Способ количественного определения селективно связанных белков-маркеров заболеваний в планарных ячейках биочипа и устройство для его осуществления

Изобретение относится к аналитическому и медицинскому приборостроению, а именно к области химического анализа биологических материалов, и может быть использовано при исследовании жидких биологических и медицинских проб, при экспресс-диагностике заболеваний в составе биочипов или лабораторий-на-чипе, в лабораторных и полевых условиях. В способе процесс селективного связывания белков-маркеров проводят в потоке исследуемой биологической жидкости в микрофлюидной системе биочипа, содержащей планарные ячейки с иммобилизованными биологическими лигандами. После прохождения биологической жидкости через микрофлюидную систему биочипа ее промывают биологическим буферным раствором. Затем биочип освещают ультрафиолетовым излучением и измеряют интегральную интенсивность светового потока, излучаемого люминофором. Устройство содержит фотоприемное устройство в виде видеосенсора со светочувствительной матрицей и сопряженный с ним биочип. Биочип является многослойным устройством, содержащим стеклянную подложку, и расположенную на ней микрофлюидную систему. Группа изобретений позволяет повысить скорость анализа, упростить его, миниатюризировать и обеспечить возможность автоматизации, а также, повысить надежность и жесткость конструкции. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 3 пр., 6 ил.

 

Изобретение относится к аналитическому и медицинскому приборостроению, биоинженерии, биофизике, биохимии, молекулярной биологии, клинической биохимии, а именно к области химического анализа биологических материалов, и может быть использовано при исследовании жидких биологических и медицинских проб. Наиболее эффективно использовать при экспресс-диагностике заболеваний в составе миниатюрных аналитических устройств - биочипов или лабораторий-на-чипе (а также биологических микрочипов), в лабораторных и полевых условиях, в приборах для диагностики на месте оказания помощи (Point-of-Care Testing, POCT) и в соответствующих телеметрических системах.

Наиболее перспективным направлением развития аналитических средств нового поколения, способных реализовать экспресс-мультипараметрическую биомедицинскую диагностику, и имеющих потенциал развития в экспертные системы, представляется применение принципов протеомики, фотоники, технологии формирования микро- и наноструктур, химии поверхности. Одной из реализаций такого подхода являются диагностические биочипы (также биологические микрочипы, лаборатории-на-чипе), в частности, реализованные на принципах протеомики, т.е. на основе использования явлений специфического молекулярного распознавания и связывания олигопептида и белка-маркера.

Анализ биологических жидкостей с целью поиска белков-маркеров с помощью технологии биочипов, включает стадии экспонирования биологических проб на биочипе с целью связывания белков-маркеров из жидкой пробы на поверхности с иммобилизованными пептидными лигандами и затем количественное определение связанных белков-маркеров. Для осуществления последнего, в большинстве случаев, применяют предварительное или в реальном времени присоединение меток к белкам-маркерам, так, чтобы можно было определить их свечение в заданной области спектра. Данная процедура является дорогостоящей, трудоемкой и длительной. Можно даже сказать, что процедура присоединения меток является лимитирующей стадией процесса.

Известны автоматические и полуавтоматические инструментальные способы обнаружения белков-маркеров в биологических жидкостях, они включают жидкостную хроматографию (Determination of myoglobin in human serum by high-performance liquid chromatography with chemiluminescence detection / V.G. Maltsev, T.M. Zimina [et al.] // Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. – 1987. – Vol. 416, - P. 45-52), капиллярный электрофорез (Матричные пептидные биосенсорные системы на основе молекулярного распознавания для экспресс-диагностики заболеваний / А.И. Егоров, Т.М. Зимина [и др.] // Биотехносфера. - 2017. - № 3, с. 48-56) и другие методы, реализуемые с помощью стационарных приборов, однако они являются длительными и централизованными.

Достижения технологий микроэлектроники, микросистемной техники и принципы миниатюризации в инструментальном анализе открыли возможности развития нового поколения технических средств - микроаналитических систем, называемых также: μ-TAS, lab-on-a-chip (лаборатории-на-чипе), биочипы, биологические микрочипы, микрофлюидные системы и др. (Manz, A. Miniaturized total chemical analysis systems: A novel concept for chemical sensing / A. Manz, N. Graber, H.M. Widmer // Sensors and Actuators. B.1. - 1990. Vol. 1, Р. 244-248; Зимина Т.М. Интегральные капиллярные сепарационные микросистемы для химического анализа / Т.М. Зимина // Петербургский журнал электроники. – 2000, № 3-4, с. 79-91). Представляя собой миниатюрные устройства, изготовленные с помощью планарных и гибридных технологий, такие системы предназначены для проведения различного рода химических и биомедицинских анализов. Они позволяют повысить производительность при осуществлении биомедицинского анализа. Разработка микроаналитических систем позволяет также решать задачи снижения стоимости, материало- и энергоемкости изделий. Эти усовершенствования возможны благодаря формированию таких устройств с помощью микро- и нанотехнологий, позволяющих реализовывать прецизионную геометрию, обеспечивающую возможность геометрической комплементарности компонентов на молекулярном уровне, повышение скорости анализа без дополнительных затрат, управление массопереносом и автоматическое регулирование в микромасштабе стадий аналитического процесса в интегрированных функциональных модулях и подсистемах. Перенос биологических объектов в таких системах может осуществляться с помощью проточного анализа, с использованием принципов микрофлюидики. Усовершенствование способов традиционного биохимического анализа, а также биочипов и методов регистрации селективно-связанных белков-маркеров заболеваний в биочипах, может быть осуществлено именно с использованием технологий микро- и наноэлектроники.

