Антитело к pd-l1, его антигенсвязывающий фрагмент и их фармацевтическое применение

Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены: моноклональное антитело к PD-L1, его антигенсвязывающий фрагмент, способ его получения и его фармацевтическое применение, а также молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, рекомбинантный вектор, клетка-хозяин, фармацевтическая композиция для лечения заболеваний, ассоциированных с PD-L1 человека, способ лечения заболеваний, ассоциированных с PD-L1 человека. Изобретение позволяет получить антитело к PD-L1 и его антигенсвязывающий фрагмент, используемые для эффективного лечения заболеваний или нарушений, ассоциированных с PD-L1. 9 н. и 5 з.п. ф-лы, 5 ил., 16 табл., 10 пр.

 

Настоящая заявка на изобретение испрашивает приоритет по 201810023267.0, поданной 10 января 2018 г., содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к антителу к PD-L1 и к его антигенсвязывающему фрагменту. Кроме того, настоящее изобретение также относится к химерному антителу и гуманизированному антителу, содержащему CDR антитела к PD-L1, и настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело к PD-L1 и его антигенсвязывающий фрагмент, и ее применению в качестве средства для диагностики и лекарственного препарата для терапии заболеваний, ассоциированных с PD-L1.

Уровень техники

Утверждения в данном документе только предоставляют информацию об уровне техники, относящуюся к настоящему изобретению, и не обязательно составляют предшествующий уровень техники.

Иммунотерапия опухолей представляет собой активно развивающееся в течение длительного времени направление в области терапии опухолей, в котором Т-клеточная иммунотерапия опухолей является основной. Иммунотерапия опухолей заключается в полноценном использовании и мобилизации Т-клеток-киллеров у пациентов с опухолями для уничтожения опухолей. Это может быть наиболее эффективным и безопасным способом лечения опухолей. В то же время ускользание опухоли от иммунного надзора представляет собой огромное препятствие для иммунотерапии опухолей. Опухолевые клетки способствуют быстрому росту опухолей посредством оказания их собственного подавляющего эффекта на иммунную систему.

Связь между механизмом ускользания опухоли от иммунного надзора и иммунным ответом организма на опухоль является очень сложной. На ранней стадии иммунотерапии опухолей опухолеспецифические Т-клетки-киллеры были биологически активными, но они утрачивали свою киллерную функцию на более поздней стадии роста опухоли. Следовательно, иммунотерапия опухолей заключается в повышении до максимума ответа собственной иммунной системы пациента на опухоль. Основной принцип иммунотерапии опухолей заключается не только в активации исходного ответа иммунной системы организма, но также в поддержании продолжительности и интенсивности ответа иммунной системы.

Существуют две системы сигнальных путей активации Т-клеток в организме человека. В дополнение к обеспечению первого сигнала путем презентации комплексов молекул MHC с антигенными пептидами Т-клеткам с помощью антигенпрезентирующих клеток также требуется ряд костимулирующих молекул для обеспечения второго сигнала в целях осуществления Т-клетками нормального иммунного ответа. Эта система из двух сигнальных путей играет жизненно важную роль в обеспечении баланса иммунной системы организма и точно контролирует инициирование организмом различных иммунных ответов на аутологичный антиген и экзогенные антигены. Отсутствие второго сигнала, обеспечиваемого костимулирующей молекулой, приводит к отсутствию ответа или замедлению специфичного иммунного ответа с участием Т-клеток, что таким образом обуславливает толерантность. Следовательно, второй сигнальный путь играет ключевую регуляторную роль во всем процессе иммунного ответа.

В 1992 г. было обнаружено, что молекула 1 запрограммированной гибели клеток (PD-1) представляет собой белковый рецептор, экспрессируемый на поверхности Т-клеток, который принимает участие в апоптозе клеток. PD-1 принадлежит к семейству CD28 и характеризуется 23% гомологией аминокислот с антигеном 4 цитотоксических T-лимфоцитов (CTLA-4), но его экспрессия, в отличие от CTLA, происходит главным образом на активированных Т-клетках, В-клетках и миелоидных клетках. Существуют два лиганда PD-1 - PD-L1 и PD-L2 соответственно. PD-L1 экспрессируется главным образом на T-клетках, B-клетках, макрофагах и дендритных клетках (DC), и его экспрессия на активированных клетках может быть повышена. Экспрессия PD-L2 является относительно ограниченной и происходит главным образом на антигенпрезентирующих клетках, таких как активированные макрофаги и дендритные клетки.

PD-L1 ингибирует иммунную систему посредством связывания с PD-1 и B7-1. PD-L1 экспрессируется во многих опухолевых клетках и иммунных клетках в микроокружении опухолевой ткани. В ходе новых исследований было обнаружено, что высокая экспрессия белка PD-L1 была выявлена в опухолевых тканях человека, как, например, при раке молочной железы, раке легкого, карциноме желудка, раке кишечника, раке почки, меланоме, немелкоклеточном раке легкого, раке ободочной кишки, раке мочевого пузыря, раке яичника, раке поджелудочной железы и раке печени, и уровень экспрессии PD-L1 тесно связан с клинической ситуацией и прогнозом у пациентов.

Поскольку PD-L1 играет роль в ингибировании пролиферации Т-клеток во втором сигнальном пути, блокирование связывания PD-L1/PD-1 стало многообещающей новой целью иммунотерапии опухолей.

В настоящее время множество международных фармацевтических компаний разрабатывают моноклональные антитела к PD-L1. Посредством блокирования связывания PD-L1/PD-1 можно повысить до максимума ответ собственной иммунной системы пациента на опухоли, за счет чего обеспечивается достижение цели уничтожения опухолевых клеток. Ниже приведены соответствующие патенты: WO0139722, WO2013173223, WO2014195852, WO2013181634, WO2015048520, WO2015036511, US2014335093, WO2014100079, WO2014055897, US6803192B1, WO2014022758, US8617546B2 и WO2010089411A2.

Содержание настоящего изобретения

В настоящем изобретении представлено моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент (также называемые молекулой, связывающей PD-L1 человека), которые связываются с аминокислотной последовательностью или трехмерной структурой внеклеточной области PD-L1.

В некоторых альтернативных вариантах осуществления в настоящем изобретении представлено моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с PD-L1 человека, которые содержат:

(i) вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 10, 12 и 13 соответственно; и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 14, 15 и 16 соответственно; где X₁ представляет собой F или M, X₂ представляет собой R или V, и X₃ представляет собой N или H в HCDR2 под SEQ ID NO: 12; или

(ii) вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 11, 12 и 13 соответственно; и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 14, 15 и 16 соответственно; где X₁ представляет собой F или M, X₂ представляет собой R или V, и X₃ представляет собой N или H в HCDR2 под SEQ ID NO: 12; или

(iii) вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 20, 21 и 22 соответственно; и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 23, 24 и 25 соответственно; где HCDR1, HCDR2, HCDR3 и LCDR1, LCDR2, LCDR3 соответственно не представляют собой SEQ ID NO: 30, 38, 22, 23, 40 и 25 одновременно,

где X₄ представляет собой S или D, X₅ представляет собой Y или K, X₆ представляет собой H или M, X₇ представляет собой T, S, H или G, X₈ представляет собой S, N или G, X₉ представляет собой S, L или G, X₁₀ представляет собой F, L, W или M, и X₁₁ представляет собой A, P или T, X₁₂ представляет собой M, V, L или S, X₁₃ представляет собой F или Y в SEQ ID NO: 20 и 21, и X₁₄ представляет собой V или A, X₁₅ представляет собой Y или N, X₁₆ представляет собой A, L или V, и X₁₇ представляет собой E, F, Y или A в LCDR2 под SEQ ID NO: 24.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с PD-L1 человека, определенные выше, содержат вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10, HCDR2, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 28 или 29, и HCDR3, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13, вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 14, 15 и 16 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с PD-L1 человека, определенные выше, содержат вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11, HCDR2, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 28 или 29, и HCDR3, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13, вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 14, 15 и 16 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с PD-L1 человека, определенные выше, содержат вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 30, HCDR2, имеющую аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 32-37, и HCDR3, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 22, вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 23, LCDR2, имеющую аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 39, 40, 41, 67 и 69, и LCDR3, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 25.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с PD-L1 человека, определенные выше, содержат вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 31, HCDR2, имеющую аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 32, 33, 34, 35, 36 и 37, и HCDR3, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 22, вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 23, LCDR2, имеющую аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 39, 40, 41, 67 и 69, и LCDR3, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 25.

В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, определенных выше, содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 13 соответственно; их вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 14-16 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, определенных выше, содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 13 соответственно; их вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 14-16 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, определенных выше, содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 13 соответственно; их вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 14-16 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, определенных выше, содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 22 соответственно; их вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 25 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, определенных выше, содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 22 соответственно; их вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 25 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, определенных выше, содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 22 соответственно; их вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 25 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, определенных выше, содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 22 соответственно; их вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 25 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, определенных выше, содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 22 соответственно; их вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 25 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, определенных выше, содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 22 соответственно; их вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 67 и SEQ ID NO: 25 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, определенных выше, содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 22 соответственно; их вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 69 и SEQ ID NO: 25 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, определенных выше, содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 22 соответственно; их вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 25 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, определенных выше, содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 22 соответственно; их вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 25 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, определенных выше, содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 22 соответственно; их вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 25 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, определенных выше, содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 22 соответственно; их вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 25 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления величина KD, характеризующая аффинность моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, определенных выше, к PD-L1 человека, составляет менее 10^-9M или 10^-10M.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, определенные выше, характеризуются перекрестным связыванием с PD-L1 макака-крабоеда или макака-резуса и/или PD-L1 мыши.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, определенные выше, содержат вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, определенные выше, содержат вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, определенные выше, содержат вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 26, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 27.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, определенные выше, содержат вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 42, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 45.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, определенные выше, содержат вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 43, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 45.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, определенные выше, содержат вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 44, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 45.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, определенные выше, содержат вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 46, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 55, 56 и 57.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 47, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 55, 56 и 57.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, определенные выше, содержат вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 48, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 55, 56 и 57.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, определенные выше, содержат вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 49, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 55, 56 и 57.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 50, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 55, 56 и 57.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, определенные выше, содержат вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 51, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 55, 56 и 57.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, определенные выше, содержат вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 52, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 55, 56 и 57.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, определенные выше, содержат вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 53, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 55, 56 и 57.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, определенные выше, содержат вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 54, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 55 и 57.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, определенные выше, содержат вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 46, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 55, 56, 57, 70 и 72.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, определенные выше, содержат вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 47, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 55, 56, 57, 70 и 72.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, определенные выше, содержат вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 48, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 55, 56, 57, 70 и 72.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, определенные выше, содержат вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 49, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 55, 56, 57, 70 и 72.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, определенные выше, содержат вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 50, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 55, 56, 57, 70 и 72.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, определенные выше, содержат вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 51, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 55, 56, 57, 70 и 72.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, определенные выше, содержат вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 52, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 55, 56, 57, 70 и 72.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, определенные выше, содержат вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 53, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 55, 56, 57, 70 и 72.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, определенные выше, содержат вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 66, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 55, 56, 57, 70 и 72.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, определенные выше, содержат вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 54, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 55, 57, 70 и 72.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, определенное выше, представляет собой полноразмерное антитело, дополнительно содержащее константные области антитела человека; при этом предпочтительно константная область тяжелой цепи из константных областей антитела человека выбрана из константных областей IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 человека и их традиционных вариантов, и константная область легкой цепи из константных областей антитела человека выбрана из константных областей κ- и λ-цепей антитела человека и их традиционных вариантов; предпочтительно содержащее константную область тяжелой цепи антитела человека, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 58, 60 или 65, и константную область легкой цепи человека, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 59.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, определенное выше, представляет собой полноразмерное антитело, дополнительно содержащее константные области антитела человека, которое содержит константную область тяжелой цепи антитела человека под SEQ ID NO: 58 и константную область легкой цепи человека под SEQ ID NO: 59.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, определенное выше, представляет собой полноразмерное антитело, дополнительно содержащее константные области антитела человека, которое содержит константную область тяжелой цепи антитела человека под SEQ ID NO: 60 и константную область легкой цепи человека под SEQ ID NO: 59.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, определенное выше, представляет собой полноразмерное антитело, дополнительно содержащее константные области антитела человека, которое содержит константную область тяжелой цепи антитела человека под SEQ ID NO: 65 и константную область легкой цепи человека под SEQ ID NO: 59.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab')₂, одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv), димеризованного домена V (диатела), Fv, стабилизированного дисульфидными связями (dsFv), и пептидов, содержащих CDR.

В другом аспекте в настоящем изобретении представлена фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, определенных выше, и один или более из фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или наполнителей; терапевтически эффективное количество моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента предпочтительно представляет собой однократную дозу 0,1-3000 мг/кг моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, определенных выше.

В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, определенные выше.

В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлен рекомбинантный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, определенную выше.

В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлена клетка-хозяин, трансформированная с помощью рекомбинантного вектора, определенного выше, где клетка-хозяин выбрана из прокариотической клетки и эукариотической клетки, предпочтительно эукариотической клетки, более предпочтительно клетки млекопитающего.

В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлен способ получения моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, определенных выше, где способ включает культивирование клетки-хозяина, определенной выше, в среде с получением и накоплением моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, определенных выше, и сбор моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из культуры.

В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлен способ иммунодетекции или определения PD-L1 человека, где способ включает применение моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, определенных выше.

В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлено применение моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, определенных выше, при получении средства для диагностики заболевания, связанного с PD-L1 человека.

В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлен способ лечения заболеваний, ассоциированных с PD-L1 человека, где способ включает введение субъекту фармацевтически эффективного количества моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, определенных выше, или предусматриваемой фармацевтической композиции, определенной выше, или молекулы нуклеиновой кислоты, определенной выше, для лечения заболеваний, ассоциированных с PD-L1 человека, где заболевание предпочтительно представляет собой опухоль или рак; более предпочтительно плоскоклеточную карциному, миелому, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), плоскоклеточную карциному головы и шеи (HNSCC), глиому, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому (DLBCL), фолликулярную лимфому, острый лимфобластный лейкоз (ALL), острый миелоидный лейкоз (AML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), хронический миелоидный лейкоз (CML), первичную медиастинальную крупноклеточную В-клеточную лимфому, лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (SLL), крупноклеточную B-клеточную лимфому, богатую Т-клетками/гистиоцитами, множественную миелому, заболевание, ассоциированное с белком 1 миелоидноклеточного лейкоза (Mcl-1), миелодиспластический синдром (MDS), рак желудочно-кишечного тракта, почечный рак, рак яичника, рак печени, лимфобластный лейкоз, лимфоцитарный лейкоз, колоректальный рак, рак эндометрия, рак почки, рак предстательной железы, рак щитовидной железы, меланому, хондросаркому, нейробластому, рак поджелудочной железы, мультиформную глиобластому, карциному желудка, рак костей, саркому Юинга, рак шейки матки, рак головного мозга, карциному желудка, рак мочевого пузыря, гепатоцеллюлярную карциному, рак молочной железы, рак ободочной кишки, гепатоцеллюлярную карциному (HCC), светлоклеточную почечноклеточную карциному (RCC), рак головы и шеи, рак гортани, рак печени и желчевыводящих путей, рак центральной нервной системы, рак пищевода, злокачественную мезотелиому плевры, системный амилоидоз легких цепей, лимфоплазмоцитарную лимфому, миелодиспластический синдром, миелопролиферативную опухоль, нейроэндокринное новообразование, карциному из клеток Меркеля, рак яичка и рак кожи; наиболее предпочтительно карциному, миелому, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), плоскоклеточную карциному головы и шеи (HNSCC), глиому, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому (DLBCL), фолликулярную лимфому, острый лимфобластный лейкоз (ALL), острый миелоидный лейкоз (AML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), хронический миелоидный лейкоз (CML), первичную медиастинальную крупноклеточную В-клеточную лимфому, лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (SLL), крупноклеточную B-клеточную лимфому, богатую Т-клетками/гистиоцитами, множественную миелому, заболевание, ассоциированное с белком 1 миелоидноклеточного лейкоза (Mcl-1), миелодиспластический синдром (MDS), рак желудочно-кишечного тракта, почечный рак, рак яичника, рак печени, лимфобластный лейкоз, лимфоцитарный лейкоз, колоректальный рак, рак эндометрия, рак почки, рак предстательной железы, рак щитовидной железы, меланому, хондросаркому, нейробластому, рак поджелудочной железы, мультиформную глиобластому, карциному желудка, рак костей, саркому Юинга, рак шейки матки, рак головного мозга, карциному желудка, рак мочевого пузыря, гепатоцеллюлярную карциному, рак молочной железы, рак ободочной кишки, гепатоцеллюлярную карциному (HCC), светлоклеточную почечноклеточную карциному (RCC), рак головы и шеи, рак гортани, рак печени и желчевыводящих путей, рак центральной нервной системы, рак пищевода, злокачественную мезотелиому плевры, системный амилоидоз легких цепей, лимфоплазмоцитарную лимфому, миелодиспластический синдром, миелопролиферативную опухоль, нейроэндокринное новообразование, карциному из клеток Меркеля, рак яичка и рак кожи из PD-L1-положительных клеток.

