммунного ответа. На модели интраназальной летальной гриппозной инфекции у мышей было показано, что трехкратная пероральная вакцинация созданной живой пробиотической вакциной повышала защиту от летальной гриппозной инфекции.

Конструирование живой вакцины на основе биологически активного пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 за счет включения в его пили антигена LAH+4M2e позволило объединить в одном препарате эффективность полезных свойств пробиотика и специфического антигенного стимула. Созданная живая вакцина против вируса гриппа проявила выраженные иммуногенный и протективный эффекты.

Для получения слитого гена entF-(lah+4m2e) и его клонирования были сконструированы уникальные праймеры, представленные в таблице.

Подчеркнутые звенья нуклеотидной последовательности указывают на сайты рестрикции.

Для получения необходимой конструкции lah+4m2e была взяты две плазмиды, одна из которых несла полноразмерный ген гемагглютинина (НА) штамма A/California/07/09 (H1N1), а другая - кассету из 4-х эпитопов М2е различной природы (человек, свинья, птица). На первом этапе исследования были проведены параллельные ПЦР с использованием специфических праймеров, которые были подобраны так, чтобы большая часть олигонуклеотидной последовательности была полностью комплементарна участку ДНК плазмиды, а другая - несла бы в себе участок перекрывания, одинаковый для обеих плазмид. В результате были получены два фрагмента ДНК, соответствующие lah и 4 т2е.

Далее с полученными участками была проведена дополнительная перекрывающая ПЦР, в результате которой был получен амплифицированный фрагмент ДНК, содержащий фрагменты lah и 4m2е соединенные между собой гибким линкером (фиг. 1).

Клонирование амплифицированного фрагмента ДНК осуществляли с использованием плазмиды pJET1.2, используя Clone JET™ PCR Cloning Kit (Fermentas). В результате клонирования было получено 17 клонов, из которых были выделены ДНК, которые были проверены в реакции ПЦР с праймерами LAH+4M2e-F и LAH+4M2e-R.

11 трансформантов дали положительный ответ.Из одного из них была выделена плазмидная ДНК и обозначена, как pJET1.2-(lah+m2e). Наличие в ней нужной вставки было подтверждено реакцией гидролиза ферментами NdeI и EcoRI, сайты рестрикции которых были заложены в праймеры LAH+4M2e-F и LAH+4M2e-R. Она была переклонирована из плазмиды pJET1.2 в суицидную плазмиду pT7ERMB с геном устойчивости к эритромицину.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pentF-pspf представляющая собой ДНК, полученную в результате вставки суммарного фрагмента ДНК, состоящего из двух отдельных фрагментов гена пробиотика Enterococcus faecium L3 и фрагмента гена pspf описанная в предыдущей заявке на патент №2018144657 «Создание живой вакцины на основе штамма пробиотиков Enterococcus faecium L3 для профилактики инфекции, вызванной Streptococcus pneumoniae», (2018)], была использована для настоящей конструкции. Из плазмидной ДНК pentF-pspf нужно было удалить вставку гена пневмококка pspf и заменить ее на вставку гена lah+4m2e. Для этого плазмидную ДНК pentF-pspf гидролизовали ферментами NdeI и EcoRI, сайты для которых ограничивают последовательность гена pspf (фиг. 2). Полученный верхний фрагмент после гидролиза был использован для дальнейшего клонирования.

Фрагменты ДНК pJET1.2-(lah+4m2e) и pentF-pspf после гидролиза ферментами NdeI и EcoRI выделяли из агарозы с помощью набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Qiagen, USA), дотировали и трансформировали в гетерологичную систему E.coli DH5α. Среда для отбора содержала 500 мкг/мл эритромицина.

Из полученных 17 клонов после трансформации были выделены ДНК, которые были проверены в реакции ПЦР с праймерами LAH+4M2e-F и LAH+4M2e-R. Три трансформанта дали положительный ответ. Из двух из них были выделены плазмиды, которые содержали ожидаемую вставку. Наличие вставки подтверждалось гидролизом плазмиды ферментами NdeI и EcoRI (фиг. 3).

Таким образом, в результате клонирования была получена плазмида pentF-(lah+4m2e) с ожидаемой вставкой и геном устойчивости к эритромицину, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1.