Среди первых описаний анализа с помощью биочипа, известен биочип на основе олигонуклеотидных лигандов, ковалентно-присоединенных к твердой подложке в виде топологически кодированных площадок (Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip: МПК C07B 61/00; C12M 1/00; C12N 15/09; C12Q 1/68; G01N 33/53; G01N 33/566; G01N 37/00/ Gold L., Zichi D. PCT/US98/26515 (1998-12-14)). Каждый лиганд на основе нуклеиновой кислоты специфически и активно связывается с конкретной молекулой-мишенью, содержащейся в тестируемой биологической жидкости, включая белки. Контакт тестируемой биологической жидкости с биочипом приводит к связыванию молекулы-мишени (преимущественно, белка-маркера) с родственным ей лигандом на основе олигонуклеотида. При этом молекулы-мишени должны содержать реагент, ковалентно присоединенный к ним и позволяющий распознавать их после присоединения к биочипу. Альтернативно, биочип может вступать в контакт с реагентами (после присоединения к нему молекул-мишеней), ковалентно реагирующими с присоединенными молекулами-мишенями (в частности, белками-маркерами), позволяющими обнаружить каждую из таких молекул-мишеней в тестируемой жидкости по соответствующему адресу на биочипе.

В данном методе впервые использовался принцип пространственного распознавания белков цепью олигонуклеотида (аптамера – термин введен авторами патента), но для детектирования применяют реагенты (метки), ковалентно присоединяемые к белкам, что делает анализ сложным и дорогим. Кроме того, отмечается недостаточно высокая селективность олигонуклеотидных аптамеров, связанная с жесткостью их цепи (Kalra P., A. Simple Methods and Rational Design for Enhancing Aptamer Sensitivity and Specificity / P. Kalra, W. Dhiman [et al.] // Front Mol Biosci. – 2018. Vol. 5, P. 41). Отмечается, что аптамеры – структурированные молекулы нуклеиновых кислот, в принципе, могут связывать молекулярные мишени с высокой афинностью и специфичностью. Однако известные аптамеры, полученные методом SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment), могут и не демонстрировать необходимую аффинность и специфичность.

Более высокую аффинность и специфичность при связывании белков-маркеров могут проявлять пептидные аптамеры, или олигопептидные фрагменты. Именно такой механизм молекулярного биораспознавания реализован в живой природе, поскольку олигопептидные цепи обладают более высокой гибкостью, а следовательно, способны сформировать пространственные структуры более высокой сложности и размерности (Parker B.W., Mapping low-affinity/high-specificity peptide–protein interactions using ligand-footprinting mass spectrometry / B.W. Parker, E.J. Goncz [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences – 2019. Vol. 116 (42), P. 21001-21011).

Известен способ обнаружения белка-маркера инфаркта миокарда с помощью биочипа применимого в портативной системе (POCT) (Biochip for detecting myocardial infarction marker, and detection method applying same. B01L 3/00; G01N 35/00. CN109061207 (A) ZHANG Y. 2018). Биочип представляет собой подложку и участки с антителами, иммобилизованными на этой подложке, причем антитела могут образовывать иммунный комплекс с антигеном, конъюгированным с магнитными частицами, и маркерным белком, и сложный агрегат магнитных частиц будет образовываться на биосенсоре, покрытом участками с антителами, когда образец крови содержит белок-маркер инфаркта миокарда. Регистрация иммобилизованных белков-маркеров осуществляется путем измерения магнитного поля, генерируемого магнитными микрочастицами. Таким образом, изобретение обеспечивает способ обнаружения белков-маркеров с помощью биочипа, что сокращает объем пробы и время диагностики до 15 - 20 минут. Данный способ, предполагает использование белков - антител, являющихся лабильными веществами, требующими специальных условий хранения, пробоподготовки, заключающейся во внесении конъюгатов с магнитными частицами в биопрепараты, которые вследствие диффузионных ограничений затруднительно использовать в системах более высокой размерности.

Близкий к описанному выше способ описан для микрофлюидного биочипа с магнитными частицами для анализа четырех маркеров воспаления, который также относится к формату POCT диагностики (Magnetic particle microfluidic biochip for four inflammation markers and detection method. B01L 3/00; G01N 33/68, CN108722507 (A), ZHANG Y. 2018). Описанный биочип содержит биосенсор также на основе антител и использует конъюгат на основе антител, связанных с магнитными частицами. Концентрация белка – маркера заболевания, определяется по интенсивности сигнала магнитного сопротивления комплекса в биочипе. Способ разработан для четырех маркеров воспаления: PCT, IL-6, CRP и SAA. Данный способ обладает такими же недостатками, как и предыдущий, но с технической точки зрения ближе к заявляемому способу, так как в нем используется микрофлюидный перенос вещества.

Апатамеры создали альтернативу применению антител в анализе биомаркеров (Nimjee S.M. Aptamers: an emerging class of therapeutics / S.M. Nimjee, C.P. Rusconi, B.A. Sullenger // Rev Med. – 2005. Vol. 56, P. 555–583).

