Композиции и соответствующие способы контроля заболеваний, передаваемых переносчиками

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к способу снижения приспособленности насекомого-переносчика к патогену животного, при этом способ включает: доставку насекомому-переносчику композиции, содержащей противомикробный пептид и пептид, проникающий в клетку, где противомикробный пептид нацелен на микроорганизм, обитающий в организме насекомого-переносчика, что приводит к снижению приспособленности насекомого-переносчика по сравнению с контрольным насекомым-переносчиком, не обработанным композицией, где противомикробный пептид включает один или более из следующих: Uy192 (SEQ ID NO: 227), UyCT3 (SEQ ID NO: 228), D3 (SEQ ID NO: 229), D10 (SEQID NO: 230) и Uy17 (SEQ ID NO: 231), и пептид, проникающий в клетку, имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 213-220, и также относится к композиции для снижения приспособленности насекомого-переносчика к патогену животного, содержащей противомикробный пептид и пептид, проникающий в клетку, где противомикробный пептид нацелен на микроорганизм, обитающий в насекомом-переносчике, что приводит к снижению приспособленности насекомого-переносчика по сравнению с контрольным насекомым-переносчиком, не обработанным композицией, где противомикробный пептид включает один или более из следующих: Uy192 (SEQ ID NO: 227), UyCT3 (SEQ ID NO: 228), D3 (SEQ ID NO: 229), D10 (SEQ ID NO: 230) и Uy17 (SEQ ID NO: 231), и пептид, проникающий в клетку, имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 213-220. Группа изобретений обеспечивает разработку способов и композиций для контроля насекомых, которые переносят заболевания, передаваемые переносчиками. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 85 ил., 28 пр., 12 табл.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке США № 62/450032, поданной 24 января 2017 г., и предварительной заявке США № 62/583925, поданной 9 ноября 2017 г., содержание которых включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Насекомые выступают в роли переносчиков патогенов, вызывающих серьезные заболевания у человека и животных, такие как лихорадка денге, трипаносомоз и малярия. Заболевания, передаваемые переносчиками, которые инфицируют животных, таких как домашний скот, представляют большую нагрузку для системы здравоохранения во всем мире. Таким образом, в данной области техники имеется потребность в способах и композициях для контроля насекомых, которые переносят заболевания, передаваемые переносчиками.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе раскрыты композиции и способы для модулирования приспособленности насекомых для контроля распространения заболеваний, передаваемых переносчиками, у животных. Композиция содержит средство, которое изменяет уровень, активность или метаболизм одного или нескольких микроорганизмов, обитающих в организме хозяина, при этом изменение приводит к модулированию приспособленности хозяина.

В одном аспекте в данном документе предусмотрен способ снижения приспособленности переносчика (например, насекомого-переносчика) патогена животного, при этом способ предусматривает доставку противомикробного пептида, характеризующегося по меньшей мере 90% идентичностью последовательности (например, по меньшей мере 90%, 92%, 94%, 96%, 98% или 100% идентичностью последовательности) с одним или несколькими из следующих: цекропина (SEQ ID NO: 82), мелиттина, копсина, дрозомицина (SEQ ID NO: 93), дермсидина (SEQ ID NO: 81), андропина (SEQ ID NO: 83), морицина (SEQ ID NO: 84), цератотоксина (SEQ ID NO: 85), абецина (SEQ ID NO: 86), апидецина (SEQ ID NO: 87), профенина (SEQ ID NO: 88), индолицидина (SEQ ID NO: 89), протегрина (SEQ ID NO: 90), тахиплезина (SEQ ID NO: 91) или дефензина (SEQ ID NO: 92), переносчику.

В некоторых вариантах осуществления доставка включает доставку противомикробного пептида в по меньшей мере одну среду обитания, в которой переносчик растет, живет, размножается, питается или осуществляет заражение.

В некоторых вариантах осуществления противомикробный пептид может быть доставлен в композиции, съедобной для насекомого, для поглощения переносчиком.

В некоторых вариантах осуществления противомикробный пептид может быть составлен в виде жидкой, твердой, аэрозольной, пастообразной, гелеобразной или газообразной композиции.

В некоторых вариантах осуществления насекомое может являться по меньшей мере одним из комара, галлицы, вши, москита, иксодового клеща, триатомового клопа, мухи цеце или блохи.

В другом аспекте в данном документе предусмотрена композиция, содержащая противомикробный пептид, характеризующийся по меньшей мере 90% идентичностью последовательности (например, по меньшей мере 90%, 92%, 94%, 96%, 98% или 100% идентичностью последовательности) с одним или несколькими из следующих: цекропина (SEQ ID NO: 82), мелиттина, копсина, дрозомицина (SEQ ID NO: 93), дермсидина (SEQ ID NO: 81), андропина (SEQ ID NO: 83), морицина (SEQ ID NO: 84), цератотоксина (SEQ ID NO: 85), абецина (SEQ ID NO: 86), апидецина (SEQ ID NO: 87), профенина (SEQ ID NO: 88), индолицидина (SEQ ID NO: 89), протегрина (SEQ ID NO: 90), тахиплезина (SEQ ID NO: 91) или дефензина (SEQ ID NO: 92), составленная для целенаправленного воздействия на микроорганизм в переносчике (например, насекомом-переносчике) патогена животного.

В некоторых вариантах осуществления второго аспекта противомикробный пептид может находиться в композиции в концентрации от приблизительно 0,1 нг/г до приблизительно 100 мг/г (от приблизительно 0,1 нг/г до приблизительно 1 нг/г, от приблизительно 1 нг/г до приблизительно 10 нг/г, от приблизительно 10 нг/г до приблизительно 100 нг/г, от приблизительно 100 нг/г до приблизительно 1000 нг/г, от приблизительно 1 мг/г до приблизительно 10 мг/г, от приблизительно 10 мг/г до приблизительно 100 мг/г) или от приблизительно 0,1 нг/мл до приблизительно 100 мг/мл (от приблизительно 0,1 нг/мл до приблизительно 1 нг/мл, от приблизительно 1 нг/мл до приблизительно 10 нг/мл, от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл, от приблизительно 100 нг/мл до приблизительно 1000 нг/мл, от приблизительно 1 мг/мл до приблизительно 10 мг/мл, от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 100 мг/мл).

В некоторых вариантах осуществления второго аспекта противомикробный пептид может дополнительно содержать нацеливающий домен.

В некоторых вариантах осуществления второго аспекта противомикробный пептид может дополнительно содержать пептид, проникающий в клетку.

В еще одном аспекте композиция содержит средство, которое изменяет уровень, активность или метаболизм одного или нескольких микроорганизмов, обитающих в организме насекомого-хозяина, при этом изменение приводит к снижению приспособленности насекомого-хозяина.

В некоторых вариантах осуществления любой из вышеуказанных композиций один или несколько микроорганизмов могут представлять собой бактерию или гриб, обитающие в организме хозяина. В некоторых вариантах осуществления бактерия, обитающая в организме хозяина, представляет собой по меньшей мере одну бактерию, выбранную из группы, состоящей из Candidatus spp, Buchenera spp, Blattabacterium spp, Baumania spp, Wigglesworthia spp, Wolbachia spp, Rickettsia spp, Orientia spp, Sodalis spp, Burkholderia spp, Cupriavidus spp, Frankia spp, Snirhizobium spp, Streptococcus spp, Wolinella spp, Xylella spp, Erwinia spp, Agrobacterium spp, Bacillus spp, Paenibacillus spp, Streptomyces spp, Micrococcus spp, Corynebacterium spp, Acetobacter spp, Cyanobacteria spp, Salmonella spp, Rhodococcus spp, Pseudomonas spp, Lactobacillus spp, Enterococcus spp, Alcaligenes spp, Klebsiella spp, Paenibacillus spp, Arthrobacter spp, Corynebacterium spp, Brevibacterium spp, Thermus spp, Pseudomonas spp, Clostridium spp и Escherichia spp. В некоторых вариантах осуществления гриб, обитающий в организме хозяина, представляет собой по меньшей мере один гриб, выбранный из группы, состоящей из Candida, Metschnikowia, Debaromyces, Starmerella, Pichia, Cryptococcus, Pseudozyma, Symbiotaphrina bucneri, Symbiotaphrina kochii, Scheffersomyces shehatae, Scheffersomyces stipites, Cryptococcus, Trichosporon, Amylostereum areolatum, Epichloe spp, Pichia pinus, Hansenula capsulate, Daldinia decipien, Ceratocytis spp, Ophiostoma spp и Attamyces bromatificus. В определенных вариантах осуществления бактерия представляет собой Wolbachia spp. (например, в организме комара-хозяина). В определенных вариантах осуществления бактерия представляет собой Rickettsia spp. (например, в организме иксодового клеща-хозяина).

В любой из вышеуказанных композиций средство, которое далее в данном документе также может называться модулирующим средством, может изменять рост, деление, жизнеспособность, метаболизм и/или продолжительность жизни микроорганизма, обитающего в организме хозяина. В любом из вышеуказанных вариантов осуществления модулирующее средство может снижать жизнеспособность одного или нескольких микроорганизмов, обитающих в организме хозяина. В некоторых вариантах осуществления модулирующее средство повышает рост или жизнеспособность одного или нескольких микроорганизмов, обитающих в организме хозяина.

В любом из вышеуказанных вариантов осуществления модулирующее средство представляет собой фаг, полипептид, малую молекулу, антибиотик, бактерию или любую их комбинацию.

В некоторых вариантах осуществления фаг связывается с белком клеточной поверхности в бактерии, обитающей в организме хозяина. В некоторых вариантах осуществления фаг является вирулентным по отношению к бактерии, обитающей в организме хозяина. В некоторых вариантах осуществления фаг представляет собой по меньшей мере один фаг, выбранный из группы, состоящей из Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae, Lipothrixviridae, Rudiviridae, Ampullaviridae, Bicaudaviridae, Clavaviridae, Corticoviridae, Cystoviridae, Fuselloviridae, Gluboloviridae, Guttaviridae, Inoviridae, Leviviridae, Microviridae, Plasmaviridae и Tectiviridae.

В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой по меньшей мере одно из бактериоцина, бактериоцина R-типа, C-богатого пептида клубеньков, противомикробного пептида, лизина или регуляторного пептида бактериоцитов.

В некоторых вариантах осуществления малая молекула представляет собой метаболит.

В некоторых вариантах осуществления антибиотик представляет собой антибиотик широкого спектра действия.

В некоторых вариантах осуществления модулирующее средство представляет собой встречающуюся в природе бактерию. В некоторых вариантах осуществления бактерия представляет собой по меньшей мере одну бактерию, выбранную из группы, состоящей из Bartonella apis, Parasaccharibacter apium, Frischella perrara, Snodgrassella alvi, Gilliamela apicola, Bifidobacterium spp и Lactobacillus spp. В некоторых вариантах осуществления бактерия представляет собой по меньшей мере одну бактерию, выбранную из группы, состоящей из Candidatus spp, Buchenera spp, Blattabacterium spp, Baumania spp, Wigglesworthia spp, Wolbachia spp, Rickettsia spp, Orientia spp, Sodalis spp, Burkholderia spp, Cupriavidus spp, Frankia spp, Snirhizobium spp, Streptococcus spp, Wolinella spp, Xylella spp, Erwinia spp, Agrobacterium spp, Bacillus spp, Paenibacillus spp, Streptomyces spp, Micrococcus spp, Corynebacterium spp, Acetobacter spp, Cyanobacteria spp, Salmonella spp, Rhodococcus spp, Pseudomonas spp, Lactobacillus spp, Enterococcus spp, Alcaligenes spp, Klebsiella spp, Paenibacillus spp, Arthrobacter spp, Corynebacterium spp, Brevibacterium spp, Thermus spp, Pseudomonas spp, Clostridium spp и Escherichia spp.

В любой из вышеуказанных композиций приспособленность хозяина может быть измерена по выживаемости, размножению или метаболизму хозяина. В любом из вышеуказанных вариантов осуществления модулирующее средство может модулировать приспособленность хозяина посредством повышения восприимчивости хозяина к пестицидам (например, восприимчивости к пестициду, приведенному в таблице 12). В некоторых вариантах осуществления модулирующее средство модулирует приспособленность хозяина посредством повышения восприимчивости хозяина к пестицидам. В некоторых вариантах осуществления восприимчивость к пестицидам представляет собой восприимчивость к бактерицидам или фунгицидам. В некоторых вариантах осуществления восприимчивость к пестицидам представляет собой восприимчивость к инсектицидам.

В любой из вышеуказанных композиций композиция может содержать множество различных модулирующих средств. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит модулирующее средство и пестицидное средство (например, пестицид, приведенный в таблице 12). В некоторых вариантах осуществления пестицидное средство представляет собой бактерицидное или фунгицидное средство. В некоторых вариантах осуществления пестицидное средство представляет собой инсектицидное средство.

В любой из вышеуказанных композиций модулирующее средство может быть связано со вторым фрагментом. В некоторых вариантах осуществления второй фрагмент может представлять собой модулирующее средство.

В любой из вышеуказанных композиций модулирующее средство может быть связано с нацеливающим доменом. В некоторых вариантах осуществления нацеливающий домен нацеливает модулирующее средство на участок-мишень в организме хозяина. В некоторых вариантах осуществления нацеливающий домен нацеливает модулирующее средство на один или несколько микроорганизмов, обитающих в организме хозяина.

В любой из вышеуказанных композиций модулирующее средство может содержать инактивирующую пре- или пропоследовательность с образованием тем самым модулирующего средства-предшественника. В некоторых вариантах осуществления модулирующее средство-предшественник превращается в активную форму в организме хозяина.

В любой из вышеуказанных композиций модулирующее средство может содержать линкер. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой расщепляемый линкер.

В любой из вышеуказанных композиций композиция может дополнительно содержать носитель. В некоторых случаях носитель может представлять собой приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель.

В любой из вышеуказанных композиций композиция может дополнительно содержать приманку для хозяина, липкое средство или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления приманка для хозяина представляет собой съедобное средство и/или хемоаттрактант.

В любой из вышеуказанных композиций композиция может содержаться в дозе, эффективной для модулирования приспособленности хозяина.

В любой из вышеуказанных композиций композиция может быть составлена для доставки в микроорганизм, обитающий в кишке хозяина. В любой из вышеуказанных композиций композиция может быть составлена для доставки в микроорганизм, обитающий в бактериоците хозяина и/или кишке хозяина. В некоторых вариантах осуществления композиция может быть составлена для доставки в растение. В некоторых вариантах осуществления композиция может быть составлена для применения в кормушке для хозяина.

В любой из вышеуказанных композиций композиция может быть составлена в виде жидкости, порошка, гранул или наночастиц. В некоторых вариантах осуществления композицию составляют в виде композиции, выбранной из группы, состоящей из липосомы, полимера, бактерии, секретирующей пептид, и синтетической нанокапсулы. В некоторых вариантах осуществления синтетическая нанокапсула доставляет композицию в участок-мишень в организме хозяина. В некоторых вариантах осуществления участок-мишень представляет собой кишку хозяина. В некоторых вариантах осуществления участок-мишень представляет собой бактериоцит в организме хозяина.

В дополнительном аспекте в данном документе также предусмотрены хозяева, которые содержат любую из вышеуказанных композиций. В некоторых вариантах осуществления хозяин представляет собой насекомое. В некоторых вариантах осуществления насекомое может представлять собой комара, галлицу, вошь, москита, иксодового клеща, триатомового клопа, муху цеце или блоху. В определенных вариантах осуществления насекомое представляет собой комара. В определенных вариантах осуществления насекомое представляет собой иксодового клеща. В определенных вариантах осуществления насекомое представляет собой микроскопического клеща. В определенных вариантах осуществления насекомое представляет собой вошь.

В данном документе также предусмотрена система для модулирования приспособленности хозяина, содержащая модулирующее средство, которое целенаправленно воздействует на микроорганизм, требуемый для приспособленности хозяина, при этом система является эффективной для модулирования приспособленности хозяина, и при этом хозяин представляет собой насекомое. Модулирующее средство может включать в себя любую из композиций, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления модулирующее средство составляют в виде порошка. В некоторых вариантах осуществления модулирующее средство составляют в виде растворителя. В некоторых вариантах осуществления модулирующее средство составляют в виде концентрата. В некоторых вариантах осуществления модулирующее средство составляют в виде разбавителя. В некоторых вариантах осуществления модулирующее средство готовят для доставки посредством объединения любой из предыдущих композиций с носителем.

В еще одном дополнительном аспекте также предусмотрены способы модулирования приспособленности насекомого с помощью любой из композиций, описанных в данном документе. В одном случае способ модулирования приспособленности насекомого-хозяина предусматривает доставку композиции по любому из предыдущих пунктов хозяину, при этом модулирующее средство целенаправленно воздействует на один или несколько микроорганизмов, обитающих в организме хозяина, и тем самым модулирует приспособленность хозяина. В другом случае способ модулирования разнообразия микроорганизмов в организме насекомого-хозяина предусматривает доставку композиции по любому из предыдущих пунктов хозяину, при этом модулирующее средство целенаправленно воздействует на один или несколько микроорганизмов, обитающих в организме хозяина, и тем самым модулирует разнообразие микроорганизмов в организме хозяина.

В некоторых вариантах осуществления любого из вышеуказанных способов модулирующее средство может изменять уровни одного или нескольких микроорганизмов, обитающих в организме хозяина. В некоторых вариантах осуществления любого из вышеуказанных способов модулирующее средство может снижать изменять функцию одного или нескольких микроорганизмов, обитающих в организме хозяина. В некоторых вариантах осуществления один или несколько микроорганизмов может представлять собой бактерию и/или гриб. В некоторых вариантах осуществления один или несколько микроорганизмов требуются для приспособленности хозяина. В некоторых вариантах осуществления один или несколько микроорганизмов требуются для выживаемости хозяина.

В некоторых вариантах осуществления любого из вышеуказанных способов этап доставки может включать предоставление модулирующего средства в дозе и в течение времени, достаточных для воздействия на один или несколько микроорганизмов с модулированием тем самым разнообразия микроорганизмов в организме хозяина. В некоторых вариантах осуществления этап доставки включает местное применение любой из предыдущих композиций в отношении растения. В некоторых вариантах осуществления этап доставки включает предоставление модулирующего средства через генетически модифицированное растение. В некоторых вариантах осуществления этап доставки включает предоставление модулирующего средства хозяину в виде съедобного средства. В некоторых вариантах осуществления этап доставки включает получение хозяина, несущего модулирующее средство. В некоторых вариантах осуществления хозяин, несущий модулирующее средство, может переносить модулирующее средство одному или нескольким дополнительным хозяевам.

В некоторых вариантах осуществления любого из вышеуказанных способов композиция может быть эффективной для повышения восприимчивости хозяина к пестицидному средству (например, пестициду, приведенному в таблице 12). В некоторых вариантах осуществления хозяин является устойчивым к пестицидному средству до доставки модулирующего средства. В некоторых вариантах осуществления пестицидное средство представляет собой аллелохимическое средство. В некоторых вариантах осуществления аллелохимическое средство представляет собой кофеин, цистатин N сои, монотерпены, дитерпеновые кислоты или фенольные соединения. В некоторых вариантах осуществления композиция является эффективной для избирательного уничтожения хозяина. В некоторых вариантах осуществления композиция является эффективной для снижения приспособленности хозяина. В некоторых вариантах осуществления композиция является эффективной для снижения продуцирования незаменимых аминокислот и/или витаминов в организме хозяина.

В некоторых вариантах осуществления любого из вышеуказанных способов хозяин представляет собой насекомое. В некоторых вариантах осуществления хозяин представляет собой переносчика патогена животного. В некоторых вариантах осуществления переносчик может представлять собой комара, галлицу, вошь, москита, иксодового клеща, триатомового клопа, муху цеце или блоху. В определенных вариантах осуществления переносчик представляет собой комара. В определенных вариантах осуществления переносчик представляет собой иксодового клеща. В определенных вариантах осуществления переносчик представляет собой микроскопического клеща. В определенных вариантах осуществления переносчик представляет собой вошь. В некоторых вариантах осуществления патоген животного представляет собой вирус, простейшее, бактерию, протисту или нематоду. В некоторых вариантах осуществления вирус представляет собой вирус, принадлежащий к группе Togaviridae, Flaviviridae, Bunyaviridae, Rhabdoviridae или Orbiviridae. В некоторых вариантах осуществления бактерия представляет собой бактерию, принадлежащую к роду Yersinia, Francisella, Rickettsia, Orientia или Borrelia. В некоторых вариантах осуществления простейшее представляет собой простейшее, принадлежащее к роду Plasmodium, Trypanosoma, Leishmania или Babesia. В некоторых вариантах осуществления нематода представляет собой нематоду, принадлежащую к роду Brugia. В некоторых вариантах осуществления композиция является эффективной для предупреждения или уменьшения передачи патогена животным. В некоторых вариантах осуществления композиция является эффективной для предупреждения или уменьшения горизонтальной или вертикальной передачи патогена между хозяевами. В некоторых вариантах осуществления композиция является эффективной для снижения приспособленности хозяина, темпов развития хозяина или способности к переносу.

В другом аспекте в данном документе также предусмотрены скрининговые анализы для идентификации модулирующего средства, которое модулирует приспособленность хозяина. В одном случае скрининговый анализ для идентификации модулирующего средства, которое модулирует приспособленность хозяина, включает этапы (a) воздействия на микроорганизм, который может обитать в организме хозяина, одного или нескольких кандидатных модулирующих средств и (b) идентификации модулирующего средства, которое снижает приспособленность хозяина.

В некоторых вариантах осуществления скринингового анализа модулирующее средство представляет собой микроорганизм, обитающий в организме хозяина. В некоторых вариантах осуществления микроорганизм представляет собой бактерию. В некоторых вариантах осуществления бактерия, обитая в организме хозяина, снижает приспособленность хозяина. В некоторых вариантах осуществления скринингового анализа модулирующее средство отрицательно влияет на микроорганизм, расщепляющий аллелохимикат. В некоторых вариантах осуществления модулирующее средство представляет собой фаг, антибиотик или исследуемое соединение. В некоторых вариантах осуществления антибиотик представляет собой тиментин или азитромицин.

В некоторых вариантах осуществления скринингового анализа хозяин может представлять собой беспозвоночное. В некоторых вариантах осуществления беспозвоночное представляет собой насекомое. В некоторых вариантах осуществления насекомое представляет собой комара. В некоторых вариантах осуществления насекомое представляет собой иксодового клеща. В определенных вариантах осуществления насекомое представляет собой микроскопического клеща. В определенных вариантах осуществления насекомое представляет собой вошь.

В любом из вышеуказанных вариантов осуществления скринингового анализа приспособленность хозяина может быть модулирована путем модулирования микробиоты хозяина.

Определения

Используемый в данном документе термин "животные" относится к домашнему скоту или сельскохозяйственным животным и другим животным, имеющим ветеринарное значение, относящихся к млекопитающим.

Используемый в данном документе термин "бактериоцин" относится к пептиду или полипептиду, который обладает противомикробными свойствами. Встречающиеся в природе бактериоцины продуцируются определенными прокариотами и действуют против организмов, родственных штамму-продуценту, но не против самого штамма-продуцента. Бактериоцины, предусмотренные в данном документе, включают в себя без ограничения встречающиеся в природе бактериоцины, такие как бактериоцины, продуцируемые бактериями, и их производные, такие как сконструированные бактериоцины, рекомбинантно экспрессируемые бактериоцины и химически синтезируемые бактериоцины. В некоторых случаях бактериоцин представляет собой функционально активный вариант бактериоцинов, описанных в данном документе. В некоторых случаях вариант бактериоцина является на по меньшей мере 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичным, например, в определенной области или во всей последовательности, последовательности бактериоцина, описанного в данном документе, или встречающегося в природе бактериоцина.

Используемый в данном документе термин "бактериоцит" относится к специализированной клетке, встречающейся в определенных насекомых, в которых обитают внутриклеточные бактерии со свойствами симбиотических бактерий.

Используемый в данном документе термин "эффективное количество" относится к количеству модулирующего средства (например, фага, лизина, бактериоцина, малой молекулы или антибиотика) или композиции, содержащей указанное средство, достаточному для получения указанного результата, например, для снижения или ослабления приспособленности организма-хозяина (например, насекомого, например, комара, иксодового клеща, микроскопического клеща, вши); для достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации модулирующего средства в организме хозяина-мишени; для достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации модулирующего средства в кишке хозяина-мишени; для достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации модулирующего средства в бактериоците хозяина-мишени; для модулирования уровня или активности одного или нескольких микроорганизмов (например, эндосимбионтов) в организме хозяина-мишени.

Используемый в данном документе термин "приспособленность" относится к способности организма-хозяина выживать и/или давать жизнеспособное потомство. Приспособленность организма может быть измерена с помощью одного или нескольких параметров, в том числе без ограничения продолжительности жизни, скорости размножения, подвижности, массы тела и скорости метаболизма. Приспособленность может быть дополнительно измерена на основе показателей активности (например, у животных, наносящих укусы) или передачи заболевания (например, переноса от переносчика переносчику или переноса от переносчика животному).

Используемый в данном документе термин "кишка" относится к любой части кишки хозяина, в том числе передней кишке, средне кишке или задней кишке хозяина.

Используемый в данном документе термин "хозяин" относится к организму (например, насекомому, например, комару, вши, микроскопическому клещу или иксодовому клещу), несущему обитающие в нем микроорганизмы (например, эндогенные микроорганизмы, эндосимбиотические микроорганизмы (например, первичные или вторичные эндосимбионты), организмы-комменсалы и/или патогенные микроорганизмы).

Используемый в данном документе термин "снижение приспособленности хозяина" относится к любому нарушению физиологических процессов хозяина или любой активности, осуществляемой указанным хозяином, вследствие введения модулирующего средства, в том числе без ограничения любому одному или нескольким из следующих необходимых эффектов: (1) снижению популяции хозяина на приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% или больше; (2) снижению скорости размножения хозяина (например, насекомого, например, комара, иксодового клеща, микроскопического клеща, вши) на приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% или больше; (3) снижению подвижности хозяина (например, насекомого, например, комара, иксодового клеща, микроскопического клеща, вши) на приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% или больше; (4) снижению массы тела хозяина (например, насекомого, например, комара, клеща, микроскопического клеща, вши) на приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% или больше; (5) повышению скорости метаболизма или активности хозяина (например, насекомого, например, комара, клеща, микроскопического клеща, вши) на приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% или больше; (6) снижению переноса патогена от переносчика переносчику (например, вертикального или горизонтального переноса патогена от одного насекомого другому) из организма хозяина (например, насекомого, например, комара, клеща, микроскопического клеща, вши) на приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% или больше; (7) снижению переноса патогена от переносчика животному (например, от насекомого, например комара, клеща, микроскопического клеща, вши) на приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% или больше; (8) снижению продолжительности жизни хозяина (например, насекомого, например, комара, клеща, микроскопического клеща, вши) на приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% или больше; (9) повышению восприимчивости хозяина (например, насекомого, например, комара, клеща, микроскопического клеща, вши) к пестицидам (например, инсектицидам) на приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% или больше; или (10) снижению способности к переносу у хозяина (например, насекомого, например, комара, клеща, микроскопического клеща, вши) на приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% или больше. Снижение приспособленности хозяина может быть определено по сравнению с организмом-хозяином, которому модулирующее средство не было введено.

Термин "насекомое" включает любой организм, принадлежащий к типу Arthropoda и классу Insecta или классу Arachnida, в любой стадии развития, т. е. неполовозрелых и взрослых насекомых.

Используемый в данном документе термин "лизин", также известный как эндолизин, аутолизин, муреингидролаза, пептидогликангидролаза или гидролаза клеточной стенки, относится к гидролитическому ферменту, который может лизировать бактерию посредством расщепления пептидогликана в клеточной стенке бактерии. Лизины, предусмотренные в данном документе, включают в себя без ограничения встречающиеся в природе лизины, такие как лизины, продуцируемые фагами, лизины, продуцируемые бактериями, и их производные, такие как сконструированные лизины, рекомбинантно экспрессируемые лизины и химически синтезируемые лизины. Функционально активный вариант бактериоцина может являться на по меньшей мере 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичным, например, в определенной области или во всей последовательности, последовательности синтетического, рекомбинантного или встречающегося в природе бактериоцина, в том числе любого описанного в данном документе.

Используемый в данном документе термин "микроорганизм" относится к бактериям или грибам. Микроорганизмы могут относиться к микроорганизмам, обитающим в организме-хозяине (например, эндогенным микроорганизмам, эндосимбиотическим микроорганизмам (например, первичным или вторичным эндосимбионтам)), или микроорганизмам, экзогенным для хозяина, в том числе микроорганизмам, которые могут выступать в качестве модулирующих средств. Используемый в данном документе термин "микроорганизм-мишень" относится к микроорганизму, который обитает в организме хозяина и подвергается воздействию модулирующего средства, прямо или косвенно.

Используемый в данном документе термин "средство" или "модулирующее средство" относится к средству, которое способно изменять уровни и/или функционирование микроорганизмов, обитающих в организме-хозяине (например, насекомом, например, комаре, иксодовом клеще, микроскопическом клеще, вши), и тем самым модулировать (например, снижать) приспособленность организма-хозяина (например, насекомого, например, комара, иксодового клеща, микроскопического клеща, вши).

Используемый в данном документе термин "пестицид" или "пестицидное средство" относится к веществу, которое можно применять для контроля вредителей, значимых для сельского хозяйства, окружающей среды и домашнего хозяйства/быта, таких как насекомые, грибы, бактерии или вирусы. Термин "пестицид" понимают как охватывающий встречающиеся в природе или синтетические инсектициды (ларвициды или адультициды), регуляторы роста насекомых, акарициды (майтициды), нематоциды, эктопаразитициды, бактерициды, фунгициды или гербициды (вещества, которые можно применять в сельском хозяйстве для контроля или модификации роста растений). Дополнительные примеры пестицидов или пестицидных средств приведены в таблице 12. В некоторых случаях пестицид представляет собой аллелохимикат. Используемый в данном документе термин "аллелохимикат" или "аллелохимическое средство" представляет собой вещество, продуцируемое организмом, который может воздействовать на физиологическую функцию (например, зарождение, рост, выживаемость или размножение) другого организма (например, насекомого-хозяина).

Используемый в данном документе термин "пептид", "белок" или "полипептид" охватывает любую цепь из встречающихся в природе или не встречающихся в природе аминокислот (как D-, так и L-аминокислот), независимо от длины (например, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 40, 50, 100 или больше аминокислот), наличия или отсутствия посттрансляционных модификаций (например, гликозилирования или фосфорилирования) или наличия, например, одной или нескольких не являющихся аминоацильными групп (например, углеводных, липидных и т.д.), ковалентно связанных с пептидом, и включает, например, встречающиеся в природе белки, синтетические или рекомбинантные полипептиды и пептиды, гибридные молекулы, пептоиды и пептидомиметики.

Как используется в данном документе, "процент идентичности" между двумя последовательностями определяют с помощью алгоритма BLAST 2.0, который описан в Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. Программное обеспечение для проведения анализов BLAST общедоступно благодаря Национальному центру биотехнологической информации.

Используемый в данном документе термин "бактериофаг" или "фаг" относится к вирусу, который инфицирует бактерии и реплицируется в них. Бактериофаги реплицируются в бактериях после введения их генома в цитоплазму и осуществляют это с помощью литического цикла, который приводит к лизису бактериальной клетки, или лизогенного (не являющегося литическим) цикла, при котором бактериальная клетка остается интактной. Фаг может представлять собой изолят встречающегося в природе фага или сконструированный фаг, в том числе векторы или нуклеиновые кислоты, которые кодируют частичный геном фага (например, в том числе по меньшей мере все важнейшие гены, необходимые для осуществления жизненного цикла фага в бактерии-хозяине) или полный геном фага.

Используемый в данном документе термин "растение" относится к целым растениям, органам растений, растительным тканям, растительным клеткам, семенам и их потомству. Растительные клетки включают в себя без ограничения клетки из семян, суспензионных культур, зародышей, участков меристемы, каллюсной ткани, листьев, корней, побегов, гаметофитов, спорофитов, пыльцы и микроспор. Части растений включают в себя дифференцированные и недифференцированные ткани, в том числе без ограничения: корни, стебли, побеги, листья, пыльцу, семена, опухолевую ткань и различные формы клеток и культуры (например, отдельные клетки, протопласты, зародыши и каллюсную ткань). Растительная ткань может находиться в растении или в органе, ткани или культуре клеток растения. Кроме того, растение может быть генетически модифицированным таким образом, что в нем продуцируется гетерологичный белок или РНК, например, любого из модулирующих средств в способах и композициях, описанных в данном документе.

Используемый в данном документе термин "переносчик" относится к насекомому, которое может передавать или переносить патогена животного из резервуара животному. Иллюстративные переносчики включают в себя насекомых, таких как насекомые с колюще-сосущими ротовыми аппаратами, которые встречаются у Hemiptera и некоторых Hymenoptera и Diptera, таких как комары, пчелы, осы, галлицы, вши, муха цеце, блохи и муравьи, а также представителей Arachnidae, такие как иксодовые клещи и микроскопические клещи.

Другие характеристики и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фигуры предусмотрены для иллюстрации одной или нескольких характеристик, аспектов или вариантов осуществления настоящего изобретения и не предполагаются как ограничивающие.

На фиг. 1A-1G показаны изображения различных систем доставки антибиотиков. Тлей LSR-1 на стадии личинок первого возраста обрабатывали различными терапевтическими растворами путем доставки через растения (фиг. 1A), покрытия листьев (фиг. 1B), микроинъекции (фиг. 1C) и местной доставки (фиг. 1D).

На фиг. 2A-2C показана задержка развития тлей во время обработки рифампицином у тлей LSR-1 на стадии личинок первого возраста, обработанных путем доставки через растения с использованием трех различных условий: искусственного рациона без незаменимых аминокислот (только AD), искусственного рациона без незаменимых аминокислот со 100 мкг/мл рифампицина (AD+Rif) и искусственного рациона со 100 мкг/мл рифампицина и незаменимыми аминокислотами (AD+Rif+EAA). На фиг. 2A представлена серия графиков, на которых показан процент живых тлей на каждой стадии развития (размер выборки=33 тлей/группа). На фиг. 2B показаны иллюстративные изображения после каждой обработки, полученные через 12 дней. Масштабные метки соответствуют 2,5 мм. На фиг. 2C показаны измерения площади тела тлей, демонстрирующие существенный эффект обработки рифампицином. Добавление незаменимых аминокислот обратно частично устраняло дефекты развития.

На фиг. 3 показано, что обработка рифампицином приводила к гибели тлей. Выживаемость отслеживали ежедневно в случае тлей LSR-1, обработанных путем доставки через растения искусственного рациона без незаменимых аминокислот (только AD), искусственного рациона без незаменимых аминокислот со 100 мкг/мл рифампицина (AD+Rif) и искусственного рациона со 100 мкг/мл рифампицина и (AD+Rif+EAA). Число в скобках обозначает число тлей в каждой группе. Статистическую значимость определяли с помощью логарифмического рангового критерия, и определяли следующие статистически значимые различия: только AD по сравнению с AD+Rif, p<0,0001 и AD+Rif по сравнению с AD+Rif+EAA, p=0,017.

На фиг. 4 представлен график, на котором показано, что обработка рифампицином приводила к утрате способности к размножению у тлей. Тлей LSR-1 на стадии личинок первого возраста обрабатывали путем доставки через растения искусственного рациона без незаменимых аминокислот (только AD), искусственного рациона без незаменимых аминокислот со 100 мкг/мл рифампицина (AD+Rif) и искусственного рациона со 100 мкг/мл рифампицина и (AD+Rif+EAA), и измеряли число потомков, образующихся в каждый день после того, как тли достигали зрелого возраста. Показано среднее число потомков, образующихся за день, ± S.D. после того, как тли достигали зрелого возраста.

На фиг. 5 представлен график, на котором показано, что обработка рифампицином приводила к устранению эндосимбиотических Buchnera. Титр симбионтов определяли для различных условий через 7 дней после обработки. ДНК из тлей экстрагировали, и для определения соотношения количества ДНК Buchnera и ДНК тлей проводили qPCR. Показано среднее соотношение количества ДНК Buchnera и ДНК тлей ± SD для 3 тлей на группу. Статистически значимые различия определяли с помощью однофакторного ANOVA с последующим применением апостериорного критерия Тьюки; *, p<0,05.

На фиг. 6A и 6B показано, что обработка рифампицином, доставляемым посредством покрытия листьев, приводила к задержке развития тлей. Тлей eNASCO на стадии личинок первого возраста обрабатывали путем покрытия листьев 100 мкл двух различных растворов: контрольного растворителя (0,025% Silwet L-77) и 50 мкг/мл рифампицина. На фиг. 6A представлена серия графиков, на которых показана динамика стадий развития для каждого условия. Показан процент живых тлей на каждой стадии развития (размер выборки=20 тлей/группа). На фиг. 6B представлен график, на котором показаны измерения площади тела тлей, демонстрирующие существенный эффект листьев, покрытых рифампицином, в отношении размера тлей. Статистически значимые различия определяли с помощью однофакторного ANOVA с последующим применением апостериорного критерия Тьюки; *, p<0,05.

На фиг. 7 показано, что обработка рифампицином, доставляемым посредством покрытия листьев, приводила к гибели тлей. Выживаемость отслеживали ежедневно в случае тлей eNASCO, обработанных путем покрытия листьев 100 мкл двух различных растворов: контрольного растворителя (Silwet L-77) и 50 мкг/мл рифампицина. Обработка отрицательно влияла на показатель выживаемости тлей.

На фиг. 8 показано, что обработка рифампицином, доставляемым посредством покрытия листьев, приводила к устранению эндосимбиотических Buchnera. Титр симбионтов определяли для двух условий через 6 дней после обработки. ДНК из тлей экстрагировали, и для определения соотношения количества ДНК Buchnera и ДНК тлей проводили qPCR. Показано среднее соотношение количества ДНК Buchnera и ДНК тлей ± SD. Статистически значимые различия определяли с помощью однофакторного ANOVA с последующим применением апостериорного критерия Тьюки; *, p<0,05.

На фиг. 9 представлен график, на котором показано, что обработка рифампицином путем микроинъекции приводила к устранению эндосимбиотических Buchnera. Титр симбионтов определяли через 4 дня после инъекции при указанных условиях. Контрольный образец представлял собой растворитель, 0,025% Silwet L-77, описанный выше. ДНК из тлей экстрагировали, и для определения соотношения количества ДНК Buchnera и ДНК тлей проводили qPCR. Показано среднее соотношение количества ДНК Buchnera и ДНК тлей ± SD. Статистически значимые различия определяли с помощью однофакторного ANOVA с последующим применением апостериорного критерия Тьюки; *, p<0,05.

На фиг. 10 представлен график, показывающий, что обработка рифампицином, доставляемым посредством местного применения, приводила к устранению эндосимбиотических Buchnera. Титр симбионтов определяли через 3 дня после распыления растворителя (Silwet L-77) или раствора рифампицина, разведенного в растворителе. ДНК из тлей экстрагировали, и для определения соотношения количества ДНК Buchnera и ДНК тлей проводили qPCR. Показано среднее соотношение количества ДНК Buchnera и ДНК тлей ± SD. Статистически значимые различия определяли с помощью однофакторного ANOVA с последующим применением апостериорного критерия Тьюки; *, p<0,05.

На фиг. 11 представлена панель графиков, на которых показано, что тлей LSR-1 на стадии личинок 1-го и 2-го возраста помещали на листья, залитые водой с пищевым красителем или 50 мкг/мл рифампицина в воде с пищевым красителем. Определяли динамику стадий развития для каждого условия. Показан процент живых тлей на каждой стадии развития (размер выборки=74-81 тля/группа).

На фиг. 12 представлен график, на котором показана выживаемость тлей LSR-1 на стадии личинок 1-го и 2-го возраста, помещенных на листья, залитые водой с пищевым красителем или 50 мкг/мл рифампицина в воде с пищевым красителем. Число в скобках обозначает число тлей в каждой группе. Статистическую значимость определяли с помощью логарифмического рангового критерия.

На фиг. 13 представлен график, на котором показан титр симбионтов, определенный через 8 дней после обработки листьев, залитых водой с пищевым красителем или рифампицином с водой и пищевым красителем. ДНК из тлей экстрагировали, и для определения соотношения количества ДНК Buchnera и ДНК тлей проводили qPCR. Показано среднее соотношение количества ДНК Buchnera и ДНК тлей ± SD. Число в прямоугольнике обозначает медиану для экспериментальной группы.

На фиг. 14 представлена панель графиков, на которых показано, что тлей LSR-1 на стадии личинок 1-го и 2-го возраста обрабатывали посредством инъекции в листья и через растение воды с пищевым красителем или 100 мкг/мл рифампицина в воде с пищевым красителем. Определяли динамику стадий развития для каждого условия. Показан процент живых тлей на каждой стадии развития (размер выборки=49-50 тлей/группа).

На фиг. 15 представлен график, на котором показана выживаемость тлей LSR-1 на стадии личинок 1-го и 2-го возраста, помещенных на листья, залитые и обработанные водой с пищевым красителем или 100 мкг/мл рифампицина в воде с пищевым красителем. Число в скобках обозначает число тлей в каждой группе. Рассчитывали логарифмический ранговый критерий и определяли, что статистически значимые различия между группами отсутствовали.

На фиг. 16А и 16В представлены графики, на которых показан титр симбионтов, определенный через 6 (16А) и 8 (16В) дней после обработки у тлей, вскармливаемых на листьях, залитых и обработанных водой и пищевым красителем или рифампицином с водой и пищевым красителем. ДНК экстрагировали из тлей, и для определения соотношения количества ДНК Buchnera и ДНК тлей проводили qPCR. Показано среднее соотношение количества ДНК Buchnera и ДНК тлей ± SD. Число в прямоугольнике обозначает медиану для экспериментальной группы.

На фиг. 17 представлена панель графиков, на которых показано, что тлей LSR-1 на стадии личинок 1-го и 2-го возраста обрабатывали контрольными растворами (водой и Silwet L-77) или комбинацией средств обработки со 100 мкг/мл рифампицина. Определяли динамику стадий развития для каждого условия. Показан процент живых тлей на каждой стадии развития (размер выборки=76-80 тлей/группа).

На фиг. 18 представлен график, показывающий, что тлей LSR-1 на стадии личинок 1-го и 2-го возраста обрабатывали контрольными растворами или комбинацией средств обработки, включающей рифампицин. Число в скобках обозначает число тлей в каждой группе. Рассчитывали логарифмический ранговый критерий и определяли, что статистически значимые различия между группами отсутствовали.

На фиг. 19 представлен график, на котором показан титр симбионтов, определенный через 7 дней после обработки контрольными растворами или растворами рифампицина. ДНК из тлей экстрагировали, и для определения соотношения количества ДНК Buchnera и ДНК тлей проводили qPCR. Показано среднее соотношение количества ДНК Buchnera и ДНК тлей ± SD. Число в прямоугольнике обозначает медиану для экспериментальной группы. Статистически значимые различия определяли с помощью t-критерия.

На фиг. 20 представлено изображение, на котором показана система доставки хитозана. Тлей A. pisum обрабатывали терапевтическим раствором путем доставки с помощью заливания в листья и через растения, как показано.

На фиг. 21 представлена панель графиков, на которых показано, что обработка хитозаном приводила к задержке развития тлей. Тлей A. pisum на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали путем доставки через растения и заливания в листья контрольного раствора (воды), а также 300 мкг/мл хитозана в воде. Стадии развития отслеживали в ходе всего эксперимента. Показан процент тлей на каждой стадии развития (личинка 1-го возраста, личинка 2-го возраста, личинка 3-го возраста, личинка 4-го возраста, личинка 5-го возраста или личинка 5R, что обозначает размножающуюся личинку 5-го возраста) на группу обработки.

На фиг. 22 представлен график, на котором показано снижение выживаемости насекомых при обработке хитозаном. Тлей A. pisum на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали путем доставки через растения и заливания в листья только воды или раствора хитозана, и выживаемость отслеживали ежедневно в течение эксперимента. Число в скобках обозначает общее число тлей в группе обработки.

На фиг. 23 представлен график, на котором показано, что обработка хитозаном приводила к снижению количества эндосимбиотических Buchnera. Тлей A. pisum на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали путем доставки через растения и заливания в листья воды или 300 мкг/мл хитозана в воде. Через 8 дней после обработки ДНК из тлей экстрагировали, и для определения соотношения количества ДНК Buchnera и ДНК тлей проводили qPCR. Показано среднее соотношение количества ДНК Buchnera и ДНК тлей ± SD для 6 тлей/группа. Медианное значение для каждой группы показано в прямоугольнике.

На фиг. 24 представлена панель графиков, на которых показано, что обработка низином приводила к задержке развития тлей. Тлей A. pisum LSR-2 на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали водой (контроль) или 1,6 или 7 мг/мл низина путем доставки с помощью инъекции в листья и через растение, и определяли динамику развития. Показан процент тлей на каждой стадии развития (стадия личинок 1-го возраста, 2-го возраста, 3-го возраста, 4-го возраста, 5-го возраста и 5R (размножающиеся личинки 5-го возраста)) в указанный момент времени. N=56-59 тлей/группа.

На фиг. 25 представлен график, на котором показано дозозависимое снижение выживаемости насекомых при обработке низином. Тлей A. pisum LSR-1 на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали водой (контроль) или 1,6 или 7 мг/мл низина путем доставки с помощью инъекции в листья и через растение, и выживаемость отслеживали в динамике. Число в скобках обозначает число тлей/группа. Статистически значимые различия определяли с помощью логарифмического рангового критерия (Кокса-Мантеля).

На фиг. 26 представлен график, на котором показано, что обработка низином приводила к снижению количества эндосимбиотических Buchnera. Тлей A. pisum LSR-1 на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали водой (контроль) или 1,6 мг/мл низина путем доставки с помощью инъекции в листья и через растение, и ДНК экстрагировали из некоторых тлей через восемь дней после обработки и использовали в qPCR для определения числа копий Buchnera. Показаны средние соотношения Buchnera/тля для каждой обработки +/- SEM. Число в прямоугольнике над каждой экспериментальной группой обозначает медианное значение для этой группы. Каждая точка данных обозначает одну тлю.

На фиг. 27 представлена панель графиков, на которых показано, что обработка левулиновой кислотой приводила к задержке развития тлей. Тлей A. pisum eNASCO на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали водой (контроль) или 0,03 или 0,3% левулиновой кислотой путем доставки с помощью инъекции в листья и через растение, и определяли динамику развития. Показан процент тлей на каждой стадии развития (стадия личинок 1-го возраста, 2-го возраста, 3-го возраста, 4-го возраста и 5-го возраста) в указанный момент времени. N=57-59 тлей/группа.

На фиг. 28 представлен график, на котором показано снижение выживаемости насекомых при обработке левулиновой кислотой. Тлей A. pisum eNASCO на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали водой (контроль) или 0,03 или 0,3% левулиновой кислотой путем доставки с помощью инъекции в листья и через растение, и выживаемость отслеживали в динамике. N=57-59 тлей/группа. Статистически значимые различия определяли с помощью логарифмического рангового критерия (Кокса-Мантеля); **, p<0,01.

На фиг. 29 представлена панель графиков, на которых показано, что обработка левулиновой кислотой приводила к снижению количества эндосимбиотических Buchnera. Тлей A. pisum eNASCO на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали водой (контроль) или 0,03 или 0,3% левулиновой кислотой путем доставки с помощью инъекции в листья и через растение, и ДНК экстрагировали из некоторых тлей через семь и одиннадцать дней после обработки и использовали в qPCR для определения числа копий Buchnera. Показаны средние соотношения Buchnera/тля для каждой обработки +/- SEM. Статистически значимые различия определяли с помощью однофакторного ANOVA и критерия множественных сравнений Даннетта; *, p<0,05. Каждая точка данных обозначает одну тлю.

На фиг. 30A и 30B представлены графики, на которых показано, что обработка госсиполом приводила к задержке развития тлей. Тлей A. pisum на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали путем доставки через растения искусственного рациона без незаменимых аминокислот (только AD) и искусственного рациона без незаменимых аминокислот с различными концентрациями госсипола (0,05%, 0,25% и 0,5%). Стадии развития отслеживали в ходе всего эксперимента. На фиг. 30А представлена серия графиков, на которых показано среднее число тлей на каждой стадии развития (личинка 1-го возраста, личинка 2-го возраста, личинка 3-го возраста, личинка 4-го возраста, личинка 5-го возраста или личинка 5R, что обозначает размножающуюся личинку 5-го возраста) на группу обработки. В указанное время тлей визуализировали, и их размер определяли с использованием Image J. На фиг. 30B представлен график, на котором показана средняя площадь тлей ± SD для тлей, обработанных искусственным рационом (контроль) или обработанных госсиполом. Статистическую значимость определяли с помощью однофакторного ANOVA с последующим применением апостериорного критерия Тьюки. *, p<0,05. **, p<0,01.

На фиг. 31 представлен график, на котором показано дозозависимое снижение выживаемости тлей при обработке аллелохимикатом госсиполом. Тлей A. pisum на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали путем доставки через растения искусственного рациона без незаменимых аминокислот (AD без EAA), искусственного рациона без незаменимых аминокислот с 0,5% госсиполуксусной кислотой (0,5% госсиполом), искусственного рациона без незаменимых аминокислот с 0,25% госсиполуксусной кислотой (0,25% госсиполом) и искусственного рациона без незаменимых аминокислот с 0,05% госсиполуксусной кислотой (0,05% госсиполом), и выживаемость отслеживали ежедневно в течение эксперимента. Число в скобках обозначает число тлей в каждой группе применения среды без незаменимых аминокислот. Статистически значимые различия определяли с помощью логарифмического рангового критерия, и группы AD без EAA и 0,5% госсипола статистически значимо различаются, p=0,0002.

На фиг. 32A и 32B представлены два графика, на которых показано, что обработка 0,25% госсиполом приводила к снижению плодовитости. Тлей A. pisum на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали с помощью доставки через растения искусственного рациона без незаменимых аминокислот (AD5-2 без EAA) или искусственного рациона без незаменимых аминокислот с 0,25% госсиполуксусной кислотой (AD5-2 без EAA+0,25% госсипол), и плодовитость определяли на протяжении всего эксперимента. На фиг. 32A показано, что определяли средний день ± SD, на который тли начинают давать потомство, и обработка госсиполом приводила к задержке образования потомства. На фиг. 32B показано, что определяли среднее число потомков ± SD, образуемых после того, как тля становилась взрослой размножающейся особью, и обработка госсиполом приводила к снижению числа образуемых потомков. Каждая точка данных обозначает одну тлю.

На фиг. 33 представлен график, на котором показано, что обработка госсиполом в различных концентрациях приводила к снижению количества эндосимбиотических Buchnera. Тлей A. pisum на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали путем доставки через растения искусственного рациона без незаменимых аминокислот (контроль) или искусственного рациона без незаменимых аминокислот с 0,5%, 0,25% и 0,05% госсиполом. Через 5 или 13 дней после обработки ДНК из тлей экстрагировали, и для определения соотношения количества ДНК Buchnera и ДНК тлей проводили qPCR. Показано среднее соотношение количества ДНК Buchnera и ДНК тлей ± SD для 2-6 тлей/группа. Статистически значимые различия определяли с помощью непарного t-критерия; *, p<0,05.

На фиг. 34 представлен график, на котором показано, что микроинъекция госсипола приводила к снижению уровней Buchnera у тлей. Тлям A. pisum LSR-1 на стадии личинок < 3-го возраста (нимфам) инъецировали 20 нл искусственного рациона без незаменимых аминокислот (AD) или искусственного рациона без незаменимых аминокислот с 0,05% госсиполом (госсипол (0,05%)). Через три дня после инъекции ДНК экстрагировали из тлей, и уровни Buchnera определяли с помощью qPCR. Показаны средние соотношения количества ДНК Buchnera/тлей ± SD. Каждая точка данных обозначает одну тлю.

На фиг. 35 представлена панель графиков, на которых показано, что обработка транс-коричным альдегидом приводила к задержке развития тлей. Тлей A. pisum на стадии личинок первого или второго возраста обрабатывали путем доставки через растения воды и воды с различными концентрациями транс-коричного альдегида (TC, 0,05%, 0,5% и 5%). Стадии развития отслеживали в ходе всего эксперимента. Показано среднее число тлей на каждой стадии развития (личинка 1-го возраста, личинка 2-го возраста, личинка 3-го возраста, личинка 4-го возраста, личинка 5-го возраста или личинка 5R, что обозначает размножающуюся личинку 5-го возраста) на группу обработки. N=40-49 тлей/экспериментальная группа.

На фиг. 36 представлен график, на котором показано, что имело место дозозависимое снижение выживаемости при обработке природным противомикробным средством транс-коричным альдегидом. Тлей A. pisum на стадии личинок первого или второго возраста обрабатывали путем доставки через растения воды и воды с различными концентрациями транс-коричного альдегида (TC, 0,05%, 0,5% и 5%). Выживаемость отслеживали на протяжении всей обработки. Статистически значимые различия определяли с помощью логарифмического рангового критерия. N=40-49 тлей/группа.

На фиг. 37 представлен график, на котором показано, что обработка транс-коричным альдегидом в различных концентрациях приводила к снижению количества эндосимбиотических Buchnera. Тлей A. pisum на стадии личинок первого или второго возраста обрабатывали путем доставки через растения воды и воды с различными концентрациями транс-коричного альдегида (0,05%, 0,5% и 5%). Через 3 дней после обработки ДНК из тлей экстрагировали, и для определения соотношения количества ДНК Buchnera и ДНК тлей проводили qPCR. Показано среднее соотношение количества ДНК Buchnera и ДНК тлей ± SD для 2-11 тлей/группа. Медиана для каждой группы обработки показана в прямоугольнике над точками данных. Статистически значимые различия определяли с помощью непарного t-критерия; *, p<0,05. Имела место статистически значимое различие между группой контроля c водой и 0,5% транс-коричного альдегида.

На фиг. 38 представлена панель графиков, на которых показано, что обработка пептидом скорпиона Uy192 приводила к задержке развития тлей. Тлей A. pisum на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали путем доставки через растения и заливания в листья контрольного раствора (воды), а также 100 мкг/мл Uy192 в воде. Стадии развития отслеживали в ходе всего эксперимента. Показан процент тлей на каждой стадии развития (личинка 1-го возраста, личинка 2-го возраста, личинка 3-го возраста, личинка 4-го возраста, личинка 5-го возраста или личинка 5R, что обозначает размножающуюся личинку 5-го возраста) на группу обработки.

На фиг. 39 представлен график, на котором показано снижение выживаемости насекомых при обработке с помощью AMP скорпиона Uy192. Тлей A. pisum на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали путем доставки через растения и заливания в листья только воды или раствора Uy192, и выживаемость отслеживали ежедневно в течение эксперимента. Число в скобках обозначает общее число тлей в группе обработки.

На фиг. 40 представлен график, на котором показано, что обработка с помощью Uy192 приводила к снижению количества эндосимбиотических Buchnera. Тлей A. pisum на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали путем доставки через растения и заливания в листья воды или 100 мкг/мл Uy192 в воде, через 8 дней после обработки ДНК из тлей экстрагировали, и для определения соотношения количества ДНК Buchnera и ДНК тлей проводили qPCR. Показано среднее соотношение количества ДНК Buchnera и ДНК тлей ± SD для 2-6 тлей/группа. Медианное значение для каждой группы показано в прямоугольнике.

На фиг. 41 представлен график, на котором показано снижение выживаемости тлей, которым вводили микроинъекцию пептидов скорпиона D10 и D3. Тлям A. pisum LSR-1 вводили микроинъекцию воды (контроль) или 100 нг пептида скорпиона D3 или D10. После инъекции тлей выпускали на листья конских бобов, и выживаемость отслеживали на протяжении всего эксперимента. Число в скобках обозначает число тлей в каждой экспериментальной группе обработки.

На фиг. 42 представлен график, на котором показано снижение титров эндосимбионтов при инъекции пептидов скорпиона D3 и D10. Тлям A. pisum LSR-1 вводили микроинъекцию воды (контроль) или 100 нг пептида скорпиона D3 или D10. После инъекции тлей выпускали на листья конских бобов, и через 5 дней после обработки ДНК экстрагировали из оставшихся живых тлей, и для определения соотношения количества ДНК Buchnera/тлей проводили qPCR. Показано среднее значение ± SD для каждой группы обработки. N=2-9 тлей/группа. Число над каждой группой обработки в прямоугольнике обозначает медиану для совокупности данных.

На фиг. 43 представлен график, на котором показано снижение выживаемости насекомых при обработке коктейлем AMP скорпиона. Тлей eNASCO на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали путем доставки с помощью заливания в листья и через растения коктейля пептидов скорпиона (40 мкг/мл каждого из Uy17, D3, UyCt3 и D10), и выживаемость отслеживали в течение эксперимента. Число в скобках обозначает число тлей в каждой группе обработки.

На фиг. 44 представлена панель графиков, на которых показано, что обработка пептидом скорпиона, слитым с пептидом, проникающим в клетку, приводила к задержке развития тлей. Тлей A. pisum LSR-2 на стадии личинок первого возраста обрабатывали водой (контроль) или 100 мкг/мл Uy192+CPP+FAM путем доставки с помощью инъекции в листья и через растение, и определяли динамику развития. Показан процент тлей на каждой стадии развития (стадия личинок 1-го возраста, 2-го возраста, 3-го возраста, 4-го возраста, 5-го возраста и 5R (размножающиеся личинки 5-го возраста)) в указанный момент времени. N=90 тлей/группа.

На фиг. 45 представлен график, на котором показано, что обработка тлей пептидом скорпиона, слитым с пептидом, проникающим в клетку, повышала смертность. Тлей A. pisum LSR-1 на стадии личинок первого возраста обрабатывали водой или 100 мкг/мл UY192+CPP+FAM (пептида) в воде, доставляемых путем инъекции в листья и через растение. Выживаемость отслеживали в динамике. Число в скобках обозначает число тлей/группа. Статистически значимые различия определяли с помощью логарифмического рангового критерия (Кокса-Мантеля), и имела место статистически значимое различие между двумя экспериментальными группами (p=0,0036).

На фиг. 46 представлен график, на котором показано, что обработка с помощью Uy192+CPP+FAM приводила к снижению количества эндосимбиотических Buchnera. Тлей A. pisum LSR-1 на стадии личинок первого возраста обрабатывали водой или 100 мкг/мл Uy192+CPP+FAM (пептида) в воде, доставляемых путем инъекции в листья и через растение. ДНК экстрагировали из некоторых тлей через пять дней после обработки и использовали в qPCR для определения числа копий Buchnera. Показаны средние соотношения Buchnera/тля для каждой обработки +/- SEM. Число в прямоугольнике над каждой экспериментальной группой обозначает медианное значение для этой группы. Каждая точка данных обозначает одну тлю. Статистически значимые различия определяли с помощью t-критерия Стьюдента; ****, p<0,0001.

На фиг. 47 представлена панель изображений, на которых показано, что Uy192+CPP+FAM проникали через мембраны бактериоцитов. Бактериоциты извлекали из тлей и инкубировали с 250 мкг/мл пептида Uy192+CPP+FAM в течение 30 минут. После промывания и визуализации Uy192+CPP+FAM можно наблюдать в больших количествах внутри бактериоцитов.

На фиг. 48A и фиг. 48B представлена панель графиков, на которых показано, что обработка пантотенолом приводила к задержке развития тлей. Тлей eNASCO на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали путем доставки через растения трех различных условий: искусственного рациона без незаменимых аминокислот (AD без EAA), искусственного рациона без незаменимых аминокислот с 10 мкM пантотенола (10 мкМ пантотенола) и искусственного рациона без незаменимых аминокислот со 100 мкM пантотенола (100 мкM пантотенола), искусственного рациона без незаменимых аминокислот со 100 мкM пантотенола и искусственного рациона без незаменимых аминокислот с 10 мкM пантотенола. На фиг. 48A показаны стадии развития, динамика которых отслеживается для каждого условия. На фиг. 48B представлены измерения относительной площади тела тлей, демонстрирующие существенный эффект обработки пантотенола.

На фиг. 49 представлен график, на котором показано, что обработка пантотенолом приводила к повышению смертности тлей. Выживаемость отслеживали ежедневно в случае тлей eNASCO, обработанных путем доставки через растения искусственного рациона без незаменимых аминокислот или искусственного рациона без незаменимых аминокислот, содержащего 10 или 100 мкМ пантотенола. Число в скобках обозначает число тлей в каждой группе.

На фиг. 50A, 50B и 50C представлена панель графиков, на которых показано, что обработка пантотенолом приводила к утрате способности к размножению. Тлей eNASCO на стадии личинок первого и второго возраста обрабатывали путем доставки через растения искусственного рациона без незаменимых аминокислот или искусственного рациона без незаменимых аминокислот с 10 или 100 мкМ пантотенола. На фиг. 50A показана доля тлей, доживших до зрелого возраста и появления способности к размножению. На фиг. 50B показан средний день, в который тли в каждой группе начинали размножаться. Показан средний день ± SD, в который тли начинали размножаться. На фиг. 50C показано среднее число потомков, образующихся за день, после того, как тля начинала размножаться. Показано среднее число потомков/день ± SD.

На фиг. 51 представлен график, на котором показано, что обработка пантотенолом не влияла отрицательно на эндосимбиотические Buchnera. Титр симбионтов определяли для различных условий через 8 дней после обработки. ДНК из тлей экстрагировали, и для определения соотношения количества ДНК Buchnera и ДНК тлей проводили qPCR. Показано среднее соотношение количества ДНК Buchnera и ДНК тлей ± SD для 6 тлей на группу.

На фиг. 52 представлена панель графиков, на которых показано, что обработка пантотенолом, доставляемым через растения, не влияла отрицательно на развитие тлей. Тлей eNASCO на стадии личинок первого возраста обрабатывали путем покрытия листьев 100 мкл двух различных растворов: контрольного растворителя (0,025% Silwet L-77) и 10 мкМ пантотенола, и определяли динамику стадий развития для каждого условия. Показан процент живых тлей на каждой стадии развития (размер выборки=20 тлей/группа).

На фиг. 53 представлен график, на котором показано, что обработка пантотенолом, доставляемым посредством покрытия листьев, приводила к гибели тлей. Выживаемость отслеживали ежедневно в случае тлей eNASCO, обработанных путем покрытия листьев 100 мкл двух различных растворов: контрольного растворителя (Silwet L-77) и 10 мкМ пантотенола. Обработка отрицательно влияла на показатель выживаемости тлей. Размер выборки=20 тлей/группа. Логарифмический ранговый критерий Кокса-Мантеля использовали для определения наличия статистически значимых различий между группами и выявления того, что две группы статистически значимо различаются (p=0,0019).

На фиг. 54A и 54B представлена панель графиков, на которых показано, что обработка коктейлем аналогов аминокислот приводила к задержке развития тлей. Тлей LSR-1 на стадии личинок первого возраста обрабатывали путем доставки с помощью заливания в листья и через растения воды или коктейля аналогов аминокислот в воде (коктейля AA). На фиг. 54A показаны стадии развития, динамика которых определяется для каждого условия. Показан процент живых тлей на каждой стадии развития. На фиг. 54B показаны измерения площади тела тлей, демонстрирующие существенный эффект обработки коктейлем аналогов аминокислот (коктейлем AA). Статистически значимые различия определяли с помощью t-критерия Стьюдента; ****, p<0,0001.

На фиг. 55 представлен график, на котором показано, что обработка коктейлем аналогов аминокислот приводила к устранению эндосимбиотических Buchnera. Титр симбионтов определяли для различных условий через 6 дней после обработки. ДНК из тлей экстрагировали, и для определения соотношения количества ДНК Buchnera и ДНК тлей проводили qPCR. Показаны средние соотношения количества ДНК Buchnera и ДНК тлей ± SD для 19-20 тлей на группу. Каждая точка данных обозначает отдельную тлю. Статистически значимые различия определяли с помощью t-критерия Стьюдента; *, p<0,05.

На фиг. 56A и 56B представлена панель графиков, на которых показано, что обработка комбинацией трех средств приводила к задержке развития тлей. Тлей LSR-1 на стадии личинок первого возраста обрабатывали путем доставки с помощью заливания в листья и через растения воды или комбинации трех средств в воде (пептид-рифампицин-хитозан). На фиг. 56A показаны стадии развития, динамика которых определяется для каждого условия. Показан процент живых тлей на каждой стадии развития. На фиг. 56B показаны измерения площади тела тлей, демонстрирующие существенный эффект обработки комбинацией трех средств обработки (пептид-рифампицин-хитозан). Статистически значимые различия определяли с помощью t-критерия Стьюдента; ****, p<0,0001.

На фиг. 57 представлен график, на котором показано, что обработка комбинацией пептида, антибиотика и природного противомикробного средства приводила к повышению смертности тлей. Тлей LSR-1 обрабатывали водой или комбинацией трех средств обработки (пептид-рифампицин-хитозан), и после обработки ежедневно отслеживали выживаемость.

На фиг. 58 представлен график, на котором показано, что обработка комбинацией пептида, антибиотика и природного противомикробного средства приводила к устранению эндосимбиотических Buchnera. Титр симбионтов определяли для различных условий через 6 дней после обработки. ДНК из тлей экстрагировали, и для определения соотношения количества ДНК Buchnera и ДНК тлей проводили qPCR. Показаны средние соотношения количества ДНК Buchnera и ДНК тлей ± SD для 20-21 тли на группу. Каждая точка данных обозначает отдельную тлю.

На фиг. 59A и 59B представлена панель изображений, на которых показаны зерна кукурузы, которые были покрыты ципрофлоксацином и в которые проник ципрофлоксацин. Зерна кукурузы замачивали в воде (без антибиотика) или указанной концентрации ципрофлоксацина в воде, и целые зерна или зерно исследовали с целью обнаружения того, могут ли они ингибировать рост DH5α E. coli. На фиг. 59A показан рост бактерий в присутствии зерна кукурузы, замоченного в воде без антибиотиков, а на фиг. 59B показано ингибирование роста бактерий в случае, если целые зерна или половинки зерен кукурузы, которые замачивали в антибиотиках, помещали на чашку, по которой была распределена E. coli.

На фиг. 60 представлен график, на котором показано, что зрелых долгоносиков S. zeamais обрабатывали ципрофлоксацином (250 мкг/мл или 2,5 мг/мл) или подвергали ложной обработке водой. Через 18 дней после обработки геномную ДНК выделяли из долгоносиков, и количество первичного эндосимбионта Sitophilus определяли с помощью qPCR. Показано среднее значение ± SEM для каждой группы. Каждая точка данных обозначает одного долгоносика. Медиана для каждой группы указана над совокупностью данных.

На фиг. 61A и 61B представлены графики, на которых показано развитие долгоносиков после обработки ципрофлоксацином. На фиг. 61A показаны отдельные зерна кукурузы, вскрытые через 25 дней после того, как зрелые особи были удалены, из одной повторности каждой из групп исходных зерен кукурузы, замоченных в воде/покрытых водой (контролем) или ципрофлоксацином (250 мкг/мл или 2,5 мг/мл) и исследованные на наличие личинок, куколок или почти полностью развившихся (зрелых) долгоносиков. Показана процентная доля каждой стадии жизненного цикла, обнаруженная в зернах из каждой группы обработки. Общее число потомков, обнаруженных в зернах из каждой группы обработки, указано над каждой совокупностью данных. На фиг. 61B показана геномная ДНК, выделенная из потомков, извлеченных из зерен кукурузы из контрольной группы (вода) и группы обработки 2,5 мг/мл ципрофлоксацина; для измерения количества присутствующего первичного эндосимбионта Sitophilus проводили qPCR. Показано среднее значение ± SD для каждой группы. Статистически значимые различия определяли с помощью непарного t-критерия; *, p<0,001.

