Способ очистки сиаловой кислоты из ферментационного бульона

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ выделения сиаловой кислоты из ферментационного бульона. Способ включает стадию удаления биомассы из ферментационного бульона. Затем полученный осветленный раствор подвергают обработке на катионообменнике и обработке на анионообменнике в условиях, при которых сиаловая кислота проходит через ионообменный материал и присутствует в проходящем потоке. Затем проводят стадию удаления солей путем электродиализа. Изобретение позволяет получать сиаловую кислоту с высокой степенью чистоты, с качеством, пригодным для применения в пищевой промышленности, и в промышленных масштабах за один цикл. 14 з.п. ф-лы, 8 ил., 3 табл., 7 пр.

 

В настоящем изобретении описывается эффективный способ выделения сиаловой кислоты из ферментационного бульона. Сиаловая кислота, содержащаяся в ферментационном бульоне, образуется в результате бактериальной ферментации. Способ по изобретению включает стадию удаления биомассы из ферментационного бульона, стадию подвергания полученного раствора по меньшей мере одной обработке на катионообменнике и одной обработке на анионообменнике и стадию удаления солей после обработки на ионообменнике. Применение данного способа может обеспечить получение сиаловой кислоты в высушенной распылением форме, а также в форме кристаллической сиаловой кислоты.

Общий термин "сиаловая кислота" применяется для обозначения N- или О-замещенных производных нейраминовой кислоты, моносахарида с основной цепью из девяти атомов углерода, содержащей функциональную карбоксильную группу. Карбоксильная группа может придавать данному сахару отрицательный заряд при соответствующем значении рН. Все известные структуры сиаловых кислот происходят из четырех первичных основных структур: (а) 2-кето-3-дезоксинонановой кислоты (Kdn), (b) нейраминовой кислоты (Neu), (с) N-ацетилнейраминовой кислоты (Neu5Ac) и (d) N-гликолилнейраминовой кислоты (Neu5Gc), с возможными замещениями при гидроксильных группах в положениях С-4, С-7, С-8 и С-9 (с введением О-ацетильных, О-метильных, О-сульфатных, О-лактильных или фосфатных групп). Между положениями С-2 и С-7, С-4 или С-8 могут образовываться лактоны или образовываться лактамы между положением С-2 и аминогруппой Neu в положении С-5. Помимо этого также известны природные дегидросиаловые кислоты, такие как 2-дезокси-2,3-дидегидро-N-ацетилнейраминовая кислота (Neu2en5Ac, также известная как DANA). Дегидросиаловые кислоты, подобные DANA, могут обладать ингибирующими свойствами в отношении сиалидаз и, соответственно, потенциальными ингибирующими свойствами в отношении некоторых вирусов (например, вируса гриппа).

Сиаловая кислота обычно существует в виде α-гликозида, располагаясь с нередуцирующего конца гетероолигосахаридов в гликоконъюгатах, таких как гликолипиды и гликопротеины, и является ярким примером разнообразия гликанов как по структуре, так и по функции. Семейство сиаловых кислоты состоит более чем из 40 производных содержащей девять углеродных атомов нейраминовой кислоты, включая ее N- и О-замещенные производные. Структурные признаки членов указанного семейства конкретизированы благодаря наличию аминогруппы в положении 5 и карбоксильной группы в положении 1, что делает все сиаловые кислоты сильными органическими кислотами с отрицательным зарядом в физиологических условиях.

Сиаловые кислоты присутствуют в качестве концевых сахаридов гликанов в гликоконъюгатах на поверхности клеток (в гликопротеинах и гликолипидах) у позвоночных и высших беспозвоночных. Сиаловые кислоты являются также компонентами липополисахаридов и капсульных полисахаридов патогенных бактерий, включая Escherichia coli K1, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Pasteurella multocida, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Campylobacter jejuni и Streptococcus agalactiae. У млекопитающих сиаловые кислоты обнаружены преимущественно в виде концевых остатков содержащих сахара конъюгатов на клеточной поверхности. Два производных Neu обладают наиболее распространенными для сиаловых кислот структурами, обнаруженными в клетках млекопитающих: N-ацетилнейраминовая кислота (Neu5Ac) и ее гидроксилированное производное, N-гликолилнейраминовая кислота (Neu5Gc). Среди млекопитающих люди известны как исключение ввиду отсутствия Neu5Gc по причине мутации, приводящей к инактивации гидроксилазы, в результате которой происходит изменение СМР(цитидин-монофосфо)-Neu5Ac с образованием СМР-Neu5Gc.

Поскольку в природе не обнаружена незамещенная форма нейраминовой кислоты, наиболее широко встречающейся сиаловой кислотой является N-ацетилнейраминовая кислота (также сокращенно обозначаемая как "Neu5Ac" или как "NANA"). Neu5Ac представляет собой сиаловую кислоту, в которой атом N аминогруппы является ацетилированным. В литературе термин "сиаловая кислота" иногда используют как синоним конкретной сиаловой кислоты Neu5Ac, но в последующем изложении термин "сиаловая кислота" понимается как семейство всех сиаловых кислот, a Neu5Ac понимается как конкретный член указанного семейства, а именно, как N-ацетилнейраминовая кислота.

Neu5Ac выполняет различные биологические функции, действуя как рецептор для микроорганизмов, вирусов, токсинов и гормонов. Neu5Ac является характерным компонентом аминосахаров, которые важны для межклеточных взаимодействий.

Другим существенным природным вариантом является N-гликолилнейраминовая кислота (Neu5Gc), которая образуется в результате замены одного из атомов водорода в метильной группировке ацетильной группы на гидроксильную группу. Neu5Gc имеется у большого числа видов животных, особенно в ткани свинообразных, но не обнаружена в ткани человека за исключением лиц, пораженных отдельными видами рака.

Среди прочего Neu5Ac служит для защиты белков от расщепления под действием протеаз. Ввиду высокой концентрации Neu5Ac в ганглиозидах, которые встречаются в мембранах нервных клеток, Neu5Ac отводится важная роль в развитии нейронов, а также в функционировании нейронной системы. Помимо этого, известно, что многочисленные вирусные патогены, такие как вирусы гриппа человека или вирусы птичьего гриппа, используют сиалированные соединения для инфицирования организма человека. Neu5Ac, соединения, содержащие Neu5Ac, и соединения, происходящие из Neu5Ac, уже используются в активных веществах для борьбы с вирусными инфекциями. Дальнейшие исследования направлены на применение этих соединений для обеспечения оптимального развития нейронов или для предупреждения дегенеративных заболеваний головного мозга.

Модификация, затрагивающая Neu5Ac, в молекулах клеточной поверхности играет роль во многих биологических явлениях, таких как стабильность структуры белка, регуляция клеточной адгезии и сигнальная трансдукция. Расстройства, связанные с дефицитом Neu5Ac, такие как GNE миопатия, которая также известна как наследственная миопатия с образованием телец включения (HIBM), дистальная миопатия с вакуолями в оправе (DMRV) или миопатия Нонака, представляют собой клинические заболевания, возникающие в результате снижения образования сиаловых кислот. Образование Neu5Ac является основной причиной заболевания, вызываемого этой мутацией. Замена метаболита после осуществления генетического блокирования в данном пути теоретически может ослабить симптомы дефицита Neu5Ac (Jay et al., Gene Reg. and Sys., 2009, Biology, 3: 181-190). Однако, введение одного или более соединений в путь биосинтеза Neu5Ac in vivo является серьезной проблемой. Эти соединения характеризуются чрезвычайно быстрым выведением и экскретируются с мочой прежде, чем они могут быть метаболизированы.

В организме человека самая высокая концентрация Neu5Ac может быть обнаружена в головном мозге, где Neu5Ac выступает в качестве неотъемлемой части ганглиозидной структуры в синаптогенезе и передаче нервного импульса (Wang et al., Eur. J. Clin. Nutr., 2003, Nov, 57(11): 1351-69). По-видимому, особенно в первый год жизни Neu5Ac играет важную роль в развитии головного мозга. Быстрый рост головного мозга у младенцев обуславливает исключительно высокую потребность в поступлении питательных веществ из пищи, особенно в случае недоношенных новорожденных. Neu5Ac является важным компонентом ганглиозидов головного мозга и цепей полисиаловой кислоты (polySia), которые модифицируют молекулы адгезии нервных клеток (NCAM). Уровни сиаловой кислоты в женском грудном молоке являются высокими, в основном уровни конкретной сиаловой кислоты Neu5Ac. Напротив, смеси для грудных детей характеризуются низким уровнем как Neu5Ac, так и Neu5Gc (Wang, Annu. Rev. Nutr., 2009, 29: 177-222). Таким образом, продемонстрирован высокий потенциал в отношении применения Neu5Ac в смесях для грудных детей с целью поддержания развития головного мозга у младенцев.

Сиаловые кислоты играют важную роль во многих физиологических и патофизиологических процессах, включая развитие нервной системы у эмбриона, метастазирование, регуляцию иммунных ответов и инфекции бактериями или вирусами. Сиаловые кислоты являются важным компонентом ганглиозидов головного мозга и цепей полисиаловой кислоты, которые модифицируют молекулы адгезии нервных клеток (NCAM), что облегчает межклеточные взаимодействия, отрастание нейронов, модификацию синаптических связей и формирование памяти. Поедание поросятами пищи, богатой сиаловыми кислотами, повышает уровень сиаловых кислот в головном мозге и экспрессию двух связанных с обучением генов. Соответственно, такой рацион также улучшает обучение и память.

Младенцы, в особенности недоношенные новорожденные, испытывают большую потребность в питательных веществах, в том числе сиаловых кислотах, ввиду быстрого роста головного мозга и развития у них иммунной системы на этой стадии развития. В женском грудном молоке также имеются высокие уровни сиаловых кислот, в частности, Neu5Ac (приблизительно 0,5 г/л). Напротив, смеси для грудных детей на сегодняшний день содержат небольшие или даже ничтожно малые количества Neu5Ac. Помимо свободной Neu5Ac грудное молоко человека содержит различные кислые, т.е. сиалилированные, олигосахариды, принадлежащие семейству олигосахаридов грудного молока (HMO) (Urashima Т. et al., (2011) Nutrition and diet research progress: Milk oligosaccharides, Nova Sciences Publishers Inc., New York, ISBN-978-1-61122-831-1), прежде всего 3'-сиалиллактозу, 6'-сиалиллактозу и сиалилированные производные лакто-N-тетраозы (LNT), такие как LST-a, LST-b, LST-c и дисиалилированная LNT. В то время как молоко некоторых млекопитающих, таких как, например грызуны, особенно богато сиалилированными олигосахаридами молока, грудное молоко человека особенно богато нейтральными олигосахаридами, такими как 2'-фукозиллактоза, 3-фукозиллактоза, лакто-N-тетраоза, лакто-N-неотетраоза и лакто-N-фукопентаоза I.

Другой аспект, который важен при разработке лекарственных средств, заключается в том, что активные вещества в случае лекарственных композиций фармацевтического качества должны иметь стабильную, возможно кристаллическую структуру. Специалисты в областях фармацевтики понимают, что кристаллизация активного фармацевтического ингредиента обеспечивает наилучший способ контроля важных физико-химических характеристик, таких как стабильность, растворимость, биодоступность, размер частиц, объемная плотность, реологические свойства, содержание полиморфных форм и другие свойства. Таким образом, существует потребность в кристаллических формах сиаловых кислот, подобных Neu5Ac, и способах получения таких форм. Эти кристаллические формы должны подходить для фармацевтического применения.

Другим применением для производных Neu5Ac является применение в качестве ингибиторов нейраминидазы для лечения вирусных инфекций, например гриппа. Как один из примеров, Neu5Ac представляет собой возможное исходное вещество в синтезе занамивира, который можно использовать для предупреждения и лечения инфекций гриппа обоих типов А и В, таких как вирус птичьего гриппа H5N1 (Kawei et al., Clin. Infect. Dis., 2009, 48: 996-997). Кроме того, Neu5Ac характеризуется большим разнообразием медицинских применений, как например, связанные с противораковым, антиадгезивным и противовоспалительным действиями (Varki et al., Lab. Invest., 2007, 87: 851-857).

Высокая стоимость Neu5Ac обусловлена ее недостаточной доступностью и недостаточными запасами. Существует несколько стратегий получения Neu5Ac. Традиционно Neu5Ac экстрагируют из природных веществ, таких как яичные желтки, молочная сыворотка и съедобные птичьи гнезда. Однако, содержание Neu5Ac в природных источниках является относительно низким, в результате чего способы разделения и очистки относительно сложны, затратны по времени и обременительны, в частности, ввиду сложного процесса очистки, загрязненного исходного материала и низкого выхода (Tao et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2010, 87: 1281-1289). Ввиду этого, для крупномасштабного получения Neu5Ac традиционные способы экономически неэффективны.

Как описано ранее, Neu5Ac можно выделять из съедобных птичьих гнезд. Съедобные птичьи гнезда являются природным ресурсом с самым высоким содержанием Neu5Ac. Содержание Neu5Ac в съедобных птичьих гнездах составляет до 100 г/кг включительно в отличие от 2 г/кг в яичном желтке (Koketsu et al., Glycoconj. J., 1992, Apr, 9(2): 70-4). В большинстве случаев Neu5Ac получают не в полностью очищенном, а только в обогащенном виде. Тогда данный продукт продают в виде экстракта птичьих гнезд. Содержание сиаловой кислоты в этом экстракте птичьих гнезд составляет только 1,5% (Bird's Nest Extract, ORYZA OIL & FAT CHEMICAL CO., LTD).

В CN 104072533 А раскрыт способ выделения Neu5Ac из птичьих гнезд. Материал будет проинкубирован с водой, нагрет до 121°С и подвергнут сублимационной сушке. Neu5Ac извлекали из обработанных таким образом гнезд путем добавления этанола. Этанольную фракцию фильтровали для удаления нерастворенных веществ и инкубировали с этилацетатом для осаждения Neu5Ac. Это приводит к получению Neu5Ac с чистотой около 79% и выходом в результате очистки 55-60%.

Одним из возможных способов промышленного получения Neu5Ac является химический синтез. Например, N-ацетил-глюкозамин (GlcNAc) и оксалоацетат можно конденсировать в щелочных условиях с последующим декарбоксилированием (описано Cornforth et al., Biochem. J., 1958, 68: 57-61). Другим способом является получение посредством асимметричного синтеза из D-маннозы и не являющихся сахарами предшественников, таких как 1,2-цис-дигидро-катехол (Danishefsky et al., J. Am. Soc, 1988, 110: 3929-3940). Однако в большинстве случаев химический синтез Neu5Ac включает трудоемкие повторяющиеся последовательные стадии введения и удаления защиты или требует их выполнения и может привести к образованию ряда промежуточных продуктов реакции и изомеров. Эти факты могут привести к тому, что процесс разделения станет очень сложным, трудным и дорогостоящим.

Третьим вариантом промышленного получения Neu5Ac является получение с использованием биокаталитических способов. Указанные биокаталитические способы включают ферментативный катализ, биокатализ с применением цельных клеток и ферментацию. Способы биокатализа и ферментации стали важным инструментом для получения различных веществ. Эти способы используют для крупномасштабного получения или синтеза химических веществ массового производства, агрохимических промежуточных продуктов, активных фармацевтических средств и пищевых ингредиентов. Биокатализ и ферментация предоставляют возможность для осуществления простого и недорогого производства разных веществ. В большинстве данных способов используются экологически чистые операции в мягких условиях.

Что касается получения Neu5Ac, то описаны два разных фермента, которые можно использовать для биокаталитического или основанного на применении ферментов получения. Такими ферментами являются синтаза Neu5Ac (ЕС 4.1.3.19) и альдолаза Neu5Ac (NAL, ранее называемая лиаза Neu5Ac, ЕС 4.1.3.3). Альдолаза Neu5Ac предпочтительнее синтазы Neu5Ac, поскольку ее субстрат пируват гораздо более доступен, чем субстрат синтазы Neu5Ac фосфоенолпируват (Tao et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2010, 87: 1281-1289). NAL впервые была использована для получения Neu5Ac в 1960 году с N-ацетил-D-маннозамином (ManNAc) и пируватом в качестве исходных веществ (Comb et al., J. Biol. Chem., 160, 235: 2529-2537). Одной из критических точек для крупномасштабного получения Neu5Ac этим способом является стоимость N-ацетил-D-маннозамина, которая является очень высокой. Кроме того, N-ацетил-D-маннозамин на сегодняшний день недоступен в больших количествах.

В DE 3937891 А1 раскрыт способ получения Neu5Ac с использованием биокаталитических процессов, который может быть применен в более крупном масштабе. Изомеризация N-ацетилглюкозамина, катализируемая N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразой (ЕС 5.1.3.8), с образованием N-ацетилманнозамина и последующая реакция в присутствии лиазы N-ацетилнейраминовой кислоты (ЕС 4.1.3.3) и пирувата с образованием Neu5Ac с успехом может быть осуществлена в биореакторе.