Так, известен биочип, содержащий биораспознающие лиганды в виде пептида, комплементарного к холерному токсину и специфически присоединяющий его (The peptide probes high specific and high selective for target biomarker and the biochip for clinical prediction of Vibrio cholera toxin. KR20170009047 (A) PARK J. P., LIM J. M. - 2017). Однако данное изобретение описывает способ, в котором регистрация иммобилизованного в биочипе биомаркера, осуществляется с применением флюорофора, конъюгированного с иммуноглобулином и биотином. Подобные способы, различающиеся химической структурой пептидных аптамеров, описаны в ряде патентов (KR101657881 (B1) 2016-09-19; KR20160111202 (A) 2016-09-26; KR101732787 (B1) 2017-05-08; KR101641825 (B1) 2016-07-2), в которых также не предусмотрена возможность прямой регистрации иммобилизованных белков-маркеров.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ анализа взаимодействий между молекулами, флуоресцирующими в ультрафиолетовом (УФ) диапазоне, включая белки, последовательность которых содержит один или несколько аминокислотных остатков триптофана (Trp) и биологическими молекулами, иммобилизованными в ячейках биологического микрочипа (биочипа), в ходе которого регистрируются взаимодействия на основе измерения интенсивности флуоресценции, возбуждаемой в УФ диапазоне спектра. (Способ и устройство для анализа взаимодействий биологических молекул на биологическом микрочипе на основе флуоресценции аминокислотных остатков триптофана. G01N 33/52. RU2588816). Технический результат обеспечивает возможность избежать использования флуоресцентных меток на белках-мишенях для регистрации связывания. Способ осуществляется с использованием биочипа, содержащего лиганды, закрепленные на топологически кодированных площадках твердой подложки. Исследуемая проба биологической жидкости, содержащая белки-маркеры, наносится на подложку и лиганды биочипа взаимодействуют с жидкой пробой, содержащей белки-маркеры, содержащие один или более аминокислотных остатков триптофана (Trp). Интенсивность флуоресценции белков-маркеров на биочипе измеряют в УФ области спектра (300-350 нм) с помощью специализированного настольного анализатора биочипов, приспособленного для работы в УФ диапазоне (возбуждение 250-300 нм, флуоресценция 300-400 нм). Это позволяет исключить использование флуоресцентных меток для регистрации связывания. В качестве анализатора изображения биочипа в данном методе можно использовать флуоресцентный микроскоп с кварцевой оптикой, который оснащен источником ультрафиолетового излучения (например, газоразрядной лампой, излучающей в области 250-300 нм), набором фильтров и фотоприемником, позволяющим регистрировать испускаемое объектом излучение в диапазоне длин волн 300-400 нм, или сканер, позволяющий регистрировать флуоресценцию в области 300-400 нм при возбуждении в области 250-300 нм.

Основными недостатками прототипа являются:

1. Сложность конструкции, содержащей большое количество дорогостоящих элементов, включая светофильтры, кварцевое стекло, газоразрядную лампу. Все это делает невозможным применение метода в формате мобильного устройства (point-of-care testing, POCT).

2. Флюоресценция в диапазоне 300 – 400 нм, требует применения специализированных средств регистрации изображения, что делает способ более дорогостоящим и снижает его доступность в медицинской практике.

3. Загрузка пробы осуществляется ручным методом путем полива пробы на поверхность чипа, или погружения чипа в жидкий раствор пробы. Это снижает воспроизводимость результатов метода, делает его более трудоемким и повышает объем пробы биологической жидкости.

Задачей заявляемого способа является получение технического результата, заключающегося в упрощении процедуры анализа взаимодействий биологических молекул на биологическом микрочипе (биочипе) для количественного определения селективно связанных белков-маркеров заболеваний. Кроме того, заявляемый способ решает задачу использования его в приборах класса POCT и в лабораториях-на-чипе, а также возможность автоматизации процедуры ввода пробы.

Данный технический результат достигается тем, что в способе количественного определения селективно связанных белков-маркеров заболеваний в планарных ячейках биочипа обеспечивают взаимодействие исследуемой биологической жидкости, содержащей белки-маркеры, с биологическими молекулами (лигандами), иммобилизованными в планарных ячейках биочипа, по уровню флуоресценции иммобилизованных белков-маркеров при возбуждении УФ излучением. Причем процесс селективного связывания белков-маркеров проводят в потоке исследуемой биологической жидкости, в микрофлюидной системе биочипа, содержащей планарные ячейки с иммобилизованными биологическими лигандами, а после прохождения всего объема пробы биологической жидкости через микрофлюидную систему биочипа ее промывают биологическим буферным раствором с низкой ионной силой, характеризующимся отсутствием остаточной флюоресценции при возбуждении ультрафиолетовым излучением, затем биочип освещают ультрафиолетовым излучением в диапазоне 260 – 280 нм, при этом вторичное излучение флюоресценции белка в диапазоне 300 – 350 нм направляют через стеклянную подложку, являющуюся одновременно оптическим фильтром, на слой люминофора нанесенный на его внешнюю поверхность, после чего измеряют интегральную интенсивность светового потока, излучаемого люминофором в диапазоне 450 – 550 нм, и в зависимости от ее уровня определяют количество белков-маркеров на основе калибровочной зависимости для конкретного белка-маркера..