В результате электропорации энтерококков созданной интегративной плазмидой pentF-(lah+m2e) было получено 15 трансформантов. Они были проверены в реакции ПЦР с праймерами LAH+4M2e-F и LAH+4M2e-R. Для этого из трансформантов выделяли ДНК, используя набор ДНК-экспресс (Литех, Россия). Положительный ответ дали все трансформанты (фиг. 4).

Из них выбрали один и обозначили его как L3-(LAH+4M2e). Была проведена амплификация ДНК, выделенной из этого клона, с праймерами В1 и LAH+4M2e-R для проведения секвенирования, чтобы подтвердить интеграцию плазмидной ДНК pentF-(lah+m2e) в хромосомную ДНК энтерококка (фиг. 5).

Клон энтерококков L3-(LAH+4M2e), экспрессирующий ген LAH+4M2e белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, выбран в качестве вакцинного препарата для дальнейшего исследования.

Вакцинацию выбранным клоном L3-(LAH+4M2e), проводили перорально путем кормления мышей.

Мышей разделили на две группы. Первой группе мышей с помощью адаптера в пищевод вводили 5×10*9 КОЕ пробиотика Enterococcus faecium L3 в объеме 300 мкл. Второй группе в том же режиме вводили живую пробиотическую вакцину Enterococcus faecium L3-(LAH+4M2e). Курс вакцинации состоял в ежедневном введении бактерий в течение трех дней подряд. Курс вакцинации повторяли три раза с интервалом в две недели.

Через три недели после последней вакцинации per os двенадцать мышей из каждой группы были интраназально инфицированы 4,0 logl0EID50 адаптированного к мышам штамма A/California/7/09 (Са109 MA) в объеме 50 мкл. Эта доза соответствовала 10 50% мышиным летальным дозам (LD50). Снижение массы тела и выживаемость инфицированных мышей наблюдали ежедневно в течение 14 дней. В дополнение к мышам, которые были найдены мертвыми, мыши с потерей массы тела >30% были гуманно усыплены и зарегистрированы как мертвые. Кроме того, на 6-е сутки от каждой контрольной группы у четырех мышей забирали ткани легкого для оценки инфекционных титров вируса. Ткани легкого гомогенизировали в 1 мл стерильного PBS с помощью автоматического гомогенизатора, а осветленные супернатанты использовали для определения титра вируса методом предельных разведений в развивающихся куриных эмбрионах.

Трех последовательных процедур кормления было достаточно, чтобы индуцировать обнаруживаемые уровни М2е-специфичных IgG антител в сыворотках крови у мышей: титры антител в группе вакцины L3-(LAH+4M2e) достигали значения 1:80, в то время как в контрольной группе повышения антител не наблюдалось (фиг. 6). Характерно, что титры сывороточных IgG - антител, связывающих белок LAH, незначительно различались в контроле и вакцинной группе (фиг. 7). Это может быть связано с наличием потенциальной перекрестной реактивности между белками Enterococcus faecium L3 и LAH.

Вакцинированных per os мышей заражали высокой дозой вируса гриппа Ca109 МА и наблюдали в течение следующих 14 дней. Мыши, вакцинированные L3-(LAH+4M2e), в процессе инфекции продемонстрировали менее выраженную потерю веса по сравнению с контрольной группой. Животные из группы L3-(LAH+4M2e) выздоравливали быстрее и имели значительно меньшую смертность, чем контрольная группа (фиг. 8 А, Б).

Однако через шесть дней после заражения не было отмечено достоверного снижения титра вируса в легких у вакцинированных групп по сравнению с контролем. Возможно, этот результат объясняется не нейтрализующей природой М2е-антител и наличием высокой перекрестной реактивности L3 с самим белком LAH.

Пример 1. Получение слитого гена entF-(lah+4m2e) и его клонирование.

Для получения необходимой конструкции lah+4m2e была взяты две плазмиды, одна из которых несла полноразмерный ген гемагглютинина (НА) штамма A/California/07/09 (H1N1), а другая - кассету из 4-х эпитопов М2е различной природы (человек, свинья, птица). На первом этапе исследования были проведены параллельные ПЦР с использованием специфических праймеров, которые были подобраны так, чтобы большая часть олигонуклеотидной последовательности была полностью комплементарна участку ДНК плазмиды, а другая - несла бы в себе участок перекрывания, одинаковый для обеих плазмид. В результате были получены два фрагмента ДНК, соответствующие lah и 4m2е.