В WO 94/29476 А1 раскрыт способ получения N-ацетил-D-нейраминовой кислоты из N-ацетил-D-глюкозамина (NAG, GlcNAc) in vitro. В данном способе получения NAG превращают в N-ацетил-D-маннозамин (NAM, ManNAc) посредством катализируемой основанием эпимеризации. Далее NAM приводят во взаимодействие с пируватом в реакции, катализируемой Neu5Ac-альдолазой, получая Neu5Ac. Neu5Ac-альдолазу получали из рекомбинантных клеток Е. coli, экспрессирующих указанную Neu5Ac-альдолазу. Фермент альдолазу иммобилизовали путем смешивания гранул Eupergit-C^® с неочищенным экстрактом указанных рекомбинантных клеток Е. coli. Превращение NAM в Neu5Ac инициировали путем добавления указанных гранул с иммобилизованным ферментом к смеси NAM и пирувата. Neu5Ac получали из реакционной смеси после удаления фермента фильтрованием, смешивания фильтрата с ледяной уксусной кислотой и небольшим количеством затравки с получением "влажного осадка на фильтре". Влажный осадок на фильтре подвергали либо десольватации с использованием ацетона, либо кристаллизации с получением кристаллов ромбовидной формы.

В ЕР 0578825 А1 раскрыт способ получения Neu5Ac in vitro путем обработки смеси N-ацетилглюкозамина и пировиноградной кислоты лиазой N-ацетилнейраминовой кислоты в щелочных условиях. Продукт реакции выделяли хроматографией на ионообменной колонке с использованием Dowex 1 (Dow Chemical Company) и изоляты концентрировали посредством кристаллизации.

Чтобы избежать применения N-ацетил-D-маннозамина в реакционной смеси, известен ферментативный подход, в котором в качестве субстрата используют N-ацетил-D-глюкозамин. Во время первой стадии N-ацетил-D-глюкозамин с использованием N-ацил-D-глюкозамин-2-эпимеразы превращали в N-ацетил-D-маннозамин с коэффициентом конверсии 77%. Во время второй стадии полученный таким образом N-ацетил-D-маннозамин и пируват использовали в качестве субстратов для лиазы N-ацетилнейраминовой кислоты с получением Neu5Ac (Maru et al., Carbohydrate Research, 1998, 306: 575-578). С использованием этого способа можно было получить 29 кг Neu5Ac из 27 кг N-ацетил-D-глюкозамина. Полученную Neu5Ac извлекали посредством прямой кристаллизации. Раствор нагревали в течение 5 мин до 80°С для осаждения содержащихся ферментов. Нерастворимые части удаляли фильтрованием. Для извлечения Neu5Ac из реакционной смеси к раствору добавляли 5 объемов ледяной уксусной кислоты. После проведения кристаллизации Neu5Ac извлекали фильтрованием и промывали этанолом для удаления оставшейся уксусной кислоты. Вещество сушили при 40°С до получения постоянного веса. По данным высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) и инфракрасной (ИК) спектроскопии полученную и выделенную таким образом Neu5Ac было невозможно отличить от природной Neu5Ac.

Этот способ получения Neu5Ac также известен благодаря другому подходу для крупномасштабного получения. В соответствии с указанным подходом Neu5Ac синтезируют, используя препарат фермента альдолазы (лиазы N-ацетилнейраминовой кислоты; CAS (Химическая реферативная служба): 9027-60-5; ЕС 4.1.3.3; фермент альдолаза), полученного из модифицированного штамма производного Escherichia coli K12. Данный фермент катализирует реакцию сочетания N-ацетилманнозамина и пирувата натрия с образованием N-ацетилнейраминовой кислоты. (Уведомление 602 относительно признания безвредности (GRAS), требование освобождения от GRAS для N-ацетил-D-нейраминовой кислоты (NANA), Glycom A/S). Затем полученную этим способом Neu5Ac очищают за несколько стадий. Первая стадия необходима для удаления с использованием фильтрования белков со стадии каталитического получения. После фильтрования из реакционной смеси посредством кристаллизации извлекали безводную Neu5Ac. После стадии первой кристаллизации вещество растворяли снова, обрабатывали активированным углем для удаления окраски и примесей и кристаллизовали еще раз, получая Neu5Ac в форме кристаллического дигидрата. Однако, биокаталитический метод получения сиаловой кислоты является технически осуществимым только в масштабе нескольких сотен кг и не является реалистичным вариантом для получения такой сиаловой кислоты, как Neu5Ac, в масштабе нескольких тонн для применения в пищевых продуктах, таких как продукты питания для детей грудного и ясельного возраста. Для включения Neu5Ac в обычной концентрации, составляющей приблизительно 0,5 г/л, в продукт питания для детей грудного возраста потребуется количество, составляющее примерно 3,75 г Neu5Ac на один кг смеси для питания детей грудного возраста. Таким образом, даже в случае "небольшой" партии продукта на основе смеси для питания детей грудного возраста необходимо несколько тонн вещества. Кроме того, биокаталитический метод получения сиаловой кислоты является слишком затратным для применения в пищевой промышленности в настоящее время.

Помимо биокаталитического способа получения in vitro также существует возможность получения Neu5Ac посредством ферментации с помощью микроорганизмов in vivo. В этом случае используемые ферменты будут продуцироваться внутри микроорганизма, но без последующего выделения, которое описано выше. Скорее, цельную клетку используют в качестве реакционного сосуда, Neu5Ac продуцируется внутри клеток и во время продуцирования Neu5Ac секретируется в окружающую среду. По окончании ферментации Neu5Ac выделяют из культуральной жидкости. Для получения Neu5Ac в литературе описаны, в частности, бактерии, подобные Е. coli, и дрожжи.

В ЕР 1484406 А1 описывается способ получения Neu5Ac с использованием микроорганизма, который обладает способностью продуцировать Neu5Ac, но имеет ограниченную способность или вообще не способен расщеплять Neu5Ac по сравнению со штаммом дикого типа, в результате чего Neu5Ac накапливается в культуральной среде и может быть извлечена оттуда. Для обеспечения продуцирования Neu5Ac данный микроорганизм обладает сильной активностью синтазы N-ацетилнейраминовой кислоты и/или активностью N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразы.

В CN 106929461 А раскрыт способ получения Neu5Ac с использованием клеток Bacillus subtilis, в которых экспрессируются гены, кодирующие глюкозамин-фруктозо-6-фосфат-трансаминазу, глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазу, N-ацетилглюкозамин-изомеразу и синтазу N-ацетилнейраминовой кислоты. Кроме того, у этих клеток делетирован ген ptsG, который кодирует глюкоза-специфичный компонент фосфотрансферазной системы EIICBA. Выхода Neu5Ac, составляющего 0,66 гл^-1, достигали путем культивирования этих клеток в содержащей глюкозу среде.

Zhu D. и соавторы (Zhu, D. et al. (2017) Biotechnol. Lett., 39: 227-234) сообщают, что с использованием высококопийного коэкспрессирующего вектора для сверхэкспрессии связанных с синтезом кодирующих фосфоенолпируват (PEP) генов, pck и ppsA, в Е. coli усиливается продуцирование Neu5Ac. Более конкретно, клетки Е. coli подвергали случайному мутагенезу, и клеточную линию, которая благоприятно росла на среде, содержащей глюкозу, но демонстрировала ограниченный рост или отсутствие какого-либо роста на среде, содержащей Neu5Ac, трансформировали экспрессирующей плазмидой, кодирующей синтазу N-ацетилнейраминовой кислоты и N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу. После окончания периода культивирования клетки собирали посредством центрифугирования, хранили при -20°С в виде так называемых "влажных клеток" и использовали по мере необходимости после размораживания. Для получения Neu5Ac готовили реакционную смесь (30 мл), содержащую N-ацетилглюкозамин (90 г^⋅л^-1), глюкозу (50 г^⋅л^-1), ксилол (10 мл^⋅л^-1) и указанные влажные клетки из расчета 200 г^⋅л^-1, пермеабилизированные вследствие наличия детергента (4 г^⋅л^-1). По завершении реакции in vitro оценивали образование Neu5Ac посредством HPLC.

В US 2003/0109007 А1 раскрыт способ получения Neu5Ac с применением пермеабилизированных микроорганизмов. Способ включает приготовление смеси, содержащей (1) культуру микроорганизма, обладающего активностью альдолазы N-ацетилнейраминовой кислоты или активностью синтетазы N-ацетилнейраминовой кислоты, или смеси, обработанной веществом, происходящим из этой культуры; (2) культуру микроорганизма, способного продуцировать пировиноградную кислоту (или смеси, обработанной веществом, происходящим из этой культуры), или культуру микроорганизма, способного продуцировать фосфоенолпировиноградную кислоту (или смеси, обработанной веществом, происходящим из этой культуры); (3) N-ацетилманнозамин; и (4) источник энергии, который необходим для образования пировиноградной кислоты или фосфоенолпировиноградной кислоты. Смесь готовят в водной среде, содержащей хелатирующий агент или поверхностно-активное вещество, способствующие образованию и накоплению Neu5Ac в такой водной среде. Проводили количественное определение продуктов реакции, используя систему для анализа углеводов. Недостатки вышеупомянутых способов заключаются в том, что получение возможно только в мелком масштабе, и необходим избыток пирувата для смещения равновесия в данной реакции в сторону образования Neu5Ac. Вдобавок, N-ацетилглюкозамин, N-ацетилманнозамин и фосфоенолпируват являются дорогостоящими субстратами для этих реакций.

В WO 2008/040717 А2 раскрыт способ получения Neu5Ac, включающий культивирование микроорганизма в среде, при этом указанный микроорганизм несет гетерологичные гены, кодирующие синтазу сиаловой кислоты (NeuB) и эпимеразу UDP(уридин-дифосфо)-GlcNAc (NeuC), при этом указанный микроорганизм не лишен гена, кодирующего синтазу CMP-Neu5Ac (NeuA), либо при этом любые гены, кодирующие синтазу CMP-Neu5Ac (NeuA), инактивированы или делетированы, и при этом эндогенные гены, кодирующие альдолазу сиаловых кислот (NanA), переносчик сиаловых кислот (NanT) и возможно ManNAc-киназу (NanK), делетированы или инактивированы. Neu5Ac была очищена из супернатанта (из 2 литров) культуры путем осаждения с использованием ледяной уксусной кислоты.

WO 2008/097366 А2 относится к Neu5Ac-продуцирующим клеткам Е. coli с генетически измененным метаболизмом. В указанных клетках гены nanT (переносчика сиаловых кислот) и nanA (альдолазы сиаловых кислот) инактивированы, а гены neuC и neuB, которые способствуют биосинтезу Neu5Ac в Neisseria meningitidis группы В, введены и сверхэкспрессированы с использованием экспрессирующих плазмид в указанных клетках nanT-nanA Е. coli. В дополнение к этому, совместно с neuB и neuC сверхэкспрессируется ген глюкозаминсинтазы из Е. coli (glmS). Neu5Ac очищали из культуральной жидкости посредством ионообменной хроматографии.

CN 106929461 А относится к генетически модифицированному штамму Bacillus subtilis с улучшенным продуцированием Neu5Ac. Количество Neu5Ac в ферментируемых культурах определяли посредством HPLC. Соответственно, цель заключалась в получении микроорганизмов, которые способны продуцировать Neu5Ac более эффективно в промышленном масштабе и с применением недорогостоящего источника углерода в качестве единственного источника углерода.

В WO 2012/083329 А1 раскрыты способы и агенты для получения Neu5Ac с использованием генетически модифицированных клеток грибов рода Trichoderma, которые конститутивно экспрессируют N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу и синтазу N-ацетилнейраминовой кислоты. Такие клетки Trichoderma культивировали в присутствии GlcNAc. Мицелий таких штаммов Trichoderma анализировали на предмет наличия Neu5Ac посредством HPLC-MS (масс-спектрометрия).

В ЕР 0474410 А2 раскрыт способ получения Neu5Ac путем гидролиза делипидизированного яичного желтка. Способ включает стадии обессоливания раствора, содержащего Neu5Ac, полученного путем гидролиза делипидизированного яичного желтка, адсорбирования Neu5Ac на анионообменной смоле и затем элюирования Neu5Ac. Обессоливания можно достичь путем использования мембраны обратного осмоса, мембраны для электродиализа или диализной мембраны. Процесс адсорбирования может включать пропускание обессоленного гидролизата через катионообменную смолу и дальнейшее пропускание его через анионообменную смолу. Конечный элюат сушили при пониженном давлении, получая твердое вещество.

В JP 08-119986 А описывается способ очистки Neu5Ac или ее аналога, включающий синтез Neu5Ac посредством реакции конденсации N-ацетилманнозамина с пировиноградной кислотой в присутствии альдолазы сиаловых кислот. Раствор, содержащий Neu5Ac или ее аналог, концентрируют, используя испаритель. Концентрированный раствор смешивают с органической кислотой, содержащей два или три атома углерода. После этого смесь нагревают до 50°С и оставляют стоять при 4°С с целью осаждения белых кристаллов Neu5Ac.

Существующие попытки получения очищенной сиаловой кислоты включали только мелкомасштабные примеры, но на сегодняшний день не существует никакого способа очистки сиаловой кислоты из ферментационного бульона в больших масштабах с достижением и чистоты, и качества, пригодных для применения в пищевой промышленности.

Цель настоящего изобретения заключалась в разработке способа крупномасштабной (в промышленных масштабах) очистки с получением сиаловой кислоты (например, Neu5Ac) высокой степени чистоты. В частности, данный способ должен быть пригоден для получения сиаловой кислоты в масштабе от нескольких кг до нескольких тонн с качеством, подходящим для применения в пищевой промышленности, и должен быть пригоден для выполнения в непрерывном режиме.

Цель достигается путем разработки способа по п. 1, композиции по п. 19, пищевой композиции по п. 22, жидкого, готового к применению продукта питания для детей грудного или ясельного возраста по п. 29, высушенного распылением продукта на основе смеси для детей грудного возраста по п. 30, пищевой добавки по п. 31, премикса по п. 32 и применения композиции по п. 34. Зависимые пункты формулы изобретения иллюстрируют предпочтительные воплощения.

Согласно изобретению предложен способ очистки сиаловой кислоты из ферментационного бульона. Данный способ включает следующие стадии:

удаление биомассы из ферментационного бульона, содержащего сиаловую кислоту, при этом получается осветленный раствор,

получение очищенного раствора путем подвергания осветленного раствора:

обработке на катионообменнике с использованием катионообменного материала, при этом обработку на катионообменнике осуществляют в условиях, при которых сиаловая кислота проходит через катионообменный материал и присутствует в проходящем потоке; и

обработке на анионообменнике с использованием анионообменного материала, при этом обработку на анионообменнике осуществляют в условиях, при которых сиаловая кислота проходит через анионообменный материал и присутствует в проходящем потоке; и

удаление солей из очищенного раствора путем электродиализа.

Способ по изобретению подходит для получения желаемой сиаловой кислоты с высокой степенью чистоты (с качеством, пригодным для применения в пищевой промышленности) и в больших масштабах (в промышленных масштабах в диапазоне от одного кг до нескольких тонн за один цикл). Помимо этого, способ по изобретению может быть осуществлен очень быстро и без больших затрат. Следовательно, он может быть проведен очень экономичным образом. Кроме того, способ может быть осуществлен периодическим или непрерывным образом. Последнее еще больше улучшает выход получаемого продукта в единицу времени. По окончании применения способа чистота сиаловой кислоты может составлять выше 80%, предпочтительно выше 90%, более предпочтительно выше 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 98%.

Преимущество предложенного способа очистки сиаловой кислоты также заключается в том, что препарат сиаловой кислоты не содержит рекомбинантной ДНК и рекомбинантных белков, происходящих при ферментации из рекомбинантных микробных штаммов, которые используют для получения желаемой сиаловой кислоты.

Несмотря на то, что способ по изобретению был задуман для очистки конкретной сиаловой кислоты (например, Neu5Ac) из ферментационного бульона, указанный способ также может быть применен для очистки конкретной сиаловой кислоты, получаемой с использованием ферментативной реакции in vitro, так называемой биокаталитической реакции in vitro, или с использованием метода биокатализа с применением пермеабилизированных цельных клеток. Очевидно, что при очистке сиаловой кислоты из реакционной смеси в случае биокаталитической реакции in vitro нет необходимости в удалении биомассы из реакционной смеси. Таким образом, реакционная смесь в случае биокаталитической реакции in vitro соответствует осветленному технологическому потоку.