В способе количественного определения селективно связанных белков-маркеров заболеваний в планарных ячейках биочипа проводят заполнение микрофлюидной системы биочипа исследуемой биологической жидкостью при скорости потока 0,1 – 1,0 мм × с^-1, в процессе которого благодаря диффузионной подвижности белки-маркеры приближаются к поверхности ячеек, содержащих иммобилизованные биологические молекулы (олигопептиды), пространственная конфигурация которых обеспечивает накопление белка-маркера в ячейках биочипа, а также полноту связывания белка-маркера с биологическими молекулами, иммобилизованными в ячейках биочипа, за счет снижения диффузионных ограничений при поперечной подвижности белков-маркеров в потоке в микрофлюидном канале, и тем самым повышает чувствительность метода. Объем биологической жидкости составляет от 10 мкл до 1 мл. После прохода всего объема биологической жидкости систему промывают биологическим буфером с низкой ионной силой, и не характеризующимся остаточной флюоресценцией при возбуждении ультрафиолетовым излучением. Например, таким буфером может быть 0,01 мол × л^-1 ацетат натрия, pH 7. Непосредственно после этого канал с ячейками освещают ультрафиолетовым излучением, как правило, в диапазоне 260 - 280 нм, через герметизирующую поверхность, прозрачную в ультрафиолетовом диапазоне излучения, а именно при длинах волн 260 – 280 нм, при этом связанный белок-маркер поглощает ультрафиолетовое излучение, а его ароматические компоненты, например аминокислота триптофан, флюоресцируют в диапазоне 300-350 нм, причем флюоресценция распространяется по всем направлениям в пределах 4π стерадиан, а часть ее в пределах апертуры приема порядка π – π/2 стерадиан, определяемой оптическим окном (или системой окон), проходит сквозь стеклянную подложку, герметизирующую микрофлюидный канал со стороны, противоположной источнику излучения, и облучает слой люминофора, нанесенный на нее с противоположной от микрофлюидного канала стороны, который начинает излучать люминесценцию в области длин волн 450–550 нм, при этом первичное излучение УФ источника в значительной степени поглощается стеклянной подложкой и не влияет на уровень выходного излучения. Применение стеклянной подложки биочипа одновременно в качестве светофильтра, поглощающего первичное ультрафиолетовое излучение источника (в диапазоне 260-280 нм) позволяет существенно упростить процедуру позиционирования рабочей области биочипа в апертуре приема оптической системы, а следовательно, упростить процедуру анализа. Использование слоя люминофора, нанесенного на противоположную от микрофлюидного канала сторону стеклянной подложки, обеспечивает смещение полосы вторичного излучения в область спектральной чувствительности типовых видеосенсоров, включая веб-камеры. Интегральная интенсивность светового потока, излучаемого люминофором, сопряженным геометрически с площадкой, содержащей лиганды, прямо пропорциональна количеству белка-маркера, иммобилизованного лигандами вследствие их взаимодействия с белком–маркером. Данную зависимость интенсивности светового потока от количества белка-маркера получают путем калибрования системы растворами белков в заданном диапазоне концентраций. Это позволяет осуществлять калибровку системы для каждого конкретного белка-маркера и определять его количество в пробе.

Калибровочная зависимость представляет собой соотношение уровня интегральной интенсивности светового потока, регистрируемого фотоприемным устройством, и концентрации калибровочного белка-маркера, при котором минимальной концентрации искомого белка-маркера соответствует минимальному уровню флуоресценции, в пробе, сигнал от которой можно надёжно отличить от фона (см. Пример 3).

Совокупность признаков по п. 2 формулы, характеризующих способ, заключается в использовании в качестве биологических молекул (лигандов), иммобилизованных в планарных ячейках биочипа, пептидов или их производные. Достоинство этого признака заключается в том, что лиганды на основе пептидов или их производных обладают пространственной комплементарностью к конкретным белкам, вследствие чего они способны связываться с белками-маркерами с высокой степенью селективности и специфичности, а также в том, что поиск высокоселективных лигандов может быть проведен путем средств компьютерного моделирования, что позволяет обеспечить не только заданную их пространственную конфигурацию, но и химический состав.

Совокупность признаков по п. 3, характеризующих способ, заключается в использовании пептидов, иммобилизованных в планарных ячейках биочипа, не имеющих в своем составе ароматических аминокислот. Достоинство этого признака заключается в том, что, он позволяет обеспечить снижение фоновой флюоресценции, поскольку ароматические аминокислоты, в частности триптофан, вносят основной вклад в флуоресценцию белков-маркеров, что, в свою очередь, обеспечивает повышение чувствительности способа и расширение его динамического диапазона.

Совокупность признаков по п. 4, характеризующих способ, описывает измерение интегральной интенсивности светового потока, излучаемого люминофором, которое осуществляется с помощью видеосенсора, сопряженного геометрически с биочипом. Достоинство этого признака заключается в том, что он позволяет использовать для регистрации селективно связанных белков-маркеров заболеваний в планарных ячейках биочипа наиболее распространенные и дешевые фотоприемные устройства (например, видеосенсоры на основе КМОП-матриц веб-камер) и реализовать функцию одновременное мультипараметрическое детектирование на всех ячейках биочипа.

