Количественный метод определения экспрессии аллелей gnao1 здоровой формы и с мутацией c.607 g>a

Изобретение относится к биотехнологии, в частности разработан количественный метод на основе ПЦР с использованием специфических праймеров и зондов для определения уровней экспрессии транскриптов GNAO1 дикого типа и клинического варианта c.607 G>A. Настоящее изобретение может быть использовано для оценки эффективности препаратов РНК-терапии, направленной на специфическое подавление экспрессии транскриптов GNAO1 с мутацией c.607 G>A. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 5 ил., 5 пр.

 

Область техники

Изобретение относится к области генетики и молекулярной биологии. Разработан количественный метод на основе ПЦР с использованием специфических праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для определения уровней экспрессии транскриптов GNAO1 дикого типа и клинического варианта c.607 G>A. Настоящее изобретение может быть использовано для оценки эффективности препаратов РНК-терапии, направленной на специфическое подавление экспрессии транскриптов GNAO1 с мутацией c.607 G>A.

Изобретение создано при финансовой поддержке Министерства Науки и Высшего образования Российской Федерации в рамках Соглашения № 075-15-2019-1661 от 31.10.2019.

Уровень техники

В 2013 году была обнаружена связь между мутациями в гене GNAO1 и орфанным неврологическим расстройством, получившим название GNAO1-ассоциированной энцефалопатии. Данное заболевание проявляется в младенчестве и характеризуется эпилептической энцефалопатией (OMIM 615473) и/или нарушением развития мозга с непроизвольными движениями (OMIM 617493). Ген GNAO1 экспрессируется преимущественно в мозге и кодирует белок Gαo1. На 2021 год в литературе описано 25 вариантов патогенных мутаций данного гена. Мутации у пациентов возникают de novo и имеют доминантное проявление. Одной из наиболее часто встречаемых мутаций является вариант с.607 G>A (полиморфизм rs587777057). Данная мутация встречается только в гетерозиготном состоянии и приводит к аминокислотной замене G203R вблизи ГТФ-связывающего центра белка.

Для изучения GNAO1-ассоциированной энцефалопатии с вариантом с.607 G>A, а также для тестирования препаратов РНК-направленной терапии (антисмысловые олигонуклеотиды, малые интерферирующие РНК, искусственные микроРНК) необходим количественный метод оценки уровней экспрессии здорового и мутантного транскрипта GNAO1 в биологических образцах (биоптат кожи пациента, пациент-специфические нейроны, клеточные тест-системы). Разработка такого метода возможна на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени.

Для оценки уровня экспрессии гена GNAO1 в исследуемых образцах компанией Bio-Rad было разработано два набора реагентов. a) “PrimePCR SYBR® Green Assay: GNAO1, Human” (qHsaCID0006500), поставляемая ПЦР-смесь содержит праймеры специфичные к транскрипту гена GNAO1. Детекция сигнала при использовании набора осуществляется за счет накопления флуоресцентного сигнала от ДНК-интеркалирующего красителя SYBR Green. б) “PrimePCR Probe Assay: GNAO1, Human” (qHsaCIP0026191), поставляемая ПЦР-смесь содержит праймеры специфичные к транскрипту гена GNAO1, а также ДНК-зонд, меченый одним из пяти флуорофоров на выбор. Оба набора применимы только для оценки общего уровня экспрессии гена GNAO1 в образцах и не позволяют дискриминировать транскрипты дикого типа и с мутацией с.607 G>A .

