Композиции для применения в качестве профилактического средства для пациентов с риском туберкулезной инфекции или в качестве вторичных средств для лечения пациентов с туберкулезной инфекцией
Настоящее изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к способу получения лиофилизированной композиции, состоящей из выделенного микроорганизма, принадлежащего к Mycobacterium tuberculosis, отличающемуся наличием фенотипа PhoP− в результате инактивации посредством генетической делеции гена Rv0757 и делеции второго гена, Rv2930 (fadD26), предотвращающей продукцию PDIM (фенотип PDIM−) (штамм MTBVAC). Изобретение позволяет получать лиофилизированую композицию и эффективно ее использовать в качестве профилактического средства для индивидуумов, имеющих риск инфекции M. tuberculosis или имеющих риск развития туберкулеза, или в качестве вторичных средств для лечения пациентов с туберкулезной инфекцией. 1 з.п. ф-лы, 11 ил., 15 табл., 3 пр.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, таким как вакцины, и к способам получения и применения таких композиций.
Уровень техники
Вакцина бациллы Кальметта-Герена (БЦЖ) представляет собой аттенуированный штамм Mycobacterium bovis, возбудителя туберкулеза (TB) у крупного рогатого скота. БЦЖ впервые внедрили в клиническую практику почти сто лет назад, когда в 1921 году ее ввели перорально младенцу, мать которого умерла от TB через день после родов. У младенца не наблюдали нежелательных явлений в ответ на вакцинацию БЦЖ, и, что важно, у него не развился TB. В то время пероральный путь введения БЦЖ считали природным путем (желудочно-кишечный тракт) заражения TB у младенцев и детей, которых кормили непастеризованным молоком. TB связан с бедностью, при этом основное бремя приходится на бедные развивающиеся страны мира. Частота TB повышается по всему миру из-за бедности и неравенства и усугубляется пандемией ВИЧ/СПИД, что значительно повышает риск перехода инфекции в активное заболевание. Диабет, метаболический синдром, курение и, в последнее время, дефицит витаминов по причине недостаточного питания и плохих социально-экономических условий являются важными факторами риска TB. Важно то, как эти факторы могут влиять на оценку эффективности новых вакцин против TB, требуя особого внимания при определении дизайна клинического испытания, включающего исследование или выборки пациентов со спектром таких факторов риска. В результате роста глобализации и возникновения штаммов TB с множественной лекарственной устойчивостью (MDR) и с широкой лекарственной устойчивостью (XDR), TB становится серьезной угрозой для всего мира.
В настоящее время TB достигает опасной частоты 10,0 миллионов случаев заболевания и 1,6 миллионов случаев смерти, приписываемой заболеванию, что описано в последнем глобальном отчете Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) о TB 2018 года. В мире приблизительно 50 миллионов индивидуумов уже латентно инфицированы штаммами M. tuberculosis с MDR, что создает существенный ресурс для последующих случаев заболевания активным TB в недостаточными вариантами лечения. Несмотря на это, в заявлении ВОЗ "The End TB Strategy" обещано снижение заболеваемости TB на 90% и смертности от TB на 95% к 2035 году и подчеркнута насущная потребность в более доступных диагностических инструментах, являющихся быстрыми и надежными, новых менее токсичных и более эффективных антибиотиках для сокращения терапии и, наконец, новых вакцинах для профилактики TB легких для достижения этой амбициозной цели.
Настоящее изобретение способствует достижению цели получения новых вакцин для профилактики TB.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к живой аттенуированной вакцинной композиции M. tuberculosis, предпочтительно к восстановленной композиции после лиофилизации, содержащей выделенный микроорганизм, принадлежащий к штамму MTBVAC, имеющему i) фенотип PhoP− в результате инактивации посредством генетической делеции гена Rv0757 и ii) делецию второго гена, Rv2930 (fadD26), предотвращающую продукцию PDIM (фенотип PDIM−), где указанная композиция отличается тем, что содержит следующие компоненты на мл (в процентных долях):
| Компоненты | MTBVAC Доза на 1 мл |
| L-аспарагин | 0,034-0,066% |
| Дигидроортофосфат калия | 0,006-0,010% |
| Сульфат магния H2O | 0,008-0,012% |
| Цитрат железа (III)-аммония | 0,0004-0,0008% |
| Моногидрат декстрозы | 0,05-0,066% |
| Глицерин | 0,00005-0,0001% |
| Лимонная кислота | 0,026-0,034% |
| Полисорбат 80 | 0,000002-0,000008% |
| Глутамат натрия | 0,33-1,33% |
| Сахароза | 3,3-13,3% |
| Очищенная вода в достаточном количестве | 1 мл |
Краткое описание чертежей
Другие цели, преимущества и новые признаки настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания изобретения в сочетании с сопутствующими чертежами.
Фигура 1. Выращивание штамма SO2 в среде Миддлбрука 7H9 и синтетической среде Сатона. Результаты в OD и КОЕ/мл пассажей культуры 1 и 2.
На фигуре 2 показаны результаты в OD культур MTBVAC в среде Сатона, средах SD и SDG.
На фигуре 3 показаны результаты анализа стабильности при температуре от 2-8°C до -30°C серий или партий, указанных в таблице 15.
Фигура 4. Защита у мышей. Данные на фигуре представляют собой совокупность двух независимых экспериментов (n=12 мышей/группу). Все данные представляют собой среднее ±SEM. Индекс защиты определяют как различие между бактериальной нагрузкой в невакцинированных и вакцинированных группах (показано в десятичном логарифме).
Фигура 5 (А-С). Иммуногенность у мышей. Данные на фигуре соответствуют одному эксперименту (n=5 мышей/группу). Все данные представляют собой среднее ±SEM. SFC: Пятнообразующая колония.
Фигура 6. Вакцинация новорожденных из TB-эндемичных условий с повышением доз MTBVAC, что приводило преимущественно к Th1-опосредованным (ИФНγ, ИЛ-2 или ФНОα) антиген-специфическим ответам CD4+ T-клеток. Наибольшая доза MTBVAC 2,5×105 КОЕ индуцировала наибольшую величину антиген-специфического CD4+ T-клеточно-опосредованного цитокинового ответа в день 70. Наименьшая доза MTBVAC 2,5×103 КОЕ являлась наименее иммуногенной.
Фигура 7. Вакцинация новорожденных из TB-эндемичных условий с повышением доз MTBVAC приводила к дозозависимому профилю количественного значения в анализе QFT в дни 180 и 360 после вакцинации. Значения QFT стратифицируют по трем разным областям в зависимости от риска развития активного TB в соответствии с Andrews JR, Nemes E, Tameris M et al. Serial QuantiFERON testing and tuberculosis disease risk among young children: an observational cohort study. Lancet Respir Med, (2017).
Фигура 8. Отсутствие вирулентных микобактерий в рабочей посевной серии у морских свинок.
Фигура 9. Исследования стабильности в основных и рабочих посевных сериях.
Фигура 10. Исследование долговременной стабильности вакцины MTBVAC в дозе 3-17×103 КОЕ/0,1 мл, дозе 3-17×104 КОЕ/0,1 мл и дозе 3-17×106 КОЕ/0,1 мл, хранящейся при -15°C - -30°C, (A), и хранящейся при +2°C - +8°C, (B).
Фигура 11. Постадийное конструирование из SO2 в MTBVAC. Конечный штамм с двойной делецией фенотипически идентичен прототипу SO2 (с дефицитом PDIM на основе phoP), но обеспечивает более высокую генетическую стабильность. Светло-голубым указан ген phoP, ген fadD26 указан светло-оранжевым, кассеты резистентности к антибиотикам kmr и hygr указаны пурпурным, желтыми треугольниками указаны участки res, фланкирующие Ωhygr, или остаточный участок res в делетированных областях; участки res не содержат какую-либо экзогенную кодирующую последовательность.
Подробное описание изобретения
Определения и подробное описание штамма MTBVAC
Термин "штамм MTBVAC" будет использоваться для обозначения выделенного микроорганизма штамма M. tuberculosis, в котором из клинического штамма M. tuberculosis MT103 делетирован Rv0757 и который дополнительно содержит делецию гена Rv2930 (fadD26). Таким образом, указанный штамм имеет две независимые мутации, полученные из M. tuberculosis, независимая делеция phoP не влияет на свойства вакцины, полученной в результате инактивации указанного гена. Таким образом, "штамм MTBVAC" отличается тем, что продукция PDIM инактивирована посредством делеции гена Rv2930 (fadD26), и, таким образом, этот штамм отличается тем, что содержит делецию генов Rv2930 и Rv0757.
Таким образом, необходимо отметить, что штамм MTBVAC конструировали так, чтобы он содержал две независимые необратимые делеции без маркеров резистентности к антибиотикам, что соответствует требованиям безопасности Женевского соглашения для продвижения клинического исследования фазы I живых микобактериальных вакцин. Штамм MTBVAC генетически конструировали так, чтобы он напоминал свой прототип SO2. SO2 является маркированным Mt103, мутантым по phoP в результате инсерции кассеты резистентности к канамицину (kmr) (Mt103phoP::kmr) (см. фигуру 11), где, в дополнение к сконструированному PhoP-дефектному фенотипу, SO2 имеет приобретенную спонтанную потерю биосинтеза PDIM (см. фигуру 2 из Dessislava Marinova, Jesus Gonzalo-Asensio, Nacho Aguilo & Carlos Martin (2017) MTBVAC from discovery to clinical trials in tuberculosis-endemic countries, Expert Review of Vaccines, 16:6, 565-576, DOI: 10.1080/14760584.2017.1324303), что, как описано, распространено среди M. tuberculosis в результате повторяющегося лабораторного субкультивирования и различных манипуляций.
Как показано на фигуре 11, штамм MTBVAC конструировали, следуя постадийному подходу. Сначала, в SO2 встраивали немаркированную делецию fadD26, получая SO2ΔfadD26. Таким образом, посредством немаркированной делеции phoP в SO2ΔfadD26 получали штамм MTBVAC. Для конструирования MTBVAC использовали суицидные плазмиды, несущие делетированные гены fadD26 и phoP, делетированные области прерывались маркером резистентности к гигромицину (hygr), фланкированному участками res на каждой стороне (res::hygr::res). γδ-резольваза из E. coli катализировала эксцизию кассеты резистентности к антибиотикам после распознавания участков res, оставляя копию остаточного res в виде "шрама" вместо делеции (Malaga, et al. 2003); участки res не содержат какую-либо экзогенную кодирующую последовательность. Конечную конструкцию SO2ΔfadD26::ΔphoP называли штаммом MTBVAC. В штамме MTBVAC встраивание немаркированной делеции в fadD26 обеспечивает генетически стабильное устранение биосинтеза PDIM. Размер получающейся делеции в гене fadD26 составляет 1511 п.н., и она приводит к полной инактивации этого гена, необходимого для биосинтеза PDIM. Ген дикого типа имеет размер 1752 п.н. (583 аминокислот). Остаточный "шрам" res образуется в результате эксцизии hygr под действием γδ-резольвазы. В результате этой делеции уровни транскрипции следующих пяти генов в локусе PDIM (fadD26-ppsE) снижаются, и биосинтез PDIM в MTBVAC полностью прекращается (диссертация Ainhoa Arbués на соискание звания PhD). Локус PDIM в M. tuberculosis содержит 13 генов, кластеризованных на фрагменте хромосомы длиной 50 т.п.н. Область является наибольшим опероном в геноме M. tuberculosis (Camacho, et al. 2001; Camacho, et al. 1999; Cox, et al. 1999; Trivedi, et al. 2005).
В M. tuberculosis phoP (744 п.н.) картируют выше phoR (1458 п.н.), и оба гена транскрибируются в одном направлении. Замена полученной делеции длиной 94 п.н. геном phoP с помощью остаточного участка res приводит к наличию множества стоп-кодонов, что, с другой стороны, приводит к отсутствию трансляции ДНК-связывающего домена (эквивалентного 92 аминокислотам) PhoP в MTBVAC.
Делеции генов phoP и fadD26 в MTBVAC можно определять/локализовать с использованием подхода RT-ПЦР "наличия/отсутствия". В способе используют флуоресцентные реагенты для ПЦР (праймеры и зонды) для определения наличия участков res в генах ΔphoP и ΔfadD26 и отсутствия генов phoP и fadD26 дикого типа.