В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлено применение моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, определенных выше, или предусматриваемой фармацевтической композиции, определенной выше, или предусматриваемой молекулы нуклеиновой кислоты, определенной выше, при получении средства для терапии заболевания, ассоциированного с PD-L1 человека, где заболевание предпочтительно представляет собой опухоль или рак; более предпочтительно плоскоклеточную карциному, миелому, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), плоскоклеточную карциному головы и шеи (HNSCC), глиому, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому (DLBCL), фолликулярную лимфому, острый лимфобластный лейкоз (ALL), острый миелоидный лейкоз (AML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), хронический миелоидный лейкоз (CML), первичную медиастинальную крупноклеточную В-клеточную лимфому, лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (SLL), крупноклеточную B-клеточную лимфому, богатую Т-клетками/гистиоцитами, множественную миелому, заболевание, ассоциированное с белком 1 миелоидноклеточного лейкоза (Mcl-1), миелодиспластический синдром (MDS), рак желудочно-кишечного тракта, почечный рак, рак яичника, рак печени, лимфобластный лейкоз, лимфоцитарный лейкоз, колоректальный рак, рак эндометрия, рак почки, рак предстательной железы, рак щитовидной железы, меланому, хондросаркому, нейробластому, рак поджелудочной железы, мультиформную глиобластому, карциному желудка, рак костей, саркому Юинга, рак шейки матки, рак головного мозга, карциному желудка, рак мочевого пузыря, гепатоцеллюлярную карциному, рак молочной железы, рак ободочной кишки, гепатоцеллюлярную карциному (HCC), светлоклеточную почечноклеточную карциному (RCC), рак головы и шеи, рак гортани, рак печени и желчевыводящих путей, рак центральной нервной системы, рак пищевода, злокачественную мезотелиому плевры, системный амилоидоз легких цепей, лимфоплазмоцитарную лимфому, миелодиспластический синдром, миелопролиферативную опухоль, нейроэндокринное новообразование, карциному из клеток Меркеля, рак яичка и рак кожи; наиболее предпочтительно карциному, миелому, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), плоскоклеточную карциному головы и шеи (HNSCC), глиому, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому (DLBCL), фолликулярную лимфому, острый лимфобластный лейкоз (ALL), острый миелоидный лейкоз (AML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), хронический миелоидный лейкоз (CML), первичную медиастинальную крупноклеточную В-клеточную лимфому, лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (SLL), крупноклеточную B-клеточную лимфому, богатую Т-клетками/гистиоцитами, множественную миелому, заболевание, ассоциированное с белком 1 миелоидноклеточного лейкоза (Mcl-1), миелодиспластический синдром (MDS), рак желудочно-кишечного тракта, почечный рак, рак яичника, рак печени, лимфобластный лейкоз, лимфоцитарный лейкоз, колоректальный рак, рак эндометрия, рак почки, рак предстательной железы, рак щитовидной железы, меланому, хондросаркому, нейробластому, рак поджелудочной железы, мультиформную глиобластому, карциному желудка, рак костей, саркому Юинга, рак шейки матки, рак головного мозга, карциному желудка, рак мочевого пузыря, гепатоцеллюлярную карциному, рак молочной железы, рак ободочной кишки, гепатоцеллюлярную карциному (HCC), светлоклеточную почечноклеточную карциному (RCC), рак головы и шеи, рак гортани, рак печени и желчевыводящих путей, рак центральной нервной системы, рак пищевода, злокачественную мезотелиому плевры, системный амилоидоз легких цепей, лимфоплазмоцитарную лимфому, миелодиспластический синдром, миелопролиферативную опухоль, нейроэндокринное новообразование, карциному из клеток Меркеля, рак яичка и рак кожи из PD-L1-положительных клеток.

Лекарственный препарат на основе моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, определенных выше, или содержащий фармацевтическую композицию, определенную выше, или молекулу нуклеиновой кислоты, определенную выше.

Лекарственный препарат на основе моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, определенных выше, или содержащий фармацевтическую композицию, определенную выше, или молекулу нуклеиновой кислоты, определенную выше, где лекарственный препарат применяется для лечения PD-L1-положительной опухоли или рака; при этом рак предпочтительно выбран из плоскоклеточной карциномы, миеломы, мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого (NSCLC), плоскоклеточной карциномы головы и шеи (HNSCC), глиомы, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы (DLBCL), фолликулярной лимфомы, острого лимфобластного лейкоза (ALL), острого миелоидного лейкоза (AML), хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), хронического миелоидного лейкоза (CML), первичной медиастинальной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, лимфомы из клеток мантийной зоны (MCL), мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы (SLL), крупноклеточной B-клеточной лимфомы, богатой T-клетками/гистиоцитами, множественной миеломы, заболевания, ассоциированного с белком 1 миелоидноклеточного лейкоза (Mcl-1), миелодиспластического синдрома (MDS), рака желудочно-кишечного тракта, почечного рака, рака яичника, рака печени, лимфобластного лейкоза, лимфоцитарного лейкоза, колоректального рака, рака эндометрия, рака почки, рака предстательной железы, рака щитовидной железы, меланомы, хондросаркомы, нейробластомы, рака поджелудочной железы, мультиформной глиобластомы, карциномы желудка, рака костей, саркомы Юинга, рака шейки матки, рака головного мозга, карциномы желудка, рака мочевого пузыря, гепатоцеллюлярной карциномы, рака молочной железы, рака ободочной кишки, гепатоцеллюлярной карциномы (HCC), светлоклеточной почечноклеточной карциномы (RCC), рака головы и шеи, рака гортани, рака печени и желчевыводящих путей, рака центральной нервной системы, рака пищевода, злокачественной мезотелиомы плевры, системного амилоидоза легких цепей, лимфоплазмоцитарной лимфомы, миелодиспластического синдрома, миелопролиферативной опухоли, нейроэндокринного новообразования, карциномы из клеток Меркеля, рака яичка и рака кожи.

Краткое описание графических материалов

Фигура 1. Антитело к PD-L1 способствует секреции IFNγ клетками в анализах активации T-лимфоцитов из PBMC.

Фигура 2. Сравнение эффекта ADCC у форм IgG1 и IgG4 различных антител к PD-L1. Фигура 2A представляет собой сравнение форм IgG1 и IgG4 HRP00049, фигура 2B представляет собой сравнение форм IgG1 и IgG4 H5L11, фигура 2C представляет собой сравнение форм IgG1 и IgG4 HRP00052, фигура 2D представляет собой сравнение форм IgG1 и IgG4 H6L11, и фигура 2E представляет собой сравнение форм IgG1 и IgG4 H18L61, фигура 2F представляет собой сравнение форм IgG1 и IgG4 H12L64.

Фигура 3. Эффект антитела к PD-L1 в отношении объема опухоли в ксенотрансплантатной мышиной модели A375.

Фигура 4. Эффект антитела к PD-L1 в отношении объема опухоли в мышиной модели рака ободочной кишки.

Фигура 5. Эффект антитела к PD-L1 в отношении объема опухоли в ксенотрансплантатной мышиной модели.

Подробное описание предпочтительного варианта осуществления

I. Терминология

С целью лучшего понимания настоящего изобретения некоторые технические и научные термины конкретно определены ниже. Если в данном документе не указано иное, все другие технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют значение, которое обычно понятно специалистам в области техники, к которой относится настоящее изобретение.

Трехбуквенные коды и однобуквенные коды аминокислот, используемые в настоящем изобретении, описаны в J. Biol. Chem, 243, p3558(1968).

«Антитело», описанное в настоящем изобретении, относится к иммуноглобулину, который представляет собой структуру тетрапептидной цепи, образованную путем соединения двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей посредством межцепочечных дисульфидных связей. Аминокислотный состав и порядок расположения константной области тяжелой цепи иммуноглобулина различны, поэтому их антигенность также различна. В соответствии с этим иммуноглобулины можно подразделить на пять категорий, называемых изотипами иммуноглобулинов, а именно IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, и соответствующие тяжелые цепи представляют собой μ-, δ-, γ-, α- и ε-цепи соответственно. Один и тот же класс Ig можно подразделить на различные подклассы в соответствии с различиями в аминокислотном составе шарнирной области, а также в количестве и положении дисульфидных связей в тяжелой цепи. Например, IgG можно подразделить на IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Легкую цепь подразделяют на каппа-цепь или лямбда-цепь в соответствии с различиями в константных областях. Каждый из пяти типов Ig может иметь каппа-цепь или лямбда-цепь.

В настоящем изобретении легкая цепь антитела, описанная в настоящем изобретении, может дополнительно содержать константную область легкой цепи, предусматривающую κ-, λ-цепь человека или мыши или ее варианты.

В настоящем изобретении тяжелая цепь антитела, описанная в настоящем изобретении, может дополнительно содержать константную область тяжелой цепи, предусматривающую IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 человека или мыши или их варианты.

Последовательность из приблизительно 110 аминокислот вблизи N-конца тяжелой и легкой цепей антитела значительно варьируется и поэтому называется вариабельной областью (Fv-областью); остальные аминокислотные последовательности вблизи С-конца относительно стабильны и поэтому называются константной областью. Вариабельная область содержит три гипервариабельные области (HVR) и четыре относительно консервативные каркасные области (FR). Три гипервариабельные области определяют специфичность антитела и также известны как области, определяющие комплементарность (CDR). Каждая вариабельная область легкой цепи (LCVR) и вариабельная область тяжелой цепи (HCVR) состоит из трех CDR-областей и четырех FR-областей, которые последовательно расположены от амино-конца к карбокси-концу: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Три CDR-области легкой цепи называются LCDR1, LCDR2 и LCDR3; три CDR-области тяжелой цепи называются HCDR1, HCDR2 и HCDR3. Количество и положение аминокислотных остатков CDR в LCVR и HCVR антитела или антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем изобретении, соответствует известным правилам нумерации Kabat (LCDR1-3, HCDR1-3).

Антитела по настоящему изобретению включают антитела мыши, химерные антитела, гуманизированные антитела, предпочтительно гуманизированные антитела.

«Моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции по сути однородных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, являются одними и теми же и/или связываются с одним и тем же эпитопом, за исключением возможных вариантов антител (например, содержащих встречающиеся в природе мутации или мутации, образовавшиеся в ходе изготовления препаратов моноклональных антител, и эти варианты обычно представлены в небольших количествах). В отличие от препаратов поликлональных антител, которые, как правило, содержат разные антитела, нацеливающиеся на разные детерминанты (эпитопы), каждое моноклональное антитело препарата (состава) моноклональных антител нацелено на одну детерминанту на антигене. Таким образом, модификатор «моноклональный» указывает на свойства антитела, которое получено из популяции по сути однородных антител, и не должен истолковываться как требующий изготовления антитела с помощью какого-либо конкретного способа. Например, моноклональное антитело по настоящему изобретению может быть получено с помощью различных методик, включающих без ограничения гибридомный способ, способ рекомбинантных ДНК, способ фагового дисплея и способ с использованием трансгенных животных, содержащих все локусы генов иммуноглобулинов человека или их часть, при этом такие способы, а также другие иллюстративные способы получения моноклональных антител, описаны в данном документе.

Термин «антитело мыши» в настоящем изобретении означает моноклональное антитело к PD-L1 человека, полученное в соответствии со знаниями и квалификацией в данной области техники. Тестируемым субъектам инъецируют антиген PD-L1 в ходе получения, и выделяют гибридомы, экспрессирующие антитела с желаемой последовательностью или функциональными характеристиками. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антитело к PD-L1 мыши или его антигенсвязывающий фрагмент могут дополнительно содержать константную область легкой цепи, предусматривающую κ-, λ-цепь мыши или ее варианты, или дополнительно содержать константную область тяжелой цепи IgG1, IgG2, IgG3 мыши или ее варианты.

Термин «химерное антитело» означает антитело, полученное путем слияния вариабельной области антитела мыши с константной областью антитела человека, что может ослаблять иммунный ответ, инициируемый антителом мыши. Чтобы сконструировать химерное антитело, вначале создают гибридому, которая секретирует специфическое моноклональное антитело мыши, затем клонируют ген вариабельной области из клеток гибридомы мыши, а затем клонируют ген константной области антитела человека в соответствии с требованиями. Ген вариабельной области мыши связывают с геном константной области человека с образованием химерного гена для последующей вставки в вектор экспрессии. Наконец, молекула химерного антитела экспрессируется в эукариотической системе или прокариотической системе. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения легкая цепь антитела в химерном антителе к PD-L1 дополнительно содержит константную область легкой цепи, предусматривающую κ-, λ-цепь человека или ее вариант. Тяжелая цепь антитела в химерном антителе к PD-L1 дополнительно содержит константную область тяжелой цепи IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 человека или ее вариант, предпочтительно константную область тяжелой цепи IgG1, IgG2 или IgG4 человека или вариант IgG1, IgG2 или IgG4 с мутацией аминокислоты (например, мутацией YTE или обратной мутацией).

