Способы лечения болезни данона и других нарушений аутофагии

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к вектору на основе аденоассоциированного вируса (AAV) серотипа 9, содержащему экспрессирующую кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий ассоциированный с лизосомами мембранный белок 2B (LAMP-2B), функционально связанный с гибридным промотором, содержащим промотор β-актина курицы и энхансер CMV (промотор CAG). Изобретение эффективно для лечения болезни Данона. 4 н. и 10 з.п. ф-лы, 11 ил., 8 пр.

 

[0001] По данной патентной заявке испрашивают приоритет в соответствии с 35 U.S.C. 119(e) по предварительной патентной заявке США с серийным № 62/280,269, поданной 19 января 2016 года, которая, таким образом, включена посредством ссылки в полном объеме.

[0002] Эта работа частично поддержана грантами №№ PHS 7K23HL107755 и RSA 1268 от National Institutes of Health. Правительство США имеет определенные права на это изобретение.

ПРЕДПОСЫЛКИ

[0003] Болезнь Данона представляет собой семейную кардиомиопатию, связанную с ослабленной аутофагией из-за мутаций в гене, кодирующем ассоциированный с лизосомами мембранный белок 2 (LAMP-2, также известный как CD107b). Появилось свидетельство, подчеркивающее важность аутофагии при регуляции биоэнергетики, функции и выживаемости кардиомиоцитов. Однако механизмы, отвечающие за нарушение клеточных функций и гибель кардиомиоцитов при ослабленном аутофагическом потоке, остаются не ясны. В предыдущем исследовании, чтобы изучать молекулярные механизмы, отвечающие за болезнь Данона, авторы изобретения создавали индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (hiPSC) от двух пациентов с различными мутациями LAMP-2 (Hashem, et al., Stem Cells. 2015 Jul;33(7):2343-50). Кардиомиоциты, полученные из Danon hiPSC, (hiPSC-CM) демонстрировали ослабленный аутофагический поток и ключевые признаки сердечной недостаточности, такие как увеличенный размер клеток, увеличенная экспрессия натрийуретических пептидов и анормальный кальциевый обмен по сравнению с контрольными hiPSC-CM. Дополнительно, Danon hiPSC-CM демонстрировали чрезмерные количества митохондриального окислительного стресса и апоптоза. Использование сульфгидрильного антиоксиданта N-ацетилцистеина для удаления свободных радикалов вело к значимому снижению апоптозной гибели клеток среди Danon hiPSC-CM. Также авторы изобретения использовали лентивирусный вектор для введения кодирующей последовательности изоформы LAMP-2B под управлением доксициклин-индуцибельного промотора в одной из линий Danon hiPSC. Сверхэкспрессия LAMP-2B с добавлением доксициклина также снижала уровни окислительного стресса и апоптозную гибель клеток среди Danon hiPSC-CM, что подтверждает важность LAMP-2B в патофизиологии заболевания. Вкратце, авторы изобретения моделировали болезнь Данона с использованием hiPSC-CM от пациентов с мутациями в LAMP-2, что позволило им сделать механистическое предположение о патогенезе этого заболевания. Авторы изобретения демонстрировали, что недостаточность LAMP-2 вела к ослаблению аутофагического потока, что вело к чрезмерному окислительному стрессу и последующему апоптозу кардиомиоцитов. Удаление чрезмерных свободных радикалов с использованием антиоксидантов и сверхэкспрессия LAMP-2B улучшали фенотип заболевания in vitro. Известный уровень техники не раскрывает эффективных стратегий лечения болезни Данона или других заболеваний, связанных с аутофагией, и, таким образом, исследования in vivo, приведенные в настоящем описании, необходимы для валидации подхода.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ

[0004] В одном из аспектов предоставлены векторы для генной терапии, например, для использования в системном или локальном повышении экспрессии одной или нескольких изоформ ассоциированного с лизосомами мембранного белка 2 (LAMP-2) у субъекта. Векторы для генной терапии находят применение при предотвращении, смягчении, улучшении, снижении, ингибировании и/или лечении одного или нескольких симптомов болезни Данона или другого нарушения недостаточного аутофагического потока. В различных вариантах осуществления векторы для генной терапии содержат экспрессирующую кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий одну или несколько изоформ ассоциированного с лизосомами мембранного белка 2 (LAMP-2). В различных вариантах осуществления вектор представляет собой вирусный вектор. В различных вариантах осуществления вирусный вектор из вируса, выбранного из группы, состоящей из аденовируса, ретровируса, лентивируса, герпесвируса и аденоассоциированного вируса (AAV). В различных вариантах осуществления, вектор из одного или нескольких из серотипов 1-11 аденоассоциированного вируса (AAV) или любых их подгрупп. В различных вариантах осуществления, вирусный вектор инкапсулируют в анионную липосому. В различных вариантах осуществления вектор представляет собой невирусный вектор. В различных вариантах осуществления невирусный вектор выбирают из группы, состоящей из депротеинизированной ДНК, катионного липосомального комплекса, катионного полимерного комплекса, катионного липосомально-полимерного комплекса и экзосомы. В различных вариантах осуществления экспрессирующая кассета содержит функционально связанный в направлении от 5' к 3' (с точки зрения мРНК, подлежащей транскрипции), первый инвертированный концевой повтор, энхансер, промотор, полинуклеотид, кодирующий одну или несколько изоформ LAMP-2, 3'-нетранслируемую область, сигнал полиаденилирования (полиА) и второй инвертированный концевой повтор. В различных вариантах осуществления промотор выбирают из группы, состоящей из промотора цитомегаловируса (CMV) и промотора β-актина курицы (CAG). В различных вариантах осуществления полинуклеотид содержит ДНК или кДНК. В различных вариантах осуществления полинуклеотид, кодирующий одну или несколько изоформ LAMP-2, содержит одну или несколько изоформ LAMP-2 человека. В различных вариантах осуществления полинуклеотид, кодирующий одну или несколько изоформ LAMP-2, содержит одну или несколько изоформ LAMP-2, выбранных из группы, состоящей из LAMP-2A, LAMP-2B и LAMP-2C. В различных вариантах осуществления полинуклеотид, кодирующий одну или несколько изоформ LAMP-2, обладает по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательностей, например, по меньшей мере приблизительно 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичностью последовательностей, с одной или несколькими из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3. В различных вариантах осуществления полинуклеотид, кодирующий одну или несколько изоформ LAMP-2, содержит одну или несколько из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3.

[0005] В дополнительном аспекте предоставлены способы предотвращения, смягчения, улучшения, снижения, ингибирования, устранения и/или обращения одного или нескольких симптомов болезни Данона или другого нарушения аутофагии у нуждающегося в этом субъекта, включающие введение субъекту вектора для генной терапии, как описано раньше и в настоящем описании (см., например, фиг. 2). В дополнительном аспекте предоставлены способы предотвращения, смягчения, улучшения, снижения, ингибирования, устранения и/или обращения одного или нескольких симптомов болезни Данона или другого нарушения аутофагии у нуждающегося в этом субъекта, включающие введение субъекту вектора аденоассоциированного вируса (AAV), содержащего экспрессирующую кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий одну или несколько изоформ ассоциированного с лизосомами мембранного белка 2 (LAMP-2). В различных вариантах осуществления вектор вводят через путь, выбранный из группы, состоящей из внутривенного, внутриартериального, интракардиального, внутрикоронарного, интрамиокардиального, внутрипочечного, внутриуретрального, эпидурального, внутричерепного, подкожного и внутримышечного. В различных вариантах осуществления вектор доставляют или вводят физическим или механическим способом, выбранным из группы, состоящей из микроинъекции, струйной инъекции, бомбардировки частицами, гидродинамической инфузии, электропорации, сонопорации, лазерного облучения, магнитофекции. В различных вариантах осуществления вектор вводят несколько раз с использованием или без использования иммуносупрессии или плазмофереза у пациента. В различных вариантах осуществления нарушение аутофагии выбирают из группы, состоящей из терминальной сердечной недостаточности, инфаркта миокарда, лекарственных токсичностей, диабета, терминальной почечной недостаточности и старения. В различных вариантах осуществления субъектом является человек. В различных вариантах осуществления субъект проявляет симптомы болезни Данона или другого нарушения аутофагии. В различных вариантах осуществления субъект идентифицирован в качестве имеющего сниженную или не поддающуюся обнаружению экспрессию LAMP-2. В различных вариантах осуществления субъект идентифицирован в качестве имеющего мутантный ген LAMP-2.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[0006] Термин «болезнь Данона» относится к X-сцепленному доминантному нарушению скелетной и сердечной мышцы с полисистемными клиническими манифестациями. Мутации болезни Данона ведут к отсутствию белковой экспрессии ассоциированного с лизосомами мембранного белка 2 (LAMP-2). Основные клинические признаки включают скелетную и кардиомиопатию, аномалии сердечной проводимости, когнитивные затруднения и заболевание сетчатки. Обычно мужчины подвержены поражению раньше и более тяжело, чем женщины.

[0007] Термины «ассоциированный с лизосомами мембранный белок 2» и «LAMP-2» взаимозаменяемо относятся к нуклеиновым кислотам и полиморфным вариантам полипептидов, аллелям, мутантам и межвидовым гомологам, которые: (1) имеют аминокислотную последовательность, которая обладает больше чем приблизительно 90% идентичностью аминокислотных последовательностей, например, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или более высокой идентичностью аминокислотных последовательностей, предпочтительно на протяжении области по меньшей мере приблизительно 25, 50, 100, 200, 300, 400 или больше аминокислоты, или на протяжении всей длины, с аминокислотной последовательностью, кодируемой нуклеиновой кислотой LAMP-2 (см., например, номера доступа GenBank NM_002294.2 (изоформа A), NM_013995.2 (изоформа B), NM_001122606.1 (изоформа C)), или с аминокислотной последовательностью полипептида LAMP-2 (см., например, номера доступа GenBank NP_002285.1 (изоформа A), NP_054701.1 (изоформа B), NP_001116078.1 (изоформа C)); (2) связываются с антителами, например, поликлональными антителами, образованными против иммуногена, содержащего аминокислотную последовательность полипептида LAMP-2 (например, полипептидов LAMP-2, описанных в настоящем описании); или аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой LAMP-2 (например, полинуклеотидами LAMP-2, описанными в настоящем описании), и их консервативно модифицированными вариантами; (3) специфически гибридизуются при строгих условиях гибридизации с антисмысловой цепью, соответствующей последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок LAMP-2, и ее консервативно модифицированными вариантами; (4) имеют последовательность нуклеиновой кислоты, которая имеет больше чем приблизительно 90%, предпочтительно больше чем приблизительно 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более высокую идентичность нуклеотидных последовательностей, предпочтительно на протяжении области по меньшей мере приблизительно 25, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000 или больше нуклеотидов, или на протяжении всей длины, с нуклеиновой кислотой LAMP-2 (например, полинуклеотидами LAMP-2, как раскрыто в настоящем описании, и полинуклеотидами LAMP-2, которые кодируют полипептиды LAMP-2, как раскрыто в настоящем описании).

[0008] Термины «полипептид», «пептид» и «белок» используют взаимозаменяемо в настоящем описании, чтобы отослать к полимеру аминокислотных остатков. Термины применимы к полимерам аминокислот, в которых один или несколько аминокислотных остатков представляют собой искусственный химический миметик соответствующей встречаемой в природе аминокислоты, а также ко встречаемым в природе аминокислотным полимерам и не встречаемым в природе аминокислотным полимерам.

[0009] Термин «аминокислота» относится ко встречаемым в природе и синтетическим аминокислотам, а также аналогам аминокислот и аминокислотным миметикам, которые функционируют таким образом, который схож со встречаемыми в природе аминокислотами. Встречаемые в природе аминокислоты представляют собой те, которые кодируются генетическим кодом, а также те аминокислоты, которые впоследствии подвергают модификации, например, гидроксипролин, α-карбоксиглутамат и O-фосфосерин. Аминокислотные аналоги относится к соединениям, которые имеют ту же базовую химическую структуру, что и встречаемая в природе аминокислота, т. е. α-углерод, который связан с водородом, карбоксильной группой, аминогруппой и группой R, например, гомосерин, норлейцин, метионина сульфоксид, метионина метилсульфоний. Такие аналоги имеют модифицированные группы R (например, норлейцин) или модифицированные пептидные остовы, но сохраняют ту же базовую химическую структуру, что и встречаемая в природе аминокислота. Аминокислотные миметики относится к химическим соединениям, которые имеют структуру, которая отличается от основной химической структуры аминокислоты, но которая функционирует таким образом, который схож со встречаемой в природе аминокислотой.

[0010] Аминокислоты можно упоминать в настоящем описании с помощью их общеизвестных трехбуквенных обозначений или с помощью однобуквенных обозначений, рекомендованных в IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Нуклеотиды, аналогичным образом, можно упоминать с помощью их общепринятых однобуквенных кодов.

[0011] «Консервативно модифицированные варианты» применимы к последовательностям как аминокислот, так и нуклеиновых кислот. В отношении конкретной последовательности нуклеиновой кислоты, консервативно модифицированные варианты относятся к тем нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или по существу идентичные аминокислотные последовательности, или где нуклеиновая кислота не кодирует аминокислотную последовательность, к по существу идентичным последовательностям. По причине вырожденности генетического кода, большое число функционально идентичных нуклеиновых кислот кодируют любой заданный белок. Например, все кодоны GCA, GCC, GCG и GCU кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в каждом положении, где аланин определен кодоном, кодон можно изменять на любой из соответствующих кодонов, описанных без изменения кодируемого полипептида. Такие вариации нуклеиновых кислот представляют собой «молчащие вариации», которые представляют собой один вид консервативно модифицированных вариаций. Каждая последовательность нуклеиновой кислоты в настоящем описании, которая кодирует полипептид, также описывает каждую возможную молчащую вариацию нуклеиновой кислоты. Специалист примет во внимание, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением AUG, который, как правило, является единственным кодоном для метионина, и TGG, который, как правило, является единственным кодоном для триптофана) можно модифицировать для получения функционально идентичной молекулы. Соответственно, каждая молчащая вариация нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, является скрытой в каждой описанной последовательности.

[0012] Что касается аминокислотных последовательностей, специалист примет во внимание, что индивидуальные замены, делеции или добавления в последовательности нуклеиновой кислоты, пептида, полипептида или белка, которые изменяют, добавляют или удаляют одну аминокислоту или небольшую процентную долю аминокислот в кодируемой последовательности, представляют собой «консервативно модифицированный вариант», где изменение ведет к замене аминокислоты на химически схожую аминокислоту. Таблицы консервативных замен, в которых приведены функционально схожие аминокислоты, хорошо известны в данной области. Такие консервативно модифицированные варианты дополняют и не исключают полиморфные варианты, межвидовые гомологи и аллели по изобретению.