На фиг. 62A и 62B представлены графики, на которых показаны две оставшиеся повторности зерен кукурузы, подвергнутых ложной обработке (водой) или обработанных 250 мкг/мл или 2,5 мг/мл ципрофлоксацина, в которых отслеживалось появление потомства после того, как спаривающиеся пары были удалены (через 7 дней после обработки). На фиг. 62A показано среднее число ± SD вновь появившихся долгоносиков в динамике для каждой группы обработки. На фиг. 62B показано среднее число ± SEM появившихся долгоносиков для каждой группы обработки через 43 дня после того, как спаривающиеся пары были удалены.

На фиг. 63 представлена панель графиков, на которых показано, что обработка рифампицином и доксициклином приводила к смертности микроскопических клещей. Выживаемость отслеживали ежедневно в случае необработанных двупятнистых паутинных клещиков и микроскопических клещей, обработанных 250 мкг/мл рифампицина и 500 мкг/мл доксициклина в 0,025% Silwet L-77.

На фиг. 64 представлена панель графиков, на которых показаны результаты анализа внеклеточного потока Seahorse в отношении дыхания бактерий. Бактерии выращивали до логарифмической фазы и загружали в планшеты Seahorse XFe96 для временных измерений скорости потребления кислорода (OCR) и скорости закисления внеклеточной среды (ECAR), как описано в способах. Средства обработки инъецировали в лунки примерно через 20 минут, и бактерии отслеживали для выявления изменений роста. Рифампицин=100 мкг/мл; хлорамфеникол=25 мкг/мл; фаги (T7 в случае E. coli и ФSmVL-C1 в случае S. marcescens) представляли собой лизаты, разведенные 1:2 или 1:100 в буфере SM. Отметки на каждой линии предусмотрены исключительно в качестве индикаторов состояния, которым каждая линия соответствует, и не указывают на точки данных.

На фиг. 65 представлен график, на котором показано, что фаг, противодействующий S. marcescens, приводил к снижению смертности мух. Все мухи, которым вводили путем прокола S. marcescens, погибали в течение дня, в том время как значительная часть мух, которым вводили путем прокола как S. marcescens, так и фаг, выживали в течение пяти дней после обработки. Почти все из контрольных мух, которых никак не обрабатывали, выживали до конца эксперимента. Логарифмический ранговый критерий использовали для сравнения кривых для определения статистической значимости, звездочка обозначает p<0,0001.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе предусмотрены способы и композиции, полезные для здоровья животных, например, для изменения уровня, активности или метаболизма одного или нескольких микроорганизмов, обитающих в организме насекомого-хозяина (например, членистоногого, например, насекомого, например, переносчика патогена животного, например, комара, микроскопического клеща, вши или иксодового клеща), при этом данное изменение приводит к снижению приспособленности хозяина. В настоящем изобретении описана композиция, которая содержит модулирующее средство (например, фаг, пептид, малую молекулу, антибиотик или их комбинации), которое может изменять микробиоту хозяина таким образом, что это является пагубным для хозяина. Модулирующее средство, описанное в данном документе, можно применять для снижения приспособленности ряда насекомых, которые переносят патогенов, передаваемых переносчиками, которые вызывают заболевание у животных, посредством нарушения уровней микроорганизмов, активности микроорганизмов, метаболизма микроорганизмов или разнообразия микроорганизмов.

Способы и композиции, описанные в данном документе, основаны отчасти на примерах, предусмотренных в данном документе, которые иллюстрируют то, как модулирующие средства, например, антибиотики (например, окситетрациклин, доксициклин или их комбинация) можно применять для целенаправленного воздействия на симбиотические микроорганизмы в организме хозяина (например, эндосимбионтов в насекомых-переносчиках патогенов животных, например, эндосимбиотическую Wolbachia у комаров или Rickettsia у иксодовых клещей) для снижения приспособленности хозяина путем изменения уровня, активности или метаболизма микроорганизмов в организмах хозяев. Окситетрациклин и доксициклин представляют собой иллюстративные примеры антибиотиков, пригодных для этой цели. На основе этого в настоящем раскрытии описан ряд различных подходов для применения средств, которые изменяют уровень, активность или метаболизм одного или нескольких микроорганизмов, обитающих в организме хозяина (например, переносчика патогена животного, например, комара, микроскопического клеща, вши или иксодового клеща), при этом изменение приводит к снижению приспособленности хозяина.

I. Хозяева

i. Хозяева

Способы и композиции, предусмотренные в данном документе, можно применять в отношении любого насекомого-хозяина, которое считается переносчиком патогена, способного вызывать заболевание у животных.

Например, насекомое-хозяин может включать в себя без ограничения насекомых с колюще-сосущими ротовыми аппаратами, которые встречаются у Hemiptera и некоторых Hymenoptera и Diptera, таких как комары, пчелы, осы, галлицы, вши, муха цеце, блохи и муравьи, а также представителей Arachnidae, таких как иксодовые клещи и микроскопические клещи; в порядке, классе или семействе Acarina (иксодовых клещей и микроскопических клещей), например, у представителей семейств Argasidae, Dermanyssidae, Ixodidae, Psoroptidae или Sarcoptidae и представителей видов Amblyomma spp., Anocenton spp., Argas spp., Boophilus spp., Cheyletiella spp., Chorioptes spp., Demodex spp., Dermacentor spp., Dermanyssus spp., Haemophysalis spp., Hyalomma spp., Ixodes spp., Lynxacarus spp., Mesostigmata spp., Notoednes spp., Ornithodoros spp., Ornithonyssus spp., Otobius spp., Оtodectes spp., Pneumonyssus spp., Psoroptes spp., Rhipicephalus spp., Sancoptes spp. или Trombicula spp.; Anoplura (сосущих вшей и пухоедов), например, представителей видов Bovicola spp., Haematopinus spp., Linognathus spp., Menopon spp., Pediculus spp., Pemphigus spp., Phylloxera spp. или Solenopotes spp.; Diptera (мух), например, представителей видов Aedes spp., Anopheles spp., Calliphora spp., Chrysomyia spp., Chrysops spp., Cochliomyia spp., Culex spp., Culicoides spp., Cuterebra spp., Dermatobia spp., Gastrophilus spp., Glossina spp., Haematobia spp., Haematopota spp., Hippobosca spp., Hypoderma spp., Lucilia spp., Lyperosia spp., Melophagus spp., Oestrus spp., Phaenicia spp., Phlebotomus spp., Phormia spp., Acari (возбудителей зудневой чесотки), например, Sarcoptidae spp., Sarcophaga spp., Simulium spp., Stomoxys spp., Tabanus spp., Tannia spp. или Tipula spp.; Mallophaga (кусающих вшей), например, представителей видов Damalina spp., Felicola spp., Heterodoxus spp. или Trichodectes spp.; или Siphonaptera (бескрылых насекомых), например, представителей видов Ceratophyllus spp., Xenopsylla spp; Cimicidae (настоящих клопов), например, представителей видов Cimex spp., Tritominae spp., Rhodinius spp. или Triatoma spp.

В некоторых случаях насекомое представляет собой кровососущее насекомое из отряда Diptera (например, подотряда Nematocera, например, семейства Culicidae). В некоторых случаях насекомое относится к подсемействам Culicinae, Corethrinae, Ceratopogonidae или Simuliidae. В некоторых случаях насекомое относится к Culex spp., Theobaldia spp., Aedes spp., Anopheles spp., Aedes spp., Forciponiyia spp., Culicoides spp. или Helea spp.

В определенных случаях насекомое представляет собой комара. В определенных случаях насекомое представляет собой иксодового клеща. В определенных случаях насекомое представляет собой микроскопического клеща. В определенных случаях насекомое представляет собой пухоеда.

ii. Приспособленность хозяев

Способы и композиции, предусмотренные в данном документе, можно применять для снижения приспособленности любого из хозяев, описанных в данном документе. Снижение приспособленности может возникать в результате любых изменений в микроорганизмах, обитающих в организме хозяина, при этом изменения представляют собой следствие введения модулирующего средства и оказывают пагубные воздействия на хозяина.

В некоторых случаях снижение приспособленности хозяина может проявляться в виде нарушения или ухудшения физиологических процессов хозяина (например, ослабления здоровья или выживаемости) вследствие введения модулирующего средства. В некоторых случаях приспособленность организма может быть измерена с помощью одного или нескольких параметров, в том числе без ограничения скорости размножения, продолжительности жизни, подвижности, плодовитости, массы тела, скорости метаболизма или активности или выживаемости по сравнению с организмом-хозяином, которому модулирующее средство не было введено. Например, способы или композиции, предусмотренные в данном документе, могут быть эффективными для снижения общего состояния здоровья хозяина или для снижения общей выживаемости хозяина. В некоторых случаях снижение приспособленности хозяина составляет приблизительно 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% или более чем 100% по сравнению с эталонным уровнем (например, уровня, обнаруженного у хозяина, который не получает модулирующее средство). В некоторых случаях способы и композиции являются эффективными для снижения интенсивности размножения хозяина (например, скорости размножения) по сравнению с организмом-хозяином, которому модулирующее средство не было введено. В некоторых случаях способы и композиции являются эффективными для снижения других физиологических параметров, таких как подвижность, масса тела, продолжительность жизни, плодовитость или скорость метаболизма, на приблизительно 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% или более чем на 100% по сравнению с эталонным уровнем (например, уровнем, обнаруживаемым у хозяина, который не получает модулирующее средство).

В некоторых случаях снижение приспособленности хозяина может проявляться в виде снижения продуцирования одного или нескольких питательных веществ в организме хозяина (например, витаминов, углеводов, аминокислот или полипептидов). В некоторых случаях способы или композиции, предусмотренные в данном документе, могут быть эффективными для снижения продуцирования питательных веществ в организме хозяина (например, витаминов, углеводов, аминокислот или полипептидов) на приблизительно 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% или более чем на 100% по сравнению с эталонным уровнем (например, уровнем, обнаруживаемым у хозяина, который не получает модулирующее средство). В некоторых случаях способы или композиции, предусмотренные в данном документе, могут снижать содержание питательных веществ в организме хозяина путем снижения продуцирования питательных веществ одним или несколькими микроорганизмами (например, эндосимбионтами) в организме хозяина по сравнению с организмом-хозяином, которому модулирующее средство не было введено.

В некоторых случаях снижение приспособленности хозяина может проявляться в виде повышения восприимчивости хозяина к пестицидному средству (например, пестициду, приведенному в таблице 12) и/или снижения устойчивости хозяина к пестицидному средству (например, пестициду, приведенному в таблице 12) по сравнению с организмом-хозяином, которому модулирующее средство не было введено. В некоторых случаях способы или композиции, предусмотренные в данном документе, могут быть эффективными для повышения восприимчивости хозяина к пестицидному средству (например, пестициду, приведенному в таблице 12) на приблизительно 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% или более чем на 100% по сравнению с эталонным уровнем (например, уровнем, обнаруживаемым у хозяина, который не получает модулирующее средство). Пестицидное средство может представлять собой любое пестицидное средство, известное в данной области техники, в том числе инсектицидные средства. В некоторых случаях способы или композиции, предусмотренные в данном документе, могут повышать восприимчивость хозяина к пестицидному средству (например, пестициду, упомянутому в таблице 12) посредством снижения способности хозяина метаболизировать или расщеплять пестицидное средство на пригодные к использованию субстраты по сравнению с организмом-хозяином, которому модулирующее средство не было введено.

В некоторых случаях снижение приспособленности хозяина может проявляться в виде повышения восприимчивости хозяина к аллелохимическому средству и/или снижения устойчивости хозяина к аллелохимическому средству по сравнению с организмом-хозяином, которому модулирующее средство не было введено. В некоторых случаях способы и композиции, предусмотренные в данном документе, могут быть эффективными для снижения устойчивости хозяина к аллелохимическому средству на приблизительно 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% или более чем на 100% по сравнению с эталонным уровнем (например, уровнем, обнаруживаемым у хозяина, который не получает модулирующее средство). В некоторых случаях аллелохимическое средство представляет собой кофеин, цистатин N сои, монотерпены, дитерпеновые кислоты или фенольные соединения. В некоторых случаях способы или композиции, предусмотренные в данном документе, могут повышать восприимчивость хозяина к аллелохимическому средству посредством снижения способности хозяина метаболизировать или расщеплять аллелохимическое средство на пригодные к использованию субстраты по сравнению с организмом-хозяином, которому модулирующее средство не было введено.

В некоторых случаях способы или композиции, предусмотренные в данном документе, могут быть эффективными для снижения устойчивости хозяина к паразитам или патогенам (например, грибным, бактериальным или вирусным патогенам или паразитам) по сравнению с организмом-хозяином, которому модулирующее средство не было введено. В некоторых случаях способы и композиции, предусмотренные в данном документе, могут быть эффективными для снижения устойчивости хозяина к патогену или паразиту (например, грибным, бактериальным или вирусным патогенам или паразитическим микроскопическим клещам) на приблизительно 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% или более чем на 100% по сравнению с эталонным уровнем (например, уровнем, обнаруживаемым у хозяина, который не получает модулирующее средство).

В некоторых случаях снижение приспособленности хозяина может проявляться в виде других недостатков приспособленности, таких как сниженная переносимость определенных факторов окружающей среды (например, переносимость высокой или низкой температуры), сниженная способность к выживанию в определенных средах обитания или сниженная способность к поддержанию определенного рациона по сравнению с организмом-хозяином, которому модулирующее средство не было введено. В некоторых случаях способы или композиции, предусмотренные в данном документе, могут быть эффективными для снижения приспособленности хозяина множеством способов, описанных в данном документе. Кроме того, модулирующее средство может снижать приспособленность хозяина в любом количестве классов, порядков, семейств, родов или видов хозяев (например, у 1 вида хозяев, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 200, 250, 500 или больше видов хозяев). В некоторых случаях модулирующее средство действует на один класс, порядок, семейство, род или вид хозяев.

Приспособленность хозяина может быть оценена с помощью любых стандартных способов в данной области техники. В некоторых случаях приспособленность хозяина может быть оценена с помощью оценки отдельного хозяина. В качестве альтернативы, приспособленность хозяина может быть оценена с помощью оценки популяции хозяев. Например, снижение приспособленности хозяина может проявляться в виде снижения успешного конкурирования по сравнению с другими насекомыми, что тем самым приводит к снижению размера популяции хозяев.

iii. Насекомые-хозяева в переносе заболеваний

Благодаря снижению приспособленности насекомых-хозяев, которые несут патогенов животных, модулирующие средства, предусмотренные в данном документе, являются эффективными для снижения распространения заболеваний, передаваемых переносчиками. Модулирующее средство может быть доставлено насекомым с помощью любого из составов и способов доставки, описанных в данном документе, в количестве и в течение периода времени, эффективных для снижения передачи заболевания, например, снижения вертикального или горизонтального переноса между переносчиками и/или снижения переноса животным. Например, модулирующее средство, описанное в данном документе, может снижать вертикальную или горизонтальную передачу патогена, передаваемого переносчиком, на приблизительно 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% или больше по сравнению с организмом-хозяином, которому модулирующее средство не было введено. В качестве другого примера, модулирующее средство, описанное в данном документе, может снижать способность к переносу у насекомого-переносчика на приблизительно 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% или больше по сравнению с организмом-хозяином, которому модулирующее средство не было введено.

Неограничивающие примеры заболеваний, которые можно контролировать с помощью композиций и способов, предусмотренных в данном документе, включают в себя заболевания, вызываемые вирусами Togaviridae (например, чикунгунья, лихорадку реки Росс, лихорадку Майаро, лихорадку Онионг-Нионг, лихорадку Синдбис, восточный лошадиный энцефаломиелит, западный лошадиный энцефаломиелит, венесуэльский лошадиный энцефаломиелит или лихорадку леса Барма); заболевания, вызываемые вирусами Flaviviridae (например, лихорадку Денге, желтую лихорадку, болезнь Кьясанурского леса, омскую геморрагическую лихорадку, японский энцефалит, энцефалит долины Муррея, энцефалит Росио, энцефалит Сент-Луис, энцефалит Западного Нила или клещевой энцефалит); заболевания, вызываемые вирусами Bunyaviridae (например, москитную лихорадку, лихорадку долины Рифт, энцефалит, вызываемый вирусом Ла Кросс, калифорнийский энцефалит. геморрагическую лихорадку Крым-Конго или лихорадку Оропуч); заболевания, вызываемые вирусами Rhabdoviridae (например, везикулярный стоматит); заболевания, вызываемые вирусами Orbiviridae (например, блутанг); заболевания, вызываемые бактериями (например, чуму, туляремию, Ку-лихорадку, пятнистую лихорадку Скалистых гор, мышиный тиф, марсельскую лихорадку, клещевой тиф Квинсленда, сибирский клещевой тиф, цуцугамуши, возвратную лихорадку или болезнь Лайма); или заболевания, вызываемые простейшими (например, малярию, африканский трипаносомоз, нагану, болезнь Шагаса, лейшманиоз, пироплазмоз, филяриоз Банкрофта или бругиоз).

II. Микроорганизмы-мишени

Микроорганизмы, на которые целенаправленно воздействует модулирующее средство, описанное в данном документе, могут включать в себя любой микроорганизм, обитающий в организме хозяина или на нем, в том числе без ограничения любые бактерии и/или грибы, описанные в данном документе. Микроорганизмы, обитающие в организме хозяина, могут включать в себя, например, симбиотические микроорганизмы (например, эндосимбиотические микроорганизмы, которые предоставляют полезные питательные вещества или ферменты хозяину), микроорганизмы-комменсалы, патогенные или паразитические микроорганизмы. Эндосимбиотический микроорганизм может представлять собой первичный эндосимбионт или вторичный эндосимбионт. Симбиотический микроорганизм (например, бактерия или гриб) может являться облигатным симбионтом хозяина или факультативным симбионтом хозяина. Микроорганизмы, обитающие в организме хозяина, могут быть приобретены с помощью любого пути переноса, в том числе вертикального, горизонтального переноса или переноса множественного происхождения.

i. Бактерии

Иллюстративные бактерии, на которые можно целенаправленно воздействовать в соответствии со способами и композициями, предусмотренными в данном документе, включают в себя без ограничения Xenorhabdus spp, Photorhabdus spp, Candidatus spp, Buchnera spp, Blattabacterium spp, Baumania spp, Wigglesworthia spp, Wolbachia spp, Rickettsia spp, Orientia spp, Sodalis spp, Burkholderia spp, Cupriavidus spp, Frankia spp, Snirhizobium spp, Streptococcus spp, Wolinella spp, Xylella spp, Erwinia spp, Agrobacterium spp, Bacillus spp, Paenibacillus spp, Streptomyces spp, Micrococcus spp, Corynebacterium spp, Acetobacter spp, Cyanobacteria spp, Salmonella spp, Rhodococcus spp, Pseudomonas spp, Lactobacillus spp, Enterococcus spp, Alcaligenes spp, Klebsiella spp, Paenibacillus spp, Arthrobacter spp, Corynebacterium spp, Brevibacterium spp, Thermus spp, Pseudomonas spp, Clostridium spp и Escherichia spp. Неограничивающие примеры бактерий, на которые можно целенаправленно воздействовать с помощью способов и композиций, предусмотренных в данном документе, показаны в таблице 1. В некоторых случаях последовательность 16S рРНК бактерий, на которые целенаправленно воздействуют с помощью модулирующего средства, на по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 99,9% или 100% идентична последовательности, приведенной в таблице 1.

Таблица 1. Примеры бактерий-мишеней и насекомых-хозяев

Первичный эндосимбионт Хозяин Местоположение 16S рРНК
Гамма-протеобактерии
Carsonella ruddii Листоблошки (Psylloidea) Бактериоциты TATCCAGCCACAGGTTCCCCTACAGCTACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTTACAAATCATACCGTTGTAATAGTAAAATTACTTATGATACAATTTACTTCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCTCGAGAACGTATTCACCGTAACATTCTGATTTACGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGAAATCGAGTTACAGATTTCAATCCGAACTAAGAATATTTTTTAAGATTAGCATTATGTTGCCATATAGCATATAACTTTTTGTAATACTCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACTTATAAGGGCCATGATGACTTGACGTCGTCCTCACCTTCCTCCAATTTATCATTGGCAGTTTCTTATTAGTTCTAATATATTTTTAGTAAAATAAGATAAGGGTTGCGCTCGTTATAGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAAAGCTAAAAAAGCTTTATTATTTCTAATAAATTCTTTGGATGTCAAAAGTAGGTAAGATTTTTCGTGTTGTATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGAGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGTCGTAATCCCCAGGCGGTCAACTTAACGCGTTAGCTTTTTCACTAAAAATATATAACTTTTTTTCATAAAACAAAATTACAATTATAATATTTAATAAATAGTTGACATCGTTTACTGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCATGCTTTCGTGTATTAGTGTCAGTATTAAAATAGAAATACGCCTTCGCCACTAGTATTCTTTCAGATATCTAAGCATTTCACTGCTACTCCTGAAATTCTAATTTCTTCTTTTATACTCAAGTTTATAAGTATTAATTTCAATATTAAATTACTTTAATAAATTTAAAAATTAATTTTTAAAAACAACCTGCACACCCTTTACGCCCAATAATTCCGATTAACGCTTGCACCCCTCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGAAGTTAGCCGGTGCTTCTTTTACAAATAACGTCAAAGATAATATTTTTTTATTATAAAATCTCTTCTTACTTTGTTGAAAGTGTTTTACAACCCTAAGGCCTTCTTCACACACGCGATATAGCTGGATCAAGCTTTCGCTCATTGTCCAATATCCCCCACTGCTGCCTTCCGTAAAAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGTTGTTCATCCTCTAAGATCAACTACGAATCATAGTCTTGTTAAGCTTTTACTTTAACAACTAACTAATTCGATATAAGCTCTTCTATTAGCGAACGACATTCTCGTTCTTTATCCATTAGGATACATATTGAATTACTATACATTTCTATATACTTTTCTAATACTAATAGGTAGATTCTTATATATTACTCACCCGTTCGCTGCTAATTATTTTTTTAATAATTCGCACAACTTGCATGTGTTAAGCTTATCGCTAGCGTTCAATCTGAGCTATGATCAAACTCA (SEQ ID NO: 1)
Portiera aleyrodidarum BT-B Белокрылки (Aleyrodoidea) Бактериоциты AAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTAGCGGCAGACATAACACATGCAAGTCGAGCGGCATCATACAGGTTGGCAAGCGGCGCACGGGTGAGTAATACATGTAAATATACCTAAAAGTGGGGAATAACGTACGGAAACGTACGCTAATACCGCATAATTATTACGAGATAAAGCAGGGGCTTGATAAAAAAAATCAACCTTGCGCTTTTAGAAAATTACATGCCGGATTAGCTAGTTGGTAGAGTAAAAGCCTACCAAGGTAACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGAAAAGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGGAACCCTGATCCAGTCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTTGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGAAGAAGAAAAGTTAGAAAATAAAAAGTTATAACTATGACGGTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCAGAATTACTGGGCGTAAAGGGCATGTAGGTGGTTTGTTAAGCTTTATGTGAAAGCCCTATGCTTAACATAGGAACGGAATAAAGAACTGACAAACTAGAGTGCAGAAGAGGAAGGTAGAATTCCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCTGGAGGAATACCAGTTGCGAAGGCGACCTTCTGGGCTGACACTGACACTGAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATATCAACTAGCCGTTGGATTCTTAAAGAATTTTGTGGCGTAGCTAACGCGATAAGTTGATCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGGCTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGCAAAACCTTACCTACTCTTGACATCCAAAGTACTTTCCAGAGATGGAAGGGTGCCTTAGGGAACTTTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCCAACGCATAAGGCGGGAACTTTAAGGAGACTGCTGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTAAGAGTAGGGCAACACACGTGCTACAATGGCAAAAACAAAGGGTCGCAAAATGGTAACATGAAGCTAATCCCAAAAAAATTGTCTTAGTTCGGATTGGAGTCTGAAACTCGACTCCATAAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCTCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAGTGAAATGCACCAGAAGTGGCAAGTTTAACCAAAAAACAGGAGAACAGTCACTACGGTGTGGTTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCTGTAGGGGAACCTGTGGCTGGATCACCTCCTTAA (SEQ ID NO: 2)
Buchnera aphidicola, штамм APS (Acyrthosiphon pisum) Тли (Aphidoidea) Бактериоциты AGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAAGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGCAGCGAGAAGAGAGCTTGCTCTCTTTGTCGGCAAGCGGCAAACGGGTGAGTAATATCTGGGGATCTACCCAAAAGAGGGGGATAACTACTAGAAATGGTAGCTAATACCGCATAATGTTGAAAAACCAAAGTGGGGGACCTTTTGGCCTCATGCTTTTGGATGAACCCAGACGAGATTAGCTTGTTGGTAGAGTAATAGCCTACCAAGGCAACGATCTCTAGCTGGTCTGAGAGGATAACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCTATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAAAAAATAAAACTAATAATTTTATTTCGTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCAGAATTACTGGGCGTAAAGAGCGCGTAGGTGGTTTTTTAAGTCAGGTGTGAAATCCCTAGGCTCAACCTAGGAACTGCATTTGAAACTGGAAAACTAGAGTTTCGTAGAGGGAGGTAGAATTCTAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCTGGAGGAATACCCGTGGCGAAAGCGGCCTCCTAAACGAAAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTTTCCAAGAGAAGTGACTTCCGAAGCTAACGCATTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAATTCTTTAGAAATAAAGAAGTGCCTTCGGGAGCTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCCCTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAGAGGAGACTGCCGGTTATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTTTATACAAAGAGAAGCAAATCTGCAAAGACAAGCAAACCTCATAAAGTAAATCGTAGTCCGGACTGGAGTCTGCAACTCGACTCCACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGCAGGTATCCTAACCCTTTAAAAGGAAGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAACCTGCGGTTGGATCACCTCCTT (SEQ ID NO: 3)
Buchnera aphidicola, штамм Sg (Schizaphis graminum) Тли (Aphidoidea) Бактериоциты AAACTGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAAGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGCAGCGAAAAGAAAGCTTGCTTTCTTGTCGGCGAGCGGCAAACGGGTGAGTAATATCTGGGGATCTGCCCAAAAGAGGGGGATAACTACTAGAAATGGTAGCTAATACCGCATAAAGTTGAAAAACCAAAGTGGGGGACCTTTTTTAAAGGCCTCATGCTTTTGGATGAACCCAGACGAGATTAGCTTGTTGGTAAGGTAAAAGCTTACCAAGGCAACGATCTCTAGCTGGTCTGAGAGGATAACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCTATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAAAAATTAAAACTAATAATTTTATTTTGTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCAGAATTACTGGGCGTAAAGAGCACGTAGGTGGTTTTTTAAGTCAGATGTGAAATCCCTAGGCTTAACCTAGGAACTGCATTTGAAACTGAAATGCTAGAGTATCGTAGAGGGAGGTAGAATTCTAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCTGGAGGAATACCCGTGGCGAAAGCGGCCTCCTAAACGAATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTTTCCAAGAGAAGTGACTTCCGAAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAATTTTTTAGAAATAAAAAAGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCCCTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAGAGGAGACTGCCGGTTATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTTTATACAAAGAGAAGCAAATCTGTAAAGACAAGCAAACCTCATAAAGTAAATCGTAGTCCGGACTGGAGTCTGCAACTCGACTCCACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGCAGATTTCCTAACCACGAAAGTGGAAGGCGTCTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAACCTGCGGTTGGATCACCTCCTTA (SEQ ID NO: 4)
Buchnera aphidicola, штамм Bp (Baizongia pistaciae) Тли (Aphidoidea) Бактериоциты ACTTAAAATTGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAAGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGCATCGAAGAAAAGTTTACTTTTCTGGCGGCGAGCGGCAAACGGGTGAGTAACATCTGGGGATCTACCTAAAAGAGGGGGACAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGCATAATGTTTTTAAATAAACCAAAGTAGGGGACTAAAATTTTTAGCCTTATGCTTTTAGATGAACCCAGACGAGATTAGCTTGATGGTAAGGTAATGGCTTACCAAGGCGACGATCTCTAGCTGGTCTGAGAGGATAACCAGCCACACTGGAACTGAGATACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCTAAAGCCTGATGCAGCTATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAAGAATTATGTCTAATATACATATTTTGTGACGTTACCCGAAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCAGAATTACTGGGCGTAAAGAGCACGTAGGCGGTTTATTAAGTCAGATGTGAAATCCCTAGGCTTAACTTAGGAACTGCATTTGAAACTAATAGACTAGAGTCTCATAGAGGGAGGTAGAATTCTAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCTAGAGGAATACCCGTGGCGAAAGCGACCTCCTAAATGAAAACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCTGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTTTCCTAGAGAAGTGGCTTCCGAAGCTAACGCATTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGGCTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCATAGAATTTTTTAGAGATAAAAGAGTGCCTTAGGGAACTATGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCCTTTGTTGCCATCAGGTTATGCTGGGAACTCAGAGGAGACTGCCGGTTATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGATGCAACTCTGCGAAGATAAGCAAACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGACTGGAGTCTGCAACTCGACTCCACGAAGTAGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGCAGGTAGCTTAACCAGATTATTTTATTGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAACCTGCGGTTGGATCACCTCCTTA (SEQ ID NO: 5)
Buchnera aphidicola BCc Тли (Aphidoidea) Бактериоциты ATGAGATCATTAATATATAAAAATCATGTTCCAATTAAAAAATTAGGACAAAATTTTTTACAGAATAAAGAAATTATTAATCAGATAATTAATTTAATAAATATTAATAAAAATGATAATATTATTGAAATAGGATCAGGATTAGGAGCGTTAACTTTTCCTATTTGTAGAATCATTAAAAAAATGATAGTATTAGAAATTGATGAAGATCTTGTGTTTTTTTTAACTCAAAGTTTATTTATTAAAAAATTACAAATTATAATTGCTGATATTATAAAATTTGATTTTTGTTGTTTTTTTTCTTTACAGAAATATAAAAAATATAGGTTTATTGGTAATTTACCATATAATATTGCTACTATATTTTTTTTAAAAACAATTAAATTTCTTTATAATATAATTGATATGCATTTTATGTTTCAAAAAGAAGTAGCAAAGAGATTATTAGCTACTCCTGGTACTAAAGAATATGGTAGATTAAGTATTATTGCACAATATTTTTATAAGATAGAAACTGTTATTAATGTTAATAAATTTAATTTTTTTCCTACTCCTAAAGTAGATTCTACTTTTTTACGATTTACTCCTAAATATTTTAATAGTAAATATAAAATAGATAAACATTTTTCTGTTTTAGAATTAATTACTAGATTTTCTTTTCAACATAGAAGAAAATTTTTAAATAATAATTTAATATCTTTATTTTCTACAAAAGAATTAATTTCTTTAGATATTGATCCATATTCAAGAGCAGAAAATGTTTCTTTAATTCAATATTGTAAATTAATGAAATATTATTTGAAAAGAAAAATTTTATGTTTAGATTAA (SEQ ID NO: 6)
Buchnera aphidicola (Cinara tujafilina) Тли (Aphidoidea) Бактериоциты TTATCTTATTTCACATATACGTAATATTGCGCTGCGTGCACGAGGATTTTTTTGAATTTCAGATATATTTGGTTTAATACGTTTAATAAAACGTATTTTTTTTTTTATTTTTCTTATTTGCAATTCAGTAATAGGAAGTTTTTTAGGTATATTTGGATAATTACTGTAATTCTTAATAAAGTTTTTTACAATCCTATCTTCAATAGAATGAAAACTAATAATAGCAATTTTTGATCCGGAATGTAATATGTTAATAATAATTTTTAATATTTTATGTAATTCATTTATTTCTTGGTTAATATATATTCGAAAAGCTTGAAATGTTCTCGTAGCTGGATGTTTAAATTTGTCATATTTTGGGATTGATTTTTTTATGATTTGAACTAACTCTAACGTGCTTGTTATGGTTTTTTTTTTTATTTGTAATATGATGGCTCGGGATATTTTTTTTGCGTATTTTTCTTCGCCAAAATTTTTTATTACCTGTTCTATTGTTTTTTGGTTTGTTTTTTTTAACCATTGACTAACTGATATTCCAGATTTAGGGTTCATACGCATATCTAAAGGTCCATCATTCATAAATGAAAATCCTCGGATACTAGAATTTAACTGTATTGAAGAAATACCTAAATCTAATAATATTCCATCTATTTTATCTCTATTTTTTTCTTTTTTTAATATTTTTTCAATATTAGAAAATTTACCTAAAAATATTTTAAATCGCGAATCTTTTATTTTTTTTCCGATTTTTATAGATTGTGGGTCTTGATCAATACTATATAACTTTCCATTAACCCCTAATTCTTGAAGAATTGCTTTTGAATGACCACCACCTCCAAATGTACAATCAACATATGTACCGTCTTTTTTTATTTTTAAGTATTGTATGATTTCTTTTGTTAAAACAGGTTTATGAATCAT (SEQ ID NO: 7)
Buchnera aphidicola, штамм G002 (Myzus persicae) Тли (Aphidoidea) Бактериоциты ATGAAAAGTATAAAAACTTTTAAAAAACACTTTCCTGTGAAAAAATATGGACAAAATTTTCTTATTAATAAAGAGATCATAAAAAATATTGTTAAAAAAATTAATCCAAATATAGAACAAACATTAGTAGAAATCGGACCAGGATTAGCTGCATTAACTGAGCCCATATCTCAGTTATTAAAAGAGTTAATAGTTATTGAAATAGACTGTAATCTATTATATTTTTTAAAAAAACAACCATTTTATTCAAAATTAATAGTTTTTTGTCAAGATGCTTTAAACTTTAATTATACAAATTTATTTTATAAAAAAAATAAATTAATTCGTATTTTTGGTAATTTACCATATAATATCTCTACATCTTTAATTATTTTTTTATTTCAACACATTAGAGTAATTCAAGATATGAATTTTATGCTTCAAAAAGAAGTTGCTGCAAGATTAATTGCATTACCTGGAAATAAATATTACGGTCGTTTGAGCATTATATCTCAATATTATTGTGATATCAAAATTTTATTAAATGTTGCTCCTGAAGATTTTTGGCCTATTCCGAGAGTTCATTCTATATTTGTAAATTTAACACCTCATCATAATTCTCCTTATTTTGTTTATGATATTAATATTTTAAGCCTTATTACAAATAAGGCTTTCCAAAATAGAAGAAAAATATTACGTCATAGTTTAAAAAATTTATTTTCTGAAACAACTTTATTAAATTTAGATATTAATCCCAGATTAAGAGCTGAAAATATTTCTGTTTTTCAGTATTGTCAATTAGCTAATTATTTGTATAAAAAAAATTATACTAAAAAAAATTAA (SEQ ID NO: 8)
Buchnera aphidicola, штамм Ak (Acyrthosiphon kondoi) Тли (Aphidoidea) Бактериоциты ATTATAAAAAATTTTAAAAAACATTTTCCTTTAAAAAGGTATGGACAAAATTTTCTTGTCAATACAAAAACTATTCAAAAGATAATTAATATAATTAATCCAAACACCAAACAAACATTAGTGGAAATTGGACCTGGATTAGCTGCATTAACAAAACCAATTTGTCAATTATTAGAAGAATTAATTGTTATTGAAATAGATCCTAATTTATTGTTTTTATTAAAAAAACGTTCATTTTATTCAAAATTAACAGTTTTTTATCAAGACGCTTTAAATTTCAATTATACAGATTTGTTTTATAAGAAAAATCAATTAATTCGTGTTTTTGGAAACTTGCCATATAATATTTCTACATCTTTAATTATTTCTTTATTCAATCATATTAAAGTTATTCAAGATATGAATTTTATGTTACAGAAAGAGGTTGCTGAAAGATTAATTTCTATTCCTGGAAATAAATCTTATGGCCGTTTAAGCATTATTTCTCAGTATTATTGTAAAATTAAAATATTATTAAATGTTGTACCTGAAGATTTTCGACCTATACCGAAAGTGCATTCTGTTTTTATCAATTTAACTCCTCATACCAATTCTCCATATTTTGTTTATGATACAAATATCCTCAGTTCTATCACAAGAAATGCTTTTCAAAATAGAAGGAAAATTTTGCGTCATAGTTTAAAAAATTTATTTTCTGAAAAAGAACTAATTCAATTAGAAATTAATCCAAATTTACGAGCTGAAAATATTTCTATCTTTCAGTATTGTCAATTAGCTGATTATTTATATAAAAAATTAAATAATCTTGTAAAAATCAATTAA (SEQ ID NO: 9)
Buchnera aphidicola, штамм Ua (Uroleucon ambrosiae) Тли (Aphidoidea) Бактериоциты ATGATACTAAATAAATATAAAAAATTTATTCCTTTAAAAAGATACGGACAAAATTTTCTTGTAAATAGAGAAATAATCAAAAATATTATCAAAATAATTAATCCTAAAAAAACGCAAACATTATTAGAAATTGGACCGGGTTTAGGTGCGTTAACAAAACCTATTTGTGAATTTTTAAATGAACTTATCGTCATTGAAATAGATCCTAATATATTATCTTTTTTAAAGAAATGTATATTTTTTGATAAATTAAAAATATATTGTCATAATGCTTTAGATTTTAATTATAAAAATATATTCTATAAAAAAAGTCAATTAATTCGTATTTTTGGAAATTTACCATATAATATTTCTACATCTTTAATAATATATTTATTTCGGAATATTGATATTATTCAAGATATGAATTTTATGTTACAACAAGAAGTGGCTAAAAGATTAGTTGCTATTCCTGGTGAAAAACTTTATGGTCGTTTAAGTATTATATCTCAATATTATTGTAATATTAAAATATTATTACATATTCGACCTGAAAATTTTCAACCTATTCCTAAAGTTAATTCAATGTTTGTAAATTTAACTCCGCATATTCATTCTCCTTATTTTGTTTATGATATTAATTTATTAACTAGTATTACAAAACATGCTTTTCAACATAGAAGAAAAATATTGCGTCATAGTTTAAGAAATTTTTTTTCTGAGCAAGATTTAATTCATTTAGAAATTAATCCAAATTTAAGAGCTGAAAATGTTTCTATTATTCAATATTGTCAATTGGCTAATAATTTATATAAAAAACATAAACAGTTTATTAATAATTAA (SEQ ID NO: 10)
Buchnera aphidicola (Aphis glycines) Тли (Aphidoidea) Бактериоциты ATGAAAAAGCATATTCCTATAAAAAAATTTAGTCAAAATTTTCTTGTAGATTTGAGTGTGATTAAAAAAATAATTAAATTTATTAATCCGCAGTTAAATGAAATATTGGTTGAAATTGGACCGGGATTAGCTGCTATCACTCGACCTATTTGTGATTTGATAGATCATTTAATTGTGATTGAAATTGATAAAATTTTATTAGATAGATTAAAACAGTTCTCATTTTATTCAAAATTAACAGTATATCATCAAGATGCTTTAGCATTTGATTACATAAAGTTATTTAATAAAAAAAATAAATTAGTTCGAATTTTTGGTAATTTACCATATCATGTTTCTACGTCTTTAATATTGCATTTATTTAAAAGAATTAATATTATTAAAGATATGAATTTTATGCTACAAAAAGAAGTTGCTGAACGTTTAATTGCAACTCCAGGTAGTAAATTATATGGTCGTTTAAGTATTATTTCTCAATATTATTGTAATATAAAAGTTTTATTGCATGTGTCTTCAAAATGTTTTAAACCAGTTCCTAAAGTAGAATCAATTTTTCTTAATTTGACACCTTATACTGATTATTTCCCTTATTTTACTTATAATGTAAACGTTCTTAGTTATATTACAAATTTAGCTTTTCAAAAAAGAAGAAAAATATTACGTCATAGTTTAGGTAAAATATTTTCTGAAAAAGTTTTTATAAAATTAAATATTAATCCCAAATTAAGACCTGAGAATATTTCTATATTACAATATTGTCAGTTATCTAATTATATGATAGAAAATAATATTCATCAGGAACATGTTTGTATTTAA (SEQ ID NO: 11)
Annandia pinicola (Phylloxeroidea) Бактериоциты AGATTGAACGCTGGCGGCATGCCTTACACATGCAAGTCGAACGGTAACAGGTCTTCGGACGCTGACGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTGCCCAGTCGTGGGGGATAACTACTCGAAAGAGTAGCTAATACCGCATACGATCTGAGGATGAAAGCGGGGGACCTTCGGGCCTCGCGCGATTGGAGCGGCCGATGGCAGATTAGGTAGTTGGTGGGATAAAAGCTTACCAAGCCGACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGAACTGAGATACGGTCCAGACTCTTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCTATGTCGCGTGTATGAAGAAGACCTTAGGGTTGTAAAGTACTTTCGATAGCATAAGAAGATAATGAGACTAATAATTTTATTGTCTGACGTTAGCTATAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGGGGGTGCTAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCATGTAGGTGGTTTATTAAGTCAGATGTGAAATCCCTGGACTTAATCTAGGAACTGCATTTGAAACTAATAGGCTAGAGTTTCGTAGAGGGAGGTAGAATTCTAGGTGTAGCGGTGAAATGCATAGATATCTAGAGGAATATCAGTGGCGAAGGCGACCTTCTGGACGATAACTGACGCTAAAATGCGAAAGCATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCTGTAAACGATGTCGACTAAGAGGTTGGAGGTATAACTTTTAATCTCTGTAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGGCTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCTGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGTAAAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAATTTTACAGAAATGTAGAAGTGCAATTTGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTTGTTACCATAAGATTTAAGGAACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATAAACTGGAGGAAGGCGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTATGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGATGCAATATTGCGAAATAAAGCCAATCTTATAAAATATGTCCTAGTTCGGACTGGAGTCTGCAACTCGACTCCACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGCATGCCACGGTGAATATGTTTCCAGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAGTGGATTGCAAAAGAAGTAAGAAAATTAACCTTCTTAACAAGGAAATAACTTACCACTTTGTGACTCATAACTGGGGTGA (SEQ ID NO: 12)
Moranella endobia (Coccoidea) Бактериоциты TCTTTTTGGTAAGGAGGTGATCCAACCGCAGGTTCCCCTACGGTTACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTCATGAATCACAAAGTGGTAAGCGCCCTCCTAAAAGGTTAGGCTACCTACTTCTTTTGCAACCCACTTCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCATTCTGATCCACGATTACTAGCGATTCCTACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACGCACTTTATGAGGTCCGCTAACTCTCGCGAGCTTGCTTCTCTTTGTATGCGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGACCGAATCGCTGGCAAAAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAGAGTTCCCGAAGGTACCAAAACATCTCTGCTAAGTTCTCTGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGATTTAACGCGTTAACTACGAAAGCCACAGTTCAAGACCACAGCTTTCAAATCGACATAGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTACCTGAGCGTCAGTATTCGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACTGGTATTCCTCCAGATATCTACACATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCCCCTCTACGAGACTCTAGCCTATCAGTTTCAAATGCAGTTCCTAGGTTAAGCCCAGGGATTTCACATCTGACTTAATAAACCGCCTACGTACTCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGTAGGTAACGTCAATCAATAACCGTATTAAGGATATTGCCTTCCTCCCTACTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGCATCAGGGTTTCCCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCTGGTCATCCTCTCAGACCAGCTAGGGATCGTCGCCTAGGTAAGCTATTACCTCACCTACTAGCTAATCCCATCTGGGTTCATCTGAAGGTGTGAGGCCAAAAGGTCCCCCACTTTGGTCTTACGACATTATGCGGTATTAGCTACCGTTTCCAGCAGTTATCCCCCTCCATCAGGCAGATCCCCAGACTTTACTCACCCGTTCGCTGCTCGCCGGCAAAAAAGTAAACTTTTTTCCGTTGCCGCTCAACTTGCATGTGTTAGGCCTGCCGCCAGCGTTCAATCTGAGCCATGATCAAACTCTTCAATTAAA (SEQ ID NO: 13)
Ishikawaella capsulata Mpkobe (Heteroptera) Бактериоциты AAATTGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTAGCGGCAAGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGTAACAGAAAAAAGCTTGCTTTTTTGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGGATCTACCTAATGGCGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAATGTTGTAAAACCAAAGTGGGGGACCTTATGGCCTCACACCATTAGATGAACCTAGATGGGATTAGCTTGTAGGTGGGGTAAAGGCTCACCTAGGCAACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGATACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCTATGTCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGTACTTTCATCGGGGAAGAAGGATATGAGCCTAATATTCTCATATATTGACGTTACCTGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAACACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCACGTAGGTGGTTTATTAAGTCATATGTGAAATCCCTGGGCTTAACCTAGGAACTGCATGTGAAACTGATAAACTAGAGTTTCGTAGAGGGAGGTGGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCTGGAGGAATATCAGAGGCGAAGGCGACCTTCTGGACGAAAACTGACACTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACAATGTCGACTAAAAAACTGTGAGCTTGACTTGTGGTTTTTGTAGCTAACGCATTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGTCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTGGTCTTGACATCCAGCGAATTATATAGAAATATATAAGTGCCTTTCGGGGAACTCTGAGACGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCCCTTATCCTCTGTTGCCAGCGGCATGGCCGGGAACTCAGAGGAGACTGCCAGTATTAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTATGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGTATACAAAGAGAAGCAATCTCGCAAGAGTAAGCAAAACTCAAAAAGTACATCGTAGTTCGGATTAGAGTCTGCAACTCGACTCTATGAAGTAGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCTCTGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTAAGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTTATAGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTTATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACTGTAGGGGAACCTGTGGTTGGATTACCTCCTTA (SEQ ID NO: 14)
Baumannia cicadellinicola Цикадки (Cicadellinae) Бактериоциты TTCAATTGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGTAAGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGCATCGGAAAGTAAATTAATTACTTTGCCGGCAAGCGGCGAACGGGTGAGTAATATCTGGGGATCTACCTTATGGAGAGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAACACCGCATAATGTCGTCAGACCAAAATGGGGGACCTAATTTAGGCCTCATGCCATAAGATGAACCCAGATGAGATTAGCTAGTAGGTGAGATAATAGCTCACCTAGGCAACGATCTCTAGTTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCTATACCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGGGGAAGAAAATGAAGTTACTAATAATAATTGTCAATTGACGTTACCCGCAAAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTATGTAGGCGGTTTATTTAGTCAGGTGTGAAAGCCCTAGGCTTAACCTAGGAATTGCATTTGAAACTGGTAAGCTAGAGTCTCGTAGAGGGGGGGAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAAGAATACCAGTGGCGAAGGCGCCCCCCTGGACGAAAACTGACGCTCAAGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGAAGGTTGTAGCCTTGAGCTATAGCTTTCGAAGCTAACGCATTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATACAACGCGAAAAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGTATAAAGCAGAAAAGCTTTAGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAACGATTAAGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGAGGATAACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGCATACAAAGAGAAGCAATCTCGTAAGAGTTAGCAAACCTCATAAAGTGCATCGTAGTCCGGATTAGAGTCTGCAACTCGACTCTATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGTATTGCAAAAGAAGTTAGTAGCTTAACTCATAATACGAGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATAACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAACCTGCGGTTGGATCACCTCCTTACACTAAA (SEQ ID NO: 15)
Sodalis-подобные симбионты Rhopalus sapporensis Более широкий тропизм к тканям ATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGCAGCGGGAAGAAGCTTGCTTCTTTGCCGGCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGGATCTGCCCGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTCACACCATCGGATGAACCCAGGTGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGATGGCGTTAATAGCGCTATCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTACGCAGGCGGTCTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGAAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGTGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTGGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTATTGCCAGCGATTCGGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGATCTCGCGAGAGTCAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTG (SEQ ID NO: 16)
Hartigia pinicola Хермес сосновой древесины Бактериоциты AGATTTAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTACCAGAAGAAGCTTGCTTCTTGCTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTATGGGGATCTGCCCGACAGAGGGGGATAACTATTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAATCTCTGAGGAGCAAAGCAGGGGAACTTCGGTCCTTGCGCTATCGGATGAACCCATATGGGATTAGCTAGTAGGTGAGGTAATGGCTCCCCTAGGCAACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCTTTAGGGTTGTAAAGTACTTTCAGTCGAGAGGAAAACATTGATGCTAATATCATCAATTATTGACGTTTCCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTAATTAAGTTAGATGTGAAAGCCCCGGGCTTAACCCAGGAATAGCATATAAAACTGGTCAACTAGAGTATTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCAGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAAACTGACGCTCAAATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTTCCCTTGAGGAGTAGCTTCCGTAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGGAGTACGACTGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGATAATTTAGCAGAAATGCTTTAGTACCTTCGGGAAATCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGATTAGGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGGGAAGCAACCTCGCGAGAGCAAGCGAAACTCATAAATTATGTCGTAGTTCAGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAACTTAACCTTATGGAAAGCGCTTACCACTTTGTGATTCATAACTGGGGTG (SEQ ID NO: 17)
Wigglesworthia glossinidia Муха цеце (Diptera: Glossinidae) Бактериоциты
Бета-протеобактерии
Tremblaya phenacola Phenacoccus avenae (TPPAVE). Бактериомы AGGTAATCCAGCCACACCTTCCAGTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTCACAACCCTTACCTTCGGAACTGCCCTCCTCACAACTCAAACCACCAAACACTTTTAAATCAGGTTGAGAGAGGTTAGGCCTGTTACTTCTGGCAAGAATTATTTCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGAGAACATATTCACCGTGGCATGCTGATCCACGATTACTAGCAATTCCAACTTCATGCACTCGAGTTTCAGAGTACAATCCGAACTGAGGCCGGCTTTGTGAGATTAGCTCCCTTTTGCAAGTTGGCAACTCTTTGGTCCGGCCATTGTATGATGTGTGAAGCCCCACCCATAAAGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCAACTTATCGCTGGCAGTCTCTTTAAGGTAACTGACTAATCCAGTAGCAATTAAAGACAGGGGTTGCGCTCGTTACAGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGCACTAATTCTCTTTCAAGCACTCCCGCTTCTCAACAGGATCTTAGCCATATCAAAGGTAGGTAAGGTTTTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCACATCATCCACTGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGACTTGTGCGTTAGCTGCACCACTGAAAAGGAAAACTGCCCAATGGTTAGTCAACATCGTTTAGGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCATGCTTTAGTGTCTGAGCGTCAGTAACGAACCAGGAGGCTGCCTACGCTTTCGGTATTCCTCCACATCTCTACACATTTCACTGCTACATGCGGAATTCTACCTCCCCCTCTCGTACTCCAGCCTGCCAGTAACTGCCGCATTCTGAGGTTAAGCCTCAGCCTTTCACAGCAATCTTAACAGGCAGCCTGCACACCCTTTACGCCCAATAAATCTGATTAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTTGCCGGTGCTTATTCTTTCGGTACAGTCACACCACCAAATTGTTAGTTGGGTGGCTTTCTTTCCGAACAAAAGTGCTTTACAACCCAAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATTGCTGGATCAGGCTTCCGCCCATTGTCCAAGATTCCTCACTGCTGCCTTCCTCAGAAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGGCCGTCCTCTCAGACCAGCTACCGATCATTGCCTTGGGAAGCCATTACCTTTCCAACAAGCTAATCAGACATCAGCCAATCTCAGAGCGCAAGGCAATTGGTCCCCTGCTTTCATTCTGCTTGGTAGAGAACTTTATGCGGTATTAATTAGGCTTTCACCTAGCTGTCCCCCACTCTGAGGCATGTTCTGATGCATTACTCACCCGTTTGCCACTTGCCACCAAGCCTAAGCCCGTGTTGCCGTTCGACTTGCATGTGTAAGGCATGCCGCTAGCGTTCAATCTGAGCCAGGATCAAACTCT (SEQ ID NO: 18)
Tremblaya princeps Мучнистый червец виноградный Planococcus citri Бактериомы AGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTAGCGGCATGCATTACACATGCAAGTCGTACGGCAGCACGGGCTTAGGCCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACGCCTCGGAACGTGCCTTGTAGTGGGGGATAGCCTGGCGAAAGCCAGATTAATACCGCATGAAGCCGCACAGCATGCGCGGTGAAAGTGGGGGATTCTAGCCTCACGCTACTGGATCGGCCGGGGTCTGATTAGCTAGTTGGCGGGGTAATGGCCCACCAAGGCTTAGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGCACTTTTGTTCGGGATGAAGGGGGGCGTGCAAACACCATGCCCTCTTGACGATACCGAAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATCACTGGGCGTAAAGGGTGCGCGGGTGGTTTGCCAAGACCCCTGTAAAATCCTACGGCCCAACCGTAGTGCTGCGGAGGTTACTGGTAAGCTTGAGTATGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCTGGAGGAATACCGAAGGCGAAGGCAACCCCCTGGGCCATCACTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACCATGTCGACTAGTTGTCGGGGGGAGCCCTTTTTCCTCGGTGACGAAGCTAACGCATGAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGGCGGAGATTCTGCCGAGAGGCGGAAGTGCTCGAAAGAGAATCCGTGCACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCATAACGAGCGCAACCCCCGTCTTTAGTTGCTACCACTGGGGCACTCTATAGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCTTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGCTGGAGCAAAGGGTCGCCAACTCGAGAGAGGGAGCTAATCCCACAAACCCAGCCCCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGCATGCCACGGTGAATACGTTCTCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTAAGCCGCATCAGAAGCAGCCTCCCTAACCCTATGCTGGGAAGGAGGCTGCGAAGGTGGGGTCTATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATTACCT (SEQ ID NO: 19)
Vidania Бактериомы
Nasuia deltocephalinicola Вредоносное насекомое-хозяин Macrosteles quadripunctulatus (Hemiptera: Cicadellidae) Бактериомы AGTTTAATCCTGGCTCAGATTTAACGCTTGCGACATGCCTAACACATGCAAGTTGAACGTTGAAAATATTTCAAAGTAGCGTATAGGTGAGTATAACATTTAAACATACCTTAAAGTTCGGAATACCCCGATGAAAATCGGTATAATACCGTATAAAAGTATTTAAGAATTAAAGCGGGGAAAACCTCGTGCTATAAGATTGTTAAATGCCTGATTAGTTTGTTGGTTTTTAAGGTAAAAGCTTACCAAGACTTTGATCAGTAGCTATTCTGTGAGGATGTATAGCCACATTGGGATTGAAATAATGCCCAAACCTCTACGGAGGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGAGCGAAAGCTTGATCCAGCAATGTCGCGTGTGCGATTAAGGGAAACTGTAAAGCACTTTTTTTTAAGAATAAGAAATTTTAATTAATAATTAAAATTTTTGAATGTATTAAAAGAATAAGTACCGACTAATCACGTGCCAGCAGTCGCGGTAATACGTGGGGTGCGAGCGTTAATCGGATTTATTGGGCGTAAAGTGTATTCAGGCTGCTTAAAAAGATTTATATTAAATATTTAAATTAAATTTAAAAAATGTATAAATTACTATTAAGCTAGAGTTTAGTATAAGAAAAAAGAATTTTATGTGTAGCAGTGAAATGCGTTGATATATAAAGGAACGCCGAAAGCGAAAGCATTTTTCTGTAATAGAACTGACGCTTATATACGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACTATGTCAATTAACTATTAGAATTTTTTTTAGTGGTGTAGCTAACGCGTTAAATTGACCGCCTGGGTATTACGATCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCAGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGATACGCGAAAAACCTTACCTGCCCTTGACATGGTTAGAATTTTATTGAAAAATAAAAGTGCTTGGAAAAGAGCTAACACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTACTCTTAGTTGCTAATTAAAGAACTTTAAGAGAACAGCTAACAATAAGTTTAGAGGAAGGAGGGGATGACTTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGCAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTTAATACAAAAAGTTGCAATATCGTAAGATTGAGCTAATCTTTAAAATTAATCTTAGTTCGGATTGTACTCTGCAACTCGAGTACATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATAGTTTAACTGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAATAAATCTTGTTTTAAATGAAGTAATATATTTTATCAAAACAGGTTTTGTAACCGGGGTGAAGTCGTAACA (SEQ ID NO: 20)
Zinderia insecticola CARI Пенница Clastoptera arizonana Бактериоциты ATATAAATAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTAGCGGTATGCTTTACACATGCAAGTCGAACGACAATATTAAAGCTTGCTTTAATATAAAGTGGCGAACGGGTGAGTAATATATCAAAACGTACCTTAAAGTGGGGGATAACTAATTGAAAAATTAGATAATACCGCATATTAATCTTAGGATGAAAATAGGAATAATATCTTATGCTTTTAGATCGGTTGATATCTGATTAGCTAGTTGGTAGGGTAAATGCTTACCAAGGCAATGATCAGTAGCTGGTTTTAGCGAATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTTCTACGGAAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGAGAAATCCTGATCCAGCAATACCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTCGTAAAACTCTTTTGTTAGGAAAGAAATAATTTTAAATAATATTTAAAATTGATGACGGTACCTAAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGTGCGTAGGCTGTTATATAAGATAGATGTGAAATACTTAAGCTTAACTTAAGAACTGCATTTATTACTGTTTAACTAGAGTTTATTAGAGAGAAGTGGAATTTTATGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATATAAAGGAATATCGATGGCGAAGGCAGCTTCTTGGAATAATACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACTATGTCTACTAGTTATTAAATTAAAAATAAAATTTAGTAACGTAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGATCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACACGAAAAACCTTACCTACTCTTGACATGTTTGGAATTTTAAAGAAATTTAAAAGTGCTTGAAAAAGAACCAAAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTATTATTTGCTAATAAAAAGAACTTTAATAAGACTGCCAATGACAAATTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGAGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGATATATACAATGGGTAGCAAATTTGTGAAAATGAGCCAATCCTTAAAGTATATCTTAGTTCGGATTGTAGTCTGCAACTCGACTACATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCTCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAGTGATTTTTACCAGAAATTATTTGTTTAACCTTTATTGGAAAAAAATAATTAAGGTAGAATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCAGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATTACATTTTAAAT (SEQ ID NO: 21)
Profftella armatura Diaphorina citri, азиатская цитрусовая листоблошка Бактериомы
Альфа-протеобактерии
Hodgkinia Цикада
Diceroprocta semicincta
Бактериом AATGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGACAACGTTCAAACGTTGTTAGCGGCGAACGGGTGAGTAATACGTGAGAATCTACCCATCCCAACGTGATAACATAGTCAACACCATGTCAATAACGTATGATTCCTGCAACAGGTAAAGATTTTATCGGGGATGGATGAGCTCACGCTAGATTAGCTAGTTGGTGAGATAAAAGCCCACCAAGGCCAAGATCTATAGCTGGTCTGGAAGGATGGACAGCCACATTGGGACTGAGACAAGGCCCAACCCTCTAAGGAGGGCAGCAGTGAGGAATATTGGACAATGGGCGTAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCATGAGTGATTGAAGGTCCAACGGACTGTAAAACTCTTTTCTCCAGAGATCATAAATGATAGTATCTGGTGATATAAGCTCCGGCCAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAGGGGAGCGAGTATTGTTCGGTTTTATTGGGCGTAAAGGGTGTCCAGGTTGCTAAGTAAGTTAACAACAAAATCTTGAGATTCAACCTCATAACGTTCGGTTAATACTACTAAGCTCGAGCTTGGATAGAGACAAACGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTTGATACTTGGAGGAACACCAGAGGCGAAGGCGGTTTGTCATACCAAGCTGACACTGAAGACACGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCCTAAACGTTGAGTGCTAACAGTTCGATCAAGCCACATGCTATGATCCAGGATTGTACAGCTAACGCGTTAAGCACTCCGCCTGGGTATTACGACCGCAAGGTTAAAACTCAAAGGAATTGACGGAGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACACGAAGAACCTTACCAGCCCTTGACATACCATGGCCAACCATCCTGGAAACAGGATGTTGTTCAAGTTAAACCCTTGAAATGCCAGGAACAGGTGCTGCATGGCTGTTGTCAGTTCGTGTCGTGAGATGTATGGTTAAGTCCCAAAACGAACACAACCCTCACCCATAGTTGCCATAAACACAATTGGGTTCTCTATGGGTACTGCTAACGTAAGTTAGAGGAAGGTGAGGACCACAACAAGTCATCATGGCCCTTATGGGCTGGGCCACACACATGCTACAATGGTGGTTACAAAGAGCCGCAACGTTGTGAGACCGAGCAAATCTCCAAAGACCATCTCAGTCCGGATTGTACTCTGCAACCCGAGTACATGAAGTAGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGCATGCCACGGTGAATACGTTCTCGGGTCTTGTACACGCCGCCCGTCACACCATGGGAGCTTCGCTCCGATCGAAGTCAAGTTACCCTTGACCACATCTTGGCAAGTGACCGA (SEQ ID NO: 22)
Wolbachia sp. wPip Комар
Culex quinquefasciatus
Бактериом AAATTTGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAATGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGAGTTATATTGTAGCTTGCTATGGTATAACTTAGTGGCAGACGGGTGAGTAATGTATAGGAATCTACCTAGTAGTACGGAATAATTGTTGGAAACGACAACTAATACCGTATACGCCCTACGGGGGAAAAATTTATTGCTATTAGATGAGCCTATATTAGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATAGCCTACCAAGGTAATGATCTATAGCTGATCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGATACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCATGAGTGAAGAAGGCCTTTGGGTTGTAAAGCTCTTTTAGTGAGGAAGATAATGACGGTACTCACAGAAGAAGTCCTGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGAGGGCTAGCGTTATTCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCGCGTAGGCTGGTTAATAAGTTAAAAGTGAAATCCCGAGGCTTAACCTTGGAATTGCTTTTAAAACTATTAATCTAGAGATTGAAAGAGGATAGAGGAATTCCTGATGTAGAGGTAAAATTCGTAAATATTAGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGTCTATCTGGTTCAAATCTGACGCTGAAGCGCGAAGGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGAATGTTAAATATGGGGAGTTTACTTTCTGTATTACAGCTAACGCGTTAAACATTCCGCCTGGGGACTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCACTTCTTGACATGAAAATCATACCTATTCGAAGGGATAGGGTCGGTTCGGCCGGATTTTACACAAGTGTTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCATCCTTAGTTGCCATCAGGTAATGCTGAGTACTTTAAGGAAACTGCCAGTGATAAGCTGGAGGAAGGTGGGGATGATGTCAAGTCATCATGGCCTTTATGGAGTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGTCTACAATGGGCTGCAAGGTGCGCAAGCCTAAGCTAATCCCTAAAAGACATCTCAGTTCGGATTGTACTCTGCAACTCGAGTACATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGCATGCCACGGTGAATACGTTCTCGGGTCTTGTACACACTGCCCGTCACGCCATGGGAATTGGTTTCACTCGAAGCTAATGGCCTAACCGCAAGGAAGGAGTTATTTAAAGTGGGATCAGTGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCAGTAGGGGAATCTGCAGCTGGATTACCTCCTTA (SEQ ID NO: 23)
Bacteroidetes
Uzinura diaspidicola Щитовки Бактериоциты AAAGGAGATATTCCAACCACACCTTCCGGTACGGTTACCTTGTTACGACTTAGCCCTAGTCATCAAGTTTACCTTAGGCAGACCACTGAAGGATTACTGACTTCAGGTACCCCCGACTCCCATGGCTTGACGGGCGGTGTGTACAAGGTTCGAGAACATATTCACCGCGCCATTGCTGATGCGCGATTACTAGCGATTCCTGCTTCATAGAGTCGAATTGCAGACTCCAATCCGAACTGAGACTGGTTTTAGAGATTAGCTCCTGATCACCCAGTGGCTGCCCTTTGTAACCAGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAAGGCATAGAGGCCATGATGATTTGACATCATCCCCACCTTCCTCACAGTTTACACCGGCAGTTTTGTTAGAGTCCCCGGCTTTACCCGATGGCAACTAACAATAGGGGTTGCGCTCGTTATAGGACTTAACCAAACACTTCACAGCACGAACTGAAGACAACCATGCAGCACCTTGTAATACGTCGTATAGACTAAGCTGTTTCCAGCTTATTCGTAATACATTTAAGCCTTGGTAAGGTTCCTCGCGTATCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGAACCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAATCTTGCGACTGTACTTCCCAGGTGGATCACTTATCGCTTTCGCTAAGCCACTGAATATCGTTTTTCCAATAGCTAGTGATCATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCACTGAGCGTCAGTAAAGATTTAGCAACCTGCCTTCGCTATCGGTGTTCTGTATGATATCTATGCATTTCACCGCTACACCATACATTCCAGATGCTCCAATCTTACTCAAGTTTACCAGTATCAATAGCAATTTTACAGTTAAGCTGTAAGCTTTCACTACTGACTTAATAAACAGCCTACACACCCTTTAAACCCAATAAATCCGAATAACGCTTGTGTCATCCGTATTGCCGCGGCTGCTGGCACGGAATTAGCCGACACTTATTCGTATAGTACCTTCAATCTCCTATCACGTAAGATATTTTATTTCTATACAAAAGCAGTTTACAACCTAAAAGACCTTCATCCTGCACGCGACGTAGCTGGTTCAGAGTTTCCTCCATTGACCAATATTCCTCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGTCCGTGTCTCAGTACCAGTGTGGAGGTACACCCTCTTAGGCCCCCTACTGATCATAGTCTTGGTAGAGCCATTACCTCACCAACTAACTAATCAAACGCAGGCTCATCTTTTGCCACCTAAGTTTTAATAAAGGCTCCATGCAGAAACTTTATATTATGGGGGATTAATCAGAATTTCTTCTGGCTATACCCCAGCAAAAGGTAGATTGCATACGTGTTACTCACCCATTCGCCGGTCGCCGACAAATTAAAAATTTTTCGATGCCCCTCGACTTGCATGTGTTAAGCTCGCCGCTAGCGTTAATTCTGAGCCAGGATCAAACTCTTCGTTGTAG (SEQ ID NO: 24)
Sulcia muelleri Сине-зеленые цикадки и несколько других видов цикадок Бактериоциты CTCAGGATAAACGCTAGCGGAGGGCTTAACACATGCAAGTCGAGGGGCAGCAAAAATAATTATTTTTGGCGACCGGCAAACGGGTGAGTAATACATACGTAACTTTCCTTATGCTGAGGAATAGCCTGAGGAAACTTGGATTAATACCTCATAATACAATTTTTTAGAAAGAAAAATTGTTAAAGTTTTATTATGGCATAAGATAGGCGTATGTCCAATTAGTTAGTTGGTAAGGTAATGGCTTACCAAGACGATGATTGGTAGGGGGCCTGAGAGGGGCGTTCCCCCACATTGGTACTGAGACACGGACCAAACTTCTACGGAAGGCTGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGAGGAAACTCTGAACCAGCCACTCCGCGTGCAGGATGAAAGAAAGCCTTATTGGTTGTAAACTGCTTTTGTATATGAATAAAAAATTCTAATTATAGAAATAATTGAAGGTAATATACGAATAAGTATCGACTAACTCTGTGCCAGCAGTCGCGGTAAGACAGAGGATACAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGTGCGTAGGCGGTTTTTAAAGTCAGTAGTGAAATCTTAAAGCTTAACTTTAAAAGTGCTATTGATACTGAAAAACTAGAGTAAGGTTGGAGTAACTGGAATGTGTGGTGTAGCGGTGAAATGCATAGATATCACACAGAACACCGATAGCGAAAGCAAGTTACTAACCCTATACTGACGCTGAGTCACGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGATCACTAACTATTGGGTTTTATACGTTGTAATTCAGTGGTGAAGCGAAAGTGTTAAGTGATCCACCTGAGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAATCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGATACACGAGGAACCTTACCAAGACTTAAATGTACTACGAATAAATTGGAAACAATTTAGTCAAGCGACGGAGTACAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTAAGGTTAAGTCCTTTAAACGAGCGCAACCCTTATTATTAGTTGCCATCGAGTAATGTCAGGGGACTCTAATAAGACTGCCGGCGCAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCACGGCCCTTACGTCTTGGGCCACACACGTGCTACAATGATCGGTACAAAAGGGAGCGACTGGGTGACCAGGAGCAAATCCAGAAAGCCGATCTAAGTTCGGATTGGAGTCTGAAACTCGACTCCATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTGCATCAGCCATGGCACGGTGAATATGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGGAAGTTGGAAGTACCTAAAGTTGGTTCGCTACCTAAGGTAAGTCTAATAACTGGGGCTAAGTCGTAACAAGGTA (SEQ ID NO: 25)
Дрожжеподобные симбионты
Symbiotaphrina buchneri, контрольный штамм JCM9740 Жуки-точильщики Stegobium paniceum Мицетома между передней и средней кишкой AGATTAAGCCATGCAAGTCTAAGTATAAGNAATCTATACNGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTACTACATGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAACCCCGACTTCGGAAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAATGCCCTTCGGGGCTCCTTGGTGATTCATGATAACTTAACGAATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTTTTAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGCTCTTTTGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGCCTGGCTGGCCGGTCCGCCTAACCGCGTGTACTGGTCCGGCCGGGCCTTTCCTTCTGGGGAGCCGCATGCCCTTCACTGGGTGTGTCGGGGAACCAGGACTTTTACTTTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTATGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGCGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGATAGTCGGGGGCATCAGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGTGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGGCGATGTTATTATTTTGACTCGCTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACACATTAAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTATGTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGCCCGGTCCGCTTTGGCGGGCCGCTGGCTTCTTAGAGGGACTATCGGCTCAAGCCGATGGAAGTTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGACAGAGCCAACGAGTAAATCACCTTGGCCGGAAGGTCTGGGTAATCTTGTTAAACTCTGTCGTGCTGGGGATAGAGCATTGCAATTATTGCTCTTCAACGAGGAATTCCTAGTAAGCGCAAGTCATCAGCTTGCGCTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTCAGTGAGGCCTTCGGACTGGCACAGGGACGTTGGCAACGACGACCCAGTGCCGGAAAGTTGGTCAAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTA (SEQ ID NO: 26)
Symbiotaphrina kochii, контрольный штамм CBS 589.63 Жуки-точильщики Lasioderma serricorne Мицетома TACCTGGTTGATTCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGCAAGTCTAAGTATAAGCAATCTATACGGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTACTACATGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAACCTCGACTTCGGAAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAATGCCCTTCGGGGCTCCTTGGTGATTCATGATAACTTAACGAATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTTTCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGCTCTTTTGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGCCTGGCTGGCCGGTCCGCCTAACCGCGTGTACTGGTCCGGCCGGGCCTTTCCTTCTGGGGAGCCGCATGCCCTTCACTGGGTGTGTCGGGGAACCAGGACTTTTACTTTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTATGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGATAGTCGGGGGCATCAGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGTGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGGCGATGTTATTATTTTGACTCGCTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACACATTAAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTATGTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGCCCGGTCCGCTTTGGCGGGCCGCTGGCTTCTTAGAGGGACTATCGGCTCAAGCCGATGGAAGTTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGACAGAGCCAACGAGTACATCACCTTGGCCGGAAGGTCTGGGTAATCTTGTTAAACTCTGTCGTGCTGGGGATAGAGCATTGCAATTATTGCTCTTCAACGAGGAATTCCTAGTAAGCGCAAGTCATCAGCTTGCGCTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTCAGTGAGGCCTTCGGACTGGCACAGGGACGTTGGCAACGACGACCCAGTGCCGGAAAGTTCGTCAAACTTGGTCATTTAGAGGAAGNNNAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTA (SEQ ID NO: 27)
Первичный внеклеточный симбионт Хозяин Местоположение 16S рРНК
Бактерии, расщепляющие фенитротион
Burkholderia sp. SFA1 Riptortus pedestris Кишка AGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCATGCCTTACACATGCAAGTCGAACGGCAGCACGGGGGCAACCCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTGTCCTGTAGTGGGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCGCATACGACCTAAGGGAGAAAGCGGGGGATCTTCGGACCTCGCGCTATAGGGGCGGCCGATGGCAGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAAACTTCGTCCCTAATATGGATGGAGGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTCTGTTAAGACCGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTGGTGACTGGCAGGCTTTGAGTGTGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGCCAACTACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGGGATTCATTTCCTTAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGGTCGGAACCCTGCTGAAAGGTGGGGGTGCTCGAAAGAGAACCGGCGCACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCTACGCAAGAGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGAACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCCAATCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTCACCAGAAGTAGGTAGCCTAACCGCAAGGAGGGCGCTTACCACGGTGGGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGC (SEQ ID NO: 28)
Burkholderia sp. KM-A Riptortus pedestris Кишка GCAACCCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTGTCCTGTAGTGGGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCGCATACGATCTACGGAAGAAAGCGGGGGATCCTTCGGGACCTCGCGCTATAGGGGCGGCCGATGGCAGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAAACGTCTTGGTTAATACCTGAGGCGGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTCTGTTAAGACCGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTGGTGACTGGCAGGCTTTGAGTGTGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGCCAACACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGGGATTCATTTCCTTAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGGTCGGAAGTCTGCTGAGAGGTGGACGTGCTCGAAAGAGAACCGGCGCACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCTACGCAAGAGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGAACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCCAATCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTCACCAGAAGTAGGTAGCCTAACCGCAAGGAGGGCGCTTACCACGGTGGGATTCATGACTGGGGTGAAGT (SEQ ID NO: 29)
Burkholderia sp. KM-G Riptortus pedestris Кишка GCAACCCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTGTCCTGTAGTGGGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCGCATACGACCTAAGGGAGAAAGCGGGGGATCTTCGGACCTCGCGCTATAGGGGCGGCCGATGGCAGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAAACTTCGAGGTTAATACCCTTGGAGGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTCTGTTAAGACCGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTGGTGACTGGCAGGCTTTGAGTGTGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGCCAACACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGGGATTCATTTCCTTAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGGTCGGAAGTCTGCTGAGAGGTGGACGTGCTCGAAAGAGAACCGGCGCACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCTACGCAAGAGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGAACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCCAATCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTCACCAGAAGTAGGTAGCCTAACCTGCAAAGGAGGGCGCTTACCACG (SEQ ID NO: 30)
Snodgrassella alvi Пчела медоносная (Apis mellifera) и Bombus spp. Подвздошная кишка GAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCATGCCTTACACATGCAAGTCGAACGGCAGCACGGAGAGCTTGCTCTCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGCATCGGAACGTACCGAGTAATGGGGGATAACTGTCCGAAAGGATGGCTAATACCGCATACGCCCTGAGGGGGAAAGCGGGGGATCGAAAGACCTCGCGTTATTTGAGCGGCCGATGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGGAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTCTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGGACTTTTGTTAGGGAAGAAAAGCCGGGTGTTAATACCATCTGGTGCTGACGGTACCTAAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGACGGTTAATTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGAGCTCAACTTGGGACGTGCATTTGAAACTGGTTAACTAGAGTGTGTCAGAGGGAGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCTCCTGGGATAACACTGACGTTCATGCTCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGACAATTAGCTGTTGGGACACTAGATGTCTTAGTAGCGAAGCTAACGCGTGAAATTGTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATGTACGGAATCTCTTAGAGATAGGAGAGTGCCTTCGGGAACCGTAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGACCAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGTACAGAGGGTAGCGAAGCCGCGAGGTGAAGCCAATCTCAGAAAGCCGATCGTAGTCCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCATACTGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGGGATACCAGAATTGGGTAGACTAACCGCAAGGAGGTCGCTTAACACGGTATGCTTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAG (SEQ ID NO: 33)
Gilliamella apicola Пчела медоносная (Apis mellifera) и Bombus spp. Подвздошная кишка TTAAATTGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGTAACATGAGTGCTTGCACTTGATGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAAAGTATGGGGATCTGCCGAATGGAGGGGGACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATAAAGTTGAGAGACCAAAGCATGGGACCTTCGGGCCATGCGCCATTTGATGAACCCATATGGGATTAGCTAGTTGGTAGGGTAATGGCTTACCAAGGCGACGATCTCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCGGTGATGAGGAAGGTGGTGTATCTAATAGGTGCATCAATTGACGTTAATTACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATGACTGGGCGTAAAGGGCATGTAGGCGGATAATTAAGTTAGGTGTGAAAGCCCTGGGCTCAACCTAGGAATTGCACTTAAAACTGGTTAACTAGAGTATTGTAGAGGAAGGTAGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCTTCTGGACAGATACTGACGCTGAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGTTTGTTGCCTAGAGTGATGGGCTCCGAAGCTAACGCGATAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAATCTTGCAGAGATGCGGGAGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCATCGGTTAGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCGTTGATAAAGCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGTATACAAAGGGAGGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTACGTCTAAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGATAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGTTTACCACGGTGTGGTCCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAACCTGCGGTTGGATCACCTCCTTAC (SEQ ID NO: 34)
Bartonella apis Пчела медоносная (Apis mellifera) Кишка AAGCCAAAATCAAATTTTCAACTTGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAACGCACTTTTCGGAGTGAGTGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATCTACCTATTTCTACGGAATAACGCAGAGAAATTTGTGCTAATACCGTATACGTCCTTCGGGAGAAAGATTTATCGGAGATAGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCCCACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACCGGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATATTTAAGTCAGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCTTTGATACTGGATATCTTGAGTATGGAAGAGGTAAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTACTGGTCCATTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGAATGTTAGCCGTTGGACAGTTTACTGTTCGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCCCTTGACATCCCGATCGCGGATGGTGGAGACACCGTCTTTCAGTTCGGCTGGATCGGTGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGGGACTGCCGGTGATAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGCAGCGAGACCGCGAGGTCGAGCTAATCTCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGCATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTTTACCCGAAGGTGCTGTGCTAACCGCAAGGAGGCAGGCAACCACGGTAGGGTCAGCGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGGGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTTTCTAAGGAAGATGAAGAATTGGAA (SEQ ID NO: 35)
Parasaccharibacter apium Пчела медоносная (Apis mellifera) Кишка CTACCATGCAAGTCGCACGAAACCTTTCGGGGTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTTAGGAACCTATCTGGAGGTGGGGGATAACATCGGGAAACTGGTGCTAATACCGCATGATGCCTGAGGGCCAAAGGAGAGATCCGCCATTGGAGGGGCCTGCGTTCGATTAGCTAGTTGGTTGGGTAAAGGCTGACCAAGGCGATGATCGATAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTCACTAGGGAAGATGATGACGGTACCTAGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATGACTGGGCGTAAAGGGCGCGTAGGCTGTTTGTACAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTTGATACGTGCAGACTAGAGTCCGAGAGAGGGTTGTGGAATTCCCAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTGGGAAGAACACCGGTTGCGAAGGCGGCAACCTGGCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAGCTAACGCGTTAAGCACACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGGGCTTGCATGGGGAGGCTGTATTCAGAGATGGATATTTCTTCGGACCTCCCGCACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTTTAGTTGCCATCACGTCTGGGTGGGCACTCTAGAGAGACTGCCGGTGACAAGCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGTCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGGTGACAGAGGGATGCTACATGGTGACATGGTGCTGATCTCAAAAAACCGTCTCAGTTCGGATTGTACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGGTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTTGACCTTAAGCCGGTGAGCGAACCGCAAGGAACGCAGCCGACCACCGGTTCGGGTTCAGCGACTGGGGGA (SEQ ID NO: 36)
Lactobacillus kunkeei Пчела медоносная (Apis mellifera) Кишка TTCCTTAGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCAGGTTCTCCTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCTAATCATCTGTCCCACCTTAGACGACTAGCTCCTAAAAGGTTACCCCATCGTCTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCATGCTGATCCACGATTACTAGTGATTCCAACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAATGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTTTCGCGACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGCTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCTCACTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAATAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTCTGTCCCCGAAGGGAACGCCCAATCTCTTGGGTTGGCAGAAGATGTCAAGAGCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCACTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAATACTTAATGCGTTAGCTGCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGTATTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTAACAGACCAGAAAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTTTCCTCTTCTGTACTCAAGTTTTGTAGTTTCCACTGCACTTCCTCAGTTGAGCTGAGGGCTTTCACAGCAGACTTACAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAAATACCGTCAAAGTGTTAACAGTTACTCTAACACTTGTTCTTCTTTAACAACAGAGTTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATCGTCTTGGTGGGCTTTTATCTCACCAACTAACTAATACGGCGCGGGTCCATCCCAAAGTGATAGCAAAGCCATCTTTCAAGTTGGAACCATGCGGTTCCAACTAATTATGCGGTATTAGCACTTGTTTCCAAATGTTATCCCCCGCTTCGGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCGCTCCGAATCCAAAAATCATTTATGCAAGCATAAAATCAATTTGGGAGAACTCGTTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCCAGGATCAAACTCTCATCTTAA (SEQ ID NO: 37)
Lactobacillus Firm-4 Пчела медоносная (Apis mellifera) Кишка ACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGCGGGAAGTCAGGGAAGCCTTCGGGTGGAACTGGTGGAACGAGCGGCGGATGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCTAAAGCGGGGGATACCATCTGGAAACAGGTGCTAATACCGCATAAACCCAGCAGTCACATGAGTGCTGGTTGAAAGACGGCTTCGGCTGTCACTTTAGGATGGACCTGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGGAGTAACGGTTCACCAAGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGGATGAAGAAGGTCTTCGGATCGTAAAATCCTGTTGTTGAAGAAGAACGGTTGTGAGAGTAACTGCTCATAACGTGACGGTAATCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGGGAGCGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTGAATGTGAAAGCCCTCAGCTTAACTGAGGAAGAGCATCGGAAACTGAGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTTACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGAGGTTTCCGCCTCTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTCCTGCAAGCCTAAGAGATTAGGGGTTCCCTTCGGGGACAGGAAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAATGAGAAGCGAACTCGCGAGGGGAAGCTGATCTCTGAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCC (SEQ ID NO: 38)
Шелкопряд
Энтерококк Bombyx mori Кишка AGGTGATCCAGCCGCACCTTCCGATACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCCAATCATCTATCCCACCTTAGGCGGCTGGCTCCAAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGGCTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAGAAGCTTTAAGAGATTTGCATGACCTCGCGGTCTAGCGACTCGTTGTACTTCCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCGCTAGAGTGCCCAACTAAATGATGGCAACTAACAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTTTGTCCCCGAAGGGAAAGCTCTATCTCTAGAGTGGTCAAAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTTGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGATACCGTCAGGGGACGTTCAGTTACTAACGTCCTTGTTCTTCTCTAACAACAGAGTTTTACGATCCGAAAACCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCGGTCAGACTTTCGTCCATTGCCGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTATGCATCGTGGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCACCGCGGGTCCATCCATCAGCGACACCCGAAAGCGCCTTTCACTCTTATGCCATGCGGCATAAACTGTTATGCGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGTTATCCCCCTCTGATGGGTAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCACTCCTCTTTCCAATTGAGTGCAAGCACTCGGGAGGAAAGAAGCGTTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCCAGGATCAAACTCT (SEQ ID NO: 39)
Delftia Bombyx mori Кишка CAGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCACCTTCCGATACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTCACGAACCCCGCCGTGGTAAGCGCCCTCCTTGCGGTTAGGCTACCTACTTCTGGCGAGACCCGCTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGACTGGTTTTATGGGATTAGCTCCCCCTCGCGGGTTGGCAACCCTCTGTACCAGCCATTGTATGACGTGTGTAGCCCCACCTATAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCATTAGAGTGCTCAACTGAATGTAGCAACTAATGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTGCAGGTTCTCTTTCGAGCACGAATCCATCTCTGGAAACTTCCTGCCATGTCAAAGGTGGGTAAGGTTTTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATCATCCACCGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTCACGCGTTAGCTTCGTTACTGAGAAAACTAATTCCCAACAACCAGTTGACATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCATGAGCGTCAGTACAGGTCCAGGGGATTGCCTTCGCCATCGGTGTTCCTCCGCATATCTACGCATTTCACTGCTACACGCGGAATTCCATCCCCCTCTACCGTACTCTAGCCATGCAGTCACAAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACATCTGTCTTACATAACCGCCTGCGCACGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCTTACGGTACCGTCATGGGCCCCCTGTATTAGAAGGAGCTTTTTCGTTCCGTACAAAAGCAGTTTACAACCCGAAGGCCTTCATCCTGCACGCGGCATTGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAAAATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGGTCGTCCTCTCAGACCAGCTACAGATCGTCGGCTTGGTAAGCTTTTATCCCACCAACTACCTAATCTGCCATCGGCCGCTCCAATCGCGCGAGGCCCGAAGGGCCCCCGCTTTCATCCTCAGATCGTATGCGGTATTAGCTACTCTTTCGAGTAGTTATCCCCCACGACTGGGCACGTTCCGATGTATTACTCACCCGTTCGCCACTCGTCAGCGTCCGAAGACCTGTTACCGTTCGACTTGCATGTGTAAGGCATGCCGCCAGCGTTCAATCTGAGCCAGGATCAAACTCTACAGTTCGATCT (SEQ ID NO: 40)
Pelomonas Bombyx mori Кишка ATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCATGCCTTACACATGCAAGTCGAACGGTAACAGGTTAAGCTGACGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATATATCGGAACGTGCCCAGTCGTGGGGGATAACTGCTCGAAAGAGCAGCTAATACCGCATACGACCTGAGGGTGAAAGCGGGGGATCGCAAGACCTCGCNNGATTGGAGCGGCCGATATCAGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCCACCAAGCCAACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGCGGGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAACCGCTTTTGTCAGGGAAGAAAAGGTTCTGGTTAATACCTGGGACTCATGACGGTACCTGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTATGCAAGACAGAGGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCCTTTGTGACTGCATAGCTAGAGTACGGTAGAGGGGGATGGAATTCCGCGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATGCGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAATCCCCTGGACCTGTACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTGGTTGTTGGGAGGGTTTCTTCTCAGTAACGTANNTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGCCAGGAATCCTGAAGAGATTTGGGAGTGCTCGAAAGAGAACCTGGACACAGGTGCTGCATGGCCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCTACGAAAGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAGGTCATCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTACACACGTCATACAATGGCCGGGACAGAGGGCTGCCAACCCGCGAGGGGGAGCTAATCCCAGAAACCCGGTCGTAGTCCGGATCGTAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCTTGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGCGGGTTCTGCCAGAAGTAGTTAGCCTAACCGCAAGGAGGGCGATTACCACGGCAGGGTTCGTGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCAC (SEQ ID NO: 41)