В настоящем описании ниже представлена последовательность открытой рамки считывания (ORF) гена fadD26 в Mt103 a) и в MTBVAC (ΔfadD26) b); и последовательность ORF гена phoP в Mt103 c) и в MTBVAC (ΔphoP) d). Нуклеотидная последовательность, соответствующая делетированным областям гена fadD26 (a) и phoP (c), указана строчными буквами; остаточный участок res выделен серым. Что касается флуоресцентного способа детекции на основе ПЦР, праймеры для каждой мишени подчеркнуты, а зонд Taq-man выделен полужирным шрифтом.
a) Ген fadD26 дикого типа в Mt103
SEQ ID NO 1:
ATGCCGGTGACCGACCGTTCAGTGCCCTCTTTGCTGCAAGAGAGGGCCGACCAGCAGCCTGACAGCACTGCATATACGTACATCGACTACGGATCCgaccccaagggatttgctgacagcttgacttggtcgcaggtctacagtcgtgcatgcatcattgctgaagaactcaagttatgcgggttacccggagatcgagtggcggttttagcgccacaaggactggaatatgtccttgcattcctgggcgcacttcaggctggatttatcgcggttccgctgtcaactccacagtatggcattcacgatgaccgcgtttctgcggtgttgcaggattccaagccggtagccattctcacgacttcgtccgtggtaggcgatgtaacgaaatacgcagccagccacgacgggcagcctgccccggtcgtagttgaggttgatctgcttgatttggactcgccgcgacagatgccggctttctctcgtcagcacaccggggcggcttatctccaatacacgtccggatcgacgcgtacgccggccggagtcattgtgtcgcacacgaatgtcattgccaatgtgacacaaagtatgtacggctatttcggcgatcccgcaaagattccgaccgggactgtggtgtcgtggctgcctttgtatcacgatatgggcctgattctcggaatttgcgcaccgctggtggcccgacgccgcgcgatgttgatgagcccaatgtcatttttgcgccgtccggcccgctggatgcaactgcttgccaccagcggccggtgcttttctgcggcaccgaatttcgccttcgagctggccgtgcgcagaacatctgaccaggacatggcggggctcgacctgcgcgacgtggtcggcatcgtcagtggcagtgagcgaatccatgtggcaaccgtgcggcggttcatcgagcggttcgcgccgtacaatctcagccccaccgcgatacggccgtcgtacgggctcgcggaagcgaccttatatgtggcagctcccgaagccggcgccgcgcccaagacggtccgttttgactacgagcagctgaccgccgggcaggctcggccctgcggaaccgatgggtcggtcggcaccgaactgatcagctacggctcccccgacccatcgtctgtgcgaatcgtcaacccggagaccatggttgagaatccgcctggagtggtcggtgagatctgggtgcatggcgaccacgtgactatggggtattggcagaagccgaagcagaccgcgcaggtcttcgacgccaagctggtcgatcccgcgccggcagccccggaggggccgtggctgcgcaccggcgacctgggcgtcatttccgatggtgagctgttcatcatgggccgcatcaaagacctgctcatcgtggacgggcgcaaccactaccccgacgacatcgaggcaacgatccaggagatcaccggtggacgggccgcggcgatcgcagtgcccgacgacatcaccgaacaactggtggcgatcatcgaattcaagcgacgcggtagtaccgccgaagaggtcatgctcaagctccgctcggtgaagcgtgaggtcacctccgcGATATCGAAGTCACACAGCCTGCGGGTGGCCGATCTCGTTCTGGTGTCACCTGGTTCGATTCCCATCACCACCAGCGGCAAGATCCGGCGGTCAGCCTGCGTCGAACGCTATCGCAGCGACGGCTTCAAGCGGCTGGACGTAGCCGTATGA
b) ΔfadD26 в MTBVAC
SEQ ID NO 2:
ATGCCGGTGACCGACCGTTCAGTGCCCTCTTTGCTGCAAGAGAGGGCCGACCAGCAGCCTGACAGCACTGCATATACGTACATCGACTACGGATCCACTAGTTCTAGAGCAACCGTCCGAAATATTATAAATTATCGCACACATAAAAACAGTGCTGTTAATGTGTCTATTAAATCGATTTTTTGTTATAACAGACACTGCTTGTCCGATATTTGATTTAGGATACATTTTTATGAGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCGAAGTCACACAGCCTGCGGGTGGCCGATCTCGTTCTGGTGTCACCTGGTTCGATTCCCATCACCACCAGCGGCAAGATCCGGCGGTCAGCCTGCGTCGAACGCTATCGCAGCGACGGCTTCAAGCGGCTGGACGTAGCCGTATGA
c) Ген phoP дикого типа в Mt103
SEQ ID NO 3:
ATGCGGAAAGGGGTTGATCTCGTGACGGCGGGAACCCCAGGCGAAAACACCACACCGGAGGCTCGTGTCCTCGTGGTCGATGATGAGGCCAACATCGTTGAACTGCTGTCGGTGAGCCTCAAGTTCCAGGGCTTTGAAGTCTACACCGCGACCAACGGGGCACAGGCGCTGGATCGGGCCCGGGAAACCCGGCCGGACGCGGTGATCCTCGATGTGATGATGCCCGGGATGGACGGCTTTGGGGTGCTGCGCCGGCTGCGCGCCGACGGCATCGATGCCCCGGCGTTGTTCCTGACGGCCCGTGACTCGCTACAGGACAAGATCGCGGGTCTGACCCTGGGTGGTGACGACTATGTGACAAAGCCCTTCAGTTTGGAGGAGGTCGTGGCCAGGCTGCGGGTCATCCTGCGACGCGCGGGCAAGGGCAACAAGGAACCACGTAATGTTCGACTGACGTTCGCCGATatcgagctcgacgaggagacccacgaagtgtggaaggcgggccaaccggtgtcgctgtcgcccaccgaattcaccctgctgcgctatttcgtGATCAACGCGGGCACCGTGCTGAGCAAGCCTAAGATTCTCGACCACGTTTGGCGCTACGACTTCGGTGGTGATGTCAACGTCGTCGAGTCCTACGTGTCGTATCTGCGCCGCAAGATCGACACTGGGGAGAAGCGGCTGCTGCACACGCTGCGCGGGGTGGGCTACGTACTGCGGGAGCCTCGATGA
d) ΔphoP в MTBVAC
SEQ ID NO 4:
ATGCGGAAAGGGGTTGATCTCGTGACGGCGGGAACCCCAGGCGAAAACACCACACCGGAGGCTCGTGTCCTCGTGGTCGATGATGAGGCCAACATCGTTGAACTGCTGTCGGTGAGCCTCAAGTTCCAGGGCTTTGAAGTCTACACCGCGACCAACGGGGCACAGGCGCTGGATCGGGCCCGGGAAACCCGGCCGGACGCGGTGATCCTCGATGTGATGATGCCCGGGATGGACGGCTTTGGGGTGCTGCGCCGGCTGCGCGCCGACGGCATCGATGCCCCGGCGTTGTTCCTGACGGCCCGTGACTCGCTACAGGACAAGATCGCGGGTCTGACCCTGGGTGGTGACGACTATGTGACAAAGCCCTTCAGTTTGGAGGAGGTCGTGGCCAGGCTGCGGGTCATCCTGCGACGCGCGGGCAAGGGCAACAAGGAACCACGTAATGTTCGACTGACGTTCGCCGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCTCATAAAAATGTATCCTAAATCAAATATCGGACAAGCAGTGTCTGTTATAACAAAAAATCGATTTAATAGACACATTAACAGCACTGTTTTTATGTGTGCGATAATTTATAATATTTCGGACGGTTGCTCTAGAACTAGTGGATCAACGCGGGCACCGTGCTGAGCAAGCCTAAGATTCTCGACCACGTTTGGCGCTACGACTTCGGTGGTGATGTCAACGTCGTCGAGTCCTACGTGTCGTATCTGCGCCGCAAGATCGACACTGGGGAGAAGCGGCTGCTGCACACGCTGCGCGGGGTGGGCTACGTACTGCGGGAGCCTCGATGA
SO2 обладает подробной и полной доклинической историей, демонстрирующей устойчивую безопасность, профиль аттенуации и многообещающую эффективность по сравнению с БЦЖ в соответствующих моделях на животных. К счастью, большинство из этих доклинических исследований были воспроизведены с использованием MTBVAC для подтверждения функционального профиля и биологической активности двойного аттенуированного фенотипа PhoP−PDIM−. Анализы липидного профиля показали, что MTBVAC и его прототип SO2 являются фенотипически сравнимыми, не имея DAT, PAT и PDIM.
С другой стороны, далее в контексте настоящего описания термин "БЦЖ" будет использоваться для обозначения существующей вакцины, используемой против туберкулеза с 1921 года. Она является живой аттенуированной вакциной, полученной из штамма M. bovis, утратившего свою вирулентность после субкультивирования в лаборатории, и в котором, как теперь известно, есть более сотни делетированных генов. Behr, M. A. BCG - different strains, different vaccines. Lancet Infect Dis 2002, 2(2), 86-92.
Далее в контексте настоящего описания термин "H37Rv" будет использоваться для обозначения патогенного штамма M. tuberculosis, подвергнутого секвенированию, при этом Cole et al. обозначали гены как Rv (Ref Cole et al 1998 Deciphering the biology of M. tuberculosis from the complete genome sequence. Nature 393: 537-544).
Далее в контексте настоящего описания термин "MT103" будет использоваться для обозначения клинического изолята M. tuberculosis. Camacho et al. 1999 Identification of a virulence gene cluster of M. tuberculosis by signature-tagged transposon mutagenesis. Mol Microbiol 34: 257-267.
Далее в контексте настоящего описания термин "PDIM− штамм" будет использоваться для обозначения комплекса штамма M. tuberculosis, неспособного синтезировать фтиоцеролдимикоцерозаты, являющиеся липидами, важными для патогенности M. tuberculosis.
Далее в контексте настоящего описания термин "SO2+pSO5" будет использоваться для обозначения штамма M. tuberculosis SO2, в котором мутация в Rv0757 дополнена геном Rv0757 посредством трансформации с помощью репликативной плазмиды с микобактериальным геном phoP, но он не может восполнять синтез PDIM, его фенотип представляет собой PhoP+ PDIM−.
Далее в контексте настоящего описания термин "M. tuberculosis phoP−" будет использоваться для обозначения штамма M. tuberculosis, инактивированного посредством делеции гена Rv0757 между участками EcoRV-BspEI, его фенотип представляет собой phoP− PDIM+.
Далее в контексте настоящего описания термин "Rv2930 (fadD26)" будет использоваться для обозначения гена, находящегося в начале оперона, отвечающего за синтез фтиоцеролдимикоцерозатов (PDIM) (Camacho et al.), и элиминация этого гена в M. tuberculosis придает стабильный фенотип PDIM−.
Описание
Использование вакцин для профилактики TB у людей уже почти столетие является огромной проблемой. БЦЖ, полученная из M. bovis, в настоящее время является единственной сертифицированной используемой вакциной против TB, а также наиболее широко используемой вакциной в мире. Разработка и генерализованное введение вакцины БЦЖ с начала 1920-х гг. представляло собой значительный прогресс с перспективой ликвидации TB во всем мире. Однако эти исходные перспективы не были достигнуты, и, учитывая результаты большого количества исследований эффективности, очевидно, что вакцина БЦЖ в своей нынешней форме имеет ограниченное использование в контроле заболевания, в частности, при респираторных формах у взрослых в странах третьего мира, где заболевание является эндемичным. Fine, P.E. Variation in protection by BCG: implications of and for heterologous immunity. Lancet 1995, 346(8986), 1339-1345. Благодаря росту знаний о вирулентности M. tuberculosis и разработке моделей иммунного ответа, приводящего к образованию защитного иммунитета, можно разработать более эффективные вакцины, чем БЦЖ. Наблюдение достижения более высоких уровней защиты при вакцинации организма-хозяина с помощью БЦЖ позволяет предполагать, что жизнеспособность и персистенция являются основополагающими свойствами, необходимыми для успеха противотуберкулезной вакцины. В связи с этим, в патенте США № US 8287886 B2 описано, что использование штамма M. tuberculosis с инактивированным геном Rv0757 (phoP) и второй независимой мутацией phoP, предотвращающей синтез PDIM, обеспечивает получение прототипа однодозовой живой вакцины, являющейся более аттенуированной, чем БЦЖ, в случае иммунокомпрометированных мышей SCID, приводя к уровням защиты, сравнимым с уровнями, придаваемыми БЦЖ, у мышей и более высокой защите, чем БЦЖ, у морских свинок.