[0013] Каждая из следующих восьми групп содержит аминокислоты, которые представляют собой консервативные замены друг для друга:

1) аланин (A), глицин (G);

2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (E);

3) аспарагин (N), глутамин (Q);

4) аргинин I, лизин (K);

5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (M), валин (V);

6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W); и

7) серин (S), треонин (T)

[0014] «Полинуклеотид» представляет собой одно- или двухцепочечный полимер дезоксирибонуклеотидных или рибонуклеотидных оснований, читаемый от 5'- к 3'-концу. Полинуклеотиды включают РНК и ДНК, и их можно выделять из природных источников, синтезировать in vitro или получать из комбинации природных и синтетических молекул. Размеры полинуклеотидов выражают в парах оснований (сокращенно «п. о.»), нуклеотидах («н.») или тысячах оснований («т. о.»). Когда контекст позволяет, последние два термина могут описывать полинуклеотиды, которые являются одноцепочечными или двухцепочечными. Когда термин применяют к двухцепочечным молекулам, его используют для обозначения длины, и его следует понимать как эквивалент термина «пары оснований». Специалисты в данной области примут во внимание, что две цепи двухцепочечного полинуклеотида могут слегка различаться по длине и что их концы могут быть смещены в результате ферментативного расщепления; таким образом, все нуклеотиды в двухцепочечной молекуле полинуклеотида могут не быть спаренными.

[0015] Термины «идентичный» или процент «идентичности» в контексте двух или больше нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей относятся к двум или больше последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют конкретную процентную долю аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми (т. е. обладают по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью, например, по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичностью на протяжении точно определенной области эталонной последовательности, например, полинуклеотид LAMP-2 или полипептидная последовательность, как раскрыто в настоящем описании, при сравнении и выравнивании для максимального соответствия на протяжении окна сравнения, или обозначенной области, как измеряют с использованием одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или посредством выравнивания вручную и визуальной проверки. Тогда такие последовательности представляют собой так называемые «по существу идентичные». Это определение также относится к дополнению тестовой последовательности. Предпочтительно, идентичность имеет место на протяжении области, которая составляет по меньшей мере приблизительно 25 аминокислот или нуклеотидов в длину, например, на протяжении области, которая составляет 50, 100, 200, 300, 400 аминокислот или нуклеотидов в длину или на протяжении всей длины эталонной последовательности.

[0016] При сравнении последовательностей обычно одна последовательность выполняет функцию эталонной последовательности, с которой сравнивают тестовые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестовую и эталонную последовательности вводят в компьютер, обозначают координаты подпоследовательностей, в случае необходимости, и задают параметры программы с алгоритмом последовательностей. Можно использовать параметры программы по умолчанию или можно задавать альтернативные параметры. Затем алгоритм сравнения последовательностей вычисляет процент идентичности последовательностей для тестовых последовательностей относительно эталонной последовательности, на основании параметров программы. Для сравнения последовательностей нуклеиновых кислот и белков с нуклеиновыми кислотами и белками LAMP-2 используют алгоритмы BLAST и BLAST 2.0 и параметры по умолчанию.

[0017] «Окно сравнения», как используют в настоящем описании, включает указание на сегмент любой одной из множества непрерывных положений, выбранных из группы, состоящей из от 20 до 600, обычно приблизительно от 50 приблизительно до 200, более обычно приблизительно от 100 приблизительно до 150, где последовательность можно сравнивать с эталонной последовательностью с тем же числом непрерывных положений после оптимального выравнивания двух последовательностей. Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно проводить, например, с помощью алгоритма локальной гомологии Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), с помощью алгоритм гомологичного выравнивания Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), с помощью способа поиск сходства Pearson and Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), с помощью компьютерных реализаций этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) или с помощью выравнивания вручную и визуальной проверки (см., например, Ausubel et al., ред., Current Protocols in Molecular Biology (1995, приложение)). Примеры алгоритмов, которые подходят для определения процента идентичность последовательностей и сходства последовательностей, представляют собой алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, которые описаны в Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990) и Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1977), соответственно. Программное обеспечение для осуществления анализа BLAST общедоступно через National Center for Biotechnology Information (во всемирной сети по адресу ncbi.nlm.nih.gov/).

[0018] Указание на то, что две последовательности нуклеиновой кислоты или полипептида по существу идентичны, состоит в том, что полипептид, кодируемый первой нуклеиновой кислотой, обладает иммунологической перекрестной реактивностью с антителами, образованными против полипептида, кодируемого второй нуклеиновой кислотой, как описано ниже. Таким образом, полипептид обычно по существу идентичен второму полипептиду, например, когда два пептида различаются только консервативными заменами. Другое указание того, что две последовательности нуклеиновой кислоты по существу идентичны, состоит в том, что две молекулы или их комплементы образуют гибрид друг с другом при строгих условиях, как описано ниже. Еще одно другое указание на то, что две последовательности нуклеиновой кислоты по существу идентичны, состоит в том, что можно использовать те же праймеры для амплификации последовательности.

[0019] Как используют в настоящем описании, «введение» относится к локальному и системному введению, например, в том числе энтеральному, парентеральному, легочному и топическому/трансдермальному введению. Пути введения для соединений (например, полинуклеотид, кодирующего одну или несколько изоформ LAMP-2), которые находят применение в способах, описанных в настоящем описании, включают, например, оральное (per os (P.O.)) введение, назальное или ингаляционное введение, введение в виде суппозитория, топический контакт, трансдермальную доставку (например, через трансдермальный пластырь), интратекальное (IT) введение, внутривенное («iv») введение, интраперитонеальное («ip») введение, внутримышечное («im») введение, введение внутрь повреждения или подкожное («sc») введение или имплантацию устройства с медленным высвобождением, например, миниосмотического насоса, состава депо и т. д., субъекту. Введение может происходить через любой путь, включая парентеральный и чресслизистый (например, оральный, назальный, вагинальный, ректальный или трансдермальный). Парентеральное введение включает, например, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, внутрипочечное, внутриуретральное, интракардиальное, внутрикоронарное, интрамиокардиальное, внутрикожное, эпидуральное, подкожное, интраперитонеальное, внутрижелудочковое, ионофоретическое и внутричерепное. Другие способы доставки включают, но не ограничиваясь этим, использование липосомных составов, внутривенную инфузию, трансдермальные пластыри и т.д.

[0020] Термины «системное введение» и «системно введенный» относятся к способу введения соединения или композиции млекопитающему с тем, чтобы доставлять соединение или композицию в определенные места в организме, в том числе целевые места фармацевтического действия, через кровеносную систему. Системное введение включает, но не ограничиваясь этим, оральное, интраназальное, ректальное и парентеральное (например, отличное от введения через пищеварительный тракт, такое как внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, трансдермальное и подкожное) введение.

[0021] Термин «совместное введение» или «параллельное введение», когда используют, например, в отношении соединений (например, полинуклеотидов LAMP-2) и/или их аналогов и другого активного средства, относится к введению соединения и/или аналогов и активного средства так, что оба могут одновременно достигать физиологического эффекта. Однако два средства не обязательно вводят вместе. В определенных вариантах осуществления введение одного средства может предшествовать введению другого. Одновременный физиологический эффект не обязательно требует присутствия обоих средств в циркуляции одновременно. Однако в определенных вариантах осуществления совместное введение обычно ведет к тому, что значительная доля (например, 20% или более, например, 30% или 40% или более, например, 50% или 60% или более, например, 70% или 80% или 90% или более) обоих средств одновременно присутствует в организме (например, в плазме) от максимальной концентрации в сыворотке для любой заданной дозы.

[0022] Термин «эффективное количество» или «фармацевтически эффективное количество» относится к количеству и/или дозе и/или схеме дозирования одного или нескольких соединений (например, векторов для генной терапии), необходимым для получения желаемого результата например, повышенной экспрессии одной или нескольких изоформ LAMP-2 в количестве, достаточном для того, чтобы снижать основную тяжесть заболевания, отличающегося ослабленной или недостаточной аутофагией (например, болезни Данона).

[0023] Фраза «вызывать введение» относится к действиям, предпринимаемым профессиональным медиком (например, врачом) или человеком, контролирующим медицинский уход за субъектом, который контролирует и/или разрешает введение рассматриваемого средства(в)/соединения(й) субъекту. Вызывать введение может диагностирование и/или определение подходящей терапевтической или профилактической схемы и/или предписание конкретного средства(в)/соединений субъекту. Такое предписание может включать, например, составление рецептурного бланка, аннотирование медицинской записи и т.п.

[0024] Фраза «в сочетании с», когда используют по отношению к использованию активного средства(в), описанного в настоящем описании (например, одной или нескольких изоформ полинуклеотида LAMP-2), в сочетании с одним или несколькими другими лекарственными средствами, описанными в настоящем описании (например, ингибитор ацетилхолинэстеразы), активное средство(а) и другое лекарственное средство(а) вводят с тем, чтобы имело место по меньшей мере некоторое хронологические наложение их физиологической активности в организме. Когда их не вводят в сочетании друг с другом, хронологическое наложение физиологической активности в организме отсутствует. В определенных предпочтительных вариантах осуществления «другое лекарственное средство(а)» не вводят вовсе (например, не вводят совместно) в организм.

[0025] Как используют в настоящем описании, термины «лечить» и «лечение» относятся к задержке начала, замедлению или обращению прогресса, снижению тяжести или облегчению или предотвращению заболевания или состояния, к которому применяют термин, или одного или нескольких симптомов такого заболевания или состояния.

[0026] Термин «смягчение» относится к снижению или устранению одного или нескольких симптомов этой патологии или заболевания и/или к снижению скорости или задержке начала или тяжести одного или нескольких симптомов этой патологии или заболевания и/или предотвращению этой патологии или заболевания. В определенных вариантах осуществления снижение или устранение одного или нескольких симптомов патологии или заболевания может включать, например, поддающееся измерению и длительное увеличение уровней экспрессии одной или нескольких изоформ LAMP-2.

[0027] Как используют в настоящем описании, фраза «состоит по существу из» относится к семействам или видам активных фармацевтических средств, перечисленных в способе или композиции, и дополнительно может включать другие средства, которые сами по себе не имеют существенной активности в отношении изложенного показания или цели.

[0028] Термины «субъект», «индивидуум» и «пациент» взаимозаменяемо относятся к млекопитающему, предпочтительно человеку или не являющемуся человеком примату, а также к одомашненным млекопитающим (например, псовым или кошачьим), лабораторным млекопитающим (например, мышь, крыса, кролик, хомяк, морская свинка) и сельскохозяйственным млекопитающим (например, лошадь, корова, свинья, овца). В различных вариантах осуществления, субъектом может являться человек (например, взрослый мужчина, взрослая женщина, мужчина-подросток, женщина-подросток, мальчик, девочка), за которым ухаживает врач или другой работник здравоохранения в больнице, учреждении психиатрического ухода, в качестве амбулаторного пациента или в другом клиническом контексте. В определенных вариантах осуществления субъект может не иметь ухода или предписания врача или другого работника здравоохранения.

[0029] Термины «перенос генов» или «доставка генов» относятся к способам или системам для надежного встраивания чужеродной ДНК в клетки-хозяева. Такие способы могут вести ко временной экспрессии не встроенной перенесенной ДНК, внехромосомной репликации и экспрессии перенесенных репликонов (например, эписом) или встраивания перенесенного генетического материала в геномную ДНК клеток-хозяев.

[0030] Под «AAV вектором» понимают вектор, полученный из аденоассоциированного вируса определенного серотипа, в том числе без ограничения AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6 и т. д. AAV векторы могут иметь один или несколько генов AAV дикого типа, которые удалены целиком или частично, например, гены rep и/или cap, но сохраняют последовательности функциональных фланкирующих инвертированных концевых повторов (ITR). Последовательности функциональный ITR необходимы для спасения, репликации и упаковки вириона AAV. Таким образом, AAV вектор определяют в настоящем описании как содержащий по меньшей мере те последовательности, которые необходимы в цис для репликации и упаковки (например, функциональные ITR) вируса. ITR, не обязательно представляют собой нуклеотидные последовательности дикого типа, и их можно изменять, например, посредством инсерции, делеции или замены нуклеотидов, до тех пор пока последовательности обеспечивают функциональное спасение, репликацию и упаковку. AAV экспрессирующие векторы конструируют с использованием известных способов, чтобы по меньшей мере предоставлять, в виде функционально связанных компонентов в направлении транскрипции, управляющие элементы, включая область инициации транскрипции, ДНК, представляющую интерес (т. е. ген LAMP-2), и область терминации транскрипции.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

[0031] На фиг. 1 проиллюстрирована схема аденоассоциированных вирусных конструкций для доставки генов LAMP-2. В целом, следует понимать, что указанная кодирующая область ассоциированного с лизосомами мембранного белка (LAMP) LAMP-2 включает последовательность связывания рибосомы и инициирующий кодон выше по направлению считывания, но в некоторых вариантах осуществления нативный элемент можно заменять на гетерологичный. Участок связывания рибосомы выше по направлению считывания не используют в комбинации с кодирующими областями ниже по направлению считывания от IRES или саморасщепляющегося пептида. Инициирующий кодон не обязательно присутствует в кодирующих областях ниже по направлению считывания от саморасщепляющегося пептида. На фиг. 1A-1F представлены геномы векторов, содержащие одну изоформу LAMP-2. На фиг. 1G-1K представлены геномы векторов, содержащие две изоформы LAMP-2. На фиг. 1L-1O представлены геномы векторов, содержащие все три изоформы LAMP-2. На фиг. используют следующие сокращения: ITR: инвертированный концевой повтор; LAMP-2: ассоциированный с лизосомами мембранный белок 2 типа; UTR: нетранслируемая область; Poly A: сигнал полиаденилирования; CAG: промоторная область, содержащая последовательности энхансера CMV и промотора CBA; CMV: цитомегаловирус; CBA: β-актин курицы; WPRE: посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков; RBG: сигнал полиаденилирования β-глобина кролика; EF-1: фактор элонгации-1 человека; IRES: внутренний участок связывания рибосомы; P2A: 2A пептид.

[0032] На фиг. 1A представлена схема конструкции, содержащей кодирующую белок информацию для одной изоформы LAMP-2 - A, B или C - с обычными 5' и 3' управляющими областями.