Наиболее близким к настоящему изобретению является набор реагентов компании Thermo Fisher Scientific для аллель-специфической детекции полиморфизма rs587777057 методом мультиплекс-ПЦР с системой детекции TaqMan. Набор (“TaqMan™ SNP Genotyping Assay, human”, Assay ID: C_338418529_10) представляет собой пару праймеров, специфичных к геномному участку GNAO1 и два зонда с различными флуоресцентными метками для изоформ G и А полиморфизма rs587777057. Присутствие аллели GNAO1 дикого типа (изоформа G) детектируется в канале VIC, наличие клинического варианта с.607 G>A (изоформа А) регистрируется в канале FAM. Данный метод детекции полиморфизма rs587777057 предназначен для генотипирования образцов ДНК и не может быть применен для изучения транскриптов GNAO1, что является его существенным недостатком. Более того, данный метод подразумевает только качественную, но не количественную детекцию изоформ G/А полиморфизма rs587777057. И наконец, в наборе отсутствует универсальный зонд, детектирующий обе изоформы полиморфизма и выполняющий роль внутреннего положительного контроля прохождения реакции.

Техническая задача и технический результат

Задачей данного изобретения является разработка количественного метода на основе ПЦР для оценки уровня экспрессии G и А изоформ транскриптов GNAO1 при гетерозиготном полиморфизме rs587777057.

Настоящее изобретение заключается в создании набора праймеров и флуоресцентно-меченых зондов (ПЦР-набор №1) с системой детекции TaqMan, специфичных к транскриптам GNAO1 дикого типа (изоформа G), клинического варианта с.607 G>A (изоформа А) и обоим изоформам транскрипта в качестве внутреннего положительного контроля.

Изобретение также заключается в разработке способа количественной оценки уровня экспрессии изоформ транскриптов GNAO1 с полиморфизмом rs587777057 (G/A). Для количественности метода помимо ПЦР-набора №1 необходимо использовать ДНК-стандарты с известной концентрацией. Для количественного сравнения нескольких аналогичных биологических образцов разработаны праймеры и флуоресцентно-меченые зонды (ПЦР-набор №2), специфичные к транскриптам генов “домашнего хозяйства”. Оптимизированные условия реакции мультиплекс-ПЦР обеспечивают высокую специфичность и эффективность работы праймеров и зондов ПЦР-набора №1 и №2. Это в свою очередь определяет точность качественной и количественной оценки экспрессии изоформ транскриптов GNAO1 с полиморфизмом rs587777057 (G/A).

Данное изобретение может быть использовано в научных целях для изучения механизма GNAO1 c.607 G>A энцефалопатии и её моделирования, в диагностических целях для определения уровня экспрессии здорового и мутантного аллелей в тканях пациента с гетерозиготным полиморфизмом rs587777057, а также для разработки и оценки эффективности препаратов РНК-терапии (антисмысловые олигонуклеотиды, малые интерферирующие РНК, искусственные микроРНК), направленных на аллель-селективное подавление экспрессии мутантного транскрипта GNAO1 с.607 G>A.

Раскрытие сущности изобретения

Настоящее изобретение представляет собой количественный метод на основе мультиплекс-ПЦР для оценки уровня экспрессии транскриптов GNAO1 дикого типа и с мутацией c.607 G>A (полиморфизм rs587777057) в биологических образцах. Сущность разработанного метода заключается в использовании праймеров и зондов, высокоспецифичных к изоформам G и А транскриптов GNAO1 (ПЦР-набор №1), а также в способе количественной оценки экспрессии транскриптов, основанном на применении ДНК-стандартов и праймеров и зондов к генам “домашнего хозяйства” (ПЦР-набор №2).

ПЦР-набор №1 для детекции транскриптов GNAO1 схематически представлен на Фигуре 1. Универсальная пара прямого (GNAO1_F) и обратного (GNAO1_R) праймеров обеспечивают амплификацию транскриптов GNAO1 независимо от изоформы полиморфизма rs587777057. Для дифференциации транскриптов GNAO1 дикого типа и с мутацией были разработаны зонды GNAO1-G-FAM и GNAO1-A-VIC, строго специфичные к изоформам G и А полиморфизма rs587777057, соответственно. В качестве внутреннего контроля прохождения ПЦР, а также для детекции суммарного уровня транскриптов GNAO1, в наборе используется зонд GNAO1-ROX. Оптимизированные условия мультиплекс-ПЦР гарантируют высокую специфичность (фиг. 2) и эффективность (фиг. 3) работы праймеров и трех зондов в одной реакции и позволяют совместную качественную детекцию здоровых и мутантных транскриптов GNAO1 в биологических образцах (фиг. 4).