Ген phoP вместе с phoR образует часть двухкомпонентной системы, демонстрирующей высокую степень сходства с другими двухкомпонентными системами, контролирующими транскрипцию ключевых генов вирулентности во внутриклеточных патогенах. Он также контролирует экспрессию многих других генов, не вовлеченных в вирулентность напрямую. Groisman, E. A. The pleiotropic two-component regulatory system PhoP-PhoQ. J Bacteriol 2001, 183(6), 1835-1842. Элиминация генов вирулентности, по-видимому, сама по себе не является единственным способом аттенуации M. tuberculosis. Показано, что пантотенат-ауксотрофный мутант M. tuberculosis, неспособный к синтезу de novo пантотеновой кислоты, персистировал в мышах SCID, не вызывая заболевание. Sambandamurthy, V. K., Wang, X., Chen, B. et al. A pantothenate auxotroph of M. tuberculosis is highly attenuated and protects mice against tuberculosis. Nat Med 2002, 8(10), 1171-1174. Отдельные лейциновые ауксотрофы также сильно аттенуированы и неспособны к репликации in vivo в мышах SCID. Hondalus, M. K., Bardarov, S., Russell, R., Chan, J., Jacobs, W. R., Jr. & Bloom, B. R. Attenuation of and protection induced by leucine auxotroph of M. tuberculosis. Infect Immun 2000, 68(5), 2888-2898. Таким образом, в настоящее время, как правило, принят принцип, согласно которому вакцинные штаммы на основе M. tuberculosis можно успешно аттенуировать при сохранении генов, супрессированных в БЦЖ M. bovis.
До описанного в патенте США № US 8287886 B2, поиск более эффективных вакцин, чем БЦЖ, был основан на наблюдении о том, что потеря вирулентности БЦЖ сама по себе являлась фактором, вносящим вклад в отсутствие полной эффективности защиты. Behr, M. A., Wilson, M. A., Gill, W. P. et al. Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray. Science 1999, 284(5419), 1520-1523. Таким образом, был сделан вывод о том, что новые аттенуированные мутанты M. tuberculosis с меньшей вирулентностью могут быть более эффективными в качестве вакцин. В связи с этим, хотя было показано, что природная инфекция M. tuberculosis и вакцинация БЦЖ не отличаются по своей способности вызывать защитный иммунитет против туберкулеза (Sampson, S. L., Dascher, C. C., Sambandamurthy, V. K. et al. Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of M. tuberculosis in guinea pigs. Infect Immun 2004, 72(5), 3031-3037), инфицированные M. tuberculosis индивидуумы с латентным туберкулезом имеют на 79% меньший риск прогрессирующего туберкулеза после повторного инфицирования по сравнению с неинфицированными индивидуумами (Andrews 2012. CID 54:784-790). Кроме того, и учитывая тот факт, что большинство из этих индивидуумов могут быть вакцинированы БЦЖ, на практике это свидетельствует о том, что может иметь место различие в защитном иммунитете, обеспечиваемом БЦЖ и M. tuberculosis. Это вызывает вопросы о том, можно ли улучшить БЦЖ посредством рациональной аттенуации M. tuberculosis. В этом контексте особое значение имеет наблюдение того, что мутантный штамм M. tuberculosis, описанный в патенте США № US 8287886 B2, с комбинацией 2 независимых мутаций, связанных с синтезом белка PhoP и синтезом PDIM, является более аттенуированным, чем БЦЖ в модели на мышах SCID даже при использовании дозы, в 10 раз более высокой, чем у БЦЖ, и имеет более высокую степень защиты, чем БЦЖ, в модели на морских свинках.
Мутантный штамм M. tuberculosis, описанный в патенте США № US 8287886 B2, отличается тем, что является выделенным микроорганизмом, принадлежащим к роду Mycobacterium, включающим инактивацию гена Rv 0757 (phoP) и инактивацию второго гена, предотвращающую продукцию PDIM (фтиоцеролдимикоцерозатов). В частности, такой мутантный штамм M. tuberculosis, описанный в патенте США № US 8287886 B2 (штамм SO2), отличается тем, что включает инактивацию гена Rv 0757 (phoP) и вторую независимую мутацию phoP, предотвращающую продукцию PDIM.
Необходимо отметить, что, как описано в патенте США № US 8287886 B2, штамм SO2 не считали токсичным для шести морских свинок, которым инокулировали 50-кратную дозу вакцины для этого биологического вида. Кроме того, исследовали их коэффициент выживаемости и кривую массы. Коэффициент выживаемости составлял 100% после 6-месячного эксперимента. На фиг. 12 из патента США № US 8287886 B2 показано наблюдаемое увеличение массы у всех животных в течение 6 месяцев, что свидетельствует о нетоксичности штамма SO2 (Y=масса в граммах и X=время инфекции в неделях). Кроме того, в патенте США № US 8287886 B2 также исследовали коэффициент выживаемости вакцинированных морских свинок после инфекции M. tuberculosis (фиг. 13). В исследовании защиты на морских свинках отслеживали коэффициент выживаемости после 300 дней. Строили кривую коэффициента выживаемости для невакцинированных морских свинок (физиологический раствор) и морских свинок, вакцинированных существующей вакциной БЦЖ, штаммом M. tuberculosis phoP− или штаммом SO2 (мутантом phoP− и PDIM−). После подкожной вакцинации животных инфицировали вирулентным штаммом M. tuberculosis (H37Rv) в высокой дозе для исследования коэффициента выживаемости. Через 60 дней 6 морских свинок, которых не вакцинировали (вводили физиологический раствор), умерли, в то время как группы, вакцинированные штаммом SO2, phoP− и БЦЖ, выжили. Через 300 дней инфекции 3 морские свинки, вакцинированные БЦЖ и phoP−, умерли, в то время как в группах, вакцинированных штаммом SO2, умерла лишь одна морская свинка, что свидетельствует о том, что защита в случае мутанта phoP схожа с таковой в случае существующей вакцины БЦЖ, в то время как вакцинация штаммом SO2, двойным мутантом phoP− и PDIM−, обеспечивала лучшую защиту в модели на морских свинках. Кроме того, на фиг. 14 из патента США № US 8287886 B2 показана выживаемость после 400 дней у морских свинок, отслеживание которых показано на фиг. 13. 6 невакцинированных морских свинок умерли через 60 дней. Через 400 дней инфекции 3 морские свинки из группы, вакцинированной штаммом SO2 (фиг. 14 a), выжили, в то время как только 1 морская свинка, вакцинированная БЦЖ (фиг. 14 a и фиг. 14 b) и phoP− (фиг. 14 b), выжила, что также свидетельствует о том, что защита в случае мутанта phoP является схожей с таковой в случае БЦЖ, в то время как вакцинация штаммом SO2, двойным мутантом phoP− и PDIM−, обеспечивала лучшую защиту после 400 дней эксперимента.
В заключение, результаты, описанные в патенте США № US 8287886 B2, свидетельствуют о том, что штамм SO2 и, таким образом, микроорганизм, принадлежащий к роду Mycobacterium (в частности, из комплекса M. tuberculosis), с фенотипом PhoP− PDIM− является более эффективной вакциной, чем БЦЖ в соответствии с рядом критериев. Она является более аттенуированной, чем БЦЖ у мышей SCID, обеспечивает мышей защитным иммунитетом, являющимся по меньшей мере настолько же хорошим, насколько и в случае БЦЖ, и вызывает более сильные клеточные иммунные ответы. Кроме того, в экспериментах, проведенных на морских свинках, по исследованию защиты против инфекции высокими дозами штамм H37Rv с фенотипом PDIM− PhoP− приводит к коэффициенту выживаемости морских свинок 100% в условиях, в которых в случае БЦЖ достигали коэффициента выживаемости лишь 33%. Эта защита связана с уменьшением тяжести заболевания и бактериальной нагрузки.
В свете этих результатов, авторы настоящего изобретения приступили к разработке живой аттенуированной вакцины M. tuberculosis, содержащей штамм MTBVAC, находящийся в виде лиофилизированного осадка во флаконах из янтарного стекла объемом 3 мл. Как уже указано, штамм MTBVAC конструировали так, чтобы он содержал две независимые необратимые делеции, не имел маркеров резистентности к антибиотикам, соответствовал требованиям безопасности Женевского соглашения. В связи с этим, штамм MTBVAC генетически конструировали так, чтобы он фенотипически и функционально напоминал свой прототип SO2. В штамме MTBVAC встраивание немаркированной делеции fadD26 обеспечивает генетически стабильное устранение биосинтеза PDIM. Необходимо отметить, что SO2 обладает подробной и полной доклинической историей, демонстрирующей устойчивую безопасность, профиль аттенуации и многообещающую эффективность по сравнению с БЦЖ в соответствующих моделях на животных. Как уже указано, большинство этих доклинических исследований воспроизводили с использованием MTBVAC для подтверждения функционального профиля и биологической активности двойного аттенуированного PhoP-/PDIM--дефектного фенотипа.
С учетом указанного выше, авторы настоящего изобретения получали вакцину, содержащую штамм MTBVAC. Одну дозу 0,05 мл указанной вакцины вводили новорожденным с использованием внутрикожного пути, аналогично БЦЖ. Таким образом, первой целью авторов настоящего изобретения являлось получение, предпочтительно лиофилизированной, вакцины, которую можно использовать для новорожденных для лечения или профилактики TB в этой конкретной возрастной группе популяции. Учитывая это, авторы настоящего изобретения проводили эксперименты на новорожденных, описанные в примерах 2 и 3 настоящей заявки, где, в результате этих экспериментов, делали вывод о том, что вакцинация с использованием MTBVAC в приблизительной дозе 2,5×104 или 2,5×105 или более КОЕ являлась иммуногенной для новорожденных из TB-эндемичных условий.
Необходимо отметить, что в настоящей заявке термин "новорожденные" означает новорожденного ребенка (или другого млекопитающего) или младенца возрастом менее четырех недель.
В силу указанных выше результатов, авторы настоящего изобретения в настоящее время приступили к рандомизированному контролируемому исследованию фазы 2a для определения дозы, безопасности и иммуногенности MTBVAC на здоровых, неподвергавшихся введению БЦЖ, ВИЧ-отрицательных новорожденных из Южной Африки. Это исследование будут осуществлять на выборке из девяносто девяти ВИЧ-отрицательных, неподвергавшихся введению БЦЖ новорожденных без известного воздействия M. tuberculosis в домашних условиях. Приблизительная продолжительность исследования (от вакцинации первого участника до завершения сбора данных) будет составлять приблизительно 36 месяцев. В этом исследовании MTBVAC будут вводить новорожденным при трех уровнях доз: 1,5-8,5×104 КОЕ/0,05 мл, 1,5-8,5×105 КОЕ/0,05 мл и 1,5-8,5×106 КОЕ/0,05 мл. Активным контролем является вакцина БЦЖ. Участникам будут вводить одну дозу MTBVAC или БЦЖ, вводимых внутрикожно в день исследования 0. Цели исследования являлись следующими:
Первичные:
Оценка безопасности и реактогенности MTBVAC при повышении уровней доз по сравнению с вакциной БЦЖ на здоровых, неподвергавшихся введению БЦЖ, ВИЧ-отрицательных новорожденных из Южной Африки.
Оценка иммуногенности MTBVAC при повышении уровней доз на здоровых, неподвергавшихся введению БЦЖ, ВИЧ-отрицательных новорожденных из Южной Африки.
Вторичные:
Оценка коэффициент конверсии в анализе QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT) у новорожденных, подвергнутых повышению уровней доз MTBVAC.
Исследовательские:
Оценка различий рестриктированных по главному комплексу гистосовместимости (MHC) T-клеточных ответов, индуцируемых при вакцинации MTBVAC и БЦЖ.
Оценка различий ответов нерестриктированных по донору T-клеток, индуцируемых при вакцинации MTBVAC и БЦЖ.
Учитывая тот факт, что в примерах 2 и 3 уже указано, что вакцинация MTBVAC в приблизительных дозах 2,5×104 или 2,5×105 КОЕ или более являлась иммуногенной у новорожденных из TB-эндемичных условий, и что реактогенность вакцины MTBVAC была очевидно ниже, чем реактогенность вакцины БЦЖ, представляется вероятным, что введение MTBVAC новорожденным в дозах 1,5-8,5×104 КОЕ/0,05 мл, 1,5-8,5×105 КОЕ/0,05 мл или 1,5-8,5×106 КОЕ/0,05 мл можно использовать в качестве профилактического средства для новорожденных, имеющих риск инфекции M. tuberculosis или риск развития туберкулеза.
Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей выделенный микроорганизм, принадлежащих к комплексу M. tuberculosis, предпочтительно - клинический изолят M. tuberculosis, более предпочтительно - клинический изолят M. tuberculosis, отличающийся тем, что имеет фенотип PhoP− в результате инактивации посредством генетической делеции гена Rv0757 и делецию второго гена, Rv2930 (fadD26), предотвращающую продукцию PDIM (фенотип PDIM−), более предпочтительно, указанный микроорганизм является штаммом MTBVAC, где композиция содержит по меньшей мере 1,5×104 КОЕ/0,05 мл выделенных микроорганизмов или более. Предпочтительно, композиция содержит от 1,5×104 КОЕ/0,05 мл до 8,5×106 КОЕ/0,05 мл выделенных микроорганизмов. Более предпочтительно, композиция содержит 1,5-8,5×104 КОЕ/0,05 мл, или 1,5-8,5×105 КОЕ/0,05 мл, или 1,5-8,5×106 КОЕ/0,05 мл выделенных микроорганизмов.