Термин «гуманизированное антитело», которое также называется антителом с пересаженными CDR, относится к антителу, полученному посредством пересадки последовательности CDR мыши на каркасную область вариабельной области антитела человека, то есть антителу, полученному из различных типов последовательностей каркасной области антитела человека зародышевого типа. Оно может предотвращать неоднородный ответ, инициируемый химерным антителом, которое несет большое количество белковых компонентов мыши. Такие последовательности каркасной области можно получить из общедоступной базы данных ДНК, содержащей последовательности генов антител зародышевого типа, или опубликованных литературных источников. Например, последовательности ДНК зародышевого типа для генов вариабельной области тяжелой и легкой цепи человека можно получить из базы данных последовательностей генов зародышевого типа человека «VBase» (доступной на веб-сайте www.mrccpe.com.ac.uk/vbase), а также из Kabat, EA, etc., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition. Чтобы избежать снижения активности, вызванного снижением иммуногенности, последовательность каркасной области вариабельной области антитела человека можно подвергнуть минимальной реверсивной мутации или обратной мутации с целью сохранения активности. Гуманизированные антитела по настоящему изобретению также включают гуманизированные антитела с CDR, подвергнутыми созреванию аффинности с помощью фагового дисплея. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения разрабатывают и выбирают каркасную область вариабельной области антитела человека, где последовательность FR тяжелой цепи в вариабельной области тяжелой цепи антитела получают из объединенной последовательности тяжелой цепи зародышевого типа человека IGHV3-23*04 и hJH4.1 и объединенной последовательности легкой цепи зародышевого типа человека IGKV1-12*01 и hJK4.1. Чтобы избежать снижения активности, вызванного снижением иммуногенности, вариабельную область антитела человека можно подвергнуть минимальной реверсивной мутации (обратной мутации, т.е., аминокислотные остатки в FR из антитела человека подвергают мутации по типу замены на аминокислотные остатки в соответствующем положении исходного антитела) с целью сохранения активности.

Пересадка CDR может привести к снижению аффинности полученного антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего фрагмента к антигену вследствие контакта остатков каркасной области с антигеном. Такие взаимодействия могут быть обусловлены высокой частотой мутаций в соматических клетках. Следовательно, по-прежнему может быть необходимой пересадка таких аминокислот из донорной каркасной области на каркасную область гуманизированного антитела. Аминокислотные остатки, участвующие в связывании антигена, из антитела к PD-L1, отличного от человеческого, или его антигенсвязывающего фрагмента могут быть идентифицированы путем изучения последовательности и структуры вариабельной области моноклонального антитела мыши. Остатки в каркасной области, являющейся донором CDR, которые отличаются от зародышевого типа, могут считаться родственными. Если ближайший зародышевый тип не может быть определен, последовательность можно сравнить с консенсусной последовательностью для подкласса или с консенсусной последовательностью для последовательности мыши с высокой процентной долей сходства. Считается, что редкие остатки каркасной области обусловлены высокой частотой мутаций в соматических клетках, что, таким образом, играет важную роль в связывании.

Термин «антигенсвязывающий фрагмент» или «функциональный фрагмент» антитела относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфично связывать антиген (например, PD-L1). Было показано, что фрагменты полноразмерного антитела можно использовать для осуществления антигенсвязывающей функции антитела. Примеры связывающих фрагментов, на которые указывает термин «антигенсвязывающий фрагмент» антитела, включают (i) Fab-фрагмент, т.е. одновалентный фрагмент, состоящий из VL-, VH-, CL- и CH1-доменов; (ii) F(ab')₂-фрагмент - двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, соединенных дисульфидным(дисульфидными) мостиком(мостиками) в шарнирной области, (iii) Fd-фрагмент, состоящий из VH- и CH1-доменов; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из VH-домена и VL-домена одного плеча антитела; (v) отдельный домен или dAb-фрагмент (Ward et al. (1989) Nature 341: 544-546), который состоит из VH-домена; и (vi) выделенную область, определяющую комплиментарность (CDR), или (vii) необязательно комбинацию двух или более отдельных CDR, соединенных посредством синтетического линкера. Кроме того, хотя два домена VL и VH Fv-фрагмента кодируются отдельными генами, эти гены могут быть объединены с помощью синтетического линкера с применением рекомбинантных способов, за счет чего обеспечивается получение единой белковой цепи, которая представляет собой одновалентную молекулу, образованную путем спаривания VL- и VH-областей (называемую одноцепочечным Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 5879-5883). Такие scFv также предполагаются как включенные в термин «антигенсвязывающий фрагмент» антитела. Такие фрагменты антител получают с помощью традиционных методик, известных специалистам в данной области, и подвергают скринингу в отношении их функциональных свойств таким же образом, как и интактные антитела. Антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены с помощью технологии рекомбинантных ДНК или с помощью ферментативного или химического расщепления интактных иммуноглобулинов. Антитела могут представлять собой антитела различных изотипов, например, антитела IgG (например, подтипов IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM.

Антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению включают Fab, F(ab')2, Fab', одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), димеризованный домен V (диатело), Fv, стабилизированный дисульфидными связями (dsFv), пептиды, содержащие CDR, и т.д.

Fab представляет собой фрагмент антитела, имеющий молекулярную массу, составляющую приблизительно 50000, полученный посредством обработки молекулы антитела IgG протеазой, такой как папаин (расщепляет по аминокислотному остатку в положении 224 H-цепи), который обладает антигенсвязывающей активностью фрагментов, где приблизительно половина N-концевой части H-цепи и вся L-цепь соединены друг с другом посредством дисульфидных связей.

Fab по настоящему изобретению может быть получен посредством обработки папаином моноклонального антитела по настоящему изобретению, которое специфично распознает аминокислотную последовательность внеклеточной области PD-L1 человека или ее трехмерную структуру и связывается с ней. Кроме того, Fab может быть получен посредством вставки ДНК, кодирующей Fab антитела, в вектор экспрессии у прокариот или вектор экспрессии у эукариот и введения вектора путем трансформации в прокариота или эукариота для экспрессии Fab.

F(ab')2 представляет собой фрагмент антитела, имеющий молекулярную массу, составляющую приблизительно 100000, полученный посредством расщепления нижних частей двух дисульфидных связей в шарнирной области IgG ферментом пепcином, который обладает антигенсвязывающей активностью и в котором две Fab-области соединены в положениях в шарнирной области.

F(ab')2 по настоящему изобретению может быть получен посредством обработки пепсином моноклонального антитела по настоящему изобретению, которое специфично распознает аминокислотную последовательность внеклеточной области PD-L1 человека или ее трехмерную структуру и связывается с ней. Кроме того, F(ab')2 может быть получен путем соединения Fab', описанных ниже, тиоэфирной(тиоэфирными) связью(связями) или дисульфидной(дисульфидными) связью (связями).

Fab' представляет собой фрагмент антитела, имеющий молекулярную массу, составляющую приблизительно 50000, полученный путем расщепления дисульфидной связи в шарнирной области F(ab')2, описанного выше, который обладает антигенсвязывающей активностью. Fab' по настоящему изобретению может быть получен посредством обработки восстановителем, таким как дитиотреитол, F(ab')2 по настоящему изобретению, который специфично распознает аминокислотную последовательность внеклеточной области PD-L1 или ее трехмерную структуру и связывается с ней.

Кроме того, Fab' может быть получен посредством вставки ДНК, кодирующей Fab'-фрагмент антитела, в вектор экспрессии у прокариот или вектор экспрессии у эукариот и введения вектора путем трансформации в прокариота или эукариота для экспрессии Fab'.

Термин «одноцепочечный вариабельный фрагмент», «одноцепочечный Fv» или «scFv» относится к молекуле, содержащей вариабельный домен тяжелой цепи антитела (или область; VH) и вариабельный домен легкой цепи антитела (или область; VL), конъюгированные с помощью линкера. Такие молекулы scFv могут иметь общую структуру NH₂-VL-линкер-VH-COOH или NH₂-VH-линкер-VL-COOH. Подходящие линкеры из предшествующего уровня техники состоят из повторяющихся аминокислотных последовательностей GGGGS или их вариантов, например, с использованием 1-4 повторяющихся вариантов (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:6444-6448). Другие линкеры, которые могут использоваться в настоящем изобретении, описаны в Alfthan et al. (1995), Protein Eng.8:725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immuno l.31:94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res.56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 и Roovers et al. (2001), Cancer Immunol.

scFv по настоящему изобретению может быть получен с использованием следующих этапов: получения кДНК, кодирующей VH и VL моноклонального антитела по настоящему изобретению, которое специфично распознает аминокислотную последовательность внеклеточной области PD-L1 человека или ее трехмерную структуру и связывается с ней, и конструирования ДНК, кодирующей scFv, вставки ДНК в вектор экспрессии у прокариот или эукариот и затем введения вектора экспрессии путем трансформации в прокариота или эукариота для экспрессии scFv.

Диатело представляет собой фрагмент антитела, в котором scFv димеризован и обладает двухвалентной антигенсвязывающей активностью. Два антигена для двухвалентной антигенсвязывающей активности могут быть одинаковыми или разными.

Диатело по настоящему изобретению может быть получено с использованием следующих этапов: получения кДНК, кодирующей VH и VL моноклонального антитела по настоящему изобретению, которое специфично распознает аминокислотную последовательность внеклеточной области PD-L1 человека или ее трехмерную структуру и связывается с ней, и конструирования ДНК, кодирующей scFv, так чтобы длина аминокислотной последовательности пептидного линкера составляла 8 остатков или меньше, вставки ДНК в вектор экспрессии у прокариот или эукариот и затем введения вектора экспрессии путем трансформации в прокариота или эукариота для экспрессии диатела.

dsFv получают путем связывания полипептида, в котором один аминокислотный остаток в каждом из VH и VL замещен цистеиновым остатком с образованием дисульфидной связи между цистеиновыми остатками. Аминокислотные остатки, замещаемые цистеиновыми остатками, могут быть выбраны в соответствии с известным способом (Protein Engineering, 7697(1994)) на основании предсказания трехмерной структуры антитела.

dsFv по настоящему изобретению может быть получен с использованием следующих этапов: получения кДНК, кодирующей VH и VL моноклонального антитела по настоящему изобретению, которое специфично распознает аминокислотную последовательность внеклеточной области PD-L1 человека или ее трехмерную структуру и связывается с ней, и конструирования ДНК, кодирующей dsFv, вставки ДНК в вектор экспрессии у прокариот или эукариот и затем введения вектора экспрессии путем трансформации в прокариота или эукариота для экспрессии dsFv.

Пептид, содержащий CDR, содержит одну или более CDR, полученных из VH или VL. Несколько пептидов, содержащих CDR, могут быть конъюгированы непосредственно или с помощью подходящего пептидного линкера.

Пептиды, содержащие CDR, по настоящему изобретению могут быть получены с использованием следующих этапов: конструирования ДНК, кодирующей CDR, полученные из VH и VL моноклонального антитела по настоящему изобретению, которое специфично распознает аминокислотную последовательность внеклеточной области PD-L1 человека или ее трехмерную структуру и связывается с ней, вставки ДНК в вектор экспрессии у прокариот или эукариот и затем введения вектора экспрессии путем трансформации в прокариота или эукариота для экспрессии пептида. Пептид, содержащий CDR, также может быть получен с помощью способа химического синтеза, такого как способ Fmoc или способ tBoc.

Термин «CDR» относится к одной из шести гипервариабельных областей в вариабельном домене антитела, которые в первую очередь содействуют связыванию антигена. Одно из наиболее широко используемых определений 6 CDR приведено в Kabat E.A. et al. ((1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242). Используемое в данном документе определение CDR по Kabat применимо к CDR1, CDR2 и CDR3 (CDR L1, CDR L2, CDR L3 или L1, L2, L3) вариабельного домена легкой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 (CDR H1, CDR H2, CDR H3 или H2, H3) вариабельного домена тяжелой цепи.

Термин «каркасная область антитела», используемый в данном документе, относится к части вариабельного домена VL или VH, которая служит в качестве каркаса для антигенсвязывающей петли (CDR) вариабельного домена. В сущности, она представляет собой вариабельный домен без CDR.

«Традиционный вариант» константной области тяжелой цепи антитела человека и константной области легкой цепи антитела человека относится к вариантам константной области тяжелой цепи или константной области легкой цепи, полученным от человека, в которых не изменена структура и функция вариабельной области антитела, которая была раскрыта в предшествующем уровне техники. Иллюстративные варианты включают в себя варианты константной области тяжелой цепи IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, которые подвергнуты сайт-направленной модификации и замене аминокислот в константной области тяжелой цепи, и такие конкретные замены известны из предшествующего уровня техники: мутации YTE, мутация L234A и/или L235A, или мутация S228P, или мутация с получением структуры «выступ во впадину» (так, чтобы тяжелая цепь антитела имела комбинацию «выступов» Fc и «впадин» Fc), или комбинация вышеупомянутых мутаций. Было подтверждено, что такие мутации придают антителу новые свойства, но не изменяют функцию вариабельной области антитела.

Термин «эпитоп» или «антигенная детерминанта» относится к части антигена, с которой иммуноглобулин или антитело специфично связывается (например, к некоторым частям молекулы PD-L1). Эпитоп, как правило, содержит по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 последовательно или непоследовательно расположенных аминокислот в уникальной пространственной конформации. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, vol.66, G. E. Morris, Ed. (1996).

Термины «специфичное связывание», «избирательное связывание», «связывать избирательно» и «связывать специфично» относятся к связыванию антитела с эпитопами на предварительно определенном антигене. Как правило, антитела связывают антигены с аффинностью (KD), составляющей менее чем приблизительно 10^-8M, как, например, менее чем приблизительно 10^-9M, 10^-10M, 10^-11M или меньше.

Термин «KD» или «Kd» относится к равновесной константе диссоциации для специфического взаимодействия антитело-антиген. Как правило, антитела по настоящему изобретению связывают PD-L1 с равновесной константой диссоциации (KD), составляющей менее чем приблизительно 10^-7M, как, например, менее чем приблизительно 10^-8M, 10^-9M или 10^-10M или меньше, например, согласно измерению с помощью прибора BIACORE с применением технологии поверхностного плазменного резонанса (SPR).

Термин «конкуренция» при использовании в случае с антигенсвязывающими белками, конкурирующими за один и тот же эпитоп (такими как нейтрализующие антигенсвязывающие белки или нейтрализующие антитела), означает конкуренцию между антигенсвязывающими белками, которая определяется посредством следующего анализа. В анализе антигенсвязывающий белок (например, антитело или его иммунологически функциональный фрагмент), подлежащий тестированию, предотвращает или ингибирует (например, ослабляет) связывание эталонного антигенсвязывающего белка (например, лиганда или эталонного антитела) с общим антигеном (например, антигеном PD-L1 или его фрагментом). Для определения того, конкурирует ли один антигенсвязывающий белок с другим, можно применять многочисленные типы анализов конкурентного связывания, такие как твердофазный прямой или непрямой радиоиммунологический анализ (RIA), твердофазный прямой или непрямой иммуноферментный анализ (EIA), конкурентный сэндвич-анализ (см., например, Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253); твердофазный прямой EIA с использованием системы биотин-авидин (см., например, Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619), твердофазный анализ с прямым мечением, твердофазный сэндвич-анализ с прямым мечением (см., например, Harlow and Lane, 1988, (Antibodies, A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Press); твердофазный RIA с прямым мечением с использованием I-125 (см., например, Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15); твердофазный прямой EIA с использованием системы биотин-авидин (см., например, Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552) и RIA с прямым мечением (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82). Как правило, анализ включает применение очищенного антигена, связанного с твердой поверхностью или клеткой, несущей немеченый детекторный антигенсвязывающий белок либо меченый эталонный антигенсвязывающий белок. Конкурентное ингибирование измеряют путем измерения количества меток, которые связываются с твердой поверхностью или клеткой в присутствии тестируемого антигенсвязывающего белка. Обычно имеется избыток тестируемых антигенсвязывающих белков. Антигенсвязывающие белки, идентифицируемые путем конкурентного анализа (конкурирующий антигенсвязывающий белок), включают в себя антигенсвязывающий белок, который связывается с тем же эпитопом, что и эталонный антигенсвязывающий белок, и антигенсвязывающий белок, который связывается с соседним эпитопом, расположенным достаточно близко от эпитопа, связываемого эталонным антигенсвязывающим белком, и при этом каждый из двух эпитопов пространственно затрудняет связывание с другим из них. Дополнительные подробности относительно способов, применяемых для определения конкурентного связывания, представлены в вариантах осуществления в данном документе. Обычно, если имеется избыток конкурирующих антигенсвязывающих белков, будет происходить ингибирование (например, ослабление) специфичного связывания эталонного антигенсвязывающего белка с общим антигеном на по меньшей мере 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% или 75% или больше. В некоторых случаях связывание ингибируется на по меньшей мере 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97% или 97% или больше.

