Применение бензоата для лечения нарушений центральной нервной системы

Изобретение относится к способу защиты кортикальных нейронов от митохондриальной дисфункции, токсичности или депривации кислорода и глюкозы, включающему введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества бензоата лития, где эффективное количество бензоата лития составляет от 100 до 1000 мг. 11 з.п. ф-лы, 21 ил., 2 табл., 10 пр.

 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По этой заявке испрашивается приоритет временной заявки в США, U.S.S.N. 62/349,600, поданной 13 июня 2016, которая полностью включена в настоящее описание ссылкой.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Центральная нервная система (ЦНС) включает головной мозг и спинной мозг. ЦНС уязвима для различных нарушений, которые могут быть вызваны различными факторами, включая травму, инфекции, дегенерацию, дислокации и/или повреждения, опухоли, разрушение тока крови и аутоиммунные нарушения. Симптомы расстройства центральной нервной системы зависят от области нервной системы, затрагиваемой и являющейся причиной нарушения.

Развитие эффективных методов лечения расстройств центральной нервной системы отстает от других терапевтических областей вследствие сложности таких нарушений и нехватки эффективной технологии для доставки терапевтических агентов через гематоэнцефалический барьер. Также это очень интересно для развития новых подходов к лечению расстройств центральной нервной системы.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее раскрытие базируется по меньшей мере частично, на неожиданных результатах, заключающихся в том, что бензоат лития показал защитные эффекты в различных in vitro и in vivo моделях заболеваний ЦНС. Например, бензоат лития успешно предотвратил токсичность нейрона, вызванную 3-нитропропионовой кислотой (3-NP), которая, как известно, вызывает дисфункцию митохондрий, окислительный стресс и сверхпродукцию реакционоспособных форм кислорода; в значительной степени сохранил респираторную способность функций митохондрий, играющую важную роль в различных расстройствах центральной нервной системы; уменьшил прогрессию заболевания в модели бокового амиотрофического склероза (ALS) животных; защищал нейроны от депривации кислорода и глюкозы; снижал гибель клеток и поведенческие нарушения вследствие токсичности, вызванной 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридином (MPTP), индивидуально или в комбинации с 3-NP; и защищал нейроны от ущерба, вызванного β-амилоидными пептидами. Далее, наблюдали, что бензоат лития неожиданно облегчал боль. Наконец, бензоат лития неожиданно показал лучшие фармакокинетические признаки и терапевтическую эффективность по сравнению с бензоатом натрия и хлоридом лития в комбинации.

Соответственно, один аспект настоящего раскрытия относится к способу лечения заболевания центральной нервной системы (ЦНС), включающему введение пациенту эффективного количества соединения бензоата лития, которое может быть составлено в композицию, дополнительно включающую носитель. В некоторых примерах композиция может быть фармацевтической композицией, продуктом лечебного питания или диетическим продуктом, которая может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления заболевание ЦНС является нейродегенеративным заболеванием, включая, но не ограничиваясь ими, болезнь Гентингтона, множественную системную атрофию (MSA), связанную с судорогами нейротоксичность, болезнь Паркинсона, вызванные митохондриальными дисфункциями расстройства ЦНС, митохондриальная энцефаломиопатия, лактатацидоз, инсультоподобные эпизоды (MELAS), синдром невропатии, атаксии, пигментного ретинита и птоза (NARP), мионейрогенную желудочно-кишечную энцефалопатию (MNGIE), наследственную оптическую невропатию Лебера (LHON), синдром Лея, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз (ALS), миоклоническую эпилепсию, рассеянный склероз, ишемический инсульт, сосудистую деменцию, травматическое повреждение головного мозга, повреждение спинного мозга, синдром Дауна, деменцию с тельцами Леви (LBD), спорадический миозит с телами включения (sIBM) или спорадическую церебральную амилоидную ангиопатию (CAA), лобно-височную деменцию (FTD), синдром хрупкой X хромосомы (FXS), перивентрикулярную лейкомаляцию, атаксия Фридриха, болезнь Гоше, субарахноидальное кровотечение, перинатальную гипоксическую ишемическую энцефалопатию, прогрессирующий надъядерный паралич (PSP), внутричерепную гипертензию, спорадическую болезнь Крейтцфельда-Якоба, позднюю дискинезию, синдром Ретта, боковой склероз, наследственный спастический парапарез, прогрессирующий яремный паралич, спинную мышечную атрофию или связанную с X-хромосомой спинобульбарную мышечную атрофию (болезнь Кеннеди).

В некоторых вариантах осуществления заболевание ЦНС связано с окислительным стрессом, сверхпродукцией реакционоспособных форм кислорода или обеими причинами. Примеры включают, но не ограничены ими, перивентрикулярную лейкомаляцию, атаксия Фридриха, болезнь Гоше, субарахноидальное кровотечение, перинатальную гипоксическую ишемическую энцефалопатию, прогрессирующий надъядерный паралич (PSP), внутричерепную гипертензию, спорадическую болезнь Крейтцфельда-Якоба, позднюю дискинезию, синдром Ретта или заболевание мотонейронов (например, ALS, основной боковой склероз, наследственный спастический парапарез, прогрессирующий яремный паралич (у некоторых есть мутация SOD1), спинную мышечную атрофию или Связанную с X-хромосомой спинобульбарную мышечную атрофию (заболевание Кеннеди)).

В некоторых вариантах осуществления пациентом является человек, имеющий генетический дефект, связанный с функцией мотонейрона. В одном примере человеческий пациент имеет мутированный ген супероксид дисмутазы 1 (SOD1). В других примерах пациентом является человек, имеющий митохондриальную дисфункцию. Также или кроме того, пациентом является человек, имеющий или у которого подозревается наличие заболевания ЦНС. В некоторых примерах пациент проходит другое лечение заболевания ЦНС.

В другом аспекте настоящее раскрытие относится к способу облегчения боли у пациента, включающему введение пациенту эффективного количества любого соединения бензоата лития, как описано здесь (например, бензоата лития или LiBen), которое может быть составлено в композицию (например, фармацевтическую композицию, продукт лечебного питания или диетический продукт), которая дополнительно включает носитель, например, фармацевтически приемлемый носитель. Пациент может быть пациентом-человеком, страдающим острой болью, хронической болью, нейропатической болью, комплексным регионарный болевым синдромом или болью, вызванную диабетической невропатией, воспалением или остеопорозом. В некоторых примерах пациент проходит другое лечение боли.

В любом из способов, описанных здесь, пациенту может быть введено соединение бензоата лития в количестве от приблизительно 5 до приблизительно 150 мг/кг, например, от приблизительно 15 до приблизительно 140 мг/кг; от приблизительно 25 до приблизительно 130 мг/кг; от приблизительно 35 до приблизительно 120 мг/кг; от приблизительно 45 до приблизительно 110 мг/кг; от приблизительно 55 до приблизительно 100 мг/кг; от приблизительно 65 до приблизительно 90 мг/кг; или от приблизительно 75 до приблизительно 80 мг/кг. Также или кроме того, пациенту может быть введено соединение бензоата лития с частотой от четырех раз в сутки до одного раза в месяц. Соединение бензоата лития, которое может быть составлено в фармацевтическую композицию, может быть введено системным путем, например, пероральным введением или парентеральным введением.