Во втором аспекте изобретения композицию по первому аспекту вводят для профилактики у новорожденных, имеющих риск инфекции M. tuberculosis или имеющих риск развития туберкулеза, против инфекций, вызываемых комплексом M. tuberculosis, предпочтительно - M. tuberculosis; или для применения в профилактике у новорожденных людей, имеющих риск развития туберкулеза и страдающих латентной туберкулезной инфекцией, против развития клинической симптоматики, ассоциированной с активной формой заболевания, вызываемого комплексом M. tuberculosis, предпочтительно - M. tuberculosis; или для применения в качестве вторичных средств для лечения пациентов, имеющих латентную и/или активную инфекцию TB, среди новорожденных; или для применения в ревакцинации, бустерной вакцинации или бустерной дозе при профилактическом лечении новорожденных людей, имеющих риск инфекции M. tuberculosis, против инфекций, вызываемых комплексом M. tuberculosis, предпочтительно - M. tuberculosis; или для применения в качестве вторичных средств для профилактики любых неродственных инфекций, иных, чем туберкулез, вызываемый M. tuberculosis, включая инфекции нетуберкулезных микобактерий у новорожденных. Более предпочтительно, указанную композицию вводят новорожденным внутрикожным путем.
В дополнение к изложенному выше, следует отметить, что авторы настоящего изобретения в настоящее время проводят двойное слепое, рандомизированное, БЦЖ-контролируемое исследование безопасности и иммуногенности с повышением дозы на взрослых с латентной туберкулезной инфекцией (LTBI) и без нее, что измеряют с помощью анализа QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT). Оно является двойным слепым, рандомизированным, БЦЖ-контролируемым исследованием фазы 1b/2a безопасности и иммуногенности с повышением дозы на здоровых взрослых с LTBI и без нее. Все участников ранее подвергали вакцинации БЦЖ в младенчестве. Исследовательским продуктом является MTBVAC при четырех уровнях доз: 5×103 КОЕ, 5×104 КОЕ, 5×105 КОЕ и 5×106 КОЕ. Активным контролем является БЦЖ (5×105 КОЕ).
Участников, соответствующих критериям включения/исключения, будут рандомизировать по когортам для введения одной дозы MTBVAC или ревакцинации БЦЖ, вводимых внутрикожно в день исследования 0. Исследование будут проводить в одном центре в Южной Африке. Участников будут включать в одну из восьми когорт и отслеживать контрольные точки безопасности и иммуногенности до дня исследования 182. Приблизительное время до завершения включения составляет приблизительно 9 месяцев.
Когорты 1-8 будут включать QFT-отрицательных (когорты 1-4) и QFT-положительных (когорты 5-8) участников. Участников будут рандомизировать в каждой когорте для введения MTBVAC или БЦЖ.
С учетом этого, в третьем аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей выделенный микроорганизм, принадлежащий к комплексу M. tuberculosis, предпочтительно - клинический изолят M. tuberculosis, более предпочтительно - клинический изолят MT103 M. tuberculosis, отличающийся тем, что содержит фенотип PhoP− в результате инактивации посредством генетической делеции гена Rv0757 и делеции второго гена, Rv2930 (fadD26), предотвращающей продукцию PDIM (фенотип PDIM−),более предпочтительно - указанный микроорганизм является штаммом MTBVAC, где композиция содержит по меньшей мере 3×103 КОЕ/0,1 мл выделенных микроорганизмов или более. Предпочтительно, композиция содержит от 3×103 КОЕ/0,1 мл до 17×106 КОЕ/0,1 мл выделенных микроорганизмов. Более предпочтительно, композиция содержит 3-17×103 КОЕ/0,1 мл, или 3-17×104 КОЕ/0,1 мл, или 3-17×105 КОЕ/0,1 мл, или 3-17×106 КОЕ/0,1 мл выделенных микроорганизмов.
В четвертом аспекте изобретения композицию по третьему аспекту вводят для профилактики (включая бустерную вакцинацию) у людей, не являющихся новорожденными, таких как дети, подростки и взрослые, имеющих риск инфекции M. tuberculosis, против инфекций, вызываемых комплексом M. tuberculosis, предпочтительно - M. tuberculosis. Более предпочтительно, указанную композицию вводят внутрикожным путем.
В пятом аспекте изобретения композицию по третьему аспекту вводят для профилактики у людей, не являющихся новорожденными, таких как дети, подростки и взрослые, имеющих риск развития туберкулеза и страдающих латентной туберкулезной инфекцией, против развития клинической симптоматики, ассоциированной с активной формой заболевания, вызываемого комплексом M. tuberculosis, предпочтительно - M. tuberculosis. Более предпочтительно, указанную композицию вводят внутрикожным путем.
В шестом аспекте изобретения композицию по третьему аспекту вводят для применения в качестве вторичных средств для лечения пациентов, имеющих латентную и/или активную инфекцию TB, среди новорожденных и людей, не являющихся новорожденными, таких как дети, подростки и взрослые. Более предпочтительно, указанную композицию вводят внутрикожным путем.
В седьмом аспекте изобретения композицию по третьему аспекту вводят для бустерной вакцинации или бустерной дозы при профилактическом лечении людей, не являющихся новорожденными, таких как дети, подростки и взрослые, имеющих риск инфекции M. tuberculosis, против инфекций, вызываемых комплексом M. tuberculosis, предпочтительно - M. tuberculosis. В связи с этим, необходимо отметить, что после исходной иммунизации бустерная инъекция или бустерная доза представляет собой повторное воздействие иммунизирующего антигена. Она предназначена для повышения иммунитета против этого антигена обратно до протективных уровней после снижения памяти против этого антигена с течением времени.
С другой стороны, для разработки предпочтительного способа практического осуществления указанных выше аспектов изобретения с использованием штамма MTBVAC и минимизации потери жизнеспособности после лиофилизации при разработке, приводящей к получению постоянного результата и продукта со сроком годности по меньшей мере 2 года при хранении при +2-8°C, авторы настоящего изобретения осуществляли ряд исследований для определения наиболее подходящего способа получения вакцины MTBVAC. При первом приближении, тестировали различные среды для культивирования, а также различные композиции стабилизаторов.
Первой проблемой при получении вакцины MTBVAC являлось культивирование в среде с определенной композицией, в которой отсутствовали компоненты животного происхождения. По этой причине эксперименты осуществляли с использованием штамма SO2. Необходимо отметить, что штамм MTBVAC генетически конструировали так, чтобы фенотипически и функционально он напоминал свой прототип SO2, и, таким образом, штамм SO2 считали подходящей начальной точкой для разработки наиболее подходящего способа получения вакцины MTBVAC.
Используя штамм SO2, разрабатывали и тестировали разные среды, не содержащие какие-либо компоненты животного происхождения в своей композиции. Некоторые из известных сред для культивирования являлись следующими:
• среда Миддлбрука 7H9 и ее варианты (Media for Tubercle Bacilli, Dubos, R.J. and Middlebrook, G. American Review of Tuberculosis and Pulmonary Diseases, 1947 Vol. 56 No.4 pp. 334-45 ref.15).
• синтетическая среда Сатона (Handbook of Microbiological Media, Fourth Edition, Ronald M. Atlas, CRC Press, 2010. Page 1540) и ее варианты.
Композиции среды Сатона и среды Миддлбрука подробно представлены в следующих таблицах:
Таблица 1
| Среда Сатона | |
| Глицерин | 2% |
| L-аспарагин | 0,4% |
| Глюкоза | 0,2% |
| Лимонная кислота | 0,2% |
| Дигидроортофосфат калия | 0,05% |
| Сульфат магния | 0,055% |
| Полисорбат 80 | 0,0155% |
| Цитрат железа (III)-аммония | 0,005% |
| Сульфат цинка | 0,00001% |
Таблица 2
| Среда Миддлбрука 7H9 +ADC+Полисорбат | |
| Гидрофосфат натрия | 2,5 г/л |
| Дигидроортофосфат калия | 1,0 г/л |
| Глутаминовая кислота | 0,5 г/л |
| Сульфат аммония | 0,5 г/л |
| Цитрат натрия | 0,1 г/л |
| Сульфат магния | 50,0 мг/л |
| Цитрат железа (III)-аммония | 40,0 мг/л |
| Сульфат цинка | 1,0 мг/л |
| Сульфат меди | 1,0 мг/л |
| Пиридоксин | 1,0 мг/л |
| Хлорид кальция | 0,5 мг/л |
| Биотин | 0,5 мг/л |
| Глицерин | 2,0 мл/L |
| Бычий сывороточный альбумин | 5,0 г/л |
| Декстроза | 2,0 г/л |
| Каталаза | 3,0 мг/л |
| Полисорбат 80 | 0,5 г/л |
В среде Сатона рост являлся схожим с ростом в референсной среде (среде Миддлбрука без модификаций, таблица 2). На фигуре 1 показано сравнение кривой роста в среде Миддлбрука с кривой роста в среде Сатона. Параллельно композиции среды для культивирования, в этих тестах начинают профилировать другие переменные в лабораторном масштабе, такие как время культивирования, количество пассажей культуры и тип выращивания, статический или при встряхивании (см. таблицу 3).
| Выращивание M. tuberculosis SO2 в среде Сатона | ||||||||
| Условия культивирования | Статический рост | Встряхивание | ||||||
| Серия | 006 | 008 | 005 | 009 | 011 | 007 | 010 | 012 |
| Дни культивирования | 7 | 10 | 15 | 23 | 24 | 28 | 24 | 31 |
| Количество жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) | 9,70×107 | 3,00×108 | 1,91×108 | 1,25×108 | 1,69×108 | 4,70×108 | 3,30×106 | 5,10×106 |
| Оптическая плотность (600 нм) | 0,475 | 0,666 | 1,86 | 2,56 | 2,17 | 2,92 | 0,408 | 0,198 |
Таблица 3. Выращивание M. tuberculosis SO2 в среде Сатона
В конечном итоге, синтетическую среду Сатона выбирали для статических условий выращивания, т.к. она подходит для выращивания штамма SO2. Также можно выбирать нестатические условия выращивания, однако, необходимо, чтобы культура находилась в аэробных условиях.
Следующей стадией разработки являлось исследование способа лиофилизации. Лиофилизация является критической стадией получения живой вакцины. Достижение стабильности лиофилизированных вакцин является комплексным процессом, т.к. микроорганизмы не только восприимчивы к факторам внешней среды после лиофилизации, таким как температура, но и условия выращивания и составления также могут влиять на успех способа. На выход жизнеспособных бактерий после лиофилизации и стабильность при последующем хранении могут влиять такие факторы, как цикл лиофилизации, композиция стабилизатора, остаточная влажность и присутствие воздуха.
В фазе разработки с использованием SO2 тестировали до 11 разных композиций стабилизаторов. В следующей таблице приведены тестируемые композиции стабилизаторов:
Таблица 4
| Стабилизатор | Компоненты | Концентрация |
| S | Среда (без стабилизатора) | NA |
| G | Глутамат натрия | 10-40 г/л |
| GSA | Глутамат натрия | 10-40 г/л |
| Сахароза | 100-400 г/л | |
| M | Маннит | 20-50 г/л |
| MS | Маннит | 20-50 г/л |
| Сахароза | 100-400 г/л | |
| GSM | Глутамат натрия | 10-40 г/л |
| Сахароза | 100-400 г/л | |
| Маннит | 20-50 г/л | |
| GC | Гликокол | 30-200 г/л |
| Трицитрат натрия | 30-40 г/л | |
| GSb | Гликокол | 30-200 г/л |
| Сахароза | 100-400 г/л | |
| GT | Гликокол | 30-200 г/л |
| Трегалоза | 18-60 г/л | |
| CGS | Трицитрат натрия | 30-40 г/л |
| Гликокол | 30-200 г/л | |
| Сахароза | 100-400 г/л | |
| CFT | Хлорид натрия | 2-5 г/л |
| Дигидроортофосфат калия | 2-5 г/л | |
| Трегалоза | 60 г/л |
В исследованиях стабилизаторов также тестировали разные составы, в которых, в дополнение к композициям, варьировали доли стабилизатора и среды для культивирования, а также объем для лиофилизации. Во всех партиях определяли потерю жизнеспособности в лиофилизированном продукте и стабильность после 30 дней при 37°C. В качестве критерия выбора стабилизаторов для последующих тестов использовали предел потери жизнеспособности 90% и/или максимум 80% потери после ускоренного анализа стабильности при 37°C (см. результаты в таблице 5).