[0033] На фиг. 1B представлена схема конструкции по некоторым вариантам осуществления и использованная в примерах далее, которая состоит из 5' и 3' элементов инвертированных концевых повторов, промоторной области CAG, содержащей последовательности энхансера CMV и промотора CBA, интрона CBA, кодирующей последовательности для одной из изоформ LAMP-2, включая последовательность связывания рибосомы и инициирующий кодон выше по направлению считывания, последовательности WPRE в качестве 3' UTR и сигнала полиаденилирования бета-глобина кролика.

[0034] На фиг. 1C представлена схема конструкции, содержащей область промотора нативного LAMP-2 человека. В некоторых вариантах осуществления эту конструкцию используют для экспрессии трансгена в ответ на клеточные сигналы, которые обычно ведут к экспрессии LAMP-2 в нормальных клетках.

[0035] На фиг. 1D представлена схема конструкции, содержащей промотор фактора элонгации-1α человека. В некоторых вариантах осуществления эту конструкцию используют для конститутивной экспрессии трансгена под управлением промоторной области человека. Другие конститутивно активные промоторы человека также можно использовать вместо EF-1α.

[0036] На фиг. 1E представлена схема конструкции, содержащей сердечный специфический промотор, такой как, но не ограничиваясь этим, промотор тропонина T2 сердца. В некоторых вариантах осуществления эту конструкцию используют для экспрессии трансгена только в сердечной ткани (и, например, избегания экспрессии в печени).

[0037] На фиг. 1F представлена схема конструкции, содержащей мышечный специфический промотор, такой как, но не ограничиваясь этим, промотор креатининкиназы мышц. В некоторых вариантах осуществления эту конструкцию используют для экспрессии трансгена в сердечной и скелетной мышце (и избегания экспрессии вне мышц).

[0038] На фиг. 1G представлена схема конструкции, содержащей кодирующие последовательности для двух изоформ LAMP-2 (с использованием любой возможной комбинации) под управлением различных областей промоторов. В некоторых вариантах осуществления эту конструкцию (а также те, что на фиг. с 1H до 1K) используют для экспрессии двух различных изоформ LAMP-2 с использованием одного и того же вирусного генома.

[0039] На фиг. 1H представлена схема конструкции, содержащей последовательности для двух изоформ LAMP-2 (с использованием любой возможной комбинации) под управлением различных областей промоторов. Одна изоформа закодирована в (+) направлении на одноцепочечном AAV геноме и другая изоформа закодирована в (-) направлении. В некоторых вариантах осуществления эту конструкцию используют для экспрессии двух различных изоформ LAMP-2 на отдельных нитях ДНК.

[0040] На фиг. 1I представлена схема конструкции, содержащей кодирующие последовательности для двух изоформ LAMP-2 (с использованием любой возможной комбинации) под управлением области промотора и внутреннего участка связывания рибосомы, соответственно, после чего следуют сигналы 3' UTR и Poly A. В некоторых вариантах осуществления эту конструкцию используют для экспрессии двух различных изоформ LAMP-2, используя один и тот же вирусный геном.

[0041] На фиг. 1J представлена схема конструкции, содержащей кодирующие последовательности для двух изоформ LAMP-2 (с использованием любой возможной комбинации), разделенные сайтом расщепления P2A. В некоторых вариантах осуществления эту конструкцию используют для экспрессии мРНК, кодирующей две различные изоформы LAMP-2, в одном полипептиде, который будет самопроизвольно расщепляться на индивидуальные изоформы белка LAMP-2 после трансляции через саморасщепление пептида 2A, используя один и тот же вирусный геном.

[0042] На фиг. 1K представлена схема конструкции, содержащей кодирующую последовательность для экзонов 1-8 LAMP-2, после чего следует интронная область (содержащая все необходимые сигналы сплайсинга), кодирующая последовательность экзона 9 для одной из изоформ LAMP-2 с 3' UTR и сигналом Poly A, вторая интронная область (содержащая все необходимые сигналы сплайсинга), и кодирующая последовательность экзона 9 для другой изоформы LAMP-2 (в любой возможной комбинации) с 3' UTR и сигналом Poly A. В некоторых вариантах осуществления эту конструкцию используют для экспрессии мРНК для двух различных изоформ LAMP-2 через альтернативный сплайсинг, который является механизмом, который создает мРНК различных LAMP-2 в нормальных клетках, используя один и тот же вирусный геном.

[0043] На фиг. 1L представлена схема конструкции, содержащей кодирующие последовательности для всех трех изоформ LAMP-2, с сигналами 3' UTR и Poly A, под управлением различных областей промоторов. В некоторых вариантах осуществления эту конструкцию используют для экспрессии всех трех различных изоформ LAMP-2, используя один и тот же вирусный геном, что позволяет восстанавливать все возможные функции LAMP-2.

[0044] На фиг. 1M представлена схема конструкции, содержащей кодирующие последовательности для всех трех изоформ LAMP-2, в любом порядке, под управлением области промотора и двух различных внутренних участков связывания рибосомы, после чего следуют сигналы 3' UTR и Poly A. В некоторых вариантах осуществления эту конструкцию используют для экспрессии всех трех изоформ LAMP-2, используя один и тот же вирусный геном.

[0045] На фиг. 1N представлена схема конструкции, содержащей кодирующие последовательности для всех трех изоформ LAMP-2, в любом возможном порядке, которые разделены сайтами расщепления P2A. В некоторых вариантах осуществления эту конструкцию используют для экспрессии мРНК, кодирующей три различные изоформы LAMP-2 в одном полипептиде, которые самопроизвольно расщепляются на индивидуальные белки изоформ LAMP-2 после трансляции через саморасщепление 2A пептида, используя один и тот же вирусный геном.

[0046] На фиг. 1O представлена схема конструкции, содержащей кодирующую последовательность для экзонов 1-8 LAMP-2, после чего следует интронная область (содержащая все необходимые сигналы сплайсинга), кодирующая последовательность экзона 9 для одной из изоформ LAMP-2 с 3' UTR и сигналом Poly A, вторая интронная область (содержащая все необходимые сигналы сплайсинга) и кодирующая последовательность экзона 9 для второй изоформы LAMP-2 с 3' UTR и сигналом Poly A, третья интронная область (содержащая все необходимые сигналы сплайсинга) и кодирующая последовательность экзона 9 для третьей изоформы LAMP-2 с 3' UTR и сигналом Poly A. В некоторых вариантах осуществления эту конструкцию используют для экспрессии мРНК для всех трех изоформ LAMP-2 через альтернативный сплайсинг, который является механизмом, который создает различные мРНК LAMP-2 в нормальных клетках, используя один и тот же вирусный геном. Кодирующие последовательности экзонов 9 можно заменять в любом возможном порядке и комбинации.

[0047] На фиг. 2 проиллюстрирована блок-схема способа терапевтического лечения (например, болезни Данона или другого заболевания, вызываемого по меньшей мере отчасти недостаточностью аутофагии) посредством содействия экспрессии одной или нескольких изоформ LAMP-2.

[0048] На фиг. 3A-F представлены кодирующие изоформы LAMP-2 и белковые последовательности: фиг. 3A: кодирующая LAMP-2A последовательность; фиг. 3B: последовательность белка LAMP-2A; фиг. 3C: кодирующая LAMP-2B последовательность; фиг. 3D: последовательность белка LAMP-2B; фиг. 3E: кодирующая LAMP-2C последовательность; и фиг. 3F: последовательность белка LAMP-2C.

[0049] На фиг. 4A-C приведено сравнение последних 90 аминокислот последовательностей белков LAMP-2A (фиг. 4A), LAMP-2B (фиг. 4B) и LAMP-2C (фиг. 4C) человека и мыши, которые показывают идентичность последовательностей.

[0050] На фиг. 5A-B проиллюстрировано дозозависимое увеличение экспрессии мРНК LAMP-2B (фиг. 5A) и LAMP-2A (фиг. 5B) после введения векторов AAV9, несущих эти гены.

[0051] На фиг. 6 проиллюстрировано дозозависимое увеличение экспрессии белка LAMP-2B и LAMP-2A после введения AAV9 векторов, несущих эти гены.

[0052] На фиг. 7A-C представлены флуоресцентные микрофотографии срезов сердца, окрашенных DAPI (синий) и флуоресцентно-меченным антителом к LAMP-2 (белый). На фиг. 7A показан срез сердца мыши с нокаутом (KO) Lamp-2, которую лечили с использованием AAV9.LAMP-2B. На фиг. 7B показан срез сердца мышь с KO Lamp-2, которую лечили с использованием AAV9.EGFP. На фиг. 7C представлен срез сердца мыши дикого типа (WT), которую не лечили.

[0053] На фиг. 8A-B показаны флуоресцентные микрофотографии срезов сердца, окрашенных DAPI (синий) и флуоресцентно-меченным антителом к LAMP-2 (белый; некоторые примеры помечены стрелками). На фиг. 7A представлен срез сердца мыши с KO Lamp-2, которую лечили с использованием AAV9.LAMP-2B. На фиг. 7B представлен срез сердца мыши с KO Lamp-2, которую лечили с использованием AAV9.EGFP.

[0054] На фиг. 9A-H проиллюстрирована аутофагическая репортерная система CAG-RFP-EGFP-LC3B. На фиг. 9A приведено схематическое представление работы системы. На фиг. 9B-G' представлены изображения флуоресцентной микроскопии; изображения X' (X штрих) представляют собой увеличение вставок, обозначенных на изображениях, помеченных той же буквой без штриха. В отношении сетки фиг. 9B-G'; первая колонка представляет собой изображения красной флуоресценции; вторая колонка представляет собой изображения зеленой флуоресценции; третья колонка представляет собой слитые изображения из первой и второй колонок, желтый представляет красную+зеленую флуоресценцию; верхние два ряда представляют собой изображения срезов сердца от мышей WT, экспрессирующих аутофагическую репортерную конструкцию CAG-RFP-EGFP-LC3B; два нижних ряда представляют собой изображения срезов сердца мышей с KO Lamp-2, экспрессирующих аутофагическую репортерную конструкцию CAG-RFP-EGFP-LC3B. незрелые аутофагосомы флуоресцируют как зеленым, так и красным (или желтым на слитых изображениях). Зрелые аутолизосомы флуоресцируют только красным. Желтые стрелки обозначают аутофагические вакуоли, флуоресцирующие обоими цветами, тогда как белые стрелки обозначают аутофагические вакуоли, флуоресцирующие только красным. На фиг. 9H проиллюстрировано число аутофагических вакуолей, которые представляют собой аутофагосомы или аутолизосомы у мышей WT и с KO Lamp-2.

[0055] На фиг. 10A-E проиллюстрирован эффект -2 генной терапии с использованием аутофагической репортерной системы CAG-RFP-EGFP-LC3B. На фиг. 10A приведено изображение среза сердца мыши WT без лечения. На фиг. 10B приведено изображение среза сердца, показывающее трансдуцированные клетки от мыши с KO Lamp-2, которую лечили с использованием контрольного вектора AAV9.EGFP. На фиг. 1°C приведено изображение среза сердца мыши с KO Lamp-2, которую лечили с использованием вектора для генной терапии AAV9.LAMP-2A. На фиг. 10D приведено изображение среза сердца мыши с KO Lamp-2, которую лечили с использованием вектора для генной терапии AAV9.LAMP-2B. На изображениях фиг. 10A, 1°C и 10D красные стрелки используют для обозначения некоторых из присутствующих аутолизосом. На фиг. 10E проиллюстрирована доля от всех аутофагических вакуолей, представленных аутофагосомами и аутолизосомами для четырех состояний.

[0056] На фиг. 11A-C' представлены электронные микрофотографии ткани сердца от мышей WT (фиг. 11A, A') и с KO Lamp-2 (фиг. 11B, B') и мыши с KO Lamp-2, которую лечили с использованием AAV9.LAMP-2B (фиг. 11C, C'). Белые стрелки обозначают некоторые из аутофагических вакуолей. Черные стрелки обозначают некоторые из поврежденных митохондрий.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

1. Введение

[0057] Болезнь Данона обусловлена мутациями, ведущими к сниженной или нулевой экспрессии гена ассоциированного с лизосомами мембранного белка 2 (LAMP-2, также известен как CD107b). Данные способы основаны отчасти на введении одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих одну или несколько изоформ LAMP-2, например, упакованных в вектор аденоассоциированного вируса (AAV), для того, чтобы доставлять ген LAMP-2/отдельных изоформ пациентам с болезнью Данона. После доставки одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих одну или несколько изоформ LAMP-2, трансген LAMP-2 экспрессируют собственные клетки пациента. Восстановление экспрессии гена LAMP-2 у пациентов с болезнью Данона может вести к улучшению фенотипа заболевания, что служит в качестве терапии этого заболевания. Доставку одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих одну или несколько изоформ LAMP-2, субъекту также можно использовать для лечения других нарушений аутофагии, включая в качестве неограничивающих примеров терминальную сердечную недостаточность, инфаркте миокарда лекарственные токсичности, диабет, терминальную почечную недостаточность и старение. Аномалии аутофагии, в частности сниженный аутофагический поток, вовлечены в эти нарушения, а также многие другие. Экспрессия более высоких уровней гена LAMP-2 увеличивает аутофагический поток и, следовательно, служит в качестве лечения этих нарушений.

[0058] На данном уровне техники не существует лечения болезни Данона способами генной терапии. Болезнь Данона не является традиционной лизосомальной болезнью накопления, которую в целом определяют как недостаточность лизосомального белка (например, транспортера или фермента), который необходим для обработки конкретного клеточного субстрата, результатом чего является токсическое накопление этого конкретного субстрата в лизосомах. Болезнь Данона понимают как нарушение аутофагии или аутофагическую вакуолярную миопатию, которая вызывает разрушение всех клеточных компонентов, подверженных обработке с помощью аутофагического пути и которая не обусловлена накоплением конкретного субстрата. Дополнительно, в существующем уровне техники не описана в явной форме доставка гена LAMP-2/отдельных изоформ для лечения болезни Данона или других нарушений аутофагии. Следовательно, данные способы предоставляют уникальный способ лечения болезни Данона и улучшает существующие AAV технологии за счет явного включения доставки гена LAMP-2 в качестве средства для улучшения нарушений аутофагии.

2. Пациенты, подлежащие лечению

[0059] Субъекты/пациенты, поддающиеся лечению с использованием способов, описанных в настоящем описании, включают индивидуумов с риском заболевания или нарушения, которое отличается недостаточным аутофагическим потоком (например, болезни Данона, а также других известных нарушений аутофагии, включая в качестве неограничивающих примеров систолическую и диастолическую сердечную недостаточность, инфаркт миокарда, лекарственные токсичности (например, антрациклины хлорохин и его производные), диабет, терминальная стадия почечной недостаточности и старение) но не проявляет симптомы, а также субъектов, проявляющих симптомы в настоящее время. Такого субъект можно идентифицировать как имеющего мутантный ген LAMP-2 или как имеющего сниженные или не поддающиеся обнаружению уровни экспрессии LAMP-2.

