Способ флюоресцентной гибридизации in situ при применении днк-зонда с меткой fgfr1 у разных видов млекопитающих на гистологических препаратах

Авторы патента:

G01N33/53 - иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого (препараты для терапевтических целей, содержащие антигены или антитела,A61K; гептены вообще, см. соответствующие рубрики в классе C07; пептиды, например протеины, вообще C07K)

G01N1/28 - Исследование или анализ материалов путем определения их химических или физических свойств (разделение материалов вообще B01D,B01J,B03,B07; аппараты, полностью охватываемые каким-либо подклассом, см. в соответствующем подклассе, например B01L; измерение или испытание с помощью ферментов или микроорганизмов C12M,C12Q; исследование грунта основания на стройплощадке E02D 1/00;мониторинговые или диагностические устройства для оборудования для обработки выхлопных газов F01N 11/00; определение изменений влажности при компенсационных измерениях других переменных величин или для коррекции показаний приборов при изменении влажности, см. G01D или соответствующий подкласс, относящийся к измеряемой величине; испытание

C12Q1/6813 - Способы измерения или испытания, использующие ферменты или микроорганизмы (устройства для измерения или испытания при работе с ферментами или микроорганизмами, например счетчики колоний C12M 1/34); составы для них; способы получения подобных составов

Владельцы патента RU 2777238:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ставропольский государственный аграрный университет" (RU)

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, а именно к лабораторной диагностике. При проведении реакции флуоресцентной гибридизации in situ на гистологических препаратах опухоли молочной железы у собак и кошек используют ДНК-зонд FGFR1 Breakapart/Amplification Probe. Способ сокращает время обработки материала, повышает точность диагностики при определении онкологического процесса. 3 ил.

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к ветеринарной медицине, а именно к лабораторной диагностике и может быть использовано для гистологических срезов, сделанных при биопсии опухоли молочной железы в ходе хирургической операции. Это основано на применении тест-системы из специальных ДНК-зондов с меткой FGFR1 для проведения реакции флуоресцентной in situ гибридизации (fluorescent in situ hybridization - FISH).

Уровень техники

Известен способ выполнения флюоресцентной гибридизации in situ на гистологических парафиновых срезах планарной ткани (Jordi Solana, RNA In Situ Hybridizationon Planarian Paraffin Sections MethodsMolBiol. 2018; 1774: 393-404. doi: 10.1007/978-1-4939-7802-1_13), в котором полученные участки от планарий гибридизуруют с гаптен-мечеными РНК-зондами. Последующее иммунологическое зондовое обнаружение проводят либо с хромогенным, либо с флуоресцентным проявлением, чтобы визуализировать экспрессию генов с клеточным или субклеточным разрешением.

Недостатком данного способа является долгая обработка в промывочных буферах (кол-во 6) перед использованием РНК-зонда. А также относительный дефицит определенных структур доступных антител для планарных белков.

Известен способ амплификации гена HER2 с помощью флуоресценцией in situ гидридизации при карциноме молочной железы у кошек (HER2 Amplification Status in Feline Mammary Carcinoma: A Tissue Microarray - Fluorescence In Situ Hydridization - Based Study» Luisa Vera Muscatello, 1.10.2018). Целью этого способа была оценка эпителиального фактора роста (HER2), статус амплификации гена и его корреляция с экспрессией белка HER2 в карциномах молочной железы кошек, с помощью иммуногистохимического метода (ИГХ) и флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).

Недостатком способа является, что проводят исследование только на амплификацию гена HER2.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятый авторами за прототип является способ флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда FGFR1 у разных видов млекопитающих на цитологических препаратах (патент RU 2755391). При котором FISH-реакцию проводят на цитологическом материале, отобранного при помощи тонкоигольной аспирационной биопсии из опухолей молочных железу собак и кошек.

Недостатками способа заключаются низкая достоверность для некоторых типов опухолей (связана с особенностями их строения), а также исследование ограниченного участка патологической ткани (только тех клеток, которые попадут на стекло при взятии биопсии).

Раскрытие изобретения

Задачей заявляемого изобретения является разработка тест-системы для исследования и определения редких типов опухолей молочной железы.

Технический результат, который может быть получен с помощью предлагаемого способа, сводится к повышению точности диагностики при определении онкологического процесса.