Таблица 5 Лиофилизация SO2 с использованием разных стабилизаторов.
| Партия | Стабилизатор | ||||||||||||
| Описание | GSA | G | GSM | M | MS | GSB | GC | GS | CGS | CFT | GT | S | |
| 005 | % потери при лиофилизации | 29% | 53% | 84% | |||||||||
| % потери при 37°C | 90% | >99% | >99% | ||||||||||
| 006 | % потери при лиофилизации | 7,40% | 10% | 8% | 66% | 5,00% | >99% | ||||||
| % потери при 37°C | 87% | 61% | 66% | 99% | 97,7% | ND | |||||||
| 007 | % потери при лиофилизации | 65% | 53% | 99% | |||||||||
| % потери при 37°C | 98,5% | 92,3% | >99% | ||||||||||
| 008 | % потери при лиофилизации | 24% | 12% | 67% | |||||||||
| % потери при 37°C | 88% | 88% | >99% | ||||||||||
| 009 | % потери при лиофилизации | 31% | 20% | 77% | |||||||||
| % потери при 37°C | 85% | >99% | >99% | ||||||||||
| 010 | % потери при лиофилизации | 70% | 91% | 54% | 79% | ||||||||
| % потери при 37°C | 88,5% | >99% | >99% | >99% | |||||||||
| 011 | % потери при лиофилизации | 9,40% | 61% | ||||||||||
| % потери при 37°C | 57% | >99% | |||||||||||
| 012 | % потери при лиофилизации | 84% | 97% | 95% | 98% | >99% | |||||||
| % потери при 37°C | >99% | >99% | >99% | >99% | >99% |
После указанных выше предварительных испытаний был сделан вывод о том, что в среду для культивирования необходимо добавлять стабилизатор для лиофилизации, т.к. потери при лиофилизации без стабилизатора составляли более 99%, и лучшим стабилизатором, соответствующим требованиям к потере при лиофилизации и ускоренным исследованиям стабильности при 37°C, являлся GSA (глутамат натрия и сахароза).
После того, как было сделано указанное выше заключение, штамм MTBVAC получали в форме лиофилизированной предосновной серии посевного материала, и вскоре после этого авторы настоящего изобретения начинали культивирование клеток этого конкретного штамма. Для выращивания штамма MTBVAC использовали первую среду Сатона с той же композицией, которую использовали в исследованиях по выращиванию родительского штамма SO2 (см. таблицу 1). Однако в случае MTBVAC неожиданно наблюдали более низкий рост в синтетической среде Сатона, чем в случае штамма SO2. Кроме того, также определяли проблемы в фазе амплификации штамма MTBVAC. Для решения этих проблем проводили тесты, добавляя и удаляя компоненты из композиции среды Сатона. Такие модификации заключались в добавлении или удалении добавок, таких как глюкоза, сульфат цинка, биотин, глицерин и полисорбат.
Обогащение синтетической среды Сатона сульфатом цинка и биотином не приводило к хорошим результатам, и не наблюдали роста MTBVAC. В случае обогащения глюкозой, полисорбатом и глицерином результаты являлись благоприятными, и наблюдали достаточный рост MTBVAC.
В результате этих исследований роста разработали среды SD и SDG и выращивали культуры MTBVAC в этих средах. Рост MTBVAC был хорошим и в среде SD, и в среде SDG, но рост некоторых культур останавливался после успешных пассажей в среде SDG, поэтому для амплификационных пассажей выбирали среду SD. На фигуре 2 показаны результаты OD для культур MTBVAC в среде Сатона и средах SD и SDG.
Однако, когда культуры штамма MTBVAC инициировали из флаконов лиофилизированной основной серии посевного материала, наблюдали невозможность инициации роста в среде SD, поэтому модифицировали ее композицию и разрабатывали посевную среду. В заключение этих исследований и для будущих пилотных и промышленных тестов в качестве средства для инициации культуры выбирали посевную среду, в качестве средства для амплификационных пассажей выбирали среду SD и в качестве средства для массового культивирования перед лиофилизацией выбирали среду SDG. Кроме того, необходимо отметить, что композиция среды SD в комбинации со стабилизатором влияла на лиофилизацию и внешний вид таблетки, таким образом, лиофилизацию будут осуществлять только в среде SDG.
В настоящем описании приведена композиция посевной среды и сред SD и SDG.
Таблица 6
| Компоненты | Посевная среда | Среда SD | Среда SDG |
| L-аспарагин | 2,00-4,00 г | 2,00-4,00 г | 2,00-4,00 г |
| Дигидроортофосфат калия | 0,30-0,60 г | 0,30-0,60 г | 0,30-0,60 г |
| Сульфат магния H2O | 0,5-0,70 г | 0,50-0,70 г | 0,50-0,70 г |
| Цитрат железа (III)-аммония | 0,02-0,05 г | 0,02-0,05 г | 0,02-0,05 г |
| Моногидрат декстрозы | 7,00-8,00 г | 3,00-4,00 г | 3,00-4,00 г |
| Глицерин | 10,0-20,0 мл | 30-40 мл | 3,0-10,0 мл |
| Лимонная кислота | 1,5-2,0 г | 1,5-2 г | 1,5-2 г |
| Полисорбат 80 | 0,15-0,5 мл | 0,15-0,5 мл | |
| Очищенная вода в достаточном количестве |
В связи с этим, в следующих трех таблицах показаны результаты получения пяти партий MTBVAC 2,5×105 в промышленных масштабах, где показана согласованность результатов, полученных с использованием средств, разработанных в ходе исследования.
Таблица 7: Культура MTBVAC из лиофилизированного рабочего посевного банка в посевной среде
| Контроль | Серия 170928 | Серия 170580 | Серия 171811 | Серия 171911 | Серия 172547 |
| Внешний вид культуры | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий |
| Чистота (EP 2.6.1) | Отсутствие контаминации | Отсутствие контаминации | Отсутствие контаминации | Отсутствие контаминации | Отсутствие контаминации |
| Чистота (по Цилю-Нильсену) | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы |
| Количество жизнеспособных бактерий | 1,37×106 КОЕ/мл | 5,3×106 КОЕ/мл | 5,4×106 КОЕ/мл | 7,5×106 КОЕ/мл | 1×106 КОЕ/мл |
Таблица 8: Культура MTBVAC в среде SD из предыдущего пассажа (таблица 7)
| Контроль | Серия 170928 | Серия 170580 | Серия 171811 | Серия 171911 | Серия 172547 |
| Внешний вид культуры | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий |
| Чистота (EP 2.6.1) | Отсутствие контаминации | Отсутствие контаминации | Отсутствие контаминации | Отсутствие контаминации | Отсутствие контаминации |
| Чистота (по Цилю-Нильсену) | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы |
| Количество жизнеспособных бактерий | 6,04×108 КОЕ/мл | 4,33×108 КОЕ/мл | 1,16×108 КОЕ/мл | 3,16×108 КОЕ/мл | 3,26×108 КОЕ/мл |
Таблица 9: Культура MTBVAC в среде SD из предыдущего пассажа (таблица 8)
| Контроль | Серия 170928 | Серия 170580 | Серия 171811 | Серия 171911 | Серия 172547 |
| Внешний вид культуры | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий |
| Чистота (EP 2.6.1) | Отсутствие контаминации | Отсутствие контаминации | Отсутствие контаминации | Отсутствие контаминации | Отсутствие контаминации |
| Чистота (по Цилю-Нильсену) | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы |
| Количество жизнеспособных бактерий | 1,73×108 КОЕ/мл | 3,03×108 КОЕ/мл | 3,02×108 КОЕ/мл | 1,27×108 КОЕ/мл | 3,7×108 КОЕ/мл |
Таблица 10: Культура MTBVAC в среде SDG из предыдущего пассажа (таблица 9)
| Контроль | Серия 170928 | Серия 170580 | Серия 171811 | Серия 171911 | Серия 172547 |
| Внешний вид культуры | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий |
| Чистота (EP 2.6.1) | Отсутствие контаминации | Отсутствие контаминации | Отсутствие контаминации | Отсутствие контаминации | Отсутствие контаминации |
| Чистота (по Цилю-Нильсену) | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы |
| Количество жизнеспособных бактерий | 7,1×108 КОЕ/мл | 4,33×108 КОЕ/мл | 4,51×108 КОЕ/мл | 2,77×108 КОЕ/мл | 3,26×108 КОЕ/мл |
В указанных предыдущих исследованиях с использованием штамма SO2 авторы настоящего изобретения делали вывод о том, что при лиофилизации необходимо использовать стабилизатор для снижения потерь количества жизнеспособных бактерий и для улучшения стабильности лиофилизированного продукта. Для разработки MTBVAC использовали те же стабилизаторы, которые выбирали в исследованиях с использованием SO2. Целью являлось получение лиофилизированной вакцины с концентрацией в диапазоне от 3×103 КОЕ/0,1 мл до 17×106 КОЕ/0,1 мл, предпочтительно - в диапазоне 3-17×103 КОЕ/0,1 мл, или 3-17×104 КОЕ/0,1 мл, или 3-17×105 КОЕ/0,1 мл, или 3-17×106 КОЕ/0,1 мл штамма MTBVAC при минимизации потери жизнеспособности после лиофилизации при разработке, что позволило бы получать согласованные результаты и продукт со сроком годности по меньшей мере 2 года при хранении при 2-8°C.
В фазе разработки с использованием MTBVAC тестировали до 7 разных композиций стабилизатора. В следующей таблице 11 приведены тестируемые композиции стабилизаторов:
Таблица 11
| Стабилизатор | Компоненты | Концентрация |
| S | Среда (без стабилизатора) | NA |
| GSA | Глутамат натрия | 10-40 г/л |
| Сахароза | 100 -400 г/л | |
| GSM | Глутамат натрия | 10-40 г/л |
| Сахароза | 100-400 г/л | |
| Маннит | 20-50 г/л | |
| GSb | Гликокол | 30-200 г/л |
| Сахароза | 100-400 г/л | |
| GT | Гликокол | 30-200 г/л |
| Трегалоза | 18-60 г/л | |
| GTS | Трегалоза | 30-60 г/л |
| Гликокол | 40-100 г/л | |
| Сахароза | 75-200 г/л | |
| GSTG | Глутамат натрия | 10-40 г/л |
| Гликокол | 75-150 г/л | |
| Сахароза | 75-200 г/л | |
| Трегалоза | 15-60 г/л |
В следующих ниже таблицах 12 и 13 представлены результаты в терминах процента потери жизнеспособности в ускоренном исследовании стабильности при тестировании лиофилизации MTBVAC лабораторного масштаба. В таблицах ниже показан эффект композиции среды для лиофилизации в комбинации со стабилизатором при лиофилизации. В этих исследованиях был сделан вывод о том, что для лиофилизации MTBVAC необходимо добавлять стабилизатор, и что стабилизатор GSA обеспечивает лучшие результаты в отношении тестируемых параметров.
| Партия | GSA | GSB | GSM | GT | S |
| 001 | 73% | 97% | >99% | ||
| 005 | >99% | ||||
| 009 | >99% | >99% | |||
| 011 | >99% | ||||
| 012 | >99% | ||||
| 013 | >99% | >99% | >99% | ||
| 014 | >99% | >99% |
Таблица 12. Лиофилизация MTBVAC, выращенных в среде SD, с использованием разных стабилизаторов. Процент потери жизнеспособности в ускоренном исследовании стабильности.
| Партия | GSA | GSB | GSM | GTS | GT | GSTG | S |
| 002 | 61% | >99% | 60% | 98% | 98% | ||
| 003 | 62% | 77% | |||||
| 004 | 89% | >99% | >99% | ||||
| 005 | 73% | ||||||
| 006 | 59% | >99% | |||||
| 007 | 49% | 32% | 86% |
Таблица 13. Лиофилизация MTBVAC, выращенных в среде SDG, с использованием разных стабилизаторов. Процент потери жизнеспособности в ускоренном исследовании стабильности.