Термин «молекула нуклеиновой кислоты», используемый в данном документе, относится как к молекулам ДНК, так и к молекулам РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть однонитевой или двухнитевой, предпочтительно двухнитевой ДНК. Нуклеиновая кислота «эффективно связана», если она находится в функциональной связи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, если промотор или энхансер влияет на транскрипцию кодирующей последовательности, то промотор или энхансер эффективно связан с кодирующей последовательностью.

Термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной к переносу другой нуклеиновой кислоты, с которой она была связана. В одном варианте осуществления вектор представляет собой «плазмиду», которая относится к кольцевой двухнитевой петле ДНК, с которой могут быть связаны другие сегменты ДНК. В другом варианте осуществления вектор представляет собой вирусный вектор, в котором другие сегменты ДНК могут быть связаны с вирусным геномом. Векторы, раскрытые в данном документе, способны к автономной репликации в клетках-хозяевах, в которые они были введены (например, бактериальные векторы с бактериальными точками начала репликации и эписомальные векторы для экспрессии у млекопитающих), или могут интегрироваться в геном клетки-хозяина после введения в клетку-хозяина путем трансфекции, реплицируясь таким образом вместе с геномом хозяина (например, неэписомальные векторы для экспрессии у млекопитающих).

Способы получения и очистки антител и антигенсвязывающих фрагментов широко известны из предшествующего уровня техники, как, например, из глав 5-8 и 15 Using Antibodies: A Laboratory Manual, опубликованного Cold Spring Harbor. Например, мышь можно иммунизировать с помощью PD-L1 человека или его фрагментов, и полученные антитела можно подвергать ренатурации, очищать, а аминокислоты можно секвенировать с использованием традиционных способов. Антигенсвязывающие фрагменты можно также получать с помощью традиционных способов. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент, как определено в настоящем изобретении, модифицированы посредством генной инженерии с добавлением одной или более FR-областей человека в CDR-область, отличную от человеческой. Последовательность FR зародышевого типа человека можно получить путем выравнивания в базе данных генов вариабельных областей антител зародышевого типа человека IMGT с помощью программного обеспечения MOE на сайте ImMunoGeneTics (IMGT) https://imgt.cines.fr или из Journal of Immunoglobulins, 2001ISBN012441351.

Термин «клетка-хозяин» относится к клетке, в которую был введен вектор экспрессии. Клетки-хозяева могут включать клетки бактерий, микроорганизмов, растений или животных. Бактерии, которые легко подвергаются трансформации, включают представителей Enterobacteriaceae, таких как штаммы Escherichia coli или Salmonella; Bacillaceae, таких как Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus и Haemophilus influenzae. Подходящие микроорганизмы включают Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris. Подходящие линии животных клеток-хозяев включают клетки CHO (линию клеток яичника китайского хомячка) и NS0.

Сконструированные антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению могут быть получены и очищены с помощью традиционных способов. Например, последовательности кДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи, могут быть клонированы и подвергнуты рекомбинации в векторе экспрессии GS. Вектор экспрессии рекомбинантного иммуноглобулина можно вводить в клетки CHO путем стабильной трансфекции. В качестве более рекомендованного средства из предшествующего уровня техники системы экспрессии на основе клеток млекопитающих могут вызывать гликозилирование антител, особенно в высококонсервативных N-концевых участках Fc-области. Стабильные клоны получают путем экспрессии антител, которые специфично связываются с PD-L1 человека. Положительные клоны размножали в бессывороточной среде в биореакторе для получения антител. Культуральную среду, в которую секретируется антитело, можно очистить с помощью традиционных методик, например, на колонке с белком A или G, конъюгированным с сефарозой FF, с отрегулированным буфером. Неспецифично связанные компоненты удаляют путем промывания. Затем связанное антитело элюировали с помощью способа градиента pH, и фрагменты антитела выявляли с помощью SDS-PAGE и объединяли. Антитело можно концентрировать путем фильтрации традиционным способом. Растворимые смеси и полимеры также можно удалять традиционными способами, такими как использование молекулярных сит или ионный обмен. Полученный продукт необходимо немедленно заморозить, как, например, при температуре -70℃, или лиофилизировать.

При применении в отношении животного, человека, субъекта эксперимента, клетки, ткани, органа или биологической жидкости термины «вводить» и «обрабатывать» относятся к контакту экзогенного лекарственного средства, средства терапии, средства диагностики или композиции с животным, человеком, субъектом, клеткой, тканью, органом или биологической жидкостью. «Вводить» и «обрабатывать» могут относиться, например, к лечебным, фармакокинетическим, диагностическим, исследовательским и экспериментальным способам. Обработка клетки включает приведение реагента в контакт с клеткой и приведение реагента в контакт с жидкостью, где жидкость находится в контакте с клеткой. «Вводить» и «обрабатывать» также означает обработку, например, клеток in vitro и ex vivo с помощью средства, средства диагностики, связывающей композиции или другой клетки. «Лечить» при применении в отношении субъекта-человека, ветеринарного субъекта или субъекта исследования относится к терапевтическому лечению, профилактическим или превентивным мерам, исследовательским и диагностическим путям применения.

«Терапия» означает введение средства терапии для внутреннего или наружного применения, такого как композиция, содержащая любое из связывающих соединений по настоящему изобретению, пациенту, имеющему один или множество симптомов заболевания, в отношении которых, как известно, средства терапии обладают терапевтическим эффектом. Как правило, средство терапии вводят в количестве, которое обеспечивает эффективное ослабление одного или более симптомов заболевания у пациента или популяции, проходящих лечение, индуцируя снижение интенсивности таких симптомов или ингибируя развитие таких симптомов до какой-либо поддающейся клиническому измерению степени. Количество средства терапии (также называемое «терапевтически эффективным количеством»), эффективное в ослаблении симптомов какого-либо конкретного заболевания, может варьироваться в зависимости от множества факторов, таких как состояние заболевания, возраст и масса тела пациента, а также способности лекарственного средства быть эффективным так, как это желательно для пациента. То, произошло ли ослабление симптомов заболевания, можно оценить с помощью любого способа клинического тестирования, который врач или другой специалист в области здравоохранения обычно применяет для оценки тяжести или прогрессирования симптомов. Хотя варианты осуществления настоящего изобретения (например, способы или изделия для лечения) могут быть неэффективными в ослаблении каждого симптома целевого заболевания, они должны обеспечивать ослабление симптомов целевого заболевания у статистически значимого количества пациентов, подтвержденного с помощью любого из способов статистического тестирования, известных из уровня техники, таких как t-критерий Стьюдента, критерий хи-квадрат, U-критерий Манна-Уитни, критерий Краскела-Уоллиса (H-критерий), критерий Джонкхиера-Терпстра и критерий Уилкоксона.

«Консервативная модификация» или «консервативная замена или замещение» относится к замене аминокислот белка другими аминокислотами, имеющими аналогичные характеристики (такие как заряд, размер боковой цепи, гидрофобность/гидрофильность, конформация и жесткость основной цепи и т.п.), так чтобы можно было часто осуществлять изменения без изменения биологической активности белка. Специалистам в данной области понятно, что, как правило, при одиночных аминокислотных заменах в несущественных областях полипептида биологическая активность существенно не изменяется (см., например, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., P224 (4th edition)). Кроме того, при замене структурно или функционально сходных аминокислот нарушение биологической активности маловероятно.

«Эффективное количество» включает количество, достаточное для уменьшения интенсивности или предупреждения симптомов или состояний при медицинском заболевании. Эффективное количество также означает количество, достаточное для обеспечения возможности или облегчения диагностики. Эффективное количество для конкретного пациента или ветеринарного субъекта может варьироваться в зависимости от таких факторов, как состояние, подлежащее лечению, общее состояние здоровья пациента, путь и доза для введения и тяжесть побочных эффектов. Эффективным количеством может быть максимальная доза или режим дозирования, позволяющие избежать значительных побочных эффектов или токсических эффектов.

«Экзогенный» относится к веществу, которое в соответствующих случаях продуцируется вне организма, клетки или человеческого тела. «Эндогенный» относится к веществу, которое в соответствующих случаях продуцируется в клетке, организме или человеческом теле.

«Гомология» относится к сходству последовательностей между двумя полинуклеотидными последовательностями или между двумя полипептидами. Если положения в двух сравниваемых последовательностях заняты одними и теми же мономерными субъединицами, представляющими собой основание или аминокислоту, например, если каждое положение в двух молекулах ДНК занято аденином, то молекулы являются гомологичными по этому положению. Процент гомологии между двумя последовательностями находится в зависимости от числа совпадающих или гомологичных положений, общих для двух последовательностей, деленного на число сравниваемых положений × 100. Например, при оптимальном сравнении последовательностей в случае, если 6 из 10 положений в двух последовательностях совпадают или являются гомологичными, то эти две последовательности являются на 60% гомологичными; если 95 из 100 положений в двух последовательностях совпадают или являются гомологичными, то эти две последовательности являются на 95% гомологичными. Как правило, сравнения проводят при сравнении двух последовательностей для определения наибольшей процентной доли гомологии.

Используемые в данном документе термины «клетка», «линия клеток» и «культура клеток» используются взаимозаменяемо, и все такие названия включают их потомство. Таким образом, слова «трансформанты» и «трансформированные клетки» включают первичные тестируемые клетки и культуры, полученные из них, независимо от числа пассажей. Также следует понимать, что вследствие преднамеренных или непреднамеренных мутаций все потомство не может иметь точно такое же содержание ДНК. Включено мутантное потомство, которое имеет ту же функциональную или биологическую активность, что и клетки, подвергнутые первоначальному скринингу среди трансформированных клеток. Если подразумеваются разные названия, то их значения четко понятны из контекста.

Используемый в данном документе термин «полимеразная цепная реакция» или «ПЦР» относится к процедуре или методике, в которой амплифицируется конкретное количество нуклеиновой кислоты, РНК и/или ДНК, как описано, например, в патенте США № 4683195. Как правило, необходимо получить информацию о последовательности с конца целевой области или вне ее, чтобы можно было разработать олигонуклеотидные праймеры, идентичные или сходные по последовательности с соответствующими нитями матрицы, подлежащей амплификации. 5'-концевые нуклеотиды двух праймеров могут совпадать с концом материала, подлежащего амплификации. ПЦР можно применять для амплификации специфических последовательностей РНК, специфических последовательностей ДНК, полученных из общей геномной ДНК и кДНК, последовательностей фагов или плазмид, транскрибированных из общей клеточной РНК. См. в общем Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263; Edited by Erlich, (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.). Применяемая в данном документе ПЦР считается одним, но не единственным примером способа полимеразной реакции нуклеиновой кислоты для амплификации тестируемого образца нуклеиновой кислоты, включающим применение известных нуклеиновых кислот в качестве праймеров и полимерaз нуклеиновых кислот для амплификации или получения конкретных частей нуклеиновых кислот.

«Необязательный» или «необязательно» означает, что описанное позже событие или окружение может иметь место, но не обязательно, и описание включает случаи, когда событие или окружение имеет место или не имеет место. Например, «необязательно содержащий 1-3 вариабельные области тяжелой цепи антитела» означает, что вариабельная область тяжелой цепи антитела с конкретной последовательностью может присутствовать, но не обязательно.

«Фармацевтическая композиция» означает смесь, содержащую одно или более соединений или их физиологически/фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, описанные в данном документе, с другими химическими компонентами, такими как физиологически/фармацевтически приемлемые носители и наполнители. Целью фармацевтической композиции является способствование введению в организм, за счет чего облегчается всасывание активного ингредиента и проявляется его биологическая активность.

Кроме того, настоящее изобретение включает лекарственный препарат для лечения заболевания, ассоциированного с PD-L1-положительными клетками, содержащий моноклональное антитело или его фрагмент антитела по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента.

Не существует ограничения на заболевания, ассоциированные с PD-L1, при условии, что это заболевание, ассоциированное с PD-L1, например, терапевтический ответ, индуцированный молекулами, раскрытыми в настоящем изобретении, включает связывание с PD-L1 человека и затем блокирование связывания PD-L1 с его лигандом PD-1 и B7-1 или уничтожение опухолевых клеток, которые сверхэкспрессируют PD-L1. Следовательно, молекулы по настоящему изобретению являются весьма применимыми для тех, кто страдает опухолью или раком, предпочтительно меланомой, раком ободочной кишки, раком молочной железы, раком легкого, карциномой желудка, раком кишечника, почечным раком, немелкоклеточным раком легкого, раком мочевого пузыря и т.д., в препаратах и составах, подходящих для терапевтических путей применения.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу иммунодетекции или определения PD-L1, реагенту для иммунодетекции или определения PD-L1, способу иммунодетекции или определения клеток, экспрессирующих PD-L1, и средству диагностики для диагностики заболеваний, ассоциированных с PD-L1-положительными клетками, которое содержит моноклональное антитело или фрагмент антитела, которые специфично распознают PD-L1 человека и связываются с аминокислотной последовательностью внеклеточной области или ее трехмерной структурой, в качестве активного ингредиента.

В настоящем изобретении способом выявления или определения количества PD-L1 может быть любой известный способ. Например, он включает способ иммунологического выявления или измерения.

Способ иммунодетекции или определения представляет собой способ выявления или определения количества антитела или антигена с использованием меченого антигена или антитела. Примеры способа иммунодетекции или определения включают применение радиоиммунологического анализа (RIA), иммуноферментного анализа (EIA или ELISA), флуоресцентного иммунологического анализа (FIA), люминесцентного иммунологического анализа, вестерн-блоттинга, физико-химического способа и т.д.

Вышеупомянутые заболевания, ассоциированные с PD-L1-положительными клетками, могут быть диагностированы путем выявления или измерения клеток, экспрессирующих PD-L1, с помощью моноклональных антител или их фрагментов антител по настоящему изобретению.

Для выявления клеток, экспрессирующих полипептид, можно применять известный способ иммунодетекции, предпочтительно способ иммунопреципитации, способ флуоресцентного окрашивания клеток, иммуногистохимический способ и т.п. Кроме того, можно применять способ флуоресцентного окрашивания антителами с использованием системы FMAT8100HTS (Applied Biosystems).

В настоящем изобретении нет конкретного ограничения в отношении живого образца для выявления или измерения PD-L1, при условии, что для него имеется возможность включения клеток, экспрессирующих PD-L1, такого как клетки ткани, кровь, плазма крови, сыворотка крови, поджелудочный сок, моча, фекалии, тканевая жидкость или культуральная жидкость.

Средство диагностики, содержащее моноклональное антитело или его фрагмент антитела по настоящему изобретению, может дополнительно содержать реагент для проведения реакции антиген-антитело или реагент для тестирования реакции в соответствии со способом диагностики в случае необходимости. Реагенты для проведения реакции антиген-антитело включают буферы, соли и т.п. Реагенты для выявления включают реагенты, обычно применяемые в способах иммунодетекции или определения, такие как меченое вторичное антитело, которое распознает моноклональное антитело, его фрагмент антитела или его конъюгат и субстрат, соответствующий метке, и т.п.