Например, комар (например, Aedes spp. или Anopheles spp.) содержит симбиотические бактерии, которые модулируют иммунный ответ комара и влияют на способность к переносу патогенов. Модулирующее средство, описанное в данном документе, может быть пригодным для целенаправленного воздействия на бактерий, обитающих в организме комара, в том числе без ограничения EspZ, Serratia spp (например, Serratia marcescens), Enterobacteriaceae spp., Enterobacter spp. (например, Enterobacter cloacae, Enterobacter amnigenus, Enterobacter ludwigii), Proteus spp., Acinetobacter spp., Wigglesworthia spp. (Wigglesworthia gloosinidia), Xanthomonas spp. (например, Xanthomonas maltophilia), Pseudomonas spp. (например, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas rhodesiae), Escherichia spp. (например, Escherichia coli), Cedecea spp. (например, Cedecea lapagei), Ewingella spp. (например, Ewingella americana), Bacillus spp. (например, Bacillus pumilus), Comamonas spp., или Vagococcus spp. (например, Vagococcus salmoninarium), или Wolbachia spp. (например, Wolbachia - wMel, Wolbachia - wAlbB, Wolbachia - wMelPop, Wolbachia - wMelPop-CLA).

На любое количество видов бактерий можно целенаправленно воздействовать с помощью композиций или способов, описанных в данном документе. Например, в некоторых случаях модулирующее средство может целенаправленно воздействовать на один вид бактерий. В некоторых случаях модулирующее средство может целенаправленно воздействовать на по меньшей мере приблизительно любой из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 500 или больше различных видов бактерий. В некоторых случаях модулирующее средство может целенаправленно воздействовать на любой из от приблизительно 1 до приблизительно 5, от приблизительно 5 до приблизительно 10, от приблизительно 10 до приблизительно 20, от приблизительно 20 до приблизительно 50, от приблизительно 50 до приблизительно 100, от приблизительно 100 до приблизительно 200, от приблизительно 200 до приблизительно 500, от приблизительно 10 до приблизительно 50, от приблизительно 5 до приблизительно 20 или от приблизительно 10 до приблизительно 100 различных видов бактерий. В некоторых случаях модулирующее средство может целенаправленно воздействовать на по меньшей мере приблизительно любые из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или больше типов, классов, порядков, семейств или родов бактерий.

В некоторых случаях модулирующее средство может увеличивать популяцию одной или нескольких бактерий (например, патогенных бактерий, бактерий, продуцирующих токсин) на по меньшей мере приблизительно любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или больше в организме хозяина по сравнению с организмом-хозяином, которому модулирующее средство не было введено. В некоторых случаях модулирующее средство может уменьшать популяцию одной или нескольких бактерий (например, симбиотических бактерий, бактерий, расщепляющих пестициды, например, бактерии, которая расщепляет любой из пестицидов, приведенных в таблице 12) на по меньшей мере приблизительно любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или больше в организме хозяина по сравнению с организмом-хозяином, которому модулирующее средство не было введено. В некоторых случаях модулирующее средство может уничтожать популяцию бактерии (например, симбиотических бактерий, бактерий, расщепляющих пестициды, например, бактерии, которая расщепляет любой из пестицидов, приведенных в таблице 12) в организме хозяина. В некоторых случаях модулирующее средство может повышать уровень одной или нескольких патогенных бактерий на по меньшей мере приблизительно любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или больше в организме хозяина и/или может снижать уровень одной или нескольких симбиотических бактерий на по меньшей мере приблизительно любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или больше в организме хозяина по сравнению с организмом-хозяином, которому модулирующее средство не было введено.

В некоторых случаях модулирующее средство может изменять разнообразие бактерий и/или состав бактерий хозяина. В некоторых случаях модулирующее средство может увеличивать разнообразие бактерий в организме хозяина относительно исходного разнообразия на по меньшей мере приблизительно любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или больше по сравнению с организмом-хозяином, которому модулирующее средство не было введено. В некоторых случаях модулирующее средство может уменьшать разнообразие бактерий в организме хозяина относительно исходного разнообразия на по меньшей мере приблизительно любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или больше по сравнению с организмом-хозяином, которому модулирующее средство не было введено.

В некоторых случаях модулирующее средство может изменять функцию, активность, рост и/или деление одной или нескольких бактериальных клеток. Например, модулирующее средство может изменять экспрессию одного или нескольких генов в бактерии. В некоторых случаях модулирующее средство может изменять функцию одного или нескольких белков в бактерии. В некоторых случаях модулирующее средство может изменять функцию одной или нескольких клеточных структур (например, клеточной стенки, внешней или внутренней мембраны) в бактерии. В некоторых случаях модулирующее средство может уничтожать (например, лизировать) бактерию.

Бактерия-мишень может обитать в одной или нескольких частях организма насекомого. Кроме того, бактерия-мишень может быть внутриклеточной или внеклеточной. В некоторых случаях бактерии обитают в одной или нескольких частях кишки хозяина, в том числе, например, в передней кишке, средней кишке и/или задней кишке. В некоторых случаях бактерии обитают в виде внутриклеточных бактерий в клетке насекомого-хозяина. В некоторых случаях бактерии обитают в бактериоците насекомого-хозяина.

Изменения в отношении популяций бактерий в организме хозяина могут быть определены с помощью любых способов, известных в данной области техники, таких как микроматричный анализ, полимеразная цепная реакция (ПЦР), ПЦР в реальном времени, проточная цитометрия, флуоресцентная микроскопия, трансмиссионная электронная микроскопия, флуоресцентная гибридизация in situ (например, FISH), спектрофотометрия, масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-MS) и секвенирование ДНК. В некоторых случаях образец от хозяина, обработанного модулирующим средством, секвенируют (например, с помощью метагеномного секвенирования 16S рРНК или рДНК) для определения микробиоты хозяина после доставки или введения модулирующего средства. В некоторых случаях образец от хозяина, который не получал модулирующее средство, также секвенируют для получения эталона.

ii. Грибы

Иллюстративные грибы, на которые можно целенаправленно воздействовать в соответствии со способами и композициями, предусмотренными в данном документе, включают в себя без ограничения Amylostereum areolatum, Epichloe spp, Pichia pinus, Hansenula capsulate, Daldinia decipien, Ceratocytis spp, Ophiostoma spp и Attamyces bromatificus. Неограничивающие примеры дрожжевых и дрожжеподобных симбионтов, обнаруженных в насекомых, включают в себя Candida, Metschnikowia, Debaryomyces, Scheffersomyces shehatae и Scheffersomyces stipites, Starmerella, Pichia, Trichosporon, Cryptococcus, Pseudozyma, а также дрожжеподобные симбионты из подтипа Pezizomycotina (например, Symbiotaphrina bucneri и Symbiotaphrina kochii). Неограничивающие примеры дрожжевых грибов, на которые можно целенаправленно воздействовать с помощью способов и композиций согласно данному документу, приведены в таблице 2.

Таблица 2

Вид насекомого Порядок: семейство Местоположение дрожжевых грибов (вид)
Stegobium paniceum Coleoptera: Anobiidae Мицетомы
(= Sitodrepa panicea) (Saccharomyces)
Слепая кишка (Torulopsis buchnerii)
Мицетома между передней и средней кишкой
Мицетомы (Symbiotaphrina buchnerii)
Мицетомы и пищеварительная трубка (Torulopsis buchnerii)
Слепая кишка (Symbiotaphrina buchnerii)
Lasioderma serricorne Coleoptera: Anobiidae Мицетома между передней и средней кишкой
(Symbiotaphrina kochii)
Ernobius abietis Coleoptera: Anobiidae Мицетомы (Torulopsis karawaiewii)
(Candida karawaiewii)
Ernobius mollis Coleoptera: Anobiidae Мицетомы (Torulopsis ernobii)
(Candida ernobii)
Hemicoelus gibbicollis Coleoptera: Anobiidae Мицетомы личинок
Xestobium plumbeum Coleoptera: Anobiidae Мицетомы (Torulopsis xestobii)
(Candida xestobii)
Criocephalus rusticus Coleoptera: Cerambycidae Мицетомы
Phoracantha semipunctata Coleoptera: Cerambycidae Пищеварительный канал (Candida guilliermondii, C. tenuis)
Слепая кишка около средней кишки (Candida guilliermondii)
Harpium inquisitor Coleoptera: Cerambycidae Мицетомы (Candida rhagii)
Harpium mordax
H. sycophanta
Coleoptera: Cerambycidae Слепая кишка около средней кишки (Candida tenuis)
Gaurotes virginea Coleoptera: Cerambycidae Слепая кишка около средней кишки (Candida rhagii)
Leptura rubra Coleoptera: Cerambycidae Слепая кишка около средней кишки (Candida tenuis)
Слепая кишка около средней кишки (Candida parapsilosis)
Leptura maculicornis Coleoptera: Cerambycidae Слепая кишка около средней кишки (Candida parapsilosis)
L. cerambyciformis
Leptura sanguinolenta Coleoptera: Cerambycidae Слепая кишка около средней кишки (Candida sp.)
Rhagium bifasciatum Coleoptera: Cerambycidae Слепая кишка около средней кишки (Candida tenuis)
Rhagium inquisitor Coleoptera: Cerambycidae Слепая кишка около средней кишки (Candida guilliermondii)
Rhagium mordax Coleoptera: Cerambycidae Слепая кишка около средней кишки (Candida)
Carpophilus hemipterus Coleoptera: Nitidulidae Кишечный тракт (10 видов дрожжевых грибов)
Odontotaenius disjunctus Coleoptera: Passalidae Задняя кишка (Enteroramus dimorphus)
Odontotaenius disjunctus Coleoptera: Passalidae Кишка (Pichia stipitis, P. segobiensis, Candida shehatae)
Verres sternbergianus (C. ergatensis)
Scarabaeus semipunctatus Coleoptera: Scarabaeidae Пищеварительный тракт (10 видов дрожжевых грибов)
Chironitis furcifer
Неизвестный вид Coleoptera: Scarabaeidae Кишка (Trichosporon cutaneum)
Dendroctonus и Ips spp. Coleoptera: Scolytidae Пищеварительный канал (13 видов дрожжевых грибов)
Dendroctonus frontalis Coleoptera: Scolytidae Средняя кишка (Candida sp.)
Ips sexdentatus Coleoptera: Scolytidae Пищеварительный тракт (Pichia bovis, P. rhodanensis)
Hansenula holstii (Candida rhagii)
Пищеварительный тракт
(Candida pulcherina)
Ips typographus Coleoptera: Scolytidae Пищеварительный канал
Пищеварительный тракт (Hansenula capsulata, Candida parapsilosis)
Кишка и гомогенаты жуков (Hansenula holstii, H. capsulata, Candida diddensii, C. mohschtana, C. nitratophila, Cryptococcus albidus, C. laurentii)
Trypodendron lineatum Coleoptera: Scolytidae Не определено
Xyloterinus politus Coleoptera: Scolytidae Голова, грудь, брюшко (Candida, Pichia, Saccharomycopsis)
Periplaneta americana Dictyoptera: Blattidae Гемоцель (Candida sp. nov.)
Blatta orientalis Dictyoptera: Blattidae Кишечный тракт (Kluyveromyces blattae)
Blatella germanica Dictyoptera: Blattellidae Гемоцель
Cryptocercus punctulatus Dictyoptera: Cryptocercidae Задняя кишка (1 вид дрожжевых грибов)
Philophylla heraclei Diptera: Tephritidae Гемоцель
Aedes (4 вида) Diptera: Culicidae Внутренняя микрофлора (9 родов дрожжевых грибов)
Drosophila pseudoobscura Diptera: Drosophilidae Пищеварительный канал (24 вида дрожжевых грибов)
Drosophila (5 видов) Diptera: Drosophilidae Зоб (42 вида дрожжевых грибов)
Drosophila melanogaster Diptera: Drosophilidae Зоб (8 видов дрожжевых грибов)
Drosophila (4 вида) Diptera: Drosophilidae Зоб (7 видов дрожжевых грибов)
Drosophila (6 видов) Diptera: Drosophilidae Кишка личинок (17 видов дрожжевых грибов)
Drosophila (20 видов) Diptera: Drosophilidae Зоб (20 видов дрожжевых грибов)
Drosophila (8 групп видов) Diptera: Drosophilidae Зоб (Kloeckera, Candida, Kluyveromyces)
Drosophila serido Diptera: Drosophilidae Зоб (18 видов дрожжевых грибов)
Drosophila (6 видов) Diptera: Drosophilidae Эпителий кишечника (Coccidiascus legeri)
Protaxymia melanoptera Diptera Неизвестно (Candida, Cryptococcus, Sporoblomyces)
Astegopteryx styraci Homoptera: Aphididae Гемоцель и жировое тело
Tuberaphis sp. Homoptera: Aphididae Срезы тканей
Hamiltonaphis styraci
Glyphinaphis bambusae
Cerataphis sp.
Hamiltonaphis styraci Homoptera: Aphididae Гемоцель брюшка
Cofana unimaculata Homoptera: Cicadellidae Жировое тело
Leofa unicolor Homoptera: Cicadellidae Жировое тело
Lecaniines и т.д. Homoptera: Coccoidea Гемолимфа, жировая ткань и т.д.
Lecanium sp. Homoptera: Coccidae Гемолимфа, жировая ткань
Ceroplastes (4 вида) Homoptera: Coccidae Мазки крови
Laodelphax striatellus Homoptera: Delphacidae Жировое тело
Яйца
Яйца (Candida)
Nilaparvata lugens Homoptera: Delphacidae Жировое тело
Яйца (2 неидентифицированных вида дрожжевых грибов)
Яйца, нимфы (Candida)
Яйца (7 неидентифицированных видов дрожжевых грибов)
Яйца (Candida)
Nisia nervosa Homoptera: Delphacidae Жировое тело
Nisia grandiceps
Perkinsiella spp.
Sardia rostrata
Sogatella furcifera
Sogatodes orizicola Homoptera: Delphacidae Жировое тело
Amrasca devastans Homoptera: Jassidae Яйца, мицетомы, гемолимфа
Tachardina lobata Homoptera: Kerriidae Мазки крови (Torulopsis)
Laccifer (=Lakshadia) sp. Homoptera: Kerriidae Мазки крови (Torula variabilis)
Comperia merceti Hymenoptera: Encyrtidae Гемолимфа, кишка, ядовитая железа
Solenopsis invicta Hymenoptera: Formicidae Гемолимфа (Myrmecomyces annellisae)
S. quinquecuspis
Solenopsis invicta Hymenoptera: Formicidae Личинки на стадии четвертого возраста (Candida parapsilosis, Yarrowia lipolytica)
Кишка и гемолимфа (Candida parapsilosis, C. lipolytica, C. guillermondii, C. rugosa, Debaryomyces hansenii)
Apis mellifera Hymenoptera: Apidae Пищеварительный тракт (Torulopsis sp.)
Кишечный тракт (Torulopsis apicola)
Пищеварительный тракт (8 видов дрожжевых грибов)
Содержимое кишечника (12 видов дрожжевых грибов)
Содержимое кишечника (7 видов дрожжевых грибов)
Кишечник (14 видов дрожжевых грибов)
Кишечный тракт (Pichia melissophila)
Кишечный тракт (7 видов дрожжевых грибов)
Пищеварительный канал (Hansenula silvicola)
Зоб и кишка (13 видов дрожжевых грибов)
Apis mellifera Hymenoptera: Apidae Средняя кишка (9 родов дрожжевых грибов)
Anthophora occidentalis Hymenoptera: Anthophoridae
Nomia melanderi Hymenoptera: Halictidae
Halictus rubicundus Hymenoptera: Halictidae
Megachile rotundata Hymenoptera: Megachilidae

На любое количество видов грибов можно целенаправленно воздействовать с помощью композиций или способов, описанных в данном документе. Например, в некоторых случаях, модулирующее средство может целенаправленно воздействовать на один вид грибов. В некоторых случаях модулирующее средство может целенаправленно воздействовать на по меньшей мере приблизительно любой из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 500 или больше различных видов грибов. В некоторых случаях модулирующее средство может целенаправленно воздействовать на любой из от приблизительно 1 до приблизительно 5, от приблизительно 5 до приблизительно 10, от приблизительно 10 до приблизительно 20, от приблизительно 20 до приблизительно 50, от приблизительно 50 до приблизительно 100, от приблизительно 100 до приблизительно 200, от приблизительно 200 до приблизительно 500, от приблизительно 10 до приблизительно 50, от приблизительно 5 до приблизительно 20 или от приблизительно 10 до приблизительно 100 различных видов грибов. В некоторых случаях модулирующее средство может целенаправленно воздействовать на по меньшей мере приблизительно любые из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или больше типов, классов, порядков, семейств или родов грибов.

В некоторых случаях модулирующее средство может увеличивать популяцию одного или нескольких грибов (например, патогенных или паразитических грибов) на по меньшей мере приблизительно любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или больше в организме хозяина по сравнению с организмом-хозяином, которому модулирующее средство не было введено. В некоторых случаях модулирующее средство может уменьшать популяцию одного или нескольких грибов (например, симбиотических грибов) на по меньшей мере приблизительно любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или больше в организме хозяина по сравнению с организмом-хозяином, которому модулирующее средство не было введено. В некоторых случаях модулирующее средство может уничтожать популяцию грибов (например, симбиотических грибов) в организме хозяина. В некоторых случаях модулирующее средство может повышать уровень одного или нескольких симбиотических грибов на по меньшей мере приблизительно любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или больше в организме хозяина и/или может снижать уровень одного или нескольких симбиотических грибов на по меньшей мере приблизительно любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или больше в организме хозяина по сравнению с организмом-хозяином, которому модулирующее средство не было введено.

В некоторых случаях модулирующее средство может изменять разнообразие грибов и/или состав грибов хозяина. В некоторых случаях модулирующее средство может повышать разнообразие грибов в организме хозяина относительно исходного разнообразия на по меньшей мере приблизительно любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или больше по сравнению с организмом-хозяином, которому модулирующее средство не было введено. В некоторых случаях модулирующее средство может снижать разнообразие грибов в организме хозяина относительно исходного разнообразия на по меньшей мере приблизительно любое значение из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или больше по сравнению с организмом-хозяином, которому модулирующее средство не было введено.

В некоторых случаях модулирующее средство может изменять функцию, активность, рост и/или деление одного или нескольких грибов. Например, модулирующее средство может изменять экспрессию одного или нескольких генов в грибе. В некоторых случаях модулирующее средство может изменять функцию одного или нескольких белков в грибе. В некоторых случаях модулирующее средство может изменять функцию одного или нескольких клеточных компонентов в грибе. В некоторых случаях модулирующее средство может уничтожать гриб.

Кроме того, гриб-мишень может обитать в одной или нескольких частях организма насекомого. В некоторых случаях гриб обитает в одной или нескольких частях кишки насекомого или на них, в том числе, например, в передней кишке, средней кишке и/или задней кишке. В некоторых случаях гриб живет внеклеточно в гемолимфе, жировых телах или в специализированных структурах в организме хозяина.

Изменения в отношении популяции грибов в организме хозяина могут быть определены с помощью любых способов, известных в данной области техники, таких как микроматричный анализ, полимеразная цепная реакция (ПЦР), ПЦР в реальном времени, проточная цитометрия, флуоресцентная микроскопия, трансмиссионная электронная микроскопия, флуоресцентная гибридизация in situ (например, FISH), спектрофотометрия, масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-MS) и секвенирование ДНК. В некоторых случаях образец от хозяина, обработанного модулирующим средством, секвенируют (например, с помощью метагеномного секвенирования) для определения микробиоты хозяина после доставки или введения модулирующего средства. В некоторых случаях образец от хозяина, который не получал модулирующее средство, также секвенируют для получения эталона.

III. Модулирующие средства

Модулирующее средство из способов и композиций, предусмотренных в данном документе, может включать в себя фаг, полипептид, малую молекулу, антибиотик, вторичный метаболит, бактерию, гриб или любую их комбинацию.

i. Фаг

Модулирующее средство, описанное в данном документе, может включать в себя фаг (например, литический фаг или нелитический фаг). В некоторых случаях эффективная концентрация любого фага, описанного в данном документе, может изменять уровень, активность или метаболизм одного или нескольких микроорганизмов (описанных в данном документе), обитающих в организме хозяина, описанного в данном документе (например, переносчика патогена животного, например, комара, микроскопического клеща, пухоеда или иксодового клеща), при этом модулирование приводит к снижению приспособленности хозяина (например, как изложено в данном документе). В некоторых случаях модулирующее средство включает в себя по меньшей мере один фаг, выбранный из порядков Tectiviridae, Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae, Caudovirales, Lipothrixviridae, Rudiviridae или Ligamenvirales. В некоторых случаях композиция содержит по меньшей мере один фаг, выбранный из семейства Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae, Lipothrixviridae, Rudiviridae, Ampullaviridae, Bicaudaviridae, Clavaviridae, Corticoviridae, Cystoviridae, Fuselloviridae, Gluboloviridae, Guttaviridae, Inoviridae, Leviviridae, Microviridae, Plasmaviridae и Tectiviridae. Дополнительные неограничивающие примеры фагов, пригодных в способах и композициях, приведены в таблице 3.

Таблица 3. Примеры фагов и бактерий-мишеней

Фаг и № доступа Бактерия-мишень Хозяин-мишень
SA1(NC_027991), phiP68 (NC_004679) Staphylococcus sp. Семейство Apidae
WO (AB036666,1) Wolbachia sp. Aedes aegypti; Drosophila melanogaster; Plasmodium sp; Teleogryllus taiwanemma; Bombyx mori
KL1 (NC_018278), BcepNazgul (NC_005091) PhiE125 (NC_003309) Burkholderia sp. Riptortus sp.; Pyrrhocoris apterus.
Fern (NC_028851), Xenia (NC_028837), HB10c2 (NC_028758) Paenibacillus larvae Шмели: Bombus sp.; медоносные пчелы: A. mellifera
CP2 (NC_020205), XP10 (NC_004902), XP15 (NC_007024), phiL7 (NC_012742) Xanthomonas sp. Plebeina denoiti; семейство Apidae; Apis mellifera; семейство Drosophilidae и семейство Chloropidae
PP1 (NC_019542), PM1 (NC_023865) Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum Семейство Apidae
ФRSA1 (NC_009382),
ФRSB1 (NC_011201), ФRSL1 (NC_010811), RSM1 (NC_008574)
Ralstonia solanacearum Bombyx mori
SF1(NC_028807) Streptomyces scabies Philantus sp.; Trachypus sp
ECML-4 (NC_025446), ECML-117 (NC_025441), ECML-134 (NC_025449) Escherichia coli Семейство Apidae; Varroa destructor
SSP5(JX274646,1), SSP6 (NC_004831), SFP10 (NC_016073), F18SE (NC_028698) Salmonella sp. Семейство Drosophilidae
γ(NC_001416), Bcp1 (NC_024137) Bacillus sp. Непарный шелкопряд; Lymantria dispar; Varroa destructor
Phi1 (NC_009821) Enterococcus sp. Schistocerca gragaria
ФKMV (NC_005045), ФEL(AJ697969,1), ФKZ (NC_004629) Pseudomonas sp. Lymantria dispar; семейство Apidae
A2 (NC_004112), phig1e (NC_004305) Lactobacillus sp. Семейство Apidae; семейство Drosophila; Varroa destructor
KLPN1 (NC_028760) Klebsiella sp. C. capitata
vB_AbaM_Acibel004 (NC_025462), vB_AbaP_Acibel007 (NC_025457) Acinetobacter sp. Schistocerca gragaria

В некоторых случаях модулирующее средство включает в себя литический фаг. Таким образом, после доставки литического фага в бактериальную клетку, обитающую в организме хозяина, фаг вызывает лизис в бактериальной клетке-мишени. В некоторых случаях литический фаг целенаправленно воздействует на бактерию, обитающую в насекомом-хозяине, и уничтожает ее со снижением приспособленности хозяина. В качестве альтернативы или дополнительно, фаг модулирующего средства может представлять собой нелитический фаг (также называемый лизогенным или умеренным фагом). Таким образом, после доставки нелитического фага в бактериальную клетку, обитающую в организме хозяина, бактериальная клетка может оставаться жизнеспособной и способной стабильно поддерживать экспрессию генов, кодируемых в геноме фага. В некоторых случаях нелитический фаг применяют для изменения экспрессии генов в бактерии, обитающей в насекомом-хозяине, со снижением приспособленности хозяина. В некоторых случаях модулирующее средство включает в себя смесь литического и нелитического фага.

В определенных случаях фаг представляет собой встречающийся в природе фаг. Например, встречающийся в природе фаг может быть выделен из образца среды, содержащего смесь различных фагов. Встречающийся в природе фаг может быть выделен с помощью способов, известных в данной области техники для выделения, очистки и идентификации фага, который целенаправленно воздействует на определенный микроорганизм (например, бактериальный эндосимбионт в организме насекомого-хозяина). В качестве альтернативы, в определенных случаях фаг может быть сконструирован на основе встречающегося в природе фага.

Модулирующее средство, описанное в данном документе, включает в себя фаг с узким или широким спектром бактерий-мишеней. В некоторых случаях фаг имеет узкий спектр бактерий-мишеней. В некоторых случаях фаг представляет собой промискуитетный фаг с широким спектром бактерий-мишеней. Например, промискуитетный фаг может целенаправленно воздействовать на по меньшей мере приблизительно любую из 5, 10, 20, 30, 40, 50 или больше бактерий, обитающих в организме хозяина. Фаг с узким спектром бактерий-мишеней может целенаправленно воздействовать на конкретный штамм бактерий в организме хозяина без отрицательного влияния на другую, например, не являющуюся мишенью, бактерию в организме хозяина. Например, фаг может целенаправленно воздействовать на не более чем приблизительно любую из 50, 40, 30, 20, 10, 8, 6, 4, 2 или 1 бактерии, обитающей в организме хозяина. Например, фаг, описанный в данном документе, может быть пригодным для целенаправленного воздействия на одну или несколько бактерий, обитающих в организме комара, в том числе без ограничения EspZ, Serratia spp (например, Serratia marcescens), Enterobacteriaceae spp., Enterobacter spp. (например, Enterobacter cloacae, Enterobacter amnigenus, Enterobacter ludwigii), Proteus spp., Acinetobacter spp., Wigglesworthia spp. (Wigglesworthia gloosinidia), Xanthomonas spp. (например, Xanthomonas maltophilia), Pseudomonas spp. (например, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas rhodesiae), Escherichia spp. (например, Escherichia coli), Cedecea spp. (например, Cedecea lapagei), Ewingella spp. (например, Ewingella americana), Bacillus spp. (например, Bacillus pumilus), Comamonas spp., или Vagococcus spp. (например, Vagococcus salmoninarium), или Wolbachia spp. (например, Wolbachia - wMel, Wolbachia - wAlbB, Wolbachia - wMelPop, Wolbachia - wMelPop-CLA).

Композиции, описанные в данном документе, могут содержать любое количество фагов, как, например, по меньшей мере приблизительно любое количество из 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100 или больше фагов. В некоторых случаях композиция содержит фаг из одного или нескольких семейств (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше фагов), одного или нескольких порядков (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше фагов) или одного или нескольких видов (например, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100 или больше фагов). Композиции, содержащие один или несколько фагов, также называются в данном документе "коктейлями фагов". Коктейли фагов являются пригодными, поскольку они обеспечивают целенаправленное воздействие на более широкий спектр хозяев бактерий. Кроме того, они обеспечивают целенаправленное воздействие на каждый штамм (т. е. подвид) бактерий многочисленных ортогональных фагов, тем самым предупреждая или значительно задерживая появление устойчивости. В некоторых случаях коктейль содержит несколько фагов, целенаправленно воздействующих на один вид бактерий. В некоторых случаях коктейль содержит несколько фагов, целенаправленно воздействующих на несколько видов бактерий. В некоторых случаях в однофаговом "коктейле" содержится один промискуитетный фаг (т. е. фаг с широким спектром хозяев), целенаправленно воздействующий на многие штаммы в пределах вида.

Подходящие концентрации фага в модулирующем средстве, описанном в данном документе, зависят от таких факторов, как эффективность, показатель выживаемости, переносимость фага, количество различных фагов и/или типы лизина в композициях, состав и способы применения композиции. В некоторых случаях фаг находится в жидком или твердом составе. В некоторых случаях концентрация каждого фага в любой из композиций, описанных в данном документе, имеет по меньшей мере приблизительно любое значение из 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010 или больше БОЕ/мл. В некоторых случаях концентрация каждого фага в любой из композиций, описанных в данном документе, имеет не более чем приблизительно любое значение из 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 БОЕ/мл. В некоторых случаях концентрация каждого фага в композиции имеет любое значение из от приблизительно 102 до приблизительно 103, от приблизительно 103 до приблизительно 104, от приблизительно 104 до приблизительно 105, от приблизительно 105 до приблизительно 106, от приблизительно 107 до приблизительно 108, от приблизительно 108 до приблизительно 109, от приблизительно 102 до приблизительно 104, от приблизительно 104 до приблизительно 106, от приблизительно 106 до приблизительно 109 или от приблизительно 103 до приблизительно 108 БОЕ/мл. В некоторых случаях, если композиция содержит по меньшей мере два типа фагов, то концентрация каждого типа фагов может быть одной и той же или разной. Например, в некоторых случаях концентрация одного фага в коктейле составляет приблизительно 108 БОЕ/мл, и концентрация второго фага в коктейле составляет приблизительно 106 БОЕ/мл.

Модулирующее средство, включающее в себя фаг, описанный в данном документе, может быть приведено в контакт с хозяином-мишенью в количестве и в течение времени, достаточных для: (a) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации фага внутри хозяина-мишени; (b) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации фага внутри кишки хозяина-мишени; (c) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации фага внутри бактериоцита хозяина-мишени; (d) модулирования уровня или активности одного или нескольких микроорганизмов (например, эндосимбионтов) в организме хозяина-мишени или/и (e) модулирования приспособленности хозяина-мишени.

Как проиллюстрировано в примерах 5-7 и 28, фаги (например, один или несколько встречающихся в природе фагов) можно применять в качестве модулирующих средств, которые целенаправленно воздействуют на эндосимбиотическую бактерию в организме насекомого-хозяина, для снижения приспособленности хозяина (например, как изложено в данном документе).

ii. Полипептиды

Многочисленные полипептиды (например, бактериоцин, бактериоцин R-типа, C-богатый пептид клубеньков, противомикробный пептид, лизин или регуляторный пептид бактериоцитов) можно применять в композициях и способах, описанных в данном документе. В некоторых случаях эффективная концентрация любого пептида или полипептида, описанного в данном документе, может изменять уровень, активность или метаболизм одного или нескольких микроорганизмов (описанных в данном документе, например, Wolbachia spp. или Rickettsia spp.), обитающих в организме хозяина (например, переносчика патогена животного, например, комара, микроскопического клеща, пухоеда или иксодового клеща), при этом модулирование приводит к снижению приспособленности хозяина (например, как изложено в данном документе). Полипептиды, включенные в данный документ, могут включать в себя встречающиеся в природе полипептиды или рекомбинантно получаемые варианты. Например, полипептид может представлять собой функционально активный вариант любого из полипептидов, описанных в данном документе, на по меньшей мере 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичный, например, в определенной области или во всей последовательности, последовательности полипептида, описанного в данном документе, или встречающегося в природе полипептида.

Модулирующее средство, включающее в себя полипептид, описанный в данном документе, может быть приведено в контакт с хозяином-мишенью в количестве и в течение времени, достаточных для: (a) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации внутри хозяина-мишени; (b) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации внутри кишки хозяина-мишени; (c) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации внутри бактериоцита хозяина-мишени; (d) модулирования уровня или активности одного или нескольких микроорганизмов (например, эндосимбионтов) в организме хозяина-мишени или/и (e) модулирования приспособленности хозяина-мишени.

Полипептидные модулирующие средства, обсуждаемые далее в данном документе, а именно бактериоцины, лизины, противомикробные пептиды, C-богатые пептиды клубеньков и регуляторные пептиды бактериоцитов, можно применять для изменения уровня, активности или метаболизма микроорганизмов-мишеней (например, Rickettsia или Wolbachia), как указано в разделе касательно снижения приспособленности насекомых-хозяев (например, переносчика патогена животного, например, комара, микроскопического клеща, пухоеда или клеща).

(a) Бактериоцины

Модулирующее средство, описанное в данном документе, может включать в себя бактериоцин. В некоторых случаях бактериоцин продуцируется естественным образом грамположительными бактериями, такими как Pseudomonas, Streptomyces, Bacillus, Staphylococcus или молочнокислые бактерии (LAB, такие как Lactococcus lactis). В некоторых случаях бактериоцин продуцируется естественным образом грамотрицательными бактериями, такими как Hafnia alvei, Citrobacter freundii, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumonia, Enterobacter cloacae, Serratia plymithicum, Xanthomonas campestris, Erwinia carotovora, Ralstonia solanacearum или Escherichia coli. Иллюстративные бактериоцины включают в себя без ограничения антибиотики LAB I-IV класса (такие как лантибиотики), колицины, микроцины и пиоцины. Неограничивающие примеры бактериоцинов приведены в таблице 4.

Таблица 4. Примеры бактериоцинов

Класс Название Продуцент Мишени Последовательность
Класс I Низин Lactococcus lactis Активный в отношении грамположительных бактерий: Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Listeria, Clostridium ITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCHCSIHVSK (SEQ ID NO: 42)
Эпидермин Staphylococcus epidermis Грамположительные бактерии IASKFICTPGCAKTGSFNSYCC (SEQ ID NO: 43)
Класс II
Класс II a Педиоцин PA-1 Pediococcus acidilactici Pediococci, Lactobacilli, Leuconostoc, Brochothrix thermosphacta, Propionibacteria, Bacilli, Enterococci, Staphylococci, Listeria clostridia, Listeria monocytogenes, Listeria innocua KYYGNGVTCG KHSCSVDWGK ATTCIINNGAMAWATGGHQGNHKC (SEQ ID NO: 44)
Класс II b Энтероцин P Enterococcus faecium Lactobacillus sakei, Enterococcus faecium ATRSYGNGVYCNNSKCWVNWGEAKENIAGIVISGWASGLAGMGH (SEQ ID NO: 45)
Класс II c Лактококцин G Streptococcus lactis Грамположительные бактерии GTWDDIGQGIGRVAYWVGKAMGNMSDVNQASRINRKKKH (SEQ ID NO: 46)
Класс II d Лактацин-F Lactobacillus johnsonii Lactobacilli,
Enterococcus faecalis
NRWGDTVLSAASGAGTGIKACKSFGPWGMAICGVGGAAIGGYFGYTHN (SEQ ID NO: 47)
Класс III
Класс III a Энтероцин AS-48 Enterococcus faecalis Широкий спектр: грамположительные и грамотрицательные бактерии MAKEFGIPAAVAGTVLNVVEAGGWVTTIVSILTAVGSGGLSLLAAAGRESIKAYLKKEIKKKGKRAVIAW (SEQ ID NO: 48)
Класс III b Ауреоцин A70 Staphylococcus aureus Широкий спектр: грамположительные и грамотрицательные бактерии MSWLNFLKYIAKYGKKAVSAAWKYKGKVLEWLNVGPTLEWVWQKLKKIAGL (SEQ ID NO: 49)
Класс IV Гарвицин A Lactococcus garvieae Широкий спектр: грамположительные и грамотрицательные бактерии IGGALGNALNGLGTWANMMNGGGFVNQWQVYANKGKINQYRPY (SEQ ID NO: 50)
Неклассифицированные Колицин V Escherichia coli Активный в отношении Escherichia coli (а также близкородственных бактерий), Enterobacteriaceae MRTLTLNELDSVSGGASGRDIAMAIGTLSGQFVAGGIGAAAGGVAGGAIYDYASTHKPNPAMSPSGLGGTIKQKPEGIPSEAWNYAAGRLCNWSPNNLSDVCL (SEQ ID NO: 51)

В некоторых случаях бактериоцин представляет собой колицин, пиоцин или микроцин, продуцируемые грамотрицательными бактериями. В некоторых случаях бактериоцин представляет собой колицин. Колицин может представлять собой колицин группы A (например, использует систему Tol для проникновения через внешнюю мембрану бактерии-мишени) или колицин группы B (например, использует систему Ton для проникновения через внешнюю мембрану бактерии-мишени). В некоторых случаях бактериоцин представляет собой микроцин. Микроцин может представлять собой микроцин класса I (например, < 5 кДа, имеет посттрансляционные модификации) или микроцин класса II (например, 5-10 кДа, с посттрансляционными модификациями или без них). В некоторых случаях микроцин класса II представляет собой микроцин класса IIa (например, требует более одного гена для синтеза и сборки функциональных пептидов) или микроцин класса IIb (например, линейные пептиды с посттрансляционными модификациями на С-конце или без них). В некоторых случаях бактериоцин представляет собой пиоцин. В некоторых случаях пиоцин представляет собой R-пиоцин, F-пиоцин или S-пиоцин.

В некоторых случаях бактериоцин представляет собой бактериоцин класса I, класса II, класса III или класса IV, продуцируемый грамположительными бактериями. В некоторых случаях модулирующее средство включает в себя бактериоцин класса I (например, антибиотики, содержащие лантионин (лантибиотики), продуцируемые грамположительными бактериями). Бактериоцины класса I или лантибиотики могут представлять собой пептид с низкой молекулярной массой (например, менее чем приблизительно 5 кДа) и могут иметь аминокислотные остатки с посттрансляционными модификациями (например, лантионин, β-метиллантионин или дегидрированные аминокислоты).

В некоторых случаях бактериоцин представляет собой бактериоцин класса II (например, соединения, не являющиеся лантибиотиками, продуцируемые грамположительными бактериями). Многие из них являются положительно заряженными не содержащими лантионина пептидами, которые, в отличие от лантибиотиков, не подвергаются обширной посттрансляционной модификации. Бактериоцин класса II может принадлежать к одному из следующих подклассов: "педиоциноподобные" бактериоцины (например, педиоцин PA-1 и карнобактериоцин X (класс IIa)); двухпептидные бактериоцины (например, лактацин F и ABP-118 (класс IIb)); круговые бактериоцины (например, карноциклин А и энтероцин AS-48 (класс IIc)) или немодифицированные линейные непедиоциноподобные бактериоцины (например, эпидермицин NI01 и лактококцин A (класс IId)).

В некоторых случаях бактериоцин представляет собой бактериоцин класса III (например, продуцируемый грамположительными бактериями). Бактериоцины класса III могут иметь молекулярную массу более 10 кДа и могут представлять собой термонестабильные белки. Бактериоцины класса III могут быть дополнительно подразделены на бактериоцины группы IIIA и группы IIIB. Бактериоцины группы IIIA включают в себя бактериолитические ферменты, которые уничтожают чувствительные штаммы посредством лизиса клеточной стенки, такие как энтеролизин А. Бактериоцины группы IIIB включают в себя нелитические белки, такие как казеицин 80, гельветицин J и лактацин B.

В некоторых случаях бактериоцин представляет собой бактериоцин класса IV (например, продуцируемый грамположительными бактериями). Бактериоцины класса IV представляют собой группу сложных белков, ассоциированных с другими липидными или углеводными фрагментами, которые, по-видимому, требуются для активности. Они являются относительно гидрофобными и термостабильными. Примерами бактериоцинов класса IV являются лейконоцин S, лактоцин 27 и лактоцин S.

В некоторых случаях бактериоцин представляет собой бактериоцин R-типа. Бактериоцины R-типа представляют собой сократительные бактериоцидные белковые комплексы. Некоторые бактериоцины R-типа имеют сократительную структуру, подобную отростку фага. C-концевая область белка нити отростка фага определяет специфичность связывания с мишенью. Они могут прикрепляться к клеткам-мишеням посредством белка, связывающегося с рецептором, например, нити отростка. За прикреплением следует сокращение наружного чехла и введение сердцевины через оболочку бактерии-мишени. Проникновение сердцевины приводит к быстрой деполяризации потенциала клеточной мембраны и мгновенной гибели клетки. Контакт с одной частицей бактериоцина R-типа может приводить к гибели клетки. Бактериоцин R-типа, например, может быть термолабильным, умеренно кислотостойким, устойчивым к трипсину, способным осаждаться в результате центрифугирования, быть различимым при использовании электронной микроскопии или обладать комбинацией этих свойств. Другие бактериоцины R-типа могут представлять собой сложные молекулы, включающие в себя многочисленные белки, полипептиды или субъединицы, и могут напоминать структуру отростка бактериофагов семейства Myoviridae. У встречающихся в природе бактериоцинов R-типа структуры субъединиц могут кодироваться бактериальным геномом, таким как геном C. difficile или P. aeruginosa, и образовывать бактериоцины R-типа, которые выступают в качестве природной защиты против других бактерий. В некоторых случаях бактериоцин R-типа представляет собой пиоцин. В некоторых случаях пиоцин представляет собой R-пиоцин, F-пиоцин или S-пиоцин.

В некоторых случаях бактериоцин представляет собой функционально активный вариант бактериоцинов, описанных в данном документе. В некоторых случаях вариант бактериоцина является на по меньшей мере 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичным, например, в определенной области или во всей последовательности, последовательности бактериоцина, описанного в данном документе, или встречающегося в природе бактериоцина.

В некоторых случаях бактериоцин можно создавать с помощью биоинженерии в соответствии со стандартными способами для модулирования его биологической активности, например, повышения, или снижения, или регулирования, или для определения его микроорганизмов-мишеней. В других случаях бактериоцин продуцируется трансляционным аппаратом (например, рибосомой и т. д.) микробной клетки. В некоторых случаях бактериоцин синтезируют химическим путем. Некоторые бактериоцины могут образовываться из полипептидного предшественника. Полипептидный предшественник может подвергаться расщеплению (например, процессингу под действием протеазы) с образованием самого полипептида бактериоцина. Таким образом, в некоторых случаях бактериоцин продуцируется из полипептида-предшественника. В некоторых других случаях бактериоцин включает в себя полипептид, который подвергся посттрансляционным модификациям, например, расщеплению или добавлению одной или нескольких функциональных групп.

Бактериоцины, описанные в данном документе, могут быть составлены в виде композиции для любого из путей применения, описанных в данном документе. Композиции, раскрытые в данном документе, могут содержать любые количество или тип (например, классы) бактериоцинов, как, например, по меньшей мере приблизительно любое количество из 1 бактериоцина, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100 или больше бактериоцинов. Подходящие концентрации каждого бактериоцина в композициях, описанных в данном документе, зависят от таких факторов, как эффективность, стабильность бактериоцина, количество различных типов бактериоцина в композициях, состав и способы применения композиции. В некоторых случаях концентрация каждого бактериоцина в жидкой композиции составляет от приблизительно 0,01 нг/мл до приблизительно 100 мг/мл. В некоторых случаях концентрация каждого бактериоцина в твердой композиции составляет от приблизительно 0,01 нг/г до приблизительно 100 мг/г. В некоторых случаях, если композиция содержит по меньшей мере два типа бактериоцинов, то концентрация каждого типа бактериоцинов может быть одной и той же или разной. В некоторых случаях бактериоцин предусмотрен в композиции, содержащей бактериальную клетку, которая секретирует бактериоцин. В некоторых случаях бактериоцин предусмотрен в композиции, содержащей полипептид (например, полипептид, выделенный из бактериальной клетки).

Бактериоцины могут нейтрализовать (например, уничтожать) по меньшей мере один микроорганизм, отличный от отдельной бактериальной клетки, в которой полипептид образуется, в том числе клетки, клонально родственные бактериальной клетке, и другие микробные клетки. Таким образом, бактериальная клетка может проявлять цитотоксические или ингибирующие рост эффекты в отношении множества микроорганизмов посредством секреции бактериоцинов. В некоторых случаях бактериоцин целенаправленно воздействует на один или несколько видов бактерий, обитающих в организме хозяина, и уничтожает их посредством образования пор в цитоплазматической мембране, разрушения клеточной стенки (например, активности пептидогликаназы) или активности нуклеазы (например, активности ДНКазы, активности 16S рРНКазы или активности тРНКазы).

В некоторых случаях бактериоцин характеризуется нейтрализующей активностью. Нейтрализующая активность бактериоцинов может включать в себя без ограничения остановку размножения микроорганизмов или цитотоксичность. Некоторые бактериоцины характеризуются цитотоксической активностью, и, таким образом, могут уничтожать микроорганизмы, например, бактерии, дрожжевые грибы, водоросли и т. п. Некоторые бактериоцины могут ингибировать размножение микроорганизмов, например, бактерий, дрожжевых грибов, водорослей и т. п., например, посредством остановки клеточного цикла.

В некоторых случаях бактериоцин характеризуется уничтожающей активностью. Механизм уничтожения у бактериоцинов является специфичным для каждой группы бактериоцинов. В некоторых случаях бактериоцин характеризуется биологической активностью узкого спектра. Бактериоцины известны своей очень высокой активностью в отношении своих штаммов-мишеней. Активность некоторых бактериоцинов ограничена штаммами, которые являются близкородственными по отношению к штамму-продуценту бактериоцина (биологическая активность узкого спектра). В некоторых случаях бактериоцин характеризуется биологической активностью широкого спектра в отношении широкого круга родов.

В некоторых случаях бактериоцины взаимодействуют с рецепторной молекулой или стыковочной молекулой на клеточной мембране бактерии-мишени. Например, низин является крайне активным в отношении своих штаммов бактерий-мишеней, демонстрируя противомикробную активность даже в одноразрядной наномолярной концентрации. Было показано, что молекула низина связывается с липидом II, который представляет собой основной переносчик субъединиц пептидогликанов из цитоплазмы в клеточную стенку.

В некоторых случаях бактериоцин характеризуется противогрибковой активностью. Был идентифицирован ряд бактериоцинов с противодрожжевой или противогрибковой активностью. Например, было показано, что бактериоцины из Bacillus характеризуются нейтрализующей активностью в отношении некоторых штаммов дрожжей (см., например, Adetunji and Olaoye, Malaysian Journal of Microbiology 9:130-13, 2013). В другом примере было показано, что пептид Enterococcus faecalis характеризуется нейтрализующей активностью в отношении видов Candida (см., например, Shekh and Roy, BMC Microbiology 12:132, 2012). В другом примере было показано, что бактериоцины из Pseudomonas характеризуются нейтрализующей активностью в отношении грибов, таких как Curvularia lunata, виды Fusarium, виды Helminthosporium и виды Biopolaris (см., например, Shalani and Srivastava, The Internet Journal of Microbiology Volume 5 Number 2, 2008). В другом примере было показано, что ботрицидин AJ1316 и алирин B1 из B. subtilis характеризуются противогрибковой активностью.

Модулирующее средство, включающее в себя бактериоцин, описанный в данном документе, может быть приведено в контакт с хозяином-мишенью в количестве и в течение времени, достаточных для: (a) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации бактериоцина внутри хозяина-мишени; (b) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации бактериоцина внутри кишки хозяина-мишени; (c) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации бактериоцина внутри бактериоцита хозяина-мишени; (d) модулирования уровня или активности одного или нескольких микроорганизмов (например, эндосимбионтов) в организме хозяина-мишени или/и (e) модулирования приспособленности хозяина-мишени.

Как проиллюстрировано в примерах 8, 9 или 16, бактериоцины (например, colA или низин) можно применять в качестве модулирующих средств, которые целенаправленно воздействуют на эндосимбиотическую бактерию в организме насекомого-хозяина, для снижения приспособленности хозяина (например, как изложено в данном документе).

(b) Лизины

Модулирующее средство, описанное в данном документе, может включать в себя лизин (например, также известный как муреингидролаза или аутолизин пептидогликанов). Можно применять любой лизин, подходящий для ингибирования бактерии, обитающей в организме хозяина. В некоторых случаях лизин представляет собой лизин, который может продуцироваться естественным путем бактериальной клеткой. В некоторых случаях лизин представляет собой лизин, который может продуцироваться естественным путем бактериофагом. В некоторых случаях лизин получают из фага, который ингибирует бактерию, обитающую в организме хозяина. В некоторых случаях лизин конструируют на основе встречающегося в природе лизина. В некоторых случаях лизин конструируют для секреции бактерией-хозяином, например, посредством введения сигнального пептида в лизин. В некоторых случаях лизин применяют в комбинации с холином фага. В некоторых случаях лизин экспрессируется рекомбинантным бактериальным хозяином, который не является чувствительным к лизину. В некоторых случаях лизин применяют для ингибирования грамположительной или грамотрицательной бактерии, обитающей в организме хозяина.

Лизин может представлять собой лизин любого класса и может иметь один или несколько видов субстратной специфичности. Например, лизин может представлять собой гликозидазу, эндопептидазу, карбопептидазу или их комбинацию. В некоторых случаях лизин расщепляет β-1-4-гликозидную связь в сахарном фрагменте клеточной стенки, амидную связь, соединяющую сахарные и пептидные фрагменты бактериальной клеточной стенки, и/или пептидные связи между пептидными фрагментами клеточной стенки. Лизин может принадлежать к одной или нескольким специфическим группам лизина в зависимости от участка расщепления в пептидогликане. В некоторых случаях лизин представляет собой N-ацетил-β-D-мурамидазу (например, лизоцим), литическую трансгликозилазу, N-ацетил-β-D-глюкозаминидазу, N-ацетилмурамил-L-аланинамидазу, L,D-эндопептидазу, D,D-эндопептидазу, D,D-карбоксипептидазу, L,D-карбоксипептидазу или L,D-транспептидазу. Неограничивающие примеры лизинов и форм их активности приведены в таблице 5.