Также в рамках настоящего раскрытия находятся (i) фармацевтические композиции для применения в лечении целевых расстройств центральной нервной системы, как описано здесь, или для облегчения боли, фармацевтическая композиция, включающая соединение бензоата лития (например, бензоат лития) и фармацевтически приемлемый носитель; и (ii) применение соединения бензоата лития, такого как бензоат лития, для получения лекарственного средства для применения в лечении любого из целевых заболеваний ЦНС или облегчения боли.

Детали одного или более вариантов осуществления изобретения сформулированы в описании ниже. Другие признаки или преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующих фигур и подробного описания нескольких вариантов осуществления, а также из приложенной формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

ФИГУРА 1 включает диаграммы, показывающие нейропротективный эффект бензоата лития в отношении токсичности, вызванной 3-нитропропионовой кислотой (3-NP) в первичной кортикальной культуре. A: гистограмма, указывающая процент выживания клеток для клеток, обработанных 0, 1 или 3 мМ бензоата лития. B: гистограмма, показывающая ʺИиндекс смертиʺ, определенный как отношение мертвых клеток к выжившим клеткам в обработанной кортикальной культуре или не обработанный 3-NP. C: фотография, показывающая результат MAP-2 иммуноцитохимии клеток, предобработанных бензоатом лития (1 или 3 мМ). 3-NP вызывает гибель клеток, в то время как бензоат лития спасает клетку дозозависимым образом.

ФИГУРА 2 включает диаграммы, показывающие эффект бензоата лития в спасении продукции ROS, индуцированной 3-NP, в первичной кортикальной культуре. A: Примеры диаграммы флуоресценции ROS в кортикальной культуре, предобработанной бензоатом лития в количестве 0, 0,5, 1, 3 мМ. B: график, показывающий результаты статистического анализа сигналов флуоресценции, показанных в группе A, полученные сравнением эффектов сокращения ROS среди бензоата лития (0,5 мМ), бензоата натрия (0,5 мМ) и хлорида лития (0,5 мМ). Черточки указывают среднее стандартное отклонение. * p-значение <0,05; ** p-значение <0,01; p-значение *** <0,001; p-значение **** <0,0001, $ указывает LiBen по сравнению с LiCl, $: p-значение <0,05; # указывает LiBen по сравнению с NaBen, ##: p-значение <0,01.

ФИГУРА 3 включает диаграммы, показывающие, что бензоат лития улучшил резервную респираторную способность функций митохондрии. A: линейный график с временной зависимостью OCR с последовательной инъекцией модуляторов. CTRL, контроль; LiBen, бензоат лития; LiCl, хлорид лития; NABen, бензоат натрия; OCR, уровень потребления кислорода; OSM, онкостатин M. B и C: гистограммы OCR, проанализированного от результата группы A с каждой частью инъекции модуляторов, включая основное дыхание, резервную респираторную способность, утечку протонов и продукцию ATФ. Бензоат лития показывает лучшую митохондриальную функцию при меньшем количестве базальной активности, утечки протонов, продукции ATФ, чем бензоат натрия и хлорид лития, а также большую резервную респираторную способность, чем бензоат натрия.

ФИГУРА 4 включает диаграммы, показывающие, что бензоат лития уменьшает прогрессию заболевания при амиотрофическом боковом склерозе (ALS). A: диаграмма, показывающая лучшую двигательную активность по числу подъемов на задние лапы при лечении бензоатом лития. B: диаграмма, показывающая лучшее общее время стояния на задних лапах (секунд) при лечении бензоатом лития. C: диаграмма, показывающая более длительное время ожидания падения (секунд) в тесте висения при лечении бензоатом лития. D: диаграмма, показывающая более длительное время ожидания падения (секунда) в тесте вращающегося стержня при лечении бензоатом лития. E: диаграмма, показывающая лучшую активность подъема на задние лапы (прерывание лучей) при лечении бензоатом лития. F: диаграмма, показывающая лучшую двуигательную активность (прерывание лучей) при лечении бензоатом лития. G: диаграмма, показывающая меньшее снижение массы тела (г) при лечении бензоатом лития. H: диаграмма, показывающая лучшую выживаемость (%) при лечении бензоатом лития. * p-значение <0,05.

ФИГУРА 5 включает диаграммы, показывающие примеры экспериментальных планов. A: пример экспериментального плана лечения бензоатом лития в течение 53 часов на первичной кортикальной культуре (твердая пластинка). B: пример экспериментального плана последующего лечения бензоатом лития в течение 48 часов на первичной кортикальной культуре (твердая пластинка).

ФИГУРА 6 включает диаграммы, показывающие, что бензоат лития защитил нейроны первичной культуры от депривации кислорода и глюкозы. A: график, показывающий жизнеспособность клетки первичной кортикальной культуры, обработанной бензоатом лития (0, 0,3, 1, 3, 5 мМ) для полной 53-часовой защиты. p-значение *** <0,001. B: график, показывающий выживание клеток (%) первичной кортикальной культуры, обработанной бензоатом лития (0, 0,3, 0,5, 1, 2, 3 мМ) в течение 48 часов. ** p-значение <0,01; p-значение *** <0,001; p-значение **** <0,0001.

ФИГУРА 7 является диаграммой, показывающей пример экспериментального плана лечения бензоатом лития и бензоатом натрия в различных условиях на первичной кортикальной культуре, обработанной 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридином (MPTP).

ФИГУРА 8 включает диаграммы, показывающие выживаемость клеток (%) первичной кортикальной культуры, которую подвергают действию MPTP. A: диаграмма, показывающая выживаемость клеток, предобработанных в течение 24 часов 1 мМ хлорида лития, 1 мМ бензоата натрия и 1 мМ бензоата лития. B: диаграмма, показывающая выживаемость клеток 24 часа после обработки 1 мМ хлорида лития, 1 мМ бензоата натрия и 1 мМ бензоата лития. Бензоат лития обеспечивает лучшую защиту, чем бензоат натрия и хлорид лития. ****: p-значение <0,0001; $ указывает сравнение между бензоатом лития и бензоатом натрия, $: p-значение <0,05; # указал сравнение между бензоатом лития и хлоридом лития, ###: p-значение <0,001.

ФИГУРА 9 является диаграммой, показывающей сравнение выживания клеток (%) в условиях обработки MPTP с защитой различными концентрациями бензоата лития (0,3, 1, 3 мМ). * p-значение <0,05; ** p-значение <0,01; p-значение *** <0,001; p-значение **** <0,0001.

ФИГУРА 10 включает диаграммы, показывающие результаты теста с шестом при вращении (панель A), и общее время, проведенное на шесте (панель B) мышей, обработанных контролем, MPTP-солевым раствором и MPTP-LiBen. LiBen существенно улучшает MPTP-индуцированные дефициты. Результаты представляют собой среднее ±SEM.* p-значение <0,05 (t-тест).

ФИГУРА 11 является диаграммой, показывающей пример экспериментального плана режима лечения бензоатом лития на вызванной MPTP и 3-NP двойной токсичностью модели мышей MSA.