Последовательности ПЦP- набора №1:

GNAO1_F 5’-atcagctcaacgactctgcc-3’ (SEQ ID NO: 1)

GNAO1_R 5’-acgtcctcgaagcaatggat-3’ (SEQ ID NO: 2)

GNAO1-ROX 5’-ROX-aaccactggcatcgtagaaaccca-BHQ2-3’ (ROX – SEQ ID NO: 3 – BHQ2)

GNAO1-G- FAM 5’-FAM-cgtcggaggccagc-BHQ1-3’ (FAM – SEQ ID NO: 4 – BHQ1)

GNAO1-A-VIC 5’-VIC-cgtcagaggccagc-BHQ1-3’ (VIC – SEQ ID NO: 5 – BHQ1);

где ROX, VIC, FAM – флуоресцентные метки разного цвета (флуорофоры), а BHQ1 и BHQ2 – гасители флуоресценции.

Оценка эффективной концентрации изоформ транскриптов GNAO1 в исследуемых образцах проводится по калибровочному графику, который строится путем анализа ПЦР-набором №1 серийных разведений ДНК-стандартов с известной концентрацией. В качестве ДНК-стандартов могут выступать любые две плазмидные конструкции известной длины, содержащие кодирующую рамку GNAO1 дикого типа и мутацией c.607 G>A. Известный нуклеотидный размер и концентрация ДНК-стандартов позволяет конвертировать регистрируемый сигнал в образцах в число копий транскриптов изоформы G и А на реакцию или 100 нг тотальной РНК.

Чтобы сравнивать экспрессию GNAO1 в нескольких образцах, полученных из одного типа клеток или тканей, эффективная концентрация изоформ G и А дополнительно нормализуется на относительное количество вносимого в ПЦР-реакцию материала. Для нормализации образцов был разработан ПЦР-набор №2, состоящий из праймеров и зондов, специфичных к транскриптам генов “домашнего хозяйства” GAPDH и EF1A.

Последовательности ПЦP- набора №2:

GAPDH_F 5’-tcggagtcaacggatttggt-3’ (SEQ ID NO: 6)

GAPDH_R 5’-ttcccgttctcagccttgac-3’ (SEQ ID NO: 7)

GAPDH-VIC 5’-VIC-tgattccacccatggcaaattcca-BHQ1-3’ (VIC – SEQ ID NO: 8 – BHQ1)

EF1A_F 5’-aaggatgttcgtcgtggcaa-3’ (SEQ ID NO: 9)

EF1F_R 5’-gccgtgtggcaatccaatac-3’ (SEQ ID NO: 10)

EF1A-ROX 5’-ROX-aaatgacccaccaatggaagcagc-BHQ2-3’ (ROX – SEQ ID NO: 11 – BHQ2);

где ROX, VIC – флуоресцентные метки разного цвета (флуорофоры), а BHQ1 и BHQ2 – гасители флуоресценции.

Описанный метод на основе мультиплекс-ПЦР позволяют проводить как качественный (Фиг. 4), так и количественный (Фиг. 5) анализ экспрессии транскриптов GNAO1 дикого типа и с мутацией с.607 G>A (полиморфизм rs587777057). В качества материала для исследований может выступать биоптат кожи пациента с полиморфизмом rs587777057, пациент-специфические культуры клеток, полученные по технологии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (Фиг. 4 и 5), перевиваемые клеточные линии с транзиентной или стабильной экспрессией GNAO1. Также разработанный метод количественной детекции можно использовать для сравнения уровня экспрессии здорового и мутантного аллелей GNAO1 при различном воздействии. Например, для оценки эффективности препаратов РНК-терапии, направленной на аллель-селективное подавление экспрессии транскриптов GNAO1 с мутацией c.607 G>A.