Таблица 5. Примеры лизинов

Бактерия-мишень Продуцент Лизины Активность Последовательность
S. pneumoniae Cp1 Cpl-1 Мурамидаза MVKKNDLFVDVSSHNGYDITGILEQMGTTNTIIKISESTTYLNPCLSAQVEQSNPIGFYHFARFGGDVAEAEREAQFFLDNVPMQVKYLVLDYEDDPSGDAQANTNACLRFMQMIADAGYKPIYYSYKPFTHDNVDYQQILAQFPNSLWIAGYGLNDGTANFEYFPSMDGIRWWQYSSNPFDKNIVLLDDEEDDKPKTAGTWKQDSKGWWFRRNNGSFPYNKWEKIGGVWYYFDSKGYCLTSEWLKDNEKWYYLKDNGAMATGWVLVGSEWYYMDDSGAMVTGWVKYKNNWYYMTNERGNMVSNEFIKSGKGWYFMNTNGELADNPSFTKEPDGLITVA (SEQ ID NO: 52)
S. pneumoniae Dp-1 Pal Амидаза MGVDIEKGVAWMQARKGRVSYSMDFRDGPDSYDCSSSMYYALRSAGASSAGWAVNTEYMHAWLIENGYELISENAPWDAKRGDIFIWGRKGASAGAGGHTGMFIDSDNIIHCNYAYDGISVNDHDERWYYAGQPYYYVYRLTNANAQPAEKKLGWQKDATGFWYARANGTYPKDEFEYIEENKSWFYFDDQGYMLAEKWLKHTDGNWYWFDRDGYMATSWKRIGESWYYFNRDGSMVTGWIKYYDNWYYCDATNGDMKSNAFIRYNDGWYLLLPDGRLADKPQFTVEPDGLITAKV (SEQ ID NO: 53)
S. pyogenes C1 C1 Амидаза Н. о.
B. anthracis γ PlyG Амидаза MEIQKKLVDPSKYGTKCPYTMKPKYITVHNTYNDAPAENEVSYMISNNNEVSFHIAVDDKKAIQGIPLERNAWACGDGNGSGNRQSISVEICYSKSGGDRYYKAEDNAVDVVRQLMSMYNIPIENVRTHQSWSGKYCPHRMLAEGRWGAFIQKVKNGNVATTSPTKQNIIQSGAFSPYETPDVMGALTSLKMTADFILQSDGLTYFISKPTSDAQLKAMKEYLDRKGWWYEVK (SEQ ID NO: 54)
B. anthracis Профаг Эймса PlyPH Амидаза Н. о.
E. faecalis и E. faecium Phi1 PlyV12 Амидаза Н. о.
S. aureus ФMR11 MV-L Эндопептидаза и амидаза MQAKLTKKEFIEWLKTSEGKQFNVDLWYGFQCFDYANAGWKVLFGLLLKGLGAKDIPFANNFDGLATVYQNTPDFLAQPGDMVVFGSNYGAGYGHVAWVIEATLDYIIVYEQNWLGGGWTDRIEQPGWGWEKVTRRQHAYDFPMWFIRPNFKSETAPRSIQSPTQASKKETAKPQPKAVELKIIKDVVKGYDLPKRGGNPKGIVIHNDAGSKGATAEAYRNGLVNAPLSRLEAGIAHSYVSGNTVWQALDESQVGWHTANQLGNKYYYGIEVCQSMGADNATFLKNEQATFQECARLLKKWGLPANRNTIRLHNEFTSTSCPHRSSVLHTGFDPVTRGLLPEDKQLQLKDYFIKQIRVYMDGKIPVATVSNESSASSNTVKPVASAWKRNKYGTYYMEENARFTNGNQPITVRKIGPFLSCPVAYQFQPGGYCDYTEVMLQDGHVWVGYTWEGQRYYLPIRTWNGSAPPNQILGDLWGEIS (SEQ ID NO: 55)
S. pyogenes C1 PlyC Амидаза Н. о.
S. agalactiae B30 Лизин GBS Мурамидаза и эндопептидаза MVINIEQAIAWMASRKGKVTYSMDYRNGPSSYDCSSSVYFALRSAGASDNGWAVNTEYEHDWLIKNGYVLIAENTNWNAQRGDIFIWGKRGASAGAFGHTGMFVDPDNIIHCNYGYNSITVNNHDEIWGYNGQPYVYAYRYSGKQSNAKVDNKSVVSKFEKELDVNTPLSNSNMPYYEATISEDYYVESKPDVNSTDKELLVAGTRVRVYEKVKGWARIGAPQSNQWVEDAYLIDATDM (SEQ ID NO: 56)
S. aureus P68 Lys16 Эндопептидаза Н. о.
S. aureus K LysK Амидаза и эндопептидаза MAKTQAEINKRLDAYAKGTVDSPYRVKKATSYDPSFGVMEAGAIDADGYYHAQCQDLITDYVLWLTDNKVRTWGNAKDQIKQSYGTGFKIHENKPSTVPKKGWIAVFTSGSYEQWGHIGIVYDGGNTSTFTILEQNWNGYANKKPTKRVDNYYGLTHFIEIPVKAGTTVKKETAKKSASKTPAPKKKATLKVSKNHINYTMDKRGKKPEGMVIHNDAGRSSGQQYENSLANAGYARYANGIAHYYGSEGYVWEAIDAKNQIAWHTGDGTGANSGNFRFAGIEVCQSMSASDAQFLKNEQAVFQFTAEKFKEWGLTPNRKTVRLHMEFVPTACPHRSMVLHTGFNPVTQGRPSQAIMNKLKDYFIKQIKNYMDKGTSSSTVVKDGKTSSASTPATRPVTGSWKKNQYGTWYKPENATFVNGNQPIVTRIGSPFLNAPVGGNLPAGATIVYDEVCIQAGHIWIGYNAYNGNRVYCPVRTCQGVPPNQIPGVAWGVFK (SEQ ID NO: 57)
L. monocytogenes A118 Ply118 Амидаза MTSYYYSRSLANVNKLADNTKAAARKLLDWSESNGIEVLIYETIRTKEQQAANVNSGASQTMRSYHLVGQALDFVMAKGKTVDWGAYRSDKGKKFVAKAKSLGFEWGGDWSGFVDNPHLQFNYKGYGTDTFGKGASTSNSSKPSADTNTNSLGLVDYMNLNKLDSSFANRKKLATSYGIKNYSGTATQNTTLLAKLKAGKPHTPASKNTYYTENPRKVKTLVQCDLYKSVDFTTKNQTGGTFPPGTVFTISGMGKTKGGTPRLKTKSGYYLTANTKFVKKI (SEQ ID NO: 58)
L. monocytogenes A511 Ply511 Амидаза MVKYTVENKIIAGLPKGKLKGANFVIAHETANSKSTIDNEVSYMTRNWKNAFVTHFVGGGGRVVQVANVNYVSWGAGQYANSYSYAQVELCRTSNATTFKKDYEVYCQLLVDLAKKAGIPITLDSGSKTSDKGIKSHKWVADKLGGTTHQDPYAYLSSWGISKAQFASDLAKVSGGGNTGTAPAKPSTPAPKPSTPSTNLDKLGLVDYMNAKKMDSSYSNRDKLAKQYGIANYSGTASQNTTLLSKIKGGAPKPSTPAPKPSTSTAKKIYFPPNKGNWSVYPTNKAPVKANAIGAINPTKFGGLTYTIQKDRGNGVYEIQTDQFGRVQVYGAPSTGAVIKK (SEQ ID NO: 59)
L. monocytogenes A500 Ply500 Эндопептидаза MALTEAWLIEKANRKLNAGGMYKITSDKTRNVIKKMAKEGIYLCVAQGYRSTAEQNALYAQGRTKPGAIVTNAKGGQSNHNYGVAVDLCLYTNDGKDVIWESTTSRWKKVVAAMKAEGFKWGGDWKSFKDYPHFELCDAVSGEKIPAATQNTNTNSNRYEGKVIDSAPLLPKMDFKSSPFRMYKVGTEFLVYDHNQYWYKTYIDDKLYYMYKSFCDVVAKKDAKGRIKVRIKSAKDLRIPVWNNIKLNSGKIKWYAPNVKLAWYNYRRGYLELWYPNDGWYYTAEYFLK (SEQ ID NO: 60)
S. pneumoniae ФDp-1 Pal, S Эндопептидаза и амидаза Н. о.
S. agalactiae Профаг LambdaSa1 LambdaSa1 Гликозидаза MVINIEQAIAWMASRKGKVTYSMDYRNGPSSYDCSSSVYFALRSAGASDNGWAVNTEYEHDWLIKNGYVLIAENTNWNAQRGDIFIWGKRGASAGAFGHTGMFVDPDNIIHCNYGYNSITVNNHDEIWGYNGQPYVYAYRYARKQSNAKVDNQSVVSKFEKELDVNTPLSNSNMPYYEATISEDYYVESKPDVNSTDKELLVAGTRVRVYEKVKGWARIGAPQSNQWVEDAYLIDATDM (SEQ ID NO: 61)
S. agalactiae Профаг LambdaSa2 LambdaSa2 Гликозидаза и эндопептидаза MEINTEIAIAWMSARQGKVSYSMDYRDGPNSYDCSSSVYYALRSAGASSAGWAVNTEYMHDWLIKNGYELIAENVDWNAVRGDIAIWGMRGHSSGAGGHVVMFIDPENIIHCNWANNGITVNNYNQTAAASGWMYCYVYRLKSGASTQGKSLDTLVKETLAGNYGNGEARKAVLGNQYEAVMSVINGKTTTNQKTVDQLVQEVIAGKHGNGEARKKSLGSQYDAVQKRVTELLKKQPSEPFKAQEVNKPTETKTSQTELTGQATATKEEGDLSFNGTILKKAVLDKILGNCKKHDILPSYALTILHYEGLWGTSAVGKADNNWGGMTWTGQGNRPSGVTVTQGSARPSNEGGHYMHYASVDDFLTDWFYLLRAGGSYKVSGAKTFSEAIKGMFKVGGAVYDYAASGFDSYIVGASSRLKAIEAENGSLDKFDKATDIGDGSKDKIDITIEGIEVTINGITYELTKKPV (SEQ ID NO: 62)
S. uberis Профаг (ATCC700407) Ply700 Амидаза MTDSIQEMRKLQSIPVRYDMGDRYGNDADRDGRIEMDCSSAVSKALGISMTNNTETLQQALPAIGYGKIHDAVDGTFDMQAYDVIIWAPRDGSSSLGAFGHVLIATSPTTAIHCNYGSDGITENDYNYIWEINGRPREIVFRKGVTQTQATVTSQFERELDVNARLTVSDKPYYEATLSEDYYVEAGPRIDSQDKELIKAGTRVRVYEKLNGWSRINHPESAQWVEDSYLVDATEM (SEQ ID NO: 63)
S. suis SMP LySMP Гликозидаза и эндопептидаза Н. о.
B. anthracis Bcp1 PlyB Мурамидаза Н. о.
S. aureus Phi11 и Phi12 Лизин Phi11 Амидаза и эндопептидаза MQAKLTKNEFIEWLKTSEGKQFNVDLWYGFQCFDYANAGWKVLFGLLLKGLGAKDIPFANNFDGLATVYQNTPDFLAQPGDMVVFGSNYGAGYGHVAWVIEATLDYIIVYEQNWLGGGWTDGIEQPGWGWEKVTRRQHAYDFPMWFIRPNFKSETAPRSVQSPTQAPKKETAKPQPKAVELKIIKDVVKGYDLPKRGSNPKGIVIHNDAGSKGATAEAYRNGLVNAPLSRLEAGIAHSYVSGNTVWQALDESQVGWHTANQIGNKYYYGIEVCQSMGADNATFLKNEQATFQECARLLKKWGLPANRNTIRLHNEFTSTSCPHRSSVLHTGFDPVTRGLLPEDKRLQLKDYFIKQIRAYMDGKIPVATVSNESSASSNTVKPVASAWKRNKYGTYYMEESARFTNGNQPITVRKVGPFLSCPVGYQFQPGGYCDYTEVMLQDGHVWVGYTWEGQRYYLPIRTWNGSAPPNQILGDLWGEIS (SEQ ID NO: 64)
S. aureus ФH5 LysH5 Амидаза и эндопептидаза MQAKLTKKEFIEWLKTSEGKQYNADGWYGFQCFDYANAGWKALFGLLLKGVGAKDIPFANNFDGLATVYQNTPDFLAQPGDMVVFGSNYGAGYGHVAWVIEATLDYIIVYEQNWLGGGWTDGVQQPGSGWEKVTRRQHAYDFPMWFIRPNFKSETAPRSVQSPTQASKKETAKPQPKAVELKIIKDVVKGYDLPKRGSNPNFIVIHNDAGSKGATAEAYRNGLVNAPLSRLEAGIAHSYVSGNTVWQALDESQVGWHTANQIGNKYGYGIEVCQSMGADNATFLKNEQATFQECARLLKKWGLPANRNTIRLHNEFTSTSCPHRSSVLHTGFDPVTRGLLPEDKRLQLKDYFIKQIRAYMDGKIPVATVSNDSSASSNTVKPVASAWKRNKYGTYYMEESARFTNGNQPITVRKVGPFLSCPVGYQFQPGGYCDYTEVMLQDGHVWVGYTWEGQRYYLPIRTWNGSAPPNQILGDLWGEIS (SEQ ID NO: 65)
S. warneri ФWMY LysWMY Амидаза и эндопептидаза MKTKAQAKSWINSKIGKGIDWDGMYGYQCMDEAVDYIHHVTDGKVTMWGNAIDAPKNNFQGLCTVYTNTPEFRPAYGDVIVWSYGTFATYGHIAIVVNPDPYGDLQYITVLEQNWNGNGIYKTEFATIRTHDYTGVSHFIRPKFADEVKETAKTVNKLSVQKKIVTPKNSVERIKNYVKTSGYINGEHYELYNRGHKPKGVVIHNTAGTASATQEGQRLTNMTFQQLANGVAHVYIDKNTIYETLPEDRIAWHVAQQYGNTEFYGIEVCGSRNTDKEQFLANEQVAFQEAARRLKSWGMRANRNTVRLHHTFSSTECPDMSMLLHTGYSMKNGKPTQDITNKCADYFMKQINAYIDGKQPTSTVVGSSSSNKLKAKNKDKSTGWNTNEYGTLWKKEHATFTCGVRQGIVTRTTGPFTSCPQAGVLYYGQSVNYDTVCKQDGYVWISWTTSDGYDVWMPIRTWDRSTDKVSEIWGTIS (SEQ ID NO: 66)
Streptococci (GBS) ФNCTC 11261 PlyGBS Мурамидаза и эндопептидаза MATYQEYKSRSNGNAYDIDGSFGAQCWDGYADYCKYLGLPYANCTNTGYARDIWEQRHENGILNYFDEVEVMQAGDVAIFMVVDGVTPYSHVAIFDSDAGGGYGWFLGQNQGGANGAYNIVKIPYSATYPTAFRPKVFKNAVTVTGNIGLNKGDYFIDVSAYQQADLTTTCQQAGTTKTIIKVSESIAWLSDRHQQQANTSDPIGYYHFGRFGGDSALAQREADLFLSNLPSKKVSYLVIDYEDSASADKQANTNAVIAFMDKIASAGYKPIYYSYKPFTLNNIDYQKIIAKYPNSIWIAGYPDYEVRTEPLWEFFPSMDGVRWWQFTSVGVAGGLDKNIVLLADDSSKMDIPKVDKPQELTFYQKLATNTKLDNSNVPYYEATLSTDYYVESKPNASSADKEFIKAGTRVRVYEKVNGWSRINHPESAQWVEDSYLVNATDM (SEQ ID NO: 67)
C. perfringens Ф3626 Ply3626 Амидаза Н. о.
C. difficile ФCD27 Лизин CD27 Амидаза Н. о.
E. faecalis Ф1 PlyV12 Амидаза Н. о.
A. naeslundii ФAv-1- Лизин Av-1 Предполагаемая амидаза/мурамидаза Н. о.
L. gasseri ФgaY LysgaY Мурамидаза Н. о.
S. aureus ФSA4 LysSA4 Амидаза и эндопептидаза Н. о.
S. haemolyticus ФSH2 SH2 Амидаза и эндопептидаза Н. о.
B. thuringiensis ФBtCS33 PlyBt33 Амидаза Н. о.
L. monocytogenes ФP40 PlyP40 Амидаза Н. о.
L. monocytogenes ФFWLLm3 LysZ5 Амидаза MVKYTVENKIIAGLPKGKLKGANFVIAHETANSKSTIDNEVSYMTRNWQNAFVTHFVGGGGRVVQVANVNYVSWGAGQYANSYSYAQVELCRTSNATTFKKDYEVYCQLLVDLAKKAGIPITLDSGSKTSDKGIKSHKWVADKLGGTTHQDPYAYLSSWGISKAQFASDLAKVSGGGNTGTAPAKPSTPSTNLDKLGLVDYMNAKKMDSSYSNRAKLAKQYGIANYSGTASQNTTLLSKIKGGAPKPSTPAPKPSTSTAKKIYFPPNKGNWSVYPTNKAPVKANAIGAINPTKFGGLTYTIQKDRGNGVYEIQTDQFGRVQVYGAPSTGAVIKK (SEQ ID NO: 68)
B. cereus ФBPS13 LysBPS13 Амидаза MAKREKYIFDVEAEVGKAAKSIKSLEAELSKLQKLNKEIDATGGDRTEKEMLATLKAAKEVNAEYQKMQRILKDLSKYSGKVSRKEFNDSKVINNAKTSVQGGKVTDSFGQMLKNMERQINSVNKQFDNHRKAMVDRGQQYTPHLKTNRKDSQGNSNPSMMGRNKSTTQDMEKAVDKFLNGQNEATTGLNQALYQLKEISKLNRRSESLSRRASASGYMSFQQYSNFTGDRRTVQQTYGGLKTANRERVLELSGQATGISKELDRLNSKKGLTAREGEERKKLMRQLEGIDAELTARKKLNSSLDETTSNMEKFNQSLVDAQVSVKPERGTMRGMMYERAPAIALAIGGAITATIGKLYSEGGNHSKAMRPDEMYVGQQTGAVGANWRPNRTATMRSGLGNHLGFTGQEMMEFQSNYLSANGYHGAEDMKAATTGQATFARATGLGSDEVKDFFNTAYRSGGIDGNQTKQFQNAFLGAMKQSGAVGREKDQLKALNGILSSMSQNRTVSNQDMMRTVGLQSAISSSGVASLQGTKGGALMEQLDNGIREGFNDPQMRVLFGQGTKYQGMGGRAALRKQMEKGISDPDNLNTLIDASKASAGQDPAEQAEVLATLASKMGVNMSSDQARGLIDLQPSGKLTKENIDKVMKEGLKEGSIESAKRDKAYSESKASIDNSSEAATAKQATELNDMGSKLRQANAALGGLPAPLYTAIAAVVAFTAAVAGSALMFKGASWLKGGMASKYGGKGGKGGKGGGTGGGGGAGGAAATGAGAAAGAGGVGAAAAGEVGAGVAAGGAAAGAAAGGSKLAGVGKGFMKGAGKLMLPLGILMGASEIMQAPEEAKGSAIGSAVGGIGGGIAGGAATGAIAGSFLGPIGTAVGGIAGGIAGGFAGSSLGETIGGWFDSGPKEDASAADKAKADASAAALAAAAGTSGAVGSSALQSQMAQGITGAPNMSQVGSMASALGISSGAMASALGISSGQENQIQTMTDKENTNTKKANEAKKGDNLSYERENISMYERVLTRAEQILAQARAQNGIMGVGGGGTAGAGGGINGFTGGGKLQFLAAGQKWSSSNLQQHDLGFTDQNLTAEDLDKWIDSKAPQGSMMRGMGATFLKAGQEYGLDPRYLIAHAAEESGWGTSKIARDKGNFFGIGAFDDSPYSSAYEFKDGTGSAAERGIMGGAKWISEKYYGKGNTTLDKMKAAGYATNASWAPNIASIMAGAPTGSGSGNVTATINVNVKGDEKVSDKLKNSSDMKKAGKDIGSLLGFYSREMTIA (SEQ ID NO: 69)
S. aureus ФGH15 LysGH15 Амидаза и эндопептидаза MAKTQAEINKRLDAYAKGTVDSPYRIKKATSYDPSFGVMEAGAIDADGYYHAQCQDLITDYVLWLTDNKVRTWGNAKDQIKQSYGTGFKIHENKPSTVPKKGWIAVFTSGSYQQWGHIGIVYDGGNTSTFTILEQNWNGYANKKPTKRVDNYYGLTHFIEIPVKAGTTVKKETAKKSASKTPAPKKKATLKVSKNHINYTMDKRGKKPEGMVIHNDAGRSSGQQYENSLANAGYARYANGIAHYYGSEGYVWEAIDAKNQIAWHTGDGTGANSGNFRFAGIEVCQSMSASDAQFLKNEQAVFQFTAEKFKEWGLTPNRKTVRLHMEFVPTACPHRSMVLHTGFNPVTQGRPSQAIMNKLKDYFIKQIKNYMDKGTSSSTVVKDGKTSSASTPATRPVTGSWKKNQYGTWYKPENATFVNGNQPIVTRIGSPFLNAPVGGNLPAGATIVYDEVCIQAGHIWIGYNAYNGDRVYCPVRTCQGVPPNHIPGVAWGVFK (SEQ ID NO: 70)
S. aureus ФvB SauS-PLA88 HydH5 Эндопептидаза и гликозидаза Н. о.
E. faecalis ФF168/08 Lys168 Эндопептидаза Н. о.
E. faecalis ФF170/08 Lys170 Амидаза Н. о.
S. aureus ФP-27/HP P-27/HP Неопределенные Н. о.
C. perfringens ФSM101 Psm Мурамидаза Н. о.
C. sporogenes Ф8074-B1 CS74L Амидаза MKIGIDMGHTLSGADYGVVGLRPESVLTREVGTKVIYKLQKLGHVVVNCTVDKASSVSESLYTRYYRANQANVDLFISIHFNATPGGTGTEVYTYAGRQLGEATRIRQEFKSLGLRDRGTKDGSGLAVIRNTKAKAMLVECCFCDNPNDMKLYNSESFSNAIVKGITGKLPNGESGNNNQGGNKVKAVVIYNEGADRRGAEYLADYLNCPTISNSRTFDYSCVEHVYAVGGKKEQYTKYLKTLLSGANRYDTMQQILNFINGGK (SEQ ID NO: 71)
S. typhimurium ФSPN1S SPN1S Гликозидаза MDINQFRRASGINEQLAARWFPHITTAMNEFGITKPDDQAMFIAQVGHESGGFTRLQENFNYSVNGLSGFIRAGRITPDQANALGRKTYEKSLPLERQRAIANLVYSKRMGNNGPGDGWNYRGRGLIQITGLNNYRDCGNGLKVDLVAQPELLAQDEYAARSAAWFFSSKGCMKYTGDLVRVTQIINGGQNGIDDRRTRYAAARKVLAL (SEQ ID NO: 72)
C. michiganensis ФCMP1 CMP1 Пептидаза Н. о.
C. michiganensis ФCN77 CN77 Пептидаза MGYWGYPNGQIPNDKMALYRGCLLRADAAAQAYALQDAYTRATGKPLVILEGYRDLTRQKYLRNLYLSGRGNIAAVPGLSNHGWGLACDFAAPLNSSGSEEHRWMRQNAPLFGFDWARGKADNEPWHWEYGNVPVSRWASLDVTPIDRNDMADITEGQMQRIAVILLDTEIQTPLGPRLVKHALGDALLLGQANANSIAEVPDKTWDVLVDHPLAKNEDGTPLKVRLGDVAKYEPLEHQNTRDAIAKLGTLQFTDKQLATIGAGVKPIDEASLVKKIVDGVRALFGRAAA (SEQ ID NO: 73)
A. baumannii ФAB2 LysAB2 Гликозидаза MILTKDGFSIIRNELFGGKLDQTQVDAINFIVAKATESGLTYPEAAYLLATIYHETGLPSGYRTMQPIKEAGSDSYLRSKKYYPYIGYGYVQLTWKENYERIGKLIGVDLIKNPEKALEPLIAIQIAIKGMLNGWFTGVGFRRKRPVSKYNKQQYVAARNIINGKDKAELIAKYAIIFERALRSL (SEQ ID NO: 74)
B. cereus ФB4 LysB4 Эндопептидаза MAMALQTLIDKANRKLNVSGMRKDVADRTRAVITQMHAQGIYICVAQGFRSFAEQNALYAQGRTKPGSIVTNARGGQSNHNYGVAVDLCLYTQDGSDVIWTVEGNFRKVIAAMKAQGFKWGGDWVSFKDYPHFELYDVVGGQKPPADNGGAVDNGGGSGSTGGSGGGSTGGGSTGGGYDSSWFTKETGTFVTNTSIKLRTAPFTSADVIATLPAGSPVNYNGFGIEYDGYVWIRQPRSNGYGYLATGESKGGKRQNYWGTFK (SEQ ID NO: 75)
P. aeruginosa ФKMV KMV45 Неопределенные Н. о.
C. tyrobutyricum ФCTP1 Ctp1l Гликозидаза MKKIADISNLNGNVDVKLLFNLGYIGIIAKASEGGTFVDKYYKQNYTNTKAQGKITGAYHFANFSTIAKAQQEANFFLNCIAGTTPDFVVLDLEQQCTGDITDACLAFLNIVAKKFKCVVYCNSSFIKEHLNSKICAYPLWIANYGVATPAFTLWTKYAMWQFTEKGQVSGISGYIDFSYITDEFIKYIKGEDEVENLVVYNDGADQRAAEYLADRLACPTINNARKFDYSNVKNVYAVGGNKEQYTSYLTTLIAGSTRYTTMQAVLDYIKNLK (SEQ ID NO: 76)
P. aeruginosa ФEL EL188 Трансгликозилаза Н. о.
P. aeruginosa ФKZ KZ144 Трансгликозилаза Н. о.
S. aureus Ply187 Гидролаза клеточной стенки MALPKTGKPTAKQVVDWAINLIGSGVDVDGYYGRQCWDLPNYIFNRYWNFKTPGNARDMAWYRYPEGFKVFRNTSDFVPKPGDIAVWTGGNYNWNTWGHTGIVVGPSTKSYFYSVDQNWNNSNSYVGSPAAKIKHSYFGVTHFVRPAYKAEPKPTPPAQNNPAPKDPEPSKKPESNKPIYKVVTKILFTTAHIEHVKANRFVHYITKSDNHNNKPNKIVIKNTNTALSTIDVYRYRDELDKDEIPHFFVDRLNVWACRPIEDSINGYHDSVVLSITETRTALSDNFKMNEIECLSLAESILKANNKKMSASNIIVDNKAWRTFKLHTGKDSLKSSSFTSKDYQKAVNELIKLFNDKDKLLNNKPKDVVERIRIRTIVKENTKFVPSELKPRNNIRDKQDSKIDRVINNYTLKQALNIQYKLNPKPQTSNGVSWYNASVNQIKSAMDTTKIFNNNVQVYQFLKLNQYQGIPVDKLNKLLVGKGTLANQGHAFADGCKKYNINEIYLIAHRFLESANGTSFFASGKTGVYNYFGIGAFDNNPNNAMAFARSHGWTSPTKAIIGGAEFVGKGYFNVGQNTLYRMRWNPQKPGTHQYATDISWAKVQAQMISAMYKEIGLTGDYFIYDQYKK (SEQ ID NO: 77)
P. fluorescens ФOBP OBPgp279 Гликозидаза Н. о.
L. monocytogenes ФP35 PlyP35 Амидаза MARKFTKAELVAKAEKKVGGLKPDVKKAVLSAVKEAYDRYGIGIIVSQGYRSIAEQNGLYAQGRTKPGNIVTNAKGGQSNHNFGVAVDFAIDLIDDGKIDSWQPSATIVNMMKRRGFKWGGDWKSFTDLPHFEACDWYRGERKYKVDTSEWKKKENINIVIKDVGYFQDKPQFLNSKSVRQWKHGTKVKLTKHNSHWYTGVVKDGNKSVRGYIYHSMAKVTSKNSDGSVNATINAHAFCWDNKKLNGGDFINLKRGFKGITHPASDGFYPLYFASRKKTFYIPRYMFDIKK (SEQ ID NO: 78)
L. fermentum ФPYB5 Lyb5 Мурамидаза Н. о.
S. pneumoniae ФCP-7 Cpl-7 Мурамидаза MVKKNDLFVDVASHQGYDISGILEEAGTTNTIIKVSESTSYLNPCLSAQVSQSNPIGFYHFAWFGGNEEEAEAEARYFLDNVPTQVKYLVLDYEDHASASVQRNTTACLRFMQIIAEAGYTPIYYSYKPFTLDNVDYQQILAQFPNSLWIAGYGLNDGTANFEYFPSMDGIRWWQYSSNPFDKNIVLLDDEKEDNINNENTLKSLTTVANEVIQGLWGNGQERYDSLANAGYDPQAVQDKVNEILNAREIADLTTVANEVIQGLWGNGQERYDSLANAGYDPQAVQDKVNEILNAREIADLTTVANEVIQGLWGNGQERYDSLANAGYDPQAVQDKVNELLS (SEQ ID NO: 79)
P. chlororaphis201 Ф2-1 201ϕ2-1gp229 Гликозидаза Н. о.
S. enterica ФPVP-SE1) PVP-SE1gp146 Гликозидаза Н. о.
Corynebacterium ФBFK20 BKF20 Амидаза Н. о.
E. faecalis ФEFAP-1 EFAL-1 Амидаза MKLKGILLSVVTTFGLLFGATNVQAYEVNNEFNLQPWEGSQQLAYPNKIILHETANPRATGRNEATYMKNNWFNAHTTAIVGDGGIVYKVAPEGNVSWGAGNANPYAPVQIELQHTNDPELFKANYKAYVDYTRDMGKKFGIPMTLDQGGSLWEKGVVSHQWVTDFVWGDHTDPYGYLAKMGISKAQLAHDLANGVSGNTATPTPKPDKPKPTQPSKPSNKKRFNYRVDGLEYVNGMWQIYNEHLGKIDFNWTENGIPVEVVDKVNPATGQPTKDQVLKVGDYFNFQENSTGVVQEQTPYMGYTLSHVQLPNEFIWLFTDSKQALMYQ (SEQ ID NO: 80)
Lactobacilli LamdaSA2 LysA, LysA2, и Lysga Y Неопределенные Н. о.
S. aureus SAL-1 Неопределенные Н. о.

В некоторых случаях лизин представляет собой функционально активный вариант лизинов, описанных в данном документе. В некоторых случаях вариант лизина является на по меньшей мере 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичным, например, в определенной области или во всей последовательности, последовательности лизина, описанного в данном документе, или встречающегося в природе лизина.

В некоторых случаях лизин можно создавать с помощью биоинженерии для модулирования его биологической активности, например, повышения, или снижения, или регулирования, или для определения его микроорганизма-мишени. В некоторых случаях лизин продуцируется трансляционным аппаратом (например, рибосомой и т. д.) микробной клетки. В некоторых случаях лизин синтезируют химическим путем. В некоторых случаях лизин образуется из полипептидного предшественника. Полипептидный предшественник может подвергаться расщеплению (например, процессингу под действием протеазы) с образованием самого полипептида лизина. Таким образом, в некоторых случаях лизин продуцируется из полипептида-предшественника. В некоторых случаях лизин включает в себя полипептид, который подвергся посттрансляционным модификациям, например, расщеплению или добавлению одной или нескольких функциональных групп.

Лизины, описанные в данном документе, могут быть составлены в виде композиции для любого из путей применения, описанных в данном документе. Композиции, раскрытые в данном документе, могут содержать любые количество или тип (например, классы) лизинов, как, например, по меньшей мере приблизительно любое количество из 1 лизина, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 или больше лизинов. Подходящая концентрация каждого лизина в композиции зависит от таких факторов, как эффективность, стабильность лизина, количество различных лизинов, состав и способы применения композиции. В некоторых случаях концентрация каждого лизина в жидкой композиции составляет от приблизительно 0,1 нг/мл до приблизительно 100 мг/мл. В некоторых случаях концентрация каждого лизина в твердой композиции составляет от приблизительно 0,1 нг/г до приблизительно 100 мг/г. В некоторых случаях, если композиция содержит по меньшей мере два типа лизинов, то концентрация каждого типа лизинов может быть одной и той же или разной.

Модулирующее средство, включающее в себя лизин, описанный в данном документе, может быть приведено в контакт с хозяином-мишенью в количестве и в течение времени, достаточных для: (a) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации лизина внутри хозяина-мишени; (b) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации лизина внутри кишки хозяина-мишени; (c) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации лизина внутри бактериоцита хозяина-мишени; (d) модулирования уровня или активности одного или нескольких микроорганизмов (например, эндосимбионтов) в организме хозяина-мишени или/и (e) модулирования приспособленности хозяина-мишени.

(c) Противомикробные пептиды

Модулирующее средство, описанное в данном документе, может включать в себя противомикробный пептид (AMP). Можно применять любой AMP, подходящий для ингибирования микроорганизма, обитающего в организме хозяина. AMP представляют собой разнообразную группу молекул, которые разделяются на подгруппы на основании их аминокислотного состава и структуры. AMP могут быть получены из любого организма или продуцироваться в любом организме, который естественным образом продуцирует AMP, в том числе AMP, получаемые из растений (например, копсин), насекомых (например, дрозоцин, пептид скорпиона (например, Uy192, UyCT3, D3, D10, Uy17, Uy192), мастопаран, понератоксин, цекропин, морицин, меллитин), лягушек (например, магаинин, дермасептин, ауреин) и млекопитающих (например, кателицидины, дефензины и протегрины). Например, AMP может представлять собой пептид скорпиона, такой как Uy192 (5'- FLSTIWNGIKGLL-3'; SEQ ID NO: 227), UyCT3 (5'- LSAIWSGIKSLF-3; SEQ ID NO: 228), D3 (5'- LWGKLWEGVKSLI-3'; SEQ ID NO: 229) и D10 (5'- FPFLKLSLKIPKSAIKSAIKRL-3'; SEQ ID NO: 230), Uy17 (5'- ILSAIWSGIKGLL-3'; SEQ ID NO: 231) или их комбинацию. В некоторых случаях противомикробный пептид может представлять собой пептид, характеризующийся по меньшей мере 90% идентичностью последовательности (например, по меньшей мере 90%, 92%, 94%, 96%, 98% или 100% идентичностью последовательности) с одним или несколькими из следующих: цекропина (SEQ ID NO: 82), мелиттина, копсина, дрозомицина (SEQ ID NO: 93), дермсидина (SEQ ID NO: 81), андропина (SEQ ID NO: 83), морицина (SEQ ID NO: 84), цератотоксина (SEQ ID NO: 85), абецина (SEQ ID NO: 86), апидецина (SEQ ID NO: 87), профенина (SEQ ID NO: 88), индолицидина (SEQ ID NO: 89), протегрина (SEQ ID NO: 90), тахиплезина (SEQ ID NO: 91) или дефензина (SEQ ID NO: 92), для переносчика патогена животного. Неограничивающие примеры AMP приведены в таблице 6.

Таблица 6. Примеры противомикробных пептидов

Тип Характеристика Иллюстративный AMP Последовательность
Анионные пептиды Богатые глутаминовой и аспарагиновой кислотой Дермсидин SSLLEKGLDGAKKAVGGLGKLGKDAVEDLESVGKGAVHDVKDVLDSVL (SEQ ID NO: 81)
Линейные катионные α-спиральные пептиды Не имеют цистеина Цекропин A KWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAK (SEQ ID NO: 82)
Андропин MKYFSVLVVLTLILAIVDQSDAFINLLDKVEDALHTGAQAGFKLIRPVERGATPKKSEKPEK (SEQ ID NO: 83)
Морицин MNILKFFFVFIVAMSLVSCSTAAPAKIPIKAIKTVGKAVGKGLRAINIASTANDVFNFLKPKKRKH (SEQ ID NO: 84)
Цератотоксин MANLKAVFLICIVAFIALQCVVAEPAAEDSVVVKRSIGSALKKALPVAKKIGKIALPIAKAALPVAAGLVG (SEQ ID NO: 85)
Катионные пептиды, обогащенные конкретными аминокислотами Богатые пролином, аргинином, фенилаланином, глицином, триптофаном Абецин MKVVIFIFALLATICAAFAYVPLPNVPQPGRRPFPTFPGQGPFNPKIKWPQGY (SEQ ID NO: 86)
Апидецины KNFALAILVVTFVVAVFGNTNLDPPTRPTRLRREAKPEAEPGNNRPVYIPQPRPPHPRLRREAEPEAEPGNNRPVYIPQPRPPHPRLRREAELEAEPGNNRPVYISQPRPPHPRLRREAEPEAEPGNNRPVYIPQPRPPHPRLRREAELEAEPGNNRPVYISQPRPPHPRLRREAEPEAEPGNNRPVYIPQPRPPHPRLRREAEPEAEPGNNRPVYIPQPRPPHPRLRREAEPEAEPGNNRPVYIPQPRPPHPRLRREAKPEAKPGNNRPVYIPQPRPPHPRI (SEQ ID NO: 87)
Профенин METQRASLCLGRWSLWLLLLALVVPSASAQALSYREAVLRAVDRLNEQSSEANLYRLLELDQPPKADEDPGTPKPVSFTVKETVCPRPTRRPPELCDFKENGRVKQCVGTVTLDQIKDPLDITCNEGVRRFPWWWPFLRRPRLRRQAFPPPNVPGPRFPPPNVPGPRFPPPNFPGPRFPPPNFPGPRFPPPNFPGPPFPPPIFPGPWFPPPPPFRPPPFGPPRFPGRR (SEQ ID NO: 88)
Индолицидин MQTQRASLSLGRWSLWLLLLGLVVPSASAQALSYREAVLRAVDQLNELSSEANLYRLLELDPPPKDNEDLGTRKPVSFTVKETVCPRTIQQPAEQCDFKEKGRVKQCVGTVTLDPSNDQFDLNCNELQSVILPWKWPWWPWRRG (SEQ ID NO: 89)
Анионные и катионные пептиды, которые содержат цистеин и образуют дисульфидные связи Содержат 1-3 дисульфидные связи Протегрин METQRASLCLGRWSLWLLLLALVVPSASAQALSYREAVLRAVDRLNEQSSEANLYRLLELDQPPKADEDPGTPKPVSFTVKETVCPRPTRQPPELCDFKENGRVKQCVGTVTLDQIKDPLDITCNEVQGVRGGRLCYCRRRFCVCVGRG (SEQ ID NO: 90)
Тахиплезины KWCFRVCYRGICYRRCR (SEQ ID NO: 91)
Дефензины MKCATIVCTIAVVLAATLLNGSVQAAPQEEAALSGGANLNTLLDELPEETHHAALENYRAKRATCDLASGFGVGSSLCAAHCIARRYRGGYCNSKAVCVCRN (SEQ ID NO: 92)
Дрозомицин MMQIKYLFALFAVLMLVVLGANEADADCLSGRYKGPCAVWDNETCRRVCKEEGRSSGHCSPSLKCWCEGC (SEQ ID NO: 93)

AMP может быть активным в отношении любого количества микроорганизмов-мишеней. В некоторых случаях AMP может характеризоваться формами антибактериальной и/или противогрибковой активности. В некоторых случаях AMP может характеризоваться биологической активностью узкого спектра или биологической активностью широкого спектра. Например, некоторые AMP целенаправленно воздействуют только на несколько видов бактерий или грибов и уничтожают их, тогда как другие являются активными в отношении как грамотрицательных, так и грамположительных бактерий, а также грибов.

Кроме того, AMP может функционировать посредством ряда известных механизмов действия. Например, цитоплазматическая мембрана представляет собой частую мишень для AMP, однако AMP могут также нарушать синтез ДНК и белка, сворачивание белка и синтез клеточной стенки. В некоторых случаях AMP с суммарным катионным зарядом и амфипатической природой разрушают мембраны бактерий, приводя к лизису клеток. В некоторых случаях AMP могут проникать в клетки и взаимодействовать с внутриклеточной мишенью с нарушением синтеза ДНК, РНК, белка или клеточной стенки. Помимо уничтожения микроорганизмов, AMP продемонстрировали ряд иммуномодулирующих функций, которые вовлечены в устранение инфекции, в том числе способность изменять экспрессию генов хозяев, выступать в роли хемокинов и/или индуцировать продуцирование хемокинов, ингибировать продуцирование провоспалительных цитокинов, индуцированное липополисахаридами, способствовать заживлению ран и модулировать ответы дендритных клеток и клеток, участвующих в адаптивном иммунном ответе.

В некоторых случаях AMP представляет собой функционально активный вариант AMP, описанных в данном документе. В некоторых случаях вариант AMP является на по меньшей мере 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичным, например, в определенной области или во всей последовательности, последовательности AMP, описанного в данном документе, или AMP природного происхождения.

В некоторых случаях AMP можно создавать с помощью биоинженерии для модулирования его биологической активности, например, повышения, или снижения, или регулирования, или для определения его микроорганизма-мишени. В некоторых случаях AMP продуцируется трансляционным аппаратом (например, рибосомой и т. д.) клетки. В некоторых случаях AMP синтезируют химическим путем. В некоторых случаях AMP образуется из полипептидного предшественника. Полипептидный предшественник может подвергаться расщеплению (например, процессингу под действием протеазы) с образованием самого полипептида AMP. Таким образом, в некоторых случаях AMP продуцируется из полипептида-предшественника. В некоторых случаях AMP включает в себя полипептид, который подвергся посттрансляционным модификациям, например, расщеплению или добавлению одной или нескольких функциональных групп.

AMP, описанные в данном документе, могут быть составлены в виде композиции для любого из путей применения, описанных в данном документе. Композиции, раскрытые в данном документе, могут содержать любые количество или тип (например, классы) AMP, как, например, по меньшей мере приблизительно любое количество из 1 AMP, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 или больше AMP. Например, композиции могут содержать коктейль AMP (например, коктейль пептидов скорпиона, например, UyCT3, D3, D10 и Uy17). Подходящая концентрация каждого AMP в композиции зависит от таких факторов, как эффективность, стабильность AMP, количество различных AMP в композиции, состав и способы применения композиции. В некоторых случаях концентрация каждого AMP в жидкой композиции составляет от приблизительно 0,1 нг/мл до приблизительно 100 мг/мл (от приблизительно 0,1 нг/мл до приблизительно 1 нг/мл, от приблизительно 1 нг/мл до приблизительно 10 нг/мл, от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл, от приблизительно 100 нг/мл до приблизительно 1000 нг/мл, от приблизительно 1 мг/мл до приблизительно 10 мг/мл, от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 100 мг/мл). В некоторых случаях концентрация каждого AMP в твердой композиции составляет от приблизительно 0,1 нг/г до приблизительно 100 мг/г (от приблизительно 0,1 нг/г до приблизительно 1 нг/г, от приблизительно 1 нг/г до приблизительно 10 нг/г, от приблизительно 10 нг/г до приблизительно 100 нг/г, от приблизительно 100 нг/г до приблизительно 1000 нг/г, от приблизительно 1 мг/г до приблизительно 10 мг/г, от приблизительно 10 мг/г до приблизительно 100 мг/г). В некоторых случаях, если композиция содержит по меньшей мере два типа AMP, то концентрация каждого типа AMP может быть одной и той же или разной.

Модулирующее средство, включающее в себя AMP, описанный в данном документе, может быть приведено в контакт с хозяином-мишенью в количестве и в течение времени, достаточных для: (a) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации AMP внутри хозяина-мишени; (b) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации AMP внутри кишки хозяина-мишени; (c) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации AMP внутри бактериоцита хозяина-мишени; (d) модулирования уровня или активности одного или нескольких микроорганизмов (например, эндосимбионтов) в организме хозяина-мишени или/и (e) модулирования приспособленности хозяина-мишени.

Как проиллюстрировано в примерах 16 и 20-22, AMP, такие как пептиды скорпиона, можно применять в качестве модулирующих средств, которые целенаправленно воздействуют на эндосимбиотическую бактерию в организме насекомого-хозяина, для снижения приспособленности хозяина (например, как изложено в данном документе).

(d) C-богатые пептиды клубеньков

Модулирующее средство, описанное в данном документе, может включать в себя C-богатый пептид клубеньков (пептид NCR). Пептиды NCR продуцируются в определенных видах бобовых растений и играют важную роль в мутуалистическом азотфиксирующем симбиозе растений с бактериями из семейства Rhizobiaceae (клубеньковыми бактериями), который приводит к образованию корневых клубеньков, в которых растительные клетки содержат тысячи внутриклеточных эндосимбионтов. Пептиды NCR обладают противомикробными свойствами, управляя необратимым процессом терминальной дифференцировки бактерий, например, с пермеабилизацией мембраны бактерий, нарушением клеточного деления или ингибированием синтеза белка. Например, в клетках клубеньков Medicago truncatula, инфицированных Sinorhizobium meliloti, продуцируются сотни пептидов NCR, которые управляют необратимым процессом дифференцировки бактерий в крупные полиплоидные азотфиксирующие бактероиды. Неограничивающие примеры пептидов NCR приведены в таблице 7.

Таблица 7. Примеры пептидов NCR

Название Пептидная последовательность Продуцент
>gi|152218086|gb|ABS31477,1| NCR 340 MTKIVVFIYVVILLLTIFHVSAKKKRYIECETHEDCSQVFMPPFVMRCVIHECKIFNGEHLRY (SEQ ID NO: 94) Medicago truncatula
>gi|152218084|gb|ABS31476,1| NCR 339 MAKIMKFVYNMIPFLSIFIITLQVNVVVCEIDADCPQICMPPYEVRCVNHRCGWVNTDDSLFLTQEFTRSKQYIIS (SEQ ID NO: 95) Medicago truncatula
>gi|152218082|gb|ABS31475,1| NCR 338 MYKVVESIFIRYMHRKPNMTKFFKFVYTMFILISLFLVVTNANAHNCTDISDCSSNHCSYEGVSLCMNGQCICIYE (SEQ ID NO: 96) Medicago truncatula
>gi|152218080|gb|ABS31474,1| NCR 337 MVETLRLFYIMILFVSLCLVVVDGESKLEQTCSEDFECYIKNPHVPFGHLRCFEGFCQQLNGPA (SEQ ID NO: 97) Medicago truncatula
>gi|152218078|gb|ABS31473,1| NCR 336 MAKIVNFVYSMIVFLFLFLVATKAARGYLCVTDSHCPPHMCPPGMEPRCVRRMCKCLPIGWRKYFVP (SEQ ID NO: 98) Medicago truncatula
>gi|152218076|gb|ABS31472,1| NCR 335 MQIGKNMVETPKLDYVIIFFFLYFFFRQMIILRLNTTFRPLNFKMLRFWGQNRNIMKHRGQKVHFSLILSDCKTNKDCPKLRRANVRCRKSYCVPI (SEQ ID NO: 99) Medicago truncatula
>gi|152218074|gb|ABS31471,1| NCR 334 MLRLYLVSYFLLKRTLLVSYFSYFSTYIIECKTDNDCPISQLKIYAWKCVKNGCHLFDVIPMMYE (SEQ ID NO: 100) Medicago truncatula
>gi|152218072|gb|ABS31470,1| NCR 333 MAEILKFVYIVILFVSLLLIVVASERECVTDDDCEKLYPTNEYRMMCDSGYCMNLLNGKIIYLLCLKKKKFLIIISVLL (SEQ ID NO: 101) Medicago truncatula
>gi|152218070|gb|ABS31469,1| NCR 332 MAEIIKFVYIMILCVSLLLIEVAGEECVTDADCDKLYPDIRKPLMCSIGECYSLYKGKFSLSIISKTSFSLMVYNVVTLVICLRLAYISLLLKFL (SEQ ID NO: 102) Medicago truncatula
>gi|152218068|gb|ABS31468,1| NCR 331 MAEILKDFYAMNLFIFLIILPAKIRGETLSLTHPKCHHIMLPSLFITEVFQRVTDDGCPKPVNHLRVVKCIEHICEYGYNYRPDFASQIPESTKMPRKRE (SEQ ID NO: 103) Medicago truncatula
>gi|152218066|gb|ABS31467,1| NCR 330 MVEILKNFYAMNLFIFLIILAVKIRGAHFPCVTDDDCPKPVNKLRVIKCIDHICQYARNLPDFASEISESTKMPCKGE (SEQ ID NO: 104) Medicago truncatula
>gi|152218064|gb|ABS31466,1| NCR 329 MFHAQAENMAKVSNFVCIMILFLALFFITMNDAARFECREDSHCVTRIKCVLPRKPECRNYACGCYDSNKYR (SEQ ID NO: 105) Medicago truncatula
>gi|152218062|gb|ABS31465,1| NCR 328 MQMRQNMATILNFVFVIILFISLLLVVTKGYREPFSSFTEGPTCKEDIDCPSISCVNPQVPKCIMFECHCKYIPTTLK (SEQ ID NO: 106) Medicago truncatula
>gi|152218060|gb|ABS31464,1| NCR 327 MATILMYVYITILFISILTVLTEGLYEPLYNFRRDPDCRRNIDCPSYLCVAPKVPRCIMFECHCKDIPSDH (SEQ ID NO: 107) Medicago truncatula
>gi|152218058|gb|ABS31463,1| NCR 326 MTTSLKFVYVAILFLSLLLVVMGGIRRFECRQDSDCPSYFCEKLTVPKCFWSKCYCK (SEQ ID NO: 108) Medicago truncatula
>gi|152218056|gb|ABS31462,1| NCR 325 MTTSLKFVYVAILFLSLLLVVMGGIRKKECRQDSDCPSYFCEKLTIAKCIHSTCLCK (SEQ ID NO: 109) Medicago truncatula
>gi|152218054|gb|ABS31461,1| NCR 324 MQIGKNMVETPKLVYFIILFLSIFLCITVSNSSFSQIFNSACKTDKDCPKFGRVNVRCRKGNCVPI (SEQ ID NO: 110) Medicago truncatula
>gi|152218046|gb|ABS31457,1| NCR 320 MTAILKKFINAVFLFIVLFLATTNVEDFVGGSNDECVYPDVFQCINNICKCVSHHRT (SEQ ID NO: 111) Medicago truncatula
>gi|152218044|gb|ABS31456,1| NCR 319 MQKRKNMAQIIFYVYALIILFSPFLAARLVFVNPEKPCVTDADCDRYRHESAIYSDMFCKDGYCFIDYHHDPYP (SEQ ID NO: 112) Medicago truncatula
>gi|152218042|gb|ABS31455,1| NCR 318 MQMRKNMAQILFYVYALLILFTPFLVARIMVVNPNNPCVTDADCQRYRHKLATRMICNQGFCLMDFTHDPYAPSLP (SEQ ID NO: 113) Medicago truncatula
>gi|152218040|gb|ABS31454,1| NCR 317 MNHISKFVYALIIFLSIYLVVLDGLPISCKDHFECRRKINILRCIYRQEKPMCINSICTCVKLL (SEQ ID NO: 114) Medicago truncatula
>gi|152218038|gb|ABS31453,1| NCR 316 MQREKNMAKIFEFVYAMIIFILLFLVEKNVVAYLKFECKTDDDCQKSLLKTYVWKCVKNECYFFAKK (SEQ ID NO: 115) Medicago truncatula
>gi|152218036|gb|ABS31452,1| NCR 315 MAGIIKFVHVLIIFLSLFHVVKNDDGSFCFKDSDCPDEMCPSPLKEMCYFLQCKCGVDTIA (SEQ ID NO: 116) Medicago truncatula
>gi|152218034|gb|ABS31451,1| NCR 314 MANTHKLVSMILFIFLFLASNNVEGYVNCETDADCPPSTRVKRFKCVKGECRWTRMSYA (SEQ ID NO: 117) Medicago truncatula
>gi|152218032|gb|ABS31450,1| NCR 313 MQRRKKKAQVVMFVHDLIICIYLFIVITTRKTDIRCRFYYDCPRLEYHFCECIEDFCAYIRLN (SEQ ID NO: 118) Medicago truncatula
>gi|152218030|gb|ABS31449,1| NCR 312 MAKVYMFVYALIIFVSPFLLATFRTRLPCEKDDDCPEAFLPPVMKCVNRFCQYEILE (SEQ ID NO: 119) Medicago truncatula
>gi|152218028|gb|ABS31448,1| NCR 310 MIKQFSVCYIQMRRNMTTILKFPYIMVICLLLLHVAAYEDFEKEIFDCKKDGDCDHMCVTPGIPKCTGYVCFCFENL (SEQ ID NO: 120) Medicago truncatula
>gi|152218026|gb|ABS31447,1| NCR 309 MQRSRNMTTIFKFAYIMIICVFLLNIAAQEIENGIHPCKKNEDCNHMCVMPGLPWCHENNLCFCYENAYGNTR (SEQ ID NO: 121) Medicago truncatula
>gi|152218024|gb|ABS31446,1| NCR 304 MTIIIKFVNVLIIFLSLFHVAKNDDNKLLLSFIEEGFLCFKDSDCPYNMCPSPLKEMCYFIKCVCGVYGPIRERRLYQSHNPMIQ (SEQ ID NO: 122) Medicago truncatula
>gi|152218022|gb|ABS31445,1| NCR 303 MRKNMTKILMIGYALMIFIFLSIAVSITGNLARASRKKPVDVIPCIYDHDCPRKLYFLERCVGRVCKYL (SEQ ID NO: 123) Medicago truncatula
>gi|152218020|gb|ABS31444,1| NCR 301 MAHKLVYAITLFIFLFLIANNIEDDIFCITDNDCPPNTLVQRYRCINGKCNLSFVSYG (SEQ ID NO: 124) Medicago truncatula
>gi|152218018|gb|ABS31443,1| NCR 300 MDETLKFVYILILFVSLCLVVADGVKNINRECTQTSDCYKKYPFIPWGKVRCVKGRCRLDM (SEQ ID NO: 125) Medicago truncatula
>gi|152218016|gb|ABS31442,1| NCR 290 MAKIIKFVYVLAIFFSLFLVAKNVNGWTCVEDSDCPANICQPPMQRMCFYGECACVRSKFCT (SEQ ID NO: 126) Medicago truncatula
>gi|152218014|gb|ABS31441,1| NCR 289 MVKIIKFVYFMTLFLSMLLVTTKEDGSVECIANIDCPQIFMLPFVMRCINFRCQIVNSEDT (SEQ ID NO: 127) Medicago truncatula
>gi|152218012|gb|ABS31440,1| NCR 286 MDEILKFVYTLIIFFSLFFAANNVDANIMNCQSTFDCPRDMCSHIRDVICIFKKCKCAGGRYMPQVP (SEQ ID NO: 128) Medicago truncatula
>gi|152218008|gb|ABS31438,1| NCR 278 MQRRKNMANNHMLIYAMIICLFPYLVVTFKTAITCDCNEDCLNFFTPLDNLKCIDNVCEVFM (SEQ ID NO: 129) Medicago truncatula
>gi|152218006|gb|ABS31437,1| NCR 266 MVNILKFIYVIIFFILMFFVLIDVDGHVLVECIENRDCEKGMCKFPFIVRCLMDQCKCVRIHNLI (SEQ ID NO: 130) Medicago truncatula
>gi|152218004|gb|ABS31436,1| NCR 265 MIIQFSIYYMQRRKLNMVEILKFSHALIIFLFLSALVTNANIFFCSTDEDCTWNLCRQPWVQKCRLHMCSCEKN (SEQ ID NO: 131) Medicago truncatula
>gi|152218002|gb|ABS31435,1| NCR 263 MDEVFKFVYVMIIFPFLILDVATNAEKIRRCFNDAHCPPDMCTLGVIPKCSRFTICIC (SEQ ID NO: 132) Medicago truncatula
>gi|152218000|gb|ABS31434,1| NCR 244 MHRKPNMTKFFKFVYTMFILISLFLVVTNANANNCTDTSDCSSNHCSYEGVSLCMNGQCICIYE (SEQ ID NO: 133) Medicago truncatula
>gi|152217998|gb|ABS31433,1| NCR 239 MQMKKMATILKFVYLIILLIYPLLVVTEESHYMKFSICKDDTDCPTLFCVLPNVPKCIGSKCHCKLMVN (SEQ ID NO: 134) Medicago truncatula
>gi|152217996|gb|ABS31432,1| NCR 237 MVETLRLFYIMILFVSLYLVVVDGVSKLAQSCSEDFECYIKNPHAPFGQLRCFEGYCQRLDKPT (SEQ ID NO: 135) Medicago truncatula
>gi|152217994|gb|ABS31431,1| NCR 228 MTTFLKVAYIMIICVFVLHLAAQVDSQKRLHGCKEDRDCDNICSVHAVTKCIGNMCRCLANVK (SEQ ID NO: 136) Medicago truncatula
>gi|152217992|gb|ABS31430,1| NCR 224 MRINRTPAIFKFVYTIIIYLFLLRVVAKDLPFNICEKDEDCLEFCAHDKVAKCMLNICFCF (SEQ ID NO: 137) Medicago truncatula
>gi|152217990|gb|ABS31429,1| NCR 221 MAEILKILYVFIIFLSLILAVISQHPFTPCETNADCKCRNHKRPDCLWHKCYCY (SEQ ID NO: 138) Medicago truncatula
>gi|152217988|gb|ABS31428,1| NCR 217 MRKSMATILKFVYVIMLFIYSLFVIESFGHRFLIYNNCKNDTECPNDCGPHEQAKCILYACYCVE (SEQ ID NO: 139) Medicago truncatula
>gi|152217986|gb|ABS31427,1| NCR 209 MNTILKFIFVVFLFLSIFLSAGNSKSYGPCTTLQDCETHNWFEVCSCIDFECKCWSLL (SEQ ID NO: 140) Medicago truncatula
>gi|152217984|gb|ABS31426,1| NCR 206 MAEIIKFVYIMILCVSLLLIAEASGKECVTDADCENLYPGNKKPMFCNNTGYCMSLYKEPSRYM (SEQ ID NO: 141) Medicago truncatula
>gi|152217982|gb|ABS31425,1| NCR 201 MAKIIKFVYIMILCVSLLLIVEAGGKECVTDVDCEKIYPGNKKPLICSTGYCYSLYEEPPRYHK (SEQ ID NO: 142) Medicago truncatula
>gi|152217980|gb|ABS31424,1| NCR 200 MAKVTKFGYIIIHFLSLFFLAMNVAGGRECHANSHCVGKITCVLPQKPECWNYACVCYDSNKYR (SEQ ID NO: 143) Medicago truncatula
>gi|152217978|gb|ABS31423,1| NCR 192 MAKIFNYVYALIMFLSLFLMGTSGMKNGCKHTGHCPRKMCGAKTTKCRNNKCQCV (SEQ ID NO: 144) Medicago truncatula
>gi|152217976|gb|ABS31422,1| NCR 189 MTEILKFVCVMIIFISSFIVSKSLNGGGKDKCFRDSDCPKHMCPSSLVAKCINRLCRCRRPELQVQLNP (SEQ ID NO: 145) Medicago truncatula
>gi|152217974|gb|ABS31421,1| NCR 187 MAHIIMFVYALIYALIIFSSLFVRDGIPCLSDDECPEMSHYSFKCNNKICEYDLGEMSDDDYYLEMSRE (SEQ ID NO: 146) Medicago truncatula
>gi|152217972|gb|ABS31420,1| NCR 181 MYREKNMAKTLKFVYVIVLFLSLFLAAKNIDGRVSYNSFIALPVCQTAADCPEGTRGRTYKCINNKCRYPKLLKPIQ (SEQ ID NO: 147) Medicago truncatula
>gi|152217970|gb|ABS31419,1| NCR 176 MAHIFNYVYALLVFLSLFLMVTNGIHIGCDKDRDCPKQMCHLNQTPKCLKNICKCV (SEQ ID NO: 148) Medicago truncatula
>gi|152217968|gb|ABS31418,1| NCR 175 MAEILKCFYTMNLFIFLIILPAKIREHIQCVIDDDCPKSLNKLLIIKCINHVCQYVGNLPDFASQIPKSTKMPYKGE (SEQ ID NO: 149) Medicago truncatula
>gi|152217966|gb|ABS31417,1| NCR 173 MAYISRIFYVLIIFLSLFFVVINGVKSLLLIKVRSFIPCQRSDDCPRNLCVDQIIPTCVWAKCKCKNYND (SEQ ID NO: 150) Medicago truncatula
>gi|152217964|gb|ABS31416,1| NCR 172 MANVTKFVYIAIYFLSLFFIAKNDATATFCHDDSHCVTKIKCVLPRTPQCRNEACGCYHSNKFR (SEQ ID NO: 151) Medicago truncatula
>gi|152217962|gb|ABS31415,1| NCR 171 MGEIMKFVYVMIIYLFMFNVATGSEFIFTKKLTSCDSSKDCRSFLCYSPKFPVCKRGICECI (SEQ ID NO: 152) Medicago truncatula
>gi|152217960|gb|ABS31414,1| NCR 169 MGEMFKFIYTFILFVHLFLVVIFEDIGHIKYCGIVDDCYKSKKPLFKIWKCVENVCVLWYK (SEQ ID NO: 153) Medicago truncatula
>gi|152217958|gb|ABS31413,1| NCR 165 MARTLKFVYSMILFLSLFLVANGLKIFCIDVADCPKDLYPLLYKCIYNKCIVFTRIPFPFDWI (SEQ ID NO: 154) Medicago truncatula
>gi|152217956|gb|ABS31412,1| NCR 159 MANITKFVYIAILFLSLFFIGMNDAAILECREDSHCVTKIKCVLPRKPECRNNACTCYKGGFSFHH (SEQ ID NO: 155) Medicago truncatula
>gi|152217954|gb|ABS31411,1| NCR 147 MQRVKKMSETLKFVYVLILFISIFHVVIVCDSIYFPVSRPCITDKDCPNMKHYKAKCRKGFCISSRVR (SEQ ID NO: 156) Medicago truncatula
>gi|152217952|gb|ABS31410,1| NCR 146 MQIRKIMSGVLKFVYAIILFLFLFLVAREVGGLETIECETDGDCPRSMIKMWNKNYRHKCIDGKCEWIKKLP (SEQ ID NO: 157) Medicago truncatula
>gi|152217950|gb|ABS31409,1| NCR 145 MFVYDLILFISLILVVTGINAEADTSCHSFDDCPWVAHHYRECIEGLCAYRILY (SEQ ID NO: 158) Medicago truncatula
>gi|152217948|gb|ABS31408,1| NCR 144 MQRRKKSMAKMLKFFFAIILLLSLFLVATEVGGAYIECEVDDDCPKPMKNSHPDTYYKCVKHRCQWAWK (SEQ ID NO: 159) Medicago truncatula
>gi|152217946|gb|ABS31407,1| NCR 140 MFVYTLIIFLFPSHVITNKIAIYCVSDDDCLKTFTPLDLKCVDNVCEFNLRCKGKCGERDEKFVFLKALKKMDQKLVLEEQGNAREVKIPKKLLFDRIQVPTPATKDQVEEDDYDDDDEEEEEEEDDVDMWFHLPDVVCH (SEQ ID NO: 160) Medicago truncatula
>gi|152217944|gb|ABS31406,1| NCR 138 MAKFSMFVYALINFLSLFLVETAITNIRCVSDDDCPKVIKPLVMKCIGNYCYFFMIYEGP (SEQ ID NO: 161) Medicago truncatula
>gi|152217942|gb|ABS31405,1| NCR 136 MAHKFVYAIILFIFLFLVAKNVKGYVVCRTVDDCPPDTRDLRYRCLNGKCKSYRLSYG (SEQ ID NO: 162) Medicago truncatula
>gi|152217940|gb|ABS31404,1| NCR 129 MQRKKNMGQILIFVFALINFLSPILVEMTTTTIPCTFIDDCPKMPLVVKCIDNFCNYFEIK (SEQ ID NO: 163) Medicago truncatula
>gi|152217938|gb|ABS31403,1| NCR 128 MAQTLMLVYALIIFTSLFLVVISRQTDIPCKSDDACPRVSSHHIECVKGFCTYWKLD (SEQ ID NO: 164) Medicago truncatula
>gi|152217936|gb|ABS31402,1| NCR 127 MLRRKNTVQILMFVSALLIYIFLFLVITSSANIPCNSDSDCPWKIYYTYRCNDGFCVYKSIDPSTIPQYMTDLIFPR (SEQ ID NO: 165) Medicago truncatula
>gi|152217934|gb|ABS31401,1| NCR 122 MAVILKFVYIMIIFLFLLYVVNGTRCNRDEDCPFICTGPQIPKCVSHICFCLSSGKEAY (SEQ ID NO: 166) Medicago truncatula
>gi|152217932|gb|ABS31400,1| NCR 121 MDAILKFIYAMFLFLFLFVTTRNVEALFECNRDFVCGNDDECVYPYAVQCIHRYCKCLKSRN (SEQ ID NO: 167) Medicago truncatula
>gi|152217930|gb|ABS31399,1| NCR 119 MQIGRKKMGETPKLVYVIILFLSIFLCTNSSFSQMINFRGCKRDKDCPQFRGVNIRCRSGFCTPIDS (SEQ ID NO: 168) Medicago truncatula
>gi|152217928|gb|ABS31398,1| NCR 118 MQMRKNMAQILFYVYALLILFSPFLVARIMVVNPNNPCVTDADCQRYRHKLATRMVCNIGFCLMDFTHDPYAPSLP (SEQ ID NO: 169) Medicago truncatula
>gi|152217926|gb|ABS31397,1| NCR 111 MYVYYIQMGKNMAQRFMFIYALIIFLSQFFVVINTSDIPNNSNRNSPKEDVFCNSNDDCPTILYYVSKCVYNFCEYW (SEQ ID NO: 170) Medicago truncatula
>gi|152217924|gb|ABS31396,1| NCR 103 MAKIVNFVYSMIIFVSLFLVATKGGSKPFLTRPYPCNTGSDCPQNMCPPGYKPGCEDGYCNHCYKRW (SEQ ID NO: 171) Medicago truncatula
>gi|152217922|gb|ABS31395,1| NCR 101 MVRTLKFVYVIILILSLFLVAKGGGKKIYCENAASCPRLMYPLVYKCLDNKCVKFMMKSRFV (SEQ ID NO: 172) Medicago truncatula
>gi|152217920|gb|ABS31394,1| NCR 96 MARTLKFVYAVILFLSLFLVAKGDDVKIKCVVAANCPDLMYPLVYKCLNGICVQFTLTFPFV (SEQ ID NO: 173) Medicago truncatula
>gi|152217918|gb|ABS31393,1| NCR 94 MSNTLMFVITFIVLVTLFLGPKNVYAFQPCVTTADCMKTLKTDENIWYECINDFCIPFPIPKGRK (SEQ ID NO: 174) Medicago truncatula
>gi|152217916|gb|ABS31392,1| NCR 93 MKRVVNMAKIVKYVYVIIIFLSLFLVATKIEGYYYKCFKDSDCVKLLCRIPLRPKCMYRHICKCKVVLTQNNYVLT (SEQ ID NO: 175) Medicago truncatula
>gi|152217914|gb|ABS31391,1| NCR 90 MKRGKNMSKILKFIYATLVLYLFLVVTKASDDECKIDGDCPISWQKFHTYKCINQKCKWVLRFHEY (SEQ ID NO: 176) Medicago truncatula
>gi|152217912|gb|ABS31390,1| NCR 88 MAKTLNFMFALILFISLFLVSKNVAIDIFVCQTDADCPKSELSMYTWKCIDNECNLFKVMQQMV (SEQ ID NO: 177) Medicago truncatula
>gi|152217910|gb|ABS31389,1| NCR 86 MANTHKLVSMILFIFLFLVANNVEGYVNCETDADCPPSTRVKRFKCVKGECRWTRMSYA (SEQ ID NO: 178) Medicago truncatula
>gi|152217908|gb|ABS31388,1| NCR 77 MAHFLMFVYALITCLSLFLVEMGHLSIHCVSVDDCPKVEKPITMKCINNYCKYFVDHKL (SEQ ID NO: 179) Medicago truncatula
>gi|152217906|gb|ABS31387,1| NCR 76 MNQIPMFGYTLIIFFSLFPVITNGDRIPCVTNGDCPVMRLPLYMRCITYSCELFFDGPNLCAVERI (SEQ ID NO: 180) Medicago truncatula
>gi|152217904|gb|ABS31386,1| NCR 74 MRKDMARISLFVYALIIFFSLFFVLTNGELEIRCVSDADCPLFPLPLHNRCIDDVCHLFTS (SEQ ID NO: 181) Medicago truncatula
>gi|152217902|gb|ABS31385,1| NCR 68 MAQILMFVYFLIIFLSLFLVESIKIFTEHRCRTDADCPARELPEYLKCQGGMCRLLIKKD (SEQ ID NO: 182) Medicago truncatula
>gi|152217900|gb|ABS31384,1| NCR 65 MARVISLFYALIIFLFLFLVATNGDLSPCLRSGDCSKDECPSHLVPKCIGLTCYCI (SEQ ID NO: 183) Medicago truncatula
>gi|152217898|gb|ABS31383,1| NCR 62 MQRRKNMAQILLFAYVFIISISLFLVVTNGVKIPCVKDTDCPTLPCPLYSKCVDGFCKMLSI (SEQ ID NO: 184) Medicago truncatula
>gi|152217896|gb|ABS31382,1| NCR 57 MNHISKFVYALIIFLSVYLVVLDGRPVSCKDHYDCRRKVKIVGCIFPQEKPMCINSMCTCIREIVP (SEQ ID NO: 185) Medicago truncatula
>gi|152217894|gb|ABS31381,1| NCR 56 MKSQNHAKFISFYKNDLFKIFQNNDSHFKVFFALIIFLYTYLHVTNGVFVSCNSHIHCRVNNHKIGCNIPEQYLLCVNLFCLWLDY (SEQ ID NO: 186) Medicago truncatula
>gi|152217892|gb|ABS31380,1| NCR 54 MTYISKVVYALIIFLSIYVGVNDCMLVTCEDHFDCRQNVQQVGCSFREIPQCINSICKCMKG (SEQ ID NO: 187) Medicago truncatula
>gi|152217890|gb|ABS31379,1| NCR 53 MTHISKFVFALIIFLSIYVGVNDCKRIPCKDNNDCNNNWQLLACRFEREVPRCINSICKCMPM (SEQ ID NO: 188) Medicago truncatula
>gi|152217888|gb|ABS31378,1| NCR 43 MVQTPKLVYVIVLLLSIFLGMTICNSSFSHFFEGACKSDKDCPKLHRSNVRCRKGQCVQI (SEQ ID NO: 189) Medicago truncatula
>gi|152217886|gb|ABS31377,1| NCR 28 MTKILMLFYAMIVFHSIFLVASYTDECSTDADCEYILCLFPIIKRCIHNHCKCVPMGSIEPMSTIPNGVHKFHIINN (SEQ ID NO: 190) Medicago truncatula
>gi|152217884|gb|ABS31376,1| NCR 26 MAKTLNFVCAMILFISLFLVSKNVALYIIECKTDADCPISKLNMYNWRCIKSSCHLYKVIQFMV (SEQ ID NO: 191) Medicago truncatula
>gi|152217882|gb|ABS31375,1| NCR 24 MQKEKNMAKTFEFVYAMIIFILLFLVENNFAAYIIECQTDDDCPKSQLEMFAWKCVKNGCHLFGMYEDDDDP (SEQ ID NO: 192) Medicago truncatula
>gi|152217880|gb|ABS31374,1| NCR 21 MAATRKFIYVLSHFLFLFLVTKITDARVCKSDKDCKDIIIYRYILKCRNGECVKIKI (SEQ ID NO: 193) Medicago truncatula
>gi|152217878|gb|ABS31373,1| NCR 20 MQRLDNMAKNVKFIYVIILLLFIFLVIIVCDSAFVPNSGPCTTDKDCKQVKGYIARCRKGYCMQSVKRTWSSYSR (SEQ ID NO: 194) Medicago truncatula
>gi|152217876|gb|ABS31372,1| NCR 19 MKFIYIMILFLSLFLVQFLTCKGLTVPCENPTTCPEDFCTPPMITRCINFICLCDGPEYAEPEYDGPEPEYDHKGDFLSVKPKIINENMMMRERHMMKEIEV (SEQ ID NO: 195) Medicago truncatula
>gi|152217874|gb|ABS31371,1| NCR 12 MAQFLMFIYVLIIFLYLFYVEAAMFELTKSTIRCVTDADCPNVVKPLKPKCVDGFCEYT (SEQ ID NO: 196) Medicago truncatula
>gi|152217872|gb|ABS31370,1| NCR 10 MKMRIHMAQIIMFFYALIIFLSPFLVDRRSFPSSFVSPKSYTSEIPCKATRDCPYELYYETKCVDSLCTY (SEQ ID NO: 197) Medicago truncatula

Любой пептид NCR, известный в данной области техники, является подходящим для применения в способах или композициях, описанных в данном документе. Растения, продуцирующие пептиды NCR, включают в себя без ограничения Pisum sativum (горох), Astragalus sinicus (бобовые IRLC), Phaseolus vulgaris (фасоль), Vigna unguiculata (коровий горох), Medicago truncatula (люцерну усеченную) и Lotus japonicus. Например, на основании геномной последовательности M. truncatula прогнозируют свыше 600 потенциальных пептидов NCR, и почти 150 различных пептидов NCR были выявлены в клетках, выделенных из корневых клубеньков, с помощью масс-спектрометрии.