Далее с полученными участками была проведена дополнительная перекрывающая ПЦР, в результате которой был получен амплифицированный фрагмент ДНК, содержащий фрагменты lah и 4m2е, соединенные между собой гибким линкером (фиг. 1).

Клонирование амплифицированного фрагмента ДНК осуществляли с использованием плазмиды pJET1.2, используя Clone JET™ PCR Cloning Kit (Fermentas). В результате клонирования было получено 17 клонов, из которых были выделены ДНК. которые были проверены в реакции ПЦР с праймерами LAH+4M2e-F и LAH+4M2e-R.

Положительный ответ дали 11 трансформантов. Из одного из них была выделена плазмидная ДНК и обозначена как pJET1.2-(lah+m2e). Наличие в ней нужной вставки было подтверждено реакцией гидролиза ферментами NdeI и EcoRI, сайты рестрикции которых были заложены в праймеры LAH+4M2e-F и LAH+4M2e-R. Она была переклонирована из плазмиды pJET1.2 в суицидную плазмиду pT7ERMB с геном устойчивости к эритромицину.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pentF-pspf, представляющая собой плазмидную ДНК, полученную в результате вставки суммарного фрагмента ДНК, состоящего из двух отдельных фрагментов гена пробиотика Enterococcus faecium L3 и фрагмента гена pspf описанная в предыдущей заявке на патент №2018144657 «Создание живой вакцины на основе штамма пробиотиков Enterococcus faecium L3 для профилактики инфекции, вызванной Streptococcus pneumonie», (2018) была использована для создания слитого гена entF-(lah+m2e). Для этого из плазмидной ДНК pentF-pspf вырезали вставку гена пневмококка pspf, проведя гидролиз плазмидной ДНК pentF-pspf ферментами NdEI и EcoRI (фиг.2). Полученный верхний фрагмент после гидролиза был использован для дальнейшего клонирования. На фиг. 1 показаны этапы получения конструкции, содержащей LAH+4М2е, где А и Б - проведение ПЦР со специфическими праймерами; В - полученные фрагменты, соответствующие фрагментам LAH и 4m2е; Г - получение единой ДНК, содержащей участки LAH и 4М2е, соединенные между собой гибким линкером.

На фиг. 2 приведена электрофореграмма рестрицированной плазмидной ДНК pentF-pspf ферментами NdEI и EcoRI, где цифрами обозначены:

1 - плазмида pentF-pspf - исходная;

2 - плазмида pentF-pspf рестрицированная;

3-100 п. н. ДНК - маркер (сверху вниз: 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 нуклеотидных пар).

Фрагменты ДНК pSET1.2-(lah+m2e) и pentF-pspf после гидролиза ферментами NdEI и EcoRI выделяли из агарозы с помощью набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Qiagen, USA), лигировали и трансформировали в гетерологичную систему E.coli DH5a. Среда для отбора содержала 500 мкг/мл эритромицина.

Из полученных 17 клонов после трансформации были выделены ДНК, которые были проверены в реакции ПЦР с праймерами LAH+4M2e-F и LAH+4M2e-R. Три трансформанта дали положительный ответ.Из одной из них были выделена плазмида и обозначена, как pentF-(lah+m2e), которая содержала ожидаемую вставку. Наличие вставки подтверждалось гидролизом плазмиды ферментами NdEI и EcoRI. На фиг. 3. представлена электрофореграмма рестрицированной плазмиды NdEI и EcoRI, где 1 -плазмида pentF- (lah+m2e), 2-100 п. н. ДНК - маркер (сверху вниз: 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 нуклеотидных пар). Таким образом, в результате клонирования была получена плазмида pentF-(lah+4m2e) с ожидаемой вставкой и геном устойчивости к эритромицину

Пример 2. Электропорация энтерококков.