[0060] В некоторых вариантах осуществления субъект проявляет симптомы заболевания или нарушения, которое отличается недостаточным аутофагическим потоком (например, болезни Данона, а также других известных нарушений аутофагии, включая в качестве неограничивающих примеров систолическую и диастолическую сердечную недостаточность, инфаркт миокарда, лекарственные токсичности, диабет, терминальную стадию почечной недостаточности и старение). Симптомы могут быть активно проявляемыми или могут быть подавленными или контролируемыми (например, с помощью медикаментозного лечения) или в ремиссии. У субъекта может быть или может не быть диагностировано нарушение, например, квалифицированным врачом.

[0061] Субъектом может являться любое млекопитающее на любом этапе развития во время доставки, таком как эмбриональный, плодный, детский, подростковый или взрослый. В различных вариантах осуществления, субъектом является ребенок, подросток или взрослый. В различных вариантах осуществления, субъектом является млекопитающее, например, человек или одомашненное млекопитающее (например, псовое или кошачье).

3. Векторы доставки полинуклеотида LAMP-2

[0062] В целом, векторы для генной терапии, описанные в настоящем описании, содержат экспрессирующую кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий одну или несколько изоформ ассоциированного с лизосомами мембранного белка 2 (LAMP-2), который делает возможной экспрессию LAMP-2 для частичного или полного исправления уровней экспрессии дефицитного белка LAMP-2 и аутофагического потока у нуждающегося в этом субъекта (например, у субъекта, имеющего болезнь Данона или другое нарушение, отличающееся недостаточным аутофагическим потоком, по меньшей мере отчасти, из-за недостаточности экспрессии LAMP-2). Векторы для генной терапии могут представлять собой вирусные или невирусные векторы. Иллюстративные невирусные векторы включают, например, депротеинизированную ДНК, катионные липосомальные комплексы, катионные полимерные комплексы, катионные липосомально-полимерные комплексы и экзосомы.

[0063] В некоторых вариантах осуществления вектор несет одну изоформу, LAMP-2A, LAMP-2B или LAMP-2C; см., например, фиг. 1A-F, где представлена схема AAV вектора, несущего ген для одной изоформы LAMP-2. В других вариантах осуществления вектор несет гены для двух изоформ LAMP-2; см., например, фиг. 1G-K, где представлена схема AAV векторов, несущих ген для двух изоформ LAMP-2, LAMP-2B на одной нити ДНК и LAMP-2A на другой нити ДНК. Другие варианты осуществления несут все три изоформы (см. фиг. 1L-O). В дополнение к изображенным геномным структурам, векторы с тремя изоформами также можно сконструировать посредством создания гибридов различных представленных вариантов осуществления. Например, могут иметь место два промотора, один управляет экспрессией одной изоформы, а другой управляет экспрессией кассеты с двумя изоформами с использованием IRES, саморасщепляющегося пептида или альтернативного сплайсинга. В различных вариантах осуществления, содержащих несколько изоформ, изоформы встречаются в любом порядке, или отражающем естественный порядок B, A, C, или изменяя его. С помощью одного вектора, несущего несколько изоформ, можно обеспечивать совместную экспрессию изоформ в трансфицированных клетках и использовать меньше полных векторных частиц в дозе.

[0064] Примеры вирусного вектора включают, но без ограничения, аденовирусные, ретровирусные, лентивирусные, герпесвирусные векторы и векторы аденоассоциированных вирусов (AAV). Вирусные векторы доставки генов, которые можно использовать при практической реализации настоящего изобретения, можно сконструировать с использованием способов, хорошо известных в области молекулярной биологии. Обычно вирусные векторы, несущие трансгены, собирают из полинуклеотидов, кодирующих трансген, подходящих регуляторных элементов и элементов, необходимых для продуцирования вирусных белков, которые опосредуют трансдукцию клетки,

[0065] Такие рекомбинантные вирусы можно получать способами, известными в данной области, например, посредством трансфекции упаковывающих клеток или посредством временной трансфекции с использованием плазмид- или вирусов-помощников. Типичные примеры упаковывающих вирус клеток включают, но не ограничиваясь этим, клетки PA317, клетки PsiCRIP, клетки GPenv+, клетки 293 и т. д. Подробные протоколы получения таких рекомбинантных вирусов с дефектом репликации можно найти, например, в WO95/14785, WO96/22378, патенте США № 5882877, патенте США № 6013516, патенте США № 4861719, патенте США № 5278056 и WO94/19478, полное содержание каждого из которых, таким образом, включено посредством ссылки.

[0066] В некоторых вариантах осуществления генный вирусный вектор представляет собой аденовирусный вектор или вектор аденоассоциированного вируса (AAV). В различных вариантах осуществления AAV вектор выбирают из серотипов AAV AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AA5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAVrh10 и их подгрупп и смесей, включая самокомплементарные геномы AAV (scAAV) или любые другие серотипы AAV, которые могут инфицировать человека, обезьян или другие виды. В одном из вариантов осуществления AAV вектор представляет собой AAVrh10. В другом варианте осуществления AAV вектор представляет собой AAV9. В другом варианте осуществления AAV вектор представляет собой AAV8. Часто для доставки терапевтических генов используют рекомбинантные AAV (rAAV) векторы, которые изучали в клинических исследованиях у человека. rAAV векторы можно разрабатывать для того, чтобы доставлять конкретные трансгены в клетки пациента для экспрессии. После инфекции и введения вирусного генома с помощью rAAV вектора, вирусные гены существуют главным образом в виде внехромосомных структур, которые не встраиваются в геном хозяина, но их экспрессирует трансляционный аппарат клетки-хозяина. Для успешной инфекции клетки-хозяина и экспрессии гена rAAV векторам необходимы некоторые компоненты (см. фиг. 1): элементы инвертированных концевых повторов (ITR), область промотора и/или энхансера, трансген и 3'-нетранслируемая область и сигнал полиаденилирования. После вирусной инфекции клеток-хозяев, область промотора инициирует сигналы для трансляции трансгена, доставленного вирусом, с помощью трансляционного аппарата клетки-хозяина.

[0067] В целом, выбирают управляющие элементы, которые функциональны в клетке млекопитающего. Получаемую конструкцию, которая содержит функционально связанные компоненты, связывают (5' и 3') с функциональными AAV ITR последовательностями. Под «аденоассоциированными вирусными инвертированными концевыми повторами» или «AAV ITR» понимают участки, принятые в данной области, которые встречаются на каждом конце AAV генома, которые функционируют вместе в цис в качестве точек начала репликации для репликации ДНК и в качестве сигналов упаковки для вируса. AAV ITR, вместе с AAV кодирующей областью rep, обеспечивают эффективное вырезание и спасение, а также встраивание нуклеотидной последовательности, расположенной между двумя фланкирующими ITR, в геном клетки млекопитающего. Нуклеотидные последовательности AAV областей ITR известны. AAV2 последовательности см., например, в Kotin, 1994; Berns, K I «Parvoviridae and their Replication» в Fundamental Virology, 2-е изд., (ред. B. N. Fields и D. M. Knipe, полное содержание которого, таким образом, включено посредством ссылки). Как используют в настоящем описании, «AAV ITR» не обязательно содержит нуклеотидную последовательность дикого типа, и ее можно изменять, например, посредством инсерции, делеции или замены нуклеотидов.

[0068] Дополнительно, AAV ITR можно извлекать из любого из нескольких серотипов AAV, в том числе без ограничения AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AA5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAVrh10. Кроме того, 5' и 3' ITR, которые фланкируют выбранную нуклеотидную последовательность в AAV векторе, не обязательно должны быть идентичны или получены из одного и того же серотипа или изолята AAV, при условии, что они выполняют планируемую функцию, т. е. делают возможной экспрессию и спасение последовательности, представляющей интерес, из генома клетки-хозяина или вектора и делают возможным встраивание гетерологичной последовательности в геном клетки-реципиента, когда продукты генов AAV Rep присутствуют в клетке. Дополнительно, AAV ITR можно извлекать из любого из нескольких серотипов AAV, в том числе без ограничения AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AA5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAVrh10. Кроме того, 5' и 3' ITR, которые фланкируют выбранную нуклеотидную последовательность в AAV экспрессирующем векторе, не обязательно должны быть идентичны или получены из одного и того же серотипа или изолята AAV, при условии, что они выполняют планируемую функцию, т. е. делают возможным вырезание и спасение последовательности, представляющей интерес, из генома клетки-хозяина или вектора, и делают возможным встраивание молекулы ДНК в геном клетки-реципиента, когда продукты генов AAV Rep присутствуют в клетке.

[0069] В различных вариантах осуществления используют векторы, полученные из серотипов AAV, обладающих тропизмом к клеткам миокарда млекопитающего, в частности к кардиомиоцитам и предшественникам кардиомиоцитов, а также высокими эффективностями трансдукции в них. Обзор и сравнение эффективностей трансдукции у различных серотипов приведены в Cearley C N et al., Molecular Therapy 16(10); 1710-1718, 2008, полное содержание которого, таким образом, включено посредством ссылки. В других неограничивающих примерах предпочтительные векторы включают векторы, полученные из любых серотипов, таких как AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AA5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 или AAVrh10, для которых также показано, что они трансдуцируют клетки кардиомиоцитов.

[0070] В различных вариантах осуществления выбранную нуклеотидную последовательность функционально связывают с управляющими элементами, которые управляют ее транскрипцией или экспрессией у субъекта in vivo. Такие управляющие элементы могут содержать управляющие последовательности, обычно связанные с выбранным геном.

[0071] Альтернативно можно использовать гетерологичные управляющие последовательности. Эффективные гетерологичные управляющие последовательности в целом включают те, которые получают из последовательностей, кодирующих гены млекопитающих или вирусов. Примеры включают, но не ограничиваясь этим, промотор фосфоглицераткиназы (PKG), промотор CAG (энхансер CMV с промотором β-актина курицы, содержащим последовательность до 1-го интрона, и акцепторным сайтом сплайсинга гена бета-глобина кролика), промотор MCK (креатинкиназы мышц), ранний промотор SV40, промотор LTR вируса опухоли молочной железы мыши; главный поздний промотор аденовируса (Ad MLP); промотор вируса простого герпеса (HSV), промотор цитомегаловируса (CMV), такой как область предраннего промотора CMV (CMVIE), промотор вируса саркомы Рауса (RSV), синтетические промоторы, гибридные промоторы и т. п. Промоторы могут происходить от человека или других видов, в том числе от мышей. Кроме того, последовательности, получаемые из невирусных генов, таких как ген металлотионеина морских животных, также найдут применение в настоящем описании. Такие промоторные последовательности коммерчески доступны, например, в Stratagene (San Diego, Calif.). Примеры гетерологичных промоторов включают, но не ограничиваясь этим, промотор CMV. Примеры индуцибельных промоторов включают, но не ограничиваясь этим, ДНК чувствительные элементы для экдизона, тетрациклина и гипоксиандауфина. Когда один вектор кодирует несколько изоформ, они предпочтительно, но не обязательно, функционально связаны с различными управляющими последовательностями.

[0072] Аналогичным образом, управляющие элементы на 3'-конце кодирующей области, включая 3'-нетранслируемую область (3' UTR) и сигнал полиаденилирования, могут происходить из встроенного гена или из гетерологичного источника. В конкретных вариантах осуществления используют посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков (WPRE) в качестве 3' UTR или сигнал полиаденилирования бета-глобина кролика или оба. 3' управляющие элементы также могут включать управляющие элементы, соединяющие с кодирующими областями. Например, можно экспрессировать несколько изоформ LAMP-2 под управлением одного промотора, помещая внутренний участок связывания рибосомы (IRES) (см., например, фиг. 1I и 1M) или саморасщепляющуюся пептидную последовательность (такую как пептид 2A пикорнавируса; см., например, фиг. 1J и 1N) между 1-й и 2-й и 2-й и 3-й (если присутствует) изоформами. В случае IRES транслируют 2 или 3 полипептида. В случае саморасщепляющегося пептида, изоформы LAMP-2 наряду с промежуточным саморасщепляющимся пептидом присутствуют в векторе в виде одной рамки считывания, которую транслируют в виде одного полипептида, который расщепляется на его замещающие изоформы LAMP-2 после или во время трансляции.

[0073] Транскрипции под управлением одного промотора также можно достигать, когда вектор конструируют для поддержания альтернативного сплайсинга. В таких конструкциях первые восемь экзонов LAMP-2 присутствуют в виде сплайсированных вместе в кДНК, после чего следуют две или три пары интрон-экзон, чтобы включать два или все три альтернативных экзона, которые дают начало трем изоформам LAMP-2 (см., например, фиг. 1K и 1O). В различных вариантах осуществления пары интрон-экзон встречаются в любом порядке, или отражающем естественный порядок B, A, C, или изменяя его. Нативные интроны слишком длинны для включения в векторы, которые ограничены по размеру, такие как AAV. В таких случаях интроны усекают посредством удаления центральных последовательностей, при этом сохраняя необходимые 5' и 3' сайты сплайсинга и сигналы сплайсинга. Обычно сохранения всего лишь нескольких оснований на 5'-конце интрона и приблизительно 100-200 оснований на 3'-конце интрона достаточно для обеспечения сплайсинга. Альтернативно, гетерологичные интроны можно заменять на нативные интроны.

[0074] AAV экспрессирующий вектор, который несет молекулу ДНК, представляющую интерес, ограниченную с помощью AAV ITR, можно сконструировать путем непосредственного встраивания выбранной последовательности(ей) в геном AAV, из которого вырезаны основные открытые рамки считывания («ORF») AAV. Другие части генома AAV также можно удалять, при условии, что достаточная часть ITR остается для того, чтобы делать возможными функции репликации и упаковки. Такие конструкции можно разрабатывать с использованием способов, хорошо известных в данной области. См., например, патенты США №№ 5173414 и 5139941; международные публикации WO 92/01070 (опубликовано 23 января 1992 года) и WO 93/03769 (опубликовано 4 марта 1993 года); Lebkowski et al., 1988; Vincent et al., 1990; Carter, 1992; Muzyczka, 1992; Kotin, 1994; Shelling and Smith, 1994; и Zhou et al., 1994, полное содержащие каждого из которых, таким образом, включено посредством ссылки.