Определения

Согласно изобретению, термин "чистота" относится к химической чистоте и конкретизирует степень, до которой вещество, такое как конкретная индивидуальная сиаловая кислота, является неразбавленным или несмешанным с посторонними веществами. Таким образом, химическая чистота представляет собой показатель взаимосвязи между индивидуальным веществом и побочными продуктами/примесями. Химическую чистоту выражают в виде процентного содержания (%) и рассчитывают, используя следующую формулу:

В композиции, содержащей сиаловую кислоту, чистота сиаловой кислоты может быть определена любым подходящим методом, известным специалисту в данной области техники, например, посредством использования HPLC. Соответствующий детектор может представлять собой детектор, выбранный из группы, состоящей из электрохимического детектора, рефрактометрического (RI) детектора, масс-спектрометрического (MS) детектора, диодного матричного детектора (DAD) и детектора ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Например, в случае HPLC это есть отношение площади под пиком, представляющим количество конкретной сиаловой кислоты (например, Neu5Ac), к сумме площадей под пиками, представляющими как количество конкретной сиаловой кислоты, так и соединений, отличающихся от этой конкретной сиаловой кислоты, на одной и той же хроматограмме. Тем не менее, это подразумевает, что выбранным методом с использованием HPLC могут быть проанализированы все примеси. В противном случае необходим подход, основанный на балансе масс, т.е. на определении абсолютного количества желаемого продукта (например, Neu5Ac). В указанном подходе в качестве референсного вещества для количественного определения чистоты используют чистые вещества, и чистоту тогда оценивают для полученного продукта в виде сухого вещества (желаемого продукта со всеми примесями). Указанный подход, основанный на балансе масс, также можно использовать для определения чистоты согласно изобретению.

В соответствии с данным изобретением термин "сиаловая кислота" относится к сиаловой кислоте, выбранной среди членов семейства всех сиаловых кислот. Так, согласно изобретению, подлежащая очистке сиаловая кислота предпочтительно представляет собой N- или О-замещенное производное нейраминовой кислоты, более предпочтительно N-замещенное производное нейраминовой кислоты, еще более предпочтительно N-ацетилнейраминовую кислоту (2-кето-5-ацетамидо-3,5-дидезокси-D-глицеро-D-галактононулопираноз-1-оновую кислоту, сокращенно обозначаемую как "Neu5Ac" или "NANA"), N-гликолилнейраминовую кислоту (сокращенно обозначаемую как "Neu5Gc") или 2-дезокси-2,3-дидегидро-N-ацетилнейраминовую кислоту (сокращенно обозначаемую как "Neu2en5Ac" или "DANA"). В особенно предпочтительном воплощении изобретения сиаловая кислота представляет собой N-ацетилнейраминовую кислоту ("Neu5Ac" или "NANA").

Согласно изобретению, термин "культуральная жидкость" относится к любой жидкости после проведения ферментации, которая содержит сиаловую кислоту, подлежащую очистке. Термины "культуральная жидкость", "ферментационный бульон" и "культуральная среда" используют в данном описании как синонимы. Культуральная жидкость содержит сиаловую кислоту, которая подлежит очистке, а также биомассу (например, биологические клетки и клеточный дебрис), компоненты среды, соли и примеси типа других кислот и окрашенных соединений. Чистота подлежащей очистке сиаловой кислоты в пределах культуральной жидкости может составлять меньше 80%. Биологическими клетками, содержащимися в культуральной жидкости, являются биологические клетки, которые внутриклеточно продуцируют желаемую сиаловую кислоту (например, Neu5Ac) и секретируют продуцируемую сиаловую кислоту в жидкую культуральную среду. Биологические клетки могут включать или представлять собой генетически модифицированные биологические клетки, например, генетически модифицированные клетки Е. coli. Генетическая модификация может включать или представлять собой модификацию с целью получения индивидуальной (желаемой) сиаловой кислоты (например, Neu5Ac), в частности во время фазы роста указанных биологических клеток.

Термин "биомасса", использованный в данном описании, относится ко всей совокупности биологических клеток, находящихся в ферментационном бульоне по окончании стадии ферментации. Биомасса включает в себя клетки микроорганизма, которые продуцировали желаемую сиаловую кислоту (например, Neu5Ac), дочерние клетки микроорганизма, которые могут утратить свою способность продуцировать желаемую сиаловую кислоту (например, Neu5Ac) в ходе стадии ферментации, а также какие-либо другие клетки, которые случайно находятся в ферментационном бульоне по окончании стадии ферментации. Поэтому по существу все биологические клетки, находящиеся в ферментационном бульоне по окончании стадии ферментации, отделяют от ферментационного бульона, в результате чего осветленный ферментационный бульон, т.е. технологический поток, по существу не содержит клеток.

Термин "технологический поток" относится к любому раствору, содержащему конкретную сиаловую кислоту, которая подлежит очистке.

Термин "проходящий поток" относится к раствору, содержащему сиаловую кислоту, подлежащую очистке, который только что прошел через ионообменный материал (т.е. катионо- и/или анионообменный материал), т.е. представляет собой подвижную фазу, содержащую сиаловую кислоту после контакта с твердой фазой ионообменного материала. Другими словами, сиаловая кислота, находящаяся в проходящем потоке, не была адсорбирована или не абсорбировалась неподвижной фазой.

Согласно данному изобретению различие между слабым катионообменным материалом и сильным катионообменным материалом заключается в том, что химические группы, подходящие для ионного обмена, у первого, имеют значения pKa, составляющие по меньшей мере 1 (например, pKa от 2 до 5, аналогично карбоксилатной группе), тогда как у последнего имеют значения pKa меньше 1 (например, pKa от -4 до 0, аналогично сульфогруппе).

Получение осветленного раствора

Биомасса может быть удалена из ферментационного бульона посредством центрифугирования и/или фильтрации.

В методах центрифугирования, подходящих для удаления биомассы из культуральной жидкости, биомассу получают в виде осадка после центрифугирования, а супернатант в виде осветленного технологического потока, который подвергают дальнейшим обработкам. В методах фильтрации, подходящих для удаления биомассы из культуральной жидкости, фильтрат становится осветленным технологический потоком. Предпочтительным методом фильтрации для удаления биомассы является микрофильтрация и/или ультрафильтрация. При проведении ультрафильтрации могут быть удалены даже более мелкие частицы, чем при использовании микрофильтрации. Возможно, что ультрафильтрация представляет собой ультрафильтрацию в режиме с тангенциальным потоком.

Микрофильтрация представляет собой способ физического разделения, при котором содержащую частицы жидкость пропускают через среду, при этом указанная среда представляет собой либо пористое вещество, содержащее извилистые каналы для удержания частиц (глубинное фильтрование) и/или мембрану с определенным размером пор, позволяющую проходить частицам/молекулам, размер которых меньше указанного размера пор (мембранная фильтрация или тупиковая фильтрация). Термин "микрофильтрация", использованный в данном описании, относится к способу физического разделения, при котором биологические клетки (и клеточный дебрис) удаляют из ферментационного бульона, получая (осветленный) технологический поток.

Ультрафильтрация представляет собой форму мембранной фильтрации, которая радикально не отличается от тупиковой микрофильтрации. При проведении ультрафильтрации силы, создаваемые градиентами давления и концентрации, приводят к удалению частиц и больших молекул растворенных веществ путем пропускания жидкости, содержащей такие частицы и большие молекулы растворенных веществ, через полупроницаемую мембрану, в результате чего частицы и большие молекулы растворенных веществ будут удерживаться в так называемом ретентате, в то время как вода и низкомолекулярные растворенные вещества, такие как подлежащая очистке сиаловая кислота, проходят через мембрану в пермеат (фильтрат). Ультрафильтрационные мембраны характеризуются в соответствии с их значением отсечения по молекулярной массе (MWCO), которое описывает максимальную молекулярную массу молекулы растворенного вещества, которая может пройти через мембрану в пермеат. Любые частицы, а также молекулы размером больше MWCO, не способны пройти через мембрану и остаются в ретентате. Ультрафильтрация может применяться в режиме с тангенциальным потоком, когда поток жидкости параллелен поверхности мембраны, или в тупиковом режиме, когда поток жидкости перпендикулярен поверхности мембраны.

Неограничивающие примеры и подходящие фильтры для микрофильтрации и/или ультрафильтрации для удаления биомассы из ферментационного бульона включают SPIRA-CEL^® DS МР005 4333, который представляет собой модуль, содержащий полиэфирсульфоновую мембрану с намоткой по спирали для обеспечения компактной конструкции и лучшей производительности и имеющую номинальный размер пор 0,05 пм для ультрафильтрационных применений. Подходящие мембраны для удаления биомассы посредством микрофильтрации могут иметь размер пор по меньшей мере 0,2 пм. Альтернативно, удаление биомассы может быть выполнено посредством микрофильтрации с применением мембран, имеющих MWCO от 100 до 1000 кДа, предпочтительно от 150 кДа до 500 кДа, для удаления биомассы и дополнительного клеточного дебриса, такого как более крупные белки. Например, в качестве альтернативы можно использовать FS10-FC FUS1582 (Microdyn-Nadir GmbH, Wiesbaden, DE), ультрафильтрационный модуль на полых волокнах, в котором применяется полиэфирсульфоновая мембрана (5 м²) с MWCO 150000 дальтон (150 кДа).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении более мелкие частицы и большие молекулы растворенных веществ удаляют из осветленного технологического потока с использованием ультрафильтрации в режиме с тангенциальным потоком. Здесь осветленный технологический поток может быть подвергнут стадии ультрафильтрации с применением фильтра, имеющего MWCO равное 10 кДа, например, Spira-Cel DSUP010 (Microdyn-Nadir GmbH, Wiesbaden, DE), ультрафильтрационного модуля с намоткой по спирали с использованием полиэфирсульфоновой мембраны (5,7 м²) с MWCO 10000 дальтон (10 кДа).

В итоге, в настоящем изобретении могут быть использованы следующие возможности для удаления биомассы из ферментационного бульона:

1) сбор посредством центрифугирования. Нерастворенные части удаляют из культуральной жидкости за одну стадию. Преимущество: быстрое удаление нерастворенных частей;

2) сбор посредством микрофильтрации. Нерастворенные части и большие молекулы выше определенного размера удаляют из культуральной жидкости за одну стадию. При проведении микрофильтрации можно использовать мембраны с намоткой по спирали или фильтровальное устройство на полых волокнах в режиме с тангенциальным потоком. Можно использовать микрофильтрационные мембраны, которые имеют значение отсечения по молекулярной массе >500 кДа, более предпочтительно >150 кДа. Преимущество: быстрое удаление нерастворенных частей и больших молекул выше определенного размера;

3) сбор посредством ультрафильтрации. Нерастворенные части, большие молекулы и малые молекулы выше определенного размера удаляют из культуральной жидкости за одну стадию. При проведении ультрафильтрации можно использовать мембраны с намоткой по спирали или фильтровальное устройство на полых волокнах в режиме с тангенциальным потоком. Можно использовать ультрафильтрационные мембраны, которые имеют значение отсечения по молекулярной массе <100 кДа, более предпочтительно <10 кДа. Преимущество: быстрое удаление нерастворенных частей, больших молекул и малых молекул выше определенного размера;

4) сбор посредством центрифугирования в сочетании с микрофильтрацией. Нерастворенные части и большие молекулы выше определенного размера удаляют из культуральной жидкости за две стадии. При проведении микрофильтрации можно использовать мембраны с намоткой по спирали или фильтровальное устройство на полых волокнах в режиме с тангенциальным потоком. Можно использовать микрофильтрационные мембраны, которые имеют значение отсечения по молекулярной массе >500 кДа, более предпочтительно >150 кДа. Преимущество: быстрое удаление нерастворенных частей и больших молекул выше определенного размера без забивания пор в мембранах или фильтрах, используемых при проведении микрофильтрации;

5) сбор посредством центрифугирования в сочетании с ультрафильтрацией. Нерастворенные части, большие молекулы и малые молекулы выше определенного размера удаляют из культуральной жидкости за две стадии. При проведении ультрафильтрации можно использовать мембраны с намоткой по спирали или фильтровальное устройство на полых волокнах в режиме с тангенциальным потоком. Можно использовать ультрафильтрационные мембраны, которые имеют значение отсечения по молекулярной массе <100 кДа, более предпочтительно <10 кДа. Преимущество: быстрое удаление нерастворенных частей, больших молекул и малых молекул выше определенного размера без забивания пор в мембранах или фильтрах, используемых при проведении ультрафильтрации;

6) сбор посредством микрофильтрации в сочетании со стадией ультрафильтрации. Нерастворенные части, большие молекулы и малые молекулы выше определенного размера удаляют из культуральной жидкости за две стадии. При проведении микрофильтрации и/или ультрафильтрации можно использовать мембраны с намоткой по спирали или фильтровальное устройство на полых волокнах в режиме с тангенциальным потоком. Можно использовать микрофильтрационные мембраны, которые имеют значение отсечения по молекулярной массе >500 кДа, более предпочтительно >150 кДа. Можно использовать ультрафильтрационные мембраны, которые имеют значение отсечения по молекулярной массе <100 кДа, более предпочтительно <10 кДа. Преимущество: наиболее быстрое удаление нерастворенных частей, больших молекул и малых молекул выше определенного размера со сниженным риском забивания пор в мембранах или фильтрах, используемых при проведении ультрафильтрации.

Осветленный технологический поток, содержащий сиаловую кислоту, обычно может содержать значительное количество нежелательных примесей, включая (но не ограничиваясь этим) одновалентные ионы, двухвалентные ионы, аминокислоты, полипептиды, белки, органические кислоты, нуклеиновые кислоты, моносахариды и/или олигосахариды.

Стадии, которые предпочтительно отсутствуют в способе по изобретению

Способ по изобретению может отличаться тем, что данный способ не включает хроматографического разделения. Преимущество заключается в том, что данный способ можно быть выполнен быстрее и с меньшими затратами, потому что отпадают затраты времени и средств на приготовление элюирующего раствора и его использование для элюирования сиаловой кислоты с твердой фазы.

Кроме того, способ по изобретению может отличаться тем, что он не включает применение этанола и/или этилацетата, возможно не включает применение какого-либо органического растворителя. Преимущество заключается в том, что он может гарантировать отсутствие этанола и/или этилацетата в конечном продукте, конечной сиаловой кислоте или композиции, содержащей сиаловую кислоту, возможно отсутствие какого-либо органического растворителя. Помимо этого данный способ становится менее затратным и более безопасным для работников.

Кроме того, способ по изобретению может отличаться тем, что он не включает стадии элюирования сиаловой кислоты с неподвижной фазы с использованием раствора, содержащего органический растворитель. Преимущество заключается в том, что очищенную сиаловую кислоту можно хранить без какого-либо органического растворителя. Помимо этого данный способ становится менее затратным и более безопасным для работников.

Более того, способ по изобретению может отличаться тем, что он не включает применения тяжелого металла. Преимущество заключается в том, что он может гарантировать отсутствие тяжелых металлов в очищенной сиаловой кислоте.

Кроме того, способ по изобретению может отличаться тем, что он не включает стадию нагревания ферментационного бульона, осветленного раствора и/или очищенного раствора до температуры выше 45°С. Преимущество заключается в том, что по сравнению со способами предшествующего уровня техники, в которых используется такая стадия тепловой обработки, экономится энергия на нагревание соответствующих растворов, что делает данный способ более экономичным и более экологичным.

Обработка на катионообменнике

Катионы могут быть удалены из осветленного технологического потока среди других примесей на стадии обработки на катионообменнике способа по изобретению, т.е. путем применения по меньшей мере одной обработки на катионообменнике осветленного технологического потока. Конкретно, катионы заменяют на другие катионы, которые связываются с катионообменным материалом (неподвижной фазой) перед тем, как осветленный технологический поток подают на стадию обработки на катионообменнике. Важно, что было обнаружено, что в результате обработки на катионообменнике из осветленного технологического потока удаляется аммиак и часть загрязняющих белков.

На стадии обработки на катионообменнике положительно заряженные вещества могут быть удалены из не содержащей клеток культуральной жидкости, поскольку они связываются со смолой. Водный раствор сиаловой кислоты приводят в контакт любым подходящим способом, который позволяет положительно заряженным веществам адсорбироваться на катионообменном материале, в то время как сиаловая кислота проходит через него. Жидкость, полученная после приведения в контакт с катионообменной смолой, содержит воду, определенные катионы (те, которые были иммобилизованы на катионообменном материале до проведения этой стадии), анионы, окрашивающие вещества и желаемую сиаловую кислоту.

Обработка на катионообменнике может быть проведена с применением слабого катионообменного материала или с применением сильного катионообменного материала, предпочтительно ее проводят с применением сильного катионообменного материала.

При обработке на катионообменнике согласно способу по изобретению можно использовать сильный катионообменник. Подходящие для удаления положительно заряженных веществ катионообменные смолы представляют собой сильнокислотные катионообменные смолы, такие как смолы, которые содержат карбоксильную группу (слабый катионообменник) или сульфогруппу (сильный катионообменник), присоединенную к твердому остову (например, к полистирольному остову). Подходящие смолы включают (но не ограничиваются этим) Lewatit^® S2568 (Н⁺) (Lanxess AG, Cologne, DE), Dowex^® 50WX2 (Merck KGaA, Darmstadt, DE); Amberlite^® IR-116 (Japan Organo Co., Ltd.) и Diaion™ SK-102 (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd).