Технический результат достигается способа флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда с меткой FGFR1 у разных видов млекопитающих на гистологических препаратах, включающий взятие на исследование кусочка ткани, который фиксируют в фиксаторе, а затем заключают в расплавленный парафиновый воск, после чего восковой блок с образцом ткани, режут на микротоме для получения тонких срезов парафина, содержащих ткань, типично от 3 до 4 микрон толщины, с последующим нанесением срез образца на предметное стекло, высушиванием на воздухе и нагреванием, после того как срез зафиксирован удаляют парафин путем окунания стекол в две порции ксилола - 5 минут в каждой и две порции спирта 96% - по 5 минут в каждой, после чего проводят ополоскивание в 70% спирте и дистиллированной воде, далее наносят на парафиновый срез примерно 200 мкл раствора пепсина Pepsin Solution и инкубируют 15 минут, затем промывают в дистиллированной воде и помещают в раствор 2×SSC на 5 минут, после дегидратируют препараты в 70% спирте - 1 минута, в двух порциях 96% спирта - по 1 минуте в каждой и высушивают на воздухе в течение 20 минут, после чего наносится ДНК-зонд FGFR1 Breakapart/Amplification Probe, с последующей денатурацией в автоматической FISH- системе в течение 5 минут при 80°С и гибридизацией при 37°С 16-18 часов, затем проводят отмывание буферными растворами в течение 3 минут и наносят флюоресцентный краситель DAPI.

Фибробласты управляют морфогенезом эпителия молочной железы через передачу сигналов паракринной связи, которая между стромальными и эпителиальными клетками является двунаправленной, т.е. эпителиальные клетки также сигнализируют стромальным клеткам. Одним из таких является фактор роста фибробластов 1 (FGF1) - циркулирующий белок, состоящий из 181 аминокислот, который способен стимулировать пролиферацию фибробластов, а также участвует в регуляции клеточной миграции и выживания, регенерации тканей, в процессах ангиогенеза и нейрогенеза. При наличии аберрантно активированных стромальных клеток, особенно миофибробластов, может произойти нарушение сигнального пути FGF1, что может привести к злокачественной трансформации эпителиальных клеток в молочной железе, которая способствует развитию опухолевого роста.

Рецептор, кодирующий FGFR1, локализуется на хромосоме 8 в локусе p11.23 (8p11.23), преимущественно всего его обнаруживают на плазматической мембране и цитоплазме, включая аппарат Гольджи. При наличии опухолевой патологии данный ген подвергается многообразным изменениям, в том числе амплификации и мутации в различных экзонах.

В настоящее время в опубликованных источниках отсутствуют какие-либо данные о применении флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда с меткой FGFR1 на гистологических срезах опухоли молочной железы у лабораторных (крысы) и домашних млекопитающих (кошка, собака) животных. Понимание того, как сигнальные пути фибробластов регулируют развитие молочной железы, можно дать представление о механизме биологии рака молочной железы (РМЖ).

Краткое описание чертежей и иных материалов

Фиг. 1 - сигнал Fibroblast Growth Factor Receptor 1 (FGFR1) в клетке фибробластического дифферона у собаки. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH). Фильтр FITC (зеленое свечение). Ок. 15, об. 100.

Фиг. 2 - сигнал Fibroblast Growth Factor Receptor 1 (FGFR1) в клетке фибробластического дифферона у собаки. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH). Фильтр Texas Red (красное свечение). Ок. 15, об. 100.

Фиг. 3 - количество клеток с сигналами гена FGFR1.

Осуществление изобретения

Исследования проводят на базе Научно-диагностического и лечебного ветеринарного центра ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет» в гистологической лаборатории.

Гистологическое исследование материала опухоли молочных желез, отобранного при биопсии в ходе хирургической операции, осуществляют следующим образом: для приготовления образца ткани для гистологического исследования кусочки ткани фиксируют в фиксаторе (формальдегид), а затем заключают в расплавленный парафиновый воск. Затем восковой блок, содержащий образец ткани, режут на микротоме для получения тонких срезов парафина, содержащих ткань, типично от 3 до 4 микрон толщины. Потом срез образца наносят на предметное стекло, высушивают на воздухе и нагревают, чтобы вызвать приклеивание образца к предметному стеклу.