Для электропорации энтерококков культуру Enterococcus faecium L3 сеяли в 3 мл бульона Tood-Hewitt (ТНВ) («HiMedia», Индия) и выращивали в течение ночи при 37°С, затем пересевали в 50 мл бульона ТНВ 1 мл ночной культуры и выращивали ее до оптической плотности при длине волны 650 нм 0.3. После этого культуру помещали в лед и затем отмывали трижды в 20 мл 10% глицерина при температуре 40°С, полученный осадок суспендировали в 0.5 мл стерильного раствора глицерола, переосаждали и конечный осадок ресуспендировали в 0.3 мл того же раствора, разлили по 50 мкл в пробирки и проводили электропорацию в кювете с расстоянием между электродами 1 мм при напряжении 2100 В. Во льду к клеткам добавили ДНК (полученную интегративную pentF- (lah+4m2e) плазмиду, 300 нг). Оптимальная продолжительность импульса составила 4-5 миллисекунд. После проведения разряда тока в кювету добавляли 1 мл ТНВ, инкубировали 1 час и высевали на чашки с селективной средой, которая содержала 10 мкг/мл эритромицина. Затем ожидали появления трансформантов через 24 часа.

В результате электропорации энтерококков созданной интегративной плазмидой pentF-(lah+m2e) было получено 15 трансформантов. Они были проверены в реакции ПЦР с праймерами. LAH+4M2e-F и LAH+4M2e-R. Для этого из трансформантов выделяли ДНК, используя набор ДНК-экспресс (Литех, Россия). Положительный ответ дали все трансформанты, как показано на фиг. 4, где представлена электрофореграмма амплифицированных ДНК-фрагментов, а именно: 1 - 15 - продукты ПЦР ДНК из полученных клонов; 16 - 100 п. н. ДНК - маркер (сверху вниз: 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 нуклеотидных пар); 17 - продукт ПЦР плазмидной ДНК pentF-{lah+4m2e).

Из них выбрали один и обозначили его как L3-(LAH+4M2e). Была проведена амплификация ДНК, выделенной из этого клона с праймерами В1 и LAH+4M2e-R для проведения секвенирования для подтверждения интеграции плазмидной ДНК pentF-(lah+4m2e) в хромосомную ДНК энтерококка. На фиг. 5 представлена нуклеотидная последовательность, показывающая интеграцию плазмидной ДНК pentF-(lah+m2e) в хромосомную ДНК энтерококка.

Жирным шрифтом выделены последовательности праймеров В1 и LAH+4M2e-R. Этот клон энтерококков, экспрессирующий ген LAH+4M2e белка, L3- (LAH+4M2e), выбран в качестве вакцинного препарата для дальнейшего исследования.

Пример 3. Анализ иммуногенной активности живой пробиотической вакцины

Мышей разделили на две группы. Первой группе мышей с помощью адаптера в пищевод вводили 5×10⁹ КОЕ пробиотика Enterococcus faecium L3 в объеме 300 мкл. Второй группе в том же режиме вводили живую пробиотическую вакцину Enterococcus faecium L3 (LAH+4M2e). Курс вакцинации состоял в ежедневном введении бактерий в течение трех дней подряд. Курс вакцинации повторяли три раза с интервалом в две недели.

После проведения трех курсов вакцинации per os в крови было достоверно зарегистрировано накопление сывороточных IgG антител против М2е белка у мышей. Титры антител в группе вакцины L3-(LAH+4M2e) достигали 1: 80, в то время как в контрольной группе повышения антител не наблюдалось (фиг. 6А). На фиг. 6 представлен иммунный ответ к антигену вируса гриппа в иммуноферментном анализе (уровни сывороточных IgG к М2е белку).

Установлено, что титры сывороточных IgG антител, связывающих белок LAH, незначительно различались в контрольной и исследуемой группе (фиг. 7). Это может быть связано с наличием в составе Enterococcus faecium L3 белков, антигенно сходных с LAH, что может являться причиной перекрестной реактивности антител. На фиг. 7 представлен иммунный ответ к антигену вируса гриппа в иммуноферментном анализе (уровни сывороточных IgG к LAH белку).

Пример 4. Анализ протективной эффективности живой пробиотической вакцины.

Вакцинированных per os мышей заражали высокой дозой вируса гриппа Са109 МА и наблюдали в течение следующих 14 дней. Мыши, вакцинированные L3-(LAH+4M2e), в процессе инфекции продемонстрировали менее выраженную потерю веса по сравнению с контрольной группой. Животные из группы L3-(LAH+4M2e) выздоравливали быстрее и имели значительно меньшую смертность, чем контрольная группа, как показано на фиг. 8, где (А) - потеря веса и (Б) - выживаемость мышей после заражения вирусом Ca109 МА).