Стадия обработки на катионообменнике может представлять собой первую стадию после удаления биомассы из культуральной среды, т.е. первую стадию, которой подвергают осветленную культуральную среду.

Неспецифические катионы предпочтительно заменяют на конкретный катион Н⁺ или Na⁺. Если неспецифические катионы заменяют на Н⁺, то значение рН в проходящем потоке предпочтительно доводят до рН 6-8 перед проведением последующей стадии обработки (например, обработки на анионообменнике), наиболее предпочтительно путем добавления NaOH к проходящему потоку.

В предпочтительном воплощении перед нанесением на катионообменник осветленного технологического потока катионообменный материал находится в Н⁺-форме, т.е. обменивающийся ионами лиганд на катионообменном материале протонирован. Это приводит к тому, что при проведении катионного обмена катионы в осветленном технологическом потоке заменяются на Н⁺. Поэтому значение рН раствора после завершения указанной стадии (в проходящем потоке) оказывается соответствующим более кислым средам, чем значение рН раствора до проведения указанной стадии. Предпочтительно, чтобы перед проведением последующих стадий очистки значение рН в проходящем потоке было повышено до нейтрального или почти нейтрального значения рН (например, рН ≥6,5 и рН ≤7,5). Повышение значения рН может быть достигнуто путем добавления NaOH в технологический поток. Ввиду этого сиаловая кислота в протонированной форме (Н⁺-форме) преобразуется в соль сиаловой кислоты. В случае добавления NaOH получают сиаловую кислоту в форме натриевой соли (в Na⁺-форме).

В качестве противоиона в катионообменнике может быть использован ион любого щелочного металла (Li⁺, Na⁺, K⁺), ион щелочноземельного металла (такой как Са²⁺, Mg²⁺), ион аммония или карбонат-ион. Предпочтительно, противоионом катионообменника является ион натрия (Na⁺). Более предпочтительно, противоионом катионообменника является ион водорода (Н⁺). Преимущество иона водорода как противоиона заключается в том, что в результате приведения в контакт с катионообменным материалом образуется протонированная форма сиаловой кислоты, и она обнаруживается в проходящем потоке, т.е. в растворе, прошедшем через катионообменный материал. После этого протонированная форма сиаловой кислоты может быть нейтрализована путем добавления основания (например, NaOH) в содержащий продукт поток, в результате чего сиаловая кислота преобразуется в свою солевую форму (например, натриевую форму). Наличие натриевой формы сиаловой кислоты предпочтительно, поскольку ионы натрия являются относительно небольшими катионами и могут быть с большей легкостью удалены посредством нанофильтрации и/или электродиализа, чем более крупные катионы.

Предпочтительно, стадию обработки на катионообменнике осуществляют перед стадией обработки на анионообменнике. Преимущество этой последовательности заключается в том, что технологический поток, который прошел анионообменный материал и содержит желаемую сиаловую кислоту, имеет низкую концентрацию солей, поскольку сиаловая кислота не связывается с катионообменным материалом (т.е. находится в проходящем потоке). Затем указанный проходящий поток можно применять для обработки на анионообменнике без необходимости в стадии обессоливания. Однако, в принципе, обработка на катионообменнике также может быть проведена после стадии обработки на анионообменнике.

Размер частиц катионообменной смолы предпочтительно находится в диапазоне от 0,1 до 1 мм. Такой диапазон размера частиц способствует эффективному прохождению используемой не содержащей клеток культуральной жидкости, по-прежнему с одновременным эффективным удалением заряженных веществ на катионообменной смоле. Чтобы обеспечить эффективный обмен ионов, объемная скорость потока предпочтительно должна составлять от 0,5 до 2,5 объема хроматографического слоя, более предпочтительно от 1,0 до 2,0 объема хроматографического слоя. Обработка на ионообменнике может быть осуществлена традиционным образом, например, партиями или непрерывно, предпочтительно непрерывно.

Условия, при которых сиаловая кислота проходит через катионообменный материал, могут быть установлены путем регулировки рН и/или концентрации солей в осветленном растворе, предпочтительно путем доведения рН осветленного раствора до значения рН в диапазоне 6-8 и/или путем подведения концентрации солей, если необходимо.

После обработки на катионообменнике и обработки на анионообменнике очищенный раствор может содержать сиаловую кислоту, придающие окраску вещества и соль, при этом соль предпочтительно представляет собой NaCl. Согласно предпочтительному воплощению изобретения, при обработке на анионообменнике анионообменный материал используют в хлоридной форме.

Согласно следующему предпочтительному воплощению изобретения при обработке на катионообменнике катионообменный материал используют в водородной форме. Было обнаружено, что использование катионообменника в водородной форме (противоионом является Н⁺) является предпочтительным, поскольку достигается гораздо лучшее связывание солей и загрязняющих белков по сравнению с катионообменным материалом в любой другой форме (противоионом не является Н⁺). Применение водородной формы приводит к тому, что проходящий поток имеет соответствующее более кислым средам значение рН, чем раствор, который наносили для проведения обработки на катионообменнике. Однако, указанное значение рН можно легко повысить путем добавления основания, предпочтительно NaOH, до нейтрального значения рН, предпочтительно до значения рН в диапазоне 6-8. Осуществление нейтрализации с использованием NaOH предпочтительно, поскольку введенные ионы натрия являются относительно небольшими и могут быть легко удалены посредством нанофильтрации и/или электродиализа.

Размер частиц катионообменной смолы следует выбирать таким, чтобы способствовать эффективному прохождению используемой не содержащей клеток культуральной жидкости по-прежнему с одновременным эффективным удалением заряженных веществ на катионообменной смоле. Чтобы обеспечить эффективный обмен ионов, объемная скорость потока предпочтительно должна составлять от 0,2 до 2,0 объема хроматографического слоя, более предпочтительно от 0,5 до 1,5 объема хроматографического слоя. Обработка на ионообменнике может быть осуществлена традиционным образом, например, партиями или непрерывно, предпочтительно непрерывно.

Сначала осветленный раствор может быть подвергнут обработке на катионообменнике, а затем обработке на анионообменнике. Преимущество такой последовательности в способе заключается в том, что катионообменный материал может быть в Н⁺-форме для получения сильного связывания загрязняющих белков, а после нейтрализации с использованием основания (например, NaOH) через анионообменный материал может быть пропущен раствор, содержащий сиаловую кислоту в определенной солевой форме (например, сиаловую кислоту в Na⁺-форме).

Обработка на анионообменнике

Предпочтительно, стадию обработки на анионообменнике осуществляют после стадии обработки на катионообменнике. Однако, в принципе, она также может быть проведена до стадии обработки на катионообменнике, т.е. до того, как технологический поток будет обработан на катионообменнике.

Стадию обработки на анионообменнике проводят для удаления неспецифических анионов и замены их на конкретные анионы, предпочтительно на конкретный анион Cl^- или ОН^-. Если неспецифические анионы заменяют на Cl^-, то значение рН в проходящем потоке предпочтительно доводят до рН 6-8 перед проведением последующей стадии обработки (например, удаление солей из очищенного раствора путем электродиализа), наиболее предпочтительно путем добавления NaOH к проходящему потоку.

Анионы могут быть удалены из осветленного технологического потока на стадии обработки на анионообменнике способа по изобретению, т.е. посредством применения по меньшей мере одной обработки на анионообменнике в отношении осветленного технологического потока. Стадия обработки на анионообменнике может представлять собой первую стадию после удаления биомассы из культуральной среды, т.е. первую стадию, которой подвергают осветленную культуральную среду. Предпочтительно, стадию обработки на анионообменнике проводят на стадии, осуществляемой после стадии обработки на катионообменнике.

Отрицательно заряженные вещества могут быть удалены из технологического потока, поскольку они связываются с анионообменной смолой. Водный раствор, содержащий желаемую сиаловую кислоту, приводят в контакт любым подходящим способом, который позволяет отрицательно заряженным веществам адсорбироваться на анионообменном материале, в то время как сиаловая кислота проходит через него. Полученная жидкость после приведения в контакт с анионообменной смолой содержит воду, определенные катионы, определенные анионы, окрашивающие вещества и желаемую сиаловую кислоту. Условия стадии с применением анионообменника таковы, что сиаловая кислота не связывается с анионообменным материалом, т.е. находится в проходящем потоке после контакта с материалом.

В начале обработки на анионообменнике значение рН содержащего продукт потока предпочтительно доводят до рН 6-8 (наиболее предпочтительно до рН 7). Проходящий поток (содержащий продукт поток, прошедший через анионообменный материал) может иметь более низкое значение рН, например, рН в диапазоне от 4,5 до 6. При этом значении рН сиаловая кислота находится в натриевой форме. Значение рН в проходящем потоке может быть повышено путем добавления основания, например, NaOH.

Во время обмена анионов анионы в осветленном технологическом потоке могут быть заменены на Cl^-. Поэтому значение рН в технологическом потоке становится соответствующим немного более кислым средам. Предпочтительно, значение рН повышают перед последующими стадиями очистки, предпочтительно до достижения нейтрального или почти нейтрального значения рН (т.е. рН ≥6,5 и рН ≤7,5) в технологическом потоке. Более предпочтительно, данного повышения значения рН в технологическом потоке достигают путем добавления в технологический поток NaOH.

Анионообменник может представлять собой слабый анионообменник или сильный анионообменник, предпочтительно сильный анионообменник.

Подходящими сильноосновными анионообменными смолами являются смолы, которые содержат группу триметиламмония или гидроксиэтильную группу, соединенную с твердым остовом (например, с полистирольным остовом). Подходящие смолы включают (но не ограничиваются этим) Lewatit^® S6368 А, Lewatit^® S4268, Lewatit^® S5528, Lewatit^® S6368A (Lanxess AG, Cologne, DE), Dowex^® AG 1x2 (200-400 меш), Dowex^® 1x8 (100-200 меш), Purolite^® Chromalite CGA100x4 (Purolite GmbH, Ratingen, DE), Amberlite^® FPA51 (Dow Chemicals, MI, USA). Анионообменная смола предпочтительно находится в хлоридной форме. Подходящими слабыми анионообменными смолами являются смолы, которые содержат аминогруппу, соединенную с твердым остовом (например, с полистирольным остовом).

Анионообменник может быть использован с любым основанием в качестве противоиона, например, НСО₃^-, I^-, Br^-, NO₃^-. Предпочтительно, противоионом является гидроксид-ион (ОН^-). Более предпочтительно, противоионом является хлорид-ион (Cl^-). Преимущество использования хлорид-иона в качестве противоиона заключается в том, что анион Cl^- меньше многих других анионов, которые изначально присутствуют в ферментационном бульоне. Это приводит к тому, что анион хлора может быть более легко удален из технологического потока путем электродиализа. Преимущество использования аниона ОН^- в качестве противоиона заключается в том, что, когда на стадии после обработки на анионообменнике рН подводят к нейтральному значению с использованием HCl, тогда в технологический поток вводят небольшой анион хлора, который может быть более легко удален, чем другие анионы.

Размер частиц анионообменной смолы предпочтительно находится в диапазоне от 0,1 до 1 мм, что способствует эффективному прохождению используемого технологического потока по-прежнему с одновременным эффективным удалением заряженных веществ на анионообменной смоле. Чтобы обеспечить эффективный обмен ионов, объемная скорость потока предпочтительно должна составлять от 0,5 до 2,5 объема хроматографического слоя, более предпочтительно от 1,0 до 2,0 объема хроматографического слоя. Обработка на ионообменнике может быть осуществлена традиционным образом, например, партиями или непрерывно, предпочтительно непрерывно.

Условия, при которых сиаловая кислота проходит через анионообменный материал, могут быть установлены путем регулировки рН и/или концентрации солей в осветленном растворе, предпочтительно путем доведения рН осветленного раствора до значения рН в диапазоне 6-8 и/или путем подведения концентрации солей, если необходимо. Например, отмечено, что, если раствор, содержащий сиаловую кислоту, который получен в результате обработки проходящего потока на катионообменнике с Н⁺ в качестве противоиона и в котором значение рН подведено до 6-8 путем добавления NaOH, подвергают обработке на анионообменнике, то концентрация солей в проходящем потоке оказывается достаточно высокой, чтобы предотвратить связывание сиаловой кислоты с анионообменной смолой. Тем не менее отмечено, что нежелательные примеси (например, некоторые белки, молекулы ДНК и окрашенные вещества) все же связываются с анионообменной смолой в указанных условиях.

В предпочтительном воплощении способ очистки включает обработку с использованием катионообменной смолы в водородной (Н⁺) форме и анионообменной смолы в хлоридной (Cl^-) форме. Катионообменная смола предпочтительно представляет собой сильный катионообменник. Анионообменник может быть слабым или сильным анионообменником, предпочтительно он является сильным анионообменником. Кроме того, анионообменный материал также может представлять собой абсорбирующий материал. Обработка с использованием как катионообменной смолы, так и анионообменной смолы позволяет удалить все неспецифические ионы из содержащего продукт потока. Таким образом, неспецифические ионы могут быть заменены на конкретные ионы, предпочтительно на катион натрия (например, введенный в результате нейтрализации содержащего продукт потока с использованием NaOH после контактирования с катионообменным материалом с Н⁺ в качестве противоиона) и анион хлора. Катион натрия и анион хлора оба являются относительно небольшими ионами и могут быть удалены посредством электродиализа более быстрым и более экономичным образом, чем более крупные ионы.

Концентрирование очищенного раствора

В предпочтительном воплощении раствор после обработки на ионообменнике (проходящий поток), который содержит желаемую сиаловую кислоту (например, N-ацетилнейраминовую кислоту), концентрируют, предпочтительно посредством нанофильтрации, обратного осмоса и/или упаривания в вакууме (например, с применением испарителя с падающей пленкой, роторного испарителя или пластинчатого испарителя). Обратный осмос и/или нанофильтрация представляют собой предпочтительные способы (например, нанофильтрация с применением нанофильтрационной мембраны, имеющей предел исключения по размеру ≥20). Особенно предпочтительной является нанофильтрация. Преимущество нанофильтрации по сравнению с обратным осмосом заключается в том, что нанофильтрация обеспечивает более быстрое концентрирование, а также позволяет частично удалять ионы солей. Преимущество нанофильтрации по сравнению с упариванием в вакууме заключается в том, что никаких реакций карамелизации с сиаловой кислотой не происходит, т.е. в процессе концентрирования не образуется никаких окрашенных "карамельных" продуктов.

Наиболее предпочтительно концентрирование очищенного раствора посредством нанофильтрации, при этом наиболее предпочтительной используемой нанофильтрационной мембраной является мембрана, которая имеет значение отсечения по молекулярной массе в диапазоне 100-200 кДа. Преимущество такого отсечения по молекулярной массе заключается в том, что подлежащая очистке сиаловая кислота удерживается, в то время как ионы солей могут проходить через мембрану, т.е. помимо концентрирования осуществляется обессоливание.

Перед концентрированием раствора концентрация сиаловой кислоты в растворе может составлять ≤20% (масс./масс.), ≤10% (масс./масс.) или ≤5% (масс./масс.).

В ходе этого процесса осветленный раствор и/или очищенный раствор может быть сконцентрирован до концентрации сиаловой кислоты ≥100 г/л, предпочтительно ≥200 г/л, более предпочтительно ≥300 г/л.

Кроме того, осветленный раствор и/или очищенный раствор может быть сконцентрирован посредством нанофильтрации при температуре ниже 80°С, предпочтительно ниже 50°С, более предпочтительно от 4°С до 45°С, более предпочтительно от 10°С до 40°С, еще более предпочтительно в диапазоне 15-30°С, наиболее предпочтительно в диапазоне 15-20°С.

Кроме того, осветленный раствор и/или очищенный раствор может быть сконцентрирован посредством обратного осмоса при температуре от 20°С до 50°С, более предпочтительно от 30°С до 45°С, наиболее предпочтительно от 35°С до 45°С.

Более того, осветленный раствор и/или очищенный раствор может быть сконцентрирован при давлении в диапазоне от выше 5 бар (0,5 МПа) до ниже 50 бар (5 МПа), предпочтительно при давлении в диапазоне от выше 10 бар (1 МПа) до ниже 40 бар (4 МПа), более предпочтительно при давлении в диапазоне от выше 15 до ниже 30 бар (3 МПа).