В настоящем изобретении путем модификации получают антитела к PD-L1 с более высокой аффинностью, более сильной активностью уничтожения опухолей и более низкой иммуногенностью.

II. Варианты осуществления и тестовые примеры

Настоящее изобретение дополнительно описано ниже со ссылкой на варианты осуществления, но эти варианты осуществления не предполагаются как ограничивающие объем настоящего изобретения Экспериментальные способы без указания определенных условий в вариантах осуществления настоящего изобретения осуществляются обычно в соответствии с традиционными условиями, такими как описанные в Using Antibodies: A Laboratory Manual, and Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor; или условиями, предлагаемыми производителями сырьевых материалов или товаров потребления. Реагенты являются коммерчески доступными традиционными реагентами, если не указано иное.

Вариант осуществления 1. Конструирование дрожжевой библиотеки антител к PD-L1, подвергнутых созреванию аффинности, и валидация библиотеки

С целью получения лучших антител к PD-L1 человека разработали и получили дрожжевую библиотеку антител scFv, подвергнутых созреванию аффинности, на основе антител HRP00052 и HRP00049, в которой новые антитела к PD-L1 человека подвергали скринингу. Все последовательности CDR, вариабельных областей легкой цепи и вариабельных областей тяжелой цепи HRP00052 и HRP00049 получены из WO2017084495A1. Конкретные последовательности представлены ниже.

HRP00049: IgG4 9-2 (H2/L10) (AA) (S228P)

Тяжелая цепь: последовательность тяжелой цепи антитела HRP00049: (SEQ ID NO: 1)

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWTWIRQHPGKGLEYIGYISYTGSTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDYWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

Последовательность гена, кодирующая тяжелую цепь антитела HRP00049: (SEQ ID NO: 2)

CAGGTGCAACTGCAGGAGAGCGGCCCCGGACTCGTGAAACCCTCCCAGACCCTGAGCCTGACCTGTACCGTGAGCGGCGGCAGCATCAGCAACGACTACTGGACTTGGATCAGGCAGCACCCCGGCAAAGGCCTGGAGTACATCGGCTACATCAGCTACACCGGCTCCACCTACTACAACCCCAGCCTGAAGTCCAGGGTGACCATCAGCCGGGACACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCGCTGCCGACACAGCCGTGTACTATTGTGCCAGAAGCGGCGGATGGCTGGCCCCTTTCGACTACTGGGGCAGAGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGGCTGCTGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA

Легкая цепь: последовательность легкой цепи антитела HRP00049: (SEQ ID NO: 3)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYHSNQKHSLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYGYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Последовательность гена, кодирующая легкую цепь антитела HRP00049: (SEQ ID NO: 4)

GACATCGTGATGACCCAGAGCCCTGATAGCCTGGCTGTGAGCCTGGGCGAGAGAGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGTTCTACCATAGCAACCAGAAGCACAGCCTCGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAACCCCCCAAGCTGCTGATCTACGGCGCCAGCACAAGAGAGAGCGGAGTGCCCGATAGGTTCAGCGGCAGCGGATCCGGCACCGATTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGATGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACTACGGCTACCCTTACACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA

HRP00052: IgG4 24D5 (GF) (AA) (S228P)

Тяжелая цепь: последовательность тяжелой цепи антитела HRP00052: (SEQ ID NO: 5)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIGPNSGFTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

Последовательность гена, кодирующая тяжелую цепь антитела HRP00052: (SEQ ID NO: 6)

CAGGTGCAACTGGTGCAGAGCGGTGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCAAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGCAGGATCGGGCCCAACAGTGGTTTCACTAGCTACAATGAAAAGTTCAAGAACAGGGTAACCATGACCAGGGACACCTCCACCAGCACAGTGTATATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGGCGGCAGCAGCTACGACTACTTCGACTATTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGTGCTTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGGCTGCTGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA

Легкая цепь: последовательность легкой цепи антитела HRP00052: (SEQ ID NO: 7)

DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Последовательность гена, кодирующая легкую цепь антитела HRP00052: (SEQ ID NO: 8)

GACATCGTGCTGACCCAGAGTCCCGCCTCACTTGCCGTGAGCCCCGGTCAGAGGGCCACCATCACCTGTAGGGCCAGCGAGAGCGTGAGCATCCACGGCACCCACCTGATGCACTGGTATCAACAGAAACCCGGCCAGCCCCCCAAACTGCTGATCTACGCCGCCAGCAACCTGGAGAGCGGCGTGCCCGCCAGGTTCAGCGGCTCCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTCACTATCAACCCCGTGGAGGCCGAGGACACCGCCAACTACTACTGCCAGCAGAGCTTCGAGGACCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA

Часть вышеуказанной последовательности антитела, выделенная подчеркиванием, указывает на часть антитела, являющуюся его вариабельной областью, а другая стандартизированная форма представляет часть антитела, являющуюся его константной областью.

Конструирование дрожжевой библиотеки: разрабатывали вырожденные праймеры, и разработанные мутантные аминокислоты вводили в библиотеки антител HRP00049 и HRP00052 с помощью ПЦР. Затем QC библиотеки подтверждали с помощью способа секвенирования второго поколения, в котором конструировали семь дрожжевых библиотек антител с емкостью 10⁹ на основе последовательностей HRP00049 и HRP00052.

Вариант осуществления 2. Получение антигена

Слитый белок PD-L1 человека-Fc IgG1 разрабатывали и синтезировали, а также очищали в колонке для аффинной хроматографии с белком A с получением рекомбинантного белка PD-L1-Fc высокой степени чистоты для выявления связывания антитела к PD-L1 с антигеном.

PD-L1 человека-Fc IgG1: (SEQ ID NO: 9)

MEFGLSWLFLVAILKGVQCFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNEREPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Примечание: сигнальный пептид + внеклеточный домен + hIgG1Fc.

Вариант осуществления 3. Скрининг антител

В библиотеке HRP00052 использовали биотинилированный антиген PD-L1 человека-hIgG1Fc, и ее подвергали двум циклам скрининга методом MACS (магнитные гранулы со стрептомицином, Invitrogen) и двум циклам скрининга методом FACS (BD FACSAria™ FUSION). Затем выбирали приблизительно 400 дрожжевых моноклональных культур, и индуцировали их экспрессию. FACS (BD FACSCanto II) применяли для выявления связывания дрожжевых моноклональных антител с антигеном PD-L1 человека-hIgG1Fc, и для подтверждения последовательности выбирали дрожжевые моноклональные антитела с более высокой аффинностью, чем у антитела HRP00052 дикого типа. После сравнения и анализа секвенированных клонов и удаления избыточных последовательностей неизбыточные последовательности преобразовывали в полноразмерный IgG (γ1, κ) для экспрессии в клетках млекопитающих. Полноразмерные антитела после аффинной очистки подвергали определению аффинности с помощью BIAcoreTM X-100 (GE Life Sciences).

В библиотеке HRP00049 использовали биотинилированный антиген PD-L1 человека-hIgG1Fc и биотинилированный PD-L1 мыши-hIgG1Fc, и ее подвергали трем циклам скрининга методом MACS и трем циклам скрининга методом FACS. Затем выбирали приблизительно 400 дрожжевых моноклональных культур, и индуцировали их экспрессию. FACS применяли для выявления связывания дрожжевых моноклональных антител с антигеном PD-L1 человека-hIgG1Fc и с антигеном PD-L1 мыши-hIgG1Fc, и для подтверждения последовательности выбирали дрожжевые моноклональные антитела, которые сочетают в себе связывание с антигеном PD-L1 человека-hIgG1Fc и антигеном PD-L1 мыши-hIgG1Fc. После удаления избыточных последовательностей неизбыточные последовательности преобразовывали в полноразмерный IgG (γ1, κ) для экспрессии в клетках млекопитающих. Полноразмерные антитела после аффинной очистки подвергали определению аффинности с помощью BIAcore ™ X-100 (GE Life Sciences).

После скрининга выбирали последовательность CDR-области антитела.

Антитело из библиотеки мутантных форм HRP00049

Клоны, выбранные на основании последовательностей из библиотеки мутантных форм HRP00049, отличаются от HRP00049 по HCDR1 и HCDR2. Соответствующие последовательности CDR или их общие формулы и соответствующие им вариабельные области тяжелой цепи описаны ниже.

HCDR1

представляет собой DGSAYWS (SEQ ID NO: 10) или NDYWT (SEQ ID NO: 11)

HCDR2	X1ISX2AGSTYX3TPSLKG	SEQ ID NO: 12
HCDR3	SGGWLAPFDY	SEQ ID NO: 13
LCDR1	KSSQSLFYHSNQKHSLA	SEQ ID NO: 14
LCDR2	GASTRES	SEQ ID NO: 15
LCDR3	QQYYGYPYT	SEQ ID NO: 16

Полученная общая формула соответствующей последовательности вариабельной области тяжелой цепи представлена ниже:

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISDGSAYWSWIRQHPGKGLEYIGX₁ISX₂AGS TYX₃TPSLKGRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 17)

или

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWTWIRQHPGKGLEYIGX₁ISX₂AGSTY X₃TPSLKGRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 18). X₁ выбран из F или M, X₂ выбран из R или V, X₃ выбран из N или H в вышеуказанной HCDR2 под SEQ ID NO: 12 и вариабельной области тяжелой цепи под SEQ ID NO: 17 или 18.

Полученная соответствующая последовательность вариабельной области легкой цепи представлена ниже: (SEQ ID NO: 19)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYHSNQKHSLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYGYPYTFGGGTKVEIK

Антитело из библиотеки мутантных форм HRP00052

Клоны, выбранные на основании последовательностей из библиотеки мутантных форм HRP00052, отличаются от HRP00052 по HCDR1, HCDR2 и LCDR2. Соответствующие последовательности CDR или их общие формулы и соответствующие им вариабельные области тяжелой цепи описаны ниже.

HCDR1	X4X5WMX6	SEQ ID NO: 20
HCDR2	RIX7PX8X9GX10X11X12YNEKX13KN	SEQ ID NO: 21
HCDR3	GGSSYDYFDY	SEQ ID NO: 22
LCDR1	RASESVSIHGTHLMH	SEQ ID NO: 23
LCDR2	X14ASX15X16X17S	SEQ ID NO: 24
LCDR3	QQSFEDPLT	SEQ ID NO: 25

Полученная общая формула соответствующей последовательности вариабельной области тяжелой цепи представлена ниже: (SEQ ID NO: 26)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTX₄X₅WMX₆WVRQAPGQGLEWMGRIX₇P X₈X₉GX₁₀X₁₁X₁₂YNEKX₁₃KNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDY WGQGTTVTVSS, в вышеуказанных HCDR1 и HCDR2 под SEQ ID NO: 20 и 21 и вариабельной области тяжелой цепи под SEQ ID NO: 26 X₄ выбран из S и D, X₅ выбран из Y и K, X₆ выбран из H и M, X₇ выбран из T, S, H и G, X₈ выбран из S, N и G, X₉ выбран из S, L и G, X₁₀ выбран из F, L, W и M, X₁₁ выбран из A, P и T, X₁₂ выбран из M, V, L и S, X₁₃ выбран из F и Y.

Полученная общая формула соответствующей последовательности вариабельной области легкой цепи представлена ниже: (SEQ ID NO: 27)

DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYX₁₄ASX₁₅ X₁₆X₁₇SGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK, где X₁₄ выбран из V и A, X₁₅ выбран из Y и N, X₁₆ выбран из A, L и V, и X₁₇ выбран из E, F, Y и A (включая то, что X₁₇ выбран из E, F и A и X₁₇ выбран из Y) в LCDR2 под SEQ ID NO: 24 и вариабельной области легкой цепи под SEQ ID NO. 27. Полученные конкретные соответствующие последовательности включают без ограничения последовательности, описанные в таблице 1 и таблице 2.

Таблица 1. Последовательности вариабельной области тяжелой цепи, определенные с помощью скрининга аффинности

Таблица 2. Последовательности вариабельной области легкой цепи, определенные с помощью скрининга аффинности

Конкретные последовательности вариабельных областей легкой цепи и вариабельных областей тяжелой цепи антител, полученные из библиотеки мутантных антител HRP00049:

Вариабельная область тяжелой цепи 9-2 H5 (SEQ ID NO: 42)

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISDGSAYWSWIRQHPGKGLEYIGFISRAGST YNTPSLKGRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDYWGRGTLVTVSS

Вариабельная область тяжелой цепи 9-2 H6 (SEQ ID NO: 43)

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWTWIRQHPGKGLEYIGFISRAGSTYN TPSLKGRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDYWGRGTLVTVSS

Вариабельная область тяжелой цепи 9-2 H7 (SEQ ID NO: 44)

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISNDYWTWIRQHPGKGLEYIGMISVAGSTY HTPSLKGRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGGWLAPFDYWGRGTLVTVSS

Вариабельная область легкой цепи 9-2 L11 (SEQ ID NO: 45)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYHSNQKHSLAWYQQKPGQPPKLLIYGAST RESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYGYPYTFGGGTKVEIK

Конкретные последовательности вариабельных областей легкой цепи и вариабельных областей тяжелой цепи антител, полученные из библиотеки мутантных антител HRP00052:

Вариабельная область тяжелой цепи 24D5 H12 (SEQ ID NO: 46)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRITPSSG FAMYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSS

Вариабельная область тяжелой цепи 24D5 H13 (SEQ ID NO: 47)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRISPSLG LAVYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSS

Вариабельная область тяжелой цепи 24D5 H14 (SEQ ID NO: 48)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIHPSL GLPLYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSS

Вариабельная область тяжелой цепи 24D5 H15 (SEQ ID NO: 49)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKANGYTFTDKWMMWVRQAPGQGLEWMGRITPSS GFAMYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSS

Вариабельная область тяжелой цепи 24D5 H16 (SEQ ID NO: 50)

QVQLVQSGAEVKKPGASMKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRISPSL GLAVYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSS

Вариабельная область тяжелой цепи 24D5 H17 (SEQ ID NO: 51)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIGPNL GWAMYNEKYKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLGSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSS

Вариабельная область тяжелой цепи 24D5 H18 (SEQ ID NO: 52)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRISPSSG MAVYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSS

Вариабельная область тяжелой цепи 24D5 H19 (SEQ ID NO: 53)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRISPGG GFTLYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSS

Вариабельная область тяжелой цепи 24D5 H20 (SEQ ID NO: 54)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIGPNS GFTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSS

Вариабельная область тяжелой цепи 24D5 H21 (SEQ ID NO: 66)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDKWMMWVRQAPGQGLEWMGRITPSS GFAMYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGTTVTVSS

Вариабельная область легкой цепи 24D5 L64 (SEQ ID NO: 55)

DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYVASYAA SGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK

Вариабельная область легкой цепи 24D5 L61 (SEQ ID NO: 56)

DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLE SGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK

Вариабельная область легкой цепи 24D5 L66 (SEQ ID NO: 57)

DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYVASNVF SGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK

Вариабельная область легкой цепи 24D5 L67 (SEQ ID NO: 70)

DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYVASNVE SGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK

Вариабельная область легкой цепи 24D5 L68 (SEQ ID NO: 71)

DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYVASNV WSGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK

Вариабельная область легкой цепи 24D5 L69 (SEQ ID NO: 72)

DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYVASNVY SGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK

Для вариабельных областей легкой цепи и вариабельных областей тяжелой цепи вышеуказанных антител константную область тяжелой цепи IgG1/легкой каппа-цепи человека выбирают и объединяют с каждой вариабельной областью тяжелой цепи и вариабельной областью легкой цепи с образованием полной тяжелой цепи антитела и полной легкой цепи антитела. Последовательности константной области и константной области легкой цепи представлены ниже:

Константная область тяжелой цепи IgG1 (SEQ ID NO: 58)

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Константная область легкой каппа-цепи (SEQ ID NO: 59)

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Таблица 3. Комбинации вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи интактных антител, полученных из мутантного HRP00049

Таблица 4-1. Комбинации вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи полных антител, полученных из мутантного HRP00052

Таблица 4-2. Комбинации вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи полных антител, полученных из мутантного HRP00052

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения все вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи, полученные из библиотек мутантных антител HRP00049 и HRP00052, описанных в таблице 5-1 и таблице 5-2, будучи связанными с константными областями тяжелой цепи и константными областями легкой цепи с образованием полного антитела, представляют собой полное антитело, образованное путем соединения с константной областью тяжелой цепи IgG1 человека (SEQ ID NO: 58) и константной областью легкой каппа-цепи (SEQ ID NO: 59), описанными выше. Например, H15L61 означает, что тяжелая цепь образована путем соединения H15 с константной областью тяжелой цепи IgG1, и легкая цепь образована путем соединения L61 с константной областью легкой каппа-цепи, а легкая и тяжелая цепи связаны с образованием полного антитела, и другие антитела названы по аналогии.