[0075] Альтернативно, AAV ITR можно вырезать из вирусного генома или из AAV вектора, содержащего те же и слитые 5' и 3' выбранной конструкции нуклеиновой кислоты, которая присутствует в другом векторе, используя стандартные способы лигирования. AAV векторы, которые содержат ITR, описаны, например, в патенте США № 5139941, полное содержание которого, таким образом, включено посредством ссылки. В частности, там описаны несколько AAV векторов, которые доступны в American Type Culture Collection («ATCC») под номерами доступа 53222, 53223, 53224, 53225 и 53226. Дополнительно, синтетически можно получать химерные гены, которые содержат AAV ITR последовательности, расположенные 5' и 3' от одной или нескольких выбранных последовательностей нуклеиновой кислоты. Можно использовать предпочтительные кодоны для экспрессии последовательности химерного гена в клетках CNS млекопитающего. Полную химерную последовательность собирают из перекрывающихся олигонуклеотидов, полученных стандартными способами. См., например, Edge Nature, том 292, 1981, стр. 756; Nambair et al., Science, том 223, 1984, стр. 1299; Jay et al., J. Biol. Chem. том 259, 1984, стр. 6311, полное содержание каждого из которых, таким образом, включено посредством ссылки. Для того чтобы получать вирионы AAV, AAV экспрессирующий вектор вводят в подходящую клетку-хозяина с использованием известных способов, например, посредством трансфекции. В целом в данной области известно множество способов трансфекции. См., например, Graham et al, Virology, 52, 456-467, (1973); Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, и Chu et al. (1981) Gene 13:197. В частности, подходящие способы трансфекции включают копреципитацию с фосфатом кальция (Graham et al., 1973), прямую микроинъекцию в культивируемые клетки (Capeechi, 1980), электропорацию (Shigekawa et al., 1988), опосредованный липосомами перенос генов (Mannino et al., 1988), опосредованную липидами трансдукцию (Felgner et al., 1987, PNAS USA, 84, 21, 7413-17) и доставку нуклеиновых кислот с использованием высокоскоростных микроснарядов (Klein et al., 1987, Endocrinology 120:2339-45). Полное содержание каждого из вышеуказанных источников включено, таким образом, посредством ссылки в полном объеме.

[0076] В одном из вариантов осуществления AAV содержит, в дополнение к кодирующей изоформу LAMP-2 последовательности(ям) нуклеиновой кислоты, остов AAV вектора с ITR, полученным из AAV2, промотор, такой как промотор гена PGK (фосфоглицераткиназы) мыши или гибридный промотор цитомегаловируса/β-актина курицы (CAG), который содержит энхансер из немедленного гена цитомегаловируса и промотор, донор сплайсированного фрагмента и интрон из гена β-актина курицы, акцепторный сайт сплайсинга из β-глобина кролика или любой промотор, такой как промотор PGK, CAG, MCK, EF-1 или нативный промотор LAMP-2. В различных вариантах осуществления, вирусный вектор инкапсулируют в анионную липосому, например, как описано в публикации патента США № 2015/0284691.

[0077] В различных вариантах осуществления структура экспрессирующей кассеты в векторе содержит первый и второй (например, 5' и 3') инвертированные концевые повторы (ITR) из любого известного серотипа или подгруппы AAV, включая scAAV, любую известную область промотора (например, промотор цитомегаловируса (CMV) или промотор β-актина курицы) с любым известным энхансерным элементом (например, энхансером CMV) или без него, ген ассоциированного с лизосомами белка 2 (включая все известные изоформы, например, LAMP-2A, LAMP-2B и LAMP-2C, и все известные полиморфизмы этих изоформ), и сигнал полиаденилирования (включая в качестве неограничивающих примеров, β-глобин кролика или ).

[0078] Трансляция доставленного вирусом гена изоформы LAMP-2 или комбинации различных генов изоформ ведет к экспрессии этой конкретной изоформы белка LAMP-2, которая затем направляется к лизосомальным мембранам клетки-хозяина с помощью аппарата клетки-хозяина. Тогда восстановление экспрессии изоформ(ы) LAMP-2 и функции восстанавливает аутофагический поток (потенциально включающий, без обязательного ограничения, все известные формы аутофагии, такие как макроаутофагия, митофагия, опосредованная шаперонами аутофагия и ДНК/РНК аутофагия), который недостаточен и является причиной у пациентов с болезнью Данона, что позволяет пораженным клеткам-хозяевам устранять токсичные клеточные компоненты и поврежденные органеллы и, таким образом, повышать функцию и выживаемость клетки. В конечном итоге, восстановление экспрессии изоформ(ы) LAMP-2 служит для лечения подлежащей генетической недостаточности, которая вызывает болезнь Данона и ослабляет фенотип и симптомы заболевания. При других нарушениях аутофагии, где LAMP-2 может быть экспрессирован, но не на достаточном уровне для того, чтобы создавать достаточный аутофагический поток и, таким образом, содействовать нормальной функции и выживаемости клетки, доставка трансгенных изоформ(ы) LAMP-2 посредством rAAV вектора ведет к сверхэкспрессии получаемых белков(белка) LAMP-2. Эта сверхэкспрессия восстанавливает аутофагический поток до почти нормального, нормального или сверх нормального уровня. Тогда восстановление аутофагического потока при заболевании, которое вызывает нарушение нормальной аутофагии, облегчает, смягчает, и/или обращает фенотип и симптомы заболевания.

4. Векторные фармацевтические композиции

[0079] Предоставлены фармацевтические композиции, например, для использования при предотвращении или лечении нарушения, которое отличается недостаточным аутофагическим потоком (например, болезни Данона), которые содержат терапевтически эффективное количество вектора, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты полинуклеотида, который кодирует одну или несколько изоформ LAMP-2.

[0080] Понятно, что принимать решение об однократной дозе или общей суточной дозе соединений и композиций по настоящему изобретению будет принимать лечащий врач в рамках здравого медицинского суждения. Конкретный уровень терапевтически эффективной дозы для любого конкретного пациента зависит от различных факторов, включая нарушения, подлежащие лечению, и тяжесть нарушения; активность конкретного используемого соединения; конкретную используемую композицию, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и диету пациента; время введения, путь введения и скорость выведения конкретного используемого соединения; длительность лечения; лекарственные средства, используемые в комбинации или случайно вместе с конкретными используемыми нуклеиновой кислотой или полипептидом; и схожие факторы, хорошо известные в области медицины. Например, навыки в данной области вполне позволяют начинать дозы соединения с уровней ниже тех, которые необходимы для достижения желаемого терапевтического эффекта, и постепенно увеличивать дозу до тех пор, пока не достигают желаемого эффекта. Однако суточная доза продуктов может варьировать в широком диапазоне на взрослого в сутки. Терапевтически эффективное количество вектора в соответствии с изобретением, которое следует вводить, а также доза для лечения патологического состояния с использованием множества вирусных или невирусных частиц и/или фармацевтических композиций, описанных в настоящем описании, будут зависеть от множества факторов, в том числе возраста и состояния пациента, тяжести расстройства или нарушения, способа и частоты введения и конкретного пептида, подлежащего использованию.

[0081] Фармацевтические композиции, которые содержат вектор, могут быть в любой форме, которая подходит для выбранного способа введения, например, для внутрижелудочкового, интрамиокардиального, внутрикоронарного, внутривенного, внутриартериального, внутрипочечного, внутриуретрального, эпидурального или внутримышечного введения. Вектор для генной терапии, содержащий полинуклеотид, кодирующий одну или несколько изоформ LAMP-2, можно вводить, в качестве единственного активного средства или в комбинации с другими активными средствами, в стандартной форме для введения, в виде смеси со стандартными фармацевтическими носителями, животным и человеку.

[0082] В различных вариантах осуществления фармацевтические композиции содержат носители, которые фармацевтически приемлемы для состава, который можно инъецировать. В частности, они могут представлять собой изотонические, стерильные, физиологические растворы (фосфат мононатрия или динатрия, хлорид натрия, калия, кальция или магния и т. п. или смеси таких солей) или сухие, в частности, лиофилизированные композиции, которые при добавлении, в зависимости от случая, стерилизованной воды или физиологического раствора, допускают получение инъецируемых растворов.

[0083] Фармацевтические формы, подходящие для инъекционного использования, включают стерильные водные растворы или дисперсии; составы, содержащие сезамовое масло, арахисовое масло или водный пропиленгликоль; и стерильные порошки для экстемпорального получения стерильных инъецируемых растворов или дисперсий. Во всех случаях форма должна быть стерильной и текучей. Она должна быть стабильна при условиях изготовления и хранения и должна быть предохранена от контаминирующего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы.

[0084] Растворы, содержащие векторы для генной терапии в виде свободного основания или фармакологически приемлемых солей, можно получать в воде, подходящим образом смешанной с поверхностно-активным средством, таким как гидроксипропилцеллюлоза. Дисперсии также можно получать в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях и в маслах. При обычных условиях хранения и использования, эти препараты содержат консервант для того, чтобы предотвращать рост микроорганизмов.

[0085] Векторы для генной терапии можно формулировать в композиции в нейтральной или солевой форме. Фармацевтически приемлемые соли включают кислотно-аддитивные соли (образованные со свободными аминогруппами белка) и те, которые образованы с неорганическими кислотами, такими как, например, соляная или фосфорная кислоты, или такими органическими кислотами, как уксусная, щавелевая, винная, миндальная и т. п. Соли, образованные со свободными карбоксильными группами, также можно получать из неорганических оснований, например, таких как гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа, и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и т. п.

[0086] Носитель также может быть в качестве растворителя или дисперсионной среды, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль, и т. п.), их подходящие смеси и растительные масла. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, с помощью покрытия, такого как лецитин, посредством поддержания требуемого размера частицы в случае дисперсии и с помощью поверхностно-активных средств. Предотвращение действия микроорганизмов можно обеспечивать с помощью различных антибактериальных и противогрибковых средств, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тимеросала и т. п. Во многих случаях, будет предпочтительно включать изотонические средства, например, сахара или хлорид натрия. Пролонгированную абсорбцию инъецируемых композиций можно обеспечивать посредством использования в композициях средств, которые задерживают абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.

[0087] Стерильные инъецируемые растворы получают посредством включения активных полипептидов в требуемом количестве в подходящий растворитель с несколькими другими ингредиентами, перечисленными выше, при необходимости, после чего следует стерилизация фильтрованием. В целом, дисперсии получают посредством включения различных стерилизованных активных ингредиентов в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из тех, что перечислены выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъецируемых растворов, предпочтительные способы получения представляют собой способы вакуумной сушки и лиофилизации, которые дают порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желаемый ингредиент из его предварительно стерильно фильтрованного раствора.

5. Способы лечения заболеваний аутофагии

[0088] Дополнительно предоставлены способы предотвращения, смягчения, улучшения, снижения, ингибирования, устранения и/или обращения одного или нескольких симптомов болезни Данона или другого нарушения аутофагии у нуждающегося в этом субъекта, включающие введение субъекту вектора для генной терапии, как описано раньше и в настоящем описании, например, вектора аденоассоциированного вируса (AAV), содержащего экспрессирующую кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий одну или несколько изоформ ассоциированного с лизосомами мембранного белка 2 (LAMP-2). Вектор доставляют субъекту, нуждающемуся в этом, в соответствии с чем трансдуцированные клетки экспрессируют полинуклеотид, кодирующий одну или несколько изоформ LAMP-2, на терапевтически эффективном уровне.

[0089] В одном конкретном варианте осуществления вектор представляет собой AAV9. В другом конкретном варианте осуществления вектор представляет собой AAV8. В другом конкретном варианте осуществления вектор представляет собой AAVrH10. В дополнительном аспекте этих вариантов осуществления, их используют, в частности, при лечении болезни Данона.

[0090] В различных вариантах осуществления вектор вводят через путь, выбранный из группы, состоящей из внутривенного, внутриартериального, интракардиального, внутрикоронарного, интрамиокардиального, внутрипочечного, внутриуретрального, эпидурального, подкожного и внутримышечного. В различных вариантах осуществления вектор доставляют непосредственно в миокард посредством эпикардиальной инъекции через миниторакотомию, посредством внутрикоронарной инъекции, посредством эндомиокардиальной инъекции или посредством инъекции другого типа, которую можно использовать в сердце. Дополнительные пути введения также могут включать локальное применение вектора при прямой визуализации, например, поверхностное кортикальное применение или другое не стереотактическое применение.

[0091] Вирусные векторы обычно вызывают иммунный ответ, который может включать образование антител, которые могут снижать или полностью ингибировать эффективность конкретного вектора у этого индивидуума, когда повторное дозирование становится необходимым или желательным. Повторное дозирование может становиться подходящим, например, поскольку вектор может быть утрачен с течением времени из-за клеточной пролиферации, в частности, эписомальные векторы. Ткан, осуществлять доступ к которым более сложно, могут требовать несколько введений вектора для того, чтобы трансфицировать достаточное число клеток для эффективного лечения заболевания. Экспрессия трансгена также может быть утрачена с течением времени. Необходимость вводить вектор для генной терапии ввиду ингибирования образования антител может быть удовлетворена различными способами. Например, титры антител можно снижать посредством афереза перед введением вектора или у пациента можно вызывать иммуносупрессию с использованием подходящей медицинской схемы. Альтернативно, пустой AAV капсид можно вводить для связывания антител хозяина и клеток иммунной системы перед инъекцией терапевтического AAV, содержащего трансген(ы) LAMP-2. В зависимости от ткани-мишени, непосредственное местное введение взамен системного введения может быть эффективно для преодоления или улучшения ингибирующего эффекта антител против вектора. В еще одном другом подходе можно использовать вектор на основании вируса другого серотипа, из которого из получали. Например, если исходно использовали AAV9 вектор и возникает проблема с титром антител против AAV, но существует потребность в дополнительной генной терапии, можно вводить AAV8 вектор, несущий ту же (или другую) генную конструкцию.

[0092] После формулирования растворы можно вводить таким образом, который совместим с дозированным составом, и в таком количестве, которое терапевтически эффективно. Составы легко вводят в различных дозированных формах, таких как тип инъецируемых растворов, описанных выше, но также можно использовать капсулы с высвобождением лекарственного средства и т. п. Также можно вводить множество доз.

[0093] Как подходит, векторы, описанные в настоящем описании, можно формулировать в любом подходящем носителе для доставки. Например, их можно помещать в фармацевтически приемлемую суспензию, раствор или эмульсию. Подходящие среды включают физиологический раствор и липосомные препараты. Более конкретно, фармацевтически приемлемые носители могут включать стерильные водные или не водные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами не водных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъецируемые сложные органические эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают, но не ограничиваясь этим, воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии в том числе физиологический раствор и буферные среды. Внутривенные носители включают восполнители текучих и питательных веществ, восполнители электролитов (такие как те, что на основании декстрозы Рингера) и т. п.