Обратный осмос представляет собой способ мембранной фильтрации, с помощью которого из раствора (технологического потока) удаляют частицы размером больше 0,1 нм. Из технологического потока будет удалена только вода, в то время как все другие молекулы, например, ионы, сахара и т.д., будут концентрироваться внутри ретентата. При использовании обратного осмоса можно осуществить только повышение концентрации сиаловой кислоты, но без ее обессоливания.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении стадия концентрирования характеризуется по меньшей мере одним из следующих параметров, возможно всеми следующими параметрами:

1) концентрирование проводят до достижения концентрации сиаловой кислоты ≥100 г/л, предпочтительно ≥200 г/л, более предпочтительно ≥300 г/л;

2) концентрирование проводят при температуре ниже 80°С, предпочтительно ≤50°С, более предпочтительно от 4°С до 45°С; наиболее предпочтительно от 4°С до 40°С, если концентрирование проводят посредством нанофильтрации;

3) концентрирование проводят при температуре ниже 50°С, предпочтительно от 20°С до 45°С; наиболее предпочтительно от 30°С до 45°С, более предпочтительно от 35°С до 45°С, если концентрирование проводят посредством обратного осмоса и/или упаривания в вакууме; и

4) концентрирование осуществляют при давлении в диапазоне от выше 5 бар (0,5 МПа) до ниже 50 бар (5 МПа), предпочтительно при давлении в диапазоне от выше 10 бар (1 МПа) до ниже 40 бар (4 МПа), более предпочтительно при давлении в диапазоне от выше 15 до ниже 30 бар (3 МПа).

В другом предпочтительном воплощении изобретения раствор, содержащий сиаловую кислоту, концентрируют после стадии электродиализа с использованием упаривания в вакууме (например, используя испаритель с падающей пленкой или пластинчатый испаритель), обратного осмоса или нанофильтрации (например, нанофильтрации с применением нанофильтрационной мембраны, имеющей предел исключения по размеру>20 А), предпочтительно с использованием нанофильтрации или обратного осмоса, более предпочтительно с использованием нанофильтрации.

Удаление солей

Способ очистки сиаловой кислоты включает стадию, на которой из раствора удаляют соли, предпочтительно удаляют из осветленного раствора и/или очищенного раствора. Удаление солей может быть достигнуто путем обессоливания раствора с использованием нанофильтрации и/или электродиализа.

Нанофильтрация представляет собой метод мембранной фильтрации, при котором мембрана содержит поры нанометрового размера. Нанофильтрационные мембраны имеют размеры пор в диапазоне от 1 до 10 нанометров. Размер пор нанофильтрационных мембран меньше размеров пор, используемых при микрофильтрации, и даже меньше размеров пор ультрафильтрационных мембран, но обычно больше размеров пор мембран, используемых для обратного осмоса. Мембраны для применения при нанофильтрации преимущественно изготавливают из тонких полимерных пленок. Обычно используемые материалы включают полиэтилентерефталат или такие металлы, как алюминий. Плотность пор может находиться в диапазоне от 1 до 10⁶ пор на один см². Нанофильтрацию используют в способе очистки желаемой сиаловой кислоты для повышения концентрации сиаловой кислоты в растворе, например, в осветленный растворе и/или очищенном растворе. Помимо этого происходит обессоливание раствора (технологического потока).

Мембраны, подходящие для нанофильтрации, включают мембраны из полиамида или полипиперазина, тонкопленочного композитного мембранного материала, обеспечивающего исключение по размеру в диапазоне от 150 до 300 Да, например, Dow Filmtec™ NF270 (Dow Chemical Company, USA). Такие мембраны позволяют работать с большим потоком. В частности, нанофильтрационные мембраны с отсечением по молекулярной массе в диапазоне от 100 до 300 кДа выгодны для повышения концентрации желаемой сиаловой кислоты (например, Neu5Ac) в технологическом потоке. Мембраны с таким значением отсечения по молекулярной массе предотвращают прохождение сиаловой кислоты через мембрану и имеют то преимущество, что они также выполняют обессоливание, поскольку соль (например, хлорид натрия), которая имеется в технологическом потоке после обработки на ионообменном(ых) материале(ах), проходит через мембрану и отделяется от сиаловой кислоты. Дополнительные примеры мембран, подходящих для нанофильтрации, включают Trisep 4040-XN45-TSF (Microdyn-Nadir GmbH, Wiesbaden, DE), GE4040F30 и GH4040F50 (GE Water & Process Technologies, Ratingen, DE).

Было обнаружено, что с использованием нанофильтрации эффективно удаляются значительные количества примесей (например, ионов солей) перед обработкой раствора, содержащего сиаловую кислоту, электродиализом. Также было обнаружено, что нанофильтрация эффективна для удаления низкомолекулярных примесей из осветленного ферментационного бульона после удаления биомассы из ферментационного бульона (например, на стадии ультрафильтрации). Удаление низкомолекулярных компонентов оказывается полезным для концентрирования и деминерализации раствора, содержащего сиаловую кислоту, перед обработкой с использованием ионообменника. Применение нанофильтрации для повышения концентрации сиаловой кислоты приводит к снижению энергетических затрат и затрат на переработку, а также к улучшению качества продукта благодаря уменьшению теплового воздействия.

Электродиализ сочетает в себе диализ и электролиз, и его можно использовать для разделения или концентрирования ионов в растворах на основании их селективной электромиграции через полупроницаемую мембрану. Первые применения электродиализа в промышленности датируются началом 1960-х годов, когда этот метод использовали для деминерализации сырной сыворотки с целью включения в смесь для грудных детей. Другие применения электродиализа включают его использование для регулирования рН таких напитков, как вина, виноградное сусло, яблочный сок и апельсиновый сок.

Опреснение слабоминерализованной воды с целью получения питьевой воды и деминерализация молочной сыворотки для производства детского питания являются наиболее распространенными видами применения электродиализа в настоящее время. Основной принцип электродиализа заключается в использовании электролитической ячейки, содержащей пару электродов, погруженных для обеспечения ионной проводимости в электролит и подключенных к источнику постоянного тока. Электрод, соединенный с положительным полюсом источника постоянного тока, представляет собой анод, а электрод, соединенный с отрицательным полюсом, представляет собой катод. Таким образом, раствор электролита поддерживает электрический ток, который обусловлен движением отрицательных и положительных ионов по направлению к аноду и катоду, соответственно. Мембраны, используемые для электродиализа, по существу представляют собой листы из пористых ионообменных смол с отрицательно или положительно заряженными группами и поэтому описываются как катионные или анионные мембраны, соответственно. Ионообменные мембраны обычно изготовлены из полистирола, несущего подходящую функциональную группу (такую как сульфогруппа для катионных мембран или группа четвертичного аммония для анионных мембран), перекрестно сшитого с использованием дивинилбензола.

Электролитом может быть, например, водный раствор, содержащий хлорид натрия, ацетат натрия, пропионат натрия и/или сульфаминовую кислоту. Электролит окружает катод и анод и служит для обеспечения протекания электрического тока внутри ячейки. Затем собирают электродиализный пакет таким образом, чтобы анионные и катионные мембраны располагались параллельно как в фильтр-прессе между двумя электродными блоками, с тем, чтобы поток, подвергающийся обеднению ионами, хорошо отделялся от потока, подвергающегося обогащению ионами (эти два раствора также называются разбавленным раствором (раствором, подвергающимся обеднению ионами) и концентратом (раствором, подвергающимся обогащению ионами)).

Основой процесса электродиализа является использование пакета мембран, который состоит из нескольких разделенных прокладками анионообменных мембран и катионообменных мембран, установленных между двумя электродами. При подключении источника постоянного электрического тока анионы и катионы будут мигрировать сквозь мембраны по направлению к электродам, образуя (обессоленный) поток разбавленного раствора и поток концентрата.

Размер пор ионообменных мембран для применения в электродиализе достаточно мал, чтобы предотвратить диффузию продукта из потока разбавленного раствора в поток концентрата, обусловленную большой разницей в концентрациях между этими двумя потоками. После отделения биомассы и/или обмена катионов и/или анионов должно произойти количественное удаление белков и в особенности молекул рекомбинантной ДНК (изменяющихся в размере от фрагментов до целых геномов) из желаемого продукта.

Электродиализ использовали для удаления ионов из водного раствора, в то время как сиаловая кислота будет оставаться внутри технологического потока. Важное преимущество электродиализа заключается в том, что из раствора, содержащего подлежащую очистке сиаловую кислоту, молекулы рекомбинантной ДНК могут быть удалены полностью. Кроме того обнаружено, что посредством электродиализа можно значительно уменьшать количество соли в технологическом потоке. Фактически было открыто, что из содержащего продукт потока можно полностью удалить хлорид натрия. Это имеет то преимущество, что можно получить сиаловую кислоту, не содержащую такой соли, как хлорид натрия, что предотвращает любое негативное влияние, которое может оказать наличие соли (например, хлорида натрия) в конечном продукте, например, для питания детей грудного возраста.

Электродиализ может быть проведен до тех пор, пока не будет достигнуто стабильное значение электропроводности (мСм/см²) в диапазоне от 0,2 до 10,0 мСм/см², предпочтительно от 0,4 до 5,0 мСм/см², более предпочтительно от 0,5 до 1,0 мСм/см². Кроме того, электродиализ может быть проведен до тех пор, пока концентрация соли (г/л) не станет ниже 10,0 г/л, предпочтительно ниже 5,0 г/л, более предпочтительно ниже 1,0 г/л, наиболее предпочтительно ниже 0,5 г/л.

Электродиализ можно проводить в нейтральных условиях или в кислотных условиях. Различие между этими двумя вариантами заключается в форме сиаловой кислоты. При нейтральных значениях рН сиаловая кислота находится в форме натриевой соли. В этом случае значение рН необходимо регулировать во время электродиализа. При кислотных значениях рН сиаловая кислота находится в свободной форме (водородной форме). Преимущество использования электродиализа в кислотных условиях заключается в том, что, когда указанному электродиализу подвергают сиаловую кислоту в натриевой форме, тогда после проведения электродиализа сиаловая кислота будет присутствовать в свободной форме (водородной форме). Вкратце, электродиализ в кислотных условиях не только приводит к удалению загрязняющей соли из раствора соли сиаловой кислоты (например, натриевой соли сиаловой кислоты), но также способствует превращению соли сиаловой кислоты в свободную форму (водородную форму) сиаловой кислоты.

Вследствие применения нейтральных условий при проведении электродиализа подлежащая очистке натриевая форма сиаловой кислоты оказывается незаряженной (благодаря взаимодействию отрицательно заряженной карбоксильной группы сиаловой кислоты с положительно заряженным ионом натрия). Перед началом проведения электродиализа значение рН технологического потока может быть подведено с использованием кислоты, предпочтительно соляной кислоты (HCl), или основания, предпочтительно гидроксида натрия (NaOH), до достижения рН от 5,0 до 9,0, предпочтительно от 6,0 до 8,0, более предпочтительно от 6,5 до 7,5.

Вследствие применения кислотных условий при проведении электродиализа протонированная форма сиаловой кислоты оказывается незаряженной (благодаря взаимодействию отрицательно заряженной карбоксильной группы сиаловой кислоты с положительно заряженным протоном). Перед началом проведения электродиализа технологический поток подкисляют с использованием кислоты, предпочтительно соляной кислоты (HCl), до достижения рН от 1,0 до 3,0, предпочтительно от 1,5 до 2,5, более предпочтительно от 1,8 до 2,2. Электродиализ предпочтительно проводят до достижения стабильных значений электропроводности (мСм/см²) и рН.

Электродиализ может быть проведен до тех пор, пока не достигнуто стабильное значение электропроводности (мСм/см²) в диапазоне от 1,0 до 10,0 мСм/см², предпочтительно от 1,5 до 10,0 мСм/см², более предпочтительно от 2,0 до 8,0 мСм/см². Во время проведения электродиализа рН необходимо регулировать и доводить с использованием основания, предпочтительно гидроксида натрия. В указанных нейтральных условиях электродиализ может быть проведен с использованием биполярных мембран. В этом случае сиаловая кислота может быть сконцентрирована в отдельном контуре для электродиализного концентрата. Таким образом, сиаловая кислота может быть обогащена во время проведения электродиализа.

В данном способе после удаления солей из очищенного раствора

1) количество соли в очищенном растворе может составлять меньше 10% (масс./масс.), предпочтительно меньше 5% (масс./масс.), более предпочтительно меньше 1% (масс./масс.); и/или

2) значение электропроводности может находиться в диапазоне от 0,2 до 10,0 мСм/см², предпочтительно в диапазоне от 0,4 до 5,0 мСм/см², более предпочтительно в диапазоне от 0,5 до 1,0 мСм/см².

Обесцвечивание осветленного и/или очищенного раствора

Осветленный раствор и/или очищенный раствор может быть подвергнут стадии обесцвечивания, предпочтительно путем обработки активированным углем и/или обработки с использованием катионообменника и анионообменника, которые соединены последовательно.

Стадия обесцвечивания может быть проведена

1) до или после стадии диафильтрации и/или концентрирования осветленного раствора; и/или

2) до или после стадии электродиализа и/или диафильтрации осветленного раствора.

Возможно, что указанную стадию проводят после стадии нанофильтрации и/или перед стадией электродиализа.

Преимущество удаления придающих окраску веществ путем обработки активированным углем по сравнению с обработкой с использованием катионообменника и анионообменника (которые соединены последовательно) заключается в том, что могут быть удалены как электрически заряженные, так и электрически незаряженные (нейтральные) придающие окраску вещества и могут быть удалены электрически незаряженные (нейтральные) олигосахариды.

Активированный углерод, также называемый активированным углем, представляет собой форму углерода, которая была обработана с целью получения небольших пор малого объема, которые увеличивают площадь поверхности, доступную для адсорбции. Обычно всего лишь один грамм активированного угля ввиду высокой степени его микропористости имеет площадь поверхности, превышающую 3000 м², что определено по данным адсорбции газа.

Углевод, подобный моносахариду или олигосахариду, имеет тенденцию связываться с поверхностью частиц активированного угля из водного раствора. Взаимодействие олигосахаридов с активированным углем является гораздо более сильным, чем взаимодействие моносахаридов. Такое поведение обусловлено их структурой и приводит к тому, что сиаловая кислота (например, Neu5Ac) связывается слабее, т.е. в меньшем количестве, с активированным углем, чем примесный олигосахарид. Кроме олигосахаридов на активированном угле адсорбируются окрашенные вещества. Другие водорастворимые соединения, такие как соли, связываются слабее и элюируются с активированного угля вместе с желаемой сиаловой кислотой в результате промывки активированного угля водой (после инкубирования). После элюирования водой адсорбированные олигосахариды и окрашенные вещества по-прежнему остаются связанными с активированным углем. Поэтому на стадии обработки активированным углем возможно удаление примесных олигосахаридов и окрашенных примесей. В итоге, на стадии с использованием активированного угля удаляются окрашивающие вещества, другие примеси и уменьшается количество водорастворимых загрязняющих веществ, таких как соль.

Подходящими активированными углями для удаления придающих окраску соединений, олигосахаридов или загрязняющих веществ являются (но не ограничиваются этим) гранулированные активированные древесные угли, такие как Norit GAC830EN (Carbot Cooperation) и Epibon Y 12x40 spezial (Donaucarbon) или порошкообразный активированный уголь, такой как Norit DX1, Norit SA2 (Carbot Cooperation) и Carbopal MB 4 (Donaucarbon).

Удаление придающих окраску веществ путем обработки с использованием катионообменника и анионообменника (которые соединены последовательно) имеет то преимущество по сравнению с обработкой активированным углем, что не только придающие окраску вещества могут быть удалены из раствора, но и в растворе может быть выполнена замена неспецифических ионов солей на конкретные ионы солей, такие как, например, Na⁺ и Cl^-. Преимущество указанного ионного обмена заключается том, что процесс обессоливания может стать более эффективным (Na⁺ и Cl^- являются небольшими ионами по сравнению с другими возможными ионами и поэтому могут быть более легко удалены на стадии обработки с целью обессоливания). Дополнительное преимущество заключается в том, что можно избежать негативного влияния некоторых неспецифических солей на кристаллизацию сиаловой кислоты.

Обработку на ионообменнике проводят таким образом, что заряженные вещества и придающие окраску вещества адсорбируются на соответствующем ионообменном материале, в то время как сиаловая кислота проходит через соответствующий ионообменный материал, т.е. находится в проходящем потоке. Полученная жидкость (проходящий поток) содержит воду, небольшое количество определенных ионов, более низкое количество придающих окраску веществ и сиаловую кислоту.

Катионообменник может представлять собой слабый катионообменник или сильный катионообменник, предпочтительно сильный катионообменник.

Подходящими катионообменными смолами являются сильнокислотные катионообменные смолы, такие как (но не ограничиваясь этим) Lewatit^® S2568(H⁺) (Lanxess AG, Cologne, DE), Dowex^® 50WX2 (Merck KGaA, Darmstadt, DE); Amberlite^® IR-116 (Japan Organo Co., Ltd.) и Diaion™ SK-102 (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd).