Наиболее близким к заявляемому устройству является устройство для анализа белков в биологической жидкости c помощью биочипа и флюоресцентного детектирования (Fluorescent biochip diagnosis device. МПК G01N 33/50; G01N 33/533; H01L 27/146; H01L 31/10. CN101868727 (A). B. S. LEE BYOUNG. - 2010). Раскрыто флуоресцентное диагностическое устройство биочипа, включающее в себя: датчик изображения, имеющий множество фотодетекторов; и блок полосового фильтра, имеющий множество полосовых фильтров, сформированных на множестве фотодетекторов, при этом множество полосовых фильтров реализовано путем формирования рисунка наноструктуры в металлическом слое. Поскольку флуоресцентное диагностическое устройство с биочипом имеет небольшие оптические потери из-за короткого интервала между биочипом и фотодетектором, может быть обеспечена превосходная чувствительность. Кроме того, поскольку сигналы могут быть одновременно измерены путем комбинирования световых пучков с короткой длиной волны, используемых в качестве освещения, в зависимости от типа флуоресцентного белкового материала время диагностики могут быть уменьшены.

Основным недостатком прототипного устройства является то, что оно усложняет осуществление анализа, поскольку флюоресценция белков в области 350-400 нм требует применения специальных моделей видеосенсоров. Кроме того, устройство содержит избыточное количество светофильтров.

Задачей заявляемого изобретения является разработка устройства для осуществления способа количественного определения селективно связанных белков-маркеров заболеваний в планарных ячейках биочипа, последовательность которых содержит флюоресцирующие компоненты, например триптофан, позволяющего получить технический результат, заключающийся в повышении скорости анализа, его упрощении, миниатюризации и обеспечении возможности автоматизации, а также повышении надежности и жесткости конструкции и возможности применения в изделиях класса PОCT.

Технический результат достигается тем, что устройство для осуществления способа количественного определения селективно связанных белков-маркеров заболеваний содержит источник УФ излучения в диапазоне 260-280 нм и фотоприемное устройство. Причем оно содержит фотоприемное устройство в виде видеосенсора со светочувствительной матрицей в видимом диапазоне спектра, сопряженный с ним биочип, представляющий собой многослойное устройство, содержащее стеклянную подложку, прозрачную для излучения в видимом диапазоне спектра и предназначенную для поглощения значительной части первичного УФ излучения, расположенную на ней микрофлюидную систему, выполненную в виде слоя с рельефом каналов для жидкости, слой, герметизирующий микрофлюидные каналы, из УФ-прозрачного полимера, и слой люминофора, нанесенный на внешнюю поверхность стеклянной подложки, сопряженный с видеосенсором, а сторона подложки, обращенная в сторону микрофлюидной системы, выполнена с возможностью иммобилизации на ней биологических молекул (лиганд).

Сущность заявляемого устройства заключается в том, что в устройстве для осуществления способа количественной регистрации связанных белков-маркеров содержится планарный биочип, представляющий собой сэндвич-структуру, состоящую из подложки, выполненной из стекла и покрытой слоем люминофора с наружной стороны, причем на внутренней стороне подложка содержит герметично закрепленный полимерный слой с рельефом микрофлюидных каналов. Данный слой герметизируется УФ-прозрачной пленкой, содержащей входное и выходное отверстия для жидкости. В микрофлюидной системе образуется проточная система, использование которой для загрузки и концентрирования жидких биопроб, позволяет повысить точность и чувствительность количественного анализа белков-маркеров, а также обеспечить возможности накопления целевого белка-маркера при контроле объема пробы, что повышает как точность, так и чувствительность анализа. На участках поверхности стеклянной подложки, граничащих с жидкостью, иммобилизованы пептиды, состоящие из 10 – 40 аминокислотных остатков и не имеющие в своем составе ароматических аминокислотных остатков, образующие пространственные конфигурации, обладающие комплементарностью к целевым белкам-маркерам, что обеспечивает снижение фоновой засветки в системе и повышение чувствительности и динамического диапазона регистрации белков-маркеров. Микрофлюидные каналы освещаются через УФ-прозрачный слой светодиодным источником излучения в диапазоне длин волн 260 – 280 нм, возбуждая флюоресценцию белков-маркеров в диапазоне 300 – 350 нм, которая проходит через стеклянную подложку биочипа и возбуждает люминесценцию люминофора в диапазоне 450-550 нм, которая попадает на поверхность фотоприемного устройства в виде видеосенсора со светочувствительной матрицей в видимом диапазоне спектра, при этом первичное УФ-излучение источника поглощается стеклянной подложкой. Применение люминофора в виде тонкого слоя, нанесенного на внешнюю поверхность стеклянной подложки, позволяет использовать наиболее распространенные и дешевые фотоприемные устройства (например, видеосенсоры на основе КМОП-матриц веб-камер), что позволяет упростить конструкцию устройства и дополнительно снизить стоимость устройства. Конфигурация оптической системы приема люминесценции реализована на основе сопряженной системы приема сигнала, т.е. сенсор геометрически сопряжен в пространстве с биочипом, а именно, с его стороной, которая покрыта люминофором, что позволяет повысить компактность устройства, чувствительность вследствие увеличения угла апертуры приема и жесткость конструкции, т.е. надежность и простоту настройки устройства.

Совокупность признаков по п. 6 формулы характеризует устройство, в котором стеклянная подложка состоит из натриевого или боросиликатного стекла, стекла Крон-8, в том числе предметного стекла, покровного стекла, задерживающих возбуждающее флюоресценцию белков излучение источника в диапазоне 260-280 нм и одновременно пропускающих флуоресценцию белков в диапазоне 300-350 нм позволяет существенно сократить количество цветных светофильтров и упростить его конструкцию, а также дополнительно снизить стоимость устройства.