[0094] Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как, например, противомикробные, антиоксидантные, хелатирующие средства и инертные газы и т. п.

[0095] Коллоидную дисперсионную систему также можно использовать для направленной доставки генов. Коллоидные дисперсионные системы включают макромолекулярные комплексы, нанокапсулы, микросферы, бусы и системы на основе липидов, включая эмульсии «масло-в-воде», мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы.

[0096] Врач может определять подходящую схему, которая зависит от возраста, пола, массы субъекта и этапа заболевания. Например, для доставки последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид LAMP-2, используя вирусный экспрессирующий вектор, каждая стандартная доза экспрессирующего полипептид LAMP-2 вектора может содержать от 2,5 мкл до 100 мкл композиции, содержащей вирусный экспрессирующий вектор в фармацевтически приемлемом текучем веществе, например, в концентрации в диапазоне от 10¹¹ до 10¹⁶ вирусных геномов на мл.

[0097] В некоторых схемах используют вектор, несущий ген для одной изоформы LAMP-2, например, LAMP-2B. В других схемах используют вектор, несущий ген для двух изоформ LAMP-2, например, LAMP-2B и LAMP-2A. В некоторых вариантах осуществления различные препараты векторов несут две изоформы. В одном из аспектов оба препарата векторов получают из одного и того же вектора, например, AAV9 вектора или любого другого конкретного вектора, описанного выше. В других вариантах осуществления оба полипептида кодируют в одном векторе; см., например, фиг. 1. Аналогичным образом, если схема включает введение последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих все три изоформы, изоформы могут нести отдельные векторы или единый вектор. В схемах с использованием нескольких изоформ, которые несут отдельные векторы, несколько векторов можно вводить одновременно, индивидуально или смешивать вместе, или их можно вводить последовательно с интервалами в часы, сутки или недели.

6. Наборы

[0098] Дополнительно предоставлены наборы, содержащие вектор для генной терапии, содержащий полинуклеотид, кодирующий одну или несколько изоформ LAMP-2, как описано раньше и в настоящем описании. В различных вариантах осуществления, наборы предусматривают векторы для генной терапии, полученные в виде одной или нескольких стандартных дозированных формах, готовых для введения субъекту, например, в предварительно заполненном шприце или в ампуле. В различных вариантах осуществления, вектор для генной терапии предоставляют в лиофилизированной форме.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. AAV9 генная терапия

[0099] Конкретные векторы, в соответствии с приведенными выше описаниями, конструировали в виде AAV9 вектора с ITR, полученными из AAV2, которые кодируют LAMP-2A или LAMP-2B под управлением промотора β-актина курицы с энхансером CMV (промотор CAG). Дополнительно, эти векторы содержали посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков и сигнал полиаденилирования β-глобина кролика (см. фиг. 1B). Эти векторы получали из National Heart, Lung, and Blood Institute Gene Therapy Resource Program Preclinical Vector Core Facility в University of Pennsylvania. Последовательности LAMP-2 человека встраивали, ожидая, что они будут функциональны у мыши из-за высокой степени идентичности последовательностей между гомологами, в частности в C-концевой области, которая образует компоненты трансмембранного и цитоплазматического хвоста белка (см. фиг. 4).

[0100] Вектор используют для того, чтобы доставлять изоформы LAMP-2 in vivo. Серотип AAV9 обладает превосходным тропизмом к сердечной и скелетной мышце, а также нервной ткани, органам, более всего поражаемым болезнью Данона. Однако болезнь Данона представляет собой полисистемное нарушение, в которое могут быть вовлечены многие различные органы; следовательно, экспрессия трансгенных изоформ LAMP-2 находится под управлением конститутивно активного промотора β-актина курицы (CBA) с энхансером цитомегаловируса (CMV) (конструкция CAG). Этот промотор повсеместно активен и делает возможной экспрессию трансгена LAMP-2 во всех тканях в зависимости от эффективности инфекции. AAV9 вектор, несущий ген усиленного зеленого флуоресцентного белка (eGFP), также получали для применения в качестве контрольного реактива.

Пример 2. Введение AAV9 векторов с изоформами LAMP-2 мышам с нокаутом LAMP-2.

[0101] у мышей с KO Lamp-2 (Nature. 2000 Aug 24;406(6798):902-6; Basic Res Cardiol. 2006 Jul;101(4):281-91) развивает синдром, похожий на болезнь Данона, хотя тяжесть заболевания более умерена, чем при заболевании человека, вероятно по меньшей мере отчасти из-за более короткой продолжительности жизни мышей, что дает меньше времени для накопления повреждений из-за ослабленного аутофагического потока. Следовательно, желательно ждать, пока мыши не достигнут возраста по меньшей мере 3 месяца и предпочтительно 5-6 месяцев прежде, чем начинать лечение, чтобы имело место достаточное накопление патологии, чтобы ее обращение легко поддавалось обнаружению.

[0102] В идеальной процедуре мыши с KO Lamp-2 в возрасте 6 месяцев получают 5×10¹¹, 1×10¹² или 2×10¹² геномных копий (г. к.) AAV вектора через внутривенную инъекцию во внешнюю яремную вену. В различных экспериментах мыши WT получают векторы с изоформами LAMP-2 и мыши с KO Lamp-2 получают eGFP вектор в качестве контролей. Используют достаточное число мышей с тем, чтобы субпопуляции можно было умерщвлять и оценивать в различные моменты времени, например, через 1, 2 и 6 месяцев после введения.

Пример 3. Оценка транскрипции изоформы гена LAMP-2 после введения вектора

[0103] Мыши с KO Lamp-2, в возрасте приблизительно 3-4 месяца, получали возрастающие дозы векторов AAV9.LAMP-2B и AAV9.LAMP-2A (см. фиг. 1B и описания выше) по 5×10¹¹, 1×10¹² и 2×10¹² г. к./мышь. Умерщвляли по одной мыши на каждое условие и осуществляли RT-qPCR в трех повторениях на расщепленной ткани сердца для того, чтобы оценивать экспрессию мРНК (транскрипцию гена) трансгенов человека. мышь WT без лечения использовали для того, чтобы демонстрировать отсутствие экспрессии изоформ LAMP-2 человека. Данные говорят о дозозависимом увеличении экспрессии трансгенов человека (см. фиг. 5).

Пример 4. Оценка экспрессии изоформы белка LAMP-2 после введения вектора

[0104] Используя тех же мышей, что и в примере 3, осуществляли иммуноблоттинг на расщепленной ткани сердца для того, чтобы оценивать экспрессию белка трансгенов человека относительно GAPDH. Контрольная мышь с KO Lamp-2, которую лечили с использованием AAV9.EGFP, не демонстрировала значимой экспрессии белка LAMP-2. Данные говорят о дозозависимом увеличении экспрессии трансгенов человека у мышей, получающих вирусные векторы (см. фиг. 6).

Пример 5. Определение субклеточного местоположения трансгенных LAMP-2B после введения вектора

[0105] Срезы сердца мыши с KO Lamp-2, получавшей 2×10¹² г. к./мышь или AAV9.LAMP-2B или AAV9.EGFP, которую умерщвляли через 1 месяц после доставки, окрашивали с использованием DAPI (который связывается с AT-богатой ДНК и, таким образом, делает ядра клеток видимыми) и флуоресцентно-меченным антителом к LAMP-2 (см. фиг. 7). Паттерн окрашивания LAMP-2 указывает на локализацию трансгенного белка LAMP-2B человека во внутриклеточных вакуолях и схож с окрашиванием, которое наблюдают у контрольных мышей WT по белку Lamp-2 мыши. Окрашивание LAMP-2 человека не наблюдают у мыши с KO Lamp-2, получающей контрольный AAV9.EGFP вектор. Эти данные демонстрируют, что лечение с использованием AAV9.LAMP-2B вектора ведет к экспрессии белка LAMP-2B человека в физиологически подходящем местоположении.

[0106] В схожем эксперименте окрашивание LAMP-2 человека сохранялось через 2 месяца после доставки AAV9.LAMP-2B в дозе 5× 10¹¹ г. к./мышь у тестовой мыши. Хотя в соответствии с примером 4, меньшее окрашивание наблюдали с использованием этой более низкой дозы вектора. В качестве сравнения, через 3 месяца после доставки 5×10¹¹ г. к./мышь AAV9.EGFP вектора не обнаруживали окрашивания LAMP-2 человека. См. фиг. 8.

Пример 6. Аутофагическая репортерная система CAG-RFP-EGFP-LC3B

[0107] Аутофагическая репортерная система CAG-RFP-EGFP-LC3B позволяет оценивать макроаутофагический поток. На поверхности аутофагосом экспрессирована легкая цепь 3 (LC3) ассоциированного с микротрубочками белка 1. Конструируют слитые гены для экспрессии LC3, слитого как с красным флуоресцентным белком (RFP), так и с eGFP. Этот экспрессируют этот слитый белок, RFP компонент флуоресцирует как в аутофагосомах, так и в лизосомах, тогда как eGFP компонент флуоресцирует в аутофагосомах, но гасится кислой средой лизосом. Как результат, на слитом изображении аутофагосомы желтые, а лизосомы красные (см. фиг. 9A). При экспрессии в WT контексте, видят больше красных точек, чем зеленых точек на отдельных красных и зеленых изображениях и смесь красных и желтых точек на слитых изображениях (см. фиг. 9B-D'). Lamp-2 необходим для нормального слияния аутофагосом с лизосомами для формирования аутолизосом. Таким образом, когда эту конструкцию экспрессируют у мыши с KO Lamp-2, приблизительно равное число красных и зеленых точек наблюдают на отдельных красных и зеленых изображениях при почти полностью желтых точках на слитых изображениях (см. фиг. 9E-G'). Накопление аутофагосом и почти отсутствие аутолизосом, наряду с общим более высоким числом аутофагических вакуолей (AV), отражает дефект аутофагического потока из-за отсутствия Lamp-2 (см. фиг. 9H).

Пример 7. Введение вектора, несущего или LAMP-2A или LAMP-2B, восстанавливает аутофагический поток

[0108] Мышам с KO Lamp-2, экспрессирующим конструкцию CAG-RFP-EGFP-LC3B (мыши с KO Lamp-2/репортером CAG-RFP-EGFP-LC3B) вводили AAV9.LAMP-2B или AAV9.LAMP-2A и сравнивали с мышами с KO Lamp-2, экспрессирующими аутофагическую репортерную систему CAG-RFP-EGFP-LC3B (мыши с репортером CAG-RFP-EGFP-LC3B). Через один месяц после доставки вектора мышей умерщвляли и оценивали срезы сердца с помощью флуоресцентной микроскопии для того, чтобы оценивать аутофагический поток. мыши с KO Lamp-2/репортером без лечения продолжали демонстрировать почти только желтые аутофагические вакуоли, то есть аутофагосомы (см. фиг. 10B и фиг. 9G'). В отличие от этого, мыши с KO Lamp-2/репортером, получающие любой вектор для генной терапии, AAV9.LAMP-2B или AAV9.LAMP-2A, демонстрировали много красных аутофагических вакуолей, которые представляют собой аутолизосомы, в схожем соотношении с контрольной репортерной мышью WT (см. фиг. 10 A, C и D, образцовые точки на них обозначены стрелками). Количественное определение AV демонстрировало, что соотношение незрелых аутофагосом и зрелых аутолизосом схоже у мышей с KO Lamp-2 с лечением при сравнении с мышами WT (см. фиг. 10E). Таким образом, генная терапия с использованием AAV9.LAMP-2B или AAV9.LAMP-2A восстанавливала нормальное слияние аутофагосом и лизосом в кардиомиоцитах мышей с KO Lamp-2.

Пример 8. Восстановление ультраструктуры кардиомиоцитов, как оценивали с помощью электронной микроскопии

[0109] Мыши с KO Lamp-2 инъецировали внутривенно 5×10¹¹ г. к./мышь AAV9.LAMP-2B, и сравнивали ее с ретроспективной мышью того же возраста с KO Lamp-2 и мышью WT, которых не лечили. Через 1 месяц после доставки вектора мышей умерщвляли и анализировали срезы сердца посредством электронной микроскопии. По сравнению с WT (см. фиг. 11A, A'), мышь с KO Lamp-2 без лечения демонстрировала накопление и увеличение размеров AV (см. фиг. 11B, B', желтые стрелки) и увеличение числа аномальных митохондрий (см. фиг. 11B, красные стрелки). В отличие от этого, электронные микрофотографии мыши с KO Lamp-2, которую лечили с использованием AAV9.LAMP-2B, более близко походили на ультраструктуру мыши WT без лечения (см. фиг. 11C, C'). Таким образом, лечение вектором для генной терапии восстанавливает ультраструктуру кардиомиоцитов.

[0110] Вкратце, эти примеры показывают, что векторы для генной терапии на основании аденоассоциированного вируса, кодирующие изоформы LAMP-2A и LAMP-2B, можно вводить внутривенно, чтобы успешно достигать экспрессии трансгена в ткани сердца. Дополнительно, такая экспрессия ведет к обращению дефектов аутофагического потока и ультраструктуры кардиомиоцитов, дефектов, которые также связаны с болезнью Данона. Эти данные подтверждают использование таких векторов для генной терапии при лечении болезни Данона и других нарушений, связанных с дефектами аутофагического потока.

[0111] В заключение, следует понимать, что несмотря на то, что аспекты данного описания освещены через обращение к конкретным вариантам осуществления, специалист в данной области без труда примет во внимание, что эти раскрытые варианты осуществления являются только иллюстрацией принципов объекта изобретения, раскрытого в настоящем описании. Следовательно, следует понимать, что раскрытый объект изобретения ни коим образом не ограничен конкретным способом, протоколом и/или реактивов и т. д., которые описаны в настоящем описании. По существу, различные модификации или изменения или альтернативные конфигурации для раскрытого объекта изобретения можно выполнять в соответствии с положениями настоящего описания, не отступая от сущности данного описания. Наконец, терминология, используемая в настоящем описании, служит лишь цели описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для того, чтобы ограничивать объем настоящего изобретения, который определяет только формула изобретения. Соответственно, настоящее изобретение не ограничено этим, точно как показано и описано.