Краткое описание чертежей

Фигура 1. Иллюстрация технического решения по детекции транскриптов гена GNAO1 дикого типа и с мутацией c.607 G>A, а также суммарного уровня транскриптов GNAO1 (ПЦР набор №1). Схематически показан участок транскрипта GNAO1 (NM_020988.3) с однонуклеотидным полиморфизмом rs587777057. Белые стрелки условно показывают расположение прямого и обратного праймеров для ПЦР, специфичных к последовательности транскрипта GNAO1. Серые стрелки показывают положение зондов для ПЦР, меченых флуорофорами ROX, VIC, FAM для универсальной и селективной детекции транскриптов GNAO1.

Фигура 2. Селективность метода детекции GNAO1 дикого типа и с мутацией с.607 G>A с помощью набора специфических праймеров и зондов для мультиплекс-ПЦР (ПЦР набор №1). В качестве ДНК-стандартов использовались две плазмидные ДНК с известной концентрацией, содержащие кодирующую область GNAO1 дикого типа и с мутацией (pGNAO1 дикий тип и pGNAO1 с.607 G>A, соответственно). В реакцию с ПЦР мастер-миксом #1 вносили серийные, 10-кратные разведения ДНК-стандартов в диапазоне 0,05 нг - 0,5 фг на реакцию. Амплификацию проводили на приборе CFX96 Real-Time PCR Detection System; флуоресцентный сигнал регистрировали в каналах ROX, FAM, VIC. Приведены репрезентативные кривые накопления ПЦР-продукта. В канале ROX детектируется GNAO1 дикого типа и с мутацией. В каналах FAM и VIC строго селективно в выбранном диапазоне концентраций детектируются GNAO1 дикого типа и с мутацией c.607 G>A, соответственно.

Фигура 3. Эффективность мультиплекс-ПЦР для детекции GNAO1 дикого типа и с мутацией с.607 G>A с помощью набора специфических праймеров и зондов. Проводили реакцию в ПЦР мастер-микс #1 и строили стандартную кривую по амплификации сигнала флуоресценции в каналах ROX, FAM, VIC с 10-кратными разведениями ДНК-стандартов (pGNAO1 дикий тип и pGNAO1 с.607 G>A) в диапазоне 0,05 нг - 0,5 фг на реакцию. Эффективность для каждого из зондов (GNAO1-ROX, GNAO1-G-FAM, GNAO1-A-VIC) рассчитывали по стандартной кривой. Показаны репрезентативные стандартные кривые и средние значения эффективности ПЦР-реакций для n=5 независимых экспериментов.

Фигура 4. Качественная детекция транскриптов GNAO1 дикого типа и с мутацией c.607 G>A методом ПЦР-мультиплекс. В качестве материала для исследования использовались нейроны, полученные по технологии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из биоптата кожи здорового донора и пациента с мутацией GNAO1 c.607 G>A. Подготовку образцов проводили согласно стандартной методике, качественный анализ экспрессии проводили c помощью ПЦР мастер-микса #1.

Фигура 5. Количественная оценка уровня экспрессии транскриптов в клетках, экспрессирующих GNAO1 дикого типа и с мутацией c.607 G>A.

В качестве материала для исследования использовались нейрональные клетки, полученные из биоптата кожи здорового донора и пациента с гетерозиготной мутацией GNAO1 c.607 G>A. Подготовку образцов проводили согласно стандартной методике, анализ экспрессии GNAO1 и генов “домашнего хозяйства” c проводили помощью ПЦР мастер-микса #1 и #2 соответственно. Количество копий каждого из вариантов GNAO1 в реакции определяли по стандартной кривой, построенной с помощью серийных разведений ДНК-стандартов. Каждый образец нормализовали на количество вносимого в ПЦР-реакцию материала, определенный с помощью генов “домашнего хозяйства” и стандартной кривой с контрольным образцом. Уровень экспрессии транскриптов GNAO1 дикого типа и с мутацией c.607 G>A в образцах выражена в копиях на 100 нг тотальной РНК.