ФИГУРА 12 включает диаграммы, показывающие эффективность бензоата лития на производительность на вращающемся барабане на мышах, которых подвергают действию как MPTP, так и 3-NP модели мышей MSA. A: диаграмма, показывающая базовое время удерживания на барабане (отсутствие лечения лечение), 0 дней (после 9 дней MPTP плюс индукция 3-NP) и 7 дней (лечение бензоатом лития или солевым раствором в течение 7 дней) в различных группах, как обозначено. B: диаграмма, показывающая улучшение времени удерживания на барабане в различных группах после 7 дней лечения бензоатом лития в течение 7 дней. Результаты представляют собой среднее ±SEM. * p-значение <0,05.

ФИГУРА 13 является диаграммой, показывающей пример экспериментальный план исследования эффекта бензоата лития при лечении острой боли.

ФИГУРА 14 является линейным графиком, показывающим различный момент времени порогов вывода лапы после лечения бензоатом лития или контролем PBS в задаче Фон Фрэя. Результаты представляют собой среднее ±SEM. * p-значение <0,05 (t-тест). Двусторонний тест ANOVA не показал взаимодействия результатов с временной зависимостью. В T-тесте Стъюдента был проанализирован PBS по сравнению с LiBen в каждый момент времени. Группа LiBen показывает лучший болевой порог и в 30, и в 60 минут.

ФИГУРА 15 включает диаграммы, показывающие линейный график кривой зависимости «концентрация-время» бензойной кислоты. A: диаграмма, показывающая плазменную концентрацию бензойной кислоты с 0 минут до 1440 минут. B: диаграмма, показывающая плазменную концентрацию бензойной кислоты с 0 минут до 360 минут. Бензоат лития вызывает более высокую концентрацию бензоата, чем эквимолярная комбинация карбоната лития и бензоата натрия.

ФИГУРА 16 включает кривые зависимости «концентрация-время» лития. A: диаграмма, показывающая плазменную концентрацию бензойной кислоты с 0 минут до 1440 минут. B: диаграмма, показывающая плазменную концентрацию бензойной кислоты с 0 минут до 720 минут. Бензоат лития вызывает более высокую концентрацию лития, чем эквимолярная комбинация карбоната лития и бензоата натрия в нескольких моментах времени.

ФИГУРА 17 является гистограммой теста MTT, показывающего, что после обработки Aβ25-35 LiCl и LiBen значительно увеличили проценты выживания клеток по сравнению с контрольной группой. Лечение LiBen дает лучшую защиту, чем LiCl.

ФИГУРА 18 включает гистограммы тестов MTT, показывающих, что сниженные проценты выживания клеток наблюдались только в контрольной группе NaBen, когда MK801 блокировал рецептор NMDA, тогда как лечение MK801 не изменяло эффекты защиты бензоата лития. A: диаграмма, показывающая плазменную концентрацию лития в отсутствие лечения MK801 (0 мкМ). B: диаграмма, показывающая плазменную концентрацию лития в присутствии MK801 в концентрации 10 мкМ. В то время как эффект NaBen может быть заблокирован антагонистом NMDA, эффект бензоата лития не изменялся антагонистом NMDA.

ФИГУРА 19 включает диаграммы, показывающие, что бензоат лития улучшил нейрогенез в первичной кортикальной культуре. A и B: иммуноцитохимический тест, показывающий окрашивание клеток Хехст, NeuN и BrdU. Увеличенные числа BrdU (+)/NeuN (+) клеток наблюдались в LiCl/NaBen/LiBen-обработанных кортикальных клетках по сравнению с группой, не получавшей никакой обработки. C: гистограмма количественного определения результатов A и B. **** указывает p <0,0001. LiBen приводит к намного более сильному нейрогенезу, чем LiCl и NaBen.

ФИГУРА 20 включает диаграммы, показывающие, что LiBen и LiCl значительно сократили количество GFAP(+) клеток после цитотоксичности Aβ25-35 по сравнению с NaBen. Одновременно LiBen показал лучший эффект защиты, чем LiCl. A: результаты иммуноцитохимического теста. B: гистограмма A. ****: p <0,0001.

ФИГУРА 21 является диаграммой, показывающей, что бензоат лития улучшает выживаемость при болезни Гентингтона (HD).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее раскрытие базируется, по меньшей мере частично? на неожиданных результатах, заключающихся в том, что бензоат лития показал защитные эффекты в различных in vitro и in vivo моделях заболевания ЦНС. Бензоат лития успешно устранил токсичность нейрона, вызванную 3-нитропропионовой кислотой (3-NP), которая, как известно, вызывает дисфункцию митохондрий, окислительный стресс и сверхпродукцию реакционоспособных форм кислорода. Модель 3-NP является достоверной для изучения болезни Гентингтона (HD) (Ramaswamy et al., ILAR J. 48 (4):356-73 (2007)); выраженной MSA (Fellner et al., Front Neurosci. 10:99 (2016)); и конвульсий (Bhowmik et al., Br. J. Pharmacol., 167(7):1398-1414 (2012)). Кроме того, 3-NP, как было известно, вызвает окислительный стресс и сверхпродукцию ROS, которые, как известно, связаны с различными заболеваниями ЦНС, включая перивентрикулярную лейкомаляцию (Volpe et al., Pediatric Res. 50:553-562 (2001)), атаксию Фридриха (Hayashi, Free Radical Biology and Medicine, 88:10-17 (2015)), болезнь Гоше (de la Mata, Sci. Rep. 5: 10903 (2015)), субарахноидальное кровотечение (Ayer, Acta Neurochir Suppl. 104: 33-41 (2008)), перинатальную гипоксическую ишемическую энцефалопатию (Lai, J. Biomed Biotechnol 2011, Article ID 609813 (2011)), прогрессирующий надъядерный паралич (PSP) (Stamelou, Brain 133, 1578-1590 (2010)), внутричерепную гипертензию (Martı´nez-Revelles S. Antioxid Redox Signal. 18: 51-65(2013)), спорадическую болезнь Крейтцфельда-Якоба (Kovacic, Curr Neuropharmacol 10:289-302 (2012)), позднюю дискинезию (Lohr J.B. CNS Drugs 17:47-62 (2003)), синдром Ретта (De Felice Neurobiology of Disease 68:66-77 (2014)) и различные заболевания мотонейронов: ALS, основной боковой склероз, наследственный спастический парапарез, прогрессирующий яремный паралич (у некоторых имеется мутация SOD1), спинную мышечную атрофию, связанную с X-хромосомой спинобульбарную мышечную атрофию (болезнь Кеннеди)) (Rossi, Int'l J. Cell Biol. 2012, Article ID 908724 (2012)). Соответственно, ожидается, что соединение бензоата лития, как описано здесь, будет эффективным в лечении любого из этих расстройств ЦНС.