Однако, через шесть дней после заражения не было отмечено достоверного снижения титра вируса в легких у вакцинированных групп по сравнению с контролем. Возможно, этот результат объясняется не нейтрализующей природой М2е-антител и наличием высокой перекрестной реактивности поверхностных белков L3 с вакцинным белком LAH вируса гриппа.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ФГБНУ "ИЭМ"

<120> Живая пробиотическая вакцина, содержащая консервативные эпитопы вируса

гриппа А (LAH+4M2e), для профилактики гриппозной инфекции

<140>

<141>

<150>

<151>

<160> 2

<170>

<210> 1

<211> 1674

<212> Нуклеотидная последовательность

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность (LAH+4M2e) вируса гриппа А,

экспрессированная в системе Escherichia coli

<400> 1

atgagagcag ctggtattga gttgaatgat acatttctat ctatttacag tttaaatgga 60

cagtatcagc aacgtgtgtc ttggtataat gacaataatg aatctgtcgg tgaacgtaat 120

attgatatga gagaatttgt tgggtatgaa aaaatgggta gcttacctta ttttgtcaca 180

acagatacag catgtgcaga atacaaagct cctgcgttat caacaaacaa tttaacttca 240

aaagtagtgg gaggacgtgc agaaaaggct tatagctcga atgatcattt caccgatgtt 300

gtaggagctg atacttatca cagaagtggt gtaacgtata cgcttcaagg cgcttcccca 360

acattcatga ttggcgcaaa tacgaatagt atgatgttta gctttgatac tgcattgcta 420

tggacaccac aaccatcgaa gcctacaaaa gaagtgttta acaaagctaa tactgaagag 480

gcagcacaca atattgacaa aaaagtgatt ccacaaggat cagatgttta ctatcatatt 540

catcaaaagt ttgatgcatt aacagtcaac acaatgaaca aatacaaatc atttaaaatc 600

actgatacct ttgacagcaa aaattttgat atggtatcgg atgggaaaaa ctatgatggc 660

gcattgcata tgaatacaca gttcacagca gtaggtaaag agttcaacca cctggaaaaa 720

agaatagaga atttaaataa aaaagttgat gatggtttcc tggacatttg gacttacaat 780

gccgaactgt tggttctatt ggaaaatgaa agaactttgg actaccacga ttcaaatgtg 840

aagaacttat atgaaaaggt aagaagccag ctaaaaaaca atgccgaatt cgtcgacagc 900

cttctaaccg aggtcgaaac acctatcaga aacgaatggg ggtccagatc caacgattca 960

agtgacgctg ctgcaggtgg agcagctagc cttctaaccg aggtcgaaac acctatcaga 1020

aacgaatggg ggtccagatc caacgattca agtgacgctg ctgcaccagg agcagctagt 1080

cttctaaccg aggtcgaaac gcctaccaga agcgaatggg agtccagatc cagcgattca 1140

agtgatgctg ctgcaggtgg agcagctagt cttctaaccg aggtcgaaac gcctaccaga 1200

aacgaatggg agtcgcgctc gtctgacagt tcagatgaat tctacgaaaa aaacctgaaa 1260

gaatacaccg acaagctgga taaactcgag aaaggttctg cgcgagtgat agatatgagt 1320

acaggaaaag atattacttc agaaggtaca ctaacctatg atagcaattt aagaacgctg 1380

aaatgggaag cttccgctga tttcttaagt aaaaatcttt tagatggacg agaaattcaa 1440

ctgatattta cagctaaaac tccactacag tcagaaaaaa atattgataa ccaagccgta 1500

gcagcagtag agaatgtttc taataaaacg aatgttgtaa caattggtgt tgatcctaac 1560

ttaccacaag tcattgttcc tagaacaggt tctacacatt tagtaacaat tttagtggtt 1620

agcttagtat tacttgtgtt agctactctt agttatgtgg ctctgaagtt caat 1674

<210> 2

<211> 558

<212> Аминокислотная последовательность

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность гибридного белка LAH+4M2e