Пептиды NCR, описанные в данном документе, могут быть зрелыми или незрелыми пептидами NCR. Незрелые пептиды NCR имеют C-концевой сигнальный пептид, который требуется для транслокации в эндоплазматический ретикулум и отщепляется после транслокации. N-конец пептида NCR содержит сигнальный пептид, который может быть отщепляемым, для нацеливания на секреторный путь. Пептиды NCR, как правило, представляют собой малые пептиды с дисульфидными мостиками, которые стабилизируют их структуры. Зрелые пептиды NCR имеют длину в диапазоне от приблизительно 20 до приблизительно 60 аминокислот, от приблизительно 25 до приблизительно 55 аминокислот, от приблизительно 30 до приблизительно 50 аминокислот, от приблизительно 35 до приблизительно 45 аминокислот или в любом диапазоне в промежутке между этими значениями. Пептиды NCR могут содержать консервативную последовательность из цистеиновых остатков, при этом остальная часть пептидной последовательности является высоковариабельной. Пептиды NCR, как правило, имеют приблизительно четыре или восемь молекул цистеина.

Пептиды NCR могут быть анионными, нейтральными или катионными. В некоторых случаях синтетические катионные пептиды NCR, имеющие pI, превышающую приблизительно восемь, обладают формами противомикробной активности. Например, как NCR247 (pI=10,15) (RNGCIVDPRCPYQQCRRPLYCRRR; SEQ ID NO: 198), так и NCR335 (pI=11,22) (MAQFLLFVYSLIIFLSLFFGEAAFERTETRMLTIPCTSDDNCPKVISPCHTKCFDGFCGWYIEGSYEGP; SEQ ID NO: 199) являются эффективными в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий, а также грибов. В некоторых случаях нейтральные и/или анионные пептиды NCR, такие как NCR001, не обладают формами противомикробной активности при pI, превышающей приблизительно 8.

В некоторых случаях пептид NCR является эффективным в уничтожении бактерий. В некоторых случаях пептид NCR является эффективным в уничтожении S. meliloti, Xenorhabdus spp, Photorhabdus spp, Candidatus spp, Buchnera spp, Blattabacterium spp, Baumania spp, Wigglesworthia spp, Wolbachia spp, Rickettsia spp, Orientia spp, Sodalis spp, Burkholderia spp, Cupriavidus spp, Frankia spp, Snirhizobium spp, Streptococcus spp, Wolinella spp, Xylella spp, Erwinia spp, Agrobacterium spp, Bacillus spp, Paenibacillus spp, Streptomyces spp, Micrococcus spp, Corynebacterium spp, Acetobacter spp, Cyanobacteria spp, Salmonella spp, Rhodococcus spp, Pseudomonas spp, Lactobacillus spp, Enterococcus spp, Alcaligenes spp, Klebsiella spp, Paenibacillus spp, Arthrobacter spp, Corynebacterium spp, Brevibacterium spp, Thermus spp, Pseudomonas spp, Clostridium spp или Escherichia spp.

В некоторых случаях пептид NCR представляет собой функционально активный вариант пептида NCR, описанного в данном документе. В некоторых случаях вариант пептида NCR является на по меньшей мере 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичным, например, в определенной области или во всей последовательности, последовательности пептида NCR, описанного в данном документе, или пептида NCR природного происхождения.

В некоторых случаях пептид NCR можно создавать с помощью биоинженерии для модулирования его биологической активности, например, повышения, или снижения, или регулирования, или для определения его микроорганизма-мишени. В некоторых случаях пептид NCR продуцируется трансляционным аппаратом (например, рибосомой и т. д.) клетки. В некоторых случаях пептид NCR синтезируют химическим путем. В некоторых случаях пептид NCR образуется из полипептидного предшественника. Полипептидный предшественник может подвергаться расщеплению (например, процессингу под действием протеазы) с образованием самого пептида NCR. Таким образом, в некоторых случаях пептид NCR продуцируется из полипептида-предшественника. В некоторых случаях пептид NCR включает в себя полипептид, который подвергся посттрансляционным модификациям, например, расщеплению или добавлению одной или нескольких функциональных групп.

Пептид NCR, описанный в данном документе, может быть составлен в виде композиции для любого из путей применения, описанных в данном документе. Композиции, раскрытые в данном документе, могут содержать любые количество или тип пептидов NCR, как, например, по меньшей мере приблизительно любое количество из 1 пептида NCR, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100 или больше пептидов NCR. Подходящая концентрация каждого пептида NCR в композиции зависит от таких факторов, как эффективность, стабильность пептида NCR, количество различных пептидов NCR, состав и способы применения композиции. В некоторых случаях концентрация каждого пептида NCR в жидкой композиции составляет от приблизительно 0,1 нг/мл до приблизительно 100 мг/мл. В некоторых случаях концентрация каждого пептида NCR в твердой композиции составляет от приблизительно 0,1 нг/г до приблизительно 100 мг/г. В некоторых случаях, если композиция содержит по меньшей мере два типа пептидов NCR, то концентрация каждого типа пептида NCR может быть одной и той же или разной.

Модулирующее средство, включающее в себя пептид NCR, описанный в данном документе, может быть приведено в контакт с хозяином-мишенью в количестве и в течение времени, достаточных для: (a) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации пептида NCR внутри хозяина-мишени; (b) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации пептида NCR внутри кишки хозяина-мишени; (c) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации пептида NCR внутри бактериоцита хозяина-мишени; (d) модулирования уровня или активности одного или нескольких микроорганизмов (например, эндосимбионтов) в организме хозяина-мишени или/и (e) модулирования приспособленности хозяина-мишени.

(e) Регуляторные пептиды бактериоцитов

Модулирующее средство, описанное в данном документе, может включать в себя регуляторный пептид бактериоцитов (BRP). BRP представляют собой пептиды, экспрессируемые в бактериоцитах насекомых. Эти гены впервые экспрессируются в момент времени развития, совпадающий с включением симбионтов, а их специфичная для бактериоцитов экспрессия поддерживается в течение всей жизни насекомого. В некоторых случаях BRP имеет гидрофобный аминоконцевой домен, который, как предполагается, представляет собой сигнальный пептид. Помимо этого, некоторые BRP имеют домен, богатый цистеином. В некоторых случаях регуляторный пептид бактериоцитов представляет собой специфичный для бактериоцитов белок, богатый цистеином (BCR). Регуляторные пептиды бактериоцитов имеют длину от приблизительно 40 до 150 аминокислот. В некоторых случаях регуляторный пептид бактериоцитов имеет длину в диапазоне от приблизительно 45 до приблизительно 145, от приблизительно 50 до приблизительно 140, от приблизительно 55 до приблизительно 135, от приблизительно 60 до приблизительно 130, от приблизительно 65 до приблизительно 125, от приблизительно 70 до приблизительно 120, от приблизительно 75 до приблизительно 115, от приблизительно 80 до приблизительно 110, от приблизительно 85 до приблизительно 105 или в любом диапазоне в промежутке между этими значениями. Неограничивающие примеры BRP и форм их активности приведены в таблице 8.

Таблица 8. Примеры регуляторных пептидов бактериоцитов

Название Пептидная последовательность
Семейство специфичных для бактериоцитов белков BCR, богатых цистеином, пептид BCR1 MKLLHGFLIIMLTMHLSIQYAYGGPFLTKYLCDRVCHKLCGDEFVCSCIQYKSLKGLWFPHCPTGKASVVLHNFLTSP (SEQ ID NO: 200)
Семейство специфичных для бактериоцитов белков BCR, богатых цистеином, пептид BCR2 MKLLYGFLIIMLTIHLSVQYFESPFETKYNCDTHCNKLCGKIDHCSCIQYHSMEGLWFPHCRTGSAAQMLHDFLSNP (SEQ ID NO: 201)
Семейство специфичных для бактериоцитов белков BCR, богатых цистеином, пептид BCR3 MSVRKNVLPTMFVVLLIMSPVTPTSVFISAVCYSGCGSLALVCFVSNGITNGLDYFKSSAPLSTSETSCGEAFDTCTDHCLANFKF (SEQ ID NO: 202)
Семейство специфичных для бактериоцитов белков BCR, богатых цистеином, пептид BCR4 MRLLYGFLIIMLTIYLSVQDFDPTEFKGPFPTIEICSKYCAVVCNYTSRPCYCVEAAKERDQWFPYCYD (SEQ ID NO: 203)
Семейство специфичных для бактериоцитов белков BCR, богатых цистеином, пептид BCR5 MRLLYGFLIIMLTIHLSVQDIDPNTLRGPYPTKEICSKYCEYNVVCGASLPCICVQDARQLDHWFACCYDGGPEMLM (SEQ ID NO: 204)
Семейство секретируемых белков SP, пептид SP1 MKLFVVVVLVAVGIMFVFASDTAAAPTDYEDTNDMISLSSLVGDNSPYVRVSSADSGGSSKTSSKNPILGLLKSVIKLLTKIFGTYSDAAPAMPPIPPALRKNRGMLA (SEQ ID NO: 205)
Семейство секретируемых белков SP, пептид SP2 MVACKVILAVAVVFVAAVQGRPGGEPEWAAPIFAELKSVSDNITNLVGLDNAGEYATAAKNNLNAFAESLKTEAAVFSKSFEGKASASDVFKESTKNFQAVVDTYIKNLPKDLTLKDFTEKSEQALKYMVEHGTEITKKAQGNTETEKEIKEFFKKQIENLIGQGKALQAKIAEAKKA (SEQ ID NO: 206)
Семейство секретируемых белков SP, пептид SP3 MKTSSSKVFASCVAIVCLASVANALPVQKSVAATTENPIVEKHGCRAHKNLVRQNVVDLKTYDSMLITNEVVQKQSNEVQSSEQSNEGQNSEQSNEGQNSEQSNEVQSSEHSNEGQNSKQSNEGQNSEQSNEVQSSEHSNEGQNSEQSNEVQSSEHSNEGQNSKQSNEGQNSKQSNEVQSSEHWNEGQNSKQSNEDQNSEQSNEGQNSKQSNEGQNSKQSNEDQNSEQSNEGQNSKQSNEVQSSEQSNEGQNSKQSNEGQSSEQSNEGQNSKQSNEVQSPEEHYDLPDPESSYESEETKGSHESGDDSEHR (SEQ ID NO: 207)
Семейство секретируемых белков SP, пептид SP4 MKTIILGLCLFGALFWSTQSMPVGEVAPAVPAVPSEAVPQKQVEAKPETNAASPVSDAKPESDSKPVDAEVKPTVSEVKAESEQKPSGEPKPESDAKPVVASESKPESDPKPAAVVESKPENDAVAPETNNDAKPENAAAPVSENKPATDAKAETELIAQAKPESKPASDLKAEPEAAKPNSEVPVALPLNPTETKATQQSVETNQVEQAAPAAAQADPAAAPAADPAPAPAAAPVAAEEAKLSESAPSTENKAAEEPSKPAEQQSAKPVEDAVPAASEISETKVSPAVPAVPEVPASPSAPAVADPVSAPEAEKNAEPAKAANSAEPAVQSEAKPAEDIQKSGAVVSAENPKPVEEQKPAEVAKPAEQSKSEAPAEAPKPTEQSAAEEPKKPESANDEKKEQHSVNKRDATKEKKPTDSIMKKQKQKKAN (SEQ ID NO: 208)
Семейство секретируемых белков SP, пептид SP5a MNGKIVLCFAVVFIGQAMSAATGTTPEVEDIKKVAEQMSQTFMSVANHLVGITPNSADAQKSIEKIRTIMNKGFTDMETEANKMKDIVRKNADPKLVEKYDELEKELKKHLSTAKDMFEDKVVKPIGEKVELKKITENVIKTTKDMEATMNKAIDGFKKQ (SEQ ID NO: 209)
Семейство секретируемых белков SP, пептид SP6 MHLFLALGLFIVCGMVDATFYNPRSQTFNQLMERRQRSIPIPYSYGYHYNPIEPSINVLDSLSEGLDSRINTFKPIYQNVKMSTQDVNSVPRTQYQPKNSLYDSEYISAKDIPSLFPEEDSYDYKYLGSPLNKYLTRPSTQESGIAINLVAIKETSVFDYGFPTYKSPYSSDSVWNFGSKIPNTVFEDPQSVESDPNTFKVSSPTIKIVKLLPETPEQESIITTTKNYELNYKTTQETPTEAELYPITSEEFQTEDEWHPMVPKENTTKDESSFITTEEPLTEDKSNSITIEKTQTEDESNSIEFNSIRTEEKSNSITTEENQKEDDESMSTTSQETTTAFNLNDTFDTNRYSSSHESLMLRIRELMKNIADQQNKSQFRTVDNIPAKSQSNLSSDESTNQQFEPQLVNGADTYK (SEQ ID NO: 210)
Колеоптерицин A, пептид ColA MTRTMLFLACVAALYVCISATAGKPEEFAKLSDEAPSNDQAMYESIQRYRRFVDGNRYNGGQQQQQQPKQWEVRPDLSRDQRGNTKAQVEINKKGDNHDINAGWGKNINGPDSHKDTWHVGGSVRW (SEQ ID NO: 211)
RlpA I типа MKETTVVWAKLFLILIILAKPLGLKAVNECKRLGNNSCRSHGECCSGFCFIEPGWALGVCKRLGTPKKSDDSNNGKNIEKNNGVHERIDDVFERGVCSYYKGPSITANGDVFDENEMTAAHRTLPFNTMVKVEGMGTSVVVKINDRKTAADGKVMLLSRAAAESLNIDENTGPVQCQLKFVLDGSGCTPDYGDTCVLHHECCSQNCFREMFSDKGFCLPK (SEQ ID NO: 212)

В некоторых случаях BRP изменяет рост и/или активность одной или нескольких бактерий, обитающих в бактериоците хозяина. В некоторых случаях BRP можно создавать с помощью биоинженерии для модулирования его биологической активности (например, повышения, снижения или регулирования) или для определения его микроорганизма-мишени. В некоторых случаях BRP продуцируется трансляционным аппаратом (например, рибосомой и т. д.) клетки. В некоторых случаях BRP синтезируют химическим путем. В некоторых случаях BRP образуется из полипептидного предшественника. Полипептидный предшественник может подвергаться расщеплению (например, процессингу под действием протеазы) с образованием самого полипептида BRP. Таким образом, в некоторых случаях BRP продуцируется из полипептида-предшественника. В некоторых случаях BRP включает в себя полипептид, который подвергся посттрансляционным модификациям, например, расщеплению или добавлению одной или нескольких функциональных групп.

Функционально активные варианты BRP, описанные в данном документе, также пригодны в композициях и способах, описанных в данном документе. В некоторых случаях вариант BRP является на по меньшей мере 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичным, например, в определенной области или во всей последовательности, последовательности BRP, описанного в данном документе, или BRP природного происхождения.

BRP, описанный в данном документе, может быть составлен в виде композиции для любого из путей применения, описанных в данном документе. Композиции, раскрытые в данном документе, могут содержать любые количество или тип (например, классы) BRP, как, например, по меньшей мере приблизительно любое количество из 1 BRP, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 или больше BRP. Подходящая концентрация каждого BRP в композиции зависит от таких факторов, как эффективность, стабильность BRP, количество различных BRP, состав и способы применения композиции. В некоторых случаях концентрация каждого BRP в жидкой композиции составляет от приблизительно 0,1 нг/мл до приблизительно 100 мг/мл. В некоторых случаях концентрация каждого BRP в твердой композиции составляет от приблизительно 0,1 нг/г до приблизительно 100 мг/г. В некоторых случаях, если композиция содержит по меньшей мере два типа BRP, то концентрация каждого типа BRP может быть одной и той же или разной.

Модулирующее средство, включающее в себя BRP, описанный в данном документе, может быть приведено в контакт с хозяином-мишенью в количестве и в течение времени, достаточных для: (a) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации BRP внутри хозяина-мишени; (b) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации BRP внутри кишки хозяина-мишени; (c) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации BRP внутри бактериоцита хозяина-мишени; (d) модулирования уровня или активности одного или нескольких микроорганизмов (например, эндосимбионтов) в организме хозяина-мишени или/и (e) модулирования приспособленности хозяина-мишени.

iii. Малые молекулы

Многочисленные малые молекулы (например, антибиотик или метаболит) могут быть пригодными в композициях и способах, описанных в данном документе. В некоторых случаях эффективная концентрация любой малой молекулы, описанной в данном документе, может изменять уровень, активность или метаболизм одного или нескольких микроорганизмов (описанных выше), обитающих в организме хозяина, при этом изменение приводит к снижению приспособленности хозяина.

Модулирующее средство, включающее в себя малую молекулу, описанную в данном документе, может быть приведено в контакт с хозяином-мишенью в количестве и в течение времени, достаточных для: (a) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации малой молекулы внутри хозяина-мишени; (b) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации малой молекулы внутри кишки хозяина-мишени; (c) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации малой молекулы внутри бактериоцита хозяина-мишени; (d) модулирования уровня или активности одного или нескольких микроорганизмов (например, эндосимбионтов) в организме хозяина-мишени или/и (e) модулирования приспособленности хозяина-мишени.

Малые молекулы, обсуждаемые далее в данном документе, а именно антибиотики и вторичные метаболиты, можно применять для изменения уровня, активности или метаболизма микроорганизмов-мишеней, как указано в разделах касательно снижения приспособленности насекомого-хозяина (например, переносчика патогена животного), такого как комар, микроскопический клещ, вошь или иксодовый клещ.

(a) Антибиотики

Модулирующее средство, описанное в данном документе, может включать в себя антибиотик. Можно применять любой антибиотик, известный в данной области техники. Антибиотики обычно классифицируются на основании их механизма действия, химической структуры или спектра активности.

Антибиотик, описанный в данном документе, может целенаправленно воздействовать на любую функцию или процессы роста бактерий и может быть как бактериостатическим (например, замедлять или предупреждать рост бактерий), так и бактерицидным (например, уничтожать бактерии). В некоторых случаях антибиотик представляет собой бактерицидный антибиотик. В некоторых случаях бактерицидный антибиотик представляет собой антибиотик, который целенаправленно воздействует на клеточную стенку бактерий (например, пенициллины и цефалоспорины); антибиотик, который целенаправленно воздействует на клеточную мембрану (например, полимиксины); или антибиотик, который ингибирует важнейшие ферменты бактерий (например, рифамицины, липиармицины, хинолоны и сульфонамиды). В некоторых случаях бактерицидный антибиотик представляет собой аминогликозид. В некоторых случаях антибиотик представляет собой бактериостатический антибиотик. В некоторых случаях бактериостатический антибиотик целенаправленно воздействует на синтез белка (например, макролиды, линкозамиды и тетрациклины). Дополнительные классы антибиотиков, которые можно применять в данном документе, включают в себя циклические липопептиды (такие как даптомицин), глицилциклины (такие как тигециклин), оксазолидиноны (такие как линезолид) или липиармицины (такие как фидаксомицин). Примеры антибиотиков включают в себя окситетрациклин, доксициклин, рифампицин, ципрофлоксацин, ампициллин и полимиксин B. Другие неограничивающие примеры антибиотиков находятся в таблице 9.

Таблица 9. Примеры антибиотиков

Антибиотики Действие
Пенициллины, цефалоспорины, ванкомицин Синтез клеточной стенки
Полимиксин, грамицидин Мембраноактивное средство, разрушает клеточную мембрану
Тетрациклины, макролиды, хлорамфеникол, клиндамицин, спектиномицин Ингибируют синтез белка
Сульфонамиды Ингибируют фолат-зависимые пути
Ципрофлоксацин Ингибируют ДНК-гиразу
Изониазид, рифампицин, пиразинамид, этамбутол, (миамбутол), стрептомицин Антимикобактериальные средства

Антибиотик, описанный в данном документе, может характеризоваться любым уровнем специфичности к мишеням (например, узким или широким спектром действия). В некоторых случаях антибиотик представляет собой антибиотик узкого спектра действия и, таким образом, целенаправленно воздействует на конкретные типы бактерий, такие как грамотрицательные или грамположительные бактерии. В качестве альтернативы, антибиотик может представлять собой антибиотик широкого спектра действия, который целенаправленно воздействует на широкий круг бактерий.

Антибиотики, описанные в данном документе, могут быть составлены в виде композиции для любого из путей применения, описанных в данном документе. Композиции, раскрытые в данном документе, могут содержать любые количество или тип (например, классы) антибиотиков, как, например, по меньшей мере приблизительно любое количество из 1 антибиотика, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 или больше антибиотиков (например, комбинацию рифампицина и доксициклина или комбинацию ампициллина и рифампицина). Подходящая концентрация каждого антибиотика в композиции зависит от таких факторов, как эффективность, стабильность антибиотика, количество различных антибиотиков, состав и способы применения композиции. В некоторых случаях, если композиция содержит по меньшей мере два типа антибиотиков, то концентрация каждого типа антибиотика может быть одной и той же или разной.

Модулирующее средство, включающее в себя антибиотик, описанный в данном документе, может быть приведено в контакт с хозяином-мишенью в количестве и в течение времени, достаточных для: (a) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации антибиотика внутри хозяина-мишени; (b) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации антибиотика внутри кишки хозяина-мишени; (c) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации антибиотика внутри бактериоцита хозяина-мишени; (d) модулирования уровня или активности одного или нескольких микроорганизмов (например, эндосимбионтов) в организме хозяина-мишени или/и (e) модулирования приспособленности хозяина-мишени.

Как проиллюстрировано в примерах 1-4, 14, 26 и 27, антибиотики (например, доксициклин, окситетрациклин, азитромицин, ципрофлоксацин или рифампицин) можно применять в качестве модулирующих средств, которые целенаправленно воздействуют на эндосимбиотическую бактерию, такую как Wolbachia spp., в организме насекомого-хозяина (например, насекомого-переносчика патогена животного, такого как комар, или микроскопический клещ, или иксодовый клещ, или пухоед), для снижения приспособленности хозяина (например, как изложено в данном документе). Как проиллюстрировано в примере 3, антибиотики, такие как окситетрациклин, можно применять в качестве модулирующих средств, которые целенаправленно воздействуют на эндосимбиотическую бактерию, такую как Rickettsia spp., в организме насекомого-хозяина, такого как микроскопические клещи, для снижения приспособленности хозяина (например, как изложено в данном документе).

(b) Вторичные метаболиты

В некоторых случаях модулирующее средство в композициях и способах, описанных в данном документе, включает в себя вторичный метаболит. Вторичные метаболиты образуются из органических молекул, продуцируемых организмом. Вторичные метаболиты могут выступать (i) в качестве конкурентных средств, применяемых в отношении бактерий, грибов, амеб, растений, насекомых и крупных животных; (ii) в качестве средств, транспортирующих металлы; (iii) в качестве средств симбиоза между микробами и растениями, насекомыми и более крупными животными; (iv) в качестве половых гормонов и (v) в качестве эффекторов дифференцировки. Неограничивающие примеры вторичных метаболитов находятся в таблице 10.

Таблица 10. Примеры вторичных метаболитов

Фенилпропаноиды Алкалоиды Терпеноиды Хиноны Стероиды Поликетиды
Антоцианы Акридины Каротины Антрохиноны Сердечные Эритромицин
Кумарины Беталаины Монотерпены Бензохиноны гликозиды Ловастатин и другие статины
Флавоноиды Хинолизидины Сесквитерпены Нафтохиноны Производные Дискодермолид
Производные Фуронохиноны Дитерпены прегненолона Афлатоксин B1
гидроксициннамоила Харрингтонины Тритерпены Авермектины
Изофлавоноиды Изохинолины Нистатин
Лигнаны Индолы Рифамицин
Феноленоны Пурины
Проантоцианидины Пиридины
Стильбены Тропановые
Таннины алкалоиды

Вторичный метаболит, применяемый в данном документе, может включать в себя метаболит из любой известной группы вторичных метаболитов. Например, вторичные метаболиты можно классифицировать на следующие группы: алкалоиды, терпеноиды, флавоноиды, гликозиды, природные фенолы (например, госсиполуксусная кислота), енали (например, транс-коричный альдегид), феназины, бифенолы и дибензофураны, поликетиды, пептиды синтазы жирных кислот, нерибосомальные пептиды, пептиды, синтезируемые в рибосомах и подвергающиеся посттрансляционным модификациям, полифенолы, полисахариды (например, хитозан) и биополимеры. Углубленный обзор вторичных метаболитов см., например, в Vining, Annu. Rev. Microbiol. 44:395-427, 1990.

Вторичные метаболиты, пригодные для композиций и способов, описанных в данном документе, включают в себя метаболиты, которые изменяют природную функцию эндосимбионта (например, первичного или вторичного эндосимбионта), бактериоцита или внеклеточного симбионта. В некоторых случаях один или несколько вторичных метаболитов, описанных в данном документе, выделяют в результате высокопроизводительного скрининга (HTS) противомикробных соединений. Например, скрининг HTS выявил 49 антибактериальных экстрактов, которые характеризуются специфичностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, из свыше 39000 неочищенных экстрактов из организмов, растущих в различных экосистемах одного конкретного региона. В некоторых случаях вторичный метаболит транспортируется внутрь бактериоцита.

В некоторых случаях малая молекула представляет собой ингибитор синтеза витаминов. В некоторых случаях ингибитор синтеза витаминов представляет собой аналог предшественника витамина. В определенных случаях аналог предшественника витамина представляет собой пантотенол.

В некоторых случаях малая молекула представляет собой аналог аминокислоты. В определенных случаях аналог аминокислоты представляет собой L-канаванин, D-аргинин, D-валин, D-метионин, D-фенилаланин, D-гистидин, D-триптофан, D-треонин, D-лейцин, L-NG-нитроаргинин или их комбинацию.

В некоторых случаях малая молекула представляет собой природное противомикробное соединение, такое как пропионовая кислота, левулиновая кислота, транс-коричный альдегид, низин или низкомолекулярный хитозан. Вторичный метаболит, описанный в данном документе, может быть составлен в виде композиции для любого из путей применения, описанных в данном документе. Композиции, раскрытые в данном документе, могут содержать любые количество или тип (например, классы) вторичных метаболитов, как, например, по меньшей мере приблизительно любое количество из 1 вторичного метаболита, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 или больше вторичных метаболитов. Подходящая концентрация каждого вторичного метаболита в композиции зависит от таких факторов, как эффективность, стабильность вторичного метаболита, количество различных вторичных метаболитов, состав и способы применения композиции. В некоторых случаях, если композиция содержит по меньшей мере два типа вторичных метаболитов, то концентрация каждого типа вторичного метаболита может быть одной и той же или разной.

Модулирующее средство, включающее в себя вторичный метаболит, описанный в данном документе, может быть приведено в контакт с хозяином-мишенью в количестве и в течение времени, достаточных для: (a) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации вторичного метаболита внутри хозяина-мишени; (b) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации вторичного метаболита внутри кишки хозяина-мишени; (c) достижения целевого уровня (например, предварительно определенного или порогового уровня) концентрации вторичного метаболита внутри бактериоцита хозяина-мишени; (d) модулирования уровня или активности одного или нескольких микроорганизмов (например, эндосимбионтов) в организме хозяина-мишени или/и (e) модулирования приспособленности хозяина-мишени.

Как проиллюстрировано в примере 15, вторичные метаболиты (например, госсипол) можно применять в качестве модулирующих средств, которые целенаправленно воздействуют на эндосимбиотическую бактерию в организме насекомого-хозяина, для снижения приспособленности хозяина (например, как изложено в данном документе). Как дополнительно проиллюстрировано в примерах 11-13, 15-19, 23 и 24, малые молекулы, такие как транс-коричный альдегид, левулиновая кислота, хитозан, аналоги витаминов или ингибиторы транспорта аминокислот, можно применять в качестве модулирующих средств, которые целенаправленно воздействуют на эндосимбиотическую бактерию в организме насекомого-хозяина, для снижения приспособленности хозяина (например, как изложено в данном документе).

iv. Бактерии в качестве модулирующих средств

В некоторых случаях модулирующее средство, описанное в данном документе, включает в себя одну или несколько бактерий. Многочисленные бактерии являются пригодными в композициях и способах, описанных в данном документе. В некоторых случаях средство представляет собой вид бактерий, обнаруживаемый эндогенно в организме хозяина. В некоторых случаях бактериальное модулирующее средство представляет собой вид эндосимбиотических бактерий. Неограничивающие примеры бактерий, которые можно применять в качестве модулирующих средств, включают в себя все виды бактерий, описанные в данном документе в разделе II подробного описания, и виды бактерий, приведенные в таблице 1. Например, модулирующее средство может представлять собой вид бактерий из любого типа бактерий, присутствующего в кишках насекомых, в том числе Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes (например, Lactobacillus и Bacillus spp.), Clostridia, Actinomycetes, Spirochetes, Verrucomicrobia и Actinobacteria.

В некоторых случаях модулирующее средство представляет собой бактерию, которая нарушает разнообразие микроорганизмов или иным образом изменяет микробиоту хозяина таким образом, что это является пагубным для хозяина. В одном случае бактерии могут быть предусмотрены для нарушения микробиоты комаров. Например, бактериальное модулирующее средство может конкурировать с популяцией симбиотических бактерий в организме комара, вытеснять и/или уменьшать ее.

В другом случае бактерии могут быть предусмотрены для нарушения микробиоты микроскопических клещей. Например, бактериальное модулирующее средство может конкурировать с популяцией симбиотических бактерий в организме микроскопического клеща, вытеснять и/или уменьшать ее.

В другом случае бактерии могут быть предусмотрены для нарушения микробиоты пухоедов. Например, бактериальное модулирующее средство может конкурировать с популяцией симбиотических бактерий в организме пухоеда, вытеснять и/или уменьшать ее.

В другом случае бактерии могут быть предусмотрены для нарушения микробиоты иксодовых клещей. Например, бактериальное модулирующее средство может конкурировать с популяцией симбиотических бактерий в организме иксодового клеща, вытеснять и/или уменьшать ее.

Бактериальные модулирующие средства, обсуждаемые в данном документе, можно применять для изменения уровня, активности или метаболизма микроорганизмов-мишеней, как указано в разделах касательно снижения приспособленности насекомого-хозяина (например, переносчика патогена животного), такого как комар, микроскопический клещ, пухоед или иксодовый клещ.

v. Модификации в отношении модулирующих средств

(a) Продукты слияния

Любое из модулирующих средств, описанных в данном документе, может быть слито или связано с дополнительным фрагментом. В некоторых случаях модулирующее средство включает в себя продукт слияния одного или нескольких дополнительных фрагментов (например, 1 дополнительного фрагмента, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше дополнительных фрагментов). В некоторых случаях дополнительный фрагмент представляет собой любое из модулирующих средств, описанных в данном документе (например, пептид, полипептид, малую молекулу или антибиотик). В качестве альтернативы, дополнительный фрагмент может сам по себе не выступать в качестве модулирующего средства, однако вместо этого может выполнять вторичную функцию. Например, дополнительный фрагмент может облегчать доступ, связывание или активирование модулирующего средства в участке-мишени в организме хозяина (например, в кишке хозяина или бактериоците хозяина) или в микроорганизме-мишени, обитающем в организме хозяина (например, переносчика патогена животного, например, комара, микроскопического клеща, пухоеда или иксодового клеща).

В некоторых случаях дополнительный фрагмент может облегчать проникновение модулирующего средства в клетку хозяина-мишени или микроорганизм-мишень, обитающий в организме хозяина. Например, дополнительный фрагмент может включать в себя пептид, проникающий в клетку. Пептиды, проникающие в клетку (CPP), могут представлять собой природные последовательности, полученные из белков; химерные пептиды, которые образуются в результате слияния двух природных последовательностей; или синтетические CPP, которые представляют собой последовательности, сконструированные синтетическим путем на основе исследований взаимосвязи структуры и активности. В некоторых случаях CPP характеризуются способностью повсеместно проникать через клеточные мембраны (например, клеточные мембраны прокариот и эукариот) с ограниченной токсичностью. Кроме того, CPP могут характеризоваться способностью проникать через клеточные мембраны посредством энергозависимых и/или энергонезависимых механизмов без необходимости хирального распознавания специфическими рецепторами. CPP могут связываться с любыми из модулирующих средств, описанных в данном документе. Например, CPP может связываться с противомикробным пептидом (AMP), например, пептидом скорпиона, например, UY192, слитым с пептидом, проникающим в клетку (например, YGRKKRRQRRRFLSTIWNGIKGLL; SEQ ID NO: 232). Неограничивающие примеры CPP приведены в таблице 11.

Таблица 11. Примеры пептидов, проникающих в клетку (CPP)

Пептид Происхождение Последовательность
Полученные из белков
Пенетратин Antennapedia RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 213)
Пептид Tat Tat GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 214)
pVEC Кадгерин LLIILRRRIRKQAHAHSK (SEQ ID NO: 215)
Химерные
Транспортан Галанин/Мастопаран GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 216)
MPG HIV-gp41/T-антиген SV40 GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV (SEQ ID NO: 217)
Pep-1 Обратная транскриптаза HIV/T-антиген SV40 KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (SEQ ID NO: 218)
Синтетические
Полиаргинины На основе пептида Tat (R)n ; 6 < n < 12
MAP de novo KLALKLALKALKAALKLA (SEQ ID NO: 219)
R6W3 На основе пенетратина RRWWRRWRR (SEQ ID NO: 220)

В других случаях дополнительный фрагмент облегчает связывание модулирующего средства с микроорганизмом-мишенью (например, грибом или бактерий), обитающим в организме хозяина. Дополнительный фрагмент может включать в себя один или несколько нацеливающих доменов. В некоторых случаях нацеливающий домен может нацеливать модулирующее средство на один или несколько микроорганизмов (например, бактерию или гриб), обитающих в кишке хозяина. В некоторых случаях нацеливающий домен может нацеливать модулирующее средство на конкретную область в организме хозяина (например, кишку или бактериоцит хозяина) для доступа к микроорганизмам, которые обычно присутствуют в указанной области организма хозяина. Например, нацеливающий домен может нацеливать модулирующее средство на переднюю кишку, среднюю кишку или заднюю кишку хозяина. В других случаях нацеливающий домен может нацеливать модулирующее средство на бактериоцит в организме хозяина и/или одну или несколько бактерий, обитающих в бактериоците хозяина. Например, нацеливающий домен может представлять собой лектин или агглютинин Galanthus nivalis (GNA), связанный с модулирующим средством, описанным в данном документе, например, AMP, например, пептидом скорпиона, например, Uy192.

(b) Пре- или продомены

В некоторых случаях модулирующее средство может включать в себя аминокислотную пре- и пропоследовательность. Например, модулирующее средство может представлять собой неактивный белок или пептид, которые могут быть активированы посредством расщепления или посттрансляционной модификации пре- или пропоследовательности. В некоторых случаях модулирующее средство конструируют с инактивирующей пре- или пропоследовательностью. Например, пре- или пропоследовательность может закрывать сайт активации на модулирующем средстве, например, сайт связывания с рецептором, или может индуцировать конформационное изменение в модулирующем средстве. Таким образом, при отщеплении пре- или пропоследовательности модулирующее средство активируется.

В качестве альтернативы, модулирующее средство может включать в себя малую пре- или промолекулу, например, антибиотик. Модулирующее средство может представлять собой неактивную малую молекулу, описанную в данном документе, которая может быть активирована в среде-мишени внутри хозяина. Например, малая молекула может быть активирована при достижении определенного значения pH в кишке хозяина.

(c) Линкеры

В случаях, если модулирующее средство связано с дополнительным фрагментом, модулирующее средство может дополнительно содержать линкер. Например, линкер может представлять собой химическую связь, например, одну или несколько ковалентных связей или нековалентных связей. В некоторых случаях линкер может представлять собой пептидный линкер (например, длиной 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 25, 30, 35, 40 или больше аминокислот). Линкер может включать в себя любые гибкие, жесткие или расщепляемые линкеры, описанные в данном документе.

Гибкий пептидный линкер может включать в себя любой из линкеров, широко применяемых в данной области техники, в том числе линкеры, имеющие последовательности, содержащие главным образом остатки Gly и Ser (линкер "GS"). Гибкие линкеры могут быть пригодны для соединения доменов, которые требуют определенной степени подвижности или взаимодействия, и могут содержать небольшие, неполярные (например, Gly) или полярные (например, Ser или Thr) аминокислоты.

В качестве альтернативы, пептидный линкер может представлять собой жесткий линкер. Жесткие линкеры пригодны для сохранения фиксированного расстояния между фрагментами и поддержания их независимых функций. Жесткие линкеры также могут быть пригодны, если пространственное разделение доменов является важным для сохранения стабильности или биологической активности одного или нескольких компонентов в продукте слияния. Жесткие линкеры, например, могут иметь альфа-спиральную структуру или Pro-богатую последовательность, (XP)n, при этом X обозначает любую аминокислоту, предпочтительно Ala, Lys или Glu.

В еще нескольких случаях пептидный линкер может представлять собой расщепляемый линкер. В некоторых случаях линкеры могут расщепляться в специфических условиях, таких как присутствие восстанавливающих реагентов или протеаз. Расщепляемые in vivo линкеры могут использовать обратимую природу дисульфидной связи. Один пример включает в себя чувствительную к тромбину последовательность (например, PRS) между двумя остатками Cys. Обработка тромбином CPRSC in vitro приводит к расщеплению чувствительной к тромбину последовательности, тогда как обратимая дисульфидная связь остается интактной. Такие линкеры известны и описаны, например, в Chen et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 65(10):1357-1369, 2013. Расщепление линкеров в продуктах слияния также может осуществляться протеазами, которые экспрессируются в условиях in vivo в конкретных клетках или тканях хозяина или микроорганизмах, обитающих в организме хозяина. В некоторых случаях при достижении участка- или клетки-мишени в результате расщепления линкера может высвобождаться свободное функциональное модулирующее средство.

Продукты слияния, описанные в данном документе, в качестве альтернативы могут быть связаны со связывающей молекулой, в том числе гидрофобным линкером, таким как отрицательно заряженная сульфонатная группа; липидами, такими как поли(--CH2--)углеводородные цепи, такие как полиэтиленгликолевая (PEG) группа, их ненасыщенными вариантами, их гидроксилированными вариантами, амидированными или их в других отношениях N-содержащими вариантами, неуглеродными линкерами; углеводными линкерами; фосфодиэфирными линкерами, или другими молекулами, способными ковалентно связывать две или более молекул, например, модулирующих средств. Можно применять нековалентные линкеры, такие как гидрофобные липидные глобулы, с которыми связывается модулирующее средство, например, посредством гидрофобной области модулирующего средства или гидрофобного удлинения модулирующего средства, такого как ряд остатков, богатый лейцином, изолейцином, валином или, возможно, также аланином, фенилаланином или даже тирозином, метионином, глицином или другим гидрофобным остатком. Модулирующее средство может быть связано с помощью химического взаимодействия зарядов таким образом, что положительно заряженный фрагмент модулирующего средства связывается с отрицательно заряженным другим модулирующим средством или дополнительным фрагментом.

IV. Составы и композиции

Композиции, описанные в данном документе, могут быть составлены в чистой форме (например, композиция содержит модулирующее средство) либо совместно с одним или несколькими дополнительными средствами (такими как наполнитель, средство доставки, носитель, разбавитель, стабилизатор и т. д.) для облегчения применения или доставки композиций. Примеры подходящих наполнителей и разбавителей включают в себя без ограничения лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, крахмалы, аравийскую камедь, фосфат кальция, альгинаты, трагакант, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, воду, солевой раствор, сироп, метилцеллюлозу, метит- и пропилгидроксибензоаты, тальк, стеарат магния и минеральное масло.

В некоторых случаях композиция содержит средство доставки или носитель. В некоторых случаях средство доставки включает в себя наполнитель. Иллюстративные наполнители включают в себя без ограничения твердые или жидкие материалы-носители, растворители, стабилизаторы, наполнители для составов с замедленным высвобождением, красители и поверхностно-активные вещества (поверхностно-активные средства). В некоторых случаях средство доставки представляет собой стабилизирующее средство доставки. В некоторых случаях стабилизирующее средство доставки включает в себя стабилизирующий наполнитель. Иллюстративные стабилизирующие наполнители включают в себя без ограничения эпоксидированные растительные масла, противовспенивающие средства, например, силиконовое масло, консерванты, регуляторы вязкости, связующие средства и средства, придающие липкость. В некоторых случаях стабилизирующее средство доставки представляет собой буфер, подходящий для модулирующего средства. В некоторых случаях композиция является микроинкапсулированной в средство доставки на основе полимерных гранул. В некоторых случаях стабилизирующее средство доставки защищает модулирующее средство от УФ и/или кислых условий. В некоторых случаях средство доставки содержит pH-буфер. В некоторых случаях композиция составлена таким образом, что она имеет pH в диапазоне от приблизительно 4,5 до приблизительно 9,0, включая, например, любой из диапазонов pH от приблизительно 5,0 до приблизительно 8,0, от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,5 или от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,0.

В зависимости от предполагаемых целей и преобладающих обстоятельств композиция может быть составлена в виде концентратов эмульсий, концентратов суспензий, непосредственно распыляемых или разбавляемых растворов, паст, наносимых в виде покрытия, разбавленных эмульсий, распыляемых порошков, растворимых порошков, диспергируемых порошков, смачиваемых порошков, пылевидных препаратов, гранул, форм, инкапсулированных в полимерные вещества, микрокапсул, пен, аэрозолей, препаратов на основе диоксида углерода, таблеток, препаратов на основе смол, препаратов на основе бумаги, препаратов на основе нетканого полотна или препаратов на основе трикотажного или тканого полотна. В некоторых случаях композиция представляет собой жидкость. В некоторых случаях композиция представляет собой твердое вещество. В некоторых случаях композиция представляет собой аэрозоль, как, например, в находящемся под давлением аэрозольном баллончике. В некоторых случаях композиция присутствует в отходах (таких как экскременты) вредителя. В некоторых случаях композиция присутствует внутри или на поверхности тела живого вредителя.

В некоторых случаях средство доставки представляет собой пищу или воду для хозяина. В других случаях средство доставки представляет собой источник пищи для хозяина. В некоторых случаях средство доставки представляет собой пищевую приманку для хозяина. В некоторых случаях композиция представляет собой съедобное средство, поглощаемое хозяином. В некоторых случаях композиция доставляется хозяином второму хозяину и поглощается вторым хозяином. В некоторых случаях композиция поглощается хозяином или вторым хозяином, и композиция высвобождается в окружение хозяина или второго хозяина с отходами (такими как экскременты) хозяина или второго хозяина. В некоторых случаях модулирующее средство включено в пищевую приманку, предназначенную для поглощения хозяином или переноса назад в его колонию.

В некоторых случаях средство доставки представляет собой бактериальный вектор. Модулирующее средство может быть включено в бактериальный вектор с помощью любых подходящих способов и реагентов для клонирования, известных в данной области техники, таких как описанные в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. "Бактериальный вектор", описанный в данном документе, относится к любому генетическому элементу, такому как плазмиды, векторы на основе бактериофагов, транспозоны, космиды и хромосомы, который способен к репликации внутри бактериальных клеток и который способен к переносу генов между клетками. Иллюстративные бактериальные векторы включают в себя без ограничения векторную систему на основе фага лямбда gtl 1, gt WES.tB, Charon 4 и плазмидные векторы, такие как pBR322, pBR325, pACYC177, pACYC184, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pLG339, pR290, pKC37, pKCIOI, SV 40, pBluescript II SK +/- или KS +/- (см. каталог "Stratagene Cloning Systems", Stratagene, La Jolla, California, 1993), серии pQE, pIH821, pGEX, pET (см. Studier et al., "Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes", Gene Expression Technology Vol. 185, 1990), а также любые их производные.

Каждый бактериальный вектор может кодировать одно или несколько модулирующих средств. В некоторых случаях бактериальный вектор содержит геном фага, который должен экспрессироваться и упаковываться в симбиотической бактерии-мишени. В некоторых случаях бактериальный вектор содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую лизин, который должен экспрессироваться в симбиотической бактерии-мишени или бактерии-хозяине. В некоторых случаях лизин экспрессируется совместно с холином, или лизин конструируют таким образом, чтобы он имел сигнальный пептид для секреции из бактерии-хозяина. В некоторых случаях бактериальный вектор содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую бактериоцин, который должен экспрессироваться в симбиотической бактерии-мишени. В некоторых случаях бактериальный вектор дополнительно содержит один или несколько регуляторных элементов, таких как промоторы, сигналы терминации и транскрипционные и трансляционные элементы. В некоторых случаях регуляторная последовательность функционально связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей ген (такой как бактериоцин, лизин или другие полипептиды), который должен экспрессироваться в симбиотической бактерии-мишени.

В некоторых случаях бактериальный вектор вводят в бактерию, которая должна быть поглощена хозяином или членом колонии хозяина. В некоторых случаях бактерия представляет собой симбиотическую бактерию-мишень. В некоторых случаях бактерия представляет собой встречающуюся в природе бактерию из кишки хозяина или ее генетически модифицированное производное, которое может быть легко введено хозяину посредством заглатывания. Иллюстративные бактерии для применения при переносе бактериального вектора включают в себя без ограничения Proteobacter, в том числе род Pseudomonas; Actinobacter, в том числе Priopionibacterium и Corynebacterium; Firmicutes, в том числе любой вид из родов Mycoplasma, Bacillus, Streptococcus, Staphylococcus; Fibrobacteres; Spirochaetes, в том числе Treponema и Borrelia; Bacteroides, в том числе роды Bacteroides и Flavobacterium. Также подходящими являются любые бактерии из Enterobacteriaceae, в том числе рода Serratia, в том числе без ограничения S. marcescens, S. entomophila, S. proteamaculans, S. marcensces; любые виды Enterobacter, в том числе без ограничения E. cloacae, E. amnigenus, E. aerogenes, E. dissolvens, E. agglomerans, E. hafiiiae; и любые виды, принадлежащие к следующим родам: Citrobacter, Escherichia, Klebsiella, Kluyvera, Panotea, Proteus, Salmonella, Xenorhabdus и Yokenella.

В некоторых случаях модулирующее средство может составлять от приблизительно 0,1% до приблизительно 100% композиции, как, например, любое количество из от приблизительно 0,01% до приблизительно 100%, от приблизительно 1% до приблизительно 99,9%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 10%, от приблизительно 1% до приблизительно 25%, от приблизительно 10% до приблизительно 50%, от приблизительно 50% до приблизительно 99% или от приблизительно 0,1% до приблизительно 90% активных ингредиентов (таких как фаг, лизин или бактериоцин). В некоторых случаях композиция содержит по меньшей мере любое количество из 0,1%, 0,5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или больше активных ингредиентов (таких как фаг, лизин и бактериоцин). В некоторых случаях концентрированные средства являются предпочтительными в качестве коммерческих продуктов, а конечный потребитель, как правило, использует разведенные средства, которые имеют значительно более низкую концентрацию активного ингредиента.

Любой из составов, описанных в данном документе, можно применять в форме приманки, спирали, электрического коврика, дымящегося препарата, фумиганта или листа.

i. Жидкие составы

Композиции, предусмотренные в данном документе, могут находиться в форме жидкого состава. Жидкие составы, как правило, смешивают с водой, однако в некоторых случаях их можно применять с растительным маслом, дизельным топливом, керосином или другим легким маслом в качестве носителя. Количество активного ингредиента часто находится в диапазоне от приблизительно 0,5 до приблизительно 80 процентов по весу.

Состав в виде концентрата эмульсии может содержать жидкий активный ингредиент, один или несколько растворителей на нефтяной основе и средство, которое способствует смешиванию состава с водой с образованием эмульсии. Такие концентраты можно применять в составах для сельского хозяйства, декоративных и газонных растений, лесного хозяйства, обработки зданий, обработки пищевых продуктов, сельскохозяйственных животных и вредителей, значимых для общественного здравоохранения. Их можно адаптировать для эксплуатационного оборудования от небольших переносных опрыскивателей до гидравлических опрыскивателей, малообъемных наземных опрыскивателей, вентиляторных туманообразователей и малообъемных авиационных опрыскивателей. Некоторые активные ингредиенты легко растворяются в жидком носителе. При смешивании с носителем они образуют раствор, в котором не происходит осаждение и разделение, например, гомогенный раствор. Составы этого типа могут содержать активный ингредиент, носитель и один или несколько других ингредиентов. Растворы можно применять в любом типе распылителя, в закрытом помещении и на свежем воздухе.

В некоторых случаях композиция может быть составлена в виде обратной эмульсии. Обратная эмульсия представляет собой водорастворимый активный ингредиент, диспергированный в масляном носителе. Обратные эмульсии требуют эмульгатора, который способствуют смешиванию активного ингредиента с большим объемом носителя на нефтяной основе, обычно топливного масла. Обратные эмульсии способствуют снижению сноса. В случае других составов некоторый снос при распылении происходит, когда капли воды начинают испаряться до достижения целевых поверхностей; в результате этого капли могут стать очень маленькими и легковесными. Поскольку масло испаряется более медленно, чем вода, капли обратной эмульсии сжимаются меньше, и большее количество активного ингредиента достигает цели. Масло дополнительно способствует снижению поверхностного стока и повышает устойчивость к дождю. Оно дополнительно выступает в качестве адгезивного средства путем улучшения степени покрытия поверхности и всасывания. Поскольку капли являются сравнительно большими и тяжелыми, то им сложно пройти насквозь покрытие нижней стороны листьев. Обратные эмульсии наиболее широко применяются в полосах отчуждения, где снос на восприимчивые нецелевые площади может быть проблемой.

Текучий или жидкий состав объединяет многие из характеристик концентратов эмульсий и смачиваемых порошков. Изготовители используют эти составы, если активный ингредиент представляет собой твердое вещество, которое не растворяется ни в воде, ни в масле. Активный ингредиент, пропитанный веществом, таким как глина, измельчают до очень мелкого порошка. Затем порошок суспендируют в небольшом количестве жидкости. Образующийся в результате жидкий продукт является достаточно плотным. Текучие и жидкие составы имеют многие из характеристик концентратов эмульсий, а также они имеют аналогичные недостатки. Они требуют умеренного взбалтывания для поддержания их в виде суспензии и оставляют видимые остатки, аналогичные таковым у смачиваемых порошков.

Текучие/жидкие составы являются легкими в обращении и применении. Поскольку они представляют собой жидкости, то они подлежат разбрызгиванию и расплескиванию. Они содержат твердые частицы, поэтому они способствуют абразивному износу насадок и насосов. Текучие и жидкие суспензии осаждаются в своих контейнерах. Поскольку текучие и жидкие составы склонны к осаждению, упаковка в контейнеры по пять галлонов или меньше облегчает повторное смешивание.

Аэрозольные составы содержат один или несколько активных ингредиентов и растворитель. Большинство аэрозолей имеют низкое процентное содержание активных ингредиентов. Существует два типа аэрозольных составов - готовый к применению тип, широко доступный в находящихся под давлением запечатанных контейнерах, и продукты, используемые в электрических или работающих на бензине аэрозольных генераторах, которые высвобождают состав в виде дыма или тумана.

Готовые к применению аэрозольные составы обычно представляют собой небольшие автономные блоки, которые высвобождают состав, когда клапан насадки приводится в движение. Состав пропускается через тонкое отверстие с помощью инертного газа под давлением с образованием мелкодисперсных капель. Эти продукты используются в теплицах, на небольших площадях внутри зданий или в ограниченных площадях на открытом воздухе. Коммерческие модели, которые удерживают до 5 фунтов активного ингредиента, обычно являются многоразовыми.

Дымообразующие или туманообразующие аэрозольные составы не находятся под давлением. Они используются в машинах, которые разбивают жидкий состав на мелкодисперсный туман или густой туман (аэрозоль) с помощью быстро вращающегося диска или нагреваемой поверхности.

ii. Сухие или твердые составы

Сухие составы могут быть разделены на два типа: готовые к применению и концентраты, которые должны быть смешаны с водой для применения в качестве спрея. Большинство пылевидных составов являются готовыми к применению и имеют низкое процентное содержание активных ингредиентов (меньше чем приблизительно 10 процентов по весу) наряду с очень тонкодисперсным сухим инертным носителем, изготовленным из талька, мела, глины, ореховой скорлупы или вулканического пепла. Размер отдельных пылевидных частиц варьируется. Некоторые пылевидные составы представляют собой концентраты и имеют высокое процентное содержание активных ингредиентов. Перед применением их смешивают с сухими инертными носителями. Порошки всегда используются сухими и могут легко сноситься на нецелевые участки.

iii. Гранулированные или пеллетированные составы

В некоторых случаях композиция составлена в виде гранул. Гранулированные составы аналогичны пылевидным составам, за исключением того, что гранулированные частицы являются более крупными и тяжелыми. Крупнодисперсные частицы могут быть получены из таких материалов, как глина, кукурузные початки или скорлупа грецких орехов. Активный ингредиент покрывает наружную поверхность гранул или всасывается в них. Количество активного ингредиента может быть относительно малым, обычно находясь в диапазоне от приблизительно 0,5 до приблизительно 15 процентов по весу. Гранулированные составы наиболее часто используются для применения в отношении почвы, насекомых, живущих в почве, или всасывания растениями через корни. Гранулированные составы иногда применяют с использованием самолета или вертолета с целью сведения к минимуму сноса или проникновения в густые заросли. После применения гранулы могут медленно высвобождать активный ингредиент. Некоторые гранулы требуют почвенной влаги для высвобождения активного ингредиента. Гранулированные составы также используются для контроля личинок комаров и других водных вредителей. Гранулы используются в операциях контроля вредителей в сельском хозяйстве, при обработке зданий, на декоративных и газонных растениях, в водной среде, в полосах отчуждения, а также в общественном здравоохранении (в отношении жалящих насекомых).

В некоторых случаях композиция составлена в виде пеллет. Большинство пеллетированных составов являются весьма сходными с гранулированными составами; эти термины используются взаимозаменяемо. Однако в пеллетированном составе все частицы имеют одну и ту же массу и форму. Однородность частиц облегчает применение с использованием точного эксплуатационного оборудования.

iv. Порошки

В некоторых случаях композиция составлена в виде порошка. В некоторых случаях композиция составлена в виде смачиваемого порошка. Смачиваемые порошки представляют собой сухие тонкоизмельченные составы, которые выглядят как пылевидные препараты. Обычно они должны смешиваться с водой для применения в качестве спрея. Однако, немного продуктов можно применять в качестве пылевидного препарата или в качестве смачиваемого порошка - выбор остается за потребителем. Смачиваемые порошки имеют от приблизительно 1 до приблизительно 95 процентов по весу активного ингредиента; в некоторых случаях более чем приблизительно 50 процентов. Частицы не растворяются в воде. Они быстро осаждаются, если их постоянно не взбалтывать для поддержания в суспендированном состоянии. Их можно применять для решения большинства проблем, связанных с вредителями, и в большинстве типов распылительного оборудования, в которых возможно взбалтывание. Смачиваемые порошки обладают превосходной остаточной активностью. В связи с их физическими свойствами большинство состава остается на поверхности обработанных пористых материалов, таких как бетон, штукатурка и необработанная древесина. В таких случаях только вода проникает в материал.

В некоторых случаях композиция составлена в виде растворимого порошка. Растворимые порошковые составы выглядят как смачиваемые порошки. В то же время, при смешивании с водой растворимые порошки легко растворяются и образуют истинный раствор. После их тщательного смешивания дополнительное взбалтывание не требуется. Количество активного ингредиента в растворимых порошках находится в диапазоне от приблизительно 15 до приблизительно 95 процентов по весу; в некоторых случаях более чем приблизительно 50 процентов. Растворимые порошки имеют все преимущества смачиваемых порошков и ни одного из недостатков, за исключением опасности вдыхания во время смешивания.

В некоторых случаях композиция составлена в виде гранул, диспергируемых в воде. Гранулы, диспергируемые в воде, также известные как сухие текучие составы, подобны смачиваемым порошкам за исключением того, что являются пылевидными, и их составляют в виде небольших легко определяемых гранул. Гранулы, диспергируемые в воде, должны быть смешаны с водой перед применением. Оказавшись в воде, гранулы распадаются на мелкодисперсные частицы, аналогичные смачиваемым порошкам. Состав требует непрерывного взбалтывания для поддержания его в суспендированном состоянии в воде. Процентное содержание активного ингредиента является высоким, часто не менее 90 процентов по весу. Гранулы, диспергируемые в воде, имеют многие из тех же самых преимуществ и недостатков смачиваемых порошков, за исключением того, что они являются более легко определяемыми и смешиваемыми. В связи с низким содержанием пылевидных частиц они обуславливают меньшую опасность вдыхания для потребителя во время использования.

v. Приманка

В некоторых случаях композиция включает в себя приманку. Приманка может находиться в любой подходящей форме, такой как твердое вещество, паста, пеллетированная или порошкообразная форма. Приманка также может переноситься хозяином назад в популяцию указанного хозяина (например, колонию или улей). Приманка может затем выступать в качестве источника пищи для других членов колонии, тем самым предоставляя эффективное модулирующее средство большому числу хозяев и потенциально всей колонии хозяина.

Приманки могут быть предоставлены в подходящем "домике" или "ловушке". Такие домики и ловушки являются коммерчески доступными, и существующие ловушки могут быть адаптированы для включения композиций, описанных в данном документе. Домик или ловушка могут быть предусмотрены, например, в форме коробки, и могут быть предусмотрены в готовом виде или могут быть изготовлены, например, из складывающегося картона. Подходящие материалы для домика или ловушки включают в себя пластмассу и картон, в частности, гофрированный картон. Внутренние поверхности ловушек могут быть выстланы липким веществом с целью ограничения движения хозяина при попадании в ловушку. Домик или ловушка могут содержать подходящую бороздку внутри, которая может удерживать приманку на месте. Ловушка отличается от домика, поскольку хозяин не может легко покинуть ловушку после попадания, тогда как домик выступает в качестве "кормушки", которая обеспечивает хозяина предпочтительной средой, в которой они могут кормиться и чувствовать себя в безопасности от хищников.

vi. Аттрактанты

В некоторых случаях композиция содержит аттрактант (например, хемоаттрактант). Аттрактант может привлекать взрослого хозяина или неполовозрелого хозяина (например, личинку) к месту поблизости композиции. Аттрактанты включают в себя феромоны - химические вещества, которые секретируются животным, особенно насекомым, которые влияют на поведение или развитие других особей этого же вида. Другие аттрактанты включают в себя сахарные сиропы и сиропы на основе гидролизатов белков, дрожжевые грибы и гниющее мясо. Аттрактанты также можно объединять с активным ингредиентом и распылять на листья или другие предметы в обрабатываемой области.

Известны различные аттрактанты, которые влияют на поведение хозяина, например, поиск хозяином пищи, мест для откладывание яиц или спаривания или партнеров для спаривания. Аттрактанты, пригодные в способах и композициях, описанных в данном документе, включают в себя, например, эвгенол, фенэтилпропионат, этилдиметилизобутилциклопропанкарбоксилат, пропилбензодиоксанкарбоксилат, цис-7,8-эпокси-2-метилоктадекан, транс-8,транс-0-додекадиенол, цис-9-тетрадеценаль (и цис-11-гексадеценаль), транс-11-тетрадеценаль, цис-11-гексадеценаль, (Z)-11,12-гексадекадиеналь, цис-7-додеценилацетат, цис-8-додеценилацетат, цис-9-додеценилацетат, цис-9-тетрадеценилацетат, цис-11-тетрадеценилацетат, транс-11-тетрадеценилацетат (и цис-11), цис-9,транс-11-тетрадекадиенилацетат (и цис-9,транс-12), цис-9,транс-12-тетрадекадиенилацетат, цис-7,цис-11-гексадекадиенилацетат (и цис-7,транс-11), цис-3,цис-13-октадекадиенилацетат, транс-3,цис-13-октадекадиенилацетат, анетол и изоамилсалицилат.

Для привлечения насекомых также можно применять средства, отличные от хемоаттрактантов, в том числе осветительные устройства с различными длинами волн или цветами излучения.

vii. Нанокапсулы/микроинкапсулирование/липосомы

В некоторых случаях композиция предусмотрена в виде микроинкапсулированного состава. Микроинкапсулированные составы смешивают с водой и распыляют таким же образом, как и другие распыляемые составы. После распыления пластмассовые покрытия разрушаются и медленно высвобождают активный ингредиент.

viii. Носители

Любая из композиций, описанных в данном документе, может быть составлена с включением модулирующего средства, описанного в данном документе, и инертного носителя. Такой носитель может представлять собой твердый носитель, жидкий носитель, гелеобразный носитель и/или газообразный носитель. В определенных вариантах осуществления носитель может представлять собой покрытие для семян. Покрытие для семян представляет собой любой не встречающийся в природе состав, который прилипает, целиком или частично, к поверхности семени. Состав может дополнительно содержать вспомогательное вещество или поверхностно-активное вещество. Состав может также содержать одно или несколько модулирующих средств для расширения спектра действия.

Твердый носитель, используемый для состава, включает в себя мелкодисперсный порошок или гранулы глины (например, каолиновой глины, диатомовой земли, бентонитовой глины, глины Фубасами, кислой глины и т. д.), синтетический гидратированный диоксид кремния, тальк, керамические материалы, другие неорганические минералы (например, серицит, кварц, серу, активированный уголь, карбонат кальция, гидратированный диоксид кремния и т. д.), вещество, которое может быть сублимировано и находится в твердой форме при комнатной температуре (например, 2,4,6-триизопропил-1,3,5-триоксан, нафталин, п-дихлорбензол, камфору, адамантан и т. д.); шерсть; шелк; хлопок; пеньку; жом; синтетические смолы (например, полиэтиленовые смолы, такие как полиэтилен низкой плотности, немодифицированный полиэтилен низкой плотности и полиэтилен высокой плотности; сополимеры этилена и винилового сложного эфира, такие как сополимеры этилена и винилацетата; сополимеры этилена и сложного эфира метакриловой кислоты, такие как сополимеры этилена и метилметакрилата и сополимеры этилена и этилметакрилата; сополимеры сложного эфира этилена и акриловой кислоты, такие как сополимеры этилена и метилакрилата и сополимеры этилена и этилакрилата; сополимеры этилена и винилкарбоновой кислоты, такие как сополимеры этилена и акриловой кислоты; сополимеры этилена и тетрациклододецена; полипропиленовые смолы, такие как гомополимеры пропилена и сополимеры пропилена и этилена; поли-4-метилпентен-1, полибутен-1, полибутадиен, полистирол; смолы на основе сополимера акрилонитрила и стирола; стирольные эластомеры, такие как смолы на основе сополимера акрилонитрила, бутадиена и стирола, блок-сополимеры стирола и сопряженных диенов и гидриды юлок-сополимеров стирола и сопряженных диенов; фторкаучуки; акриловые смолы, такие как поли(метилметакрилат); полиамидные смолы, такие как нейлон 6 и нейлон 66; полиэфирные смолы, такие как полиэтилентерефталат, полиэтиленнафталат, полибутилентерефталат и полициклогексилендиметилентерефталат, поликарбонаты, полиацетали, полиакрилсульфоны, полиарилаты, полиэфиры гидроксибензойной кислоты, полиэфиримиды, полиэфиркарбонаты, полифениленэфирные смолы, поливинилхлорид, поливинилиденхлорид, полиуретан и пористые смолы, такие как пенополиуретан, пенополипропилен или пеноэтилен и т. д.), стекла, металлы, керамические материалы, волокнистые материалы, ткани, трикотажные полотна, листы, бумагу, пряжу, пену, пористые вещества и мультифиламенты.