Далее удаляют парафин (депарафинизация и регидратация) путем окунания стекол в 1 порции ксилола -5 минут, во 2 порции ксилола -5 минут, затем окунали в 1 порцию спирта 96% - 5 минут, 2 порцию спирта 96% - 5 минут и полоскание в 70% спирте, затем полоскание в дистиллированной воде. После чего наносят на парафиновый срез примерно 200 мкл раствора пепсина (Pepsin Solution) и инкубируют 15 минут. Затем промывают в дистиллированной воде и помещают в раствор 2×SSC на 5 минут, после дегидратируют препараты в 70% спирте и после дегидратируют препараты в 70% спирте - 1 минута, в 1 порции 96% спирта -1 минута, во 2 порции 96% спирта -1 минута и высушивают на воздухе в течение 20 минут.

Далее накрывают каждый гистологический материал квадратным покровным 24×24 мм²стеклом и наносят по краям покровного стекла универсальный резиновый клей Момент «Кристалл» для герметизации, который согласно проведенным исследованиям имеет высокую прочность склеивания, водостойкость клеевого соединения, теплостойкость и легкое снятие без повреждения исследуемого материала после проведения денатурации и гибридизации (https://dm.henkel-dam.com/is/content/henkel/TDS-003003-RU-Moment-Contact-Crystal-tube).

Проводят денатурацию на автоматической FISH-гибридизационной системе «ThermoBrite», (кампания StatSpin), устанавливают стекла на пластину и вставляют две увлажняющие полоски, смоченные в ультрачистой ионизированной воде, в держатели на внутренней стороне крышки (https://manualzz.com/doc/4619533/wasser-bi-destillationsapparate-water-stills-for). Далее устанавливают программу «Денатурация и Гибридизация». Денатурация - это когда молекула ДНК приобретает вид одноцепочечной нити. При реакции гибридизации происходит взаимодействие ДНК-зонда и комплементарным ему участком ядерной ДНК материала.

Денатурируют материал при 80°С - 5 минут. Потом происходит автоматическое охлаждение столика, на котором расположены предметные стекла, после чего происходит автоматическая гибридизация. При гибридизации инкубируют препараты в течение 18 часов при температуре 37°С у собак и 16 часов при температуре 37°С у кошек, в связи с разным сцеплением белков с ДНК-зондом.

После гибридизации удаляют клей с краев покровного стекла и при помощи гистологической иглы снимают стекло. Затем следует отмывка, в предварительно нагретый отмывочный буфер Prewarm Wash Buffer 1 (0,4×SSC / 0,3% lgepal) до 72°С вносят стекла на 2 минуты. После чего стекла быстро (чтобы не высохли клетки) промакивают вокруг исследуемых зон одноразовыми бумажными полотенцами для создания сухого поля вокруг материала и наносят гидрофобный слой восковым маркером (для предотвращения растекания реактивов). Далее наносят при помощи 1-канальной автоматической пипетки (Eppendorf Reference 2, 0,5-10 мкл) 20 мкм буфера Wash Buffer 2 (2×SSC / 0,1% lgepal) на 1 минуту. Промакивают препараты бумажными полотенцами и наносят с помощью автоматической пипетки (Eppendorf Reference 2, 0,5-10 мкл) 15 мкл контрастирующего красителя DAPI/Antifadec0.1, содержащий флюорохромом, после чего накрывают каждое предметное стекло покровным стеклом размерами 24×60 мм².

После этого помещают в термостат при температуре 25°С, при этом время выдержки в термостате предметных стекол с флюорохромом для собак составляет 10 минут, для кошек составляет 15 минут. Затем предметные стекла с исследуемым цитологическим материалом помещают под темную светонепроницаемую пластину, после чего поочередно анализируют каждый препарат при помощи флюоресцентного микроскопа, остальные стекла с материалом остаются под темной светонепроницаемой пластиной во избежание попадания света, что влияет на экспрессию свечения.

Таким образом, время на проведение FISH-реакции составляет примерно 19 часов.