[0112] Определенные варианты осуществления настоящего изобретения описаны в настоящем описании, в том числе лучший вариант, известный авторам изобретения для осуществления изобретения. Конечно, вариации в этих описанных вариантах осуществления будут видны специалистам в данной области при прочтении вышеуказанного описания. Автор изобретения ожидает, что специалисты в данной области используют такие вариации в зависимости от ситуации, и авторы изобретения предполагают практическую реализацию настоящего изобретения иным образом, чем конкретно описано в настоящем описании. Соответственно, это изобретение включает все модификации и эквиваленты объекта изобретения, перечисленные в формуле изобретения, приложенной сюда, как позволяет применяемое право. Кроме того, любая комбинация описанных выше вариантов осуществления во всех их возможных вариациях включена в изобретение, если не указано иное в настоящем описании или не противоречит контексту иным образом.

[0113] Группировки альтернативных вариантов осуществления, элементов или стадий по настоящему изобретению не следует толковать в качестве ограничений. Каждый элемент группы можно указывать и заявлять индивидуально или в любой комбинации с другими элементами группы, раскрытыми в настоящем описании. Предполагают, что один или несколько элементов группы можно включать в или удалять из группы по причинам удобства и/или патентоспособности. Когда происходит любое такое включение или удаление, описание считают включающим группу, как модифицировано, таким образом выполняя письменное описание всех групп Маркуша, используемых в приложенной формуле изобретения.

[0114] Если не указано иное, все числа, выражающие характеристику, элемент, количество, параметр, свойство, член и так далее, используемые в настоящем описании и формуле изобретения, следует понимать как модифицированные во всех случаях термином «приблизительно». Как используют в настоящем описании, термин «приблизительно» обозначает, что характеристика, элемент, количество, параметр, свойство или член, определяемый таким образом, охватывает диапазон ±10% выше и ниже значения установленной характеристики, элемента, количества, параметра, свойства или члена. Соответственно, пока не указано иное, числовые параметры, изложенные в описании и приложенной формуле изобретения, представляют собой приближения, которые могут варьировать. В крайнем случае, и не в качестве попытки ограничить применение доктрины эквивалентов к объему формулы изобретения, каждое числовое указание следует рассматривать по меньшей мере в свете количества приведенных значащих цифр и с применением обычных способов округления. Безотносительно того, что эти числовые диапазоны и значения, задающие широкий объем изобретения, представляют собой приближения, числовые диапазоны и значения, изложенные в конкретных примерах, приведены настолько точно, насколько возможно. Однако любой числовой диапазон или значение неотъемлемо содержит определенные ошибки, являющиеся неотъемлемым результатом стандартного отклонения, встречающегося в соответствующих им тестовых измерениях. Изложение числовых диапазонов значений в настоящем описании лишь предназначено для того, чтобы служить в качестве сокращенного способа указания индивидуально каждого отдельного числового значения, попадающего в диапазон. Если не указано иное в настоящем описании, каждое индивидуальное значение числового диапазона включено в данное описание, как если бы их индивидуально перечисляли в настоящем описании.

[0115] Формы единственного числа, используемые в контексте описания настоящего изобретения (в частности, в контексте следующей формулы изобретения), следует толковать как охватывающие единственное и множественное число, если не указано иное в настоящем описании или не противоречит контексту в явной форме. Все способы, описанные в настоящем описании, можно осуществлять в любом подходящем порядке, если не указано иное в настоящем описании или не противоречит контексту иным образом в явной форме. Использование любых и всех примеров или приблизительных формулировок (например, «такой как»), приведенных в настоящем описании, предназначено лишь для более полного освещения настоящего изобретения и не накладывает ограничение на объем изобретения, заявленный иным образом. Никакие формулировки в настоящем описании не следует толковать в качестве указания на любой не заявленный элемент, обязательный для практической реализации изобретения.

[0116] Конкретные варианты осуществления, раскрытые в настоящем описании, дополнительно могут быть ограничены в формуле изобретения с использованием формулировок состоит из или по существу состоит из. Когда используют в формуле изобретения, как подано или как добавлено при изменении, переходный термин «состоящий из» исключает любой элемент, стадию или ингредиент, не указанный в формуле изобретения. Переходный термин «состоящий по существу из» ограничивает объем формулы изобретения точно определенными материалами или стадиями и тем, что не оказывает существенного влияния на основную и новую характеристику(и). Варианты осуществления настоящего изобретения, заявленные так, неотъемлемо или в явной форме описаны и задействованы в настоящем описании.

[0117] Все патенты, патентные публикации и другие публикации, упомянутые и идентифицированные в настоящем описании, индивидуально и в явной форме включены в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме с целью описания и раскрытия, например, композиции и способы, описанные в таких публикациях, которые можно использовать в связи с настоящим изобретением. Эти публикации предоставлены лишь для их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничто в связи с этим не следует толковать в качестве допущения о том, что авторы изобретения не наделены правом относить такое раскрытие к более ранней дате на основании предшествующего изобретения или по любой другой причине. Все утверждения в отношении даты или представление в отношении содержания этих документов основаны на информации, доступной заявителям и не составляют какое-либо допущение в отношении правильности дат или содержания этих документов.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> The Regents of the University of California

<120> СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНИ ДАНОНА И ДРУГИХ НАРУШЕНИЙ АУТОФАГИИ