Жидкий носитель может включать в себя, например, ароматические или алифатические углеводороды (например, ксилол, толуол, алкилнафталин, фенилксилилэтан, керосин, газойль, гексан, циклогексан и т. д.), галогензамещенные углеводороды (например, хлорбензол, дихлорметан, дихлорэтан, трихлорэтан и т. д.), спирты (например, метанол, этанол, изопропиловый спирт, бутанол, гексанол, бензиловый спирт, этиленгликоль и т. д.), эфиры (например, диэтиловый эфир, диметиловый эфир этиленгликоля, монометиловый эфир диэтиленгликоля, моноэтиловый эфир диэтиленгликоля, монометиловый эфир пропиленгликоля, тетрагидрофуран, диоксан и т. д.), сложные эфиры (например, этилацетат, бутилацетат и т. д.), кетоны (например, ацетон, метилэтилкетон, метилизобутилкетон, циклогексанон и т. д.), нитрилы (например, ацетонитрил, изобутиронитрил и т. д.), сульфоксиды (например, диметлисульфоксид и т. д.), амиды (например, N,N-диметилформамид, N,N-диметилацетамид, циклические имиды (например, N-метилпирролидон), алкилиденкарбонаты (например, пропиленкарбонат и т. д.), растительное масло (например, соевое масло, хлопковое масло и т. д.), растительные эфирные масла (например, апельсиновое масло, масло иссопа, лимонное масло и т. д.) или воду.

Газообразный носитель может включать в себя, например, газообразный бутан, газообразный политетрафторэтилен, сжиженный нефтяной газ (LPG), диметиловый эфир и газообразный диоксид углерода.

ix. Вспомогательные вещества

В некоторых случаях композиция, предусмотренная в данном документе, может содержать вспомогательное вещество. Вспомогательные вещества представляют собой химические вещества, которые не обладают активностью. Вспомогательные вещества предварительно смешивают в составе или добавляют к распылительному резервуару для улучшения смешивания или применения или для усиления функциональных характеристик. Они широко используются в продуктах, предназначенных для применения в отношении листьев. Вспомогательные вещества можно использовать для придания индивидуальных свойств составу в соответствии с конкретными нуждами и введения поправки на местные условия. Вспомогательные вещества могут быть предназначены для осуществления конкретных функций, в том числе смачивания, распределения, прилипания, снижения испарения, снижения улетучивания, буферизации, эмульгирования, диспергирования, снижения сноса при распылении и снижения пенообразования. Ни одно вспомогательное вещество не может осуществлять все эти функции само по себе, однако совместимые вспомогательные вещества часто можно объединять для осуществления нескольких функций одновременно.

Среди неограничивающих примеров вспомогательных веществ, включенных в состав, присутствуют связующие вещества, диспергирующие вещества и стабилизаторы, в частности, например, казеин, желатин, полисахариды (например, крахмал, аравийская камедь, производные целлюлозы, альгиновая кислота и т. д.), производные лигнина, бентонит, сахара, синтетические водорастворимые полимеры (например, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, полиакриловая кислота и т. д.), PAP (кислый изопропилфосфат), BHT (2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол), BHA (смесь 2-трет-бутил-4-метоксифенола и 3-трет-бутил-4-метоксифенола), растительные масла, минеральные масла, жирные кислоты и сложные эфиры жирных кислот.

x. Поверхностно-активные вещества

В некоторых случаях композиция, предусмотренная в данном документе, содержит поверхностно-активное вещество. Поверхностно-активные вещества, также называемые смачивающими средствами и распределителями, физически изменяют поверхностное натяжение капли спрея. Для того, чтобы состав надлежащим образом выполнял свою функцию, капля спрея должна быть способной смачивать листья и распределяться равномерно по листу. Поверхностно-активные вещества увеличивают площадь, покрываемую составом, тем самым усиливая воздействие химического вещества на вредителя. Поверхностно-активные вещества особенно важны при применении состава в отношении листьев, покрытых воском, или волосистых листьев. Без надлежащего смачивания и распределения капли спрея часто стекают или не могут покрыть поверхности листьев надлежащим образом. В то же время слишком большое количество поверхностно-активного вещества может вызвать избыточный поверхностный сток и снизить эффективность.

Поверхностно-активные вещества классифицируются на основе способа их ионизации или расщепления на электрически заряженные атомы или молекулы, называемые ионами. Поверхностно-активное вещество с отрицательным зарядом является анионным. Поверхностно-активное вещество с положительным зарядом является катионным, и поверхностно-активное вещество без электрического заряда является неионогенным. Активность состава в присутствии неионогенного поверхностно-активного вещества может значительно отличаться от активности в присутствии катионного или анионного поверхностно-активного вещества. Выбор неправильного поверхностно-активного вещества может снижать эффективность пестицидного продукта и наносить вред растению-мишени. Анионные поверхностно-активные вещества являются наиболее эффективными при использовании с контактными пестицидами (пестициды, которые контролируют вредителя путем непосредственного контакта, а не системного всасывания). Катионные поверхностно-активные вещества никогда не должны применяться в качестве самостоятельных поверхностно-активных веществ, поскольку они обычно являются фитотоксичными.

Неионогенные поверхностно-активные вещества, часто применяемые с системными пестицидами, облегчают проникновение пестицидных спреев через кутикулы растений. Неионогенные поверхностно-активные вещества совместимы с большинством пестицидов, и для большинства пестицидов, зарегистрированных EPA, которым необходимо поверхностно-активное вещество, рекомендуется неионогенный тип. Вспомогательные вещества включают в себя без ограничения клеящие вещества, сухие разбавители, вещества, обеспечивающие проникновение в растения, факторы совместимости, буферы или модификаторы pH, дополнительные компоненты для контроля сноса, противовспенивающие средства и загустители.

Среди неограничивающих примеров поверхностно-активных веществ, включенных в композиции, описанные в данном документе, присутствуют соли алкилсульфатных сложных эфиров, алкилсульфонаты, аклиларилсульфонаты, алкилариловые эфиры и их полиоксиэтиленированные продукты, простые эфиры полиэтиленгликоля, сложные эфиры многоатомных спиртов и производные сахарных спиртов.

xi. Комбинации

В составах и в применяемых формах, полученных из этих составов, модулирующее средство может находиться в смеси с другими активными соединениями, такими как пестицидные средства (например, инсектициды, стерилизаторы, акарициды, нематоциды, моллюскоциды или фунгициды; см., например, пестициды, приведенные в таблице 12), аттрактанты, вещества, регулирующие рост, или гербициды. Используемый в данном документе термин "пестицидное средство" относится к любому веществу или смеси веществ, предусмотренных для предупреждения воздействия, нарушения воздействия, отпугивания или ослабления воздействия любого вредителя. Пестицид может представлять собой химическое вещество или биологическое средство, применяемое против вредителей, в том числе насекомых, патогенов, сорняков и микробов, которые конкурируют с человеком за пищу, разрушают имущество, распространяют заболевания или представляют собой негативный раздражитель. Термин "пестицидное средство" может дополнительно охватывать другие биологически активные молекулы, такие как антибиотики, противовирусные пестициды, противогрибковые средства, антигельминтные средства, питательные вещества, пыльцу, сахарозу и/или средства, которые останавливают или замедляют движение насекомых.

В случаях, когда модулирующее средство применяют в отношении растений, смесь с другими известными соединениями, такими как гербициды, удобрения, регуляторы роста, антидоты, химические сигнальные вещества или другие средства для улучшения свойств растения, также является возможной.

V. Доставка

Хозяин, описанный в данном документе, может подвергаться воздействию любой из композиций, описанных в данном документе, любым подходящим образом, который обеспечивает доставку или введение композиции насекомому. Модулирующее средство может быть доставлено в отдельности или в комбинации с другими активными или неактивными веществами и может применяться, например, посредством распыления, микроинъекции, через растения, посредством полива, погружения, в форме концентрированных жидкостей, гелей, растворов, суспензий, спреев, порошков, пеллет, брикетов, плиток и т. п., составленных для доставки эффективной концентрации модулирующего средства. Количества и места для применения композиций, описанных в данном документе, как правило, определяются условиями обитания хозяина, стадией жизненного цикла, на которой на микроорганизмы хозяина можно целенаправленно воздействовать с помощью модулирующего средства, участком, в котором применение должно выполняться, а также физическими и функциональными характеристиками модулирующего средства. Модулирующие средства, описанные в данном документе, можно вводить насекомому путем перорального заглатывания, однако также можно вводить с помощью средств, которые обеспечивают проникновение через кутикулу или проникновение в дыхательную систему насекомого.

В некоторых случаях насекомое может быть просто "намочено" или "опрыскано" раствором, содержащим модулирующее средство. В качестве альтернативы, модулирующее средство может быть связано с пищевым компонентом (например, съедобным) для насекомого для облегчения доставки и/или в целях повышения поглощения модулирующего средства насекомым. Способы перорального введения включают в себя, например, непосредственное смешивание модулирующего средства с пищей для насекомого, распыления модулирующего средства в среде обитания насекомого или поле, а также подходы на основе конструирования, в которых вид, который применяется в качестве пищи, конструируется с целью экспрессии модулирующего средства, после чего скармливается насекомому, подлежащему отрицательному влиянию. В некоторых случаях, например, композиция на основе модулирующего средства может быть включена в состав рациона насекомого или покрывать его сверху. Например, композицию на основе модулирующего средства можно распылять на поле с сельскохозяйственными культурами, на которых насекомое обитает.

В некоторых случаях композицию распыляют непосредственно на растение, например, сельскохозяйственные культуры, например, путем распыления из рюкзака, распыления с воздуха, опрыскивания/опыления растительных культур и т. д. В случаях, когда модулирующее средство доставляют в растение, растение, получающее модулирующее средство, может находиться на любой стадии роста растения. Например, составленные модулирующие средства можно применять в виде покрытия для семян или средства для обработки корней на ранних стадиях роста растения или в виде средства для полной обработки растения на более поздних стадиях цикла урожая. В некоторых случаях модулирующее средство можно применять в отношении растения в качестве местного средства, так чтобы насекомое-хозяин заглатывало или иным образом приходило в контакт с растением при взаимодействии с растением.

Кроме того, модулирующее средство можно применять (например, в отношении почвы, в которой растение растет, или в отношении воды, которую используют для полива растения) в качестве системного средства, которое поглощается и распределяется по тканям (например, стеблям или листьям) растения-хозяина или животного-хозяина таким образом, что насекомое, питающееся на нем, будет получать эффективную дозу модулирующего средства. В некоторых случаях растения или организмы, используемые в качестве пищи, могут быть генетически трансформированы для экспрессии модулирующего средства, так чтобы хозяин, питающийся на растении или организме, используемом в качестве пищи, заглатывал модулирующее средство.

Замедленное или непрерывное высвобождение также может достигаться посредством покрытия модулирующего средства или композиции, содержащей модулирующее(модулирующие) средство(средства), растворимым или биоразрушаемым слоем покрытия, таким так желатин, при этом данное покрытие растворяется или разрушается в среде применения, что затем делает модулирующее средство доступным, или посредством диспергирования средства в растворимой или разрушаемой матрице. Такое непрерывное высвобождение и/или распределение означает, что устройства могут быть предпочтительно использованы для устойчивого поддержания эффективной концентрации одного или нескольких модулирующих средств, описанных в данном документе, в конкретной среде обитания хозяина.

Модулирующее средство также может быть включено в среду, в которой насекомое растет, живет, размножается, питается или осуществляет заражение. Например, модулирующее средство может быть включено в контейнер для пищи, кормушку, защитную обертку или улей. В некоторых путях применения модулирующее средство может быть связано с твердой подложкой для применения в порошкообразной форме или в "ловушке" или "кормушке". В качестве примера, в путях применения, в которых композиция подлежит применению в ловушке или в виде приманки для определенного насекомого-хозяина, композиции также могут быть связаны с твердой подложкой или инкапсулированы в материал с медленным высвобождением. Например, композиции, описанные в данном документе, можно вводить путем доставки композиции в по меньшей мере одну среду обитания, в которой переносчик (например, переносчик патогена животного, например, комар, микроскопический клещ, пухоед или иксодовый клещ) растет, живет, размножается, питается или осуществляет заражение.

VI. Скрининг

В данный документ включены способы скрининга модулирующих средств, которые являются эффективными для изменения микробиоты хозяина (например, насекомого) и тем самым снижают приспособленность хозяина. Скрининговые анализы, предусмотренные в данном документе, могут быть эффективными для идентификации одного или нескольких модулирующих средств (например, фага), которые целенаправленно воздействуют на симбиотические микроорганизмы, обитающие в организме хозяина, и тем самым снижают приспособленность хозяина. Например, идентифицированное модулирующее средство (например, фаг) может быть эффективным для снижения жизнеспособности микроорганизмов, которые расщепляют пестициды или аллелохимикаты (например, бактерий, например, бактерий, которая расщепляет пестицид, приведенный в таблице 12), с повышением тем самым восприимчивости хозяев к пестициду (например, восприимчивость к пестициду, приведенному в таблице 12) или аллелохимическому средству.

Например, библиотека фагов может быть подвергнута скринингу для идентификации фага, который целенаправленно воздействует на конкретный эндосимбиотический микроорганизм, обитающий в организме хозяина. В некоторых случаях библиотека фагов может быть предусмотрена в форме одного или нескольких образцов среды (например, почвы, прудовых донных отложений или сточной воды). В качестве альтернативы, библиотека фагов может быть создана из лабораторных изолятов. Библиотеку фагов можно совместно культивировать со штаммом бактерий-мишеней. После инкубирования со штаммом бактерий популяцию фага, который успешно инфицирует и лизирует бактерии-мишени, обогащают в культуральной среде. Культуру, обогащенную фагами, можно субкультивировать с дополнительными бактериями любое число раз для дальнейшего обогащения популяции фага, представляющего интерес. Фаг может быть выделен для применения в качестве модулирующего средства в любых из способов или композиций, описанных в данном документе, при этом фаг изменяет микробиоту хозяина таким образом, что снижается приспособленность хозяина.

Таблица 12. Пестициды
Аклонифен Фенхлоразол-этил Пендиметалин
Ацетамиприд Фенотиокарб Пенфлуфен
Аланикарб Фенитротион Пенфлуфен
Амидосульфурон Фенпропидин Пентахлорбензол
Аминоциклопирахлор Флуазолат Пентиопирад
Амиcулбром Флуфеноксурон Пентиопирад
Антрахинон Флуметралин Пиримифос-метил
Асулам, натриевая соль Флуксапироксад Праллетрин
Бенфуракарб Фуберидазол Профенофос
Бенсулид Глюфосинат аммония Проквиназид
Бета-HCH; бета-BCH Глифосат Протиофос
Биоресметрин Группа: Бура, боратные соли (см. Пираклофос
Бластицидин-S Группа: Парафиновые масла, минеральные Пиразахлор
Бура; тетраборат динатрия Галфенпрокс Пиразофос
Борная кислота Имипротрин Пиридабен
Гептаноат бромоксинила Имидаклоприд Пиридалил
Октаноат бромоксинила Ипконазол Пиридифентион
Карбосульфан Изопиразам Пирифенокс
Хлорантранилипрол Изопиразам Квинмерак
Хлордимеформ Ленацил Ротенон
Хлорфлуазурон Фосфид магния Седаксан
Хлорпрофам Метафлумизон Седаксан
Климбазол Метазахлор Силафлуофен
Клопиралид Метазахлор Синтофен
Гидроксид меди (II) Метобромурон Спинеторам
Цифлуфенамид Метоксурон Сульфоксафлор
Цигалотрин Метсульфурон-метил Темефос
Цигалотрин, гамма Милбемектин Тиаклоприд
Декагидрат Налед Тиаметоксам
Диафентиурон Напропамид Толфенпирад
Димефурон Никосульфурон Тралометрин
Димоксистробин Нитенпирам Соединения трибутилолова
Динотефуран Нитробензол Тридифан
Дикват-дихлорид o-фенилфенол Трифлумизол
Дитианон Масла Валидамицин
E-фосфамидон Оксадиаргил Фосфид цинка
EPTC Оксикарбоксин
Этабоксам Парафиновое масло
Этиримол Пенконазол

ПРИМЕРЫ

Далее представлен пример способов по настоящему изобретению. Следует понимать, что на практике могут осуществляться различные другие варианты осуществления c учетом общего описания, приведенного выше.

Пример 1. Обработка комара Aedes vexans раствором антибиотика

Данный пример демонстрирует способность уничтожать или снижать приспособленность комаров Aedes vexans в результате обработки доксициклином, антибиотиком широкого спектра действия, который ингибирует продуцирование белка. Влияние доксициклина на комаров опосредовано модулированием популяций бактерий, эндогенных по отношению к комару, которые являются восприимчивыми к доксициклину. Одним штаммом бактерий-мишеней является Wolbachia.

Успешный контроль и уничтожение вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV) в настоящее время представляет собой значительную важность для мирового промышленного свиноводства. Для снижения риска проникновения PRRSV свиноводы используют строгие меры для усиления биологической безопасности своих ферм; однако инфекция PRRSV в стадах свиней по-прежнему встречается часто. Одним из переносчиков PRRSV является комар Aedes vexans. Aedes vexans является космополитным и распространенным комаром-вредителем. Вдобавок к PRRSV, он также является известным переносчиком Dirofilaria immitis (сердечный червь собак); Myxomatosis (смертельное вирусное заболевание кроликов) и восточного лошадиного энцефалита (смертельное вирусное заболевание лошадей в США). Aedes vexans является наиболее распространенным комаром в Европе, часто составляющим более 80% популяции европейских комаров. Его распространенность зависит от доступности паводковых вод. Летом ловушки для комаров могут собирать до 8000 комаров на ловушку за ночь.

Схема терапии. Порции высасываемой крови, смешанной с растворами доксициклина, составляли при конечных концентрациях антибиотика 0 (отрицательный контроль), 1, 10 или 50 мкг/мл в 1 мл крови.

Схема эксперимента

Для подготовки к обработке комаров выращивали в лабораторных условиях и среде. Эксперименты проводили с самками комаров из Aedes vexans, изначально отобранными из полевых комаров, собранных на поле кампуса Святого Павла Миннесотского университета, выдерживаемых на человеческой крови и вскармливаемых как взрослых особей 5% фруктозой. Растворы доксициклина готовили путем растворения доксициклина (SIGMA-ALDRICH, D9891) в стерильной воде. Различные объемы раствора доксициклина добавляли к свежей крови до общего объема 1 мл в препарате порций высасываемой крови. Конечные концентрации доксициклина в крови составляли примерно 0 (контрольный раствор), 1, 10 или 50 мкг/мл.

В каждой повторности сопоставимым по возрасту 2-3-дневным комарам предлагали контроль или экспериментальную порцию крови из мембранного питающего устройства (пробирки Eppendorf на 2 мл), закрытого парафильмом, и их содержали при 37°C. Не напившихся кровью комаров исключали. Порции предоставляли каждые четыре дня в общей сложности в количестве трех порций высасываемой крови. Между порциями высасываемой крови комарам предоставляли ватные тампоны, смоченные дистиллированной водой, для откладки яиц. Ненакормленных комаров не удаляли после второй и более поздних порций высасываемой крови. Число смертельных случаев подсчитывали ежедневно, и трупы удаляли и хранили для анализа Wolbachia, как описано в данном документе. В каждой повторности использовали по меньшей мере 50 комаров на концентрацию доксициклина. После выдачи последней порции высасываемой крови комаров выдерживали в течение 12 часов перед вскрытием.

Анализ микробиоты с помощью количественной полимеразной цепной реакции

Перед вскрытием комаров погружали в 70% этанол на 5 минут, затем промывали 3 раза в стерильном фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) для уничтожения и удаления поверхностных бактерий, тем самым минимизируя контаминацию образцов бактериями кутикулы при вскрытии. Среднюю кишку каждого комара (контроль и обработка доксициклином) удаляли и сразу замораживали на сухом льду и хранили при 20°C до обработки. Среднюю кишку удаляли из анализа в случае, если она разрывалась и значительное количество содержимого кишки утрачивалось. Образцы гомогенизировали в смеси фенол/хлороформ в гомогенизаторе Precellys 24 (Bertin) с помощью стеклянных гранул шириной 0,5 мм (Bertin) в течение 30 секунд при 6800 об./мин., и дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) экстрагировали смесью фенол/хлороформ. 16S рибосомальную ДНК (рДНК) использовали для количественной оценки Wolbachia и представляли в виде отношения к уровню экспрессии 40S рибосомального белка S7, кодируемого геном домашнего хозяйства Aedes (ID гена в VectorBase AAEL009496). Последовательности праймеров для Wolbachia представляют собой: прямой праймер 5′-TCAGCCACACTGGAACTGAG-3′ (SEQ ID NO: 221) и обратный праймер 5′-TAACGCTAGCCCTCTCCGTA-3′ (SEQ ID NO: 222), а для S7: прямой 5'-AAGGTCGACACCTTCACGTC-3' (SEQ ID NO: 223) и обратный 5'-CCGTTTGGTGAGGGTCTTTA-3' (SEQ ID NO: 224). Количественную полимеразную цепную реакцию (qPCR) проводили на термоциклере для ПЦР в реальном времени 7500 Fast (Applied Biosystems) с использованием набора SYBR Premix Ex Taq (Takara) согласно инструкциям производителя. Комары, обработанные доксициклином, демонстрировали снижение экспрессии специфичных для Wolbachia генов.

Показатели выживаемости комаров, обработанных раствором доксициклина, сравнивали с комарами, обработанными отрицательным контролем. Показатели выживаемости комаров, обработанных раствором доксициклина, снижались по сравнению с контролем.

Пример 2. Обработка комаров Anopheles растворами азитромицина

Данный пример демонстрирует способность уничтожать или снижать приспособленность комаров Anopheles coluzzii и снижать скорость передачи паразитов посредством обработки азитромицином, имеющим относительно широкую, но слабую антибактериальную активность. Он ингибирует некоторые грамположительные бактерии, некоторые грамотрицательные бактерии и многие атипичные бактерии. Влияние азитромицина на комаров опосредовано модулированием популяций бактерий, эндогенных по отношению к комару, которые являются восприимчивыми к азитромицину. Одним штаммом бактерий-мишеней является Asaia.

Данный комар был описан как наиболее опасное животное в мире, а малярия представляет собой одно из заболеваний, переносимых комарами, которое пагубно влияет на человека. Насчитывается приблизительно 3500 видов комаров, и все из них, которые переносят малярию, принадлежат к подгруппе, называемой Anopheles. Примерно 40 видов Anopheles способны переносить малярию, что значительно влияет на здоровье человека.

Схема терапии. Порции высасываемой крови, смешанной с растворами азитромицина, составляли в конечных концентрациях антибиотика 0 (отрицательный контроль), 0,1, 1 или 5 мкг/мл в 1 мл крови.

Схема эксперимента

Для подготовки к обработке комаров выращивали в лабораторных условиях и среде. Эксперименты проводили с самками комаров из колонии Нгуссо Anopheles coluzzii, изначально отобранными из полевых комаров, собранных в Камеруне, выдерживаемых на человеческой крови и вскармливаемых как взрослых особей 5% фруктозой. Личинок вскармливали на обработанной тетрамином съедобной рыбе. Температуру поддерживали при 28°C (±1°C), влажности 70-80% с циклом чередования 12 часов света и темноты.

Вскармливание на человеческой крови и инфекции, вызываемые Plasmodium

Гаметоциты Plasmodium falciparum NF54 культивировали в среде RPMI (GIBCO), содержащей 300 мг L-глутамина L-1, с добавлением 50 мг/л гипоксантина, 25 мM HEPES и 10% термоинактивированной человеческой сывороткой крови без антибиотиков. Культивирование двух культур объемом 25 мл начинали за 17 и 14 дней до инфицирования при 0,5% паразитемии в 6% об./об. отмытых эритроцитах O+ (RBC). Среду меняли ежедневно. До инфицирования комарами центрифугированные RBC объединяли и дополняли 20% свежепромытыми RBC и сывороткой крови человека (соотношение между RBC и сывороткой крови 2:3 об./об.). Комарам предоставляли порцию крови из мембранного питающего устройства (пробирки Eppendorf на 2 мл), закрытого парафильмом, и их содержали при 37°C.

Растворы азитромицина готовили путем растворения азитромицина (SIGMA-ALDRICH, PZ0007) в DMSO. Различные объемы раствора азитромицина добавляли к свежей крови до общего объема 1 мл в препарате порций высасываемой крови. Конечные концентрации азитромицина в крови составляли примерно 0 (только растворитель в качестве контрольного раствора), 0,1, 1 или 5 мкг/мл.

Для каждой инфекции, вызываемой Plasmodium, по меньшей мере 100 сопоставимым по возрасту 2-3-дневным комарам на условие предлагали контроль или экспериментальную порцию крови из мембранного питающего устройства (пробирки Eppendorf на 2 мл), закрытого парафильмом, и их содержали при 37°C, а не напившихся кровью комаров исключали. Порции предоставляли каждые четыре дня в общей сложности в количестве трех порций высасываемой крови. Между порциями высасываемой крови комарам предоставляли ватные тампоны, смоченные дистиллированной водой, для откладки яиц. Ненакормленных комаров не удаляли после второй и более поздних порций высасываемой крови. Число смертельных случаев подсчитывали ежедневно, и трупы удаляли и хранили для анализа Asaia, как описано в данном документе. В каждой повторности использовали по меньшей мере 50 комаров на концентрацию азитромицина. После выдачи последней порции высасываемой крови комаров выдерживали в течение 12 часов перед вскрытием.

Анализ микробиоты с помощью количественной полимеразной цепной реакции

Перед вскрытием комаров погружали в 70% этанол на 5 минут, затем промывали 3 раза в стерильном фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) для уничтожения и удаления поверхностных бактерий, тем самым минимизируя контаминацию образцов бактериями кутикулы при вскрытии. Среднюю кишку каждого комара (контроль и обработка азитромицином) удаляли и сразу замораживали на сухом льду и хранили при 20°C до обработки. Среднюю кишку удаляли из анализа в случае, если она разрывалась и значительное количество содержимого кишки утрачивалось. Образцы гомогенизировали в смеси фенол/хлороформ в гомогенизаторе Precellys 24 (Bertin) с помощью стеклянных гранул шириной 0,5 мм (Bertin) в течение 30 секунд при 6800 об./мин., и дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) экстрагировали смесью фенол/хлороформ. 16S рибосомальную ДНК (рДНК) использовали для количественной оценки Asaia и представляли в виде отношения к уровню экспрессии 40S рибосомального белка S7, кодируемого геном домашнего хозяйства Anopheles (ID гена в VectorBase AGAP010592). Последовательности праймеров для Asaia представляют собой: прямой 5'-GTGCCGATCTCTAAAAGCCGTCTCA-3' (SEQ ID NO: 248) и обратный 5'-TTCGCTCACCGGCTTCGGGT-3' (SEQ ID NO: 249), а для S7: прямой 5'-GTGCGCGAGTTGGAGAAGA-3' (SEQ ID NO: 250) и обратный 5'-ATCGGTTTGGGCAGAATGC-3' (SEQ ID NO: 251). Количественную полимеразную цепную реакцию (qPCR) проводили на термоциклере для ПЦР в реальном времени 7500 Fast (Applied Biosystems) с использованием набора SYBR Premix Ex Taq (Takara) согласно инструкциям производителя. Комары, обработанные азитромицином, демонстрировали снижение экспрессии специфичных для Asaia генов.

Показатели выживаемости комаров, обработанных азитромицином, сравнивали с комарами, обработанными отрицательным контролем. Показатели выживаемости комаров, обработанных раствором азитромицина, снижались по сравнению с контролем.

Пример 3. Обработка Dermacentor andersoni раствором антибиотика

Данный пример демонстрирует способность уничтожать или снижать приспособленность иксодового клеща Dermacentor andersoni посредством обработки окситетрациклином ликвамицином LA-200, антибиотиком широкого спектра действия, широко используемым для лечения широкого спектра бактериальных инфекций у крупного рогатого скота. Влияние окситетрациклина ликвамицина LA-200 на иксодовых клещей опосредовано модулированием популяций бактерий, эндогенных по отношению к иксодовому клещу, которые являются восприимчивыми к окситетрациклину ликвамицину LA-200. Одним штаммом бактерий-мишеней является Rickettsia.

Иксодовые клещи представляют собой облигатных членистоногих гематофагов, которые питаются на позвоночных и вызывают большие экономические потери для сельскохозяйственных животных вследствие их способности переносить заболевания человеку и животным. В частности, иксодовые клещи переносят патогены на всех континентах и считаются основными переносчиками зоонозных патогенов. Фактически 415 новых переносимых иксодовыми клещами бактериальных патогенов были открыты с момента описания болезни Лайма в 1982 году. Dermacentor andersoni, иксодовый клещ Андерсона, считается настоящим ящиком Пандоры среди патогенных факторов и переносит нескольких патогенов, в том числе Rickettsia rickettsii и Francisella tularensis. Он также является переносчиком Anaplasma marginale, возбудителя анаплазмоза, и большинства широко распространенных патогенов сельскохозяйственных животных, переносимых иксодовыми клещами, во всем мире (Gall et al., The ISME Journal 10:1846-1855, 2016). Экономические потери вследствие анаплазмоза у крупного рогатого скота по оценкам составляют 300 миллионов долларов в год в США (Rochon et al., J. Med. Entomol. 49:253-261, 2012).

Схема терапии. Терапевтическая доза (11 мг/кг на массу тела) инъецируемого окситетрациклина ликвамицина LA-200 на -4-й, -1-й, +3-й и +5-й дни после нанесения иксодовых клещей.

Схема эксперимента

Рассматриваемых взрослых D. andersoni собирали с помощью методики отлова на флаг на участках в Бернсе, Орегон, и Лейк-Комо, Монтана, как описано в (Scoles et al., J. Med. Entomol. 42:153-162, 2005). Собранных в полевых условиях иксодовых клещей использовали для формирования лабораторных колоний. Для анализа бактерий иксодовых клещей когорту из взрослых самцов иксодовых клещей F1 или F2 из каждой колонии вскармливали на теленке голштинской породы и вскрывали для сбора средней кишки (MG) и слюнных желез (SG) для выделения геномной ДНК и количественной оценки бактерий следующим образом.

Когорту иксодовых клещей F1 вскармливали как на обработанных антибиотиками телятах, так и на необработанных телятах (контроль). Обработанные антибиотиком телята получали терапевтическую дозу (11 мг/кг массы тела) инъецируемого окситетрациклина ликвамицина LA-200 на -4-й, -1-й, +3-й и +5-й дни после нанесения иксодовых клещей, тогда как необработанные телята не получали никаких инъекций (необработанный контроль). Самок иксодовых клещей оставляли для откладки яиц для сохранения второго поколения необработанных и обработанных иксодовых клещей (поколения F2). Обработанное поколение F2 происходило из взрослых особей F1, которые подвергались воздействию антибиотиков. Иксодовые клещи F2 не подвергались действию антибиотиков.

Взрослых самцов иксодовых клещей поколения F1 и F2 вскармливали в течение 7 дней и затем вскрывали в течение 24 часов. Число смертельных случаев подсчитывали ежедневно, и иксодовых клещей удаляли и хранили для анализа Rickettsia, как описано в данном документе. Перед вскрытием иксодовых клещей подвергали поверхностной стерилизации, и все инструменты для вскрытия стерилизовали после каждого вскрытия. MG и SG иксодовых клещей иссекали и объединяли в группы по 30 с тремя биологическими повторностями. Ткани хранили в растворе для лизиса клеток (Qiagen, Валенсия, Калифорния, США) и протеиназе K (1,25 мг/мл). Геномную ДНК выделяли с помощью набора для экстракции PureGene (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя.

Количественный анализ Rickettsia bellii

Для количественной оценки Rickettsia число копий гена rickA измеряли с помощью количественной ПЦР с использованием SYBR Green для необработанных и обработанных антибиотиком в F1 и F2 иксодовых клещей. Количество Rickettsia определяли с помощью прямого (5'-TACGCCACTCCCTGTGT CA-3'; SEQ ID NO: 225) и обратного (5'-GATGTAACGGTATTAC ACCAACAG-3'; SEQ ID NO: 226) праймеров. Количество бактерий измеряли в MG и SG объединенных образцов F1 и F2. Количественную полимеразную цепную реакцию (qPCR) проводили на термоциклере для ПЦР в реальном времени 7500 Fast (Applied Biosystems) с использованием набора SYBR Premix Ex Taq (Takara) согласно инструкциям производителя. Иксодовые клещи, обработанные окситетрациклином ликвамицином LA-200, демонстрировали снижение экспрессии специфичных для Rickettsia генов.

Показатели выживаемости иксодовых клещей, обработанных раствором антибиотика, были сопоставимыми с необработанными иксодовыми клещами. Показатели выживаемости иксодовых клещей, обработанных раствором окситетрациклина ликвамицина LA-200, снижались по сравнению с необработанными особями.

Пример 4. Обработка микроскопических клещей, которые инфицируют сельскохозяйственных животных, растворами рифампицина

Данный пример демонстрирует способность уничтожать или снижать приспособленность микроскопических клещей посредством их обработки раствором антибиотика. Данный пример демонстрирует, что влияние окситетрациклина на микроскопических клещей опосредовано модулированием популяций бактерий, таких как Bacillus, эндогенных по отношению к микроскопическим клещам, которые являются восприимчивыми к окситетрациклину.

Зудневая чесотка вызывается микроскопическими клещами, которые заражают животных путем глубокого пробуравливания кожи и откладки яиц внутри ходов. Из яиц вылупляются особи на личиночной стадии. Затем микроскопические клещи на стадии личинок покидают ходы, продвигаются на поверхность кожи и начинают образовывать новые ходы в здоровой ткани кожи. Развитие от яйца до взрослой особи завершается в течение приблизительно 2 недель. Поражения, образующиеся в результате заражения этими микроскопическими клещами, являются следствием реакции иммунной системы животного на присутствие микроскопических клещей. В связи с интенсивностью иммунного ответа животного требуется лишь незначительное количество микроскопических клещей для того, чтобы привести к распространенным поражениям и генерализованному дерматиту. Несмотря на то, что микроскопических клещей можно уничтожить химически синтезированными майтицидами, эти типы химических веществ необходимо распылять на каждое животное в стаде с использованием оборудования для гидравлического распыления под высоким давлением, чтобы обеспечить проникновение спрея в кожу. Кроме того, эти типы химических пестицидов могут оказывать пагубные экологические и/или сельскохозяйственные эффекты.

Схема терапии. Раствор окситетрациклина составляли при 0 (отрицательный контроль), 1, 10 или 50 мкг/мл в 10 мл стерильной воды с 0,5% сахарозой и незаменимыми аминокислотами.

Схема эксперимента

Для определения того, имеют ли взрослые микроскопические клещи на стадии размножения другую восприимчивость по сравнению с форетическими микроскопическими клещами или их потомством, поскольку их кутикула не является завтердевшей, собирали микроскопических клещей, живущих на сельскохозяйственных животных, и микроскопических клещей, ассоциированных с личинками и куколками. В этом анализе исследовали влияние растворов антибиотика на различные типы микроскопических клещей и определяли, как их приспособленность изменяется в результате целенаправленного воздействия на эндогенные микроорганизмы, такие как Bacillus.

Отложивших яйца микроскопических клещей собирали со свиней, зараженных микроскопическими клещами. Образцы кожи собирали с помощью осторожного соскабливания и отрывания покрытых корочками участков из области внутреннего уха свиньи с использованием заостренной чайной ложки и затем исследовали на наличие микроскопических клещей.

Микроскопических клещей распределяли по группам в зависимости от возраста и анализировали по отдельности. Возраст определяли на основе морфологических характеристик и пигментации личинок или куколок следующим образом: микроскопических клещей, собранных из закрученных личинок, которые были достаточно маленькими для того, чтобы передвигаться, помещали в группу 1; микроскопических клещей, собранных из выпрямленных личинок, которые были слишком большими, чтобы лежать в ячейке, и начинали вытягиваться прямо с помощью своего ротового аппарата в направлении отверстия ячейки, помещали в группу 2; и микроскопических клещей, собранных из куколок, помещали в группу 3. Микроскопических клещей хранили на вмещающих их личинках или куколках в стеклянных чашках Петри до тех пор, пока не собирали 50 единиц. Это обеспечивало сохранение неизменным их стандартных условий питания и физиологического состояния. Чтобы предупредить отделение микроскопических клещей от вмещающих их личинок или куколок своих хозяев или заползание друг на друга, в одной и той же чашке содержали только вмещающие структуры на одной и той же стадии развития.

Устройство - кольцо из нержавеющей стали (внутренний диаметр 56 мм, высота 2-3 мм) и 2 стеклянных круга (диаметр 62 мм) - очищали ацетоном и гексаном или пентаном с образованием испытательной арены. Растворы окситетрациклина и контрольный раствор наносили на устройство путем однородного распыления на стеклянные диски и кольцо арены. Для этого в резервуар загружали 1 мл растворов; устанавливали расстояние от опрыскиваемой поверхности до дна пробирки на 11 мм, и использовали форсунку на 0,0275 дюймов. Давление регулировали (обычно в диапазоне 350-500 гПа) до тех пор, пока количество отложенного раствора не составляло 1 ± 0,05 мг/см2. Растворы антибиотика выливали в соответствующие чашки, покрывая все дно чашек, а остаточную жидкость выпаривали под вытяжным устройством. Кольцо помещали между стеклянными кругами, образуя камеру. Камеры использовали в течение 60 часов после приготовления не более чем для трех анализов в целях контроля воздействия растворов антибиотика на микроскопических клещей. В эту камеру вводили от 10 до 15 микроскопических клещей, и части устройства соединяли вместе каплями расплавленного воска. Использовали микроскопических клещей, собранных из закрученных личинок, выпрямленных личинок, белоглазых куколок и темноглазых куколок с белыми и бледными тельцами.

Через 4 часа микроскопических клещей переносили на чистую стеклянную чашку Петри (диаметр 60 мм) с двумя или тремя белоглазыми куколками (через 4-5 дней после покрытия оболочкой) для вскармливания. Микроскопических клещей наблюдали под препаровальной лупой через 4 часа, 24 часа и 48 часов после обработки антибиотиком или контрольными растворами и классифицировали в соответствии со следующими категориями:

- Подвижные: они передвигались на своих конечностях, вне зависимости от того, тыкали ли в них иглой.

- Парализованные: они двигали одним или несколькими придатками, без стимуляции или после стимуляции, однако они не могли передвигаться.

- Мертвые: неподвижные и не реагировали на 3 последовательные стимуляции.

Стерильную зубочистку или иглу использовали для стимуляции микроскопических клещей путем прикасания к их конечностям. Новые зубочистки или стерильные иглы использовали для стимуляции каждой группы для избежания контаминации между группами микроскопических клещей.

Анализы проводили при 32,5°C и относительной влажности 60-70%. Если смертность контрольных особей превышала 30%, то повторность исключали. Каждый эксперимент повторяли с использованием четырех серий камер.

Статус Bacillus в группах микроскопических клещей оценивали с помощью ПЦР. Общую ДНК выделяли из контрольных (не обработанных окситетрациклином) и обработанных окситетрациклином особей (целого тела) с помощью набора для выделения ДНК (OMEGA, Bio-tek) в соответствии с протоколом производителя. Праймеры для Bacillus, прямой праймер 5'-GAGGTAGACGAAGCGACCTG-3' (SEQ ID NO: 233) и обратный праймер 5'-TTCCCTCACGGTACTGGTTC-3' (SEQ ID NO: 234), разрабатывали на основе последовательностей 23S-5S рРНК, полученных из генома Bacillus (номер доступа: AP007209.1) (Takeno et al., J. Bacteriol. 194(17):4767-4768, 2012) с использованием программного обеспечения Primer 5.0 (Primer-E Ltd., Плимут, Великобритания). Циклы ПЦР-амплификации включали в себя начальный этап денатурации при 95°C в течение 5 минут, 35 циклов при 95°C в течение 1 минуты, при 59°C в течение 1 минуты и при 72°C в течение 2 минут и конечный этап элонгации в течение 5 минут при 72°C. Продукты амплификации из обработанных окситетрациклином и контрольных образцов анализировали на 1% агарозных гелях, окрашивали с помощью SYBR Safe и визуализировали с использованием системы визуализации.

Показатели выживаемости микроскопических клещей, обработанных раствором окситетрациклина, сравнивали с микроскопическими клещами Varroa, обработанными отрицательным контролем.

Предполагается, что показатели выживаемости и подвижность микроскопических клещей, обработанных раствором окситетрациклина, снижаются по сравнению с контролем.

Пример 5. Получение библиотеки фагов

Данный пример демонстрирует получение коллекции фагов из образцов среды.

Схема терапии Сбор библиотеки фагов, имеющей следующие семейства фагов: Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae, Lipothrixviridae, Rudiviridae, Ampullaviridae, Bicaudaviridae, Clavaviridae, Corticoviridae, Cystoviridae, Fuselloviridae, Gluboloviridae, Guttaviridae, Inoviridae, Leviviridae, Microviridae, Plasmaviridae, Tectiviridae.

Схема эксперимента.

Несколько образцов среды (почва, прудовые донные отложения, сточная вода) собирали в стерильные колбы на 1 л в течение периода 2 недель и незамедлительно обрабатывали, как описано ниже, после сбора и затем хранили при 4°C. Твердые образцы гомогенизировали в стерильном бульоне Лурия двойной крепости (LB) или триптическом соевом бульоне (TSB) Difco с добавлением 2 мM CaCl2 до конечного объема 100 мл. Значения pH и уровни фосфата измеряли с помощью индикаторных полос для фосфата. Для очистки все образцы центрифугировали при 3000-6000 g в Megafuge 1.0R, Heraeus или центрифуге Eppendorf 5702 R, в течение 10-15 минут при +4°C, и фильтровали через фильтры с размером пор 0,2 мкм с низким связыванием белка для удаления всех оставшихся бактериальных клеток. Надосадочную жидкость хранили при 4°C в присутствии хлороформа в стеклянной бутылке.

Пример 6. Идентификация фагов, специфичных в отношении мишени

Данный пример демонстрирует выделение, очистку и идентификацию отдельных фагов, специфичных в отношении мишени, из неоднородной библиотеки фагов.

Схема эксперимента

20-30 мл библиотеки фагов, описанной в примере 5, разбавляли до объема 30-40 мл бульоном LB. Штамм бактерий-мишеней, например, Buchnera, добавляли (50-200 мкл культуры, выращенной в течение ночи в бульоне LB) для обогащения популяции фагов, которые целенаправленно воздействуют на этот конкретный штамм бактерий в культуре. Эту культуру инкубировали в течение ночи при +37°C, встряхивая при 230 об./мин. Бактерии из этой обогащенной культуры удаляли центрифугированием (3000-6000 g в Megafuge 1.0R, Heraeus или центрифуге Eppendorf 5702 R, 15-20 минут, +4°C) и фильтровали (фильтр с размером пор 0,2 или 0,45 мкм). 2,5 мл культуры, не содержащей бактерий, добавляли к 2,5 мл бульона LB и 50-100 мкл бактерий-мишеней для обогащения фагами. Обогащенную культуру выращивали в течение ночи, как описано выше. Образец из этой обогащенной культуры центрифугировали при 13000 g в течение 15 мин. при комнатной температуре, и 10 мкл надосадочной жидкости помещали на чашку Петри, содержащую LB с агаром, совместно с 100-300 мкл бактерий-мишеней и 3 мл расплавленного 0,7% мягкого агара. Планшеты инкубировали в течение ночи при +37°C. Каждую из бляшек, наблюдаемую на бактериальном газоне, собирали и переносили в 500 мкл бульона LB. Образец из этой исходной культуры бляшек дополнительно высевали на бактерии-мишени. Очистку бляшек выполняли три раза для всех обнаруженных фагов с целью выделения одного однородного фага из неоднородной смеси фагов.

Лизаты из чашек с фагами с высокими титрами (> 1x 10^10 БОЕ/мл) получали путем сбора верхних слоев с планшетов, содержащих штамм бактерий-хозяев, демонстрирующий сливной лизис. После добавления 5 мл буфера верхний мягкий слой агара мацерировали, очищали центрифугированием и стерилизовали фильтрацией. Полученные лизаты хранили при 4°C. Фаговые лизаты с высоким титром дополнительно очищали с помощью изопикнического центрифугирования с использованием CsCl, как описано в (Summer et al., J. Bacteriol. 192:179-190, 2010).

ДНК выделяли из очищенных с помощью CsCl фаговых суспензий, как описано в (Summer, Methods Mol. Biol. 502:27-46, 2009). Отдельный выделенный фаг секвенировали в виде части двух пулов геномов фагов с помощью способа пиросеквенирования 454. Геномную ДНК фагов смешивали в эквимолярных количествах до конечной концентрации приблизительно 100 нг/л. Объединенную ДНК фрагментировали, лигировали с помощью мультиплексной идентификационной метки (MID), специфичной для каждого из пулов, и секвенировали с помощью пиросеквенирования с использованием полнопланшетной реакции на секвенаторе FLX Titanium Roche в соответствии с протоколами производителя. Объединенная ДНК фагов присутствовала в двух реакциях секвенирования. Урезанные выходные данные потоковых диаграмм FLX Titanium, соответствующие каждому из пулов, собирали отдельно с использованием сборщика Newbler версии 2.5.3 (454 Life Sciences), регулируя настройки таким образом, чтобы были включены только риды, содержащие одну MID на сборку. Идентичность отдельных контигов определяли с помощью ПЦР с использованием праймеров, образованных для последовательностей контигов и отдельных препаратов геномной ДНК фагов, в качестве матрицы. Sequencher 4.8 (Gene Codes Corporation) использовали для сборки и редактирования последовательностей. Хромосомные концевые структуры фагов определяли экспериментально. Липкие концы (cos) для фагов определяли посредством секвенирования концов фагового генома и секвенирования продуктов ПЦР, полученных путем амплификации посредством лигирующего соединения циркуляризованной геномной ДНК, как описано в (Summer, Methods Mol. Biol. 502:27-46, 2009). Области, кодирующие белки, изначально прогнозировали с использованием GeneMark.hmm (Lukashin et al. Nucleic Acids Res. 26:1107-1115, 1998), очищали посредством ручного анализа в Artemis (Rutherford et al., Bioinformatics 16:944-945, 2000) и анализировали путем применения BLAST (пороговое E-значение 0,005) (Camacho et al., BMC Bioinformatics 10:421, 2009). Белки, представляющие особый интерес, дополнительно анализировали с помощью InterProScan (Hunter et al., Nucleic Acids Res. 40:D306-D312, 2012).

Электронную микроскопию очищенного с помощью CsCl фага (>1 x10^11 БОЕ/мл), который лизировал эндосимбиотические бактерии Buchnera, выполняли путем разведения исходного раствора буфером на основе триптического соевого бульона. Фаги наносили на тонкие сетки Formvar на 400 меш с углеродным покрытием, окрашивали 2% (вес./об.) уранилацетатом и сушили на воздухе. Образцы наблюдали в трансмиссионном электронном микроскопе JEOL 1200EX, функционирующем при ускоряющем напряжении 100 кВ. Пять вирионов каждого фага измеряли для расчета средних значений и стандартных отклонений размеров капсида и отростка при необходимости.

Пример 7. Обработка тлей раствором очищенных фагов

Данный пример демонстрирует способность уничтожать или снижать приспособленность тлей посредством их обработки раствором фагов. Данный пример демонстрирует, что влияние фага на тлей опосредовано модулированием популяций бактерий, эндогенных по отношению к тлям, которые являются восприимчивыми к фагам. Один штамм бактерий-мишеней представляет собой Buchnera, при этом фаг был идентифицирован в примере 6.

Тли представляют собой иллюстративный вид для исследования средств, модулирующих микробиоту, и их эффектов в отношении приспособленности тлей.

Схема терапии

Растворы фагов составляли при 0 (отрицательный контроль), 102, 105 или 108 бляшкообразующих единиц (БОЕ)/мл фага из примера 6 в 10 мл стерильной воды с 0,5% сахарозой и незаменимыми аминокислотами.

Схема эксперимента

Для подготовки к обработке тлей выращивали в лабораторных условиях и среде. В комнате с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света; 60±5% RH; 20±2°C) растения конских бобов выращивали в смеси вермикулита и перлита при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5-10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5-7 дней. Для экспериментов тлей на стадии личинок второго и третьего возраста собирали из здоровых растений и разделяли по видам обработки таким образом, что для каждого вида обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции.

Растворы фагов получали, как описано в данном документе. Лунки 96-луночного планшета заполняли 200 мкл искусственного рациона для тлей (Febvay et al., Canadian Journal of Zoology 66(11):2449-2453, 1988), и планшет закрывали парафильмом для получения съедобного саше. Искусственный рацион смешивали со стерильной водой и 0,5% сахарозой и незаменимыми аминокислотами в качестве отрицательного контроля или растворами фагов с различными концентрациями фагов. Растворы фагов смешивали с искусственным рационом с получением конечных концентраций фагов от 102 до 108 (БОЕ)/мл.

Для каждой повторности обработки 30-50 тлей на стадии личинок второго и третьего возраста помещали отдельно в лунки 96-луночного планшета, и планшет со съедобным саше переворачивали над ними, что позволяло насекомым питаться через парафильм и оставаться ограниченными отдельными лунками. Экспериментальных тлей содержали при тех же самых условиях среды, что и колонии тлей. После того, как тлей вскармливали в течение 24 часов, съедобное саше заменяли новым, содержащим стерильный искусственный рацион, и новое стерильное саше предоставляли каждые 24 часа в течение 4 дней. Когда саше заменяли, тлей также проверяли в отношении смертности. Тлю считали мертвой, если она становилась коричневой или располагалась на дне лунки и не двигалась во время наблюдения. Если тля находилась на парафильме съедобного саше, но не двигалась, она считалась кормящейся и живой.

Статус Buchnera в образцах от тлей оценивали с помощью ПЦР. Взрослых тлей из группы отрицательного контроля (не обработанных фагом) и группы, обработанной фагом, вначале подвергали поверхностной стерилизации 70% этанолом в течение 1 минуты, 10% отбеливателем в течение 1 минуты и тремя промывками сверхчистой водой в течение 1 минуты. Общую ДНК экстрагировали из каждой особи (всего тела) с помощью набора для выделения ДНК насекомых (OMEGA, Bio-tek) в соответствии с протоколом производителя. Праймеры для Buchnera, прямой праймер 5'-GTCGGCTCATCACATCC-3' (SEQ ID NO: 235) и обратный праймер 5'-TTCCGTCTGTATTATCTCCT-3' (SEQ ID NO: 236), разрабатывали на основе последовательностей 23S-5S рРНК, полученных из генома Buchnera (номер доступа: GCA_000009605.1) (Shigenobu et al., Nature 407:81-86, 2000) с использованием программного обеспечения Primer 5.0 (Primer-E Ltd., Плимут, Великобритания). Циклы ПЦР-амплификации включали в себя начальный этап денатурации при 95°C в течение 5 минут, 35 циклов при 95°C в течение 30 секунд, при 55°C в течение 30 секунд и при 72°C в течение 60 секунд и конечный этап элонгации в течение 10 минут при 72°C. Продукты амплификации из обработанных рифампицином и контрольных образцов анализировали на 1% агарозных гелях, окрашивали с помощью SYBR Safe и визуализировали с использованием системы визуализации. Тли, обработанные фагами, демонстрировали снижение экспрессии специфичных для Buchnera генов.

Показатели выживаемости тлей, обработанных специфичными в отношении Buchnera фагами, сравнивали с тлями, обработанными отрицательным контролем. Показатели выживаемости тлей, обработанных специфичными в отношении Buchnera фагами, снижались по сравнению с тлями, обработанными контролем.

Пример 8. Получение раствора бактериоцина colA

Данный пример демонстрирует получение и очистку бактериоцина colA.

Последовательность конструкции

catatgatgacccgcaccatgctgtttctggcgtgcgtggcggcgctgtatgtgtgcattagcgcgaccgcgggcaaaccggaagaatttgcgaaactgagcgatgaagcgccgagcaacgatcaggcgatgtatgaaagcattcagcgctatcgccgctttgtggatggcaaccgctataacggcggccagcagcagcagcagcagccgaaacagtgggaagtgcgcccggatctgagccgcgatcagcgcggcaacaccaaagcgcaggtggaaattaacaaaaaaggcgataaccatgatattaacgcgggctggggcaaaaacattaacggcccggatagccataaagatacctggcatgtgggcggcagcgtgcgctggctcgag (SEQ ID NO: 237)

Схема эксперимента

ДНК получали с помощью ПЦР с использованием специфических праймеров с вышерасположенными (NdeI) и нижерасположенными (XhoI) сайтами рестрикции. Прямой праймер GTATCTATTCCCGTCTACGAACATATGGAATTCC (SEQ ID NO: 238) и обратный праймер CCGCTCGAGCCATCTGACACTTCCTCCAA (SEQ ID NO: 239). Очищенные фрагменты ПЦР (NucleoSpin® Extract II - Macherey Nagel) расщепляли с помощью NdeI или XhoI, и затем фрагменты лигировали. В случае клонирования colA лигируемый фрагмент ДНК клонировали в вектор pcr2.1 (номер доступа в базе данных GenBank EY122872) (Anselme et al., BMC Biol. 6:43, 2008). Нуклеотидную последовательность систематически проверяли (Cogenics).

Плазмиду с последовательностью colA экспрессировали в BL21 (DE3)/pLys. Бактерии выращивали в бульоне LB при 30°C. При OD600 0,9 добавляли изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) до конечной концентрации 1 мM, и клетки выращивали в течение 6 часов. Бактерии лизировали путем ультразвуковой обработки в 100 мM NaCl, 1% Triton X-100, 100 мM Tris-основания с pH 9,5, и белки загружали в колонку HisTrap HP (GE Healthcare). Колонку последовательно промывали с помощью 100 мM NaCl, 100 мM Tris-HCl с pH 6,8 и PBS. Элюирование проводили 0,3M имидазолом в PBS. Обессоливающие колонки PD-10 (GE Healthcare) применяли для удаления имидазола, и солюбилизированные в PBS пептиды концентрировали на центрифужных фильтрующих элементах (Millipore).

Последовательность белка ColA:

MTRTMLFLAC VAALYVCISA TAGKPEEFAK LSDEAPSNDQ AMYESIQRYR RFVDGNRYNG GQQQQQQPKQ WEVRPDLSRD QRGNTKAQVE INKKGDNHDI NAGWGKNING PDSHKDTWHV GGSVRW (SEQ ID NO: 211)

Пример 9. Обработка тлей раствором бактериоцина colA

Данный пример демонстрирует способность уничтожать или снижать приспособленность тлей посредством их обработки раствором бактериоцина. Данный пример демонстрирует, что влияние бактериоцинов на тлей опосредовано модулированием популяций бактерий, эндогенных по отношению к тлям, которые являются восприимчивыми к бактериоцину ColA. Один штамм бактерий-мишеней представляет собой Buchnera, при этом бактериоцин был получен в примере 8.

Схема терапии

Растворы ColA составляли при 0 (отрицательный контроль), 0,6, 1, 50 или 100 мг/мл ColA из примера 8 в 10 мл стерильной воды с 0,5% сахарозой и незаменимыми аминокислотами.

Схема эксперимента

Для подготовки к обработке тлей выращивали в лабораторных условиях и среде. В комнате с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света; 60±5% RH; 20±2°C) растения выращивали в смеси вермикулита и перлита и заражали тлями. В тех же самых климатических условиях личинки E. balteatus получали в результате массового производства; журчалок выкармливали с использованием сахара, пыльцы и воды; и откладку яиц индуцировали путем помещения зараженных растений-хозяев в садок для насекомых на 3 ч. Полный жизненный цикл происходил на растениях-хозяевах, которые ежедневно повторно заражали тлями.

Лунки 96-луночного планшета заполняли 200 мкл искусственного рациона для тлей (Febvay et al., Canadian Journal of Zoology 66(11):2449-2453, 1988), и планшет закрывали парафильмом для получения съедобного саше. Искусственный рацион смешивали с раствором стерильной воды с 0,5% сахарозой и незаменимыми аминокислотами в качестве отрицательного контроля или растворами ColA с различными концентрациями ColA. Растворы ColA смешивали с искусственным рационом с получением конечных концентраций от 0,6 до 100 мг/мл.

Для каждой повторности обработки 30-50 тлей на стадии личинок второго и третьего возраста помещали отдельно в лунки 96-луночного планшета, и планшет со съедобным саше переворачивали над ними, что позволяло насекомым питаться через парафильм и оставаться ограниченными отдельными лунками. Экспериментальных тлей содержали при тех же самых условиях среды, что и колонии тлей. После того, как тлей вскармливали в течение 24 часов, съедобное саше заменяли новым, содержащим стерильный искусственный рацион, и новое стерильное саше предоставляли каждые 24 часа в течение 4 дней. Когда саше заменяли, тлей также проверяли в отношении смертности. Тлю считали мертвой, если она становилась коричневой или располагалась на дне лунки и не двигалась во время наблюдения. Если тля находилась на парафильме съедобного саше, но не двигалась, она считалась кормящейся и живой.

Статус Buchnera в образцах от тлей оценивали с помощью ПЦР. Взрослых тлей из групп отрицательного контроля и обработки фагом вначале подвергали поверхностной стерилизации 70% этанолом в течение 1 минуты, 10% отбеливателем в течение 1 минуты и тремя промывками сверхчистой водой в течение 1 минуты. Общую ДНК экстрагировали из каждой особи (всего тела) с помощью набора для выделения ДНК насекомых (OMEGA, Bio-tek) в соответствии с протоколом производителя. Праймеры для Buchnera, прямой праймер 5'-GTCGGCTCATCACATCC-3' (SEQ ID NO: 235) и обратный праймер 5'-TTCCGTCTGTATTATCTCCT-3' (SEQ ID NO: 236), разрабатывали на основе последовательностей 23S-5S рРНК, полученных из генома Buchnera (номер доступа: GCA_000009605.1) (Shigenobu et al., Nature 200:407, 81-86) с использованием программного обеспечения Primer 5.0 (Primer-E Ltd., Плимут, Великобритания). Циклы ПЦР-амплификации включали в себя начальный этап денатурации при 95°C в течение 5 минут, 35 циклов при 95°C в течение 30 секунд, при 55°C в течение 30 секунд и при 72°C в течение 60 секунд и конечный этап элонгации в течение 10 минут при 72°C. Продукты амплификации из обработанных рифампицином и контрольных образцов анализировали на 1% агарозных гелях, окрашивали с помощью SYBR Safe и визуализировали с использованием системы визуализации. Тли, обработанные ColA, демонстрировали снижение экспрессии специфичных для Buchnera генов.

Показатели выживаемости тлей, обработанных специфичным в отношении Buchnera бактериоцином ColA, сравнивали с тлями, обработанными отрицательным контролем. Показатели выживаемости тлей, обработанных специфичным в отношении Buchnera бактериоцином ColA, снижались по сравнению с тлями, обработанными контролем.

Пример 10. Обработка тлей растворами рифампицина

Данный пример демонстрирует способность уничтожать или снижать приспособленность тлей посредством их обработки рифампицином, антибиотиком узкого спектра действия, который ингибирует ДНК-зависимый синтез РНК путем ингибирования бактериальной РНК-полимеразы. Данный пример демонстрирует, что влияние рифампицина на тлей опосредовано модулированием популяций бактерий, эндогенных по отношению к тлям, которые являются восприимчивыми к рифампицину. Одним штаммом бактерий-мишеней является Buchnera.

Схема терапии

Растворы антибиотика составляли при 0 (отрицательный контроль), 1, 10 или 50 мкг/мл рифампицина в 10 мл стерильной воды с 0,5% сахарозой и незаменимыми аминокислотами.

Схема эксперимента

Для подготовки к обработке тлей выращивали в лабораторных условиях и среде. В комнате с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света; 60±5% RH; 20±2°C) растения конских бобов выращивали в смеси вермикулита и перлита при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5-10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5-7 дней. Для экспериментов тлей на стадии личинок второго и третьего возраста собирали из здоровых растений и разделяли по видам обработки таким образом, что для каждого вида обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции.

Растворы рифампицина получали путем растворения рифампицина (SIGMA-ALDRICH, 557303) в стерильной воде с 0,5% сахарозой и незаменимыми аминокислотами. Лунки 96-луночного планшета заполняли 200 мкл искусственного рациона для тлей (Febvay et al., Canadian Journal of Zoology 66(11):2449-2453, 1988), и планшет закрывали парафильмом для получения съедобного саше. Искусственный рацион смешивали со стерильной водой и 0,5% сахарозой и незаменимыми аминокислотами в качестве отрицательного контроля или раствором рифампицина с одной из концентраций рифампицина. Растворы рифампицина смешивали с искусственным рационом с получением конечных концентраций антибиотика от 1 до 50 мкг/мл.

Для каждой повторности обработки 30-50 тлей на стадии личинок второго и третьего возраста помещали отдельно в лунки 96-луночного планшета, и планшет со съедобным саше переворачивали над ними, что позволяло насекомым питаться через парафильм и оставаться ограниченными отдельными лунками. Экспериментальных тлей содержали при тех же самых условиях среды, что и колонии тлей. После того, как тлей вскармливали в течение 24 часов, съедобное саше заменяли новым, содержащим стерильный искусственный рацион, и новое стерильное саше предоставляли каждые 24 часа в течение четырех дней. Когда саше заменяли, тлей также проверяли в отношении смертности. Тлю считали мертвой, если она становилась коричневой или располагалась на дне лунки и не двигалась во время наблюдения. Если тля находилась на парафильме съедобного саше, но не двигалась, она считалась кормящейся и живой.

Статус Buchnera в образцах от тлей оценивали с помощью ПЦР. Общую ДНК выделяли из контрольных (не обработанных рифампицином) и обработанных рифампицином особей с помощью набора для выделения ДНК насекомых (OMEGA, Bio-tek) в соответствии с протоколом производителя. Праймеры для Buchnera, прямой праймер 5′-GTCGGCTCATCACATCC-3′ (SEQ ID NO: 235) и обратный праймер 5′-TTCCGTCTGTATTATCTCCT-3′ (SEQ ID NO: 236), разрабатывали на основе последовательностей 23S-5S рРНК, полученных из генома Buchnera (номер доступа: GCA_000009605.1) (Shigenobu et al., Nature 407:81-86, 2000) с использованием программного обеспечения Primer 5.0 (Primer-E Ltd., Плимут, Великобритания). Циклы ПЦР-амплификации включали в себя начальный этап денатурации при 95°C в течение 5 минут, 35 циклов при 95°C в течение 30 секунд, при 55°C в течение 30 секунд и при 72°C в течение 60 секунд и конечный этап элонгации в течение 10 минут при 72°C. Продукты амплификации из обработанных рифампицином и контрольных образцов анализировали на 1% агарозных гелях, окрашивали с помощью SYBR Safe и визуализировали с использованием системы визуализации. Тли, обработанные рифампицином, демонстрировали снижение экспрессии специфичных для Buchnera генов.

Показатели выживаемости тлей, обработанных раствором рифампицина, сравнивали с тлями, обработанными отрицательным контролем. Показатели выживаемости тлей, обработанных раствором рифампицина, снижались по сравнению с контролем.

Пример 11. Высокопроизводительный скрининг (HTS) в отношении молекул, целенаправленно воздействующих на Buchnera

Данный пример демонстрирует идентификацию молекул, которые целенаправленно воздействуют на Buchnera.

Схема эксперимента. Для HTS в целях идентификации ингибиторов штаммов бактерий-мишеней Buchnera использовали сбраживание сахарозы в среде pH-MMSuc (Ymele-Leki et al., PLoS ONE 7(2):e31307, 2012) для снижения pH среды. Индикаторы pH в среде обеспечивали спектрофотометрический контроль подкисления среды по изменению поглощения при 615 нм (A615). Штамм бактерий-мишеней Buchnera, полученный из исходной культуры в глицерине, высевали на чашку с LB с агаром и инкубировали в течение ночи при 37°C. Петлю для посева с клетками собирали, промывали три раза с помощью PBS и затем ресуспендировали в PBS при оптической плотности 0,015.

Для HTS 10 мкл суспензий этих бактериальных клеток разделяли на аликвоты в лунки 384-луночного планшета, содержащего 30 мкг среды pH-MMSuc и 100 нл фракции исследуемого соединения из библиотеки природных продуктов, содержащей предварительно фракционированные экстракты (39314 экстрактов, размещенных в 384-луночных планшетах) из источников-микроорганизмов, таких как эндофиты грибов, эндофиты бактерий, почвенные бактерии и морские бактерии, описанные в (Ymele-Leki et al., PLoS ONE 7(2):e31307, 2012). Для каждого анализа A615 измеряли после инкубирования при комнатной температуре через 6 часов и 20 часов. Этот этап является автоматизированным и валидированным в формате 384-луночного планшета с использованием спектрофотометра для многолуночных планшетов EnVisionTM для исследования всех фракций из библиотеки. Фракции, которые демонстрировали замедленное подкисление среды при сбраживании сахарозы и ингибируемый клеточный рост, выбирали для дальнейшей очистки и идентификации.

Пример 12. Выделение и идентификация молекул, специфичных в отношении Buchnera

Данный пример демонстрирует выделение и идентификацию изолята из фракции, описанной в примере 11, который блокирует сбраживание сахарозы и ингибирует клеточный рост Buchnera.

Схема эксперимента

Фракцию, описанную в примере 11, ресуспендировали в 90% смеси вода/метанол и пропускали через колонку C18 SPE с получением фракции I. Затем колонку промывали метанолом с получением фракции II. Фракцию II отделяли с помощью системы для HPLC серии Agilent 1100 на колонке для препаративной хроматографии с фенилгексилом (Phenomenex, Luna, 25 см, 610 мм, размер частиц 5 мм) с использованием буфера для элюирования со смесью 20% ацетонитрил/вода с 0,1% муравьиной кислотой при скорости потока 2 мл/мин. в течение 50 минут. Это приводило к образованию многочисленных соединений с различными значениями времени элюирования. Спектры для каждого соединения получали на масс-спектрометре Alpha FT-IR (Bruker), спектрофотометре для УФ/видимой области спектра UltrospecTM 5300 pro (Amersham Biosciences) и ядерно-магнитном резонансном спектрометре INOVA на 600 МГц (Varian).

Пример 13. Обработка тлей раствором молекулы, специфичной в отношении Buchnera

Данный пример демонстрирует способность уничтожать или снижать приспособленность тлей посредством обработки их одним из соединений, идентифицированных в примере 12, благодаря модулированию популяций бактерий, эндогенных по отношению к тлям, которые являются восприимчивыми к этому соединению. Одним штаммом бактерий-мишеней является Buchnera.