HRP00052-IgG1 означает, что полное антитело образовано путем замены константной области тяжелой цепи (подкласса IgG4) HRP00052 вышеуказанной константной областью тяжелой цепи IgG1 (SEQ ID NO: 58).

Таблица 5-1. Названия полноразмерных антител, полученных путем соединения вариабельных областей тяжелой цепи с константной областью тяжелой цепи IgG1 (SEQ ID NO: 58) и вариабельных областей легкой цепи с константной областью легкой каппа-цепи (SEQ ID NO: 59)

Таблица 5-2. Названия полноразмерных антител, полученных путем соединения вариабельных областей тяжелой цепи с константной областью тяжелой цепи IgG1 (SEQ ID NO: 58) и вариабельных областей легкой цепи с константной областью легкой каппа-цепи (SEQ ID NO: 59)

Для сравнения с полными антителами, полученными путем соединения с константной областью тяжелой цепи IgG1 человека, в некоторых конкретных вариантах осуществления полноразмерные антитела из таблицы 6-1 и таблицы 6-2 являются полными антителами, образованными путем соединения вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи, подвергнутых скринингу из библиотек, полученных из вышеуказанных HRP00049 и HRP00052, со следующей константной областью тяжелой цепи IgG4 человека (под SEQ ID NO: 60, содержащей мутации S228P и 234A235A) и константной областью легкой каппа-цепи (такой же, как SEQ ID NO: 59) соответственно. Например, H15L61-IgG4 относится к полному антителу, образованному путем соединения тяжелой цепи с легкой цепью, где тяжелая цепь образована путем соединения H15 с константной областью тяжелой цепи IgG4, и легкая цепь образована путем соединения L61 с константной областью легкой каппа-цепи, и другие антитела были названы по аналогии.

Константная область тяжелой цепи IgG4 человека: (SEQ ID NO: 60)

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

Таблица 6-1. Названия полноразмерных антител, полученных путем соединения вариабельной области тяжелой цепи с константной областью тяжелой цепи IgG4 (SEQ ID NO: 60) и вариабельной области легкой цепи с константной областью легкой каппа-цепи (SEQ ID NO: 59)

Таблица 6-2. Названия полноразмерных антител, полученных путем соединения вариабельной области тяжелой цепи с константной областью тяжелой цепи IgG4 (SEQ ID NO: 60) и вариабельной области легкой цепи с константной областью легкой каппа-цепи (SEQ ID NO: 59)

В некоторых конкретных вариантах осуществления полноразмерные антитела из таблицы 7-1 и таблицы 7-2 являются полными антителами, образованными путем соединения вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи, подвергнутых скринингу из библиотек, полученных из вышеуказанных HRP00049 и HRP00052, со следующей константной областью тяжелой цепи IgG4 S228P человека (под SEQ ID NO: 65, содержащей мутацию S228P) и константной областью легкой каппа-цепи (такой же, как SEQ ID NO: 59) соответственно. Например, H15L61-IgG4 относится к полному антителу, образованному путем объединения тяжелой цепи с легкой цепью, где тяжелая цепь образована путем соединения H15 с константной областью тяжелой цепи IgG4, и легкая цепь образована путем соединения L61 с константной областью легкой каппа-цепи, и другие антитела были названы по аналогии. Последовательность константной области тяжелой цепи S228P IgG4 представлена ниже: (SEQ ID NO: 65)

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

Таблица 7-1. Названия полноразмерных антител, полученных путем соединения вариабельной области тяжелой цепи с константной областью тяжелой цепи IgG4 S228P (SEQ ID NO: 65) и вариабельной области легкой цепи с константной областью легкой каппа-цепи (SEQ ID NO: 59)

Таблица 7-2. Названия полноразмерных антител, полученных путем соединения вариабельной области тяжелой цепи с константной областью тяжелой цепи IgG4 S228P (SEQ ID NO: 65) и вариабельной области легкой цепи с константной областью легкой каппа-цепи (SEQ ID NO: 59)

Конкретные константная область легкой цепи и константная область тяжелой цепи не предполагаются как ограничивающие константные области антитела по настоящему изобретению, и другие константные области легкой цепи и константные области тяжелой цепи и их мутантные формы, известные из уровня техники, можно также выбирать для улучшения их функциональных характеристик.

Антитело авелумаб (A09) к PD-L1 от Merck и/или 3280A от Genentech в данном документе использовали в качестве положительного контроля, где аминокислотные последовательности на основе аминокислотных последовательностей легкой цепи и тяжелой цепи A09 (полученные из источника US20140341917) представлены ниже:

> Тяжелая цепь A09: (SEQ ID NO: 61)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

> Легкая цепь A09: (SEQ ID NO: 62)

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

Аминокислотные последовательности на основе аминокислотных последовательностей легкой цепи и тяжелой цепи 3280A (Genentech, атезолизумаб, WHO Drug Information, Vol. 28, No. 4, 2014, P488) представлены ниже:

> Тяжелая цепь 3280A: (SEQ ID NO: 63)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

> Легкая цепь 3280A: (SEQ ID NO: 64)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Антитела к PD-L1, описанные выше, очищали с помощью традиционных способов.

Все антитела в следующих примерах являются полноразмерными антителами

Вариант осуществления 4. Тест блокирования лиганда антителом

Дополнительно исследовали блокирующий эффект продукта в отношении связывания PD-L1 и PD1, при этом продукт сравнивали с аналогичными продуктами в клинических испытаниях. Способы относятся к тестовым примерам 2 и 3 WO2017084495A1, и антитело к PD-L1 человека применяли для блокирования связывания PD-L1/PD-1 мыши в тесте блокирования связывания PD-L1/PD-1 мыши. См. таблицу 8 ниже в отношении подробных данных.

Таблица 8. Тест антитела к PD-L1, блокирующего связывание PD-L1 с его лигандом

*10 мкг/мл, 5 мкг/мл и 1 мкг/мл являются концентрациями PD-L1 в различных тестах блокирования.

Тест блокирования лиганда подтверждает, что антитело к PD-L1 по настоящему изобретению может блокировать связывание PD-L1 и PD1, а также связывание PD-L1 и B7-1, и антитела H5L11 и H6L11, полученные путем мутации из HRP00049, обладают активностью перекрестного связывания PD-L1 мыши и могут блокировать способность PD-L1 мыши к связыванию с PD-1.

Вариант осуществления 5. Тест аффинности антител для иллюстративных антител на BIAcore

В соответствии со способом, изложенным в руководстве из набора для захвата с помощью антител человека (№ по кат. BR-1008-39, GE), захватывающее антитело человека ковалентно связывали с биосенсорным чипом CM5 (№ по кат. BR-1000-12, GE), так чтобы некоторое количество PD-L1 человека (№ по кат. 10084-H08H, Sino Biological), PD-L1 обезьяны (№ по кат. 90251-C08H, Sino Biological), PD-L1 мыши (№ по кат. 50010-M08H, Sino Biological) подвергалось аффинному захвату. Аффинность антитела к PD-L1, реагирующего с PD-L1, измеряли с помощью прибора Biacore X100, GE. В данном тесте использовали 10 X буферный раствор HBS-EP+ (№ по кат. BR-1006-69, GE), разбавленный D.I. водой до 1 × (pH 7,4), а также использовали программное обеспечение BIAevaluation версии 4.1, GE для аппроксимации данных моделью Ленгмюра (1:1) с получением величины аффинности. Результаты показаны в таблице 9.

Таблица 9-1. Аффинность связывания HRP00049, HRP00052 и полученных из них мутантных антител с PD-L1 различных видов, определенная с помощью Biacore (серийное тестирование)

Таблица 9-2. Аффинность связывания HRP00052 и полученных из него мутантных антител с PD-L1 различных видов, определенная с помощью Biacore (серийное тестирование)

Результаты показали, что аффинность антител, подвергнутых скринингу из библиотеки мутантных антител HRP00052 (за исключением H21L68), к PD-L1 человека была выше, чем у HRP00052, и у обоих из двух вышеуказанных антител она была выше, чем у антитела положительного контроля, тогда как антитела H5L11, H6L11 и H7L11, подвергнутые скринингу из библиотеки мутантных антител HRP00049, демонстрировали сильную активность перекрестной аффинности к PD-L1 мыши.

Вариант осуществления 6. Секреция клеточного IFNγ под действием антитела к PD-L1 в тесте активации T-лимфоцитов из PBMC

С целью исследования эффекта антитела к PD-L1 в отношении функции первичных Т-лимфоцитов человека собирали и очищали мононуклеарные клетки периферической крови человека (PBMC). После 5 дней стимуляции in vitro туберкулином (TB) определяли уровень секреции цитокина IFNγ. Процесс эксперимента вкратце описан ниже.

PBMC получали из свежей крови посредством центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Hypaque (Stem Cell Technologies) и культивировали в среде RPMI 1640, к которой добавляли 10% (об./об.) FBS, с последующим культивированием при 37°C и 5% CO₂.

Свежевыделенные и очищенные PBMC получали в виде клеточной суспензии с плотностью 2×10⁶/мл с использованием среды RPMI 1640, и к каждым 20 мл клеточной суспензии добавляли 25 мкл туберкулина с последующим культивированием в инкубаторе при 37°C и 5% CO₂ в течение 5 дней. На шестой день культивируемые клетки центрифугировали, один раз промывали в PBS, ресуспендировали в свежей среде RPMI 1640, доводили до плотности 1×10⁶/мл и высевали в 96-луночные планшеты для культивирования клеток в объеме 90 мкл на лунку. Одновременно добавляли образцы антител в градиентном разбавлении (разбавленные с помощью PBS) или равное количество изотипического контроля IgG в качестве холостого контроля в объеме 10 мкл на лунку. Планшет для культивирования клеток помещали в инкубатор и инкубировали при 37°C и 5% CO₂ в течение 3 дней, а затем извлекали и центрифугировали (4000 об./мин., 10 мин.) со сбором надосадочной жидкости культуры клеток. Для определения уровня IFN-γ применяли ELISA (набор для тестирования IFN-γ человека, Xinbosheng, EHC102g.96). Для получения информации о конкретных операциях обращаться к руководству по применению реагентов.

Результаты (см. фигура 1) показывают, что H18L61, H12L64, H5L11 и H6L11 могут сильно стимулировать внутриклеточную секрецию IFNγ. Среди них H12L64, H5L11 и H6L11 демонстрируют дозозависимую тенденцию при способствовании внутриклеточной секреции IFNy. Все четыре вышеуказанных антитела превосходят HRP00052-IgG1 в некоторых дозах или во всех дозах.

Вариант осуществления 7. Иллюстративный эффект ADCC, опосредованный антителами, в отношении PD-L1+ клеток

Цельную кровь человека, разбавленную равным объемом буфера PBS, добавляли на дно пробирки SepMate (STEMCELL Technologies Inc., 15460) с подходящим количеством Lymphoprep (STEMCELL Technologies Inc., 07851) и центрифугировали при 1200 g в течение 10 минут при комнатной температуре. Переливая верхнюю жидкость из пробирки в новую центрифужную пробирку объемом 50 мл, клетки промывали буфером PBS и центрифугировали при 300 g в течение 8 минут с получением PBMC. Затем PBMC ресуспендировали в среде RPMI-1640, содержащей 5% FBS с низким уровнем IgG (BIOSUN, BS-0007-500), и проводили подсчет клеток.

Клетки CHO-S/PD-L1 ресуспендировали в среде RPMI1640, содержащей 5% FBS с низким уровнем IgG, и подсчитывали, высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 10000 клеток на лунку и инкубировали с антителом к PD-L1 в градиентном разбавлении в течение 15 минут, затем 300000 PBMC клеток человека добавляли в каждую лунку и подвергали взаимодействию с антителом в течение 4 часов. Устанавливали контроли со средой, такие как контроль спонтанного высвобождения из клеток CHO-S/PD-L1, контроль спонтанного высвобождения из клеток PBMC и контроль максимального лизиса клеток CHO-S/PD-L1. Спустя 4 часа содержимое 96-луночного планшета центрифугировали, 50 мкл надосадочной жидкости из каждой лунки переносили в другой 96-луночный планшет, в каждую лунку добавляли 50 мкл реагента CytoTox 96 для нерадиоактивного анализа цитотоксичности (Promega, G1780) и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. Добавляли останавливающий раствор и считывали оптическую плотность при 490 нм. Данные анализировали в соответствии со следующей формулой для расчета показателя лизиса. Использовали программное обеспечение GraphPad Prism для расчета величины EC50 для эффекта ADCC антитела в зависимости от концентрации антитела и соответствующего показателя лизиса.

Показатель лизиса, %=(образец в лунке_{490 нм} - спонтанное высвобождение из клеток PBMC_{490 нм} - спонтанное высвобождение из клеток CHO-S/PD-L1_{490 нм}) / (максимальный лизис клеток CHO-S/PD-L1_{490 нм} - спонтанное высвобождение из клеток CHO-S/PD-L1_{490 нм}) × 100

Результаты показывают (как показано на фигурах 2A-2F), что все формы IgG1 различных антител к PD-L1 HRP00049-IgG1, H5L11, HRP00052-IgG1, H6L11, H18L61 и H12L64 обладают сильными эффектами ADCC, и эффекты ADCC всех этих молекул в значительной степени превосходили эффекты формы IgG4 различных антител к PD-L1.

Вариант осуществления 8. Эффект иллюстративных антител в ксенотрансплантатной модели меланомы человека A375

Культивируемые клетки A375 и PBMC смешивали и подкожно инокулировали мышам NOG. Эксперименты распределяли на группу PBMC + PBS, группу PBMC + 20 мг/кг H12L64, группу PBMC + 20 мг/кг H12L64-IgG4 и группу PBMC + 20 мг/кг HRP00052. Шести мышам в каждой группе проводили внутрибрюшинное введение один раз в два дня за 11 последовательных раз. После завершения введения терапевтический эффект оценивали с использованием показателя ингибирования роста опухоли TGI (%) и показателя относительного роста опухоли T/C (%).