Также наблюдалось, что бензоат лития улучшал резервную респираторную способность функции митохондрии. Было обнаружено, что дисфункция митохондрии была вовлечена в развитие различных расстройств ЦНС, например, болезни Паркинсона (Wood-Kaczmar et al., PLoS ONE, 3, e2455 (2008), Exner, N. et al., J. Neurosci., 27:12413-12418 (2007), и Dagda, R.K. et al., J. Biol. Chem., 284: 13843-13855 (2009)), болезни Альцгеймера (Baloyannis, S.J. et al., J. Alzheimers Dis., 9:119-126 (2009), Manczak, M. et al., Hum. Mol. Genet., 15:1437-1449 (2006), and Lustbader, J.W. et al., Science, 304: 448-452 (2004)), HD (Bossy-Wetzel, et al., Trends. Neurosci., 31:609-616 (2008)), ALS (Menzies et al., Brain, 125:1522-1533 (2002) и Cozzolino, M., et al., Mol. Cell. Neurosci. 2012), миоклонической эпилепсии (Greaves LC et al., J Pathol., 226:274-86 (2012)) и рассеянного склероза (Morris et al., BMC Medicine, 13:68 (2015)). Соответственно, ожидается, что соединение бензоата лития, как описано здесь, принесет пользу в лечении таких расстройств ЦНС через уменьшение сверхпродукции ROS и/или окислительного стресса.

Действительно, было обнаружено, что бензоат лития уменьшал прогрессию заболевания в модели амиотрофического бокового склероза (ALS) у животных, имеющих мутацию SOD1*G93A, которая составляет приблизительно 20% семейного ALS (Acevedo-Arozena et al., Disease Models and Mechanisms, 4: 686-700 (2011)). Этот результат позволяет предположить, что соединение бензоата лития может быть эффективным при лечении расстройств ЦНС, включающих генетические мутации, связанные с заболеваниями мотонейрона.

Далее, было обнаружено, что бензоат лития защищал нейроны от депривации кислорода и глюкозы, способствующей по существу многим расстройствам ЦНС, включая ишемический инсульт и сосудистую деменцию (Bacigaluppi et al., The Open Neurology Journal, 4:34-38 (2010) and Li et al., Phytomedicine, 19 (8-9): 677-681 (2012)). Таким образом, соединение бензоата лития может быть полезным в лечении таких расстройств ЦНС через защитные эффекты в отношении депривации кислорода и глюкозы.

Кроме того, бензоат лития уменьшал гибель клеток и расстройства поведения от токсичности, вызванной 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридином (MPTP), или индивидуально, или в комбинации с 3-NP. MPTP-индуцированная токсичность является известной моделью болезни Паркинсона и индуцированной митохондриальными дисфункциями гибели нейронов (Langston et al., Science, 219 (4587): 979-980 (1983), и Gloria et al., J Parkinsons Dis 26 декабря 2012). Двойная токсичность, вызванная MPTP и 3-NP, является установленной моделью для изучения множественной системной атрофии с преобладающим паркинсонизмом (MSA-P) и индуцированной митохондриальными дисфункциями гибели нейронов (Fernagut et al., Experimental Neurology 185:47-62 (2004) и Fernagut et al., Neuroscience (2011)).

Кроме того, бензоат лития защитил нейроны от повреждений, вызываемых β-амилоидными пептидами в модели животных, что указавает на то, что соединение бензоата лития будет эффективным при лечении AD, синдрома Дауна, спорадического миозита с телами включения (sIBM) и спорадической церебральной амилоидной ангиопатии (CAA) (Go ̈tz et al., Cell. Mol. Life Sci. 68:3359-3375 (2011) and Masters et al., Medical Sciences, 82:4245-4249 (1985), Mollenhauer et al, Journal of Alzheimer's Disease 24:383-391 (2011), Lu et al., Ann Neurol, 61:476-483 (2007), и Charidimou et al. 83:124e137 (2012)).

Кроме того, наблюдалось, что бензоат лития неожиданно облегчал боль, что позволяет предположить, что соединение бензоата лития будет полезным в облегчении боли, такой как нейропатическая боль, комплексный регионарный болевой синдром или (хроническая) боль, связанная с диабетической невропатией, воспалением или остеопорозом (Wang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 55:949-965 (2003).

В дополнение к вышеупомянутым недавно обнаруженным терапевтическим эффектам бензоат лития неожиданно показал превосходные фармакокинетические свойства и терапевтическую эффективность по сравнению с бензоатом натрия и хлоридом лития в комбинации. См. примеры ниже.

Соответственно, описанные здесь способы лечения расстройств ЦНС, таких как описанные здесь, и/или облегчения боли с использованием эффективного количества композиции, включающей соединение бензоата лития (например, бензоат лития).

Определения

ʺСоединение бензоата литияʺ относится к соединению формулы: в которой R¹ обозначает водород, C_1-3 алкил, галоген, -CN, -NO₂, -N₃, C₁-C₃ алкенил, C₁-C₃ алкинил, - OR, -NH₂, или - SR, причем R обозначает водород, галоген, -CN, -NO₂, -N₃, ацил, C_1-3 алкил, C_2-3 алкенил, C_1-3 алкинил; и а=0, 1, 2, 3, 4 или 5. В некоторых вариантах осуществления соединение бензоата лития представляет собой (бензоат лития).

ʺC_1-3 алкилʺ относится к радикалу с прямой или разветвленной цепью, имеющему насыщенную углеводородную группу, включающую от 1 до 3 атомов углерода, например, 1-2 атома углерода (ʺC_1-2 алкил ʺ) или 1 атом углерода (ʺC₁ алкил ʺ). Если не указано иное, каждая алкильная группа может быть независимо не замещена (ʺнезамещенный алкилʺ) или замещена (ʺзамещенный алкилʺ) одним или более заместителями (например, галогеном, таким как F). В некоторых вариантах осуществления алкильная группа является незамещенным C_1-3 алкилом (например, -CH₃ или- CF₃). «Галоген» относится к фтору (фтор, -F), хлору (хлор, -Cl), брому (бром, -Br) или йоду (йод, -I).

ʺC_2-4 алкенилʺ относится к радикалу с прямой или разветвленной цепью, имеющему углеводородную группу, включающую от 2 до 4 атомов углерода, одну или более двойных связей углерод-углерод и не включающую тройных связей. В некоторых примерах C_2-4 алкенильная группа имеет 2, 3 или 4 атома углерода. Если не указано иное, каждая алкенильная группа может быть независимо в случае необходимости замещена, т.е., является незамещенной (ʺнезамещенный алкенилʺ) или замещенной (ʺзамещенный алкенилʺ) одним или более заместителями. В некоторых вариантах осуществления алкенильная группа является незамещенным C_2-4 алкенилом. В некоторых вариантах осуществления алкенильная группа представляет собой замещенный алкенил, например, замещенный галогеном, таким как F или Cl, или C_1-3 алкилом, таким как -CH₃. В алкенильной группе двойная связь C=C, для которой стереохимия не определена (например, -CH=CHCH₃ или) может представлять собой (E)- или (Z)-двойную связь.

«C_2-4 алкинил» относится к радикалу с прямой или разветвленной цепью, имеющему углеводородную группу, включающую от 2 до 4 атомов углерода, одну или более тройных связей углерод-углерод и в случае необходимости одну или более двойных связей. В некоторых вариантах осуществления алкинильная группа имеет 2, 3 или 4 атома углерода. Если не указано иное, каждая алкинильная группа независимо в случае необходимости замещена, т.е., является незамещенной (ʺнезамещенный алкинилʺ) или замещенной (ʺзамещенный алкинилʺ) одним или более заместителями, например, галогеном, таким как F или Cl, или C_1-3 алкилом, таким как -CH₃.