<400> 2

Met Arg Ala Ala Gly Ile Glu Leu Asn Asp Thr Phe Leu Ser Ile Tyr

5 10 15

Ser Leu Asn Gly Gln Tyr Gln Gln Arg Val Ser Trp Tyr Asn Asp Asn

20 25 30

Asn Glu Ser Val Gly Glu Arg Asn Ile Asp Met Arg Glu Phe Val Gly

35 40 45

Tyr Glu Lys Met Gly Ser Leu Pro Tyr Phe Val Thr Thr Asp Thr Ala

50 55 60

Cys Ala Glu Tyr Lys Ala Pro Ala Leu Ser Thr Asn Asn Leu Thr Ser

65 70 75 80

Lys Val Val Gly Gly Arg Ala Glu Lys Ala Tyr Ser Ser Asn Asp His

85 90 95

Phe Thr Asp Val Val Gly Ala Asp Thr Tyr His Arg Ser Gly Val Thr

100 105 110

Tyr Thr Leu Gln Gly Ala Ser Pro Thr Phe Met Ile Gly Ala Asn Thr

115 120 125

Asn Ser Met Met Phe Ser Phe Asp Thr Ala Leu Leu Trp Thr Pro Gln

130 135 140

Pro Ser Lys Pro Thr Lys Glu Val Phe Asn Lys Ala Asn Thr Glu Glu

145 150 155 160

Ala Ala His Asn Ile Asp Lys Lys Val Ile Pro Gln Gly Ser Asp Val

165 170 175

Tyr Tyr His Ile His Gln Lys Phe Asp Ala Leu Thr Val Asn Thr Met

180 185 190

Asn Lys Tyr Lys Ser Phe Lys Ile Thr Asp Thr Phe Asp Ser Lys Asn

195 200 205

Phe Asp Met Val Ser Asp Gly Lys Asn Tyr Asp Gly Ala Leu His Met

210 215 220

Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn His Leu Glu Lys

225 230 235 240

Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile

245 250 255

Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr

260 265 270

Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Arg

275 280 285

Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Glu Phe Val Asp Ser Leu Leu Thr Glu

290 295 300

Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser

305 310 315 320

Ser Asp Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu

325 330 335

Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp

340 345 350

Ala Ala Ala Pro Gly Ala Ala Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro

355 360 365

Thr Arg Ser Glu Trp Glu Ser Arg Ser Ser Asp Ser Ser Asp Ala Ala

370 375 380

Ala Gly Gly Ala Ala Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg

385 390 395 400

Asn Glu Trp Glu Ser Arg Ser Ser Asp Ser Ser Asp Glu Phe Tyr Glu

405 410 415

Lys Asn Leu Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Leu Asp Lys Leu Glu Lys Gly

420 425 430

Ser Ala Arg Val Ile Asp Met Ser Thr Gly Lys Asp Ile Thr Ser Glu

435 440 445

Gly Thr Leu Thr Tyr Asp Ser Asn Leu Arg Thr Leu Lys Trp Glu Ala

450 455 460

Ser Ala Asp Phe Leu Ser Lys Asn Leu Leu Asp Gly Arg Glu Ile Gln

465 470 475 480

Leu Ile Phe Thr Ala Lys Thr Pro Leu Gln Ser Glu Lys Asn Ile Asp

485 490 495

Asn Gln Ala Val Ala Ala Val Glu Asn Val Ser Asn Lys Thr Asn Val

500 505 510

Val Thr Ile Gly Val Asp Pro Asn Leu Pro Gln Val Ile Val Pro Arg

515 520 525

Thr Gly Ser Thr His Leu Val Thr Ile Leu Val Val Ser Leu Val Leu

530 535 540

Leu Val Leu Ala Thr Leu Ser Tyr Val Ala Leu Lys Phe Asn

545 550 555 558

<---

1. Живая пробиотическая вакцина, предназначенная для профилактики инфекции, вызванной вирусом гриппа А, на основе биологически активного штамма Enterococcus faecium L3, содержащая в структуре его пилей антиген клинически актуального гибридного белка вируса гриппа, состоящего из консервативного участка молекулы гемагглютинина LAH и четырех тандемных повторов эктодомена М2 белка вируса гриппа А.

2. Способ создания живой пробиотической вакцины по п. 1, заключающийся в получении слитого гена entF-(lah+4m2e) и его клонировании, выявлении клонов, экспрессирующих нужный белок в пилях, иммунизации мышей живой пробиотической вакциной и определении белок-специфических антител в крови.