Схема терапии

Каждое из соединений из примера 12 составляли при 0 (отрицательный контроль), 0,6, 1, 20 или 80 мкг/мл в 10 мл стерильной воды с 0,5% сахарозой и незаменимыми аминокислотами.

Схема эксперимента

Для подготовки к обработке тлей выращивали в лабораторных условиях и среде. В комнате с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света; 60±5% RH; 20±2°C) растения конских бобов выращивали в смеси вермикулита и перлита при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5-10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5-7 дней. Для экспериментов тлей на стадии личинок второго и третьего возраста собирали из здоровых растений и разделяли по видам обработки таким образом, что для каждого вида обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции.

Лунки 96-луночного планшета заполняли 200 мкл искусственного рациона для тлей (Febvay et al., Canadian Journal of Zoology 66(11):2449-2453, 1988), и планшет закрывали парафильмом для получения съедобного саше. Искусственный рацион смешивали со стерильной водой с 0,5% сахарозой и незаменимыми аминокислотами в качестве отрицательного контроля или растворами с различными концентрациями соединения.

Для каждой повторности обработки 30-50 тлей на стадии личинок второго и третьего возраста помещали отдельно в лунки 96-луночного планшета, и планшет со съедобным саше переворачивали над ними, что позволяло насекомым питаться через парафильм и оставаться ограниченными отдельными лунками. Экспериментальных тлей содержали при тех же самых условиях среды, что и колонии тлей. После того, как тлей вскармливали в течение 24 часов, съедобное саше заменяли новым, содержащим стерильный искусственный рацион, и новое стерильное саше предоставляли каждые 24 часа в течение 4 дней. Когда саше заменяли, тлей также проверяли в отношении смертности. Тлю считали мертвой, если она становилась коричневой или располагалась на дне лунки и не двигалась во время наблюдения. Если тля находилась на парафильме съедобного саше, но не двигалась, она считалась кормящейся и живой.

Статус Buchnera в образцах от тлей оценивали с помощью ПЦР. Тлей из групп отрицательного контроля и обработки соединением 1 вначале подвергали поверхностной стерилизации 70% этанолом в течение 1 минуты, 10% отбеливателем в течение 1 минуты и тремя промывками сверхчистой водой в течение 1 минуты. Общую ДНК экстрагировали из каждой особи (всего тела) с помощью набора для выделения ДНК насекомых (OMEGA, Bio-tek) в соответствии с протоколом производителя. Праймеры для Buchnera, прямой праймер 5'-GTCGGCTCATCACATCC-3' (SEQ ID NO: 235) и обратный праймер 5'-TTCCGTCTGTATTATCTCCT-3' (SEQ ID NO: 236), разрабатывали на основе последовательностей 23S-5S рРНК, полученных из генома Buchnera (номер доступа: GCA_000009605.1) (Shigenobu et al., Nature 407:81-86, 2000) с использованием программного обеспечения Primer 5.0 (Primer-E Ltd., Плимут, Великобритания). Циклы ПЦР-амплификации включали в себя начальный этап денатурации при 95°C в течение 5 минут, 35 циклов при 95°C в течение 30 секунд, при 55°C в течение 30 секунд и при 72°C в течение 60 секунд и конечный этап элонгации в течение 10 минут при 72°C. Продукты амплификации из обработанных соединением 1 и контрольных образцов анализировали на 1% агарозных гелях, окрашивали с помощью SYBR Safe и визуализировали с использованием системы визуализации. Снижение экспрессии генов, специфичных для Buchnera, указывало на противомикробную активность соединения 1.

Показатель выживаемости тлей, обработанных соединением, сравнивали с тлями, обработанными отрицательным контролем. Предполагается, что снижение показателя выживаемости тлей, обработанных соединением, указывало на противомикробную активность соединения.

Пример 14. Насекомые, обработанные раствором антибиотика

Данный пример демонстрирует обработку тли рифампицином, антибиотиком узкого спектра действия, который ингибирует ДНК-зависимый синтез РНК путем ингибирования бактериальной РНК-полимеразы. Данный пример демонстрирует, что влияние рифампицина на модельный вид насекомых, тлей, было опосредовано модулированием популяций бактерий, эндогенных по отношению к насекомым, которые были восприимчивыми к рифампицину. Одним штаммом бактерий-мишеней является Buchnera.

Схема терапии

Раствор антибиотика составляли в соответствии со способом доставки следующим образом (фиг. 1A-1G).

1) Через растения: с 0 (отрицательный контроль) или 100 мкг/мл рифампицина, составленного в искусственном рационе (согласно Akey and Beck, 1971; см. раздел Схема эксперимента) с незаменимыми аминокислотами и без них (2 мг/мл гистидина, 2 мг/мл изолейцина, 2 мг/мл лейцина, 2 мг/мл лизина, 1 мг/мл метионина, 1,62 мг/мл фенилаланина, 2 мг/мл треонина, 1 мг/мл триптофана и 2 мг/мл валина).

2) Покрытие листьев: 100 мкл 0,025% неионогенного кремнийорганического поверхностно-активного растворителя Silwet L-77 в воде (отрицательный контроль) или 100 мкл 50 мкг/мл рифампицина, составленного в растворе растворителя, применяли непосредственно в отношении поверхности листьев и оставляли высыхать.

3) Микроинъекция: растворы для инъекций представляли собой 0,025% неионогенный кремнийорганический поверхностно-активный растворитель Silwet L-77 в воде (отрицательный контроль) или 50 мкг/мл рифампицина, составленного в растворе растворителя.

4) Местная доставка: 100 мкл 0,025% неионогенного кремнийорганического поверхностно-активного растворителя Silwet L-77 (отрицательный контроль) или 50 мкг/мл рифампицина, составленного в растворе растворителя, распыляли с помощью аэрозольного флакончика на 30 мл.

5) Способ А инъекции в листья - заливание в листья и разрезание листьев: в листья инъецировали примерно 1 мл 50 мкг/мл рифампицина в воде с пищевым красителем или примерно 1 мл отрицательного контроля с водой и пищевым красителем. Листья нарезали на квадратные кусочки размером 2×2 см, и тлей помещали на кусочки листьев.

6) Заливание в листья и доставка через растение: в листья инъецировали примерно 1 мл 100 мкг/мл рифампицина в воде с пищевым красителем или примерно 1 мл отрицательного контроля с водой и пищевым красителем. Черешок листа, в который была произведена инъекция, затем помещали в пробирку Eppendorf с 1 мл 100 мкг/мл рифампицина с водой и пищевым красителем или 1 мл отрицательного контроля, содержащего только воду и пищевой краситель.

7) Комбинированный способ доставки: a) местная доставка тлям и растениям: путем распыления как на тлей, так и на растения 0,025% неионогенного кремнийорганического поверхностно-активного растворителя Silwet L-77 в воде (отрицательный контроль) или 100 мкг/мл рифампицина, составленного в растворе растворителя, с помощью аэрозольного флакончика на 30 мл, b) доставка через растение: только вода (отрицательный контроль) или 100 мкг/мл рифампицина, составленного в воде.

Доставка через растения - схема эксперимента

Тлей (линии LSR-1, Acyrthosiphon pisum) выращивали на растениях конских бобов (бобы Vroma vicia от Johnny's Selected Seeds) в инкубаторе с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света/8 ч. темноты; 60±5% RH; 25±2°C). Перед использованием для выкармливания тлей растения конских бобов выращивали в почвенной смеси для горшечных культур при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5-10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5-7 дней. Для экспериментов тлей на стадии личинок первого возраста собирали со здоровых растений и разделяли на 3 различные группы обработки: 1) только искусственный рацион без незаменимых аминокислот, 2) только искусственный рацион без незаменимых аминокислот и 100 мкг/мл рифампицина и 3) искусственный рацион с незаменимыми аминокислотами и 100 мкг/мл рифампицина. Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции.

Используемый искусственный рацион готовили, как описано ранее (Akey and Beck, 1971 Continuous Rearing of the Pea Aphid, Acyrthosiphon pisum, on a Holidic Diet), с незаменимыми аминокислотами и без них (2 мг/мл гистидина, 2 мг/мл изолейцина, 2 мг/мл лейцина, 2 мг/мл лизина, 1 мг/мл метионина, 1,62 мг/мл фенилаланина, 2 мг/мл треонина, 1 мг/мл триптофана и 2 мг/мл валина), за исключением того, что ни в одном случае рацион не включал гомосерин или бета-аланилтирозин. Значение pH рационов доводили до 7,5 с помощью KOH, и рационы стерилизовали фильтрацией с помощью фильтра с размером пор 0,22 мкм и хранили при 4°C в течение короткого срока (<7 дней) или при -80°C в течение длительного срока.

Исходные растворы рифампицина (Tokyo Chemical Industry, LTD) готовили в концентрации 25 мг/мл в метаноле, стерилизовали путем пропускания через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранили при -20°C. Для обработок (см. раздел Схема терапии) подходящее количество исходного раствора добавляли к искусственному рациону с незаменимыми аминокислотами или без них с получением конечной концентрации 100 мкг/мл рифампицина. Рацион затем помещали в пробирку Eppendorf на 1,5 мл с черешком и листом конских бобов, и отверстие пробирки закрывали парафильмом. Эту систему вскармливания искусственным рационом затем помещали в глубокую чашку Петри (Fisher Scientific, № по кат. FB0875711), и тлей наносили на листья растения.

Для каждой обработки на каждый лист помещали 33 тли. Системы вскармливания искусственным рационом заменяли каждые 2-3 дня на протяжении всего эксперимента. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли из глубокой чашки Петри, в которой содержалась система вскармливания искусственным рационом, в случае их обнаружения.

Помимо этого, стадию развития (личинки 1-го, 2-го, 3-го, 4-го, 5-го возраста) определяли ежедневно на протяжении всего эксперимента. При достижении тлями стадии личинок 4-го возраста им предоставляли их собственные искусственные системы вскармливания в глубокой чашке Петри для того, чтобы можно было контролировать плодовитость, как только они достигали зрелого возраста.

В случае взрослых тлей новых нимф считали ежедневно и затем исключали. В конце экспериментов плодовитость определяли в виде среднего числа потомков, образуемых ежедневно после достижения тлей зрелого возраста. Снимки тлей получали на протяжении всего эксперимента для оценивания различий в размерах между группами обработки.

Через 7 дней после обработки ДНК экстрагировали из нескольких тлей из каждой группы обработки. Вкратце, поверхность тела тлей стерилизовали путем погружения тли в 6% раствор отбеливателя примерно на 5 секунд. Затем тлей промывали в стерильной воде, и ДНК экстрагировали из каждой отдельной тли с помощью набора для экстракции ДНК (Qiagen, набор DNeasy) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию ДНК измеряли посредством количественной оценки нуклеиновой кислоты с использованием NanoDrop, и число копий ДНК Buchnera и тлей измеряли с помощью qPCR. Праймерами, используемыми для Buchnera, были Buch_groES_18F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 240) и Buch_groES_98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO: 241) (Chong and Moran, 2016 PNAS). Праймерами, используемыми для тлей, были ApEF1a 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG; SEQ ID NO: 242) и ApEF1a 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO: 243) (Chong and Moran, 2016 PNAS). qPCR проводили с использованием скорости линейного изменения для qPCR-амплификации 1,6 градуса C/с и следующих условий: 1) 95°C в течение 10 минут, 2) 95°C в течение 15 секунд, 3) 55°C в течение 30 секунд, 4) повторение этапов 2-3 40x, 5) 95°C в течение 15 секунд, 6) 55°C в течение 1 минуты, 7) изменение скорости линейного изменения до 0,15 градуса C/с, 8) 95°C в течение 1 секунды. Данные qPCR анализировали с помощью аналитического программного обеспечения (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).

Обработка антибиотиками задерживает и останавливает прогрессирование развития тлей

Тлей LSR-1 на стадии личинок 1-го возраста разделяли на три отдельные группы обработки, как определено в разделе Схема эксперимента (выше). Тлей отслеживали ежедневно, и определяли число тлей на каждой стадии развития. Тли, обработанные только искусственным рационом без незаменимых аминокислот, начинали достигать зрелого возраста (стадии личинок 5-го возраста) примерно через 6 дней (фиг. 2A). Развитие задерживалось у тлей, обработанных рифампицином, и через 6 дней после обработки большинство тлей не дозревали дальше чем до стадии личинок 3-го возраста, и даже через 12 дней их размер подвергался существенному отрицательному влиянию (фиг. 2A-2C).

В отличие от этого, тли, обработанные искусственным рационом с рифампицином с добавлением незаменимых аминокислот, развивались быстрее и достигали стадий личинок более позднего возраста по сравнению с тлями, обработанными только рифампицином, однако не так быстро, как тли, обработанные искусственным рационом без незаменимых аминокислот (фиг. 2A-2C). Эти данные указывают на то, что обработка рифампицином ухудшала развитие тлей. Добавление незаменимых аминокислот обратно частично устраняло этот дефект развития.

Обработка антибиотиками повышала смертность тлей

Показатель выживаемости тлей также измеряли в ходе обработок. Большинство тлей, обработанных только искусственным рационом без незаменимых аминокислот, были живыми через 5 дней после обработки (фиг. 3). Через 5 дней тли начинали постепенно погибать, а некоторые выживали по истечении 13 дней после обработки.

В отличие от этого, тли, обработанные рифампицином без незаменимых аминокислот, имели более низкие показатели выживаемости, чем тли, обработанные только искусственным рационом (p<0,00001). Тли, обработанные рифампицином, начинали погибать через 1 день после обработки, и все тли погибали вследствие обработки через 9 дней. Тли, обработанные как рифампицином, так и незаменимыми аминокислотами, выживали дольше, чем тли, обработанные только рифампицином (p=0,017). Эти данные указывают на то, что обработка рифампицином отрицательно влияла на выживаемость тлей.

Обработка антибиотиками снижала интенсивность размножения тлей

В ходе обработок также отслеживали плодовитость тлей. Через 7 и 8 дней после обработки большинство взрослых тлей, обработанных искусственным рационом без незаменимых аминокислот, начинали размножаться. Среднее число потомков, образуемых ежедневно после достижения зрелого возраста тлями, обработанными искусственным рационом без добавления незаменимых аминокислот, составляло примерно 4 (фиг. 4). В отличие от этого, тли, обработанные рифампицином с незаменимыми аминокислотами или без них, были неспособны достигать зрелого возраста и образовывать потомство. Эти данные указывают на то, что обработка рифампицином приводила к утрате способности к размножению у тлей.

Обработка антибиотиками снижала количество Buchnera у тлей

В частности, для исследования того, приводил ли рифампицин к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 7 дней после обработки, и проводили qPCR для определения числа копий Buchnera/тлей. Тли, обработанные только искусственным рационом без незаменимых аминокислот, имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей. В отличие от этого, тли, обработанные рифампицином, имели в ~4 раза меньше копий ДНК Buchnera/тлей (фиг. 5), что указывало на то, что обработка рифампицином снижала уровни Buchnera.

Доставка путем покрытия листьев - схема эксперимента

Исходный раствор рифампицина добавляли к 0,025% неионогенного кремнийорганического поверхностно-активного растворителя Silwet L-77 с получением конечной концентрации 50 мкг/мл рифампицина. Тлей (линии eNASCO, Acyrthosiphon pisum) выращивали на растениях конских бобов, как описано в предыдущем примере. Для экспериментов тлей на стадии личинок первого возраста собирали со здоровых растений и разделяли на 2 различные группы обработки: листья опрыскивали 1) отрицательным контролем (только раствором растворителя), 2) 50 мкг/мл рифампицина в растворителе. Растворы поглощались кусочком листа конских бобов размером 2×2 см.

Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции. Для каждой обработки на каждый лист помещали 20 тлей. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли в случае их обнаружения. Помимо этого, стадию развития (личинки 1-го, 2-го, 3-го, 4-го, 5-го возраста и 5R, что обозначает размножающуюся личинку 5-го возраста) определяли ежедневно на протяжении всего эксперимента. Снимки тлей получали на протяжении всего эксперимента для оценивания различий в размерах между группами обработки.

Через 6 дней после обработки ДНК экстрагировали из нескольких тлей из каждой группы обработки, и qPCR для количественной оценки уровней Buchnera проводили, как описано в предыдущем примере.

Обработка антибиотиками, доставляемыми посредством покрытия листьев, задерживает и останавливает прогрессирование развития тлей

Тлей LSR-1 на стадии личинок 1-го возраста разделяли на две отдельные группы обработки, как определено в разделе Схема эксперимента, что описано в данном документе. Тлей отслеживали ежедневно, и определяли число тлей на каждой стадии развития. Тли, помещенные на покрытые листья, обработанные контролем, начинали достигать зрелого возраста (стадии размножающихся личинок 5-го возраста; 5R) примерно через 6 дней (фиг. 6A). Развитие задерживалось у тлей, помещенных на листья, покрытые рифампицином, и через 6 дней после обработки большинство тлей не дозревали дальше чем до стадии личинок 3-го возраста, и даже через 12 дней их размер подвергался существенному отрицательному влиянию (фиг. 6A и 6B).

Эти данные указывают на то, что покрытие листьев рифампицином ухудшало развитие тлей.

Обработка антибиотиками, доставляемыми посредством покрытия листьев, повышала смертность тлей

Показатель выживаемости тлей также измеряли в ходе обработок путем покрытия листьев. Тли, помещенные на листья, покрытые рифампицином, имели более низкие показатели выживаемости, чем тли, помещенные на листья, покрытые контролем (фиг. 7). Эти данные указывают на то, что обработка рифампицином, доставляемым посредством покрытия листьев, отрицательно влияла на выживаемость тлей.

Обработка антибиотиками, доставляемыми посредством покрытия листьев, снижала количество Buchnera у тлей

В частности, для исследования того, приводил ли рифампицин, доставляемый посредством покрытия листьев, к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 6 дней после обработки, и проводили qPCR для определения числа копий Buchnera/тлей.

Тли, помещенные на листья, покрытые контролем, имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей. В отличие от этого, тли, помещенные на листья, обработанные рифампицином, характеризовались существенным снижением числа копий ДНК Buchnera/тлей (фиг. 8), что указывало на то, что обработка путем покрытия листьев рифампицином устраняла эндосимбиотические Buchnera.

Доставка путем микроинъекции - схема эксперимента

Микроинъекцию осуществляли с помощью автоматического нанолитрового инъектора NanoJet III с выдвижной иглой из боросиликатного стекла собственного изготовления (Drummond Scientific; № по кат. 3-000-203-G/XL). Тлей (линии eNASCO, Acyrthosiphon pisum) выращивали на растениях конских бобов, как описано в предыдущем примере. Тлей переносили с помощью малярной кисти в трубную систему, подсоединенную к вакууму (фиг. 1C). Место инъекции находилось в вентральной части груди тли. Растворы для инъекций представляли собой 0,025% неионогенный кремнийорганический поверхностно-активный растворитель Silwet L-77 (Lehle Seeds, № по кат. VIS-01) в воде (отрицательный контроль) или 50 мкг/мл рифампицина, составленного в растворе растворителя. Объем инъекции составлял 10 нл для нимфы и 20 нл для взрослой особи (в обоих случаях при скорости 2 нл/с). В каждой группе обработки было примерно одно и то же число получивших инъекцию особей с каждого из растений коллекции. После инъекции тлей выпускали в чашку Петри с листьями конских бобов, черешки которых находились в 2% агаре.

Обработка антибиотиками путем микроинъекции снижала количество Buchnera у тлей

Для исследования того, приводил ли рифампицин, доставляемый посредством микроинъекции, к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, как было продемонстрировано в предыдущих примерах, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 4 дня после обработки, и проводили qPCR, как описано в предыдущем примере, для определения числа копий Buchnera/тлей.

Тли, получившие микроинъекцию отрицательного контроля, имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей. В отличие от этого, нимфы и взрослые особи тлей, получившие микроинъекцию рифампицина, характеризовались существенным снижением числа копий ДНК Buchnera/тлей (фиг. 9), что указывало на то, что обработка путем микроинъекции рифампицина уменьшала присутствие эндосимбиотических Buchnera.

Местная доставка - схема эксперимента

Тлей (линии LSR-1, Acyrthosiphon pisum) выращивали на растениях конских бобов, как описано в предыдущем примере. Аэрозольные флакончики наполняли 2 мл контроля (0,025% Silwet L-77) или растворами рифампицина (50 мкг/мл в растворе растворителя). Тлей (число=10) переносили на дно чистой чашки Петри и собирали на краю чашки Петри с помощью малярной кисти. Затем тлей разделяли на две когорты и опрыскивали ~100 мкл контрольного раствора или раствора рифампицина. Непосредственно после распыления чашку Петри закрывали крышкой. Через пять минут после распыления тлей выпускали в чашку Петри с листьями конских бобов, при этом черешки находились в 2% агаре.

Обработка антибиотиками путем местной доставки снижала количество Buchnera у тлей

Для исследования того, приводил ли рифампицин, доставляемый посредством местной доставки, к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, как было продемонстрировано в предыдущих примерах, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 3 дня после обработки, и проводили qPCR, как описано в предыдущем примере, для определения числа копий Buchnera/тлей.

Тли, опрысканные контрольным раствором, имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей. В отличие от этого, тли, опрысканные рифампицином, характеризовались существенным снижением числа копий ДНК Buchnera/тлей (фиг. 10), что указывало на то, что обработка рифампицином, доставляемым посредством местной обработки, снижала присутствие эндосимбиотических Buchnera.

Способ А инъекции в листья - заливание в листья и разрезание листьев

Схема эксперимента

Тлей LSR-1 (в которых содержатся только Buchnera) Acyrthosiphon pisum выращивали на растениях конских бобов (бобы Vroma vicia от Johnny's Selected Seeds) в инкубаторе с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света/8 ч. темноты; 60±5% RH; 25±2°C). Перед использованием для выкармливания тлей растения конских бобов выращивали в почвенной смеси для горшечных культур при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5-10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5-7 дней. Для экспериментов тлей на стадии личинок первого и второго возраста собирали со здоровых растений и разделяли на 2 различные группы обработки: 1) отрицательный контроль (лист, в который была произведена инъекция воды с синим пищевым красителем) и 2) лист, в который была произведена инъекция 50 мкг/мл рифампицина в воде с синим пищевым красителем. Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции. Для обработки исходный раствор рифампицина (25 мг/мл в 100% метаноле) разбавляли до 50 мкг/мл в воде с синим пищевым красителем. Раствор затем помещали в пробирку Eppendorf на 1,5 мл с черешком конских бобов, залитым растворами, и отверстие пробирки закрывали парафильмом. Эту систему вскармливания затем помещали в глубокую чашку Петри (Fisher Scientific, № по кат. FB0875711), и тлей наносили на листья растения. Для каждой обработки на каждый лист помещали 74-81 тлю. Системы вскармливания заменяли каждые 2-3 дня на протяжении всего эксперимента. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли из глубокой чашки Петри в случае их обнаружения. Помимо этого, стадию развития (личинки 1-го, 2-го, 3-го, 4-го, 5-го возраста и 5R (размножающиеся личинки 5-го возраста)) определяли ежедневно на протяжении всего эксперимента.

Обработка антибиотиками, доставляемыми посредством способа А инъекции в листья, задерживает и останавливает прогрессирование развития тлей

Тлей LSR-1 на стадии личинок 1-го и 2-го возраста разделяли на две отдельные группы обработки, как определено в разделе Заливание в листья и разрезание листьев - схема эксперимента (что описано в данном документе). Тлей отслеживали ежедневно, и определяли число тлей на каждой стадии развития. Тли, обработанные водой с пищевым красителем, начинали достигать зрелого возраста (стадии личинок 5-го возраста) примерно через 6 дней (фиг. 11). Развитие задерживалось у тлей, вскармливаемых на листьях, в которые была произведена инъекция рифампицина, а через 6 дней после обработки большинство тлей не дозревали дальше чем до стадии личинок 4-го возраста. Даже через 8 дней развитие тлей, вскармливаемых на листьях, в которые была произведена инъекция рифампицина, существенно задерживалось (фиг. 11). Эти данные указывают на то, что обработка рифампицином путем заливания в листья ухудшала развитие тлей.

Обработка антибиотиками, доставляемыми посредством способа А инъекции в листья, повышала смертность тлей

Показатель выживаемости тлей также измеряли в ходе экспериментов по заливанию в листья. Тли, помещенные на листья, в которые была произведена инъекция рифампицина, имели более низкие показатели выживаемости, чем тли, помещенные на листья, в которые была произведена инъекция контрольного раствора (фиг. 12). Эти данные указывают на то, что обработка рифампицином, доставляемым посредством инъекции в листья, отрицательно влияла на выживаемость тлей.

Обработка антибиотиками, доставляемыми посредством способа А инъекции в листья, приводит к сниженным уровням Buchnera

Для исследования того, приводил ли рифампицин, доставляемый посредством заливания в листья, к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, как было продемонстрировано в предыдущих примерах, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 8 дней после обработки, и проводили qPCR, как описано в предыдущем примере, для определения числа копий Buchnera/тлей.

Тли, вскармливаемые на листьях, в которые была произведена инъекция контрольного раствора, имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей. В отличие от этого, тли, вскармливаемые на листьях, в которые была произведена инъекция рифампицина, характеризовались снижением числа копий ДНК Buchnera/тлей (фиг. 13), что указывало на то, что обработка рифампицином, доставляемым посредством инъекции в листья, уменьшала присутствие эндосимбиотических Buchnera, как показано в предыдущих примерах, и приводила к снижению приспособленности.

Заливание в листья и доставка через растение

Схема эксперимента

Тлей LSR-1 (в которых содержатся только Buchnera) Acyrthosiphon pisum выращивали на растениях конских бобов (бобы Vroma vicia от Johnny's Selected Seeds) в инкубаторе с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света/8 ч. темноты; 60±5% RH; 25±2°C). Перед использованием для выкармливания тлей растения конских бобов выращивали в почвенной смеси для горшечных культур при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты.

Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5-10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5-7 дней. Для экспериментов тлей на стадии личинок первого и второго возраста собирали со здоровых растений и разделяли на 2 различные группы обработки: 1) тли, помещенные на листья, в которые была произведена инъекция раствора отрицательного контроля (вода и пищевой краситель), и помещенные в пробирку Eppendorf с раствором отрицательного контроля, или 2) тли, помещенные на листья, в которые была произведена инъекция 100 мкг/мл рифампицина в воде с пищевым красителем, и помещенные в пробирку Eppendorf со 100 мкг/мл рифампицина в воде. Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции.

Для обработки исходный раствор рифампицина (25 мг/мл в 100% метаноле) разбавляли до 100 мкг/мл в воде с синим пищевым красителем. Раствор затем помещали в пробирку Eppendorf на 1,5 мл с черешком конских бобов, лист на котором также был залит растворами, и отверстие пробирки закрывали парафильмом. Эту систему вскармливания затем помещали в глубокую чашку Петри (Fisher Scientific, № по кат. FB0875711), и тлей наносили на листья растения.

Для каждой обработки на каждый лист помещали 49-50 тлей. Системы вскармливания заменяли каждые 2-3 дня на протяжении всего эксперимента. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли из глубокой чашки Петри в случае их обнаружения.

Помимо этого, стадию развития (личинки 1-го, 2-го, 3-го, 4-го, 5-го возраста и 5R (размножающиеся личинки 5-го возраста)) определяли ежедневно на протяжении всего эксперимента.

Обработка антибиотиками, доставляемыми посредством инъекции в листья и доставки через растение, задерживает и останавливает прогрессирование развития тлей

Тлей LSR-1 на стадии личинок 1-го и 2-го возраста разделяли на две отдельные группы обработки, как определено в разделе Заливание в листья и доставка через растение - схема эксперимента (что описано в данном документе). Тлей отслеживали ежедневно, и определяли число тлей на каждой стадии развития. Тли, обработанные контрольным раствором (только водой с пищевым красителем), начинали достигать зрелого возраста (стадии личинок 5-го возраста) примерно через 6 дней (фиг. 14).

Развитие задерживалось у тлей, обработанных рифампицином, а через 6 дней после обработки большинство тлей не дозревали дальше чем до стадии личинок 3-го возраста. Даже через 8 дней их развитие существенно задерживалось (фиг. 14). Эти данные указывают на то, что обработка рифампицином путем заливания в листья ухудшала развитие тлей.

Обработка антибиотиками, доставляемыми посредством инъекции в листья и доставки через растение, повышала смертность тлей

Показатели выживаемости тлей также измеряли в ходе экспериментов, в которых тлей обрабатывали контрольным раствором или рифампицином, доставляемым посредством заливания в листья и через растение. Тли, вскармливаемые на листьях, залитых и обработанных рифампицином, имели более низкие показатели выживаемости, чем тли, вскармливаемые на листьях, залитых и обработанных контрольным раствором (фиг. 15). Эти данные указывают на то, что обработка рифампицином, доставляемым посредством заливания в листья и через растение, отрицательно влияла на выживаемость тлей.

Обработка антибиотиками, доставляемыми посредством инъекции в листья и через растение, приводит к сниженным уровням Buchnera

Для исследования того, приводил ли рифампицин, доставляемый посредством заливания в листья и через растение, к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, как было продемонстрировано в предыдущих примерах, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 6 и 8 дней после обработки, и проводили qPCR для определения числа копий Buchnera/тлей, как описано в предыдущих примерах.

Тли, вскармливаемые на листьях, в которые была произведена инъекция контрольного раствора и которые были им обработаны, имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей. В отличие от этого, тли, вскармливаемые на листьях, залитых и обработанных рифампицином, характеризовались статистически значимым снижением числа копий ДНК Buchnera/тлей в оба момента времени (p=0,0037 и p=0,0025, через 6 и 8 дней соответственно) (фиг. 16A и 16B), что указывало на то, что обработка рифампицином, доставляемым посредством заливания в листья и через растение, уменьшала присутствие эндосимбиотических Buchnera и, как показано в предыдущих примерах, приводила к снижению приспособленности.

Комбинированный способ доставки

Схема эксперимента

Тлей LSR-1 (в которых содержатся только Buchnera) Acyrthosiphon pisum выращивали на растениях конских бобов (бобы Vroma vicia от Johnny's Selected Seeds) в инкубаторе с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света/8 ч. темноты; 60±5% RH; 20±2°C). Перед использованием для выкармливания тлей растения конских бобов выращивали в почвенной смеси для горшечных культур при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5-10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5-7 дней.

Для экспериментов тлей на стадии личинок первого и второго возраста собирали со здоровых растений и разделяли на 2 различные группы обработки: 1) обработка раствором Silwet-L77 или контрольным раствором воды или 2) обработка рифампицином, разбавленным в Silwet L-77 или воде. Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции. Комбинация способов доставки была следующей: a) местная доставка тлям и растениям путем распыления 0,025% неионогенного кремнийорганического поверхностно-активного растворителя Silwet L-77 (отрицательный контроль) или 100 мкг/мл рифампицина, составленного в растворе растворителя, с помощью аэрозольного флакончика на 30 мл и b) доставка через растение воды (отрицательного контроля) или 100 мкг/мл рифампицина, составленного в воде. Для обработки исходный раствор рифампицина (25 мг/мл в 100% метаноле) разбавляли до 100 мкг/мл в Silwet L-77 (для местной обработки тлей и покрытия листа) или воде (для доставки через растение). Раствор затем помещали в пробирку Eppendorf на 1,5 мл с черешком конских бобов, лист на котором также был залит растворами, и отверстие пробирки закрывали парафильмом. Эту систему вскармливания затем помещали в глубокую чашку Петри (Fisher Scientific, № по кат. FB0875711), и тлей наносили на листья растения.

Для каждой обработки на каждый лист помещали 76-80 тлей. Системы вскармливания заменяли каждые 2-3 дня на протяжении всего эксперимента. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли из глубокой чашки Петри в случае их обнаружения.

Помимо этого, стадию развития (личинки 1-го, 2-го, 3-го, 4-го, 5-го возраста и 5R (размножающиеся личинки 5-го возраста)) определяли ежедневно на протяжении всего эксперимента.

Комбинированная обработка антибиотиками задерживает развитие тлей

Тлей LSR-1 на стадии личинок 1-го и 2-го возраста разделяли на две отдельные группы обработки, как определено в разделе Комбинированный способ доставки - схема эксперимента (что описано в данном документе). Тлей отслеживали ежедневно, и определяли число тлей на каждой стадии развития. Тли, обработанные контролем, начинали достигать зрелого возраста (стадии личинок 5-го возраста) примерно через 6 дней (фиг. 17). Развитие задерживалось у тлей, обработанных рифампицином, и через 6 дней после обработки большинство тлей не дозревали дальше чем до стадии личинок 3-го возраста, и даже через 7 дней их развитие существенно задерживалось (фиг. 17). Эти данные указывают на то, что комбинация обработок рифампицином ухудшала развитие тлей.

Комбинированная обработка антибиотиками приводит к повышенной смертности тлей

Показатели выживаемости тлей также измеряли во время экспериментов, когда тлей обрабатывали с помощью комбинации обработок рифампицином. Тли, обработанные рифампицином, характеризовались немного более низкими показателями выживаемости, чем тли, обработанные контрольными растворами (фиг. 18). Эти данные указывают на то, что обработка рифампицином, доставляемым посредством комбинации обработок, отрицательно влияла на выживаемость тлей.

Комбинированная обработка антибиотиками снижала уровни Buchnera

Для исследования того, приводил ли рифампицин, доставляемый посредством комбинации способов, к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, как было продемонстрировано в предыдущих примерах, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 7 дней после обработки, и проводили qPCR, как описано в предыдущем примере, для определения числа копий Buchnera/тлей.

Тли, обработанные контрольными растворами, имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей. В отличие от этого, тли, обработанные рифампицином, характеризовались статистически значимым и существенным снижением числа копий ДНК Buchnera/тлей (p=0,227; фиг. 19), что указывало на то, что обработка рифампицином, доставляемым посредством комбинации способов, уменьшала присутствие эндосимбиотических Buchnera, и, как показано в предыдущих примерах, это приводило к снижению приспособленности.

В совокупности эти данные, описанные в предыдущих примерах, демонстрировали способность уничтожать тлей и уменьшать их интенсивность развития, способность к размножению, продолжительность жизни и эндогенные популяции бактерий, например, приспособленность, посредством их обработки антибиотиком с помощью нескольких путей доставки.

Пример 15. Насекомые, обработанные природным противомикробным полисахаридом

Данный пример демонстрирует обработку тлей хитозаном, природным катионным линейным полисахаридом, состоящим из звеньев деацетилированного бета-1,4-D-глюкозамина, который является производным хитина. Хитин представляет собой структурный элемент экзоскелета насекомых, ракообразных (главным образом креветок и крабов) и клеточных стенок грибов, а также вторым наиболее распространенным полисахаридом после целлюлозы. Данный пример демонстрирует, что влияние хитозана на насекомых было опосредовано модулированием популяций бактерий, эндогенных по отношению к насекомым, которые были восприимчивыми к хитозану. Одним штаммом бактерий-мишеней является Buchnera aphidicola.

Схема терапии

Раствор хитозана составляли для использования в комбинации заливания в листья и доставки через растения (фиг. 20). Контрольный раствор инъецировали в листья с использованием воды+синего пищевого красителя и воды в пробирке. Раствор для обработки с 300 мкг/мл хитозана в воде (низкомолекулярного) вводили путем инъекции в листья (с синим пищевым красителем) и через растение (в пробирке Eppendorf).

Заливание в листья и доставка через растения - схема эксперимента

Тлей LSR-1 (в которых содержатся только Buchnera) Acyrthosiphon pisum выращивали на растениях конских бобов (бобы Vroma vicia от Johnny's Selected Seeds) в инкубаторе с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света/8 ч. темноты; 60±5% RH; 25±2°C). Перед использованием для выкармливания тлей растения конских бобов выращивали в почвенной смеси для горшечных культур при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5-10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5-7 дней. Для экспериментов тлей на стадии личинок первого и второго возраста собирали со здоровых растений и разделяли на 2 различные группы обработки: 1) отрицательный контроль (обработка водой), 2) раствор для обработки, содержащий 300 мкг/мл хитозана в воде (низкомолекулярного). Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции.

Исходный раствор хитозана (Sigma, № по кат. 448869-50G) готовили в концентрации 1% в уксусной кислоте, стерилизовали автоклавированием и хранили при 4°C. Для обработки (см. раздел Схема терапии) подходящее количество исходного раствора разбавляли водой с получением конечной концентрации хитозана для обработки. Раствор затем помещали в пробирку Eppendorf на 1,5 мл с черешком конских бобов, лист на котором также был залит растворами, и отверстие пробирки закрывали парафильмом. Эту систему вскармливания затем помещали в глубокую чашку Петри (Fisher Scientific, № по кат. FB0875711), и тлей наносили на листья растения.

Для каждой обработки на каждый лист помещали 50-51 тлю. Системы вскармливания заменяли каждые 2-3 дня на протяжении всего эксперимента. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли из глубокой чашки Петри в случае их обнаружения.

Помимо этого, стадию развития (личинки 1-го, 2-го, 3-го, 4-го, 5-го возраста и 5R (размножающиеся личинки 5-го возраста)) определяли ежедневно на протяжении всего эксперимента.

Через 8 дней после обработки ДНК экстрагировали из нескольких тлей из каждой группы обработки. Вкратце, поверхность тела тлей стерилизовали путем погружения тли в 6% раствор отбеливателя примерно на 5 секунд. Затем тлей промывали в стерильной воде, и ДНК экстрагировали из каждой отдельной тли с помощью набора для экстракции ДНК (Qiagen, набор DNeasy) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию ДНК измеряли посредством количественной оценки нуклеиновой кислоты с использованием NanoDrop, и число копий ДНК Buchnera и тлей измеряли с помощью qPCR. Праймерами, используемыми для Buchnera, были Buch_groES_18F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 240) и Buch_groES_98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO: 241) (Chong and Moran, 2016 PNAS). Праймерами, используемыми для тлей, были ApEF1a 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG; SEQ ID NO: 242) и ApEF1a 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO: 243) (Chong and Moran, 2016 PNAS). qPCR проводили с использованием скорости линейного изменения для qPCR-амплификации 1,6 градуса C/с и следующих условий: 1) 95°C в течение 10 минут, 2) 95°C в течение 15 секунд, 3) 55°C в течение 30 секунд, 4) повторение этапов 2-3 40x, 5) 95°C в течение 15 секунд, 6) 55°C в течение 1 минуты, 7) изменение скорости линейного изменения до 0,15 градуса C/с, 8) 95°C в течение 1 секунды. Данные qPCR анализировали с помощью аналитического программного обеспечения (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).

Имела место отрицательная реакция в отношении приспособленности насекомых при обработке природным противомикробным полисахаридом

Тлей A. pisum LSR-1 на стадии личинок 1-го и 2-го возраста разделяли на две отдельные группы обработки, как определено в разделе Схема эксперимента (выше). Тлей отслеживали ежедневно, и определяли число тлей на каждой стадии развития. Тли, обработанные только отрицательным контролем, начинали достигать зрелого возраста (стадии личинок 5-го возраста) примерно через 6 дней (фиг. 21). Развитие задерживалось у тлей, обработанных раствором хитозана, а через 6 дней после обработки хитозаном большинство тлей не дозревали дальше чем до стадии личинок 4-го возраста. Эти данные указывают на то, что обработка хитозаном задерживала и останавливала прогрессирование развития тлей.

Обработка хитозаном повышала смертность тлей

Показатель выживаемости тлей также измеряли в ходе обработок. Большинство тлей, обработанных только контролем, были живыми через 3 дня после обработки (фиг. 22). Через 4 дня тли начинали постепенно погибать, а некоторые выживали по истечении 7 дней после обработки.

В отличие от этого, тли, обработанные раствором хитозана, имели более низкие показатели выживаемости, чем тли, обработанные контролем. Эти данные указывают на то, что имело место снижение выживаемости при обработке природным противомикробным полисахаридом.

Обработка хитозаном снижала количество Buchnera у тлей

В частности, для исследования того, приводила ли обработка раствором хитозана к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 8 дней после обработки, и проводили qPCR для определения числа копий Buchnera/тлей. Тли, обработанные только контролем, имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей. В отличие от этого, тли, обработанные 300 мкг/мл хитозана в воде, имели в ~2-5 раз меньше копий ДНК Buchnera/тлей (фиг. 23), что указывало на то, что обработка хитозаном снижала уровни Buchnera.

В совокупности эти данные, описанные ранее, демонстрировали способность уничтожать тлей и уменьшать их интенсивность развития, продолжительность жизни и эндогенные популяции бактерий, например, приспособленность, посредством их обработки природным противомикробным полисахаридом.

Пример 16. Насекомые, обработанные низином, природным противомикробным пептидом

Данный пример демонстрирует обработку тлей природным полициклическим антибактериальным пептидом "широкого спектра действия", продуцируемым бактерией Lactococcus lactis, который широко используется в качестве пищевого консерванта. Антибактериальная активность низина опосредована его способностью создавать поры в клеточной мембране бактерий и прерывать биосинтез бактериальной клеточной стенки путем специфического взаимодействия с липидом II. Данный пример демонстрирует, что отрицательное влияние низина на приспособленность насекомых опосредовано модулированием популяций бактерий, эндогенных по отношению к насекомым, которые были восприимчивыми к низину. Одним штаммом бактерий-мишеней является Buchnera aphidicola.

Схема терапии

Низин составляли для использования в комбинации заливания в листья и доставки через растения. Контрольный раствор (воду) или раствор для обработки (низин) инъецировали в лист и помещали в пробирку Eppendorf. Растворы для обработки состояли из 1,6 или 7 мг/мл низина в воде.

Заливание в листья и доставка через растения - схема эксперимента

Тлей Acyrthosiphon pisum LSR-1 выращивали на растениях конских бобов (бобы Vroma vicia от Johnny's Selected Seeds) в инкубаторе с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света/8 ч. темноты; 60±5% RH; 25±2°C). Перед использованием для выкармливания тлей растения конских бобов выращивали в почвенной смеси для горшечных культур при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5-10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5-7 дней. Для экспериментов тлей на стадии личинок первого и второго возраста собирали со здоровых растений и разделяли на 2 различные группы обработки: 1) отрицательный контроль (обработка водой), 2) обработка низином в концентрации 1,6 или 7 мг/мл низина в воде. Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции.

Для обработки (см. раздел Схема терапии) раствор низина (Sigma, № продукта: N5764) готовили в концентрации 1,6 или 7 мг/мл (вес./об.) в воде и стерилизовали фильтрацией с помощью шприцевого фильтра с размером пор 0,22 мкм. Затем раствор инъецировали в лист растения, и черешок растения помещали в пробирку Eppendorf на 1,5 мл. Отверстие пробирки закрывали парафильмом. Эту систему вскармливания затем помещали в глубокую чашку Петри (Fisher Scientific, № по кат. FB0875711), и тлей наносили на листья растения.

Для каждой обработки на каждый лист помещали 56-59 тлей. Системы вскармливания заменяли каждые 2-3 дня на протяжении всего эксперимента. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли из глубокой чашки Петри в случае их обнаружения.

Помимо этого, стадию развития (личинки 1-го, 2-го, 3-го, 4-го, 5-го возраста и 5R (размножающиеся личинки тлей 5-го возраста)) определяли ежедневно на протяжении всего эксперимента.

Через 8 дней после обработки ДНК экстрагировали из оставшихся тлей в каждой группе обработки. Вкратце, поверхность тела тлей стерилизовали путем погружения тли в 6% раствор отбеливателя примерно на 5 секунд. Затем тлей промывали в стерильной воде, и ДНК экстрагировали из каждой отдельной тли с помощью набора для экстракции ДНК (Qiagen, набор DNeasy) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию ДНК измеряли посредством количественной оценки нуклеиновой кислоты с использованием NanoDrop, и число копий ДНК Buchnera и тлей измеряли с помощью qPCR. Праймерами, используемыми для Buchnera, были Buch_groES_18F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 240) и Buch_groES_98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO: 241) (Chong and Moran, 2016 PNAS). Праймерами, используемыми для тлей, были ApEF1a 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG; SEQ ID NO: 242) и ApEF1a 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO: 243) (Chong and Moran, 2016 PNAS). qPCR проводили с использованием скорости линейного изменения для qPCR-амплификации 1,6 градуса C/с и следующих условий: 1) 95°C в течение 10 минут, 2) 95°C в течение 15 секунд, 3) 55°C в течение 30 секунд, 4) повторение этапов 2-3 40x, 5) 95°C в течение 15 секунд, 6) 55°C в течение 1 минуты, 7) изменение скорости линейного изменения до 0,15 градуса C/с, 8) 95°C в течение 1 секунды. Данные qPCR анализировали с помощью аналитического программного обеспечения (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).

Имела место дозозависимая отрицательная реакция в отношении приспособленности насекомых при обработке низином

Тлей A. pisum LSR-1 на стадии личинок 1-го и 2-го возраста разделяли на три отдельные группы обработки, как определено в разделе Схема эксперимента (выше). Тлей отслеживали ежедневно, и определяли число тлей на каждой стадии развития. Тли, обработанные раствором отрицательного контроля (водой), начинали достигать зрелого возраста (стадии личинок 5-го возраста) примерно через 6 дней и способности к размножению (стадии 5R) через 7 дней (фиг. 24). Развитие значительно задерживалось у тлей, обработанных 7 мг/мл низина. Тли, обработанные 7 мг/мл низина, развивались только до стадии личинок 2-го возраста через 3 дня, а через 6 дней все тли в группе погибали (фиг. 24). Развитие немного задерживалось у тлей, обработанных более низкой концентрацией низина (1,6 мг/мл), и в каждый оцениваемый момент времени было больше менее развитых тлей по сравнению с контрольными особями, обработанными водой (фиг. 24). Эти данные указывают на то, что обработка низином задерживала и останавливала прогрессирование развития тлей, и эта задержка в развитии зависела от дозы вводимого низина.

В то же время важно отметить, что обработка с помощью 7 мг/мл низина также оказывала отрицательное влияние на состояние листьев, используемых в анализе. Вскоре после заливания в лист 7 мг/мл низина он начинал буреть. Через два дня листья, залитые 7 мг/мл, чернели. Значимого различия в состоянии у листьев, обработанных 1,6 мг/мл низина, не наблюдалось.

Обработка низином приводила к повышенной смертности тлей

Показатель выживаемости тлей также измеряли в ходе обработок. Примерно 50% тлей, обработанных только контролем, выживали после 8-дневного эксперимента (фиг. 25). В отличие от этого, выживаемость была значимо меньшей для тлей, обработанных 7 мг/мл низина (p<0,0001, согласно логарифмическому ранговому критерию Кокса-Мантеля), и все тли в этой группе погибали вследствие обработки через 6 дней (фиг. 25). Тли, обработанные более низкой дозой низина (1,6 мг/мл), имели более высокую смертность по сравнению с тлями, обработанными контролем, несмотря на то, что различие не достигало статистической значимости (p=0,0501, согласно логарифмическому ранговому критерию Кокса-Мантеля). Эти данные указывают на то, что имело место дозозависимое снижение выживаемости при обработке низином.

Обработка низином приводила к снижению количества Buchnera у тлей

В частности, для исследования того, приводила ли обработка низином к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 8 дней после обработки, и проводили qPCR для определения числа копий Buchnera/тлей. Тли, обработанные только контролем, имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей. В отличие от этого, тли, обработанные 1,6 мг/мл низина, имели в ~1,4 раза меньше копий ДНК Buchnera/тлей через 8 дней после обработки (фиг. 26). В группе, обработанной 7 мг/мл низина, не оставалось живых тлей, и, таким образом, в этой группе не оценивали число копий ДНК Buchnera/тлей. Эти данные указывают на то, что обработка низином снижала уровни Buchnera.

В совокупности эти данные, описанные ранее, демонстрируют способность уничтожать тлей и уменьшать их интенсивность развития, продолжительность жизни и эндогенные популяции бактерий, например, приспособленность, посредством их обработки противомикробным пептидом низином.

Пример 17. У насекомых, обработанных левулиновой кислотой, снижается приспособленность насекомых

Данный пример демонстрирует, что обработка тлей левулиновой кислотой, кетокислотой, продуцируемой в результате нагревания углевода, содержащего гексозу (например, древесины, крахмала, пшеницы, соломы или тростникового сахара), с добавлением разбавленной минеральной кислоты, снижает приспособленность насекомых. Левулиновую кислоту ранее исследовали в качестве противомикробного средства против Escherichia coli и Salmonella при производстве мяса (Carpenter et al., 2010, Meat Science; Savannah G. Hawkins, 2014, University of Tennessee Honors Thesis). Данный пример демонстрирует, что влияние левулиновой кислоты на насекомых было опосредовано модулированием популяций бактерий, эндогенных по отношению к насекомым, которые были восприимчивыми к левулиновой кислоте. Одним штаммом бактерий-мишеней является Buchnera aphidicola.

Схема терапии

Левулиновую кислоту составляли для использования в комбинации заливания в листья и доставки через растения. Контрольный раствор инъецировали в листья с использованием воды, и воду помещали в пробирку Eppendorf. Растворы для обработки, содержащие 0,03 или 0,3% левулиновой кислоты в воде, вводили посредством инъекции в листья и через растение (в пробирке Eppendorf).

Заливание в листья и доставка через растения

Схема эксперимента

Тлей Acyrthosiphon pisum eNASCO выращивали на растениях конских бобов (бобы Vroma vicia от Johnny's Selected Seeds) в инкубаторе с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света/8 ч. темноты; 60±5% RH; 25±2°C). Перед использованием для выкармливания тлей растения конских бобов выращивали в почвенной смеси для горшечных культур при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5-10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5-7 дней. Для экспериментов тлей на стадии личинок первого и второго возраста собирали со здоровых растений и разделяли на 2 различные группы обработки: 1) отрицательный контроль (обработка водой), 2) раствор для обработки, содержащий 0,03 или 0,3% левулиновой кислоты в воде. Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции.

Для обработки (см. раздел Схема терапии) левулиновую кислоту (Sigma, № продукта: W262706) разбавляли до 0,03 или 0,3% в воде. Раствор затем помещали в пробирку Eppendorf на 1,5 мл с черешком конских бобов, лист на котором также был залит растворами, и отверстие пробирки закрывали парафильмом. Эту систему вскармливания затем помещали в глубокую чашку Петри (Fisher Scientific, № по кат. FB0875711), и тлей наносили на листья растения.

Для каждой обработки на каждый лист помещали 57-59 тлей. Системы вскармливания заменяли каждые 2-3 дня на протяжении всего эксперимента. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли из глубокой чашки Петри в случае их обнаружения.

Помимо этого, стадию развития (личинки 1-го, 2-го, 3-го, 4-го и 5-го возраста) определяли ежедневно на протяжении всего эксперимента.

Через 7 дней после обработки ДНК экстрагировали из оставшихся тлей в каждой группе обработки. Вкратце, поверхность тела тлей стерилизовали путем погружения тли в 6% раствор отбеливателя примерно на 5 секунд. Затем тлей промывали в стерильной воде, и ДНК экстрагировали из каждой отдельной тли с помощью набора для экстракции ДНК (Qiagen, набор DNeasy) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию ДНК измеряли посредством количественной оценки нуклеиновой кислоты с использованием NanoDrop, и число копий ДНК Buchnera и тлей измеряли с помощью qPCR. Праймерами, используемыми для Buchnera, были Buch_groES_18F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 240) и Buch_groES_98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO: 241) (Chong and Moran, 2016 PNAS). Праймерами, используемыми для тлей, были ApEF1a 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG; SEQ ID NO: 242) и ApEF1a 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO: 243) (Chong and Moran, 2016 PNAS). qPCR проводили с использованием скорости линейного изменения для qPCR-амплификации 1,6 градуса C/с и следующих условий: 1) 95°C в течение 10 минут, 2) 95°C в течение 15 секунд, 3) 55°C в течение 30 секунд, 4) повторение этапов 2-3 40x, 5) 95°C в течение 15 секунд, 6) 55°C в течение 1 минуты, 7) изменение скорости линейного изменения до 0,15 градуса C/с, 8) 95°C в течение 1 секунды. Данные qPCR анализировали с помощью аналитического программного обеспечения (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).

Имела место дозозависимая отрицательная реакция в отношении приспособленности насекомых при обработке левулиновой кислотой

Тлей A. pisum eNASCO на стадии личинок 1-го и 2-го возраста разделяли на три отдельные группы обработки, как определено в разделе Схема эксперимента (выше). Тлей отслеживали ежедневно, и определяли число тлей на каждой стадии развития. Тли, обработанные только отрицательным контролем, начинали достигать зрелого возраста (стадии личинок 5-го возраста) примерно через 7 дней (фиг. 27). Развитие задерживалось у тлей, обработанных левулиновой кислотой, а через 11 дней после обработки практически все тли, обработанные контролем, достигали зрелого возраста, тогда как ~23 и 63% тлей, обработанных 0,03 и 0,3% левулиновой кислотой соответственно, не дозревали дальше чем до стадии личинок 4-го возраста. Эти данные указывают на то, что обработка левулиновой кислотой задерживала и останавливала прогрессирование развития тлей, и эта задержка в развитии зависела от дозы вводимой левулиновой кислоты.

Обработка левулиновой кислотой приводит к повышенной смертности тлей

Показатель выживаемости тлей также измеряли в ходе обработок. Примерно 50% тлей, обработанных только контролем, выживали после 11-дневного эксперимента (фиг. 28). В отличие от этого, выживаемость была значимо меньшей у тлей, обработанных 0,3% левулиновой кислотой (p<0,01). Тли, обработанные низкой дозой левулиновой кислоты (0,03%), имели более высокую смертность по сравнению с тлями, обработанными контролем, несмотря на то, что различие не достигало статистической значимости. Эти данные указывают на то, что имело место дозозависимое снижение выживаемости при обработке левулиновой кислотой.

Обработка левулиновой кислотой приводит к снижению количества Buchnera у тлей

В частности, для исследования того, приводила ли обработка левулиновой кислотой к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 7 дней после обработки, и проводили qPCR для определения числа копий Buchnera/тлей. Тли, обработанные только контролем, имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей. В отличие от этого, тли, обработанные 0,03 или 0,3% левулиновой кислотой в воде, имели в ~6 раз меньше копий ДНК Buchnera/тлей через 7 дней после обработки (фиг. 29, левая панель). Эти данные указывают на то, что обработка левулиновой кислотой снижала уровни Buchnera.

В совокупности эти данные, описанные ранее, демонстрировали способность уничтожать тлей и уменьшать их интенсивность развития, продолжительность жизни и эндогенные популяции бактерий, например, приспособленность, посредством их обработки левулиновой кислотой.

Пример 18. Насекомые, обработанные раствором вторичного метаболита растительного происхождения

Данный пример демонстрирует обработку тлей госсиполуксусной кислотой, природным фенолом, получаемым из хлопчатника (род Gossypium), который проникает в клетку и выступает в качестве ингибитора для нескольких ферментов дегидрогеназ. Данный пример демонстрирует, что влияние госсипола на насекомых было опосредовано модулированием популяций бактерий, эндогенных по отношению к насекомым, которые были восприимчивыми к госсиполу. Одним штаммом бактерий-мишеней является Buchnera aphidicola.

Схема терапии. Раствор госсипола составляли в зависимости от способа доставки.

1) Через растения: с 0 (отрицательный контроль) или 0,5%, 0,25% и 0,05% госсипола, составленного в искусственном рационе (согласно Akey and Beck, 1971; см. раздел Схема эксперимента) без незаменимых аминокислот (гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, фенилаланина, треонина, триптофана и валина).

2) Микроинъекция: растворы для инъекций представляли собой 0,5% госсипол или только искусственный рацион (отрицательный контроль).

Доставка через растения - схема эксперимента

Тлей (линии eNASCO (в которых содержатся как первичные, так и вторичные симбионты Buchnera и Serratia соответственно) или LSR-1 (в которых содержатся только Buchnera), Acyrthosiphon pisum) выращивали на растениях конских бобов (бобы Vroma vicia от Johnny's Selected Seeds) в инкубаторе с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света/8 ч. темноты; 60±5% RH; 25±2°C). Перед использованием для выкармливания тлей растения конских бобов выращивали в почвенной смеси для горшечных культур при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5-10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5-7 дней. Для экспериментов тлей на стадии личинок первого и второго возраста собирали со здоровых растений и разделяли на 4 различные группы обработки: 1) только искусственный рацион без незаменимых аминокислот, 2) только искусственный рацион без незаменимых аминокислот и 0,05% госсипол, 3) только искусственный рацион без незаменимых аминокислот и 0,25% госсипол и 4) только искусственный рацион без незаменимых аминокислот и 0,5% госсипол. Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции.

Используемый искусственный рацион готовили, как описано ранее (Akey and Beck, 1971 Continuous Rearing of the Pea Aphid, Acyrthosiphon pisum, on a Holidic Diet), с незаменимыми аминокислотами и без них (2 мг/мл гистидина, 2 мг/мл изолейцина, 2 мг/мл лейцина, 2 мг/мл лизина, 1 мг/мл метионина, 1,62 мг/мл фенилаланина, 2 мг/мл треонина, 1 мг/мл триптофана и 2 мг/мл валина), за исключением того, что ни в одном случае рацион не включал гомосерин или бета-аланилтирозин. Значение pH рационов доводили до 7,5 с помощью KOH, и рационы стерилизовали фильтрацией с помощью фильтра с размером пор 0,22 мкм и хранили при 4°C в течение короткого срока (<7 дней) или при -80°C в течение длительного срока.

Исходный раствор госсиполуксусной кислоты (Sigma, № по кат. G4382-250MG) готовили в концентрации 5% в метаноле и стерилизовали путем пропускания через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранили при 4°C. Для обработок (см. раздел Схема терапии) подходящее количество исходного раствора добавляли к искусственному рациону с получением различных конечных концентраций госсипола. Рацион затем помещали в пробирку Eppendorf на 1,5 мл с черешком и листом конских бобов, и отверстие пробирки закрывали парафильмом. Эту систему вскармливания затем помещали в глубокую чашку Петри (Fisher Scientific, № по кат. FB0875711), и тлей наносили на листья растения.

Для каждой обработки на каждый лист помещали 15-87 тлей. Системы вскармливания искусственным рационом заменяли каждые 2-3 дня на протяжении всего эксперимента. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли из глубокой чашки Петри, в которой содержалась система вскармливания искусственным рационом, в случае их обнаружения.

Помимо этого, стадию развития (личинки 1-го, 2-го, 3-го, 4-го, 5-го возраста и 5R (размножающиеся личинки 5-го возраста)) определяли ежедневно на протяжении всего эксперимента. При достижении тлями стадии личинок 4-го возраста им предоставляли их собственные искусственные системы вскармливания в глубокой чашке Петри для того, чтобы можно было контролировать плодовитость, как только они достигали зрелого возраста.

В случае взрослых тлей новых нимф считали ежедневно и затем исключали. В конце экспериментов плодовитость измеряли двумя способами: 1) средний день, в который был определен первый потомок в группе обработки, и 2) среднее число потомков, образуемых ежедневно после достижения тлей зрелого возраста. Снимки тлей получали на протяжении всего эксперимента для оценивания различий в размерах между группами обработки.

Через 5 или 13 дней после обработки ДНК экстрагировали из нескольких тлей из каждой группы обработки. Вкратце, поверхность тела тлей стерилизовали путем погружения тли в 6% раствор отбеливателя примерно на 5 секунд. Затем тлей промывали в стерильной воде, и ДНК экстрагировали из каждой отдельной тли с помощью набора для экстракции ДНК (Qiagen, набор DNeasy) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию ДНК измеряли посредством количественной оценки нуклеиновой кислоты с использованием NanoDrop, и число копий ДНК Buchnera и тлей измеряли с помощью qPCR. Праймерами, используемыми для Buchnera, были Buch_groES_18F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 240) и Buch_groES_98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO: 241) (Chong and Moran, 2016 PNAS). Праймерами, используемыми для тлей, были ApEF1a 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG; SEQ ID NO: 242) и ApEF1a 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO: 243) (Chong and Moran, 2016 PNAS). qPCR проводили с использованием скорости линейного изменения для qPCR-амплификации 1,6 градуса C/с и следующих условий: 1) 95°C в течение 10 минут, 2) 95°C в течение 15 секунд, 3) 55°C в течение 30 секунд, 4) повторение этапов 2-3 40x, 5) 95°C в течение 15 секунд, 6) 55°C в течение 1 минуты, 7) изменение скорости линейного изменения до 0,15 градуса C/с, 8) 95°C в течение 1 секунды. Данные qPCR анализировали с помощью аналитического программного обеспечения (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).

Имела место дозозависимая отрицательная реакция в отношении приспособленности насекомых при обработке аллелохимикатом госсиполом

Тлей A. pisum eNASCO и LSR-1 на стадии личинок 1-го и 2-го возраста разделяли на четыре отдельные группы обработки, как определено в разделе Схема эксперимента (что описано в данном документе). Тлей отслеживали ежедневно, и определяли число тлей на каждой стадии развития. Тли, обработанные только искусственным рационом, начинали достигать зрелого возраста (стадии личинок 5-го возраста) примерно через 3 дней (фиг. 30A). Развитие задерживалось у тлей, обработанных госсиполом, и через 5 дней после обработки с помощью 0,5% госсипола большинство тлей не дозревали дальше чем до стадии личинок 3-го возраста, и их размер также подвергался отрицательному влиянию (фиг. 30A и 30B). Эти данные указывают на то, что обработка госсиполом задерживала и останавливала прогрессирование развития тлей, и эта реакция была дозозависимой.

Обработка госсиполом повышала смертность тлей

Показатель выживаемости тлей также измеряли в ходе обработок. Большинство тлей, обработанных только искусственным рационом без незаменимых аминокислот, были живыми через 2 дней после обработки (фиг. 31). Через 4 дня тли начинали постепенно погибать, а некоторые выживали по истечении 7 дней после обработки.

В отличие от этого, тли, обработанные 0,25 (отсутствие значимых различий по сравнению с контролем, p=0,2794) и 0,5% госсиполом, имели более низкие показатели выживаемости, чем тли, обработанные только искусственным рационом, при этом при обработке 0,5% госсиполом наблюдались значимые различия по сравнению с контролем AD без EAA (p=0,002). Тли, обработанные 0,5% госсиполом, начинали погибать через 2 дня после обработки, и все тли погибали вследствие обработки через 4 дней. Тли, обработанные 0,25%, выживали немного дольше, чем тли, обработанные 0,5%, однако также подвергались существенному отрицательному влиянию. Эти данные указывают на то, что имело место дозозависимое снижение выживаемости при обработке аллелохимикатом госсиполом.

Обработка госсиполом снижала интенсивность размножения тлей

В ходе обработок также отслеживали плодовитость тлей. Через 7 и 8 дней после обработки большинство взрослых тлей, обработанных искусственным рационом без незаменимых аминокислот, начинали размножаться. Среднее число потомков, образуемых ежедневно после достижения зрелого возраста тлями, обработанными искусственным рационом без добавления незаменимых аминокислот, составляло примерно 5 (фиг. 32A и 32B).

В отличие от этого, тли, обработанные 0,25% госсиполом, демонстрировали снижение темпов достижения зрелого возраста и образования потомков. Эти данные указывают на то, что обработка госсиполом приводила к уменьшению интенсивности размножения тлей.

Обработка госсиполом снижала количество Buchnera у тлей

В частности, для исследования того, приводили ли различные концентрации госсипола к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 5 или 13 дней после обработки, и проводили qPCR для определения числа копий Buchnera/тлей. Тли, обработанные только искусственным рационом без незаменимых аминокислот (контролем), имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей. В отличие от этого, тли, обработанные 0,25 и 0,5% госсиполом, имели в ~4 раза меньше копий ДНК Buchnera/тлей (фиг. 33), что указывало на то, что обработка госсиполом снижала уровни Buchnera, и что это снижение было зависимым от концентрации.

Доставка путем микроинъекции - схема эксперимента

Микроинъекцию осуществляли с помощью автоматического нанолитрового инъектора NanoJet III с выдвижной иглой из боросиликатного стекла собственного изготовления (Drummond Scientific; № по кат. 3-000-203-G/XL). Тлей (линии LSR-1, A. pisum) выращивали на растениях конских бобов, как описано в предыдущем примере. В каждой группе обработки было примерно одно и то же число получивших инъекцию особей с каждого из растений коллекции. Нимфы тлей (на стадии личинок < 3-го возраста) переносили с помощью малярной кисти в трубную систему, подсоединенную к вакууму, и им в брюшную часть груди вводили микроинъекцию 20 нл искусственного рациона без незаменимых аминокислот (отрицательный контроль) или 0,05% раствора госсипола в искусственном рационе без незаменимых аминокислот. После инъекции тлей помещали в глубокую чашку Петри с листом конских бобов, черешок которого находился в 2% агаре.

Обработка антибиотиками путем микроинъекции снижала количество Buchnera у тлей

Для исследования того, приводил ли госсипол, доставляемый посредством микроинъекции, к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, как было продемонстрировано в предыдущих примерах, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 4 дня после обработки, и проводили qPCR, как описано в предыдущем примере, для определения числа копий Buchnera/тлей.

Тли, получившие микроинъекцию отрицательного контроля, имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей. В отличие от этого, нимфы и взрослые особи тлей, получившие микроинъекцию госсипола, характеризовались существенным снижением числа копий ДНК Buchnera/тлей (фиг. 34), что указывало на то, что обработка путем микроинъекции госсипола уменьшала присутствие эндосимбиотических Buchnera, и, как показано в предыдущих примерах, это приводило к снижению приспособленности.

В совокупности эти данные, описанные в предыдущих примерах, демонстрировали способность уничтожать тлей и уменьшать их интенсивность развития, способность к размножению, продолжительность жизни и эндогенные популяции бактерий, например, приспособленность, посредством их обработки раствором вторичного метаболита растений с помощью нескольких путей доставки.

Пример 19. Насекомые, обработанные природным противомикробным соединением растительного происхождения транс-коричным альдегидом

Этот пример демонстрирует, что обработка тлей транс-коричным альдегидом, природным ароматическим альдегидом, который представляет собой основной компонент экстракта коры коричного дерева (Cinnamomum zeylanicum), приводит к снижению приспособленности. Также было показано, что транс-коричный альдегид характеризуется противомикробной активностью в отношении как грамотрицательных, так и грамположительных организмов, несмотря на то, что точный механизм осуществления его противомикробной активности остается неясным. Транс-коричный альдегид может разрушать клеточные мембраны бактерий и ингибировать специфические клеточные процессы или ферменты (Gill and Holley, 2004 Applied Environmental Microbiology). Данный пример демонстрирует, что влияние транс-коричного альдегида на насекомых было опосредовано модулированием популяций бактерий, эндогенных по отношению к насекомым, которые были восприимчивыми к транс-коричному альдегиду. Одним штаммом бактерий-мишеней является Buchnera aphidicola.

Схема терапии

Транс-коричный альдегид разбавляли до 0,05%, 0,5% или 5% в воде и доставляли посредством заливания в листья (~1 мл инъецировали в листья) и через растения.

Схема эксперимента

Тлей (линии LSR-1 (в которых содержатся только Buchnera), Acyrthosiphon pisum) выращивали на растениях конских бобов (бобы Vroma vicia от Johnny's Selected Seeds) в инкубаторе с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света/8 ч. темноты; 60±5% RH; 25±2°C). Перед использованием для выкармливания тлей растения конских бобов выращивали в почвенной смеси для горшечных культур при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5-10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5-7 дней. Для экспериментов тлей на стадии личинок первого и второго возраста собирали со здоровых растений и разделяли на четыре различные группы обработки: 1) контроли, обработанные водой, 2) 0,05% транс-коричный альдегид в воде, 3) 0,5% транс-коричный альдегид в воде и 4) 5% транс-коричный альдегид в воде. Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции.