Катионообменник можно использовать с ионом любого щелочного металла (Li⁺, Na⁺, K⁺), ионом щелочноземельного металла (таким как Са²⁺, Mg²⁺), ионом аммония или карбонат-ионом в качестве противоиона. Предпочтительно, противоионом является ион натрия (Na⁺).

Анионообменник может представлять собой слабый анионообменник или сильный анионообменник, предпочтительно сильный анионообменник.

Подходящими анионообменными смолами являются сильноосновные (типа I) анионообменные смолы, такие как (но не ограничиваясь этим) Lewatit^® S6368 А, Lewatit^® S4268, Lewatit^® S5528, Lewatit^® S6368A (Lanxess AG, Cologne, DE), Dowex^® AG 1x2 (меш 200-400), Dowex^® 1x8 (Меш 100-200), Purolite^® Chromalite CGA100x4 (Purolite GmbH, Ratingen, DE), Amberlite^® FPA51 (Dow Chemicals, MI, USA). Предпочтительно, анионообменная смола находится в хлоридной форме.

Анионообменник можно использовать с любым основанием в качестве противоиона, например, HCO₃^-, I^-, Br^-, NO₃^-. Предпочтительно, в качестве противоиона используют гидроксид-ион (ОН^-). Более предпочтительно, в качестве противоиона используют хлорид-ион (Cl^-).

В случае последовательного соединения катионообменника и анионообменника анионообменник может быть расположен выше или ниже по потоку по отношению к катионообменнику. Предпочтительно, анионообменник располагают ниже по потоку по отношению к катионообменнику в случае последовательного соединения. Таким образом, раствор, проходящий через такое последовательное соединение, сначала проходит через катионообменник, а затем проходит через анионообменник.

Значение рН технологического потока, прошедшего через катионообменник и/или анионообменник (т.е. соответствующего проходящего потока), предпочтительно составляет выше 2,0 и ниже 10,0, более предпочтительно выше 3,0 и ниже 9,0, наиболее предпочтительно выше 4,0 и ниже 8,0.

Размер частиц ионообменной смолы должен быть выбран таким, чтобы способствовать эффективному прохождению технологического потока с одновременным эффективным удалением заряженных веществ и придающих окраску веществ на ионообменной смоле. Чтобы обеспечить эффективный обмен ионов, объемная скорость потока предпочтительно должна составлять от 0,2 до 2,0 объема хроматографического слоя, более предпочтительно от 0,5 до 1,5 объема хроматографического слоя и наиболее предпочтительно от 0,75 до 1,2 объема хроматографического слоя. Обработка на ионообменнике может быть осуществлена традиционным образом, например, партиями или непрерывно, предпочтительно непрерывно.

Стерилизующая фильтрация и/или удаление эндотоксинов В предпочтительном воплощении изобретения очищенный раствор фильтруют в стерильных условиях и/или подвергают удалению эндотоксинов, предпочтительно путем фильтрования очищенного раствора через фильтрующий модуль (<10 кДа). В качестве примера очищенный раствор, содержащий сиаловую кислоту, стерилизуют фильтрованием и/или подвергают стадии удаления эндотоксинов путем фильтрования очищенного раствора через фильтр 3 кДа или через фильтр 6 кДа. Удаление эндотоксинов является необходимым, если сиаловая кислота предназначена для потребления человеком.

Превращение сиаловой кислоты в свободной форме (водородной форме) в ее солевую форму

Для того, чтобы перевести сиаловую кислоту из формы свободной кислоты или сиаловой кислоты в форме натриевой соли в другую солевую форму, можно использовать катионообменник с любым ионом щелочного металла (Li⁺, Na⁺, K⁺), ионом щелочноземельного металла (таким как Са²⁺, Mg²⁺), ионом аммония или карбонат-ионом с образованием соответствующих солей. Сиаловая кислота в солевой форме (в особенности в натриевой форме) значительно более стабильна, чем в форме свободной кислоты, поскольку обнаружено, что в отличие от формы свободной кислоты в случае сиаловой кислоты в солевой форме никакой реакции изменения окраски в водной среде не происходит.

Сиаловую кислоту, содержащуюся в осветленном растворе и/или очищенном растворе, предпочтительно переводят в ее натриевую форму, предпочтительно путем обработки очищенного раствора с использованием сильного катионообменного материала в натриевой форме. Преимущество натриевой формы заключается в том, что она представляет собой нейтральное в отношении рН вещество, т.е. при растворении в воде рН воды остается нейтральным. Напротив, когда в воде растворяют сиаловую кислоту в свободной форме (водородной форме), значение рН воды становится соответствующим кислым средам. Отмечено, что в кислотных условиях и при температуре выше 10°С сиаловая кислота (в особенности Neu5Ac) склонна к изменению окраски, т.е. подвержена образованию окрашенных соединений. Поскольку сиаловая кислота в натриевой форме не демонстрирует протекания процесса снижения рН, то натриевая форма считается более стабильной в отношении образования окрашенных соединений.

Превращение сиаловой кислоты в натриевой форме в ее свободную форму (водородную форму)

Натриевая соль сиаловой кислоты может быть переведена в сиаловую кислоту в свободной форме (протонированной форме) посредством другой стадии катионного обмена. Во время проведения этой стадии ионы натрия (Na⁺), связанные с сиаловой кислотой или находящиеся в осветленном технологическом потоке, обменивают на протоны (Н⁺). Этот обмен приводит к тому, что рН технологического потока становится соответствующим более кислым средам.

Положительно заряженные ионы натрия могут быть отделены от сиаловой кислоты посредством обработки раствора, содержащего натриевую соль сиаловой кислоты, с использованием катионообменника в водородной (Н⁺) форме. Катионообменник может представлять собой слабый катионообменник или сильный катионообменник, предпочтительно он представляет собой сильный катионообменник. На этой стадии положительно заряженные ионы натрия, связанные с сиаловой кислотой, могут отделяться от депротонированных молекул сиаловой кислоты и связываться со смолой, при этом со смолы высвобождаются ионы Н⁺, и они могут протонировать депротонированную сиаловую кислоту. Водный раствор сиаловой кислоты приводят в контакт любым подходящим способом, который позволяет осуществлять обмен ионов натрия на ионы водорода и адсорбировать ионы натрия на катионообменном материале, в то время как сиаловая кислота проходит через него. Полученная жидкость после приведения в контакт с катионообменной смолой содержит протонированную сиаловую кислоту.

Катионообменные смолы, подходящие для удаления положительно заряженных ионов натрия из раствора сиаловой кислоты, представляют собой сильнокислотные катионообменные смолы, такие как (но не ограничиваясь этим) Lewatit^® S2568(H⁺) (Lanxess AG, Cologne, DE), Dowex^® 50WX2 (Merck KGaA, Darmstadt, DE); Amberlite^® IR-116 (Japan Organo Co., Ltd.) и Diaion™ SK-102 (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd).

Для превращения соли сиаловой кислоты в свободную кислоту или в другую солевую форму вместо обработки с использованием катионообменника можно провести стадию электродиализа. Электродиализ может быть использован для извлечения ионов натрия из технологического потока в кислотных условиях, тогда как сиаловая кислота будет оставаться в протонированной форме в технологическом потоке.

Вследствие применения кислотных условий при проведении электродиализа сиаловая кислота может быть протонирована, в результате чего она оказывается незаряженной (благодаря протонированию карбоксильной группы). Перед началом проведения электродиализа технологический поток подкисляют с использованием кислоты, предпочтительно соляной кислоты (HCl), до достижения рН от 1,0 до 3,0, предпочтительно от 1,5 до 2,5, более предпочтительно от 1,8 до 2,2. Электродиализ предпочтительно проводят до достижения стабильных значений электропроводности (мСм/см²) и рН.

Получение высушенной распылением формы сиаловой кислоты

В предпочтительном воплощении очищенный раствор сушат распылением. Очищенный раствор, который подвергают распылительной сушке, предпочтительно содержит сиаловую кислоту в натриевой форме.

Очищенный раствор может быть высушен распылением при концентрации сиаловой кислоты 5-35% (масс./масс.), предпочтительно 10-30% (масс./масс.), более предпочтительно 15-25% (масс./масс.). Температура на входе может находиться в диапазоне 110-150°С, предпочтительно 120-140°С, более предпочтительно 125-135°С. Температура на выходе может находиться в диапазоне 60-80°С, предпочтительно 65-70°С.

Получение кристаллической формы сиаловой кислоты

Очищенный раствор может быть подвергнут кристаллизации, предпочтительно путем добавления уксусной кислоты к очищенному раствору. Согласно этому воплощению кристаллическую форму сиаловой кислоты предпочтительно получают в виде дигидрата.

Способ кристаллизации сиаловой кислоты из водных растворов будет изложен в данном описании в соответствии с воплощением изобретения. Обнаружено, что сиаловая кислота (такая как, например, Neu5Ac) может быть избирательно закристаллизована после применения биокаталитического подхода с использованием ферментов или из ферментационного бульона (культуральной жидкости) в форме дигидрата.

В предпочтительном воплощении очищенный (водный) раствор сиаловой кислоты, подлежащий кристаллизации, характеризуется содержанием углеводов более 20% (масс./масс.), предпочтительно более 30% (масс./масс.), предпочтительно более 40% (масс./масс.), в частности, более 50% (масс./масс.). Альтернативно, концентрация сиаловой кислоты в очищенном (водном) растворе, подлежащем кристаллизации, составляет 450-600 г/л, предпочтительно 500-550 г/л.

Приведенные выше диапазоны и соотношения концентраций могут быть достигнуты традиционным образом путем концентрирования водного технологического потока из культуральной жидкости, предпочтительно после удаления, например клеток, придающих окраску веществ, солей и/или заряженных молекул, из культуральной жидкости с использованием описанных ранее способов.

Концентрирование раствора, содержащего сиаловую кислоту, может быть осуществлено путем упаривания в вакууме (например, с использованием роторного испарителя или пластинчатого испарителя) или с применением нанофильтрации. Для начала кристаллизации к указанному концентрированному раствору сиаловой кислоты добавляют затравочные кристаллы при температуре в диапазоне от 20°С до 50°С, предпочтительно при 25°С.

Раствор, содержащий сиаловую кислоту, может иметь концентрацию углеводов выше 50% (масс./масс.). Кристаллизуемую смесь можно инкубировать под вакуумом, предпочтительно по меньшей мере в одних из приведенных ниже условий:

1) при давлении ниже 200 мбар (20 кПа), более предпочтительно при давлении ниже 100 мбар (10 кПа), в частности, при давлении ниже 50 мбар (5 кПа);

2) при температуре продукта в диапазоне от 15°С до 60°С, предпочтительно в диапазоне от 20°С до 45°С, более предпочтительно в диапазоне от 25°С до 40°С, в частности, в диапазоне от 30°С до 35°С; и

3) при времени инкубирования до тех пор, пока концентрация углеводов не достигала выше 60%, предпочтительно ниже 70%, или пока не образуется вязкая пульпа кристаллизации.

В кристаллизационный раствор может быть добавлен органический растворитель, предпочтительно изопропанол. Чтобы улучшить процесс кристаллизации, 1 литр раствора кристаллизуемого вещества смешивают с 0,5-3 л, предпочтительно 0,7-2,0 л, более предпочтительно 1,0-1,5 л изопропанола. Полученную кристаллизуемую смесь, имеющую начальную температуру в диапазоне от 20°С до 30°С, охлаждают без перемешивания или с перемешиванием до температуры в диапазоне от 0 до 15°С, предпочтительно от 2 до 12°С, более предпочтительно от 4 до 8°С.После достижения предпочтительной температуры кристаллизуемую смесь инкубируют без перемешивания или с перемешиванием в течение 2-48 ч, предпочтительно 6-36 ч, более предпочтительно 12-24 ч при выбранной температуре.

Кристаллы сиаловой кислоты могут быть извлечены из жидкой фазы путем фильтрования с использованием или без использования вакуума либо путем центрифугирования. Для удаления оставшейся маточной жидкости кристаллы можно промывать органическим растворителем, например, этанолом, метанолом и/или изопропанолом, предпочтительно изопропанолом. Чтобы удалить оставшуюся маточную жидкость, 1 кг кристаллизованной сиаловой кислоты (например, N-ацетилнейраминовой кислоты) промывают 0,5-3 л, предпочтительно 0,7-2,0 л, более предпочтительно 1,0-1,5 л изопропанола.

Полученные кристаллы сушат в течение 4-48 ч, предпочтительно 8-36 ч, более предпочтительно 12-24 ч или до тех пор, пока не будет происходить никаких изменений массы. Температура сушки может лежать в диапазоне от 10°С до 80°С, предпочтительно в диапазоне от 20°С до 70°С, более предпочтительно в диапазоне от 30°С до 60°С, в частности, в диапазоне от 40° до 50°С.

Для кристаллизации сиаловой кислоты (например, Neu5Ac) в виде дигидрата из водного раствора в данном описании будет изложен второй альтернативный способ кристаллизации сиаловой кислоты в виде дигидрата из водных растворов.

Чтобы начать кристаллизацию, к такому концентрированному раствору сиаловой кислоты добавляют затравочные кристаллы при температуре в диапазоне от 20°С до 50°С, предпочтительно при 25°С.Раствор сиаловой кислоты может иметь концентрацию углеводов выше 50% (масс./масс.). Кристаллизуемую смесь следует инкубировать с перемешиванием до тех пор, пока не произойдет кристаллизация, предпочтительно в течение 0,5-2 часов, более предпочтительно в течение 1-1,5 часа.

К кристаллизуемому раствору добавляют органический растворитель, предпочтительно изопропанол. Чтобы улучшить процесс кристаллизации, 1 литр раствора кристаллизуемого вещества смешивают с 0,5-6,0 л, предпочтительно 1,0-4,0 л, более предпочтительно 1,5-2,5 л изопропанола. Полученную кристаллизуемую смесь, имеющую начальную температуру в диапазоне от 20°С до 30°С, охлаждают без перемешивания или с перемешиванием до температуры в диапазоне от 0 до 15°С, предпочтительно от 2 до 12°С, более предпочтительно от 4 до 8°С.После достижения предпочтительной температуры кристаллизуемую смесь инкубируют без перемешивания или с перемешиванием в течение 2-48 ч, предпочтительно 6-36 ч, более предпочтительно 12-24 ч при выбранной температуре.

Кристаллы сиаловой кислоты могут быть извлечены из жидкой фазы путем фильтрования с использованием или без использования вакуума либо путем центрифугирования. Для удаления оставшейся маточной жидкости кристаллы можно промывать органическим растворителем, например, этанолом, метанолом и/или изопропанолом, предпочтительно изопропанолом. Чтобы удалить оставшуюся маточную жидкость, 1 кг кристаллизованной сиаловой кислоты (например, N-ацетилнейраминовой кислоты) промывают 0,5-3 л, предпочтительно 0,7-2,0 л, более предпочтительно 1,0-1,5 л изопропанола.

Полученные кристаллы сушат в течение 4-48 ч, предпочтительно 8-36 ч, более предпочтительно 12-24 ч или до тех пор, пока не будет происходить никаких изменений массы. Температуру сушки выбирают в диапазоне от 10°С до 80°С, предпочтительно в диапазоне от 20°С до 70°С, более предпочтительно в диапазоне от 30°С до 60°С, в частности, в диапазоне от 40° до 50°С.

Альтернативный способ избирательной кристаллизации сиаловой кислоты (например, Neu5Ac) из водных растворов будет изложен в данном описании. Было обнаружено, что сиаловая кислота может избирательно кристаллизоваться после применения биокаталитического подхода с использованием ферментов или из ферментационного бульона (культуральной жидкости) посредством добавления ледяной уксусной кислоты.

В предпочтительном воплощении очищенный (водный) раствор сиаловой кислоты, подлежащий обработке уксусной кислотой, имеет содержание углеводов выше 10% (масс./масс.), предпочтительно выше 20% (масс./масс.), более предпочтительно выше 30% (масс./масс.), в частности, около 35-40% (масс./масс.). Альтернативно, концентрация сиаловой кислоты в очищенном (водном) растворе, подлежащем обработке уксусной кислотой, составляет 250-350 г/л, предпочтительно 290-330 г/л.

Приведенные выше диапазоны и соотношения концентраций могут быть достигнуты традиционным образом путем концентрирования водного технологического потока из культуральной жидкости, предпочтительно после удаления, например, клеток, придающих окраску веществ, солей и/или заряженных молекул, из культуральной жидкости с использованием описанных ранее методов.

Концентрирование раствора, содержащего сиаловую кислоту, может быть осуществлено посредством упаривания в вакууме (например, с использованием роторного испарителя или пластинчатого испарителя) или посредством нанофильтрации.

К полученному водному раствору добавляют уксусную кислоту при температуре в диапазоне от 20°С до 50°С, предпочтительно при 25°С. Уксусную кислоту к водному раствору добавляют полностью за один прием или порциями в течение периода времени от 0,5 до 2 часов, предпочтительно от 1 до 1,5 часа. Предпочтительно, водный раствор постоянно перемешивают при этой же температуре, добавляя при этом уксусную кислоту в то время, когда происходит кристаллизация, и предпочтительно также после указанного момента времени.