Совокупность признаков по п. 7 формулы характеризует устройство, в котором первичное излучение от источника УФ излучения в диапазоне 260-280 нм расположено с противоположной (180 град.) от приемника стороны биочипа, что возможно при использовании стеклянной подложки в качестве оптического окна/светофильтра, поглощающего УФ излучение. Достоинство этого признака устройства заключается в простоте юстировки оптической системы.

Совокупность признаков по п. 8 формулы характеризует устройство, в котором материалом герметизирующего слоя биочипа является УФ-прозрачный полимер, например, полиэтилена, полипропилена или кварцевого стекла. Достоинство данного признака заключается в обеспечении целостности микрофлюидной системы биочипа и пропускании возбуждающего флюоресценцию белков-маркеров УФ излучения в диапазоне 260-280 нм.

Изобретение поясняют следующие фигуры:

Фиг. 1 - Схема устройства для реализации способа количественного определения белков-маркеров в биологических жидкостях.

Фиг. 2 - Топология биочипа на примере топологии одноканального (37 ячеек) биочипа для анализа белков-маркеров в крови.

Фиг. 3 - Спектральные характеристики системы флюоресцентного детектирования белков-маркеров в биочипе с возбуждением их флюоресценции УФ-светодиодом на длине волны 2 с 80 нм и переизлучением флюоресценции белка в диапазоне 250 – 400 нм с помощью слоя люминофора с увеличением длины волны излучения, которую могут зарегистрировать фотоприемное устройство в виде видеосенсора со светочувствительной матрицей в видимом диапазоне спектра, например, КМОП-матрицы web-камер.

Фиг. 4 - Спектральные характеристики элементов оптической схемы приема.

Фиг. 5 - Оценка интенсивности сигнала в фотоприемном устройстве в зависимости от времени накопления при регистрации флюоресценции бычьего сывороточного альбумина (БСА).

Фиг. 6 - Изображение фрагмента рабочей зоны биочипа, заполненного Тропонином T при освещении УФ излучением без слоя люминофора (а) и со слоем люминофора толщиной 10 мкм (б).

Устройство (Фиг. 1) для осуществления способа содержит: 1 – слой люминофора, 2 – стеклянная подложка, 3 – слой микрофлюидной системы биочипа с рельефом каналов для жидкости, 4 – УФ-прозрачная пленка для герметизации слоя микрофлюидной системы, 5 – микрофлюидный канал, 6 – иммобилизованные пептиды - лиганды (аптамеры), 7 – белки-маркеры, 8 – УФ излучение, 9 – вход для жидкости, 10 – светодиодный источник УФ излучения, 11 – выход для жидкости, 12 – флюоресценция белков-маркеров, 13 – люминесценция люминофора, 14 – фотоприемное устройство (видеосенсор).

Биочип (Фиг. 1) для осуществления способа содержит микрофлюидный канал 5, заполняемый жидкостью (например, плазмой крови), который образован стеклянной подложкой 2, слоем микрофлюидной системы биочипа 3, в котором сформирован рельеф каналов для жидкости в соответствии с заданной топологией, и герметизирующей крышкой 4. Наружная сторона стеклянной подложки 2 покрыта слоем люминофора 1 с заданными спектральными характеристиками поглощения и люминесценции. Внутренняя сторона стеклянной подложки, граничащая с жидкой пробой, содержит площадки с иммобилизованными пептидами 6. Жидкая проба поступает в биочип через входное отверстие 9 и элюируется по каналам биочипа с заданной скоростью, которая определяется кинетикой массообмена в диффузионно-ограниченном процессе сорбции в системе: поверхность с иммобилизованными пептидными аптамерами 6 – раствор белков, содержащий белки-маркеры 7. При элюировании жидкой пробы целевые белки–маркеры 7 заболеваний мигрируя около аптамеров присоединяются к ним, образуя комплексы. После прохождения полного объема пробы через каналы микрофлюидной системы 5 биочипа, его проточная система промывается водно-солевым буферным раствором. После промывки, система биочипа освещается УФ светодиодом с длиной волны 280 нм, возбуждая флюоресценцию белков, иммобилизованных на пептидных лигандах (аптамерах). Излучение от флуоресценции 12 белков частично проходя через стеклянную подложку попадает на слой люминофора 1, который люминесцирует 13 в видимой области спектра (450 – 550 нм), формируя изображение биочипа на сенсоре видеокамеры 14.

Устройство (Фиг. 1) состоит из светодиодного источника УФ излучения (10) в диапазоне 260-280 нм, фотоприемного устройства (14) со светочувствительной матрицей в видимом диапазоне спектра (видеосенсора), и сопряженного с ним многослойного биочипа, состоит из подложки 2, выполненной из стекла, и покрытой слоем люминофора 1, слоя 3 микрофлюидной системы биочипа с рельефом каналов для жидкости, который может быть выполнен из пленочного фоторезиста, УФ-прозрачной пленки 4, герметизирующей микрофлюидные каналы 5. На участках поверхности слоя 2, граничащих с жидкостью, иммобилизованы пептиды 6, обладающие пространственной комплементарностью к целевым белкам-маркерам 7 и способностью их селективно связывать. Микрофлюидные каналы 5 освещаются излучением 8, светодиодного источника 10 в диапазоне длин волн 260 – 280 нм. Излучение 8, пропускается слоем 4 и падает на целевые белки, возбуждая флюоресценцию 10 их компонентов (например, ароматических аминокислот) в диапазоне 300 – 350 нм. Флюоресценция 12 пропускается стеклянной подложкой 2 биочипа и возбуждает люминесценцию 13 люминофора 1 в диапазоне 450 – 550 нм. При этом излучение 8 поглощается слоем 2 и не оказывает влияния на сигнал фотоприемного устройства 14. Излучение 13 попадает на поверхность фотоприемного устройства (видеосенсора) 14, например, КМОП-матрицы.