И наконец, в следующей таблице представлены результаты лиофилизации 4 партий MTBVAC:
Таблица 14
| Контроль | Описание | Серия 102897 | Серия 110142 | Серия 110238 | Серия 110380 |
| Внешний вид | Лиофилизированная пилюля | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий |
| Вакуум | Использован | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий |
| Чистота (EP 2.6.1) | Отсутствие контаминации | Соответствующая | Соответствующая | Соответствующая | Соответствующая |
| Остаточная влажность | <3% масс./масс. | 1,44% | 1,26% | 1,68% | 1,84% |
| Идентификация (ПЦР) | Молекулярная характеризация | Соответствующая | Соответствующая | Соответствующая | Соответствующая |
| Количество жизнеспособных клеток (КОЕ/флакон) | 3-17×106 КОЕ/флакон | 1,63×107 | 8,54×106 | 1,58×107 | 8,54×106 |
| Потеря при лиофилизации | <90% | 64% | 67% | 63% | 67% |
На фигуре 3 показаны результаты исследования стабильности при температуре от 2-8°C до -30°C серий или партий, указанных в таблице 14 выше. Кроме того, в следующей таблице 15 приведены дополнительные результаты в отношении параллельной лиофилизации культуры из таблицы 11 (среда SDG) в пилотном и промышленном исследовании.
Таблица 15
| Контроль | Описание | Лиофилизация серия | |||||
| 171437P | 171611In | 171889P | 171976In | 172952P | 172871IN | ||
| Серия культуры MTBVAC | 170928 | 170928 | 170580 | 170580 | 172547 | 172547 | |
| Внешний вид | Лиофилизированная пилюля | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий |
| Вакуум | Использован | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий |
| Чистота (EP 2.6.1) | Отсутствие контаминации | Соответствующая | Соответствующая | Соответствующая | Соответствующая | Соответствующая | Соответствующая |
| Остаточная влажность | <3% масс./масс. | 1,72 | 1,89 | 2,02 | 2,13 | 1,89 | 1,37 |
| Идентификация (ПЦР) | Молекулярная характеризация | Соответствующая | Соответствующая | Соответствующая | Соответствующая | Соответствующая | Соответствующая |
| Количество жизнеспособных клеток (КОЕ/флакон) | 3-17×106 КОЕ/флакон | 1,5×107 | 1,6×107 | 6,03×107 | 1,17×107 | 1,03×107 | 1,37×107 |
| Потеря при лиофилизации | <90% | 64% | 67% | 63% | 67% | 81,03% | 74,76% |
Все из указанных выше результатов получали посредством лиофилизации среды SDG, в которой выращивали штамм MTBVAC, предпочтительно - выращивали в диапазоне от 1×108 до 5×108 КОЕ/мл. Необходимо отметить, что для осуществления указанной лиофилизации добавляли глутамат натрия и сахарозу (GSA), предпочтительно, в концентрации 10-40 г/л глутамата натрия и 100-400 г/л сахарозы.
Таким образом, в настоящем описании представлены конкретные составы и способы, которые можно использовать для получения фармацевтических препаратов на основе живого штамма MTBVAC, как описано ниже. Составы по изобретению содержат или состоят из любых из композиций, подробно описанных ниже, и их можно использовать для культивирования штаммов MTBVAC. Композиции подробно описаны ниже:
| Компоненты | Посевная среда | Среда SD | Среда SDG | |||
| L-аспарагин | 2,00-4,00 | г | 2,00-4,00 | г | 2,00-4,00 | г |
| Дигидроортофосфат калия | 0,30-0,60 | г | 0,30-0,60 | г | 0,30-0,60 | г |
| Сульфат магния H2O | 0,5-0,70 | г | 0,50-0,70 | г | 0,50-0,70 | г |
| Цитрат железа (III)-аммония | 0,02-0,05 | г | 0,02-0,05 | г | 0,02-0,05 | г |
| Моногидрат декстрозы | 7,00-8,00 | г | 3,00-4,00 | г | 3,00-4,00 | г |
| Глицерин | 10,0-20,0 | мл | 30-40 | мл | 3,0-10,0 | мл |
| Лимонная кислота | 1,5-2,0 | г | 1,5-2 | г | 1,5-2 | г |
| Полисорбат 80 | 0,15-0,5 | мл | 0,15-0,5 | мл | ||
| Очищенная вода в достаточном количестве | 1,00 | л | 1,00 | л | 1,00 | л |
Таким образом, восьмой аспект изобретения относится к композиции, содержащей или состоящей из посевной среды, описанной выше.
Девятый аспект изобретения относится к композиции, содержащей или состоящей из среды SD, описанной выше.
Десятый аспект изобретения относится к композиции, содержащей или состоящей из среды SDG, описанной выше.
Одиннадцатый аспект изобретения относится к любой из посевной среды, среды SD или среды SDG, описанных выше, где указанная среда дополнительно содержит штаммы MTBVAC, выращенные в ней, предпочтительно - в диапазоне от 1×108 до 5×108 КОЕ/мл.
Двенадцатый аспект изобретения относится к применению любой из посевной среды, среды SD или среды SDG, описанных выше, для культивирования или выращивания штаммов MTBVAC в аэробных условиях. В связи с этим, предпочтительно, в качестве средства для инициации культуры штамма MTBVAC выбирают посевную среду, в качестве средств для амплификационных пассажей выбирают среду SD и в качестве средств для массового культивирования перед лиофилизацией выбирают среду SDG. В особенно предпочтительных вариантах осуществления двенадцатого аспекта изобретения настоящее изобретение относится к способу получения готовой лиофилизированной живой аттенуированной вакцинной композиции M. tuberculosis, содержащей выделенный микроорганизм, принадлежащий к штамму M. tuberculosis, имеющему i) фенотип PhoP− в результате инактивации посредством генетической делеции гена Rv0757 и ii) делецию второго гена, Rv2930 (fadD26), предотвращающую продукцию PDIM (фенотип PDIM−), более предпочтительно - штамму MTBVAC, где способ включает инициацию культуры штамма M. tuberculosis и выращивание или амплификацию указанных бактерий с использованием подходящей клеточной среды, где способ отличается тем, что для массового культивирования перед лиофилизацией используют среду SDG. Предпочтительно, способ включает инициацию культуры штамма M. tuberculosis в посевной среде и выращивание или амплификацию указанных бактерий с использованием среды SD и с использованием среды SDG для массового культивирования перед лиофилизацией. Более предпочтительно, способ дополнительно включает стадию лиофилизации посредством добавления сахарозы и глутамата натрия в качестве стабилизаторов в среду SDG, используемую для массового культивирования перед стадией лиофилизации.
Кроме того, обнаружено, что некоторые компоненты (например, конкретные стабилизаторы, объемообразующие средства и буферы) являются предпочтительными для получения лиофилизированных вакцин штаммов MTBVAC. Изобретение также относится к восстановленным вакцинам и профилактическим и терапевтическим способам, в которых используют композиции по настоящему изобретению. Композиции и способы по изобретению описаны далее.
В частности, тринадцатый аспект изобретения относится живой аттенуированной вакцинной композиции M. tuberculosis, содержащей выделенный микроорганизм, принадлежащий к штамму M. tuberculosis, имеющему i) фенотип PhoP− в результате инактивации посредством генетической делеции гена Rv0757 и ii) делецию второго гена, Rv2930 (fadD26), предотвращающую продукцию PDIM (фенотип PDIM−), предпочтительно, штамм M. tuberculosis является штаммом MTBVAC, где указанная композиция является лиофилизированной композицией, и где указанную композицию получают посредством лиофилизации среды для культивирования, содержащей микроорганизм, посредством добавления сахарозы и глутамата натрия в качестве стабилизаторов, и где среда для культивирования является средой SDG. Более предпочтительно, в тринадцатом аспекте настоящее изобретение относится к живой аттенуированной вакцинной композиции M. tuberculosis, содержащей выделенный микроорганизм, принадлежащий к штамму M. tuberculosis, имеющему i) фенотип PhoP− в результате инактивации посредством генетической делеции гена Rv0757 и ii) делецию второго гена, Rv2930 (fadD26), предотвращающую продукцию PDIM (фенотип PDIM−), где предпочтительно штамм M. tuberculosis является штаммом MTBVAC, и где указанную живую аттенуированную вакцинную композицию M. tuberculosis получают или могут получать способом по двенадцатому аспекту изобретения.
Еще более предпочтительно, настоящее изобретение относится к живой аттенуированной вакцинной композиции M. tuberculosis, предпочтительно - восстановленной композиции после лиофилизации, содержащей выделенный микроорганизм, принадлежащий к штамму M. tuberculosis, имеющему i) фенотип PhoP− в результате инактивации посредством генетической делеции гена Rv0757 и ii) делецию второго гена, Rv2930 (fadD26), предотвращающую продукцию PDIM (фенотип PDIM−), где, предпочтительно, штамм M. tuberculosis является штаммом MTBVAC, и где указанная композиция отличается тем, что содержит или состоит из следующих компонентов на мл (в процентах):
| Компоненты | MTBVAC Доза на 1 мл |
| L-аспарагин | 0,034-0,066% |
| Дигидроортофосфат калия | 0,006-0,010% |
| Сульфат магния H2O | 0,008-0,012% |
| Цитрат железа (III)-аммония | 0,0004-0,0008% |
| Моногидрат декстрозы | 0,05-0,066% |
| Глицерин | 0,00005-0,0001% |
| Лимонная кислота | 0,026-0,034% |
| Полисорбат 80 | 0,000002-0,000008% |
| Глутамат натрия | 0,33-1,33% |
| Сахароза | 3,3-13,3% |
| Очищенная вода в достаточном количестве | 1 мл |
Более предпочтительно, живая аттенуированная вакцинная композиция M. tuberculosis, описанная в абзаце выше, является лиофилизированной или восстановленной композицией, полученной посредством добавления воды, предпочтительно - стерилизованной воды для инъекции, в лиофилизированную композицию.
В предпочтительном варианте осуществления тринадцатого аспекта изобретения или любого из его предпочтительных вариантов осуществления указанная композиция отличается тем, что содержит по меньшей мере 3×103 КОЕ штаммов микроорганизма на 0,1 мл, предпочтительно - на 0,1 мл воды, или более. Предпочтительно, композиция содержит от 3×104 КОЕ на 0,1 мл до 17×106 КОЕ на 0,1 мл штаммов выделенного микроорганизма. Более предпочтительно, композиция содержит 3-17×104 КОЕ на 0,1 мл, или 3-17×105 КОЕ на 0,1 мл или 3-17×106 КОЕ на 0,1 мл штаммов выделенного микроорганизма. Еще более предпочтительно, в таблице ниже представлена спецификация для выпуска лиофилизированной вакцины MTBVAC, содержащей 1,5-8,5×105 КОЕ/0,05 мл штаммов MTBVAC.
| Тест | Критерии приемлемости | Методология |
| Внешний вид | Белый лиофилизированный осадок | Наблюдение |
| Вакуум | Любой флакон без вакуума выбрасывают | Наблюдают флуоресценцию |
| Чистота | Отсутствие бактериальной и грибковой контаминации, за исключением присутствия микобактерий | Тест стерильности в соответствии с Европейской Фармакопеей (2.6.1) |
| Вода | ≤3% масс./масс. | Способ Карла-Фишера |
| Идентификация-ПЦР | Подтверждение делеций fadD26 и phoP | Анализ ПЦР в реальном времени |
| Количество жизнеспособных бактерий | 1,5-8,5×105 КОЕ/дозу (0,05 мл) | Подсчет в конкретной среде |
| Потеря при лиофилизации | ≤90% | Потеря жизнеспособности |
| Чрезмерная кожная реактивность | Реакция меньше, чем в случае вакцины сравнения | Тест БЦЖ в соответствии с Европейской Фармакопеей (0163) |
| Вирулентные микобактерии | Не более 1 из 10 животных погибает в течение 42 дней после инъекции, и при аутопсии не выявляют какие-либо признаки туберкулеза. | Тест БЦЖ в соответствии с Европейской Фармакопеей (0163) |
| Форма выпуска | Соответствие | Проверка упаковки |
Кроме того, как указано в спецификации, данные о стабильности свидетельствуют о том, что основной и рабочий банки клеток, полученные из предосновного посевного материала, являются стабильными (см. фигуру 8), и что вакцина MTBVAC, хранящаяся при -15°C--30°C и +2-+8°C, является стабильной в течение более 24 месяцев (см. фигуры 3 и 10).
Кроме того, исследование стабильности показало, что вакцина MTBVAC является стабильной в течение по меньшей мере 8 часов при комнатной температуре после восстановления.