Термин ʺфармацевтически приемлемая сольʺ относится к таким солям, которые являются, в рамках здравого медицинского суждения, подходящими для использования в контакте с тканями человека и животных без нежелательной токсичности, раздражения, аллергической реакции и т.п., и соразмерны с обоснованным отношением преимущества/риска. Фармацевтически приемлемые соли известны в данной области техники. Например, Berge et al., описывают фармацевтически приемлемые соли подробно в J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19, включенном в настоящее описание ссылкой.

Фармацевтически приемлемые соли соединений, описанных здесь, включают полученные из подходящих неорганических и органических кислот и оснований. Примерами фармацевтически приемлемых нетоксичных солей присоединения с кислотой являются соли аминогруппы, сформированные с неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, бромистоводородная кислота, фосфорная кислота, серная кислота и перхлорная кислота, или с органическими кислотами, такими как уксусная кислота, щавелевая кислота, малеиновая кислота, винная кислота, лимонная кислота, янтарная кислота или малоновая кислота, или при помощи других способов, известных в данной области, таких как ионный обмен. Другие фармацевтически приемлемые соли включают адипат, альгинат, аскорбат, аспартат, бензолсульфонат, бензоат, бисульфат, борат, бутират, камфорат, камфорсульфонат, цитрат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, формиат, фумарат, глюкогептаноат, глицерофосфат, глюконат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, гидройодид, 2-гидроксиэтансульфонат, лактобионат, лактат, лаурат, лаурил сульфат, малат, малеат, малонат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, нитрат, олеат, оксалат, пальмитат, памоат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, фосфат, пикрат, пивалат, пропионат, стеарат, сукцинат, сульфат, тартрат, тиоцианат, п-толуолсульфонат, ундеканоат, валерат и т.п. Соли, полученные из подходящих оснований, включают соли щелочного металла, щелочноземельного металла, аммония и N⁺(C_1-4 Алкил)₄^-. Репрезентативные соли щелочного или щелочноземельного металла включают натрий, литий, калий, кальций, магний и т.п. Другие фармацевтически приемлемые соли включают, в соответствующих случаях, нетоксичный аммоний, четвертичный аммоний и катионы амина, сформированные с использованием противоионов, таких как галогенид, гидроксид, карбоксилат, сульфат, фосфат, нитрат, низший алкилсульфонат и арилсульфонат.

«Пациент», для которого рассматривается введение, относится к человеку (т.е., мужчине или женщине любой возрастной группы, например, пациенту педиатрической группы (например, младенцу, ребенку или подростку) или взрослому пациенту (например, молодому совершеннолетнему, взрослому средних лет или взрослому старшего возраста)) или животному. «Пациент» относится к человеку, нуждающемуся в лечении заболевания.

Термины «вводить», «вводят» или «введение» относятся к внедрению, поглощению, принятию внутрь, инъекции, ингаляции или иному представлению соединения бензоата лития, описанного здесь, или его композиции в или на пациенте.

Термины «лечить» и «лечение» относятся к изменению, облегчению, задержке начала или ингибированию прогресса заболевания, описанного здесь. В некоторых вариантах осуществления лечение может быть назначено после того, как один или несколько признаков или симптомов заболевания развились или наблюдались. В других вариантах осуществления лечение может быть назначено в отсутствие признаков или симптомов заболевания. Например, лечение может быть назначено восприимчивому пациенту до начала симптомов (например, в свете истории симптомов и/или в свете экспозиции к патогену), чтобы задержать или предотвратить возникновение заболевания. Лечение может также быть продолжено после устранения симптомов, например, для задержки или предотвращения рецидива.

Термины «состояние», «заболевание» и «нарушение» используются взаимозаменяемо.

ʺЭффективное количествоʺ композиции, включающей соединение бензоата лития, описанное здесь, относится к количеству, достаточному для индукции желаемого биологического ответа, т.е., лечения и/или снижения риска состояния. Как будет понятно специалисту, эффективное количество соединения бензоата лития, описанного здесь, может варьировать в зависимости от таких факторов как желаемый биологический результат, фармакокинетика соединения бензоата лития, подвергаемое лечению состояние, способ введения, и возраст и здоровье пациента. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество является терапевтически эффективным количеством. В некоторых вариантах осуществления эффективноей количество является профилактическим лечением. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество является количеством соединения бензоата лития, описанного здесь, в единственной дозе. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество является объединенными количествами бензоата лития, описанного здесь, в многократных дозах.

ʺТерапевтически эффективное количествоʺ соединения бензоата лития, описанного здесь, является количеством, достаточным, чтобы предоставить терапевтическое преимущество в лечении состояния или задержать или минимизировать один или несколько симптомов, связанных с этим состоянием. Терапевтически эффективное количество соединения бензоата лития означает количество терапевтического агента, индивидуально или в комбинации с другими терапиями, которое предоставляет терапевтическое преимущество в лечении состояния. Термин ʺтерапевтически эффективное количествоʺ может охватывать количество, улучшающее полную терапию, позволяющее уменьшить или избежать симптомов, признаков или причин состояния, и/или улучшающее терапевтическую эффективность другого терапевтического агента.

ʺПрофилактически эффективное количествоʺ соединения бензоата лития, описанного здесь, является количеством, достаточным, чтобы предотвратить состояние или один или несколько симптомов, связанных с состоянием, или предотвратить его рецидив. Профилактически эффективное количество соединения бензоата лития означает количество терапевтического агента, индивидуально или в комбинации с другими агентами, которое предоставляет профилактическое преимущество в профилактике состояния. Термин ʺпрофилактически эффективное количествоʺ может охватывать количество, улучшающее полную профилактику или улучшающее профилактическую эффективность другого профилактического агента.

Термины «диетическое питание» или ʺпродукт диетического питанияʺ относятся к любому виду жидких и твердых/полутвердых материалов, использующихся для питания человека и животных, для улучшения основного поведенческого функционирования, гиперактивности, беспокойства, депрессии, сенсорно-двигательного функционирования, болевого порога, памяти и/или познавательного функционирования, массы тела или для облегчения лечения любого из целевых заболеваний, отмеченных здесь. Термин ʺнутрицевтическая композицияʺ относится к композициям, содержащим компоненты источников пищи и дающим дополнительную пользу для здоровья в дополнение к основной пищевой ценности продуктов.

Термин ʺпродукт лечебного питанияʺ относится к продукту питания, составленному для потребления или энтерального введения, включая продукт питания, обычно использующийся под наблюдением врача для определенного диетического контроля целевого заболевания, такого как описанные здесь. Композиция ʺпродукта лечебного питанияʺ может относиться к композиции, которая особым образом составлена и обработана (в противоположность натуральным пищевым продуктам, используемым в естественном состоянии) для пациента, нуждающегося в лечении (например, пациента-человека, страдающего заболеванием, или для которого требуется использование продукта в качестве главного активного вещества для облегчения заболевания или состояния через определенный диетический контроль). Термин ʺнутрицевтическая композицияʺ относится к композициям, содержащим компоненты источников пищи и дающим дополнительную пользу для здоровья в дополнение к основной пищевой ценности продуктов.