Результаты показаны на фигуре 3 и в таблице 10. TGI в группе 20 мг/кг H12L64 составлял 98,15% и значимо отличался от показателя в группе PBMC + PBS (p = 0,0018); показатель ингибирования опухоли TGI в группе 20 мг/кг H12L64-IgG4 составлял 82,15% и значимо отличался от показателя в группе PBMC + PBS (p = 0,0064); показатель ингибирования опухоли TGI в группе 20 мг/кг HRP00052 составлял 68,84% и значимо отличался от показателя в группе PBMC + PBS (p = 0,0291). Результаты показывают, что в группах 20 мг/кг H12L64, 20 мг/кг H12L64-IgG4 и 20 мг/кг HRP00052 может эффективно ингибироваться рост A375 (p < 0,05). На протяжении всего эксперимента опухоленесущие мыши, получавшие H12L64, H12L64-IgG4 и HRP00052, не демонстрировали потерю массы тела или смерть животного, что указывало на то, что H12L64, H12L64-IgG4 и HRP00052 в данной дозе были хорошо переносимы мышами.

Таблица 10. Эффективность антител к PD-L1 в гуманизированной подкожной ксенотрансплантатной модели A375

%TGI: величина ингибирования роста опухоли; %T/C: показатель роста опухоли; CR: регрессия опухоли.

Вариант осуществления 9. Эффект антитела к PD-L1 в мышиной модели рака ободочной кишки MC38-hPD-L1

100 мкл клеток MC38-hPD-L1 инокулировали (hPD-L1 может экспрессироваться на поверхности клеток после введения hPD-L1 путем трансформации в раковые клетки ободочной кишки мыши MC38, 4×10⁵ клеток) в область правого ребра 50 мышей C57, и животных со слишком большим или маленьким объемом опухоли исключали. В соответствии со средним объемом опухоли, составляющим приблизительно 52 мм³, мышей произвольным образом разделяли на три группы отдельного применения антитела к PD-L1 и группу отрицательного контроля, получая в общей сложности 4 группы по 10 мышей в каждой группе. После распределения по группам каждое лекарственное средство вводили внутрибрюшинно (мышам в контрольной группе инъецировали равный объем PBS) три раза в день в общей сложности 12 раз. Период введения составлял 28 дней, и мониторинг опухоленесущих мышей завершался через два дня после прекращения приема лекарственных средств. Измеряли объем опухоли, измеряли массу, и данные регистрировали два раза в неделю. См. следующую таблицу в отношении распределения по группам и введения. Массу тела, объем опухоли и массу опухоли у животных в каждой группе характеризовали с помощью среднего значения ± стандартное отклонение (среднее значение ± SEM). Для построения графиков использовали программное обеспечение GraphPad Prism 5 и Excel, а для статистического анализа использовали t-критерий Стьюдента.

Объем опухоли (TV) = 1/2 × L_{длинная} × L_{короткая}²

Показатель пролиферации опухоли %T/C = (T - T0) / (C - C0) × 100%

Показатель ингибирования роста опухоли %TGI = 1 - %T/C

Результаты эксперимента (см. фигуру 4) показывают, что как H6L11, так и A09 могут в значительной степени ингибировать рост подкожно имплантированных опухолей из MC38-hPD-L1. По сравнению с группой отрицательного контроля в двух группах были продемонстрированы статистически значимые различия в объеме опухоли через 3 дня после введения (p < 0,05). В конце эксперимента (через 27 дней после введения) величины ингибирования роста опухоли в двух группах составляли соответственно 106,74% и 103,47% и с высокой значимостью отличались от значений в группе отрицательного контроля (p < 0,001). Приблизительно 80% - 90% опухолей могли полностью регрессировать, и H6L11 характеризуется лучшим эффектом подавления опухоли, чем A09, но между ними двумя нет статистически значимого различия (см. фигуру 4). В конце эксперимента показатель ингибирования роста опухоли для HRP00052-IgG1 составлял 29,10%.

После эксперимента опухоленесущих мышей умерщвляли, а опухоль отделяли и взвешивали. Результаты взвешивания опухоли в основном соответствовали величине объема опухоли: среди трех групп введения лекарственных средств средняя масса опухоли в группе H6L11 была наименьшей, за ней следовала группа A09, и средняя масса опухоли в группе HRP00052-IgG1 была наибольшей; наблюдалось значимое различие между каждой из двух групп H6L11 и A09 и контрольной группой (p < 0,001). Опухоленесущие мыши хорошо переносили различные лекарственные средства и не имели симптомов, таких как потеря массы тела, вызванная лекарственными средствами.

Вариант осуществления 10. Эффект антитела к PD-L1 в мышиной модели рака ободочной кишки MC38-hPD-L1

Клетки MC38-hPD-L1 инокулировали подкожно мышам C57/BL-6 при плотности 5,8 × 10⁵ клеток/100 мкл/мышь. После конструирования опухоленесущей модели измеряли объем опухоли, и животных со слишком большой или маленькой массой тела и опухолью исключали. Опухоленесущих мышей произвольным образом разделяли на 2 группы (n = 7): контрольную группу IgG-PBS (C25-IgG4), экспериментальную группу H5L11-IgG4 S228P в соответствии с размером опухоли, и дату распределения по группам и введения устанавливали в качестве D0. После распределения по группам каждое лекарственное средство вводили внутрибрюшинно три раза в неделю в общей сложности за 10 раз. Период введения составлял 18 дней, и мониторинг опухоленесущих мышей завершался через два дня после прекращения приема лекарственных средств. Измеряли объем опухоли, измеряли массу, и данные регистрировали два раза в неделю. См. следующую таблицу в отношении распределения по группам и введения. Массу тела, объем опухоли и массу опухоли у животных в каждой группе характеризовали с помощью среднего значения ± стандартное отклонение (среднее значение ± SEM). Для построения графиков использовали программное обеспечение GraphPad Prism 5 и Excel, а для статистического анализа использовали t-критерий Стьюдента.

Объем опухоли (TV) = 1/2 × L_{длинная} × L_{короткая}²

Показатель пролиферации опухоли %T/C = (T - T0) / (C - C0) × 100%

Показатель ингибирования роста опухоли %TGI = 1 - %T/C

Результат, который был показан на фигуре 5, заключался в том, что объем опухоли в экспериментальной группе введения моноклонального антитела к PD-L1 (группе H5L11-IgG4 S228P), которое демонстрировало перекрестную реактивность с PD-L1 мыши, был значимо меньшим, чем в контрольной группе, и существует статистически значимое различие между экспериментальной группой и контрольной группой с момента приблизительно одной недели после введения.

После эксперимента опухоленесущих мышей умерщвляли, а опухоль отделяли и взвешивали. Результаты измерения массы опухоли были аналогичными результатам для объема опухоли. Во время эксперимента не наблюдалось значимое различие в массе тела между группой введения и контрольной группой, и каждое вводимое антитело хорошо переносилось мышами.

Хотя вышеуказанное изобретение было подробно описано с помощью графических материалов и вариантов осуществления для четкого понимания, описание и варианты осуществления не предполагаются как ограничивающие объем настоящего изобретения. Раскрытия всех патентов и научных литературных источников, упоминаемых в данном документе, полностью и четко включены посредством ссылки.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ЦЗЯНСУ ХЭНЖУЙ МЕДИСИН КО., ЛТД.

ШАНХАЙ ХЭНЖУЙ ФАРМАСЬЮТИКАЛ КО., ЛТД

<120> Антитело к PD-L1, его антигенсвязывающий фрагмент и

их фармацевтическое применение

<150> CN201810023267.0

<151> 2018-01-10

<160> 72

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 445

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<223> Последовательность тяжелой цепи антитела HRP00049

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Asp

20 25 30

Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ser Gly Gly Trp Leu Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 2

<211> 1338

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ген

<223> Последовательность гена, кодирующая тяжелую цепь антитела HRP00049

<400> 2

caggtgcaac tgcaggagag cggccccgga ctcgtgaaac cctcccagac cctgagcctg 60

acctgtaccg tgagcggcgg cagcatcagc aacgactact ggacttggat caggcagcac 120

cccggcaaag gcctggagta catcggctac atcagctaca ccggctccac ctactacaac 180

cccagcctga agtccagggt gaccatcagc cgggacacca gcaagaacca gttcagcctg 240

aagctgagca gcgtgaccgc tgccgacaca gccgtgtact attgtgccag aagcggcgga 300

tggctggccc ctttcgacta ctggggcaga ggcaccctgg tgaccgtgag cagcgcttcc 360

accaagggcc catcggtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca 420

gccgccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcacgaa gacctacacc 600

tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gtccaaatat 660

ggtcccccat gcccaccatg cccagcacct gaggctgctg ggggaccatc agtcttcctg 720

ttccccccaa aacccaagga cactctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 780

gtggtggacg tgagccagga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggatggcgtg 840

gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt tcaacagcac gtaccgtgtg 900

gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 960

gtctccaaca aaggcctccc gtcctccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020

ccccgagagc cacaggtgta caccctgccc ccatcccagg aggagatgac caagaaccag 1080

gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140

agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200

tccttcttcc tctacagcag gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagga ggggaatgtc 1260

ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacacagaa gagcctctcc 1320

ctgtctctgg gtaaatga 1338

<210> 3

<211> 220

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<223> Последовательность легкой цепи антитела HRP00049

<400> 3

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr His

20 25 30

Ser Asn Gln Lys His Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 4

<211> 663

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ген

<223> Последовательность гена, кодирующая легкую цепь антитела HRP00049

<400> 4

gacatcgtga tgacccagag ccctgatagc ctggctgtga gcctgggcga gagagccacc 60

atcaactgca agagcagcca gagcctgttc taccatagca accagaagca cagcctcgcc 120

tggtatcagc agaagcccgg ccaacccccc aagctgctga tctacggcgc cagcacaaga 180

gagagcggag tgcccgatag gttcagcggc agcggatccg gcaccgattt caccctgacc 240

atcagcagcc tgcaggccga ggatgtggcc gtgtactact gccagcagta ctacggctac 300

ccttacacct tcggcggcgg caccaaggtg gagatcaagc gtacggtggc tgcaccatct 360

gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420

ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480

caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540

ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600

gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660

tga 663

<210> 5

<211> 446

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<223> Последовательность тяжелой цепи антитела HRP00052

<400> 5

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Gly Pro Asn Ser Gly Phe Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 6

<211> 1341

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ген

<223> Последовательность гена, кодирующая тяжелую цепь антитела HRP00052

<400> 6

caggtgcaac tggtgcagag cggtgccgag gtgaagaagc ctggcgcaag cgtgaaagtg 60

agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaggcaggcc 120

cctggacagg gcctggagtg gatgggcagg atcgggccca acagtggttt cactagctac 180

aatgaaaagt tcaagaacag ggtaaccatg accagggaca cctccaccag cacagtgtat 240

atggagctga gcagcctgag gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaggcggc 300

agcagctacg actacttcga ctattggggc cagggcacca ccgtgaccgt gagcagtgct 360

tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc 420

acagccgccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540

ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac gaagacctac 600

acctgcaacg tagatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagtccaaa 660

tatggtcccc catgcccacc atgcccagca cctgaggctg ctgggggacc atcagtcttc 720

ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 780

gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc 840

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt 900

gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 960

aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020

cagccccgag agccacaggt gtacaccctg cccccatccc aggaggagat gaccaagaac 1080

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140

gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200

ggctccttct tcctctacag caggctcacc gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat 1260

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc 1320

tccctgtctc tgggtaaatg a 1341

<210> 7

<211> 218

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<223> Последовательность легкой цепи антитела HRP00052

<400> 7

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His

20 25 30

Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 8

<211> 657

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ген

<223> Последовательность гена, кодирующая легкую цепь антитела HRP00052

<400> 8

gacatcgtgc tgacccagag tcccgcctca cttgccgtga gccccggtca gagggccacc 60

atcacctgta gggccagcga gagcgtgagc atccacggca cccacctgat gcactggtat 120

caacagaaac ccggccagcc ccccaaactg ctgatctacg ccgccagcaa cctggagagc 180

ggcgtgcccg ccaggttcag cggctccggc agcggcaccg acttcaccct cactatcaac 240

cccgtggagg ccgaggacac cgccaactac tactgccagc agagcttcga ggaccccctg 300

accttcggcc agggcaccaa gctggagatc aagcgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 360

atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420

aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480

ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540

agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600

acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttga 657

<210> 9

<211> 401

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ПЕПТИД

<223> PD-L1 человека-Fc IgG1

<400> 9

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn

20 25 30

Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn

35 40 45

Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu

50 55 60

Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala

65 70 75 80

Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val

85 90 95

Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala

100 105 110

Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala

115 120 125

Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr

130 135 140

Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg

145 150 155 160

Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys

165 170 175

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

180 185 190

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

195 200 205

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

210 215 220

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

225 230 235 240

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

245 250 255

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

260 265 270

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

275 280 285

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

290 295 300

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

305 310 315 320

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

325 330 335

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

340 345 350

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

355 360 365

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

370 375 380

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

385 390 395 400

Lys

<210> 10

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность 1 HCDR1 антитела HRP00049

<400> 10

Asp Gly Ser Ala Tyr Trp Ser

1 5

<210> 11

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность 2 HCDR1 антитела HRP00049

<400> 11

Asn Asp Tyr Trp Thr

1 5

<210> 12

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Общая формула последовательности HCDR2 антитела, полученного

из библиотеки дрожжевого дисплея антител HRP00049

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa выбрана из Phe или Met

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa выбрана из Arg или Val

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (10)..(10)

<223> Xaa выбрана из Asn или His

<400> 12

Xaa Ile Ser Xaa Ala Gly Ser Thr Tyr Xaa Thr Pro Ser Leu Lys Gly

1 5 10 15

<210> 13

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> HCDR3 антитела HRP00049

<400> 13

Ser Gly Gly Trp Leu Ala Pro Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 14

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> LCDR1 антитела HRP00049

<400> 14

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr His Ser Asn Gln Lys His Ser Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 15

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> LCDR2 антитела HRP00049

<400> 15

Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 16

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> LCDR3 антитела HRP00049

<400> 16

Gln Gln Tyr Tyr Gly Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 17

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Общая формула последовательности вариабельного домена тяжелой цепи

антитела, полученного из библиотеки дрожжевого дисплея антител HRP00049

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (52)..(52)

<223> Xaa выбрана из Phe или Met

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (55)..(55)

<223> Xaa выбрана из Arg или Val

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (61)..(61)

<223> Xaa выбрана из Asn или His

<400> 17

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asp Gly

20 25 30

Ser Ala Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Tyr Ile Gly Xaa Ile Ser Xaa Ala Gly Ser Thr Tyr Xaa Thr Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Ser Gly Gly Trp Leu Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Arg

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 18

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Общая формула последовательности вариабельного домена тяжелой цепи

антитела, полученного из библиотеки дрожжевого дисплея антител HRP00049

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (50)..(50)

<223> Xaa выбрана из Phe или Met

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (53)..(53)

<223> Xaa выбрана из Arg или Val

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (59)..(59)

<223> Xaa выбрана из Asn или His

<400> 18

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Asp

20 25 30

Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile

35 40 45

Gly Xaa Ile Ser Xaa Ala Gly Ser Thr Tyr Xaa Thr Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ser Gly Gly Trp Leu Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 19

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Вариабельная область легкой цепи антитела HRP00049

<400> 19

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr His

20 25 30

Ser Asn Gln Lys His Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 20

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Общая формула последовательности HCDR1 антитела, полученного

из библиотеки дрожжевого дисплея антител HRP00052

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa выбрана из Ser и Asp

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (2)..(2)