Как подробно описано где-либо в настоящем описании, композиции по изобретению являются особенно предпочтительными из-за стабильности и жизнеспособности активных компонентов, являющихся результатом, главным образом, состава и способа, которым получают продукт, включающего лиофилизацию. В основном, этот способ включает следующие стадии: замораживание, первичную сушку, вторичную сушку и закупоривание. Способ подробно описан ниже в экспериментальных примерах, но пример способа является следующим. На стадии замораживания полки лиофилизатора предварительно охлаждают до -50°C. После загрузки всех лотков полки держат при -50°C в течение 120 минут. На стадии первичной сушки вакуум устанавливают на 25 мТорр и осуществляют следующие стадии изменения температуры: изменение температуры при +0,1°C/минуту до температуры полки -40°C, удержание в течение 500 минут; изменение температуры при +0,1°C/минуту до температуры полки -35°C, удержание в течение 500 минут; изменение температуры при +0,1°C/минуту до температуры полки -30°C, удержание в течение 500 минут, и изменение температуры при +0,1°C/минуту до температуры полки -25°C, удержание в течение 800 минут. На стадии вторичной сушки вакуум также устанавливают на 25 мТорр, и стадию изменения температуры осуществляют таким образом, что изменение температуры осуществляют со скоростью +0,1°C/минуту до достижения температуры полки +20°C, и удерживают в течение 800 минут. При необходимости, продукт можно держать при +20°C, 25 мТорр в течение еще до 24 часов перед закупориванием. На стадии закупоривания камеру дегазируют с помощью фильтрованного через фильтр 0,22 мкм, сухого, газообразного азота, вакуум устанавливают на 800 мбар (небольшой вакуум) и проталкивают пробки во флаконы. Альтернативные циклы лиофилизации, которые можно использовать в настоящем изобретении, хорошо известны в этой области. Таким образом, способы по изобретению могут включать замораживание до или до приблизительно, например, температуры от -70°C до -30°C (например, от -60°C до -40°C, или -50°C). Замораживание можно осуществлять в течение приблизительно от 30 до 240 минут (например, от 60 до 120 минут) или более. Затем материал можно подвергать одной или более стадиям сушки, как представлено в настоящем описании. На этих стадиях можно использовать вакуум (например, 25 мТорр) и температуру можно менять постепенно (например, от 0,1 до 1,0°C/минуту или 0,5°C/минуту) за период времени (такой как 100-1000 минут, например, 200-600 или 300-500 минут). При первичной сушке температуру можно повышать до или до приблизительно, например, от -30°C до +10°C, например, от -20°C до +5°C или от -15°C до 0°C, в то время как во время вторичной сушки температуру можно изменять до, например, температуры от +5°C до +35°C, например, от 10°C до 30°C или от 15°C до 20°C. Как известно специалисту в этой области, эти параметры (например, температуры, время удержания, скорость изменения температуры и уровни вакуума) можно изменять с учетом, например, полученных результатов.
Вакцинные композиции по тринадцатому аспекту изобретения можно вводить по четырнадцатому аспекту изобретения в качестве первичных профилактических средств для индивидуумов, имеющих риск инфекции M. tuberculosis, или индивидуумов, имеющих риск развития туберкулеза, или их можно использовать в качестве вторичных средств для лечения инфицированных пациентов. Т.к. штаммы из этих композиций являются аттенуированными, они особенно подходят для введения "индивидуумам, имеющим риск", таким как новорожденные, дети, подростки, взрослые и пожилые люди. Такие вакцины также можно использовать в ветеринарии.
Предпочтительный вариант осуществления четырнадцатого аспекта изобретения относится к вакцине MTBVAC для иммунизации индивидуума против симптомов, вызываемых туберкулезом. Необходимо отметить, что указанная вакцина также может подходить для лечения рака мочевого пузыря, а также лечения или профилактики TB или в качестве вектора или адъюванта. Предпочтительно иммунизировать индивидуума против симптомов, вызванных TB.
В другом предпочтительном варианте осуществления четырнадцатого аспекта изобретения композицию по тринадцатому аспекту вводят для профилактики у новорожденных, имеющих риск инфекции M. tuberculosis или имеющих риск развития TB, против инфекций, вызываемых комплексом M. tuberculosis, предпочтительно - M. tuberculosis. Более предпочтительно, указанную композицию вводят новорожденным внутрикожным путем.
В другом предпочтительном варианте осуществления четырнадцатого аспекта изобретения композицию по тринадцатому аспекту вводят для профилактики (включая бустерную вакцинацию) у людей, не являющихся новорожденными, таких как дети, подростки и взрослые, имеющих риск инфекции M. tuberculosis, против инфекций, вызываемых комплексом M. tuberculosis, предпочтительно - M. tuberculosis. Более предпочтительно, указанную композицию вводят внутрикожным путем.
В другом предпочтительном варианте осуществления четырнадцатого аспекта изобретения композицию по тринадцатому аспекту вводят для профилактики у людей, не являющихся новорожденными, таких как дети, подростки и взрослые, имеющих риск развития TB и страдающих латентной туберкулезной инфекцией, против развития клинической симптоматики, ассоциированной с активной формой заболевания, вызываемого комплексом M. tuberculosis, предпочтительно - M. tuberculosis. Более предпочтительно, указанную композицию вводят внутрикожным путем.
В другом предпочтительном варианте осуществления четырнадцатого аспекта изобретения композицию по тринадцатому аспекту вводят для применения в качестве вторичных средств для лечения пациентов, имеющих латентную и/или активную инфекцию TB, среди новорожденных и людей, не являющихся новорожденными, таких как дети, подростки и взрослые. Более предпочтительно, указанную композицию вводят внутрикожным путем.
В другом предпочтительном варианте осуществления четырнадцатого аспекта изобретения композицию по тринадцатому аспекту вводят для бустерной вакцинации или бустерной дозы при профилактическом лечении у людей, не являющихся новорожденными, таких как дети, подростки и взрослые, имеющих риск инфекции M. tuberculosis, против инфекций, вызываемых комплексом M. tuberculosis, предпочтительно - M. tuberculosis. В связи с этим, необходимо отметить, что после исходной иммунизации, бустерная инъекция или бустерная доза представляет собой повторное воздействие антигена для иммунизации. Она предназначена для повышения иммунитета против антигена обратно до протективных уровней после того, как память против антигена снизилась с течением времени.
На всем протяжении описания и формулы изобретения термин "содержат" и его варианты не подразумевают исключения других технических характеристик, добавок, компонентов или стадий. Другие цели, преимущества и характеристики изобретения будут очевидны специалисту в этой области частично из описания и частично при практическом осуществлении изобретения. Следующие примеры и фигуры приведены в качестве неограничивающих, иллюстративных примеров по настоящему изобретению.
Примеры
Пример 1. Иммуногенность и защита не зависят от дозы MTBVAC у новорожденных мышей
Новорожденных мышей C3H (возрастом 1-3 дня) вакцинировали внутрикожно 25 мкл, содержащими одну клиническую дозу БЦЖ (приблизительно 2,5×105) или указанные дозы MTBVAC в КОЕ. В группах БЦЖ использовали коммерческие флаконы БЦЖ Danish, соответствующие сериям 111053F и 113033C. В случае MTBVAC, животных иммунизировали вакциной MTBVAC, полученной посредством лиофилизации среды SDG, в которой были выращены штаммы MTBVAC для осуществления указанной лиофилизации, глутамат натрия и сахарозу (GSA) добавляли в концентрациях 10-40 г/л глутамата натрия и 100-400 г/л сахарозы. Лиофилизированные составы ресуспендировали.
ИССЛЕДОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЗАЩИТЫ
Через восемь недель после вакцинации мышей стимулировали интраназально с помощью 150 КОЕ M. tuberculosis штамма H37Rv. Через четыре недели мышей умерщвляли и определяли бактериальную нагрузку в легких посредством посева гомогенатов ткани на твердую среду 7H11S. Результаты показаны на фигуре 4.
ИССЛЕДОВАНИЯ ИММУНОГЕННОСТИ
Через восемь недель после вакцинации мышей умерщвляли и выделяли спленоциты для оценки иммуногенности. Один миллион спленоцитов инкубировали в течение 24 часов в присутствии 10 мкг/мл очищенного белкового деривата (PPD), 2 мкг/мл перекрывающихся пептидов ESAT6 или CFP10 или не-антигена (отрицательного контроля). Клетки, продуцирующие интерферон гамма (ИФНγ), анализировали посредством ELISPOT. Результаты показаны на фигуре 5.
ВЫВОДЫ
Ни эффективность защиты, ни иммуногенность, специфическая для PPD, ESAT6 или CFP10, индуцируемая с помощью MTBVAC, не являлись дозозависимыми в модели на новорожденных мышах.
Пример 2. ДАННЫЕ ОБ ИММУНОГЕННОСТИ В ИССЛЕДОВАНИИ ФАЗЫ 1B НА НОВОРОЖДЕННЫХ (ЮЖНАЯ АФРИКА)
Цель: Определение иммуногенности и характеризация индуцируемых иммунных ответов после неонатальной вакцинации вакцины MTBVAC по настоящему изобретению.
Способы: Тридцать шесть ВИЧ-отрицательных, неподвергнутых введению БЦЖ здоровых новорожденных рандомизировали в соотношении 1:3 для введения БЦЖ (штамм SSI) или MTBVAC в дозе 2,5×103, 2,5×104 или 2,5×105 КОЕ в пределах 96 ч. после рождения. MTBVAC-специфические цитокиновые ответы в цельной крови измеряли в дни 7, 28, 70 посредством окрашивания цельной крови на внутриклеточные цитокины и проточной цитометрии с помощью BD LSRFortessa (18-цветного, сине-красно-фиолетово-зеленая конфигурация).
Анализ ICS цельной крови:
Свежие гепаринизированные образцы цельной крови незамедлительно стимулировали БЦЖ, MTBVAC или фитогемагглютинином (PHA) или оставляли нестимулированными (Nil) в течение 12 часов при 37°C. Условия стимуляции включают половину объема крови [250 мкл (0,25 мл)] и только Nil, MTBVAC и БЦЖ. После 7 часов стимуляции собирали супернатанты (для анализа растворимых цитокинов/хемокинов), соответствующие всем условиям, замораживали при -BOC и хранили для транспортировки спонсору для дальнейшего анализа. После удаления супернатанта к остальной цельной крови добавляли брефелдин A и инкубировали пробирки еще в течение 5 ч. на программируемой водяной бане. Водяную баню отключали всего после 12 часов стимуляции. На следующее утро добавляли раствор FACSLysing для лизиса эритроцитов и фиксации лейкоцитов. Затем фиксированные лейкоциты замораживали для последующего окрашивания внутриклеточных цитокинов и проточной цитометрии. Окрашивание и проточный цитометрический анализ будут осуществлять в партиях в более поздний момент времени. Оценивали изменение частот и паттернов продукции специфических цитокинов типа 1 и ИЛ-17 CD4+ T-клетками. Временные точки для оценки иммуногенности выбирали на основе недавних исследований, проведенных SATVI, показавших, что пик БЦЖ-индуцированных T-клеточных ответов у младенцев приходится на возраст приблизительно 6-10 недель.
Результаты: Вакцинация повышающимися дозами MTBVAC приводила к преимущественно Th1-опосредованному (ИФНγ, ИЛ-2 или ФНОα) антиген-специфическому ответу CD4+ T-клеток. Наибольшая доза MTBVAC 2,5×105 КОЕ индуцировала наиболее высокую величину антиген-специфического, опосредованного CD4+ T-клетками цитокинового ответа в день 70. Наименьшая доза MTBVAC 2,5×103 КОЕ являлась наименее иммуногенной. Результаты показаны на фигуре 6.
Выводы: Эти данные свидетельствуют о том, что вакцинация с помощью MTBVAC в дозе 2,5×104 или 2,5×105 или более КОЕ является иммуногенной у новорожденных из TB-эндемичных условий.
Пример 3. Рандомизированное, двойное слепое клиническое испытание MTBVAC с повышением дозы по сравнению с вакциной БЦЖ SSI на новорожденных с группой анализа безопасности, включающей взрослых, живущих в TB-эндемичной области
Цели. Оценка безопасности и иммуногенности 3 доз MTBVAC по сравнению с БЦЖ на новорожденных в TB-эндемичной области.
Способы. Восемнадцать ВИЧ-, QuantiFERON (QFT)-, ранее вакцинированных БЦЖ здоровых взрослых рандомизировали в соотношении 1:1 для введения MTBVAC (5×105 КОЕ) или БЦЖ SSI. Затем 36 ВИЧ-отрицательных, неподвергнутых введению БЦЖ здоровых новорожденных рандомизировали в соотношении 1:3 для введения БЦЖ SSI или MTBVAC в дозе 2,5×103, 2,5×104 или 2,5×105 КОЕ в пределах 96 ч. после рождения. QFT осуществляли в дни D180 и D360, и QFT+ младенцев (>0·35 МЕ/мл) направляли для профилактической терапии изониазидом.
Результаты. У всех взрослых наблюдали местные реакции в участке инъекции - отек у 18 индивидуумов (100%), покраснение у 16 индивидуумов (88,9%) и изъязвление у 10 индивидуумов (55,5%). Девять реакций регистрировали как умеренные, и один случай отека был тяжелым (35 мм). Ко дню D28 не регистрировали ни одного SAE.