Осуществление изобретения

Пример 1. Подготовка праймеров, зондов и ДНК-стандартов. Для количественного измерения уровня экспрессии здорового и мутантного транскриптов GNAO1 в биологических образцах использовались специфичные наборы праймеров и зондов для мультиплекс-ПЦР с системой детекции TaqMan, а также плазмидные ДНК-стандарты.

- Для селективной детекции транскриптов GNAO1 был разработан ПЦР набор №1 (Фиг. 1): прямой праймер GNAO1_F (5’-atcagctcaacgactctgcc-3’; SEQ ID NO: 1), обратный праймер GNAO1_R (5’-acgtcctcgaagcaatggat-3’; SEQ ID NO: 2), универсальный зонд GNAO1-ROX (5’-ROX-aaccactggcatcgtagaaaccca-BHQ2-3’; SEQ ID NO: 3) и селективные зонды GNAO1-G-FAM (5’-FAM-cgtcggaggccagc-BHQ1-3’; SEQ ID NO: 4) и GNAO1-A-VIC (5’-VIC-cgtcagaggccagc-BHQ1-3’; SEQ ID NO: 5) для здорового и мутантного транскриптов соответственно. Олигонуклеотиды были синтезированы и очищены компанией ДНК-синтез (Россия). Лиофилизированную ДНК ресуспендировали в стерильной воде для ПЦР до конечной концентрации 100 мкМ и хранили при температуре -20°C.

- Для определения количества копий транскриптов GNAO1 в образце использовались ДНК-стандарты. Для этого были созданы плазмидные конструкции с кодирующей областью гена GNAO1 (CCDS10756.1) дикого типа и мутацией с.607 G>A (pGNAO1 и pGNAO1 с.607 G>A, соответственно). Размер каждой из конструкций составляет 5079 пар нуклеотидов, а один нг плазмиды эквивалентен 1.8×10^8 копиям гена.

- Для нормализации вносимого в ПЦР реакцию материала использовался ПЦР набор №2, состоящий из праймеров и зондов, специфичных к транскриптам генов “домашнего хозяйства” GAPDH и EF1A. Для детекции GAPDH: прямой праймер GAPDH_F (5’-tcggagtcaacggatttggt-3’; SEQ ID NO: 6), обратный праймер GAPDH_R (5’-ttcccgttctcagccttgac-3’; SEQ ID NO: 7), зонд GAPDH-VIC (5’-VIC-tgattccacccatggcaaattcca-BHQ1-3’; SEQ ID NO: 8); для детекции EF1A: прямой праймер EF1A_F (5’-aaggatgttcgtcgtggcaa-3’; SEQ ID NO: 9), обратный праймер EF1F_R (5’-gccgtgtggcaatccaatac-3’; SEQ ID NO: 10), зонд EF1A-ROX (5’-ROX-aaatgacccaccaatggaagcagc-BHQ2-3’; SEQ ID NO: 11).

Пример 2. Подготовка образцов для анализа

В качестве материала для исследования могут быть использованы образцы биоптата кожи пациента с гетерозиготной заменой GNAO1 с.607 G>A и полученные из биоптата клеточные культуры (фибробласты, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, нейрональные предшественники, нейроны разной степени дифференцировки), а также перевиваемые клеточные культуры с транзиентной или стабильной экспрессией мутантного и здорового варианта GNAO1.

- Выделение тотальной РНК проводится с использованием коммерческих наборов для выделения РНК по методике, рекомендуемой производителем с учетом особенностей образца и его количества.

- Концентрация выделенной РНК измеряется спектрофотометрически.