Композиции

Настоящее раскрытие относится к композициям, включающим соединение бензоата лития, такое как бензоат лития (LiBen), как описано здесь, и носитель. Соединение бензоата лития может быть получено химическим синтезом согласно обычной технологии или получено от коммерческого поставщика. В некоторых вариантах осуществления носитель является фармацевтически приемлемым эксципиентом. В некоторых вариантах осуществления композиция, описанная здесь, включает соединение бензоата лития, описанное здесь, и носитель. Композиции, описанные здесь, могут быть использованы в лечении целевого заболевания ЦНС, как описано здесь, или для облегчения боли.

В некоторых вариантах осуществления композиция является фармацевтической композицией. В некоторых вариантах осуществления композиция является нутрицевтической композицией. В некоторых вариантах осуществления композиция является диетическим продуктом. В некоторых вариантах осуществления композиции, описанные здесь, могут быть диетической пищей или диетическим пищевым продуктом, который может быть любыми видами жидких и твердых/полутвердых материалов, использующихся для питания человека и животных для пользы лечению целевого заболевания ЦНС или для облегчения боли. Диетический пищевой продукт может быть продуктом питания (например, напитки на чайной основе, сок, безалкогольные напитки, кофе, молоко, желе, печенье, хлебные злаки, конфеты, снеки, растительные экстракты, молочные продукты (например, мороженое и йогурт)), едой/пищевой добавкой или нутрицевтическим составом.

Диетический пищевой продукт, описанный здесь, может включать один или более съедобных носителей, придающих одно или более преимуществ продукту, как описано здесь. Примеры съедобных носителей включают крахмал, циклодекстрин, мальтодекстрин, метилцеллюлозу, карбонметоксицеллюлозу, ксантановую камедь и их водные растворы. Другие примеры включают растворители, дисперсионные среды, покрытия, сурфактанты, антиоксиданты, консерванты (например, антибактериальные агенты, противогрибковые агенты), изотонические агенты, агенты, задерживающие абсорбцию, стабилизаторы, гели, связующие вещества, эксципиенты, вещества распада, смазки, подсластители, ароматизаторы, красители, подобные материалы и их комбинации, известные специалисту. В некоторых примерах диетические пищевые продукты, описанные здесь, могут дополнительно включать нейропротекторные продукты, такие как рыбий жир, льняное масло и/или бензоат.

В некоторых примерах диетический пищевой продукт является нутрицевтическая композицией, относящейся к композициям, содержащим компоненты источников пищи и дающим дополнительную пользу для здоровья в дополнение к основной пищевой ценности продуктов. Нутрицевтическая композиция, как описано здесь, включает соединение бензоата лития, описанное здесь, и дополнительные ингредиенты и добавки, улучшающие здоровье и/или улучшающие стабильность и биоактивность соединения бензоата лития.

Действия нутрицевтической композиций могут быть быстрыми или/и кратковременными или могут помочь достигнуть долгосрочных медицинских целей как описанных здесь. Нутрицевтические композиции могут содержаться в съедобном материале, например, как пищевая добавка или фармацевтический состав. Как пищевая добавка, могут быть включены дополнительные питательные вещества, такие как витамины, минералы или аминокислоты. Композиция может также быть напитком или продуктом питания, например, чаем, безалкогольным напитком, соком, молоком, кофе, печеньем, хлебным злаком, шоколадом и снеком. При желании композиция может быть подслащена путем добавления подсластителя, такого как сорбит, мальтит, гидрогенизированный сироп глюкозы и гидрогенизированный гидролизат крахмала, кукурузная патока с высоким содержанием фруктозы, тростниковый сахар, свекловичный сахар, пектин или сукралоза.

Нутрицевтическая композиция, раскрытая здесь, может быть в форме раствора. Например, нутрицевтический состав может быть составлен в среде, такой как буфер, растворитель, разбавитель, инертный носитель, масло или крем. В некоторых примерах состав присутствует в водном растворе, в случае необходимости содержащем неводный совместный растворитель, такой как спирт. Нутрицевтическая композиция может также быть в форме порошка, пасты, желе, капсулы или таблетки. Лактоза и кукурузный крахмал обычно используются в качестве разбавителей для капсул и в качестве носителей для таблеток. Лубриканты, такие как стеарат магния, как правило добавляют для формирования таблеток.

Диетические пищевые продукты могут быть составлены для подходящего пути введения, например, перорального введения. Для перорального введения композиция может принимать форму, например, таблетки или капсулы, полученных стандартными средствами с приемлемыми эксципиентами, такими как связующие (например, предварительно желатинированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропил метилцеллюлоза); наполнители (например, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза или гидрофосфат кальция); лубриканты (например, стеарат магния, тальк или кварц); разрыхлители (например, картофельный крахмал или гликолят крахмала натрия); или смачивающие агенты (например, лаурилсульфат натрия). Таблетки могут быть покрыты способами, известными в данной области техники. Также включены пластинки и другие жевательные составы.

В некоторых примерах диетический пищевой продукт может быть в жидкой форме, и один или более съедобных носителей могут быть растворителем или дисперсионной средой, включая, но не ограничиваясь ими, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль), липиды (например, триглицериды, растительные масла, липосомы) или их комбинации. Требуемая текучесть может поддерживаться, например, при помощи покрытия, такого как лецитин; поддержанием требуемого размера частиц путем диспергирования в таких носителях как, например, жидкий полиол или липиды; при помощи таких сурфактантов как, например, гидроксипропилцеллюлоза; или комбинацией этих приемов. Во многих случаях будет желательно включать изотонический агент, такой как, например, сахара, хлорид натрия или их комбинации.

Жидкие препараты для перорального введения могут принимать форму, например, растворов, сиропов или суспензий, или они могут быть представлены как сухой продукт для восстановления водой или другим подходящим носителем перед использованием. В одном варианте осуществления жидкие препараты могут быть составлены для введения с фруктовым соком. Такие жидкие препараты могут быть получены стандартными средствами с фармацевтически приемлемыми добавками, такими как суспендирующие агенты (например, сироп сорбитола, производные целлюлозы или гидрогенизированные съедобные жиры); эмульгирующие вещества (например, лецитин или гуммиарабик); неводные носители (например, миндальное масло, жирные сложные эфиры, этиловый спирт или фракционируемые растительные масла); и консерванты (например, метил или пропил-п-гидроксибензоаты, бензоат или сорбат). В некоторых вариантах осуществления композиция является продуктом лечебного питания. Продуктом лечебного питания является продукт питания, составленный для потребления или энтерального введения. Такой продукт питания обычно используется под наблюдением врача для определенного диетического контроля целевого заболевания, такого как описанные здесь. В некоторых случаях такую медицинскую пищевую композицию особым образом составляют и обрабатывают (в противоположность натуральным пищевым продуктам, используемым в естественном состоянии) для пациента, нуждающегося в лечении (например, человека, страдающего заболеванием или кому требуется использование продукта как главное активное вещество для облегчения заболевания или состояния через определенный диетический контроль). В некоторых примерах медицинская пищевая композиция, описанная здесь, не является одной из тех, которые были бы просто рекомендованы врачом как часть полной диеты для лечения симптомов или снижения риска заболевания или состояния.