Недоступность вакцины БЦЖ SSI приводила к немаскированному введению 6 младенцам MTBVAC в наиболее высокой дозе. Шестнадцать (44,4%) младенцев из всех 3 когорт имели местные реакции - 2 [16,6%], 3 [25%] и 11 [91,6%]), все из которых регистрировали как слабые, отек у 14 индивидуумов (38,9%), эритему у 5 индивидуумов (13,9%) и рубцевание у 9 индивидуумов (25,0%). Не наблюдали изъязвления. Системные AE являлись схожими среди когорт (n=32/42/40), при этом 9 регистрировали как умеренные (n=3/4/2) и 8 как тяжелые (n=4/2/2). У шести младенцев наблюдали 7 несвязанных с лекарственным средством SAE, включая несвязанную с лекарственным средством смерть по причине вирусной пневмонии, подтвержденной на аутопсии.
Дозозависимую конверсию QFT наблюдали в день D180 у реципиентов MTBVAC в когорте 1 (n=3, 37,5%), когорте 2 (n=6, 75%) и когорте 3 (n=7, 77,8%), но ни у одного из 7 реципиентов БЦЖ. Положительный QFT в день D360 наблюдали у 0 реципиентов MTBVAC в когорте 1 (0,0%), 2 в когорте 2 (25,0%) и 4 в когорте 3 (44,4%), как показано на фигуре 7.
Выводы. MTBVAC оказалась безопасной при 3 уровнях доз у новорожденных из Южной Африки и, по-видимому, приводила к транзиторной дозозависимой конверсии QFT, что может являться многообещающим показателем иммуногенности в TB-эндемичных областях. Кроме того, реактогенность вакцины MTBVAC была очевидно ниже реактогенности вакцины БЦЖ, где введение вакцины БЦЖ у 5 из 8 (62%) новорожденных приводило к рубцеванию, в то время как MTBVAC в своей наиболее высокой дозе приводила к рубцеванию только у 2 из 10 (20%) новорожденных.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Universidad de Zaragoza
BIOFABRI S.L.
<120> КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В КАЧЕСТВЕ ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО СРЕДСТВА
ДЛЯ ПАЦИЕНТОВ С РИСКОМ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ ИЛИ В КАЧЕСТВЕ ВТОРИЧНЫХ
СРЕДСТВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПАЦИЕНТОВ С ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ
<130> 903 926
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1752
<212> ДНК
<213> Mycobacterium tuberculosis
<220>
<221> прочий_признак
<222> (1)..(1752)
<223> Ген fadD26 дикого типа в Mt103
<400> 1
atgccggtga ccgaccgttc agtgccctct ttgctgcaag agagggccga ccagcagcct 60
gacagcactg catatacgta catcgactac ggatccgacc ccaagggatt tgctgacagc 120
ttgacttggt cgcaggtcta cagtcgtgca tgcatcattg ctgaagaact caagttatgc 180
gggttacccg gagatcgagt ggcggtttta gcgccacaag gactggaata tgtccttgca 240
ttcctgggcg cacttcaggc tggatttatc gcggttccgc tgtcaactcc acagtatggc 300
attcacgatg accgcgtttc tgcggtgttg caggattcca agccggtagc cattctcacg 360
acttcgtccg tggtaggcga tgtaacgaaa tacgcagcca gccacgacgg gcagcctgcc 420
ccggtcgtag ttgaggttga tctgcttgat ttggactcgc cgcgacagat gccggctttc 480
tctcgtcagc acaccggggc ggcttatctc caatacacgt ccggatcgac gcgtacgccg 540
gccggagtca ttgtgtcgca cacgaatgtc attgccaatg tgacacaaag tatgtacggc 600
tatttcggcg atcccgcaaa gattccgacc gggactgtgg tgtcgtggct gcctttgtat 660
cacgatatgg gcctgattct cggaatttgc gcaccgctgg tggcccgacg ccgcgcgatg 720
ttgatgagcc caatgtcatt tttgcgccgt ccggcccgct ggatgcaact gcttgccacc 780
agcggccggt gcttttctgc ggcaccgaat ttcgccttcg agctggccgt gcgcagaaca 840
tctgaccagg acatggcggg gctcgacctg cgcgacgtgg tcggcatcgt cagtggcagt 900
gagcgaatcc atgtggcaac cgtgcggcgg ttcatcgagc ggttcgcgcc gtacaatctc 960
agccccaccg cgatacggcc gtcgtacggg ctcgcggaag cgaccttata tgtggcagct 1020
cccgaagccg gcgccgcgcc caagacggtc cgttttgact acgagcagct gaccgccggg 1080
caggctcggc cctgcggaac cgatgggtcg gtcggcaccg aactgatcag ctacggctcc 1140
cccgacccat cgtctgtgcg aatcgtcaac ccggagacca tggttgagaa tccgcctgga 1200
gtggtcggtg agatctgggt gcatggcgac cacgtgacta tggggtattg gcagaagccg 1260
aagcagaccg cgcaggtctt cgacgccaag ctggtcgatc ccgcgccggc agccccggag 1320
gggccgtggc tgcgcaccgg cgacctgggc gtcatttccg atggtgagct gttcatcatg 1380
ggccgcatca aagacctgct catcgtggac gggcgcaacc actaccccga cgacatcgag 1440
gcaacgatcc aggagatcac cggtggacgg gccgcggcga tcgcagtgcc cgacgacatc 1500
accgaacaac tggtggcgat catcgaattc aagcgacgcg gtagtaccgc cgaagaggtc 1560
atgctcaagc tccgctcggt gaagcgtgag gtcacctccg cgatatcgaa gtcacacagc 1620
ctgcgggtgg ccgatctcgt tctggtgtca cctggttcga ttcccatcac caccagcggc 1680
aagatccggc ggtcagcctg cgtcgaacgc tatcgcagcg acggcttcaa gcggctggac 1740
gtagccgtat ga 1752
<210> 2
<211> 410
<212> ДНК
<213> Mycobacterium tuberculosis
<220>
<221> прочий_признак
<222> (1)..(410)
<223> fadD26 в MTBVAC
<400> 2
atgccggtga ccgaccgttc agtgccctct ttgctgcaag agagggccga ccagcagcct 60
gacagcactg catatacgta catcgactac ggatccacta gttctagagc aaccgtccga 120
aatattataa attatcgcac acataaaaac agtgctgtta atgtgtctat taaatcgatt 180
ttttgttata acagacactg cttgtccgat atttgattta ggatacattt ttatgagatc 240
ccccgggctg caggaattcg atatcgaagt cacacagcct gcgggtggcc gatctcgttc 300
tggtgtcacc tggttcgatt cccatcacca ccagcggcaa gatccggcgg tcagcctgcg 360
tcgaacgcta tcgcagcgac ggcttcaagc ggctggacgt agccgtatga 410
<210> 3
<211> 744
<212> ДНК
<213> Mycobacterium tuberculosis
<220>
<221> прочий_признак
<222> (1)..(744)
<223> Ген phoP дикого типа в Mt103
<400> 3
atgcggaaag gggttgatct cgtgacggcg ggaaccccag gcgaaaacac cacaccggag 60
gctcgtgtcc tcgtggtcga tgatgaggcc aacatcgttg aactgctgtc ggtgagcctc 120
aagttccagg gctttgaagt ctacaccgcg accaacgggg cacaggcgct ggatcgggcc 180
cgggaaaccc ggccggacgc ggtgatcctc gatgtgatga tgcccgggat ggacggcttt 240
ggggtgctgc gccggctgcg cgccgacggc atcgatgccc cggcgttgtt cctgacggcc 300
cgtgactcgc tacaggacaa gatcgcgggt ctgaccctgg gtggtgacga ctatgtgaca 360
aagcccttca gtttggagga ggtcgtggcc aggctgcggg tcatcctgcg acgcgcgggc 420
aagggcaaca aggaaccacg taatgttcga ctgacgttcg ccgatatcga gctcgacgag 480
gagacccacg aagtgtggaa ggcgggccaa ccggtgtcgc tgtcgcccac cgaattcacc 540
ctgctgcgct atttcgtgat caacgcgggc accgtgctga gcaagcctaa gattctcgac 600
cacgtttggc gctacgactt cggtggtgat gtcaacgtcg tcgagtccta cgtgtcgtat 660
ctgcgccgca agatcgacac tggggagaag cggctgctgc acacgctgcg cggggtgggc 720
tacgtactgc gggagcctcg atga 744
<210> 4
<211> 819
<212> ДНК
<213> Mycobacterium tuberculosis
<220>
<221> прочий_признак
<222> (1)..(819)
<223> phoP в MTBVAC
<400> 4
atgcggaaag gggttgatct cgtgacggcg ggaaccccag gcgaaaacac cacaccggag 60
gctcgtgtcc tcgtggtcga tgatgaggcc aacatcgttg aactgctgtc ggtgagcctc 120
aagttccagg gctttgaagt ctacaccgcg accaacgggg cacaggcgct ggatcgggcc 180
cgggaaaccc ggccggacgc ggtgatcctc gatgtgatga tgcccgggat ggacggcttt 240
ggggtgctgc gccggctgcg cgccgacggc atcgatgccc cggcgttgtt cctgacggcc 300
cgtgactcgc tacaggacaa gatcgcgggt ctgaccctgg gtggtgacga ctatgtgaca 360
aagcccttca gtttggagga ggtcgtggcc aggctgcggg tcatcctgcg acgcgcgggc 420
aagggcaaca aggaaccacg taatgttcga ctgacgttcg ccgatatcga attcctgcag 480
cccgggggat ctcataaaaa tgtatcctaa atcaaatatc ggacaagcag tgtctgttat 540
aacaaaaaat cgatttaata gacacattaa cagcactgtt tttatgtgtg cgataattta 600
taatatttcg gacggttgct ctagaactag tggatcaacg cgggcaccgt gctgagcaag 660
cctaagattc tcgaccacgt ttggcgctac gacttcggtg gtgatgtcaa cgtcgtcgag 720
tcctacgtgt cgtatctgcg ccgcaagatc gacactgggg agaagcggct gctgcacacg 780
ctgcgcgggg tgggctacgt actgcgggag cctcgatga 819
<---
1. Способ получения готовой лиофилизированной живой аттенуированной вакцинной композиции M. tuberculosis, содержащей выделенный микроорганизм, принадлежащий к штамму M. tuberculosis MTBVAC, имеющему i) фенотип PhoP− в результате инактивации посредством генетической делеции гена Rv0757, где последовательность открытой рамки считывания (ORF) PhoP состоит из SEQ ID NO: 4, и ii) делецию второго гена, Rv2930 (fadD26), предотвращающую продукцию PDIM (фенотип PDIM−), где последовательность открытой рамки считывания (ORF) fadD26 состоит из SEQ ID NO: 2; и где способ включает инициирование культивирования штамма MTBVAC в посевной среде, определенной в таблице ниже, и выращивание или амплификацию указанных бактерий с использованием среды SD, определенной в таблице ниже:
| Компоненты | Посевная среда | Среда SD | ||
| L-аспарагин | 2,00-4,00 | г | 2,00-4,00 | г |
| Дигидроортофосфат калия | 0,30-0,60 | г | 0,30-0,60 | г |
| Сульфат магния H2O | 0,5-0,70 | г | 0,50-0,70 | г |
| Цитрат железа (III)-аммония | 0,02-0,05 | г | 0,02-0,05 | г |
| Моногидрат декстрозы | 7,00-8,00 | г | 3,00-4,00 | г |
| Глицерин | 10,0-20,0 | мл | 30-40 | мл |
| Лимонная кислота | 1,5-2,0 | г | 1,5-2 | г |
| Полисорбат 80 | 0,15-0,5 | мл | ||
| Очищенная вода в достаточном количестве | 1,00 | л | 1,00 | л |
и где способ отличается тем, что для массового культивирования перед лиофилизацией используют среду SDG, содержащую представленную ниже количественную и качественную композицию:
| Компоненты | Среда SDG | |
| L-аспарагин | 2,00-4,00 | г |
| Дигидроортофосфат калия | 0,30-0,60 | г |
| Сульфат магния H2O | 0,50-0,70 | г |
| Цитрат железа (III)-аммония | 0,02-0,05 | г |
| Моногидрат декстрозы | 3,00-4,00 | г |
| Глицерин | 3,0-10,0 | мл |
| Лимонная кислота | 1,5-2 | г |
| Полисорбат 80 | 0,15-0,5 | мл |
| Очищенная вода в достаточном количестве | 1,00 | л |
где способ осуществляют в аэробных условиях.
2. Способ по п.1, где способ дополнительно включает стадию лиофилизации посредством добавления сахарозы и глутамата натрия в качестве стабилизаторов в среду SDG, используемую для массового культивирования перед стадией лиофилизации.