Транс-коричный альдегид (Sigma, № по кат. C80687) разбавляли до соответствующей концентрации в воде (см. раздел Схема терапии), стерилизовали путем пропускания через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранили при 4°C. В листья конских бобов инъецировали примерно 1 мл средства для обработки, и затем лист помещали в пробирку Eppendorf на 1,5 мл, содержащую тот же самый раствор для обработки. Отверстие пробирки, в которую помещали черешок конских бобов, закрывали парафильмом. Эту систему вскармливания для обработки затем помещали в глубокую чашку Петри (Fisher Scientific, № по кат. FB0875711), и тлей наносили на листья растения.

Для каждой обработки на каждый лист помещали 40-49 тлей. Системы вскармливания для обработки заменяли каждые 2-3 дня на протяжении всего эксперимента. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли из глубокой чашки Петри, в которой содержалась система вскармливания для обработки, в случае их обнаружения.

Помимо этого, стадию развития (личинки 1-го, 2-го, 3-го, 4-го, 5-го возраста и 5R (размножающиеся личинки 5-го возраста)) определяли ежедневно на протяжении всего эксперимента.

Через 3 дней после обработки ДНК экстрагировали из оставшихся живых тлей в каждой группе обработки. Вкратце, поверхность тела тлей стерилизовали путем погружения тли в 6% раствор отбеливателя примерно на 5 секунд. Затем тлей промывали в стерильной воде, и ДНК экстрагировали из каждой отдельной тли с помощью набора для экстракции ДНК (Qiagen, набор DNeasy) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию ДНК измеряли посредством количественной оценки нуклеиновой кислоты с использованием NanoDrop, и число копий ДНК Buchnera и тлей измеряли с помощью qPCR. Праймерами, используемыми для Buchnera, были Buch_groES_18F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 240) и Buch_groES_98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO: 241) (Chong and Moran, 2016 PNAS). Праймерами, используемыми для тлей, были ApEF1a 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG; SEQ ID NO: 242) и ApEF1a 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO: 243) (Chong and Moran, 2016 PNAS). qPCR проводили с использованием скорости линейного изменения для qPCR-амплификации 1,6 градуса C/с и следующих условий: 1) 95°C в течение 10 минут, 2) 95°C в течение 15 секунд, 3) 55°C в течение 30 секунд, 4) повторение этапов 2-3 40x, 5) 95°C в течение 15 секунд, 6) 55°C в течение 1 минуты, 7) изменение скорости линейного изменения до 0,15 градуса C/с, 8) 95°C в течение 1 секунды. Данные qPCR анализировали с помощью аналитического программного обеспечения (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).

Имела место дозозависимая отрицательная реакция в отношении приспособленности насекомых при обработке природным противомикробным транс-коричным альдегидом

Тлей A. pisum LSR-1 на стадии личинок 1-го и 2-го возраста разделяли на четыре отдельные группы обработки, как определено в разделе Схема эксперимента (что описано в данном документе). Тлей отслеживали ежедневно, и определяли число тлей на каждой стадии развития. Тли, обработанные только водой, начинали достигать стадии личинок 3-го возраста примерно через 3 дня после обработки (фиг. 35). Развитие задерживалось у тлей, обработанных транс-коричным альдегидом, и через 3 дня после обработки каждой из трех концентраций транс-коричного альдегида ни одна из тлей не дозревала до стадии личинок более чем второго возраста (фиг. 35). Кроме того, все тли, обработанные наиболее высокой концентрацией транс-коричного альдегида (5%), оставались на стадии личинок 1-го возраста на протяжении всего эксперимента. Эти данные указывают на то, что обработка транс-коричным альдегидом задерживала и останавливала прогрессирование развития тлей, и эта реакция была дозозависимой.

Обработка транс-коричным альдегидом повышала смертность тлей

Показатель выживаемости тлей также измеряли в ходе обработок. Примерно 75 процентов тлей, обработанных только водой, были живыми через 3 дня после обработки (фиг. 36). В отличие от этого, тли, обработанные 0,05%, 0,5% и 5% транс-коричным альдегидом, имели значимо более низкие (p<0,0001 в каждой группе обработки по сравнению с контролем, обработанным водой) показатели выживаемости, чем тли, обработанные только водой. Эти данные указывают на то, что имело место дозозависимое снижение выживаемости при обработке природным противомикробным транс-коричным альдегидом.

Обработка транс-коричным альдегидом снижала количество Buchnera у тлей

В частности, для исследования того, приводили ли различные концентрации транс-коричного альдегида к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 3 дня после обработки, и проводили qPCR для определения числа копий Buchnera/тлей. Тли, обработанные только водой (контролем), имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей. Аналогичным образом, тли, обработанные наиболее низкой концентрацией транс-коричного альдегида (0,5%), имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей.

В отличие от этого, тли, обработанные 0,5 и 5% транс-коричным альдегидом, имели в ~870 раз меньше копий ДНК Buchnera/тлей (фиг. 37), что указывало на то, что обработка транс-коричным альдегидом снижала уровни Buchnera, и что это снижение было зависимым от концентрации.

В совокупности эти данные, описанные в предыдущих примерах, демонстрируют способность уничтожать тлей и уменьшать их интенсивность развития, способность к размножению, продолжительность жизни и эндогенные популяции бактерий, например, приспособленность, посредством их обработки раствором вторичного метаболита растений с помощью нескольких путей доставки.

Пример 20. Насекомые, обработанные противомикробными пептидами скорпиона

Этот пример демонстрирует обработку тлей несколькими противомикробными пептидами скорпиона (AMP), из которых несколько AMP были идентифицированы в транскриптоме ядовитой железы скорпиона Urodacus yaschenkoi (Luna-Ramirez et al., 2017, Toxins). AMP в типичном случае имеют суммарный положительный заряд и, таким образом, высокое сродство к мембранам бактерий. Данный пример демонстрирует, что влияние AMP на насекомых было опосредовано модулированием популяций бактерий, эндогенных по отношению к насекомым, которые были восприимчивыми к пептидам AMP. Одним штаммом бактерий-мишеней является Buchnera aphidicola, облигатный симбионт тлей.

Схема терапии

Раствор Uy192 составляли для использования в комбинации заливания в листья и доставки через растения. Контрольный раствор инъецировали в листья с использованием воды+синего пищевого красителя и воды в пробирке. Раствор для обработки состоял из 100 мкг/мл Uy192 в воде для инъекции в листья (с синим пищевым красителем) и доставки через растение (в пробирке Eppendorf).

Заливание в листья и доставка через растения - схема эксперимента

Тлей LSR-1 (в которых содержатся только Buchnera) Acyrthosiphon pisum выращивали на растениях конских бобов (бобы Vroma vicia от Johnny's Selected Seeds) в инкубаторе с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света/8 ч. темноты; 60±5% RH; 20±2°C). Перед использованием для выкармливания тлей растения конских бобов выращивали в почвенной смеси для горшечных культур при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5-10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5-7 дней. Для экспериментов тлей на стадии личинок первого и второго возраста собирали со здоровых растений и разделяли на 2 различные группы обработки: 1) отрицательный контроль (обработка водой), 2) раствор для обработки, содержащий 100 мкг/мл AMP в воде. Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции.

Uy192 синтезировали в Bio-Synthesis с чистотой >75%. 1 мг лиофилизированного пептида разводили в 500 мкл 80% ацетонитрила, 20% воды и 0,1% TFA, 100 мкл (100 мкг) разделяли на аликвоты в 10 отдельных пробирок Eppendorf и оставляли высыхать. Для обработки (см. раздел Схема терапии) 1 мл воды добавляли к 100 мкг аликвоты пептида с получением конечной концентрации Uy192 (100 мкг/мл). Раствор затем помещали в пробирку Eppendorf на 1,5 мл с черешком конских бобов, лист на котором также был залит растворами, и отверстие пробирки закрывали парафильмом. Эту систему вскармливания затем помещали в глубокую чашку Петри (Fisher Scientific, № по кат. FB0875711), и тлей наносили на листья растения.

Для каждой обработки на каждый лист помещали 50 тлей. Системы вскармливания заменяли каждые 2-3 дня на протяжении всего эксперимента. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли из глубокой чашки Петри в случае их обнаружения.

Помимо этого, стадию развития (личинки 1-го, 2-го, 3-го, 4-го, 5-го возраста и 5R (размножающиеся личинки 5-го возраста)) определяли ежедневно на протяжении всего эксперимента.

Через 8 дней после обработки ДНК экстрагировали из оставшихся тлей в каждой группе обработки. Вкратце, поверхность тела тлей стерилизовали путем погружения тли в 6% раствор отбеливателя примерно на 5 секунд. Затем тлей промывали в стерильной воде, и ДНК экстрагировали из каждой отдельной тли с помощью набора для экстракции ДНК (Qiagen, набор DNeasy) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию ДНК измеряли посредством количественной оценки нуклеиновой кислоты с использованием NanoDrop, и число копий ДНК Buchnera и тлей измеряли с помощью qPCR. Праймерами, используемыми для Buchnera, были Buch_groES_18F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 240) и Buch_groES_98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO: 241) (Chong and Moran, 2016 PNAS). Праймерами, используемыми для тлей, были ApEF1a 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG; SEQ ID NO: 242) и ApEF1a 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO: 243) (Chong and Moran, 2016 PNAS). qPCR проводили с использованием скорости линейного изменения для qPCR-амплификации 1,6 градуса C/с и следующих условий: 1) 95°C в течение 10 минут, 2) 95°C в течение 15 секунд, 3) 55°C в течение 30 секунд, 4) повторение этапов 2-3 40x, 5) 95°C в течение 15 секунд, 6) 55°C в течение 1 минуты, 7) изменение скорости линейного изменения до 0,15 градуса C/с, 8) 95°C в течение 1 секунды. Данные qPCR анализировали с помощью аналитического программного обеспечения (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).

Имела место отрицательная реакция в отношении приспособленности насекомых при обработке AMP скорпиона

Тлей A. pisum LSR-1 на стадии личинок 1-го и 2-го возраста разделяли на две отдельные группы обработки, как определено в разделе Схема эксперимента (выше). Тлей отслеживали ежедневно, и определяли число тлей на каждой стадии развития. Тли, обработанные только отрицательным контролем, начинали достигать зрелого возраста (стадии личинок 5-го возраста) примерно через 6 дней (фиг. 38). Развитие задерживалось у тлей, обработанных Uy192, а через 8 дней после обработки тли не дозревали дальше чем до стадии личинок 4-го возраста. Эти данные указывают на то, что обработка с помощью Uy192 задерживала и останавливала прогрессирование развития тлей.

Обработка с помощью AMP скорпиона приводит к повышенной смертности тлей

Показатель выживаемости тлей также измеряли в ходе обработок. Большинство тлей, обработанных только контролем, были живыми через 3 дня после обработки (фиг. 39). Через 4 дня тли начинали постепенно погибать, а некоторые выживали по истечении 7 дней после обработки.

В отличие от этого, тли, обработанные с помощью Uy192, имели более низкие показатели выживаемости, чем тли, обработанные контролем. Эти данные указывают на то, что имело место снижение выживаемости при обработке с помощью АМР скорпиона Uy192.

Обработка с помощью АМР скорпиона Uy192 приводит к снижению количества Buchnera у тлей

В частности, для исследования того, приводила ли обработка с помощью Uy192 к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 8 дней после обработки, и проводили qPCR для определения числа копий Buchnera/тлей. Тли, обработанные только контролем, имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей. В отличие от этого, тли, обработанные с помощью 100 мкг/мл Uy192 в воде, имели в ~7 раз меньше копий ДНК Buchnera/тлей (фиг. 40), что указывало на то, что обработка с помощью Uy192 снижала уровни Buchnera.

В совокупности эти данные, описанные ранее, демонстрировали способность уничтожать тлей и уменьшать их интенсивность развития, продолжительность жизни и эндогенные популяции бактерий, например, приспособленность, посредством их обработки природным противомикробным пептидом скорпиона.

Пример 21. Насекомые, обработанные противомикробными пептидами скорпиона

Этот пример демонстрирует обработку тлей несколькими противомикробными пептидами скорпиона (AMP) D10, D3, Uyct3 и Uy17 - AMP, которые недавно были идентифицированы в транскриптоме ядовитой железы скорпиона Urodacus yaschenkoi (Luna-Ramirez et al., 2017, Toxins). AMP в типичном случае имеют суммарный положительный заряд и, таким образом, высокое сродство к мембранам бактерий. Данный пример демонстрирует, что влияние AMP на насекомых было опосредовано модулированием популяций бактерий, эндогенных по отношению к насекомым, которые были восприимчивыми к пептидам AMP. Одним штаммом бактерий-мишеней является Buchnera aphidicola, облигатный симбионт тлей.

Тли представляют собой сельскохозяйственных насекомых-вредителей, причиняющих непосредственный вред растению в результате кормления и выступающих в качестве переносчиков вирусов растений. Помимо этого, медвяная падь тлей способствует росту плесневых налетов грибов и привлекает вредоносных муравьев. Применение средств химической обработки, к сожалению, по-прежнему остается широко распространенным, что приводит к отбору устойчивых особей, уничтожение которых становится все более сложным.

Схема терапии

Указанный пептид или коктейль пептидов (более подробно см. нижеприведенные разделы Микроинъекция тлям - схема эксперимента и Заливание в листья и доставка через растения - схема эксперимента) вводили путем прямой микроинъекции тлям или доставляли посредством комбинации заливания в листья и доставки через растения. В качестве отрицательного контроля тлям вводили путем микроинъекции воду (в экспериментах по микроинъекции), или их помещали на листья, в которые была произведена инъекция воды, и в воду в пробирке (для экспериментов по заливанию в листья и доставке через растение). Растворы для обработки состояли из 20 нл 5 мкг/мл D3 или D10, растворенных в воде (для микроинъекций тлям), или 40 мкг/мл коктейля из D10, Uy17, D3 и UyCt3 в воде для инъекции в листья и доставки через растение (в пробирке Eppendorf).

Микроинъекция тлям - схема эксперимента

Микроинъекцию осуществляли с помощью автоматического нанолитрового инъектора NanoJet III с выдвижной иглой из боросиликатного стекла собственного изготовления (Drummond Scientific; № по кат. 3-000-203-G/XL). Тлей (линии LSR-1, Acyrthosiphon pisum) выращивали на растениях конских бобов (бобы Vroma vicia от Johnny's Selected Seeds) в инкубаторе с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света/8 ч. темноты; 60±5% RH; 25±2°C). Перед использованием для выкармливания тлей растения конских бобов выращивали в почвенной смеси для горшечных культур при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5-10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5-7 дней. В каждой группе обработки было примерно одно и то же число получивших инъекцию особей с каждого из растений коллекции. Взрослым тлям вводили микроинъекцию 20 нл воды или 100 нг (20 мкл 5 мкг/мл раствора) пептида D3 или D10 в брюшную часть груди. Скорость микроинъекции составляла 5 нл/сек. После инъекции тлей помещали в глубокую чашку Петри, содержащую лист конских бобов, черешок которого находился в 2% агаре.

Пептиды синтезировали в Bio-Synthesis с чистотой >75%. 1 мг лиофилизированного пептида разводили в 500 мкл 80% ацетонитрила, 20% воды и 0,1% TFA, 100 мкл (100 мкг) разделяли на аликвоты в 10 отдельных пробирок Eppendorf и оставляли высыхать.

Через 5 дней после обработки ДНК экстрагировали из оставшихся тлей в каждой группе обработки. Вкратце, поверхность тела тлей стерилизовали путем погружения тли в 6% раствор отбеливателя примерно на 5 секунд. Затем тлей промывали в стерильной воде, и ДНК экстрагировали из каждой отдельной тли с помощью набора для экстракции ДНК (Qiagen, набор DNeasy) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию ДНК измеряли посредством количественной оценки нуклеиновой кислоты с использованием NanoDrop, и число копий ДНК Buchnera и тлей измеряли с помощью qPCR. Праймерами, используемыми для Buchnera, были Buch_groES_18F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 240) и Buch_groES_98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO: 241) (Chong and Moran, 2016 PNAS). Праймерами, используемыми для тлей, были ApEF1a 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG; SEQ ID NO: 242) и ApEF1a 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO: 243) (Chong and Moran, 2016 PNAS). qPCR проводили с использованием скорости линейного изменения для qPCR-амплификации 1,6 градуса C/с и следующих условий: 1) 95°C в течение 10 минут, 2) 95°C в течение 15 секунд, 3) 55°C в течение 30 секунд, 4) повторение этапов 2-3 40x, 5) 95°C в течение 15 секунд, 6) 55°C в течение 1 минуты, 7) изменение скорости линейного изменения до 0,15 градуса C/с, 8) 95°C в течение 1 секунды. Данные qPCR анализировали с помощью аналитического программного обеспечения (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).

Микроинъекция тлям пептидов скорпиона D3 и D10 приводит к снижению выживаемости насекомых

Тлей A. pisum LSR-1 на стадии личинок 1-го и 2-го возраста разделяли на три отдельные группы обработки, как определено в разделе Схема эксперимента (что описано в данном документе). Тлей отслеживали ежедневно, и определяли показатель выживаемости. Через 5 дней после обработки тли, которым инъецировали пептиды скорпиона, имели более низкие показатели выживаемости по сравнению с контрольными особями, которым инъецировали воду (9, 35 и 45% выживаемость в случае инъекции D3, D10 и воды соответственно) (фиг. 41). Эти данные указывают на то, что имело место снижение выживаемости при обработке с помощью АМР скорпиона D3 и D10.

Микроинъекция тлей пептидами скорпиона D3 и D10 приводит к снижению количества эндосимбионтов Buchnera

В частности, для исследования того, приводила ли инъекция AMP скорпиона D3 и D10 к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 5 дней после инъекции, и проводили qPCR для определения числа копий Buchnera/тлей. Тли, которым инъецировали только воду, имели высокие соотношения количества ДНК Buchnera/тлей (47,4), тогда как тли, которым инъецировали D3 и D10, имели более низкие соотношения количества ДНК Buchnera/тлей (25,3 и 30,9 соответственно) (фиг. 42). Эти данные указывают на то, что обработка пептидами скорпиона D3 и D10 приводила к снижению уровней бактерий-симбионтов Buchnera.

Заливание в листья и доставка через растения - схема эксперимента

Тлей Acyrthosiphon pisum eNASCO (в которых содержатся Buchnera и Serratia) выращивали на растениях конских бобов (бобы Vroma vicia от Johnny's Selected Seeds), как описано выше. Для экспериментов тлей на стадии личинок первого и второго возраста собирали со здоровых растений и разделяли на 2 различные группы обработки: 1) отрицательный контроль (обработка водой), 2) раствор для обработки, состоящий из 40 мкг/мл каждого из D10, Uy17, D3 и UyCt3 в воде. Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции.

Пептиды синтезировали, растворяли и разделяли на аликвоты, как описано выше. Для обработки (см. раздел Схема терапии) воду добавляли к 100 мкг аликвоты пептида с получением необходимой конечной концентрации (40 мкг/мл). Четыре пептида объединяли с получением раствора коктейля пептидов. Этот раствор применяли для заливания в листья путем инъекции. После инъекции черешки листьев, в которые была произведена инъекция, помещали в пробирку Eppendorf на 1,5 мл, которую затем запечатывали парафильмом. Эту систему вскармливания затем помещали в глубокую чашку Петри (Fisher Scientific, № по кат. FB0875711), и тлей наносили на листья растения.

Для каждой обработки на каждый лист помещали 41-49 тлей. Системы вскармливания заменяли каждые 2-3 дня на протяжении всего эксперимента. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли из глубокой чашки Петри в случае их обнаружения.

Обработка коктейлем пептидов скорпиона приводит к повышенной смертности тлей

Показатель выживаемости тлей также измеряли в ходе обработок. Через 6 дней после обработки тли, обработанные коктейлем пептидов, имели более низкие показатели выживаемости по сравнению с тлями, обработанными водой, а через 9 дней эффект был более очевидным (16 и 29% выживаемость в случае обработки коктейлем пептидов и водой соответственно) (фиг. 43). Эти данные указывают на то, что имело место снижение выживаемости при обработке коктейлем AMP скорпиона, и, как показано в предыдущих примерах, эти AMP снижали уровни эндосимбионтов у тлей.

В совокупности эти данные, описанные ранее, демонстрировали способность уничтожать тлей и уменьшать их продолжительность жизни и эндогенные популяции бактерий, например, приспособленность, посредством их обработки отдельным природным противомикробным пептидом скорпиона или коктейлем пептидов.

Пример 22. Насекомые, обработанные противомикробным пептидом, слитым с пептидом, проникающим в клетку

Данный пример демонстрирует обработку тлей противомикробным пептидом скорпиона (AMP) (Uy192), слитым с пептидом, проникающим в клетку, полученным из вируса. AMP Uy192 представляет собой один из нескольких недавно идентифицированных AMP в транскриптоме ядовитой железы скорпиона Urodacus yaschenkoi (Luna-Ramirez et al., 2017, Toxins). AMP в типичном случае имеют суммарный положительный заряд и, таким образом, высокое сродство к мембранам бактерий. Для усиления доставки пептида скорпиона Uy192 в клетки тлей пептид синтезировали слитым с частью белка-трансактиватора транскрипции (TAT) вируса иммунодефицита человека I (HIV-1). Предыдущие исследования показали, что конъюгирование этого пептида, проникающего в клетку (CPP), с другими молекулами увеличивало их поглощение клетками путем трансдукции (Zhou et al., 2015 Journal of Insect Science and Cermenati et al., 2011 Journal of Insect Physiology). Данный пример демонстрирует, что влияние слитого пептида на насекомых было опосредовано модулированием популяций бактерий, эндогенных по отношению к насекомым, которые были восприимчивыми к противомикробному пептиду. Одним штаммом бактерий-мишеней является Buchnera.

Схема терапии

Пептид скорпиона, конъюгированный с пептидом, проникающим в клетку, и флуоресцентно меченный с помощью 6FAM (Uy192+CPP+FAM), составляли для использования в комбинации заливания в листья и доставки через растения. Контрольный раствор (воду) или раствор для обработки (Uy192+CPP+FAM) инъецировали в лист и помещали в пробирку Eppendorf. Раствор для обработки содержал 100 мкг/мл Uy192+CPP+FAM в воде.

Заливание в листья и доставка через растения - схема эксперимента

Тлей Acyrthosiphon pisum LSR-1 выращивали на растениях конских бобов (бобы Vroma vicia от Johnny's Selected Seeds) в инкубаторе с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света/8 ч. темноты; 60±5% RH; 25±2°C). Перед использованием для выкармливания тлей растения конских бобов выращивали в почвенной смеси для горшечных культур при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5-10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5-7 дней. Для экспериментов тлей на стадии личинок первого возраста собирали со здоровых растений и разделяли на 2 различные группы обработки: 1) отрицательный контроль (обработка водой), 2) обработка с помощью Uy192+CPP+FAM со 100 мкг/мл Uy192+CPP+FAM в воде. Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции.

Для обработки (см. раздел Схема терапии) Uy192+CPP+FAM (аминокислотная последовательность: YGRKKRRQRRRFLSTIWNGIKGLL-FAM) синтезировали в Bio-Synthesis с чистотой >75%. 5 мг лиофилизированного пептида разводили в 1 мл 80% ацетонитрила, 20% воды и 0,1% TFA, 50 мкл (100 мкг) разделяли на аликвоты в отдельные пробирки Eppendorf и оставляли высыхать. Для обработки (см. раздел Схема терапии) 1 мл стерильной воды добавляли к 100 мкг аликвоты пептида с получением конечной концентрации Uy192+CPP+FAM (100 мкг/мл). Затем раствор инъецировали в лист растения, и черешок растения помещали в пробирку Eppendorf на 1,5 мл. Отверстие пробирки закрывали парафильмом. Эту систему вскармливания затем помещали в глубокую чашку Петри (Fisher Scientific, № по кат. FB0875711), и тлей наносили на листья растения. Эпифлуоресцентная визуализация листа подтверждала, что листья содержали пептид с зеленой флуоресцентной меткой в своей сосудистой системе.

Для каждой обработки на каждый лист помещали 30 тлей в трех повторностях. Системы вскармливания заменяли каждые 2-3 дня на протяжении всего эксперимента. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли из глубокой чашки Петри в случае их обнаружения. Помимо этого, стадию развития (личинки 1-го, 2-го, 3-го, 4-го, 5-го возраста и 5R (размножающиеся личинки тлей 5-го возраста)) определяли ежедневно на протяжении всего эксперимента.

Через 5 дней после обработки ДНК экстрагировали из нескольких тлей в каждой группе обработки. Вкратце, поверхность тела тлей стерилизовали путем погружения тли в 6% раствор отбеливателя примерно на 5 секунд. Затем тлей промывали в стерильной воде, и ДНК экстрагировали из каждой отдельной тли с помощью набора для экстракции ДНК (Qiagen, набор DNeasy) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию ДНК измеряли посредством количественной оценки нуклеиновой кислоты с использованием NanoDrop, и число копий ДНК Buchnera и тлей измеряли с помощью qPCR. Праймерами, используемыми для Buchnera, были Buch_groES_18F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 240) и Buch_groES_98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO: 241) (Chong and Moran, 2016 PNAS). Праймерами, используемыми для тлей, были ApEF1a 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG; SEQ ID NO: 242) и ApEF1a 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO: 243) (Chong and Moran, 2016 PNAS). qPCR проводили с использованием скорости линейного изменения для qPCR-амплификации 1,6 градуса C/с и следующих условий: 1) 95°C в течение 10 минут, 2) 95°C в течение 15 секунд, 3) 55°C в течение 30 секунд, 4) повторение этапов 2-3 40x, 5) 95°C в течение 15 секунд, 6) 55°C в течение 1 минуты, 7) изменение скорости линейного изменения до 0,15 градуса C/с, 8) 95°C в течение 1 секунды. Данные qPCR анализировали с помощью аналитического программного обеспечения (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).

Обработка пептидом скорпиона Uy192, слитым с пептидом, проникающим в клетку, задерживала и останавливала прогрессирование развития тлей

Тлей A. pisum LSR-1 на стадии личинок 1-го возраста разделяли на три отдельные группы обработки, как определено в разделе Схема эксперимента (выше). Тлей отслеживали ежедневно, и определяли число тлей на каждой стадии развития. Развитие как тлей, обработанных водой, так и тлей, обработанных пептидом скорпиона, слитым с пептидом, проникающим в клетку, было аналогичным в дни 0 и 1 (фиг. 44). Однако в день 2 тли, обработанные контролем, развивались до стадии личинок второго или третьего возраста, в том время как некоторые тли, обработанные пептидом скорпиона, слитым с пептидом, проникающим в клетку, оставались на стадии личинок первого возраста (фиг. 44). Даже через 3 дня после обработки некоторые тли, обработанные пептидом скорпиона, слитым с пептидом, проникающим в клетку, оставались на стадии личинок первого возраста (фиг. 44). Через 7 дней после обработки большинство тлей, обработанных водой, развивались до стадии личинок 5-го возраста или стадии размножающихся личинок 5-го возраста. В отличие от этого, только 50 процентов тлей, обработанных пептидом скорпиона, слитым с пептидом, проникающим в клетку, развивались до стадии личинок 5-го возраста, тогда как ~42 и ~8 процентов тлей оставались на стадии личинок 3-го или 4-го возраста соответственно (фиг. 44). Эти данные указывают на то, что обработка пептидом скорпиона Uy192, слитым с пептидом, проникающим в клетку, задерживала и останавливала прогрессирование развития тлей.

Обработка пептидом скорпиона Uy192, слитым с пептидом, проникающим в клетку, приводила к повышенной смертности тлей

Показатель выживаемости тлей также измеряли в ходе обработок. Примерно 40% тлей, обработанных только контролем, выживали после 7-дневного эксперимента (фиг. 45). В отличие от этого, выживаемость была значимо меньшей у тлей, обработанных с помощью 100 мг/мл Uy192+CPP+FAM (p<0,0036, согласно логарифмическому ранговому критерию Кокса-Мантеля), при этом только 16% тлей доживали до дня 7 (фиг. 45). Эти данные указывают на то, что имело место снижение выживаемости при обработке пептидом скорпиона Uy192, слитым с пептидом, проникающим в клетку.

Обработка пептидом скорпиона, слитым с пептидом, проникающим в клетку, приводила к снижению соотношений количества ДНК Buchnera/тлей

В частности, для исследования того, приводила ли обработка с помощью Uy192+CPP+FAM к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе через 5 дней после обработки, и проводили qPCR для определения числа копий Buchnera/тлей. Тли, обработанные только водой, имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей (~134). В отличие от этого, тли, обработанные пептидом скорпиона, слитым с пептидом, проникающим в клетку, имели в ~1,8 раза меньше копий ДНК Buchnera/тлей через 5 дней после обработки (фиг. 46). Эти данные указывают на то, что обработка пептидом скорпиона, слитым с пептидом, проникающим в клетку, снижала уровни эндосимбионтов.

Пептид скорпиона, слитый с пептидом, проникающим в клетку, свободно проникал в бактериоциты с оказанием противодействия Buchnera

Для исследования того, способствовал ли непосредственно пептид, проникающий в клетку, доставке пептида скорпиона в бактериоциты, выделенные бактериоциты подвергали прямому воздействию слитого белка и визуализировали. Бактериоциты извлекали из тлей в среде Шнайдера с добавлением 1% вес./об. BSA (среда Шнайдера с BSA) и помещали в лунку для визуализации, содержащую 20 мкл среды Шнайдера. 100 мкг аликвоты лиофилизированного пептида скорпиона ресуспендировали в 100 мкл среды Шнайдера с получением 1 мг/мл раствора, и 5 мкл этого раствора примешивали в лунку, содержащую бактериоциты. Спустя 30 минут инкубирования при комнатной температуре бактериоциты тщательно промывали для удаления любого избытка свободного пептида в растворе. Изображения бактериоцитов получали до и после инкубирования (фиг. 47). Слитый пептид проникал через мембраны бактериоцита и был непосредственно доступен для Buchnera.

В совокупности эти данные демонстрируют способность уничтожать тлей и уменьшать их интенсивность развития, продолжительность жизни и эндогенные популяции бактерий, например, приспособленность, посредством их обработки противомикробным пептидом скорпиона Uy192, слитым с пептидом, проникающим в клетку.

Пример 23. Насекомые, обработанные аналогами витаминов

Данный пример демонстрирует обработку тлей провитамином пантотенолом, который представляет собой спиртовой аналог пантотеновой кислоты (витамин B5). Тли имеют облигатных бактерий-эндосимбионтов Buchnera, которые способствуют образованию ими незаменимых аминокислот и витаминов, в том числе витамина B5. Предыдущее исследование показало, что пантотенол ингибирует рост Plasmodium falciparum путем ингибирования специфических киназ паразита (Saliba et al., 2005). Была выдвинута гипотеза, что обработка насекомых пантотенолом была бы пагубной для симбиоза бактерия-насекомое, отрицательно влияя таким образом на приспособленность насекомого. Данный пример демонстрирует, что обработка пантотенолом снижала приспособленность насекомых.

Схема терапии

Растворы пантотенола составляли в зависимости от способа доставки.

1) В искусственном рационе через растения: с 0 (отрицательный контроль) или 10 или 100 мкМ пантотенола, составленного в искусственном рационе (согласно Akey and Beck, 1971; см. раздел Схема эксперимента) без незаменимых аминокислот (2 мг/мл гистидина, 2 мг/мл изолейцина, 2 мг/мл лейцина, 2 мг/мл лизина, 1 мг/мл метионина, 1,62 мг/мл фенилаланина, 2 мг/мл треонина, 1 мг/мл триптофана и 2 мг/мл валина).

2) Покрытие листьев: 100 мкл 0,025% неионогенного кремнийорганического поверхностно-активного растворителя Silwet L-77 в воде (отрицательный контроль) или 100 мкл 50 мкг/мл рифампицина, составленного в растворе растворителя, применяли непосредственно в отношении поверхности листьев и оставляли высыхать.

Доставка через растения - схема эксперимента

Тлей (eNASCO, Acyrthosiphon pisum) выращивали на растениях конских бобов (бобы Vroma vicia от Johnny's Selected Seeds) в инкубаторе с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света/8 ч. темноты; 60±5% RH; 25±2°C). Перед использованием для выкармливания тлей растения конских бобов выращивали в почвенной смеси для горшечных культур при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5-10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5-7 дней. Для экспериментов тлей на стадии личинок первого и второго возраста собирали со здоровых растений и разделяли на 3 различные группы обработки: 1) только искусственный рацион без незаменимых аминокислот, 2) только искусственный рацион без незаменимых аминокислот и 10 мкМ пантотенола и 3) только искусственный рацион без незаменимых аминокислот и 100 мкМ пантотенола. Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции.

Используемый искусственный рацион готовили, как описано ранее (Akey and Beck, 1971 Continuous Rearing of the Pea Aphid, Acyrthosiphon pisum, on a Holidic Diet), с незаменимыми аминокислотами и без них (2 мг/мл гистидина, 2 мг/мл изолейцина, 2 мг/мл лейцина, 2 мг/мл лизина, 1 мг/мл метионина, 1,62 мг/мл фенилаланина, 2 мг/мл треонина, 1 мг/мл триптофана и 2 мг/мл валина), за исключением того, что ни в одном случае рацион не включал гомосерин или бета-аланилтирозин. Значение pH рационов доводили до 7,5 с помощью KOH, и рационы стерилизовали фильтрацией с помощью фильтра с размером пор 0,22 мкм и хранили при 4°C в течение короткого срока (<7 дней) или при -80°C в течение длительного срока.

Растворы пантотенола (Sigma, № по кат. 295787) готовили в концентрации 10 мкМ и 100 мкМ в искусственном рационе без незаменимых аминокислот, стерилизовали путем пропускания через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранили при -20°C. Для обработок (см. раздел Схема терапии) подходящее количество исходного раствора добавляли к искусственному рациону без незаменимых аминокислот с получением конечной концентрации 10 или 100 мкМ пантотенола. Рацион затем помещали в пробирку Eppendorf на 1,5 мл с черешком и листом конских бобов, и отверстие пробирки закрывали парафильмом. Эту систему вскармливания искусственным рационом затем помещали в глубокую чашку Петри (Fisher Scientific, № по кат. FB0875711), и тлей наносили на листья растения.

Для каждой обработки на каждый лист помещали 16-20 тлей. Системы вскармливания искусственным рационом заменяли каждые 2-3 дня на протяжении всего эксперимента. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли из глубокой чашки Петри, в которой содержалась система вскармливания искусственным рационом, в случае их обнаружения.

Помимо этого, стадию развития (личинки 1-го, 2-го, 3-го, 4-го, 5-го возраста) определяли ежедневно на протяжении всего эксперимента. При достижении тлями стадии личинок 4-го возраста им предоставляли их собственные искусственные системы вскармливания в глубокой чашке Петри для того, чтобы можно было контролировать плодовитость, как только они достигали зрелого возраста.

В случае взрослых тлей новых нимф считали ежедневно и затем исключали. В конце экспериментов плодовитость определяли в виде среднего числа потомков, образуемых ежедневно после достижения тлей зрелого возраста. Снимки тлей получали на протяжении всего эксперимента для оценивания различий в размерах между группами обработки.

Через 8 дней после обработки ДНК экстрагировали из нескольких тлей из каждой группы обработки. Вкратце, поверхность тела тлей стерилизовали путем погружения тли в 6% раствор отбеливателя примерно на 5 секунд. Затем тлей промывали в стерильной воде, и ДНК экстрагировали из каждой отдельной тли с помощью набора для экстракции ДНК (Qiagen, набор DNeasy) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию ДНК измеряли посредством количественной оценки нуклеиновой кислоты с использованием NanoDrop, и число копий ДНК Buchnera и тлей измеряли с помощью qPCR. Праймерами, используемыми для Buchnera, были Buch_groES_18F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 240) и Buch_groES_98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO: 241) (Chong and Moran, 2016 PNAS). Праймерами, используемыми для тлей, были ApEF1a 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG; SEQ ID NO: 242) и ApEF1a 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO: 243) (Chong and Moran, 2016 PNAS). qPCR проводили с использованием скорости линейного изменения для qPCR-амплификации 1,6 градуса C/с и следующих условий: 1) 95°C в течение 10 минут, 2) 95°C в течение 15 секунд, 3) 55°C в течение 30 секунд, 4) повторение этапов 2-3 40x, 5) 95°C в течение 15 секунд, 6) 55°C в течение 1 минуты, 7) изменение скорости линейного изменения до 0,15 градуса C/с, 8) 95°C в течение 1 секунды. Данные qPCR анализировали с помощью аналитического программного обеспечения (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).

Обработка аналогами витаминов задерживает развитие тлей

Тлей eNASCO на стадии личинок 1-го и 2-го возраста разделяли на три отдельные группы обработки, как определено в разделе Доставка через растения - схема эксперимента (что описано в данном документе). Тлей отслеживали ежедневно, и определяли число тлей на каждой стадии развития. Тли, обработанные только искусственным рационом без незаменимых аминокислот, начинали достигать зрелого возраста (стадии личинок 5-го возраста) примерно через 5 дней (фиг. 48A). Развитие задерживалось у тлей, обработанных пантотенолом, особенно во второй и третий дни после обработки (фиг. 48A), что указывало на то, что обработка пантотенолом ухудшает развитие тлей. В конечном счете большинство тлей из каждой группы обработки достигало зрелого возраста и начинало размножаться. Помимо отслеживания динамики стадий развития тлей, тлей также визуализировали, и определяли площадь тела тлей. Все тли имели одинаковый размер через 1 день после обработки, однако через 3 дня после обработки тли, обработанные пантотенолом, имели меньшую площадь тела, чем необработанные контрольные особи. Кроме того, тли, обработанные пантотенолом, имели намного меньший прирост размера тела (определенный, исходя из площади тела) в течение эксперимента по сравнению с тлями, обработанными только искусственным рационом без незаменимых аминокислот (фиг. 48B).

Обработка аналогами витаминов повышала смертность тлей

Показатель выживаемости тлей также измеряли в ходе обработок. Тли, выкармливаемые только искусственным рационом без незаменимых аминокислот, имели более высокие показатели выживаемости по сравнению с тлями, обработанными 10 или 100 мкM пантотенола (фиг. 49), что указывало на то, что обработка пантотенолом отрицательно влияла на приспособленность тлей.

Обработка пантотенолом снижает плодовитость тлей

В ходе обработок также отслеживали плодовитость тлей. Определяли долю тлей, доживших до зрелого возраста и появления способности к размножению. Примерно одна четверть тлей, обработанных искусственным рационом без незаменимых аминокислот, доживала до достижения зрелого возраста через 8 дней после обработки (фиг. 50A). В отличие от этого, только немного более 1/10 тлей, обработанных 10 или 100 мкМ пантотенола, доживали до достижения зрелого возраста и размножались через 8 дней после обработки. Также измеряли средний день, на который тли в каждой группе обработки начинали размножаться, и для всех групп обработки средним днем, на который тли начинали размножаться, был 7-й день (фиг. 50B). Кроме того, также отслеживали среднее число потомков, образуемых за день зрелыми размножающимися тлями. Тли, обработанные только искусственным рационом без незаменимых аминокислот, образовывали примерно 7 потомков/день. В отличие от этого, тли, обработанные 10 и 100 мкМ пантотенола, образовывали только соответственно примерно 4 и 5 потомков/день, как показано на фиг. 50C. В совокупности эти данные указывают на то, что обработка пантотенолом приводила к утрате способности к размножению у тлей.

Обработка пантотенолом не влияет отрицательно на количество Buchnera у тлей

В частности, для исследования того, приводила ли обработка пантотенолом к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 8 дней после обработки, и проводили qPCR для определения числа копий Buchnera/тлей. Тли, обработанные только искусственным рационом без незаменимых аминокислот, имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей, как и тли, обработанные каждой из двух концентраций пантотенола (фиг. 51). Эти данные указывают на то, что обработка пантотенолом непосредственно не влияла отрицательно на число копий ДНК Buchnera/тлей.

Доставка путем покрытия листьев - схема эксперимента

Порошок пантотенола добавляли к 0,025% неионогенного кремнийорганического поверхностно-активного растворителя Silwet L-77 с получением конечной концентрации 10 мкМ пантотенола. Средство обработки стерилизовали фильтрацией с помощью фильтра с размером пор 0,22 мкм и хранили при 4 градусах C. Тлей (линии eNASCO, Acyrthosiphon pisum) выращивали на растениях конских бобов, как описано в предыдущем примере. Для экспериментов тлей на стадии личинок первого возраста собирали со здоровых растений и разделяли на 2 различные группы обработки: 1) отрицательный контроль (только раствор растворителя) и 2) 10 мкM пантотенола в растворителе. 100 мкл раствора поглощалось кусочком листа конских бобов размером 2×2 см.

Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции. Для каждой обработки на каждый лист помещали 20 тлей. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли в случае их обнаружения. Помимо этого, стадию развития (личинки 1-го, 2-го, 3-го, 4-го, 5-го возраста и 5R, что обозначает размножающуюся личинку 5-го возраста) определяли ежедневно на протяжении всего эксперимента.

Обработка пантотенолом, доставляемым посредством покрытия листьев, не влияет отрицательно на развитие тлей

Тлей eNASCO на стадии личинок 1-го возраста разделяли на две отдельные группы обработки, как определено в разделе Схема эксперимента, что описано в данном документе. Тлей отслеживали ежедневно, и определяли число тлей на каждой стадии развития. Тли, помещенные на покрытые листья, обработанные контрольным раствором или раствором пантотенола, созревали при аналогичных скоростях в течение двух дней после обработки (фиг. 52). Эти данные указывают на то, что покрытие листьев пантотенолом не влияло отрицательно на развитие тлей.

Обработка пантотенолом, доставляемым посредством покрытия листьев, повышала смертность тлей

Показатель выживаемости тлей также измеряли в ходе обработок путем покрытия листьев. Тли, помещенные на листья, покрытые пантотенолом, имели более низкие показатели выживаемости, чем тли, помещенные на листья, покрытые контрольным раствором (фиг. 53). Эти данные указывают на то, что обработка пантотенолом, доставляемым посредством покрытия листьев, значимо (p=0,0019) отрицательно влияла на выживаемость тлей. Все тли погибали в данном эксперименте, и никаких оставшихся тлей не оставалось для экстрагирования из них ДНК и определения соотношения количества ДНК Buchnera/тлей.

В совокупности эти данные, описанные в предыдущих примерах, демонстрируют способность уничтожать тлей и уменьшать их интенсивность развития, способность к размножению, продолжительность жизни и эндогенные популяции бактерий, например, приспособленность, посредством их обработки пантотенолом с помощью нескольких путей доставки.

Пример 24. Насекомые, обработанные коктейлем ингибиторов переносчиков аминокислот

Данный пример демонстрирует обработку тлей коктейлем аналогов аминокислот. Целью данной обработки было ингибирование захвата глутамина бактериоцитами с помощью переносчика глутамина ApGLNT1. Ранее было показано, что аргинин ингибирует захват глутамина с помощью переносчика глутамина (Price et al., 2014 PNAS), и авторы настоящего изобретения выдвинули гипотезу, что обработка аналогами аргинина или другими аналогами аминокислот может также ингибировать захват незаменимых аминокислот бактериоцитами тлей. Данный пример демонстрирует, что снижение приспособленности при обработке было опосредовано модулированием популяций бактерий, эндогенных по отношению к насекомым, которые были восприимчивыми к аналогам аминокислот. Одним штаммом бактерий-мишеней является Buchnera.

Схема терапии

Коктейль аминокислот составляли для доставки посредством заливания в листья и через растение. Этот способ доставки заключался в инъекции в листья примерно 1 мл коктейля аминокислот в воде (см. ниже перечень компонентов коктейля) или 1 мл раствора отрицательного контроля, содержащего только воду.

Заливание в листья и доставка через растения - схема эксперимента

Тлей LSR-1 (в которых содержатся только Buchnera) Acyrthosiphon pisum выращивали на растениях конских бобов (бобы Vroma vicia от Johnny's Selected Seeds) в инкубаторе с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света/8 ч. темноты; 60±5% RH; 25±2°C). Перед использованием для выкармливания тлей растения конских бобов выращивали в почвенной смеси для горшечных культур при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5-10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5-7 дней. Для экспериментов тлей на стадии личинок первого возраста собирали со здоровых растений и разделяли на 2 различные группы обработки: 1) отрицательный контроль (обработка водой) и 2) обработка коктейлем аминокислот. Коктейль аминокислот содержал каждое из следующих средств в указанных конечных концентрациях: 330 мкM L-NNA (N-нитро-L-аргинина; Sigma), 0,1 мг/мл L-канаванина (Sigma), 0,5 мг/мл D-аргинина (Sigma), 0,5 мг/мл D-фенилаланина (Sigma), 0,5 мг/мл D-гистидина (Sigma), 0,5 мг/мл D-триптофана (Sigma), 0,5 мг/мл D-треонина (Sigma), 0,5 мг/мл D-валина (Sigma), 0,5 мг/мл D-метионина (Sigma), 0,5 мг/мл D-лейцина и 6 мкM L-NMMA (цитрата) (Cayman Chemical). В лист конских бобов заливали ~1 мл раствора для обработки путем инъекции, и черешок растения помещали в пробирку Eppendorf на 1,5 мл, содержащую раствор для обработки. Отверстие пробирки закрывали парафильмом. Эту систему вскармливания затем помещали в глубокую чашку Петри (Fisher Scientific, № по кат. FB0875711), и тлей наносили на листья растения. Для каждой обработки в общей сложности 56-58 тлей помещали на каждый лист (каждая обработка состояла из двух повторностей по 28-31 тле). Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции. Системы вскармливания заменяли каждые 2-3 дня на протяжении всего эксперимента. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли из глубокой чашки Петри в случае их обнаружения. Стадию развития тлей (стадию личинок 1-го, 2-го, 3-го, 4-го и 5-го возраста) определяли ежедневно на протяжении всего эксперимента, и микроскопические изображения тлей получали в день 5 с целью выполнения измерений площади тела тлей.

Исходные растворы L-NNA готовили в концентрации 5 мM в воде, стерилизовали путем пропускания через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранили при -20°C. Исходные растворы L-канаванина готовили в концентрации 100 мг/мл в воде, стерилизовали путем пропускания через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранили при 4°C. Исходные растворы D-аргинина и D-треонина готовили в концентрации 50 мг/мл в воде, стерилизовали путем пропускания через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранили при 4°C. Исходные растворы D-валина и D-метионина готовили в концентрации 25 мг/мл в воде, стерилизовали путем пропускания через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранили при 4°C. Исходные растворы D-лейцина готовили в концентрации 12 мг/мл в воде, стерилизовали путем пропускания через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранили при 4°C. Исходные растворы D-фенилаланина и D-гистидина готовили в концентрации 50 мг/мл в 1M HCl, стерилизовали путем пропускания через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранили при 4°C. Исходные растворы D-триптофана готовили в концентрации 50 мг/мл в 0,5M HCl, стерилизовали путем пропускания через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранили при 4°C. Исходные растворы L-NMMA готовили в концентрации 6 мг/мл в стерильном PBS, стерилизовали путем пропускания через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранили при -20°C. Для обработок (см. раздел Схема терапии) соответствующее количество исходного раствора добавляли к воде с получением конечной концентрации средства в коктейле, как указано выше.

Через 6 дней после обработки ДНК экстрагировали из нескольких тлей из каждой группы обработки. Вкратце, поверхность тела тлей стерилизовали путем погружения тли в 6% раствор отбеливателя примерно на 5 секунд. Затем тлей промывали в стерильной воде, и ДНК экстрагировали из каждой отдельной тли с помощью набора для экстракции ДНК (Qiagen, набор DNeasy) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию ДНК измеряли посредством количественной оценки нуклеиновой кислоты с использованием NanoDrop, и число копий ДНК Buchnera и тлей измеряли с помощью qPCR. Праймерами, используемыми для Buchnera, были Buch_groES_18F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 240) и Buch_groES_98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO: 241) (Chong and Moran, 2016 PNAS). Праймерами, используемыми для тлей, были ApEF1a 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG; SEQ ID NO: 242) и ApEF1a 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO: 243) (Chong and Moran, 2016 PNAS). qPCR проводили с использованием скорости линейного изменения для qPCR-амплификации 1,6 градуса C/с и следующих условий: 1) 95°C в течение 10 минут, 2) 95°C в течение 15 секунд, 3) 55°C в течение 30 секунд, 4) повторение этапов 2-3 40x, 5) 95°C в течение 15 секунд, 6) 55°C в течение 1 минуты, 7) изменение скорости линейного изменения до 0,15 градуса C/с, 8) 95°C в течение 1 секунды. Данные qPCR анализировали с помощью аналитического программного обеспечения (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).

Обработка коктейлем аналогов аминокислот задерживала и останавливала прогрессирование развития тлей

Тлей LSR-1 на стадии личинок 1-го возраста разделяли на две отдельные группы обработки, как определено в разделе Заливание в листья и доставка через растения - схема эксперимента (что описано в данном документе). Тлей отслеживали ежедневно, и определяли число тлей на каждой стадии развития. Тли, обработанные водой, начинали достигать зрелого возраста (стадии личинок 5-го возраста) в день 5 после обработки (фиг. 54A). Через 6 дней после обработки ~20 процентов тлей, обработанных водой, достигали стадии личинок 5-го возраста. В отличие от этого, менее чем 3 процента тлей, обработанных коктейлем аминокислот, достигали стадии личинок 5-го возраста даже через 6 дней (фиг. 54A). Эта задержка в развитии при обработке коктейлем аминокислот была дополнительно представлена на примере путем измерений размера тлей, выполненных через 5 дней после обработки. Тли, обработанные только водой, имели площадь тела примерно 0,45 мм2, тогда как тли, обработанные коктейлем аминокислот, имели площадь тела примерно 0,33 мм2 (фиг. 54B). Эти данные указывают на то, что обработка коктейлем аминокислот задерживала развитие тлей, отрицательно влияя на приспособленность тлей.

Обработка коктейлем аналогов аминокислот приводила к снижению количества Buchnera у тлей

В частности, для исследования того, приводила ли обработка коктейлем аналогов аминокислот к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 6 дней после обработки, и проводили qPCR для определения числа копий Buchnera/тлей. Тли, помещенные на контрольный раствор, имели высокие соотношения числа копий ДНК Buchnera/тлей. В отличие от этого, тли, помещенные на коктейль AA для обработки, характеризовались существенным снижением числа копий ДНК Buchnera/тлей (фиг. 55), что указывало на то, что обработка коктейлем аналогов AA устраняла эндосимбиотические Buchnera.

В совокупности эти данные демонстрируют способность уменьшать интенсивность развития и эндогенные популяции бактерий, например, приспособленность, у тлей посредством их обработки коктейлем аналогов аминокислот.

Пример 25. Насекомые, обработанные комбинацией средств (антибиотиком, пептидом и природным противомикробным средством)

Данный пример демонстрирует обработку насекомых комбинацией из трех противомикробных средств - антибиотика (рифампицина), пептида (пептида скорпиона Uy192) и природного противомикробного средства (низкомолекулярного хитозана). В других примерах каждое из этих средств, введенное отдельно, приводило к уменьшению приспособленности тлей и снижению уровней эндосимбионтов. Данный пример демонстрирует, что посредством доставки комбинации средств обработки приспособленность насекомых и уровни эндосимбионтов снижались так же, как и при обработке каждым отдельным средством в отдельности, или в лучшей степени.

Схема терапии

Комбинацию средств обработки составляли для доставки посредством заливания в листья и через растение. Этот способ доставки заключался в инъекции в листья примерно 1 мл комбинации средств обработки в воде (с конечными концентрациями 100 мкг/мл рифампицина, 100 мкг/мл Uy192 и 300 мкг/мл хитозана) или 1 мл раствора отрицательного контроля, содержащего только воду.

Заливание в листья и доставка через растения - схема эксперимента

Тлей LSR-1 (в которых содержатся только Buchnera) Acyrthosiphon pisum выращивали на растениях конских бобов (бобы Vroma vicia от Johnny's Selected Seeds) в инкубаторе с контролируемым климатом (фотопериод с 16 ч. света/8 ч. темноты; 60±5% RH; 25±2°C). Перед использованием для выкармливания тлей растения конских бобов выращивали в почвенной смеси для горшечных культур при 24°C при 16 ч. света и 8 ч. темноты. Для ограничения материнских эффектов или различий в состоянии здоровья между растениями 5-10 взрослых особей из разных растений распределяли среди 10 растений в возрасте двух недель и оставляли размножаться до высокой плотности в течение 5-7 дней. Для экспериментов тлей на стадии личинок первого возраста собирали со здоровых растений и разделяли на 2 различные группы обработки: 1) отрицательный контроль (обработка водой) и 2) обработка комбинацией из 100 мкг/мл рифампицина, 100 мкг/мл Uy192 и 300 мкг/мл хитозана. В лист конских бобов заливали ~1 мл раствора для обработки путем инъекции, и черешок растения помещали в пробирку Eppendorf на 1,5 мл, содержащую раствор для обработки. Отверстие пробирки закрывали парафильмом. Эту систему для обработки затем помещали в глубокую чашку Петри (Fisher Scientific, № по кат. FB0875711), и тлей наносили на листья растения. Для каждой обработки в общей сложности 56 тлей помещали на каждый лист (каждая обработка состояла из двух повторностей по 28 тлей). Для каждой группы обработки получали примерно одно и то же число особей с каждого из растений коллекции. Системы вскармливания заменяли каждые 2-3 дня на протяжении всего эксперимента. У тлей ежедневно отслеживали выживаемость, и мертвых тлей удаляли из глубокой чашки Петри в случае их обнаружения. Стадию развития тлей (стадию личинок 1-го, 2-го, 3-го, 4-го и 5-го возраста) определяли ежедневно на протяжении всего эксперимента, и микроскопические изображения тлей получали в день 5 с целью выполнения измерений площади тела тлей.

Исходный раствор рифампицина (Tokyo Chemical Industry, LTD) готовили в концентрации 25 мг/мл в метаноле, стерилизовали путем пропускания через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранили при -20°C. Для обработки подходящее количество исходного раствора добавляли к воде с получением конечной концентрации 100 мкг/мл рифампицина. Uy192 синтезировали в Bio-Synthesis с чистотой >75%. 1 мг лиофилизированного пептида разбавляли в 500 мкл 80% ацетонитрила, 20% воды и 0,1% TFA. 100 мкл (100 мкг) разделяли на аликвоты в 10 отдельных пробирок Eppendorf и оставляли высыхать. Для обработки 1 мл воды добавляли к 100 мкг аликвоты пептида с получением конечной концентрации 100 мкг/мл Uy192. Исходный раствор хитозана (Sigma, № по кат. 448869-50G) готовили в концентрации 1% в уксусной кислоте, стерилизовали автоклавированием и хранили при 4°C. Для обработок подходящее количество исходного раствора добавляли к воде с получением конечной концентрации хитозана 300 мкг/мл.

Через 6 дней после обработки ДНК экстрагировали из нескольких тлей из каждой группы обработки. Вкратце, поверхность тела тлей стерилизовали путем погружения тли в 6% раствор отбеливателя примерно на 5 секунд. Затем тлей промывали в стерильной воде, и ДНК экстрагировали из каждой отдельной тли с помощью набора для экстракции ДНК (Qiagen, набор DNeasy) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию ДНК измеряли посредством количественной оценки нуклеиновой кислоты с использованием NanoDrop, и число копий ДНК Buchnera и тлей измеряли с помощью qPCR. Праймерами, используемыми для Buchnera, были Buch_groES_18F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 228) и Buch_groES_98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO: 229) (Chong and Moran, 2016 PNAS). Праймерами, используемыми для тлей, были ApEF1a 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG; SEQ ID NO: 230) и ApEF1a 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO: 231) (Chong and Moran, 2016 PNAS). qPCR проводили с использованием скорости линейного изменения для qPCR-амплификации 1,6 градуса C/с и следующих условий: 1) 95°C в течение 10 минут, 2) 95°C в течение 15 секунд, 3) 55°C в течение 30 секунд, 4) повторение этапов 2-3 40x, 5) 95°C в течение 15 секунд, 6) 55°C в течение 1 минуты, 7) изменение скорости линейного изменения до 0,15 градуса C/с, 8) 95°C в течение 1 секунды. Данные qPCR анализировали с помощью аналитического программного обеспечения (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).

Обработка комбинацией из трех противомикробных средств задерживала и останавливала прогрессирование развития тлей

Тлей LSR-1 на стадии личинок 1-го возраста разделяли на две отдельные группы обработки, как определено в разделе Заливание в листья и доставка через растения - схема эксперимента (что описано в данном документе). Тлей отслеживали ежедневно, и определяли число тлей на каждой стадии развития. Тли, обработанные водой, начинали достигать зрелого возраста (стадии личинок 5-го возраста) в день 5 после обработки (фиг. 56A). Через 6 дней после обработки ~20 процентов тлей, обработанных водой, достигали стадии личинок 5-го возраста. В отличие от этого, тли, обработанные комбинацией из трех средств, не достигали стадии личинок 5-го возраста даже через 6 дней (фиг. 56A). Эта задержка в развитии при комбинированной обработке была дополнительно представлена на примере путем измерений размера тлей, выполненных через 5 дней после обработки. Тли, обработанные только водой, имели площадь тела примерно 0,45 мм2, тогда как тли, обработанные комбинацией из 3 средств, имели площадь тела примерно 0,26 мм2 (фиг. 56B). Эти данные указывают на то, что обработка комбинацией средств задерживала развитие тлей, отрицательно влияя на приспособленность тлей.

Обработка комбинацией из трех противомикробных средств повышала смертность тлей

Выживаемость также отслеживали ежедневно после обработки. Через 2 дня после обработки примерно 75 процентов тлей, обработанных водой, были живыми, тогда как только 62 процента тлей, обработанных комбинацией средств, были живыми. Эта тенденция к большему количеству тлей, переживших обработку, в контрольной группе (обработанных водой) сохранялась в течение всего эксперимента. Через 6 дней после обработки выживали 64 процента контрольных (обработанных водой) тлей, тогда как среди тлей, обработанных комбинацией рифампицина, Uy192 и хитозана, выживали 58 процентов (фиг. 57). Эти данные указывают на то, что комбинация средств обработки отрицательно влияла на выживаемость тлей.

Обработка комбинацией из трех средств приводила к снижению количества Buchnera у тлей

В частности, для исследования того, приводила ли обработка комбинацией пептида, антибиотика и природного противомикробного средства к потере Buchnera у тлей и влияла ли эта потеря на приспособленность тлей, ДНК экстрагировали из тлей в каждой группе обработки через 6 дней после обработки, и проводили qPCR для определения числа копий Buchnera/тлей. Тли, обработанные только водой, имели соотношения количества ДНК Buchnera/тлей, составляющие примерно 2,3 (фиг. 58). В отличие от этого, тли, обработанные комбинацией пептида, антибиотика и природного противомикробного средства, имели примерно в 2 раза более низкие соотношения количества ДНК Buchnera/тлей (фиг. 58). Эти данные указывают на то, что комбинированная обработка снижала уровни эндосимбионтов, что приводило к снижению приспособленности тлей.

В совокупности эти данные демонстрируют способность уменьшать интенсивность развития и эндогенные популяции бактерий, например, приспособленность, у тлей посредством их обработки комбинацией пептида, антибиотика и природного противомикробного средства.

Пример 26. Насекомые, обработанные раствором антибиотика

Данный пример демонстрирует влияние обработки долгоносиков ципрофлоксацином, бактерицидным антибиотиком, который ингибирует активность ДНК-гиразы и топоизомеразы, двух ферментов, необходимых для репликации ДНК. Данный пример демонстрирует, что фенотипическое влияние ципрофлоксацина на других модельных насекомых, долгоносиков, было опосредовано модулированием популяций бактерий, эндогенных по отношению к насекомым, которые были восприимчивыми к ципрофлоксацину. Одним штаммом бактерий-мишеней является первичный эндосимбионт Sitophilus (SPE, Candidatus Sodalis pierantonius).

Схема эксперимента

Кукурузных долгоносиков Sitophilus (Sitophilus zeamais) выкармливали на органической кукурузе при 27,5°C и 70% относительной влажности. Перед использованием для выкармливания долгоносиков кукурузу замораживали в течение 7 дней и затем доводили до 10% влажности стерильной водой. Спаривающиеся пары взрослых самцов и самок разделяли на 3 различные группы обработки для экспериментов, которые выполняли в трех повторностях: 1) контроль c водой, 2) 250 мкг/мл ципрофлоксацина и 3) 2,5 мг/мл ципрофлоксацина. Исходные растворы ципрофлоксацина (Sigma) готовили в концентрации 25 мг/мл в 0,1 н. HCl, стерилизовали путем пропускания через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранили при -20°C. Для обработок подходящее количество исходного раствора разбавляли в стерильной воде.

Долгоносиков подвергали трем последовательным обработкам.

1. Первая обработка включала в себя замачивание 25 г кукурузы с каждым из средств для трех групп обработки, приведенных выше: 1) контроль c водой, 2) 250 мкг/мл ципрофлоксацина и 3) 2,5 мг/мл ципрофлоксацина. Вкратце, 25 г кукурузы помещали в коническую пробирку на 50 мл, и каждое из средств обработки добавляли до полного заполнения пробирки. Пробирку помещали на шейкер на 1,5 часа, после чего кукурузу удаляли и помещали в глубокую чашку Петри и сушили на воздухе. Спаривающиеся пары самцов и самок затем добавляли в каждую группу обработки и оставляли вскармливаться в течение 4 дней.

2. Через 4 дня спаривающиеся пары удаляли и подвергали второй обработке, помещая их на 25 г новой кукурузы, обработанной 1) контролем c водой, 2) 250 мкг/мл ципрофлоксацина и 3) 2,5 мг/мл ципрофлоксацина. Спаривающиеся пары вскармливались и откладывали яйца на этой кукурузе в течение 7 дней. Кукурузу после второй обработки оценивали в отношении появления потомства (см. раздел Оценка потомства ниже)

3. Спаривающиеся пары подвергали заключительной обработке, которая включала комбинацию из погружения их в средство обработки (1) контроль c водой, 2) 250 мкг/мл ципрофлоксацина и 3) 2,5 мг/мл ципрофлоксацина на 5 секунд и помещения их во флакон с 10 зернами кукурузы, которые были покрыты 1 мл 1) контроля c водой, 2) 250 мкг/мл ципрофлоксацина и 3) 2,5 мг/мл ципрофлоксацина.

Выживаемость долгоносиков отслеживали ежедневно в течение 18 дней, после чего ДНК экстрагировали из оставшихся долгоносиков в каждой группе. Вкратце, тело долгоносиков подвергали поверхностной стерилизации путем погружения долгоносика в 6% раствор отбеливателя примерно на 5 секунд. Затем долгоносиков промывали в стерильной воде, и ДНК экстрагировали из каждого отдельного долгоносика с помощью набора для экстракции ДНК (Qiagen, набор DNeasy) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию ДНК измеряли посредством количественной оценки нуклеиновой кислоты с использованием NanoDrop, и число копий ДНК SPE и долгоносиков измеряли с помощью qPCR. Праймерами, используемыми для SPE, были qPCR_Sod_F (ATAGCTGTCCAGACGCTTCG; SEQ ID NO: 244) и qPCR_Sod_R (ATGTCGTCGAGGCGATTACC; SEQ ID NO: 245). Праймерами, используемыми для долгоносиков (β-актин), были SACT144_FOR (GGTGTTGGCGTACAAGTCCT; SEQ ID NO: 246) и SACT314_REV (GAATTGCCTGATGGACAGGT; SEQ ID NO: 247) (Login et al., 2011). qPCR проводили с использованием скорости линейного изменения для qPCR-амплификации 1,6 градуса C/с и следующих условий: 1) 95°C в течение 10 минут, 2) 95°C в течение 15 секунд, 3) 57°C в течение 30 секунд, 4) повторение этапов 2-3 40x, 5) 95°C в течение 15 секунд, 6) 55°C в течение 1 минуты, 7) изменение скорости линейного изменения до 0,15 градуса C/с, 8) 95°C в течение 1 секунды. Данные qPCR анализировали с помощью аналитического программного обеспечения (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).

Оценка потомства

Через 25 дней одну повторность зерен кукурузы после второй обработки взрослых спаривающихся пар вскрывали (см. раздел Схема эксперимента, выше) для проверки наличия любых из развивающихся личинок, куколок или взрослых долгоносиков. Большая часть развития долгоносиков Sitophilus происходит в зерновых культурах/рисе/кукурузе, и взрослые особи появляются из зерен после того, как их развитие завершается. Зерна кукурузы осторожно вскрывали скальпелем, и любых развивающихся долгоносиков собирали и определяли процент взрослых особей, куколок и личинок. Долгоносиков, полученных в результате вскрытия, затем подвергали поверхностной стерилизации, и уровни SPE определяли с помощью qPCR. Зерна кукурузы из оставшихся двух повторностей каждой из групп после второй обработки не вскрывали, но проверяли ежедневно в отношении появления взрослых долгоносиков.

Оценка проникновения антибиотика в кукурузу

25 мг зерен кукурузы помещали в коническую пробирку на 50 мл, и воду или 2,5 мг/мл или 0,25 мг/мл ципрофлоксацина в воде добавляли до заполнения пробирки. Зерна замачивали в течение 1,5 часов, как описано выше. После замачивания зерна высушивали на воздухе и анализировали для определения того, был ли способен антибиотик покрывать зерно и проникать в него. Для исследования этого концентрированный образец DH5α Escherichia coli в воде распределяли по 5 чашкам с бульоном Лурия (LB). В отношении каждой чашки было выполнено следующее: 1) добавляли зерно кукурузы, замоченное в воде, 2) добавляли целое зерно кукурузы, которое было замочено в 2,5 или 0,25 мг/мл ципрофлоксацина, и 3) добавляли половинку зерна кукурузы, которое было замочено в 2,5 или 0,25 мг/мл ципрофлоксацина, и помещали вглубь чашки. Чашки инкубировали в течение ночи при 37 градусах C, и на следующий день оценивали рост бактерий и/или зону(зоны) ингибирования.

Замачивание зерен кукурузы в антибиотиках позволяло антибиотикам покрывать поверхность и проникать в зерна кукурузы

Для исследования того, мог ли ципрофлоксацин покрывать поверхность зерна кукурузы, зерна кукурузы замачивали в воде без антибиотиков или в воде с 2,5 или 0,25 мг/мл ципрофлоксацина (как описано выше). Затем концентрированную культуру E. coli распределяли по чашкам с LB, и одно из покрытых зерен затем помещали в центр чашки. Чашки инкубировали в течение ночи, а на следующий день оценивали рост бактерий.

Газон из бактерий рос на всей чашке с зерном кукурузы, которое было покрыто водой без каких-либо антибиотиков (фиг. 56A). В отличие от этого, бактерии не росли на чашках с целыми зернами кукурузы, которые были замочены в ципрофлоксацине в любой из двух концентраций (фиг. 56B, левые панели). Эти данные показывают, что способ покрытия, используемый в этих экспериментах, способствовал успешному покрытию ципрофлоксацином поверхности зерен кукурузы и ингибированию роста бактерий.

Для исследования того, мог ли ципрофлоксацин проникать в зерно кукурузы, зерна кукурузы, замоченные в 2,5 или 0,25 мг/мл ципрофлоксацине, разрезали пополам и помещали разрезанной стороной вниз на чашку с LB с концентрированной культурой E. coli. Чашки инкубировали в течение ночи, и на следующий день оценивали рост бактерий. Рост бактерий отсутствовал в чашках с зернами, замоченными антибиотиком в любой концентрации, что указывало на то, что ципрофлоксацин проникал в зерно кукурузы (фиг. 56B, правые панели). В совокупности эти данные указывают на то, что способ замачивания зерен кукурузы, применяемый в этих экспериментах, приводил к успешному покрытию зерен кукурузы антибиотиком и его проникновению в них.

Обработка антибиотиками снижает уровни SPE в поколении F0

Спаривающиеся пары S. zeamais разделяли на три отдельные группы обработки, как определено в разделе Схема эксперимента (выше). Долгоносиков отслеживали ежедневно, и все долгоносики оставались живыми в