- РНК обрабатывается ДНКазой I c помощью коммерческого набора и протокола, совместимого с последующими стадиями обратной транскрипции и амплификации. Инактивация ДНКазы I проводится согласно рекомендациям производителя.

- Синтез кДНК с РНК-матрицы проводится с использованием коммерческого набора для обратной транскрипции согласно рекомендациям производителя. Реакция проводится в объеме 20 мкл, содержащем 100 нг/мкл РНК, 1 мкМ Олиго(dT)₁₅ праймер (SB001; Евроген), случайный декануклеотидный праймер (SB002; Евроген), смесь dNTP 1 mM каждого (PB006S; Евроген), 2 mM DTT, обратная транскриптаза ММLV, 1 x буфер производителя (SK022L; Евроген), инкубация при 37°С в течение 1 часа. Инактивация 10 мин при 70°С. Образцы кДНК разбавляются в 5 раз стерильным буфером TE (PB026S; Евроген) и хранятся при -20°С до анализа.

Пример 3. Проведение ПЦР в реальном времени

Для количественного измерения уровней экспрессии аллелей GNAO1 в экспериментальных образцах проводится мультиплекс-ПЦР в реальном времени с использованием наборов праймеров и зондов, специфичных к транскриптам GNAO1 и транскриптам генов “домашнего хозяйства”, а также ДНК-стандартов.

- ПЦР мастер-микс #1 состоит из 400 nM праймеров и 200 nM зондов для селективной детекции транскриптов GNAO1 (ПЦР набор №1, описанный в примере 1); 3 mM MgCl2 и однократной реакционной смеси для ПЦР (Synthol, артикул M-428).

- К 20 мкл ПЦР мастер-микса #1 добавляют 5 мкл экспериментального или стандартного образца. В качестве экспериментального образца используют кДНК, полученную в примере 2; вносимое количество образца соответствует примерно 100 нг исходной РНК на реакцию. В качестве стандартного образца используют серийные 10-кратные разведения ДНК-стандартов, описанные в примере 1; вносимое количество образца находится в диапазоне 0,05 нг - 0,5 фг плазмиды на реакцию, что соответствует 9x10^6 - 90 копий GNAO1 на реакцию.

- ПЦР мастер-микс #2 состоит из 400 nM праймеров и 200 nM зондов для детекции транскриптов генов “домашнего хозяйства” GAPDH и EF1A (ПЦР набор №1, описанный в примере 1); 5 mM MgCl2 и однократной реакционной смеси для ПЦР (Synthol, артикул M-428).

- К 20 мкл ПЦР мастер-микса #2 добавляют 5 мкл экспериментального или стандартного образца. В качестве экспериментального образца используют кДНК, полученную в примере 2; вносимое количество образца соответствует примерно 100 нг исходной РНК на реакцию. В качестве стандартного образца используют серийные 5-кратные разведения контрольной кДНК; вносимое количество образца соответствует примерно 0.8, 2, 20 и 100 нг исходной РНК на реакцию.

- Стандартные и экспериментальные образцы анализируются в трех технических повторностях каждый.

- Реакции ПЦР замешиваются в 96-луночных тонкостенных планшетах (SSI-3401-00, SSI) и заклеиваются оптически-прозрачной пленкой UltraFlux® Standard (SSI-3622-00, SSI).

- ПЦР в реальном времени проводили на приборе CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories), используя следующую программу амплификации: денатурация 95°С - 3 мин; далее 40 циклов: 95°С – 20 сек, 60°С – 40 сек, считывание флуоресцентного сигнала. Для ПЦР мастер-микса #1 детекция сигнала проводится в каналах FAM (мишень - GNAO1 дикого типа), VIC (GNAO1 c.607 G>A), ROX (суммарный GNAO1). Для ПЦР мастер-микса #2 детекция сигнала проводится в каналах VIC (мишень - GAPDH), ROX (EF1A).