Предпочтительно, примерно 5-25 л ледяной уксусной кислоты используют на каждый килограмм сиаловой кислоты в водном растворе. Таким образом, для водного раствора сиаловой кислоты с концентрацией 250-350 г/л, предпочтительно 290-330 граммов/литр, содержание углеводов в котором составляет более 30% (масс./масс.), используют по меньшей мере примерно 5-25 литров, предпочтительно 7-20 литров, более предпочтительно 10-18 литров, в частности, 12-16 литров уксусной кислоты на один килограмм сиаловой кислоты в водном растворе.

Полученную кристаллизуемую смесь, имеющую начальную температуру в диапазоне от 20°С до 50°С, охлаждают без перемешивания или с перемешиванием до температуры в диапазоне от 0 до 15°С, предпочтительно от 2 до 12°С, более предпочтительно от 4 до 8°С.После достижения предпочтительной температуры кристаллизуемую смесь инкубируют без перемешивания или с перемешиванием в течение 2-48 ч, предпочтительно 6-36 ч, более предпочтительно 12-24 ч при выбранной температуре.

Кристаллы сиаловой кислоты извлекают из жидкой фазы путем фильтрования с использованием или без использования вакуума либо путем центрифугирования. Для удаления оставшейся уксусной кислоты кристаллы промывают органическим растворителем, например, этанолом, метанолом и/или изопропанолом, предпочтительно изопропанолом. Чтобы удалить оставшуюся уксусную кислоту, 1 кг кристаллизованной сиаловой кислоты промывают 0,5-3 л, предпочтительно 0,7-2,0 л, более предпочтительно 1,0-1,5 л изопропанола.

Полученные кристаллы сушат в течение 4-48 ч, предпочтительно 8-36 ч, более предпочтительно 12-24 ч или до тех пор, пока не будет происходить никаких изменений массы. Температуру сушки выбирают в диапазоне от 10°С до 80°С, предпочтительно в диапазоне от 20°С до 70°С, более предпочтительно в диапазоне от 30°С до 60°С, в частности, в диапазоне от 40° до 50°С.

Получение лиофилизированной формы сиаловой кислоты

Очищенный раствор, содержащий сиаловую кислоту, также может быть лиофилизирован. При указанной лиофилизации очищенный раствор, содержащий сиаловую кислоту, замораживают и затем снижают давление снижают, в результате чего замороженная вода сублимируется непосредственно из твердой фазы в газовую фазу. При применении этого метода обычно получается гигроскопичный порошок сиаловой кислоты.

Композиции и продукты, предложенные согласно изобретению

Согласно данному изобретению предложена композиция, которая содержит

a) по меньшей мере 98 масс. % сиаловой кислоты;

b) не более 1 масс. % органического растворителя; и

c) не более 1 масс. % солей, отличающихся от солевой формы сиаловой кислоты.

В предпочтительном воплощении композиция содержит

a) от 98,50 до 100,00 масс. % сиаловой кислоты, предпочтительно от 99,00 до 100,00 масс. % сиаловой кислоты, более предпочтительно от 99,50 до 100,00 масс. % сиаловой кислоты, возможно от 99,70 до 99,90 масс. % сиаловой кислоты; и/или

b) от 0,00 до 1,00 масс. % органического растворителя, предпочтительно от 0,00 до 0,50 масс. % органического растворителя, более предпочтительно от 0,00 до 0,40 масс. % органического растворителя, возможно от 0,10 до 0,20 масс. % органического растворителя; и/или

c) от 0,00 до 1,00 масс. % солей, отличающихся от солевой формы сиаловой кислоты, предпочтительно от 0,00 до 0,50 масс. % солей, отличающихся от солевой формы сиаловой кислоты, более предпочтительно от 0,00 до 0,40 масс. % солей, отличающихся от солевой формы сиаловой кислоты, возможно от 0,10 до 0,20 масс. % солей, отличающихся от солевой формы сиаловой кислоты.

Предпочтительно, композиция содержит (только)

a) от 0,00 до 0,50 масс. % белков, более предпочтительно от 0,00 до 0,40 масс. % белков, возможно от 0,10 до 0,20 масс. % белков; и/или

b) от 0,00 до 0,50 масс. % ДНК, более предпочтительно от 0,00 до 0,40 масс. % ДНК, возможно от 0,10 до 0,20 масс. % ДНК.

Композиция может отличаться тем, что сиаловая кислота находится в аморфной форме или в кристаллической форме, предпочтительно в гранулированной форме или в кристаллической форме, более предпочтительно в высушенной распылением форме или в кристаллической форме. Кристаллическая форма предпочтительно представляет собой кристаллическую форму в виде дигидрата.

Предложена пищевая композиция, предпочтительно смесь для питания детей грудного возраста, смесь для питания детей ясельного возраста или продукт для лечебного питания, причем данная пищевая композиция содержит сиаловую кислоту и по меньшей мере один олигосахарид грудного молока.

Пищевая композиция может содержать по меньшей мере один сахар, выбранный из группы, состоящей из 2'-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы, лакто-N-тетраозы, 3'-сиалиллактозы, 6-сиалиллактозы и лакто-N-неотетраозы.

Пищевая композиция может представлять собой

1) жидкую пищевую композицию и содержать сиаловую кислоту в концентрации от 1 мг/л до 2 г/л, более предпочтительно в концентрации от 5 мг/л до 1,5 г/л, еще более предпочтительно в концентрации от 20 мг/л до 1 г/л, наиболее предпочтительно в концентрации от 50 мг/л до 0,7 г/л; или

2) твердую пищевую композицию и содержать сиаловую кислоту в концентрации от 5 мг/кг до 15 г/кг, более предпочтительно в концентрации от 25 мг/кг до 10 г/кг, еще более предпочтительно в концентрации от 100 мг/кг до 10 г/кг, наиболее предпочтительно в концентрации от 375 мг/кг до 5,25 г/кг.

Пищевая композиция может содержать

1) по меньшей мере один нейтральный олигосахарид грудного молока, предпочтительно по меньшей мере один нейтральный олигосахарид грудного молока, выбранный из группы, состоящей из 2-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы, лакто-N-тетраозы и лакто-N-неотетраозы, наиболее предпочтительно все из указанных нейтральных олигосахаридов грудного молока; и

2) по меньшей мере один кислый олигосахарид грудного молока, предпочтительно по меньшей мере один кислый олигосахарид грудного молока, выбранный из группы, состоящей из 3'-сиалиллактозы и 6'-сиалиллактозы, наиболее предпочтительно все из указанных кислых олигосахаридов грудного молока; и

3) L-фукозу.

Композиция может дополнительно содержать по меньшей мере одно вещество, возможно все вещества, выбранное(ые) из группы, состоящей из лактозы, белка молочной сыворотки, биотина, обезжиренного молока, растительного масла, сухого обезжиренного молока, масла из Mortierella alpine, рыбьего жира, карбоната кальция, хлорида калия, витамина С, хлорида натрия, витамина Е, ацетата железа, сульфата цинка, ниацина, D-пантотената кальция, сульфата меди, витамина А, витамина В1, витамина В6, сульфата магния, иодата калия, фолиевой кислоты, витамина К, селенита натрия и витамина D.

Пищевая композиция может содержать по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из источника белка, витамина, масла, минерального вещества, фермента, дополнительного углевода и пробиотического штамма.

Композицией может быть композиция, выбранная из группы, состоящей из композиции для лечебного питания, пищевой добавки, продукта в саше, жидкого готового к применению продукта питания для детей грудного возраста, жидкого готового к применению продукта питания для детей ясельного возраста, гранулированного продукта, высушенного распылением продукта на основе смеси для детей грудного возраста и их комбинаций.

Далее предложен жидкий готовый к применению продукт питания для детей грудного или ясельного возраста, содержащий сиаловую кислоту в концентрации от 1 мг/л до 2 г/л, L-фукозу и

1) по меньшей мере один нейтральный олигосахарид грудного молока, выбранный из группы, состоящей из 2'-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы, дифукозиллактозы, лакто-N-тетраозы и лакто-N-неотетраозы; и/или

2) по меньшей мере один кислый олигосахарид грудного молока, выбранный из группы, состоящей из 3'-сиалиллактозы или 6'-сиалиллактозы.

Согласно изобретению также предложен высушенный распылением продукт на основе смеси для детей грудного возраста, содержащий сиаловую кислоту в концентрации от 5 мг/кг до 15 г/кг, L-фукозу и

1) по меньшей мере один нейтральный олигосахарид грудного молока, выбранный из группы, состоящей из 2'-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы, дифукозиллактозы, лакто-N-тетраозы и лакто-N-неотетраозы; и/или

2) по меньшей мере один кислый олигосахарид грудного молока, выбранный из группы, состоящей из 3'-сиалиллактозы и 6'-сиалиллактозы.

Кроме того, предложена пищевая добавка, содержащая сиаловую кислоту и по меньшей мере один нейтральный НМО, выбранный из группы, состоящей из 2'-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы, дифукозиллактозы, лакто-N-тетраозы и лакто-N-неотетраозы.

Согласно изобретению предложен премикс для пищевого продукта (например, премикс для смеси для питания детей грудного возраста), который содержит сиаловую кислоту (например, Neu5Ac) и по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из источника белка, витамина, масла, минерального вещества, фермента, дополнительный углевод (например, углевод, отличающийся от сиаловой кислоты, уже имеющейся в премиксе) и пробиотического штамма. Более предпочтительно, премикс содержит все из указанных веществ.

Источник белка может быть выбран из группы, состоящей из молочной сыворотки, соево-зерновой смеси (CSB), белковых гидролизатов и их комбинаций.

Витамин может быть выбран из группы, состоящей из витамина А, тиамина, рибофлавина, витамина В12, фолата и их комбинаций.

Масло может быть выбрано из группы, состоящей из пальмового масла, докозагексаеновой кислоты (DHA), арахидоновой кислоты и их комбинаций.

Минеральное вещество может быть выбрано из группы, состоящей из хлорида калия, иодата калия, оксида цинка и их комбинаций.

Фермент может быть выбран из группы, состоящей из амилазы, амилоглюкозидазы и их комбинаций.

Углевод может быть выбран из группы, состоящей из олигосахарида грудного молока (НМО), галактоолигосахарида (GOS), инулина (фруктоолигосахарида (FOS)), L-фукозы, дополнительной сиаловой кислоты, лактозы и их комбинаций.

Пробиотический штамм может быть выбран из группы, состоящей из (инкапсулированного) штамма Lactobacillus, Bifidobacterium и их комбинаций.

Премикс может быть в форме высушенного распылением, гранулированного или жидкого (сиропообразного) продукта.

Согласно данному изобретению предложена фармацевтическая композиция, предпочтительно фармацевтическая композиция для применения в предупреждении или лечении по меньшей мере одного из следующего: вирусной инфекции, бактериальной инфекции, потери памяти и дисбиоса. Такая фармацевтическая композиция содержит композицию по изобретению и возможно содержит по меньшей мере один сахар, отличающийся от сиаловой кислоты, и/или по меньшей мере один пробиотический бактериальный штамм, при этом по меньшей мере один сахар представляет собой предпочтительно по меньшей мере один сахар, выбранный из группы, состоящей из лактозы, лактулозы, инулина и сахарозы.

Композиции с высвобождением сиаловой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли, сольвата или сложного эфира известны в предшествующем уровне техники и описаны, например, в WO 2012/009474 и WO 2013/109906, содержание которых тем самым включено посредством ссылки.

Типичная пищевая композиция

Способ по изобретению обеспечивает получение желаемой сиаловой кислоты с чистотой, достаточной для того, чтобы ее можно было использовать в пищевых продуктах или кормах, в частности, пригодной для включения в продукты питания для детей грудного и ясельного возраста. Полученную сиаловую кислоту, в частности, Neu5Ac, можно использовать для приготовления смеси для грудных детей путем смешивания ее с компонентами базовой смеси для грудных детей. Смесь для грудных детей может представлять собой сухую смесь или готовую к применению жидкую смесь для грудных детей.

Базовая смесь может иметь по меньшей мере один, возможно все, из приведенных ниже компонентов.

Базовая смесь: Компоненты репрезентативной базовой смеси

Обезжиренное молоко

Растительные масла (пальмовое масло, рапсовое масло, подсолнечное масло)

Сухое обезжиренное молоко

Масло из Mortierella alpine

Рыбий жир

Карбонат кальция

Хлорид калия

Витамин С

Хлорид натрия

Витамин E

Ацетат железа

Сульфат цинка

Ниацин

D-Пантотенат кальция

Сульфат меди

Витамин А

Витамин В1

Витамин В6

Сульфат магния

Иодат калия

Фолиевая кислота

Витамин K

Селенит натрия

Витамин D

Применение композиции по изобретению

Предложено применение композиции по изобретению для изготовления пищевой композиции и/или фармацевтической композиции.

Подразумевается, что на основании следующих далее фигур и примеров предмет изобретения будет более подробно разъяснен без ограничения указанного предмета специальными воплощениями, показанными в данном описании.

На Фиг. 1 показан пример способа очистки сиаловой кислоты, N-ацетилнейраминовой кислоты, по изобретению. После проведения ферментации ферментационный бульон осветляют посредством центрифугирования и/или фильтрования. Осветленный ферментационный бульон подвергают обработке на ионообменнике. Проходящий поток после обработки на ионообменнике затем подвергают диафильтрации и/или концентрированию. После выполнения указанной стадии раствор, содержащий сиаловую кислоту, пропускают через активированный уголь. Затем раствор, содержащий сиаловую кислоту, подвергают электродиализу и/или диафильтрации. После этого раствор, содержащий сиаловую кислоту, подвергают распылительной сушке или кристаллизации.

На Фиг. 2 показан пример второго способа очистки сиаловой кислоты, N-ацетилнейраминовой кислоты, по изобретению. После проведения ферментации ферментационный бульон осветляют посредством центрифугирования и/или фильтрования. Осветленный ферментационный бульон подвергают обработке на ионообменнике. Проходящий поток после обработки на ионообменнике затем подвергают электродиализу и/или диафильтрации. После выполнения указанной стадии раствор, содержащий сиаловую кислоту, пропускают через активированный уголь. Затем раствор, содержащий сиаловую кислоту, подвергают диафильтрации и/или концентрированию. После этого раствор, содержащий сиаловую кислоту, подвергают распылительной сушке или кристаллизации.

На Фиг. 3 показан пример третьего способа очистки сиаловой кислоты, N-ацетилнейраминовой кислоты, по изобретению. После проведения ферментации ферментационный бульон осветляют посредством центрифугирования и/или фильтрования. Осветленный ферментационный бульон подвергают обработке на ионообменнике. Проходящий поток после обработки на ионообменнике затем пропускают через активированный уголь. После выполнения указанной стадии раствор, содержащий сиаловую кислоту, подвергают диафильтрации и/или концентрированию. Затем раствор, содержащий сиаловую кислоту, подвергают электродиализу и/или диафильтрации. После этого раствор, содержащий сиаловую кислоту, подвергают распылительной сушке или кристаллизации.

На Фиг. 4 показан пример четвертого способа очистки сиаловой кислоты, N-ацетилнейраминовой кислоты, по изобретению. После проведения ферментации ферментационный бульон осветляют посредством центрифугирования и/или фильтрования. Осветленный ферментационный бульон подвергают обработке на ионообменнике. Проходящий поток после обработки на ионообменнике затем подвергают электродиализу и/или диафильтрации. После выполнения указанной стадии раствор, содержащий сиаловую кислоту, подвергают диафильтрации и/или концентрированию. Затем раствор, содержащий сиаловую кислоту, пропускают через активированный уголь. После этого раствор, содержащий сиаловую кислоту, подвергают распылительной сушке или кристаллизации.

На Фиг. 5 показано изображение кристаллов N-ацетилнейраминовой кислоты под микроскопом. Можно видеть, что N-ацетилнейраминовая кислота образует небольшие иглообразные кристаллы длиной от 2 до 8 пм.

На Фиг. 6 приведена HPLC-диаграмма, которая была зарегистрирована для N-ацетилнейраминовой кислоты, закристаллизованной в форме дигидрата. Обнаружено, что чистота закристаллизованной N-ацетилнейраминовой кислоты составляет 98,7%.

На Фиг. 7 приведена HPLC-диаграмма, которая была зарегистрирована для N-ацетилнейраминовой кислоты, закристаллизованной с использованием уксусной кислоты. Обнаружено, что чистота закристаллизованной N-ацетилнейраминовой кислоты составляет 98,2% по сравнению с другими сахарами. Количество уксусной кислоты после сушки составило 2,8% по сравнению с общей массой вещества.