<223> Xaa выбрана из Tyr и Lys

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa выбрана из His и Met

<400> 20

Xaa Xaa Trp Met Xaa

1 5

<210> 21

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Общая формула последовательности HCDR2 антитела, полученного

из библиотеки дрожжевого дисплея антител HRP00052

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (3)..(3)

<223> Xaa выбрана из Thr，Ser，His и Gly

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa выбрана из Ser，Asn и Gly

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (6)..(6)

<223> Xaa выбрана из Ser，Leu и Gly

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (8)..(8)

<223> Xaa выбрана из Phe，Leu，Trp и Met

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (9)..(9)

<223> Xaa выбрана из Ala，Pro и Thr

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (10)..(10)

<223> Xaa выбрана из Met，Val，Leu и Ser

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (15)..(15)

<223> Xaa выбрана из Phe и Tyr

<400> 21

Arg Ile Xaa Pro Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Tyr Asn Glu Lys Xaa Lys

1 5 10 15

Asn

<210> 22

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность HCDR3 антитела HRP00052

<400> 22

Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 23

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность LCDR1 антитела HRP00052

<400> 23

Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His Gly Thr His Leu Met His

1 5 10 15

<210> 24

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Общая формула последовательности LCDR2 антитела, полученного

из библиотеки дрожжевого дисплея антител HRP00052

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (1)..(1)

<223> Xaa выбрана из Val и Ala

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (4)..(4)

<223> Xaa выбрана из Tyr и Asn

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (5)..(5)

<223> Xaa выбрана из Ala，Leu и Val

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (6)..(6)

<223> Xaa выбрана из Glu，Phe，Trp, Tyr и Ala

<400> 24

Xaa Ala Ser Xaa Xaa Xaa Ser

1 5

<210> 25

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность LCDR3 антитела HRP00052

<400> 25

Gln Gln Ser Phe Glu Asp Pro Leu Thr

1 5

<210> 26

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Общая формула последовательности вариабельного домена тяжелой цепи

антитела, полученного из библиотеки дрожжевого дисплея антител HRP00052

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (31)..(31)

<223> Xaa выбрана из Ser и Asp

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (32)..(32)

<223> Xaa выбрана из Tyr и Lys

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (35)..(35)

<223> Xaa выбрана из His и Met

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (52)..(52)

<223> Xaa выбрана из Thr，Ser，His и Gly

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (54)..(54)

<223> Xaa выбрана из Ser，Asn и Gly

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (55)..(55)

<223> Xaa выбрана из Ser，Leu и Gly

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (57)..(57)

<223> Xaa выбрана из Phe，Leu，Trp и Met

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (58)..(58)

<223> Xaa выбрана из Ala，Pro и Thr

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (59)..(59)

<223> Xaa выбрана из Met，Val，Leu и Ser

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (64)..(64)

<223> Xaa выбрана из Phe и Tyr

<400> 26

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Xaa Xaa

20 25 30

Trp Met Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Xaa Pro Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Tyr Asn Glu Lys Xaa

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 27

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Общая формула последовательности вариабельного домена легкой цепи

антитела, полученного из библиотеки дрожжевого дисплея антител HRP00052

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (54)..(54)

<223> Xaa выбрана из Val и Ala

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (57)..(57)

<223> Xaa выбрана из Tyr и Asn

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (58)..(58)

<223> Xaa выбрана из Ala，Leu и Val

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (59)..(59)

<223> Xaa выбрана из Glu，Phe，Trp，Tyr и Ala

<400> 27

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His

20 25 30

Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Ala Ser Xaa Xaa Xaa Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 28

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность HCDR2 9-2 H5

<400> 28

Phe Ile Ser Arg Ala Gly Ser Thr Tyr Asn Thr Pro Ser Leu Lys Gly

1 5 10 15

<210> 29

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность HCDR2 9-2 H7

<400> 29

Met Ile Ser Val Ala Gly Ser Thr Tyr His Thr Pro Ser Leu Lys Gly

1 5 10 15

<210> 30

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность HCDR1 24D5 H12

<400> 30

Ser Tyr Trp Met His

1 5

<210> 31

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность HCDR1 24D5 H15

<400> 31

Asp Lys Trp Met Met

1 5

<210> 32

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность HCDR2 24D5 H12

<400> 32

Arg Ile Thr Pro Ser Ser Gly Phe Ala Met Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asn

<210> 33

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность HCDR2 24D5 H13

<400> 33

Arg Ile Ser Pro Ser Leu Gly Leu Ala Val Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asn

<210> 34

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность HCDR2 24D5 H14

<400> 34

Arg Ile His Pro Ser Leu Gly Leu Pro Leu Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asn

<210> 35

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность HCDR2 24D5 H17

<400> 35

Arg Ile Gly Pro Asn Leu Gly Trp Ala Met Tyr Asn Glu Lys Tyr Lys

1 5 10 15

Asn

<210> 36

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность HCDR2 24D5 H18

<400> 36

Arg Ile Ser Pro Ser Ser Gly Met Ala Val Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asn

<210> 37

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность HCDR2 24D5 H19

<400> 37

Arg Ile Ser Pro Gly Gly Gly Phe Thr Leu Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asn

<210> 38

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность HCDR3 24D5 H20

<400> 38

Arg Ile Gly Pro Asn Ser Gly Phe Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asn

<210> 39

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность LCDR2 24D5 L64

<400> 39

Val Ala Ser Tyr Ala Ala Ser

1 5

<210> 40

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность LCDR2 24D5 L61

<400> 40

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 41

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Последовательность LCDR2 24D5 L66

<400> 41

Val Ala Ser Asn Val Phe Ser

1 5

<210> 42

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Вариабельная область тяжелой цепи 9-2 H5

<400> 42

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asp Gly

20 25 30

Ser Ala Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Tyr Ile Gly Phe Ile Ser Arg Ala Gly Ser Thr Tyr Asn Thr Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Ser Gly Gly Trp Leu Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Arg

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 43

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Вариабельная область тяжелой цепи 9-2 H6

<400> 43

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Asp

20 25 30

Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile

35 40 45

Gly Phe Ile Ser Arg Ala Gly Ser Thr Tyr Asn Thr Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ser Gly Gly Trp Leu Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 44

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Вариабельная область тяжелой цепи 9-2 H7

<400> 44

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Asp

20 25 30

Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile

35 40 45

Gly Met Ile Ser Val Ala Gly Ser Thr Tyr His Thr Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ser Gly Gly Trp Leu Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 45

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Вариабельная область легкой цепи 9-2 L11

<400> 45

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr His

20 25 30

Ser Asn Gln Lys His Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 46

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Вариабельная область тяжелой цепи 24D5 H12

<400> 46

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Thr Pro Ser Ser Gly Phe Ala Met Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 47

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Вариабельная область тяжелой цепи 24D5 H13

<400> 47

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ser Pro Ser Leu Gly Leu Ala Val Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 48

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Вариабельная область тяжелой цепи 24D5 H14

<400> 48

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile His Pro Ser Leu Gly Leu Pro Leu Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 49

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Вариабельная область тяжелой цепи 24D5 H15

<400> 49

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Lys

20 25 30

Trp Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Thr Pro Ser Ser Gly Phe Ala Met Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 50

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Вариабельная область тяжелой цепи 24D5 H16

<400> 50

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Met Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ser Pro Ser Leu Gly Leu Ala Val Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 51

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Вариабельная область тяжелой цепи 24D5 H17

<400> 51

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Gly Pro Asn Leu Gly Trp Ala Met Tyr Asn Glu Lys Tyr

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Gly Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 52

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Вариабельная область тяжелой цепи 24D5 H18

<400> 52

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ser Pro Ser Ser Gly Met Ala Val Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 53

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Вариабельная область тяжелой цепи 24D5 H19

<400> 53

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ser Pro Gly Gly Gly Phe Thr Leu Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 54

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Вариабельная область тяжелой цепи 24D5 H20

<400> 54

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Gly Pro Asn Ser Gly Phe Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 55

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Вариабельная область легкой цепи 24D5 L64

<400> 55

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His

20 25 30

Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Tyr Ala Ala Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 56

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Вариабельная область легкой цепи 24D5 L61

<400> 56

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His

20 25 30

Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 57

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Вариабельная область легкой цепи 24D5 L66

<400> 57

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His

20 25 30

Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Val Phe Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 58

<211> 330

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Константная область тяжелой цепи IgG1

<400> 58

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 59

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Константная область легкой каппа-цепи

<400> 59

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 60

<211> 327

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Константная область тяжелой цепи IgG4 человека

<400> 60

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 61

<211> 450

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<223> Последовательность тяжелой цепи авелумаба (A09)

<400> 61

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 62

<211> 216

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<223> Последовательность легкой цепи авелумаба (A09)

<400> 62

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 63

<211> 448

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<223> Последовательность тяжелой цепи 3280A (Genentech)

<400> 63

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 64

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<223> Последовательность легкой цепи 3280A (Genentech)

<400> 64

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 65

<211> 327

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Константная область тяжелой цепи IgG4 S228P человека

<400> 65

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 66

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Вариабельная область тяжелой цепи 24D5 H21

<400> 66

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Lys

20 25 30

Trp Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Thr Pro Ser Ser Gly Phe Ala Met Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ser Ser Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 67

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> LCDR2 24D5 L67

<400> 67

Val Ala Ser Asn Val Glu Ser

1 5

<210> 68

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> LCDR2 24D5 L68

<400> 68

Val Ala Ser Asn Val Trp Ser

1 5

<210> 69

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> LCDR2 24D5 L69

<400> 69

Val Ala Ser Asn Val Tyr Ser

1 5

<210> 70

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Вариабельная область легкой цепи 24D5 L67

<400> 70

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His

20 25 30

Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 71

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Вариабельная область легкой цепи 24D5 L68

<400> 71

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His

20 25 30

Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Val Trp Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 72

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Вариабельная область легкой цепи 24D5 L69

<400> 72

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His

20 25 30

Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Val Tyr Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<---

1. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с PD-L1 человека и содержат вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где:

вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 13 соответственно; вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16 соответственно; или

вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 13 соответственно; вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16 соответственно; или

вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 13 соответственно; вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16 соответственно; или

вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 22 соответственно; вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 25 соответственно; или

вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 22 соответственно; вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 25 соответственно; или

вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 22 соответственно; вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 25 соответственно; или

вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 22 соответственно; вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 25 соответственно; или

вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 22 соответственно; вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 25 соответственно; или

вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 22 соответственно; вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 67 и SEQ ID NO: 25 соответственно; или

вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 22 соответственно; вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 69 и SEQ ID NO: 25 соответственно; или

вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 22 соответственно; вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 25 соответственно; или

вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 22 соответственно; вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 25 соответственно; или

вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 22 соответственно; вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 25 соответственно; или

вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 22 соответственно; вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 25 соответственно, или

вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 22 соответственно; вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 25 соответственно.

2. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержат: вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 42, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 45; или

вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 43, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 45; или

вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 44, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 45; или

вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 46, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 55 и 56; или

вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 47, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 56; или

вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 48, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 56; или

вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 49, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 56; или

вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 50, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 56; или

вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 51, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 56; или

вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 52, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 56; или

вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 53, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 56; или

вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 66, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под любым из SEQ ID NO: 57, 70 и 72.

3. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 2, где антитело представляет собой полноразмерное антитело.

4. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 3, где полноразмерное антитело содержит константную область тяжелой цепи антитела человека под SEQ ID NO: 58, 60 или 65 и константную область легкой цепи человека под SEQ ID NO: 59.

5. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 2, где антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab')₂, одноцепочечного вариабельного фрагмента, димеризованного домена V, Fv, стабилизированного дисульфидными связями, и пептидов, содержащих CDR.

6. Фармацевтическая композиция для лечения заболеваний, ассоциированных с PD-L1 человека, содержащая терапевтически эффективное количество моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-5 и один или более фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или наполнителей.

7. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-5.

8. Рекомбинантный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 7, для экспрессии моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-5.

9. Клетка-хозяин, трансформированная с помощью рекомбинантного вектора по п. 8, для экспрессии моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-5, где клетка-хозяин представляет собой прокариотическую клетку или эукариотическую клетку.

10. Клетка-хозяин по п. 9, где клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего.

11. Способ получения моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-5, где способ включает культивирование клетки-хозяина по п. 9 в среде с получением и накоплением моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-5 и сбор моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из культуры.

12. Применение моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-5 при получении средства для диагностики заболеваний, ассоциированных с PD-L1 человека.

13. Способ лечения заболеваний, ассоциированных с PD-L1 человека, где способ включает введение субъекту фармацевтически эффективного количества моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-5, где заболевание выбрано из группы, состоящей из PD-L1-положительной плоскоклеточной карциномы, миеломы, мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, глиомы, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, острого лимфобластного лейкоза, острого миелоидного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза, хронического миелоидного лейкоза, первичной медиастинальной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, лимфомы из клеток мантийной зоны, мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, крупноклеточной В-клеточной лимфомы, богатой Т-клетками/гистиоцитами, множественной миеломы, заболевания, ассоциированного с белком 1 миелоидноклеточного лейкоза, миелодиспластического синдрома, рака желудочно-кишечного тракта, почечного рака, рака яичника, рака печени, лимфобластного лейкоза, лимфоцитарного лейкоза, колоректального рака, рака эндометрия, рака почки, рака предстательной железы, рака щитовидной железы, меланомы, хондросаркомы, нейробластомы, рака поджелудочной железы, мультиформной глиобластомы, карциномы желудка, рака костей, саркомы Юинга, рака шейки матки, рака головного мозга, карциномы желудка, рака мочевого пузыря, гепатоцеллюлярной карциномы, рака молочной железы, рака ободочной кишки, светлоклеточной почечноклеточной карциномы, рака головы и шеи, рака гортани, рака печени и желчевыводящих путей, рака центральной нервной системы, рака пищевода, злокачественной мезотелиомы плевры, системного амилоидоза легких цепей, лимфоплазмоцитарной лимфомы, миелодиспластического синдрома, миелопролиферативной опухоли, нейроэндокринного новообразования, карциномы из клеток Меркеля, рака яичка и рака кожи.

14. Применение моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-5, где заболевание выбрано из группы, состоящей из PD-L1-положительной плоскоклеточной карциномы, миеломы, мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, глиомы, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, острого лимфобластного лейкоза, острого миелоидного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза, хронического миелоидного лейкоза, первичной медиастинальной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, лимфомы из клеток мантийной зоны, мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, крупноклеточной В-клеточной лимфомы, богатой Т-клетками/гистиоцитами, множественной миеломы, заболевания, ассоциированного с белком 1 миелоидноклеточного лейкоза, миелодиспластического синдрома, рака желудочно-кишечного тракта, почечного рака, рака яичника, рака печени, лимфобластного лейкоза, лимфоцитарного лейкоза, колоректального рака, рака эндометрия, рака почки, рака предстательной железы, рака щитовидной железы, меланомы, хондросаркомы, нейробластомы, рака поджелудочной железы, мультиформной глиобластомы, карциномы желудка, рака костей, саркомы Юинга, рака шейки матки, рака головного мозга, карциномы желудка, рака мочевого пузыря, гепатоцеллюлярной карциномы, рака молочной железы, рака ободочной кишки, светлоклеточной почечноклеточной карциномы, рака головы и шеи, рака гортани, рака печени и желчевыводящих путей, рака центральной нервной системы, рака пищевода, злокачественной мезотелиомы плевры, системного амилоидоза легких цепей, лимфоплазмоцитарной лимфомы, миелодиспластического синдрома, миелопролиферативной опухоли, нейроэндокринного новообразования, карциномы из клеток Меркеля, рака яичка и рака кожи.