Способ флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда с меткой FGFR1 у разных видов млекопитающих на гистологических препаратах: выполняется следующим образом материал, полученный от собак под номерами №1, 3, 5 показал наличие флюоресцирующих сигналов под фильтрами Texas Red (красный) и FITC (зеленый), что означает среднее количество копий гена FGFR1 на клетку регистрировалось ≥6, свечения сигналов были выражены, что говорит об амплификации гена в клетках фибробластического дифферона, их активной пролиферации и синтеза белка коллагена. Материал под №2 показал среднее количество копий гена FGFR1 на клетку ≥4 и <6 (амплификация неопределенная), в то время у № 3 показал количество копий гена <4, что говорит об отсутствии амплификации гена FGFR1.

Таким образом, при патогистологическом исследовании были диагностированы такие новообразования, как папиллярная аденокарцинома, тубулярная аденокарцинома.

Материал, полученный от кошек под номерами №2, 3 ,5 показал наличие флюоресцирующих сигналов под фильтрами Texas Red/FITC, что означает среднее количество копий гена FGFR1 на клетку регистрировалось ≥6. Свечения сигналов были выражены, что говорит об амплификации гена FGFR1 в клетках фибробластического дифферона. Материал под №1 показал среднее количество копий гена FGFR1 на клетку ≥4 и <6 (амплификация неопределенная), в то время у №4 показал количество копий гена <4, что говорит об отсутствии амплификации гена FGFR1.

При патогистологическом исследовании были диагностированы такие новообразования, как папиллярная аденокарцинома, плеоморфная аденокарцинома.

Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:

- непродолжительное время обработки материала;

- высокое разрешение локализации экспрессии свечения и большая чувствительность на клеточном и даже субклеточном уровнях, благодаря значительно уменьшенной толщины ткани;

- высокая оценка флюоресцентного сигнала и его интенсивность;

- снижение стоимости гистологического препарата за счет малого расхода жидких реактивов и буферов.

Способ флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда с меткой FGFR1 у собак и кошек на гистологических препаратах, включающий взятие на исследование кусочков тканей опухолей молочной железы у собак и кошек, который фиксируют в фиксаторе, а затем заключают в расплавленный парафиновый воск, после чего восковой блок с образцом ткани режут на микротоме для получения тонких срезов парафина, содержащих ткань, с последующим нанесением среза образца на предметное стекло, высушиванием на воздухе и нагреванием, после того как срез зафиксирован, удаляют парафин путем окунания стекол в две порции ксилола - 5 минут в каждой и две порции спирта 96% - по 5 минут в каждой, после чего проводят ополоскивание в 70% спирте и дистиллированной воде, далее наносят на парафиновый срез 200 мкл раствора пепсина Pepsin Solution и инкубируют 15 минут, затем промывают в дистиллированной воде и помещают в раствор 2×SSC на 5 минут, после дегидратируют препараты в 70% спирте – 1 минута, в двух порциях 96% спирта – по 1 минуте в каждой и высушивают на воздухе в течение 20 минут, после чего наносится ДНК-зонд FGFR1 Breakapart/Amplification Probe с последующей денатурацией в автоматической FISH- системе в течение 5 минут при 80°С и гибридизацией при 37°С 16-18 часов, затем проводят отмывание буферными растворами в течение 3 минут и наносят флюоресцентный краситель DAPI.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ преимплантационного генетического тестирования муковисцидоза, предусматривающий выявление наследования патогенных вариантов NC_000007.13:g.l 17199646-117199648delCTT NM_000492.3: с.

Мониторинг терапии при лечении связывающим веществом против адреномедуллина (adm) // 2776811

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу мониторинга терапии у субъекта. Субъект проходит лечение веществом, связывающим анти-адреномедуллин (ADM), выбранным из группы, включающей антитело, фрагмент антитела и/или не-Ig каркас, связывающийся с SEQ ID NO.1.

Способ прогнозирования неустойчивой терапевтической ремиссии при алкогольной зависимости // 2776568

Изобретение относится к медицине, а именно к наркологии, и может быть использовано для прогноза неустойчивой терапевтической ремиссии у больных алкоголизмом. Для этого у больных с алкогольной зависимостью, поступивших в стационар в состоянии синдрома отмены, проводят взятие крови после алкогольной детоксикации и определяют в сыворотке крови концентрацию гормона щитовидной железы тироксина свободного (Т4 св.).

Способ выявления заражения людей и животных sars cov2 и диагностический набор для осуществления способа // 2776295

Группа изобретений относится к области медицины, в т.ч. ветеринарной медицины, в частности к серологической диагностике инфекционных болезней общих для человека и животных (к ним относится и COVID 19).