На фиг. 2 показана топология биочипа с 37 ячейками: 9 – входной резервуар для пробы, 5 – микрофлюидный канал, 21 – ячейка для иммобилизации пептидов, 11 – выходной резервуар. Спектральные характеристики каскада переизлучения в устройстве показаны на Фиг. 3.

Оценка параметров работы устройства приведена в примере 1.

На фиг. 4 показаны спектральные характеристики элементов оптической схемы приема: спектры возбуждения (15) и флуоресценции (16) люминофора ZnS:Cu, спектр излучения ультрафиолетового светодиода (17), спектр флюоресценции Тропонина Т (18), спектры поглощения покровного стекла (19) и полипропиленовой пленки (20).

На фиг. 5 показана оценка интенсивности сигнала в фотоприемном устройстве в зависимости от времени накопления при регистрации флюоресценции бычьего сывороточного альбумина (БСА) в концентрации 0,5 мг/мл в микрофлюидном канале биочипа в присутствии слоя люминофора на внешней поверхности окна (22) и без люминофора (23); (б) – зависимости интенсивности сигнала фотоприемника регистрации флюоресценции растворов БСА различных концентраций от времени накопления сигнала: 24 – 4,25 мг/мл, 25 – 2,125 мг/мл, 26 – 1,063 мг/мл, 27 – 0,531 мг/мл, 28 – 0,266 мг/мл, 29 – 0,133 мг/мл, 30 – 0,066 мг/мл, 31 – 0,033 мг/мл, 32 – 0,017 мг/мл, 33 – фосфатный буфер.

На Фиг. 6 концентрационная зависимость относительной величины сигнала фотоприемного устройства от флюоресценции Тропонина Т для чипа со слоем люминофора (34), где пунктирная линия (35) является линейной аппроксимацией полученной зависимости (в).

Пример 1

Рассмотрим фрагмент биочипа: площадку с иммобилизованными пептидными лигандами (аптамерами) размером 100 мкм х 100 мкм. На площадке иммобилизованы пептиды с плотностью, например, 1 пептид на 1 нм². Таким образом на площадке расположено 1010 пептидов. Гидродинамический размер белка, например, гемоглобина, составляет 9 нм, тогда максимальное число молекул белка-маркера, иммобилизованных на аптамерах составит 108. Если предположить, что белок содержит, по крайней мере, 1 ароматический аминокислотный остаток, например, триптофан, то площадка будет содержать 108 излучателей с квантовой эффективностью 90%, характерной для триптофана. Светодиод, имеющий мощность 1 мВт, излучает энергию 1 мДж в секунду или в апертуре одной площадки – 0,25 мкДж в секунду. При экспозиции в 60 с энергия падающего излучения составит 18 мкДж. Энергия фотона при длине волны 280 нм составляет 6,6.10-19 Дж. Значит за 60 с на площадку попадет максимально 2,73.1013 фотонов, а минимально 105 фотонов в случае, если будет связан один белок на площадке.

Если квантовая эффективность люминофора составляет 60%, то поток вторичного излучения флюоресценции белка при использовании микролинз может составить π/2 стерадиан или примерно 10% от полного объема энергии. Учитывая квантовую эффективность люминофора в 60% - энергия составит 6%. Таким образом максимальная энергия, излученная одной площадкой с аптамерами, которая может попасть на фотоприемник составляет порядка 1 мкДж.

На фиг.3 показаны спектры возбуждения (15) и флуоресценции (16) люминофора ZnS:Cu, спектр излучения ультрафиолетового светодиода (17), спектр флюоресценции Тропонина Т (18), спектры поглощения покровного стекла (19) и полипропиленовой пленки (20).

Пример 2

Сравнительное изображение флуоресценции бычьего сывороточного альбумина (БСА) в микрофлюидном канале без люминофора (Фиг. 5(а)) и со слоем люминофора перед КМОП-матрицей (Фиг.5(б)). Как видно из зависимости интенсивности флюоресценции от времени экспозиции (Фиг. 5(в)), применение люминофора ZnS:Cu в качестве переизлучающего слоя значительно повышает интенсивность принимаемого сигнала фотодетектора даже при небольших временах экспозиции. Наиболее ощутимое различие в значениях уровня принимаемого фотоприемником сигнала от флюоресценции белка можно наблюдать, начиная со времени экспозиции, равном 400 мс. Таким образом, накопление сигнала от естественной флуоресценции белка позволяет расширить динамический диапазон детектируемого сигнала.