Пример 4. Специфичность и эффективность метода

Специфичность и эффективность работы набора праймеров и зондов для аллельной детекции GNAO1 в условиях ПЦР мастер-микса #1 и режима амплификации из примера 3 оценивали по ДНК-стандартам (pGNAO1 и pGNAO1 с.607 G>A) из примера 1.

- Специфичность детекции транскриптов GNAO1 c мутацией с.607 G>A и дикого типа зондами GNAO1-A-VIC (5’-VIC-cgtcagaggccagc-BHQ1-3’) и GNAO1-G-FAM (5’-FAM-cgtcggaggccagc-BHQ1-3’) соответственно сохраняется в диапазоне от 90 копий до 9x10^6 копий кодирующей области GNAO1 на реакцию (Фиг. 2).

- Данные порогового цикла (Сq) для серийных разведений ДНК-стандартов использовали для построения калибровочных кривых и определения эффективности мультиплекс-ПЦР для аллельной детекции GNAO1. Для зондов GNAO1-A-VIC (5’-VIC-cgtcagaggccagc-BHQ1-3’), GNAO1-G-FAM (5’-FAM-cgtcggaggccagc-BHQ1-3’) и GNAO1-ROX (5’-ROX-aaccactggcatcgtagaaaccca-BHQ2-3’) составляет 105,4%, 107,6% и 101,2% соответственно (среднее по n=5 независимых экспериментов) (Фиг. 3).

Эффективность работы набора праймеров и зондов для детекции транскриптов генов “домашнего хозяйства” в условиях ПЦР мастер-микса #2 и режима амплификации из примера 3 оценивали с помощью стандартной кДНК, полученной из контрольного образца в примере 2.

- Данные порогового цикла (Сq) для серийных разведений контрольной ДНК использовали для построения калибровочных кривых и определения эффективности реакции. Эффективность мультиплекс-ПЦР для совместной детекции транскриптов GAPDH и EF1A составляет 91±4% и 89±5% (среднее по n=5 независимых экспериментов), соответственно.

Пример 5. Количественный обсчет результатов.

Количественное определение уровня экспрессии аллелей GNAO1 в экспериментальных образцах определяли следующим образом:

- Эффективную концентрацию транскриптов GNAO1 дикого типа, с мутацией и их суммарного уровня в экспериментальных образцах определяли по стандартным кривым из примера 4, построенных для серийных разведений ДНК-стандартов и зондов GNAO1-G- FAM, GNAO1-A-VIC и GNAO1-ROX соответственно.

- Копии транскриптов GNAO1 в разных образцах нормализовали на относительное количество вносимого в ПЦР-реакцию материала, определенное с помощью с праймеров/зондов к генам “домашнего хозяйства” и стандартной кривой для контрольного образца кДНК из примера 4.

- Уровень экспрессии транскриптов GNAO1 в экспериментальных образцах выражали в копиях GNAO1 на 100 нг тотальной РНК (Фиг. 5).

1. Набор праймеров и флуоресцентно-меченых зондов, специфичных к транскриптам GNAO1, предназначенный для селективной детекции в биологическом образце транскриптов GNAO1 дикого типа (или изоформы G полиморфизма rs587777057), клинического варианта GNAO1 с мутацией с.607 G>A (или изоформы А полиморфизма rs587777057), а также транскриптов GNAO1 обеих изоформ (G полиморфизма rs587777057 и A полиморфизма rs587777057),

и состоящий из:

– прямого GNAO1_F и обратного GNAO1_R праймеров, обеспечивающих амплификацию транскриптов GNAO1 независимо от изоформы полиморфизма rs587777057;

– селективных флуоресцентно-меченых зондов GNAO1-G-FAM и GNAO1-A-VIC, строго специфичных к изоформам G и А полиморфизма rs587777057 соответственно;

– универсального флуоресцентно-меченого зонда GNAO1-ROX, используемого для внутреннего контроля прохождения ПЦР и для детекции суммарного уровня транскриптов GNAO1.