Любая из медицинских пищевых композиций, описанных здесь, включающая соединение бензоата лития и по меньшей мере один носитель (например, описанные здесь), может быть в форме жидкого раствора; порошка, пластинки, вафли, суспензии в подходящей жидкости или в подходящей эмульсии, как подробно описано ниже. По меньшей мере один носитель, который может быть натуральным или синтетическим (неприродного происхождения), приносит один или более видов пользы соединению бензоата лития в композиции, например, стабильность, биодоступность и/или биоактивность. Любой из носителей, описанных здесь, может использоваться для получения медицинской пищевой композиции. В некоторых вариантах осуществления медицинская пищевая композиция может дополнительно включать один или более дополнительных ингредиентов, выбранных из группы, включая, но не ограничиваясь ими, натуральные ароматизаторы, искусственные ароматизаторы, основные минералы и микроэлементы, минералы, витамины, овес, орехи, специи, молоко, яйцо, соль, муку, лецитин, ксантановую камедь и/или подсластители. Медицинская пищевая композиция может быть помещена в подходящий контейнер, который может дополнительно включать по меньшей мере дополнительный терапевтический агент, такой как описанные здесь.

В некоторых вариантах осуществления соединения бензоата лития, описанное здесь, присутствует в фармацевтической композиции в эффективном количестве. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество является терапевтически эффективным количеством (например, количеством, эффективным для лечения и/или снижения риска заболевания ЦНС или для облегчения боли). В некоторых вариантах осуществления эффективное количество является профилактически эффективным количеством (например, количеством, эффективным для предотвращения психоневрологического нарушения у пациента).

Фармацевтические композиции, описанные здесь, могут быть получены любым способом, известным в области фармакологии. В целом такие способы получения включают включают приведение соединения бензоата лития, описанного здесь (т.е., «активного ингредиента»), в ассоциацию с носителем или эксципиентом и/или одним или более других добавочных ингредиентов, и затем, если необходимо и/или желательно, формирование и/или упаковку продукта в желаемую форму единственной дозы или множества доз.

Фармацевтические композиции могут быть получены, упакованы и/или проданы россыпью в виде единственной дозй и/или как множество доз. «Унифицированная доза» является дискретным количеством фармацевтической композиции, включающим предопределенной количество активного ингредиента. Количество активного ингредиента обычно равно дозировке активного ингредиента, которую следует вводить пациенту, и/или удобной фракции такой дозировки, такой как половина или одна треть такой дозировки.

Относительные количества активного ингредиента, фармацевтически приемлемого эксципиента и/или любых дополнительных ингредиентов в фармацевтической композиции, описанной здесь, варьируют в зависимости от идентичности, размера и/или состояния получающего лечение пациента и далее в зависимости от пути, которым должна быть введена композиция. Композиция может включать от 0,1% до 100% (вес./вес.) активного ингредиента.

Фармацевтически приемлемые эксципиенты, используемые в получении фармацевтических композиций по изобретению, включают инертные разбавители, диспергаторы и/или гранулирующие агенты, поверхностно-активные вещества и/или эмульгаторы, разрыхлители, связующие, консерванты, буферные агенты, лубриканты и/или масла. Эксципиенты, такие как масло какао и воски для суппозитория, красители, вещества покрытия, подсластители, вкусовые добавки и ароматизаторы могут также присутствовать в композиции.

Жидкие лекарственные формы для перорального введения и парентерального введения включают фармацевтически приемлемые эмульсии, микроэмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. В дополнение к активным ингредиентам, жидкие лекарственные формы могут включать инертные разбавители, обычно используемые в этой области техники, такие как, например, вода или другие растворители, солюбилизирующие агенты и эмульгаторы, такой как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этиловый эфир угольной кислоты, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла (например, семени хлопчатника, арахисовое, кукурузное, зародышевое, оливковое, касторовое и кунжутное масла), глицерин, тетрагидрофуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирной кислоты и сорбитана, и их смеси. Помимо инертных разбавителей, пероральные композиции могут включать адъюванты, такие как смачивающие агенты, эмульгирующие и суспендирующие агенты, подсластители, вкусовые добавки и ароматизаторы. В некоторых вариантах осуществления для парентерального введения конъюгаты, описанные здесь, смешивают с солюбилизирующими агентами, такими как Cremophor^®, спирты, масла, модифицированные масла, гликоли, полисорбаты, циклодекстрины, полимеры и их смеси.

Инъецируемые препараты, например, стерильные инъецируемые водные или масляные суспензии могут быть составлены согласно известному уровню техники с использованием подходящих диспергирующих или смачивающих агентов и суспендирующих агентов. Стерильный инъецируемый препарат может быть стерильным инъецируемым раствором, суспензией или эмульсией в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например, в форме раствора в 1,3-бутандиоле. Среди приемлемых носителей и растворителей, которые могут использоваться, можно назвать воду, раствор Рингера, U.S.P. и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, стерильные, нелетучие масла традиционно используются как растворяющая или суспендирующая среда. С этой целью может использоваться любое мягкое нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, используются в получении инъецируемвых составов.

Инъецируемые составы могут стерилизоваться, например, фильтрацией через задерживающий бактерии фильтр, или путем включения стерилизующих веществ в форме стерильных твердых композиций, которые могут быть растворены или диспергированы в стерилизованной воде или другой стерильной инъецируемой среде перед использованием.

Для пролонгирования эффекта лекарственного средства часто желательно замедлить абсорбцию лекарственного средства от подкожной или внутримышечной инъекции. Это может быть достигнуто с использованием жидкой суспензии кристаллического или аморфного материала с низкой водорастворимостью. Скорость абсорбции лекарственного средства в этом случае зависит от его скорости растворения, которая, в свою очередь, может зависеть от размера кристалла и кристаллической формы. Также замедленная абсорбция парентерально введенной формы лекарственного средства может быть достигнута путем растворения или суспендирования лекарственного средства в масляном носителе.

Твердые лекарственные формы для перорального введения включают капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В таких твердых лекарственных формах активный ингредиент смешан с по меньшей мере одним инертным фармацевтически приемлемым эксципиентом или носителем, таким как цитрат натрия или дикальций фосфат и/или (a) наполнителями или экстендерами, такими как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и кремневая кислота, (b) связующими, такими как, например, карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и гуммиарабик, (c) увлажнителями, такими как глицерин, (d) разрыхлителями, такими как агар, карбонат кальция, картофельный крахмал или крахмал тапиоки, альгиновая кислота, некоторые силикаты и карбонат натрия, (e) ингибиторами растворения, такими как парафин, (f) ускорителями абсорбции, такими как четвертичные аммониевые основания, (g) смачивающими агентами, таких как, например, цетиловый спирт и глицерин моностеарат, (h) абсорбентами, такими как каолин и бентонитовая глина, и (i) лубрикантами, такими как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурил сульфат натрия и их смеси. В случае капсул, таблеток и пилюль, лекарственная форма может включать буферный агент.

Твердые композиции подобного типа могут использоваться как наполнители в мягких и твердых желатиновых капсулах с использованием таких эксципиентов как лактоза или молочный сахар, а также высокомолекулярных полиэтиленгликолей и т.п. Твердые лекарственные формы таблеток, драже, капсул, пилюль и гранул могут быть получены с покрытиями и оболочками, такими как энтеросолюбильные покрытия и другие покрытия, известные в области фармакологии. Они могут в случае необходимости включать рентгеноконтрастные агенты и могут иметь такой состав, что они высвобождают активный ингредиент(ы) только, или избирательно, в определенной части кишечника, в случае необходимости, отсроченным образом. Примеры инкапсулирующих композиций, которые могут использоваться, включают полимерные вещества и воски. Твердые композиции подобного типа могут использоваться как наполнители в мягких и твердых желатиновых капсулах с использованием таких эксципиентов как лактоза или молочный сахар, а также высокомолекулярных полиэтиленгликолей и т.п.