<130> 1959169-00006

<150> US62/280,269

<151> 2016-01-19

<160> 12

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 1233

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 1

atggtgtgct tccgcctctt cccggttccg ggctcagggc tcgttctggt ctgcctagtc 60

ctgggagctg tgcggtctta tgcattggaa cttaatttga cagattcaga aaatgccact 120

tgcctttatg caaaatggca gatgaatttc acagttcgct atgaaactac aaataaaact 180

tataaaactg taaccatttc agaccatggc actgtgacat ataatggaag catttgtggg 240

gatgatcaga atggtcccaa aatagcagtg cagttcggac ctggcttttc ctggattgcg 300

aattttacca aggcagcatc tacttattca attgacagcg tctcattttc ctacaacact 360

ggtgataaca caacatttcc tgatgctgaa gataaaggaa ttcttactgt tgatgaactt 420

ttggccatca gaattccatt gaatgacctt tttagatgca atagtttatc aactttggaa 480

aagaatgatg ttgtccaaca ctactgggat gttcttgtac aagcttttgt ccaaaatggc 540

acagtgagca caaatgagtt cctgtgtgat aaagacaaaa cttcaacagt ggcacccacc 600

atacacacca ctgtgccatc tcctactaca acacctactc caaaggaaaa accagaagct 660

ggaacctatt cagttaataa tggcaatgat acttgtctgc tggctaccat ggggctgcag 720

ctgaacatca ctcaggataa ggttgcttca gttattaaca tcaaccccaa tacaactcac 780

tccacaggca gctgccgttc tcacactgct ctacttagac tcaatagcag caccattaag 840

tatctagact ttgtctttgc tgtgaaaaat gaaaaccgat tttatctgaa ggaagtgaac 900

atcagcatgt atttggttaa tggctccgtt ttcagcattg caaataacaa tctcagctac 960

tgggatgccc ccctgggaag ttcttatatg tgcaacaaag agcagactgt ttcagtgtct 1020

ggagcatttc agataaatac ctttgatcta agggttcagc ctttcaatgt gacacaagga 1080

aagtattcta cagctcaaga ctgcagtgca gatgacgaca acttcctagt gcccatagcg 1140

gtgggagctg ccttggcagg agtacttatt ctagtgttgc tggcttattt tattggtctc 1200

aagcaccatc atgctggata tgagcaattt tag 1233

<210> 2

<211> 1233

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 2

atggtgtgct tccgcctctt cccggttccg ggctcagggc tcgttctggt ctgcctagtc 60

ctgggagctg tgcggtctta tgcattggaa cttaatttga cagattcaga aaatgccact 120

tgcctttatg caaaatggca gatgaatttc acagttcgct atgaaactac aaataaaact 180

tataaaactg taaccatttc agaccatggc actgtgacat ataatggaag catttgtggg 240

gatgatcaga atggtcccaa aatagcagtg cagttcggac ctggcttttc ctggattgcg 300

aattttacca aggcagcatc tacttattca attgacagcg tctcattttc ctacaacact 360

ggtgataaca caacatttcc tgatgctgaa gataaaggaa ttcttactgt tgatgaactt 420

ttggccatca gaattccatt gaatgacctt tttagatgca atagtttatc aactttggaa 480

aagaatgatg ttgtccaaca ctactgggat gttcttgtac aagcttttgt ccaaaatggc 540

acagtgagca caaatgagtt cctgtgtgat aaagacaaaa cttcaacagt ggcacccacc 600

atacacacca ctgtgccatc tcctactaca acacctactc caaaggaaaa accagaagct 660

ggaacctatt cagttaataa tggcaatgat acttgtctgc tggctaccat ggggctgcag 720

ctgaacatca ctcaggataa ggttgcttca gttattaaca tcaaccccaa tacaactcac 780

tccacaggca gctgccgttc tcacactgct ctacttagac tcaatagcag caccattaag 840

tatctagact ttgtctttgc tgtgaaaaat gaaaaccgat tttatctgaa ggaagtgaac 900

atcagcatgt atttggttaa tggctccgtt ttcagcattg caaataacaa tctcagctac 960

tgggatgccc ccctgggaag ttcttatatg tgcaacaaag agcagactgt ttcagtgtct 1020

ggagcatttc agataaatac ctttgatcta agggttcagc ctttcaatgt gacacaagga 1080

aagtattcta cagcccaaga gtgttcgctg gatgatgaca ccattctaat cccaattata 1140

gttggtgctg gtctttcagg cttgattatc gttatagtga ttgcttacgt aattggcaga 1200

agaaaaagtt atgctggata tcagactctg taa 1233

<210> 3

<211> 1236

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 3

atggtgtgct tccgcctctt cccggttccg ggctcagggc tcgttctggt ctgcctagtc 60

ctgggagctg tgcggtctta tgcattggaa cttaatttga cagattcaga aaatgccact 120

tgcctttatg caaaatggca gatgaatttc acagttcgct atgaaactac aaataaaact 180

tataaaactg taaccatttc agaccatggc actgtgacat ataatggaag catttgtggg 240

gatgatcaga atggtctcaa aatagcagtg cagttcggac ctggcttttc ctggattgcg 300

aattttacca aggcagcatc tacttattca attgacagcg tctcattttc ctacaacact 360

ggtgataaca caacatttcc tgatgctgaa gataaaggaa ttcttactgt tgatgaactt 420

ttggccatca gaattccatt gaatgacctt tttagatgca atagtttatc aactttggaa 480

aagaatgatg ttgtccaaca ctactgggat gttcttgtac aagcttttgt ccaaaatggc 540

acagtgagca caaatgagtt cctgtgtgat aaagacaaaa cttcaacagt ggcacccacc 600

atacacacca ctgtgccatc tcctactaca acacctactc caaaggaaaa accagaagct 660

ggaacctatt cagttaataa tggcaatgat acttgtctgc tggctaccat ggggctgcag 720

ctgaacatca ctcaggataa ggttgcttca gttattaaca tcaaccccaa tacaactcac 780

tccacaggca gctgccgttc tcacactgct ctacttagac tcaatagcag caccattaag 840

tatctagact ttgtctttgc tgtgaaaaat gaaaaccgat tttatctgaa ggaagtgaac 900

atcagcatgt atttggttaa tggctccgtt ttcagcattg caaataacaa tctcagctac 960

tgggatgccc ccctgggaag ttcttatatg tgcaacaaag agcagactgt ttcagtgtct 1020

ggagcatttc agataaatac ctttgatcta agggttcagc ctttcaatgt gacacaagga 1080

aagtattcta cagctgaaga atgttctgct gactctgacc tcaactttct tattcctgtt 1140

gcagtgggtg tggccttggg cttccttata attgttgtct ttatctctta tatgattgga 1200

agaaggaaaa gtcgtactgg ttatcagtct gtgtaa 1236

<210> 4

<211> 90

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 4

Trp Asp Ala Pro Leu Gly Ser Ser Tyr Met Cys Asn Lys Glu Gln Thr

1 5 10 15

Val Ser Val Ser Gly Ala Phe Gln Ile Asn Thr Phe Asp Leu Arg Val

20 25 30

Gln Pro Phe Asn Val Thr Gln Gly Lys Tyr Ser Thr Ala Gln Asp Cys

35 40 45

Ser Ala Asp Asp Asp Asn Phe Leu Val Pro Ile Ala Val Gly Ala Ala

50 55 60

Leu Ala Gly Val Leu Ile Leu Val Leu Leu Ala Tyr Phe Ile Gly Leu

65 70 75 80

Lys His His His Ala Gly Tyr Glu Gln Phe

85 90

<210> 5

<211> 90

<212> Белок

<213> Mus musculus

<400> 5

Trp Asp Ala Pro Leu Gly Ser Ser Tyr Met Cys Asn Lys Glu Gln Val

1 5 10 15

Leu Ser Val Ser Arg Ala Phe Gln Ile Asn Thr Phe Asn Leu Lys Val

20 25 30

Gln Pro Phe Asn Val Thr Lys Gly Gln Tyr Ser Thr Ala Gln Asp Cys

35 40 45

Ser Ala Asp Glu Asp Asn Phe Leu Val Pro Ile Ala Val Gly Ala Ala

50 55 60

Leu Gly Gly Val Leu Ile Leu Val Leu Leu Ala Tyr Phe Ile Gly Leu

65 70 75 80

Lys Arg His His Thr Gly Tyr Glu Gln Phe

85 90

<210> 6

<211> 90

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 6

Trp Asp Ala Pro Leu Gly Ser Ser Tyr Met Cys Asn Lys Glu Gln Thr

1 5 10 15

Val Ser Val Ser Gly Ala Phe Gln Ile Asn Thr Phe Asp Leu Arg Val

20 25 30

Gln Pro Phe Asn Val Thr Gln Gly Lys Tyr Ser Thr Ala Gln Glu Cys

35 40 45

Ser Leu Asp Asp Asp Thr Ile Leu Ile Pro Ile Ile Val Gly Ala Gly

50 55 60

Leu Ser Gly Leu Ile Ile Val Ile Val Ile Ala Tyr Val Ile Gly Arg

65 70 75 80

Arg Lys Ser Tyr Ala Gly Tyr Gln Thr Leu

85 90

<210> 7

<211> 90

<212> Белок

<213> Mus musculus

<400> 7

Trp Asp Ala Pro Leu Gly Ser Ser Tyr Met Cys Asn Lys Glu Gln Val

1 5 10 15

Leu Ser Val Ser Arg Ala Phe Gln Ile Asn Thr Phe Asn Leu Lys Val

20 25 30

Gln Pro Phe Asn Val Thr Lys Gly Gln Tyr Ser Thr Ala Gln Glu Cys

35 40 45

Ser Leu Asp Asp Asp Thr Ile Leu Ile Pro Ile Ile Val Gly Ala Gly

50 55 60

Leu Ser Gly Leu Ile Ile Val Ile Val Ile Ala Tyr Leu Ile Gly Arg

65 70 75 80

Arg Lys Thr Tyr Ala Gly Tyr Gln Thr Leu

85 90

<210> 8

<211> 91

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 8

Trp Asp Ala Pro Leu Gly Ser Ser Tyr Met Cys Asn Lys Glu Gln Thr

1 5 10 15

Val Ser Val Ser Gly Ala Phe Gln Ile Asn Thr Phe Asp Leu Arg Val

20 25 30

Gln Pro Phe Asn Val Thr Gln Gly Lys Tyr Ser Thr Ala Glu Glu Cys

35 40 45

Ser Ala Asp Ser Asp Leu Asn Phe Leu Ile Pro Val Ala Val Gly Val

50 55 60

Ala Leu Gly Phe Leu Ile Ile Val Val Phe Ile Ser Tyr Met Ile Gly

65 70 75 80

Arg Arg Lys Ser Arg Thr Gly Tyr Gln Ser Val

85 90

<210> 9

<211> 91

<212> Белок

<213> Mus musculus

<400> 9

Trp Asp Ala Pro Leu Gly Ser Ser Tyr Met Cys Asn Lys Glu Gln Val

1 5 10 15

Leu Ser Val Ser Arg Ala Phe Gln Ile Asn Thr Phe Asn Leu Lys Val

20 25 30

Gln Pro Phe Asn Val Thr Lys Gly Gln Tyr Ser Thr Ala Glu Glu Cys

35 40 45

Ala Ala Asp Ser Asp Leu Asn Phe Leu Ile Pro Val Ala Val Gly Val

50 55 60

Ala Leu Gly Phe Leu Ile Ile Ala Val Phe Ile Ser Tyr Met Ile Gly

65 70 75 80

Arg Arg Lys Ser Arg Thr Gly Tyr Gln Ser Val

85 90

<210> 10

<211> 410

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 10

Met Val Cys Phe Arg Leu Phe Pro Val Pro Gly Ser Gly Leu Val Leu

1 5 10 15

Val Cys Leu Val Leu Gly Ala Val Arg Ser Tyr Ala Leu Glu Leu Asn

20 25 30

Leu Thr Asp Ser Glu Asn Ala Thr Cys Leu Tyr Ala Lys Trp Gln Met

35 40 45

Asn Phe Thr Val Arg Tyr Glu Thr Thr Asn Lys Thr Tyr Lys Thr Val

50 55 60

Thr Ile Ser Asp His Gly Thr Val Thr Tyr Asn Gly Ser Ile Cys Gly

65 70 75 80

Asp Asp Gln Asn Gly Pro Lys Ile Ala Val Gln Phe Gly Pro Gly Phe

85 90 95

Ser Trp Ile Ala Asn Phe Thr Lys Ala Ala Ser Thr Tyr Ser Ile Asp

100 105 110

Ser Val Ser Phe Ser Tyr Asn Thr Gly Asp Asn Thr Thr Phe Pro Asp

115 120 125

Ala Glu Asp Lys Gly Ile Leu Thr Val Asp Glu Leu Leu Ala Ile Arg

130 135 140

Ile Pro Leu Asn Asp Leu Phe Arg Cys Asn Ser Leu Ser Thr Leu Glu

145 150 155 160

Lys Asn Asp Val Val Gln His Tyr Trp Asp Val Leu Val Gln Ala Phe

165 170 175

Val Gln Asn Gly Thr Val Ser Thr Asn Glu Phe Leu Cys Asp Lys Asp

180 185 190

Lys Thr Ser Thr Val Ala Pro Thr Ile His Thr Thr Val Pro Ser Pro

195 200 205

Thr Thr Thr Pro Thr Pro Lys Glu Lys Pro Glu Ala Gly Thr Tyr Ser

210 215 220

Val Asn Asn Gly Asn Asp Thr Cys Leu Leu Ala Thr Met Gly Leu Gln

225 230 235 240

Leu Asn Ile Thr Gln Asp Lys Val Ala Ser Val Ile Asn Ile Asn Pro

245 250 255

Asn Thr Thr His Ser Thr Gly Ser Cys Arg Ser His Thr Ala Leu Leu

260 265 270

Arg Leu Asn Ser Ser Thr Ile Lys Tyr Leu Asp Phe Val Phe Ala Val

275 280 285

Lys Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Leu Lys Glu Val Asn Ile Ser Met Tyr

290 295 300

Leu Val Asn Gly Ser Val Phe Ser Ile Ala Asn Asn Asn Leu Ser Tyr

305 310 315 320

Trp Asp Ala Pro Leu Gly Ser Ser Tyr Met Cys Asn Lys Glu Gln Thr

325 330 335

Val Ser Val Ser Gly Ala Phe Gln Ile Asn Thr Phe Asp Leu Arg Val

340 345 350

Gln Pro Phe Asn Val Thr Gln Gly Lys Tyr Ser Thr Ala Gln Asp Cys

355 360 365

Ser Ala Asp Asp Asp Asn Phe Leu Val Pro Ile Ala Val Gly Ala Ala

370 375 380

Leu Ala Gly Val Leu Ile Leu Val Leu Leu Ala Tyr Phe Ile Gly Leu

385 390 395 400

Lys His His His Ala Gly Tyr Glu Gln Phe

405 410

<210> 11

<211> 410

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 11

Met Val Cys Phe Arg Leu Phe Pro Val Pro Gly Ser Gly Leu Val Leu

1 5 10 15

Val Cys Leu Val Leu Gly Ala Val Arg Ser Tyr Ala Leu Glu Leu Asn

20 25 30

Leu Thr Asp Ser Glu Asn Ala Thr Cys Leu Tyr Ala Lys Trp Gln Met

35 40 45

Asn Phe Thr Val Arg Tyr Glu Thr Thr Asn Lys Thr Tyr Lys Thr Val

50 55 60

Thr Ile Ser Asp His Gly Thr Val Thr Tyr Asn Gly Ser Ile Cys Gly

65 70 75 80

Asp Asp Gln Asn Gly Pro Lys Ile Ala Val Gln Phe Gly Pro Gly Phe

85 90 95

Ser Trp Ile Ala Asn Phe Thr Lys Ala Ala Ser Thr Tyr Ser Ile Asp

100 105 110

Ser Val Ser Phe Ser Tyr Asn Thr Gly Asp Asn Thr Thr Phe Pro Asp

115 120 125

Ala Glu Asp Lys Gly Ile Leu Thr Val Asp Glu Leu Leu Ala Ile Arg

130 135 140

Ile Pro Leu Asn Asp Leu Phe Arg Cys Asn Ser Leu Ser Thr Leu Glu

145 150 155 160

Lys Asn Asp Val Val Gln His Tyr Trp Asp Val Leu Val Gln Ala Phe

165 170 175

Val Gln Asn Gly Thr Val Ser Thr Asn Glu Phe Leu Cys Asp Lys Asp

180 185 190

Lys Thr Ser Thr Val Ala Pro Thr Ile His Thr Thr Val Pro Ser Pro

195 200 205

Thr Thr Thr Pro Thr Pro Lys Glu Lys Pro Glu Ala Gly Thr Tyr Ser

210 215 220

Val Asn Asn Gly Asn Asp Thr Cys Leu Leu Ala Thr Met Gly Leu Gln

225 230 235 240

Leu Asn Ile Thr Gln Asp Lys Val Ala Ser Val Ile Asn Ile Asn Pro

245 250 255

Asn Thr Thr His Ser Thr Gly Ser Cys Arg Ser His Thr Ala Leu Leu

260 265 270

Arg Leu Asn Ser Ser Thr Ile Lys Tyr Leu Asp Phe Val Phe Ala Val

275 280 285

Lys Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Leu Lys Glu Val Asn Ile Ser Met Tyr

290 295 300

Leu Val Asn Gly Ser Val Phe Ser Ile Ala Asn Asn Asn Leu Ser Tyr

305 310 315 320

Trp Asp Ala Pro Leu Gly Ser Ser Tyr Met Cys Asn Lys Glu Gln Thr

325 330 335

Val Ser Val Ser Gly Ala Phe Gln Ile Asn Thr Phe Asp Leu Arg Val

340 345 350

Gln Pro Phe Asn Val Thr Gln Gly Lys Tyr Ser Thr Ala Gln Glu Cys

355 360 365

Ser Leu Asp Asp Asp Thr Ile Leu Ile Pro Ile Ile Val Gly Ala Gly

370 375 380

Leu Ser Gly Leu Ile Ile Val Ile Val Ile Ala Tyr Val Ile Gly Arg

385 390 395 400

Arg Lys Ser Tyr Ala Gly Tyr Gln Thr Leu

405 410

<210> 12

<211> 411

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 12

Met Val Cys Phe Arg Leu Phe Pro Val Pro Gly Ser Gly Leu Val Leu

1 5 10 15

Val Cys Leu Val Leu Gly Ala Val Arg Ser Tyr Ala Leu Glu Leu Asn

20 25 30

Leu Thr Asp Ser Glu Asn Ala Thr Cys Leu Tyr Ala Lys Trp Gln Met

35 40 45

Asn Phe Thr Val Arg Tyr Glu Thr Thr Asn Lys Thr Tyr Lys Thr Val

50 55 60

Thr Ile Ser Asp His Gly Thr Val Thr Tyr Asn Gly Ser Ile Cys Gly

65 70 75 80

Asp Asp Gln Asn Gly Pro Lys Ile Ala Val Gln Phe Gly Pro Gly Phe

85 90 95

Ser Trp Ile Ala Asn Phe Thr Lys Ala Ala Ser Thr Tyr Ser Ile Asp

100 105 110

Ser Val Ser Phe Ser Tyr Asn Thr Gly Asp Asn Thr Thr Phe Pro Asp

115 120 125

Ala Glu Asp Lys Gly Ile Leu Thr Val Asp Glu Leu Leu Ala Ile Arg

130 135 140

Ile Pro Leu Asn Asp Leu Phe Arg Cys Asn Ser Leu Ser Thr Leu Glu

145 150 155 160

Lys Asn Asp Val Val Gln His Tyr Trp Asp Val Leu Val Gln Ala Phe

165 170 175

Val Gln Asn Gly Thr Val Ser Thr Asn Glu Phe Leu Cys Asp Lys Asp

180 185 190

Lys Thr Ser Thr Val Ala Pro Thr Ile His Thr Thr Val Pro Ser Pro

195 200 205

Thr Thr Thr Pro Thr Pro Lys Glu Lys Pro Glu Ala Gly Thr Tyr Ser

210 215 220

Val Asn Asn Gly Asn Asp Thr Cys Leu Leu Ala Thr Met Gly Leu Gln

225 230 235 240

Leu Asn Ile Thr Gln Asp Lys Val Ala Ser Val Ile Asn Ile Asn Pro

245 250 255

Asn Thr Thr His Ser Thr Gly Ser Cys Arg Ser His Thr Ala Leu Leu

260 265 270

Arg Leu Asn Ser Ser Thr Ile Lys Tyr Leu Asp Phe Val Phe Ala Val

275 280 285

Lys Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Leu Lys Glu Val Asn Ile Ser Met Tyr

290 295 300

Leu Val Asn Gly Ser Val Phe Ser Ile Ala Asn Asn Asn Leu Ser Tyr

305 310 315 320

Trp Asp Ala Pro Leu Gly Ser Ser Tyr Met Cys Asn Lys Glu Gln Thr

325 330 335

Val Ser Val Ser Gly Ala Phe Gln Ile Asn Thr Phe Asp Leu Arg Val

340 345 350

Gln Pro Phe Asn Val Thr Gln Gly Lys Tyr Ser Thr Ala Glu Glu Cys

355 360 365

Ser Ala Asp Ser Asp Leu Asn Phe Leu Ile Pro Val Ala Val Gly Val

370 375 380

Ala Leu Gly Phe Leu Ile Ile Val Val Phe Ile Ser Tyr Met Ile Gly

385 390 395 400

Arg Arg Lys Ser Arg Thr Gly Tyr Gln Ser Val

405 410

<---

1. Вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV) серотипа 9 для лечения болезни Данона, содержащий экспрессирующую кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий ассоциированный с лизосомами мембранный белок 2B (LAMP-2B), функционально связанный с гибридным промотором, содержащим промотор β-актина курицы и энхансер CMV (промотор CAG).

2. Вектор по п. 1, где вектор инкапсулируют в анионную липосому.

3. Вектор по п. 1 или 2, в котором экспрессирующая кассета содержит функционально связанные в направлении от 5' к 3' первый инвертированный концевой повтор, область энхансера/промотора, полинуклеотид, кодирующий LAMP-2B, 3'-нетранслируемую область, содержащую сигнал полиаденилирования, и второй инвертированный концевой повтор.

4. Вектор по любому из пп. 1-3, в котором полинуклеотид содержит ДНК или кДНК.

5. Вектор по любому из пп. 1-4, в котором полинуклеотид, кодирующий LAMP-2B, содержит LAMP-2 человека.

6. Вектор для генной терапии по любому из пп. 1-5, в котором полинуклеотид, кодирующий LAMP-2B, обладает по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательностей с одной или несколькими из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3.

7. Вектор по п. 6, в котором полинуклеотид, кодирующий LAMP-2B, содержит одну или несколько из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3.

8. Способ лечения болезни Данона у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту вектора по любому из пп. 1–7, где субъект идентифицирован в качестве имеющего мутантный ген LAMP-2.

9. Способ лечения болезни Данона у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту вектора на основе аденоассоциированного вируса 9 (AAV9), содержащего экспрессирующую кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий ассоциированный с лизосомами мембранный белок 2B (LAMP-2В), функционально связанный с гибридным промотором, содержащим промотор β-актина курицы и энхансер CMV (промотор CAG), где субъект идентифицирован в качестве имеющего мутантный ген LAMP-2В.

10. Способ по любому из пп. 8, 9, в котором вектор вводят через путь, выбранный из группы, состоящей из внутривенного, внутриартериального, интракардиального, внутрикоронарного, интрамиокардиального, внутрипочечного, внутриуретрального, эпидурального и внутримышечного.

11. Способ по любому из пп. 8-10, в котором вектор вводят несколько раз.

12. Способ по любому из пп. 8-11, в котором субъектом является человек.

13. Способ по любому из пп. 8-12, в котором субъект идентифицирован в качестве имеющего сниженную или не поддающуюся обнаружению экспрессию LAMP-2В.

14. Применение вектора по любому из пп. 1–7 для лечения болезни Данона у нуждающегося в этом субъекта, где субъект идентифицирован в качестве имеющего мутантный ген LAMP-2.