2. Набор праймеров и зондов по п.1, содержащий:

– в качестве прямого праймера последовательность 5’-atcagctcaacgactctgcc-3’;

– в качестве обратного праймера последовательность 5’-acgtcctcgaagcaatggat-3’;

– в качестве универсального флуоресцентно-меченого зонда для детекции суммарного уровня транскриптов GNAO1 последовательность 5’-ROX-aaccactggcatcgtagaaaccca-BHQ2-3’;

– в качестве селективного флуоресцентно-меченого зонда, специфичного к изоформе G полиморфизма rs587777057, последовательность 5’-FAM-cgtcggaggccagc-BHQ1-3’;

– в качестве селективного флуоресцентно-меченого зонда, специфичного к изоформе A полиморфизма rs587777057, последовательность 5’-VIC-cgtcagaggccagc-BHQ1-3’.

3. Способ количественного определения уровня экспрессии изоформ транскриптов GNAO1 с полиморфизмом rs587777057 в биологическом образце на основе мультиплекс-ПЦР в реальном времени, включающий следующие стадии:

1) качественная детекция с определением количества копий транскриптов GNAO1 в образце с помощью набора по пп.1, 2 и с помощью ДНК-стандартов в каналах FAM (для GNAO1 дикого типа или изоформы G полиморфизма rs587777057), VIC (для GNAO1 с мутацией c.607 G>A или изоформы А полиморфизма rs587777057) и ROX (для изоформ GNAO1 G полиморфизма rs587777057 и A полиморфизма rs587777057);

2) нормализация копий транскриптов GNAO1 на относительное количество вносимого в ПЦР-реакцию материала с помощью набора праймеров и флуоресцентно-меченых зондов, специфичных к транскриптам генов “домашнего хозяйства” GAPDH и EF1A, при этом набор содержит:

– прямой GAPDH_F и обратный GAPDH_R праймеры, специфичные к транскриптам гена “домашнего хозяйства” GAPDH;

– прямой EF1A_F и обратный EF1F_R праймеры, специфичные к транскриптам гена “домашнего хозяйства” EF1F;

– флуоресцентно-меченый зонд GAPDH-VIC, специфичный к транскриптам гена “домашнего хозяйства” GAPDH;

– флуоресцентно-меченый зонд EF1A-ROX, специфичный к транскриптам гена “домашнего хозяйства” EF1A.

3) Определение уровня экспрессии транскриптов GNAO1 дикого типа и с мутацией c.607 G>A в образцах, выраженных в копиях на 100 нг тотальной РНК.

4. Способ по п.3, в котором набор праймеров и флуоресцентно-меченых зондов, специфичных к транскриптам генов “домашнего хозяйства” GAPDH и EF1A, содержит:

– в качестве прямого праймера, специфичного к транскриптам гена “домашнего хозяйства” GAPDH - GAPDH_F, последовательность 5’-tcggagtcaacggatttggt-3’;

– в качестве обратного праймера, специфичного к транскриптам гена “домашнего хозяйства” GAPDH - GAPDH_R, последовательность 5’-ttcccgttctcagccttgac-3’;

– в качестве прямого праймера, специфичного к транскриптам гена “домашнего хозяйства” EF1F - EF1A_F, последовательность 5’-aaggatgttcgtcgtggcaa-3’;

– в качестве обратного праймера, специфичного к транскриптам гена “домашнего хозяйства” EF1F - EF1F_R, последовательность 5’-gccgtgtggcaatccaatac-3’;

– в качестве флуоресцентно-меченого зонда, специфичного к транскриптам гена “домашнего хозяйства” GAPDH - GAPDH-VIC, последовательность 5’-VIC-tgattccacccatggcaaattcca-BHQ1-3’;

– в качестве флуоресцентно-меченого зонда, специфичного к транскриптам гена “домашнего хозяйства” EF1A - EF1A-ROX, последовательность 5’-ROX-aaatgacccaccaatggaagcagc-BHQ2-3’.