На Фиг. 8 приведена HPLC-диаграмма, которая была зарегистрирована для N-ацетилнейраминовой кислоты, высушенной распылением. Обнаружено, что чистота высушенной распылением N-ацетилнейраминовой кислоты составляет 99,1%.

Пример 1. Очистка сиаловой кислоты, N-ацетилнейраминовой кислоты, после бактериальной ферментации

Сиаловая кислота, N-ацетилнейраминовая кислота, образовывалась в результате бактериальной ферментации, и ее собирали фильтрованием, при этом получали прозрачный, не содержащий частиц раствор сиаловой кислоты (37 г/л).

Этот прозрачный, не содержащий частиц раствор сначала обрабатывали с использованием сильного катионообменника (Lewatit S2568 в протонированной форме, Lanxess).

После нейтрализации с использованием гидроксида натрия (NaOH) раствор дополнительно обрабатывали с использованием сильного анионообменника (Lewatit S 6368А в хлоридной форме).

Для концентрирования и обессоливания раствора /V-ацетилнейраминовой кислоты после обработки на ионообменнике раствор дополнительно обрабатывали, используя стадию нанофильтрации. Систему обратного осмоса Emrich EMRO 1.8 (Emrich Edelstahlbau) оснащали нанофильтрационным модулем Trisep^® XN 45. Устанавливали давление на входе 30 бар (3 МПа) и раствор концентрировали до тех пор, пока скорость потока не падала ниже 100 литров в час. Диафильтрацию раствора проводили три раза, используя одинаковое количество обратноосмотической воды. Чтобы уменьшить количество соли, трижды проводили диафильтрацию раствора, используя равные объемы обратноосмотической воды.

Для удаления окраски раствор, содержащий N-ацетилнейраминовую кислоту, обрабатывали порошком активированного угля. Раствор инкубировали в течение 2 часов при перемешивании с активированным углем Norit SA2. После инкубирования активированный уголь удаляли фильтрованием и рН подводили до рН 7,0, используя гидроксид натрия.

Чтобы удалить оставшуюся окраску и неспецифические ионы, раствор еще раз обрабатывали с использованием сильного катионообменника (Lewatit S2568 в натриевой форме, Lanxess) и на сильного анионообменника (Lewatit S 6368А в хлоридной форме). После указанных обработок рН подводили до рН 7,0.

Для удаления хлорида натрия раствор подвергали электродиализу с применением системы для электродиализа PCCell Р15 (производства PCCell, Heusweiler, Германия), оснащенную пакетом мембран PCCell ED 1000А. Указанный пакет содержал следующие мембраны: катионообменную мембрану СЕМ: PC SK и анионообменную мембрану СЕМ: PcAcid60, имеющие предел исключения по размеру, составляющий 60 Да. Раствор подвергали электродиализу до достижения стабильного значения электропроводности. При проведении электродиализа рН стабилизировали при значении рН 7,0 путем добавления NaOH.

После проведения электродиализа раствор концентрировали до 20% (масс./об.) по сухому веществу посредством обратного осмоса, применяя систему обратного осмоса Emrich EMRO 1.8 (Emrich Edelstahlbau), которая была оснащена модулем обратного осмоса CSM RE8040BE.

После этого раствор фильтровали для удаления эндотоксинов и проведения стерилизующей фильтрации путем пропускания раствора через ультрафильтрационную мембрану 5 кДа (модуль Spira-Cell WY UP005 2440 С). Затем стерильный раствор хранили при комнатной температуре (20°С) и использовали в виде стерильного жидкого концентрированного продукта или стерильный раствор сушили распылением.

Пример 2. Превращение натриевой соли сиаловой кислоты, N-ацетилнейраминовой кислоты, в форму ее свободной кислоты

Чтобы выделить сиаловую кислоту в форме ее свободной кислоты после обработки активированным углем, упомянутой в примере 1, добавляли 30%-ную соляную кислоту до достижения значения рН от 1,7 до 2,3.

После доведения рН раствор еще раз обрабатывали с использованием сильного катионообменника (Lewatit S2568 в протонированной форме, Lanxess). После обработки на ионообменнике раствор снова подвергали электродиализу с применением системы для электродиализа PCCell Р15 (производства PCCell, Heusweiler, Германия), оснащенную пакетом мембран PCCell ED 1000А. Указанный пакет содержал следующие мембраны: катионообменную мембрану СЕМ: PC SK и анионообменную мембрану СЕМ: PcAcid60, имеющие предел исключения по размеру, составляющий 60 Да. Раствор подвергали электродиализу до достижения стабильного значения электропроводности. При проведении электродиализа рН стабилизировали при значении рН 2,0 путем добавления соляной кислоты.

Пример 3. Получение сиаловой кислоты, N-ацетилнейраминовой кислоты, в твердой форме с использованием распылительной сушки

Сиаловую кислоту, полученную согласно способу выделения в натриевой форме или в форме свободной кислоты, как упомянуто выше в примерах 1 и 2, концентрировали до 20% (масс./масс.) и раствор фильтровали для удаления эндотоксинов и проведения стерилизующей фильтрации путем пропускания раствора через ультрафильтрационную мембрану 5 кДа (модуль Spira-Cell WY UP005 2440 С, Microdyn Nadir, Wiesbaden, Германия). Полученный таким образом стерильный раствор, содержащий N-ацетилнейраминовую кислоту, затем сушили распылением, используя распылительную сушилку NUBILOSA LTC-GMP (NUBILOSA, Konstanz, Германия). Для проведения распылительной сушки раствора N-ацетилнейраминовой кислоты этот раствор пропускали под давлением 3,5 бар (350 кПа) через форсунки распылительной сушилки с температурой, установленной на уровне 130°С, и поток регулировали так, чтобы поддерживать температуру на выходе от 66°С до 67°С.Применяя эти настройки, можно было получить высушенный распылением порошок с содержанием влаги менее 5%. Содержание влаги определяли титрованием по методу Карла Фишера.

Пример 4. Кристаллизация сиаловой кислоты, N-ацетилнейраминовой кислоты, в форме дигидрата

Сиаловую кислоту, N-ацетилнейраминовую кислоту, в форме свободной кислоты концентрировали до 20% (масс./масс.) по сухому веществу посредством обратного осмоса с применением системы обратного осмоса Emrich EMRO 1.8 (Emrich Edelstahlbau), которая была оснащена модулем обратного осмоса CSM RE8040BE.

Для проведения кристаллизации 5 литров этого раствора концентрировали с применением промышленного испарителя Hei-VAP (Heidolph Instruments GmbH, Schwabach, Германия) до 50% (масс./масс.) по сухому веществу. В раствор вводили затравочные кристаллы и концентрировали под вакуумом до тех пор, пока не начинали образовываться кристаллы (содержание сухой массы в растворе приблизительно 75% масс./масс.).

Раствор с кристаллами смешивали в соотношении 1:1 с изопропанолом и перемешивали в течение 5 мин. Раствор инкубировали в течение по меньшей мере 12 часов при 4°С. Кристаллизованную сиаловую кислоту извлекали из маточной жидкости посредством вакуумной фильтрации и кристаллы промывали изопропанолом.

Выход осажденной N-ацетилнейраминовой кислоты составлял от 75 до 85%.

Пример 5. Кристаллизация сиаловой кислоты, N-ацетилнейраминовой кислоты, с использованием уксусной кислоты

Сиаловую кислоту, N-ацетилнейраминовую кислоту, в форме свободной кислоты концентрировали до 30% (масс./масс.) по сухому веществу посредством обратного осмоса с применением системы обратного осмоса Emrich EMRO 1.8 (Emrich Edelstahlbau), которая была оснащена модулем обратного осмоса CSM RE8040BE.

Для проведения кристаллизации к 1 литру раствора N-ацетилнейраминовой кислоты при перемешивании порциями добавляли 5 литров ледяной уксусной кислоты. Раствор охлаждали до температуры в диапазоне от комнатной температуры (20°С) до 4°С в течение 3 часов. После достижения конечной температуры (4,5°С) кристаллизуемую смесь инкубировали в течение 12-36 часов при этой температуре.

Раствор с кристаллами смешивали в соотношении 1:1 с изопропанолом и перемешивали в течение 5 мин. Кристаллизованную N-ацетилнейраминовую кислоту извлекали из маточной жидкости посредством вакуумной фильтрации и кристаллы дважды промывали равным количеством изопропанола.

Выход осажденной N-ацетилнейраминовой кислоты составлял от 74 до 81%.

Степень чистоты после типичной очистки N-ацетилнейраминовой кислоты из культуральной жидкости показана в Таблице 1.

Пример 6. Состав репрезентативного продукта на основе смеси для детей грудного возраста

Далее представлен состав репрезентативного продукта на основе смеси для детей грудного возраста (см. приведенную ниже Таблицу 2).

В данный состав входит сиаловая кислота Neu5Ac в комбинации с имеющимися в избытке нейтральными НМО, а именно: 2'-фукозиллактозой (2'-FL), 3-фукозиллактозой (3-FL), лакто-N-тетраозой (LNT) и возможно лакто-N-неотетраозой (LNnT) и лакто-N-фукопентаозой I (LNFP-I), кислыми НМО (6'-сиалиллактозой (6'-SL) и 3'-сиалиллактозой (3'-SL)) и L-фукозой.

В продукте может быть представлен один или более чем один из пробиотических штаммов. Значение конечной концентрации каждого ингредиента основывается на приготовлении композиции из расчета 13,5 г порошка в 90 мл воды.

Пример 7. Состав репрезентативного премикса для продукта на основе смеси для детей грудного возраста, содержащего олигосахарид грудного молока, моносахарид Neu5Ac и моносахарид L-фукозу

Далее представлен состав репрезентативного премикса для продукта на основе смеси для детей грудного возраста (см. приведенную ниже Таблицу 3).

В данный состав входит сиаловая кислота Neu5Ac в комбинации с имеющимися в избытке нейтральными НМО, а именно: 2'-фукозиллактозой (2'-FL), 3-фукозиллактозой (3-FL), лакто-N-тетраозой (LNT) и возможно лакто-N-неотетраозой (LNnT) и лакто-N-фукопентаозой I (LNFP-I), кислыми НМО (6'-сиалиллактозой (6'-SL) и 3'-сиалиллактозой (3'-SL)), а также моносахаридом -свободной L-фукозой.

Такой премикс можно использовать для повторного разведения смеси для грудных детей путем добавления указанного премикса к другим продуктам питания, которые необходимы для повторного разведения смеси для питания детей грудного возраста, таким как молочная сыворотка, лактоза, липиды (насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты) и минеральные вещества. Подразумевается, что премикс, приведенный в Таблице 3, будет использован для приготовления 1 кг конечного продукта на основе смеси для детей грудного возраста.

1. Способ очистки сиаловой кислоты из ферментационного бульона, включающий следующие стадии:

удаление биомассы из ферментационного бульона, содержащего сиаловую кислоту, при этом получается осветленный раствор,

получение очищенного раствора путем подвергания осветленного раствора: обработке на катионообменнике с использованием катионообменного материала, при этом обработку на катионообменнике осуществляют в условиях, при которых сиаловая кислота проходит через катионообменный материал и присутствует в проходящем потоке; и обработке на анионообменнике с использованием анионообменного материала, при этом обработку на анионообменнике осуществляют в условиях, при которых сиаловая кислота проходит через анионообменный материал и присутствует в проходящем потоке; и

удаление солей из очищенного раствора путем электродиализа.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный способ не включает

1) хроматографическое разделение; и/или

2) применение этанола и/или этилацетата, возможно не включает применение органического растворителя; и/или

3) стадию элюирования сиаловой кислоты из неподвижной фазы раствором, содержащим органический растворитель; и/или

4) применение тяжелого металла; и/или

5) стадию нагревания ферментационного бульона до температуры выше 45°C.

3. Способ по одному из пп. 1, 2, отличающийся тем, что биомассу удаляют из ферментационного бульона посредством центрифугирования и/или фильтрования.

4. Способ по одному из пп. 1-3, отличающийся тем, что

1) при обработке на катионообменнике используют сильный катионообменник и/или используют катионообменный материал в водородной форме; и/или

2) при обработке на анионообменнике используют сильный анионообменник и/или используют анионообменный материал в хлоридной форме.

5. Способ по одному из пп. 1-4, отличающийся тем, что

1) обработку на катионообменнике выполняют для удаления неспецифических катионов и для их замены на конкретные катионы, предпочтительно для замены их на конкретный катион H⁺ или Na⁺, при этом если неспецифические катионы заменяют на H⁺, то значение pH проходящего потока предпочтительно доводят до pH 6-8 перед проведением последующей стадии обработки, наиболее предпочтительно путем добавления NaOH к проходящему потоку; и/или

2) стадию обработки на анионообменнике проводят для удаления неспецифических анионов и замены их на конкретные анионы, предпочтительно на конкретный анион Cl^- или OH^-, при этом если неспецифические анионы заменяют на Cl^-, то значение pH проходящего потока предпочтительно доводят до pH 6-8, после чего проводят последующую стадию обработки, наиболее предпочтительно путем добавления NaOH к проходящему потоку.

6. Способ по одному из пп. 1-5, отличающийся тем, что условия, при которых сиаловая кислота проходит через анионообменный материал и катионообменный материал, устанавливают путем регулировки pH и/или концентрации солей в осветленном растворе, предпочтительно путем доведения pH осветленного раствора до значения pH в диапазоне 6-8.

7. Способ по одному из пп. 1-6, отличающийся тем, что после обработки на катионообменнике и обработки на анионообменнике очищенный раствор содержит сиаловую кислоту, придающие окраску вещества и соль, при этом соль предпочтительно представляет собой NaCl.

8. Способ по одному из пп. 1-7, отличающийся тем, что осветленный раствор сначала подвергают обработке на катионообменнике, а затем обработке на анионообменнике.

9. Способ по одному из пп. 1-8, отличающийся тем, что очищенный раствор концентрируют, предпочтительно посредством нанофильтрации и/или обратного осмоса, более предпочтительно посредством нанофильтрации, при этом наиболее предпочтительно используют нанофильтрационную мембрану, которая имеет значение отсечения по молекулярной массе в диапазоне 100-200 кДа.

10. Способ по одному из пп. 1-9, отличающийся тем, что осветленный раствор и/или очищенный раствор концентрируют

1) до достижения концентрации сиаловой кислоты, большей или равной 100 г/л, предпочтительно большей или равной 200 г/л, более предпочтительно большей или равной 300 г/л; и/или

2) посредством нанофильтрации при температуре ниже 80°C, предпочтительно ниже 50°C, более предпочтительно от 4°C до 45°C, более предпочтительно от 10°C до 40°C, еще более предпочтительно от 15 до 30°C, наиболее предпочтительно от 15 до 20°C; и/или

3) посредством обратного осмоса при температуре от 20°C до 50°C, более предпочтительно от 30°C до 45°C, наиболее предпочтительно от 35°C до 45°C; и/или

4) при давлении в диапазоне от выше 5 бар (0,5 МПа) до ниже 50 бар (5 МПа), предпочтительно при давлении в диапазоне от выше 10 бар (1 МПа) до ниже 40 бар (4 МПа), более предпочтительно при давлении в диапазоне от выше 15 до ниже 30 бар (3 МПа).

11. Способ по одному из пп. 1-10, отличающийся тем, что электродиализ представляет собой электродиализ в нейтральных условиях или электродиализ в кислотных условиях.

12. Способ по одному из пп. 1-11, отличающийся тем, что после удаления солей из очищенного раствора

1) количество соли в очищенном растворе составляет менее 10% (мас./мас.), предпочтительно менее 5% (мас./мас.), более предпочтительно менее 1% (мас./мас.); и/или

2) значение электропроводности находится в диапазоне от 0,2 до 10,0 мСм/см², предпочтительно от 0,4 до 5,0 мСм/см², более предпочтительно от 0,5 до 1,0 мСм/см².

13. Способ по одному из пп. 1-12, отличающийся тем, что осветленный раствор и/или очищенный раствор подвергают стадии обесцвечивания, предпочтительно путем обработки активированным углем, причем указанное удаление возможно осуществляют

1) до или после стадии диафильтрации и/или концентрирования осветленного раствора; и/или

2) до или после стадии электродиализа и/или диафильтрации осветленного раствора.

14. Способ по одному из пп. 1-13, отличающийся тем, что сиаловую кислоту, содержащуюся в осветленном растворе и/или очищенном растворе, превращают в ее натриевую форму, предпочтительно путем обработки указанного очищенного раствора с использованием сильного катионообменного материала в натриевой форме.

15. Способ по одному из пп. 1-14, отличающийся тем, что очищенный раствор

1) сушат распылением, причем указанный очищенный раствор предпочтительно содержит сиаловую кислоту в натриевой форме; или

2) подвергают кристаллизации, предпочтительно путем добавления уксусной кислоты к указанному очищенному раствору, причем особенно предпочтительно, сиаловую кислоту получают в кристаллической форме в виде дигидрата.