Способы и композиции для определения активности терапевтической клеточной композиции // 2775967

Группа изобретений относится к определению активности терапевтической клеточной композиции. Раскрыт способ определения активности образца, содержащего вспомогательные клетки (FC) и/или альфа-бета TCR+ T-клетки, включающий приведение образца, содержащего FC и/или альфа-бета TCR+ T-клетки, в контакт с митогенным стимулом; и определение числа FC и/или альфа-бета TCR+ T-клеток в образце, в которых рибосомный белок S6 фосфорилирован (pS6); где число FC и/или альфа-бета TCR+ T-клеток в образце, в которых pS6 фосфорилирован, характеризует активность FC и/или альфа-бета TCR+ T-клеток, соответственно, в образце, где способ осуществляют перед замораживанием FC и/или альфа-бета TCR+ T-клеток или осуществляют на FC и/или альфа-бета TCR+ T-клетках, которые были заморожены.

Контрольный пункт для пропуска людей, не представляющих угрозы заражения окружающих вирусным заболеванием с аэрозольным распространением // 2775882

Изобретение относится к медицинской технике, а именно к контрольному пункту для пропуска людей, не представляющих угрозы заражения окружающих вирусным заболеванием с аэрозольным распространением. Пункт содержит средство подачи воздуха, а также по меньшей мере одну управляемую преграду и средство управления этой преградой в зависимости от показаний средств приема и тестирования воздуха.

Способ оценки эффективности лечения внутривенными иммуноглобулинами у пациенток с привычным невынашиванием и циркуляцией антифосфолипидных антител // 2775311

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии. Способ подтверждения эффективности лечения внутривенными иммуноглобулинами у пациенток с привычным невынашиванием и циркуляцией антифосфолипидных антител включает иммуногистохимическое исследование плаценты путем определения относительной площади экспрессии аннексина V, равной 15% и более, которую рассчитывают по формуле: , где S% - относительная площадь экспрессии аннексина V; S позитив – значение площади иммунопозитивных клеток; S общая – значение площади препарата.

Проадреномедуллин в качестве маркера, указывающего на неблагоприятное событие // 2775090

Изобретение относится к медицинской диагностике. Раскрыт способ прогнозирования летального исхода у субъекта, страдающего от сепсиса, включающий определение уровня проадреномедуллина (проАДМ) в образце данного субъекта, где уровень проАДМ ниже 0,88 нмоль/л указывает на выживание субъекта в течение приблизительно 28 дней, и при этом субъект имеет оценку по шкале динамической оценки органной недостаточности (шкале SOFA) ≤ 6.

Способ лечения воспалительных заболеваний мультивалентными fc соединениями // 2774318

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к терапии, и предназначена для лечения воспалительного или аутоиммунного заболевания. Способ лечения воспалительного или аутоиммунного заболевания у пациента с диагностированным неадекватным ответом на мульти-Fc терапевтическое средство включает введение первой кумулятивной повышенной дозы мульти-Fc терапевтического средства в дозе по меньшей мере 105% от начальной дозы указанного мульти-Fc терапевтического средства в течение первого периода дозирования.

Способ прогнозирования обострений хронической обструктивной болезни легких у лиц, работающих в условиях воздействия промышленных аэрозолей // 2774206

Изобретение относится к медицине, а именно к медицине труда и пульмонологии, и может быть использовано для прогнозирования обострений хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) в течение последующего года у лиц, работающих в условиях воздействия промышленных аэрозолей. У пациента с установленным диагнозом профессионально обусловленной ХОБЛ (ПО ХОБЛ) определяют показатели максимальных разовых концентраций (МРК) пыли, содержащей диоксид кремния (МРК SiO2), алюминия и его сплавов (МРК А1), озона (МРК О3) в воздухе рабочей зоны больного.

Способ прогнозирования церебральной ишемии у новорожденных, родившихся от матерей с преэклампсией // 2777225

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, неонатологии, и может быть использовано для прогнозирования церебральной ишемии у новорожденных путем обследования беременных женщин. У беременных женщин с преэклампсией в сроке гестации 30 – 40 недель при поступлении в стационар до начала терапии артериальное давление (АД) измеряют двукратно на одной руке с интервалом не менее 1 минуты.