Для установления времени экспозиции, оптимального для проведения измерений концентрации белка-маркера в пробе, получено семейство кривых для различных концентраций БСА, представленное на Фиг. 6(а). Полученное семейство кривых позволяет в явном виде проследить необходимость накопления входного сигнала с помощью варьирования времени экспозиции КМОП-матрицы. При малых временах экспозиции (<200 мс) наблюдается узкий динамический диапазон детектирования, что существенно понижает достоверность измерений. При времени экспозиции >1000 мс на больших значениях концентрации наблюдаются достаточно малые различия в интенсивности выходного сигнала, что может свидетельствовать о переизбытке накопленного сигнала. Поэтому оптимальным временем экспозиции для измерения концентрационной зависимости выходного сигнала представляется выбрать время 800 мс. Таким образом, подбор оптимального времени экспозиции позволяет расширить динамический диапазон детектирования системы.

Пример 3

Исследована чувствительность метода с применением КМОП-матрицы видеокамеры ToupCam 5.1MP. Вид рабочего окна биочипа без люминофора и с нанесенным люминофором в присутствии Тропонина Т в концентрации 0,8 мкг/мл, показаны на Фиг. 6(а) и (б), соответственно. Из Фиг. 6 (б) видно, что Тропонин Т при данной концентрации не излучает сигнал, регистрируемый КМОП-матрицей. Концентрационная зависимость относительной флуоресценции Тропонина Т в диапазоне концентраций от 6 до 1000 нг/мл.

Относительные значения флуоресценции Fr на графике Фиг. 6 (в) рассчитывали следующим образом:

Fr = (FS-FB)/(FSmax-FB), (1)

где: FS – значение сигнала флуоресценции образца, FS – значение сигнала флуоресценции образца с максимальной измеренной концентрацией, FB – значение сигнала флуоресценции буферного раствора.

Зависимость на Фиг. 6(в) линейна в диапазоне концентраций Тропонина Т от 6 до 1000 нг/мл и удовлетворяет линейному уравнению; y = -0,3492x + 2,1027, c R2 = 0,9876. Предел обнаружения для Тропонина T составляет 6,0 ± 0,03 нг/мл.

Исходя из данных на Фиг. 6 видно, что относительная флуоресценция возрастает с увеличением концентрации исследуемого белка-маркера. Таким образом, для численного определения концентрации исследуемого белка-маркера, например, Тропонина Т, с помощью разработанного способа, необходимо проводить калибровку устройства с целью установления предела обнаружения для конкретного белка-маркера.

1. Способ количественного определения селективно связанных белков-маркеров заболеваний в планарных ячейках биочипа, при котором обеспечивают взаимодействие исследуемой биологической жидкости, содержащей белки-маркеры, с биологическими молекулами (лигандами), иммобилизованными в планарных ячейках биочипа, по уровню флуоресценции иммобилизованных белков-маркеров при возбуждении УФ излучением, отличающийся тем, что процесс селективного связывания белков-маркеров проводят в потоке исследуемой биологической жидкости, в микрофлюидной системе биочипа, содержащей планарные ячейки с иммобилизованными биологическими лигандами, а после прохождения всего объема пробы биологической жидкости через микрофлюидную систему биочипа ее промывают биологическим буферным раствором с низкой ионной силой, характеризующимся отсутствием остаточной флюоресценции при возбуждении ультрафиолетовым излучением, затем биочип освещают ультрафиолетовым излучением в диапазоне 260 – 280 нм, при этом вторичное излучение флюоресценции белка в диапазоне 300 – 350 нм направляют через стеклянную подложку, являющуюся одновременно оптическим фильтром, на слой люминофора, нанесенный на его внешнюю поверхность, после чего измеряют интегральную интенсивность светового потока, излучаемого люминофором в диапазоне 450 – 550 нм, и в зависимости от ее уровня определяют количество белков-маркеров на основе калибровочной зависимости для конкретного белка-маркера.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве биологических молекул (лигандов), иммобилизованных в ячейках биочипа, используют пептиды или их производные.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что пептиды, иммобилизованные в планарных ячейках биочипа, не имеют в своем составе ароматических аминокислот.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что измерение интегральной интенсивности светового потока, излучаемого люминофором, осуществляют с помощью видеосенсора, сопряженного геометрически с биочипом.

5. Устройство для осуществления способа количественного определения селективно связанных белков-маркеров заболеваний по п. 1, содержащее источник УФ излучения в диапазоне 260-280 нм и фотоприемное устройство, отличающееся тем, что оно содержит фотоприемное устройство в виде видеосенсора со светочувствительной матрицей в видимом диапазоне спектра, сопряженный с ним биочип, представляющий собой многослойное устройство, содержащее стеклянную подложку, прозрачную для излучения в видимом диапазоне спектра и предназначенную для поглощения значительной части первичного УФ излучения, расположенную на ней микрофлюидную систему, выполненную в виде слоя с рельефом каналов для жидкости, слой, герметизирующий микрофлюидные каналы, из УФ-прозрачного полимера, и слой люминофора, нанесенный на внешнюю поверхность стеклянной подложки, сопряженный с видеосенсором, а сторона подложки, обращенная в сторону микрофлюидной системы, выполнена с возможностью иммобилизации на ней биологических молекул (лиганд).

6. Устройство по п. 5, в котором стеклянная подложка биочипа состоит из натриевого или боросиликатного стекла, стекла Крон-8, в том числе предметного стекла, покровного стекла.

7. Устройство по п. 5, в котором источник УФ излучения расположен с противоположной от приемника стороны биочипа под углом 180 град. друг относительно друга.

8. Устройство по п. 5, в котором слой, герметизирующий микрофлюидные каналы, из УФ-прозрачного полимера выполнен, например, из полиэтилена, полипропилена или кварцевого стекла.