Активный ингредиент может быть в микроинкапсулированной форме с одним или более эксципиентами, как отмечено выше. Твердые лекарственные формы таблеток, драже, капсул, пилюль и гранул могут быть получены с покрытиями и оболочками, такими как энтеросолюбильные покрытия, покрытия, контролирующие высвобождение, и другие покрытия, известные в области составления фармацевтических составов. В таких твердых лекарственных формах активный ингредиент может быть смешан с по меньшей мере одним инертным разбавителем, таким как сахароза, лактоза или крахмал. Такие лекарственные формы могут включать, в рамках нормальной практики, дополнительные вещества, отличные от инертных разбавителей, например, таблеточные лубриканты и другое таблетирующие вспомогательные вещества, такие как стеарат магния и микрокристаллическая целлюлоза. В случае капсул, таблеток и пилюль, лекарственные формы могут включать буферные агенты. Они могут в случае необходимости включать рентгеноконтрастные агенты и могут иметь такой состав, что они высвобождают активный ингредиент(ы) только, или избирательно, в определенной части пищеварительного тракта, в случае необходимости, отсроченным образом. Примеры инкапсулирующих агентов, которые могут использоваться, включают, но не ограничены ими, полимерные вещества и воски.

Несмотря на то, что описания фармацевтических композиций, приведенные здесь, в основном относятся к фармацевтическим композициям, подходящим для введения человеку, такие композиции обычно подходят для введения животным всех видов. Модификация фармацевтических композиций, подходящих для введения человеку, для получения композиций, подходящих для введения различным животным, хорошо понятна, и обычно специалист в области ветеринарной фармакологии может спроектировать и/или выполнить такую модификацию путем обычного экспериментирования.

Соединения бензоата лития, описанные здесь, как правило, составляют в стандартной лекарственной форме для простоты введения и однородности дозировки. Понято, однако, что общее суточное применение композиций, описанных здесь, остается на усмотрение врача в рамках здравого медицинского суждения. Определенный терапевтически эффективный уровень дозы для любого конкретного пациента или организма будет зависеть от множества факторов, включая подвергаемое лечению заболевание и серьезность нарушения; активность конкретного используемого активного ингредиента; конкретная используемая композиция; возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и диету пациента; время введения, путь введения и уровень экскреции конкретного используемого активного ингредиента; продолжительность лечения; лекарственные средства, используемые в комбинации или параллельно с конкретным используемым активным ингредиентом; и подобные факторы, известные в области медицины.

Также раскрытием охвачены наборы (например, фармацевтические упаковки). Наборы по изобретению могут включать фармацевтическую композицию или сокристалл, описанный здесь, и контейнер (например, пузырек, ампулу, бутылка, шприц и/или фармацевтический пакет или другой подходящий контейнер). В некоторых вариантах осуществления, наборы могут в случае необходимости дополнительно включать второй контейнер, включающий фармацевтический эксципиент для разбавления или суспендирования фармацевтической композиции или соединения бензоата лития, описанного здесь. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция или соединение бензоата лития, описанное здесь, находящееся в первом контейнере и втором контейнере, объединяют для формирования одной стандартной лекарственной формы.

В некоторых вариантах осуществления набор, описанный здесь, включает первый контейнер, включающий соединения бензоата лития или композицию, описанную здесь. В некоторых вариантах осуществления набор, описанный здесь, может быть использован в лечении и/или снижении риска заболевания ЦНС или боли у пациента.

В некоторых вариантах осуществления набор, описанный здесь, дополнительно включает инструкции по применению соединения бензоата лития или композиции, включенной в набор. Набор, описанный здесь, может также включать информацию, которая требуется контролирующим органом, таким как U.S. Food and Drug Administration (FDA). В некоторых вариантах осуществления информация, включенная в наборы, является предписывающей информацией. В некоторых вариантах осуществления наборы и инструкции предусматривают лечение и/или снижение риска психоневрологического нарушения у пациента. Набор, описанный здесь, может включать один или более дополнительных фармацевтических агентов, описанных здесь, в форме отдельной композиции.

Способы лечения

Настоящее раскрытие относится к способам лечения, снижения риска или задержки начала расстройства ЦНС или болевого расстройства у пациента, включающим введение пациенту эффективного количества (например, терапевтически эффективного количества) соединения бензоата лития (например, LiBen) или композиции, включающей таковое, как описано здесь.

В некоторых вариантах осуществления расстройство ЦНС, которое может быть подвергнуто лечению соединением бензоата лития, является нейродегенеративным заболеванием, включая, но не ограничиваясь ими, болезнь Гентингтона, множественную системную атрофию (MSA), связанную с судорогами нейротоксичность, болезнь Паркинсона, вызванные митохондриальными дисфункциями расстройства ЦНС, митохондриальная энцефаломиопатия, лактатацидоз, инсультоподобные эпизоды (MELAS), синдром невропатии, атаксии, пигментного ретинита и птоза (NARP), мионейрогенную желудочно-кишечную энцефалопатию (MNGIE), наследственную оптическую невропатию Лебера (LHON), синдром Лея, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз (ALS), миоклоническую эпилепсию, рассеянный склероз, ишемический инсульт, сосудистую деменцию, травматическое повреждение головного мозга, повреждение спинного мозга, синдром Дауна, деменцию с тельцами Леви (LBD), спорадический миозит с телами включения (sIBM) или спорадическую церебральную амилоидную ангиопатию (CAA), лобно-височную деменцию (FTD), синдром хрупкой X хромосомы (FXS), перивентрикулярную лейкомаляцию, атаксия Фридриха, болезнь Гоше, субарахноидальное кровотечение, перинатальную гипоксическую ишемическую энцефалопатию, прогрессирующий надъядерный паралич (PSP), внутричерепную гипертензию, спорадическую болезнь Крейтцфельда-Якоба, позднюю дискинезию, синдром Ретта, боковой склероз, наследственный спастический парапарез, прогрессирующий яремный паралич, спинную мышечную атрофию или связанную с X-хромосомой спинобульбарную мышечную атрофию (болезнь Кеннеди).

В некоторых вариантах осуществления расстройство ЦНС связано с окислительным стрессом и/или сверхпродукцией ROS. Примеры включают, но не ограничены ими, перивентрикулярную лейкомаляцию, атаксию Фридриха, болезнь Гоше, субарахноидальное кровотечение, перинатальную гипоксическую ишемическую энцефалопатию, прогрессирующий надъядерный паралич (PSP), внутричерепную гипертензию, спорадическую болезнь Крейтцфельда-Якоба, позднюю дискинезию, синдром Ретта или заболевание мотонейрона (например, ALS, болезнь Гентингтона, основной боковой склероз, наследственный спастический парапарез, прогрессирующий яремный паралич (у некоторых имеется мутация SOD1), спинную мышечную атрофию или связанную с X-хромосомой спинобульбарную мышечную атрофию (болезнь Кеннеди)).

В некоторых вариантах осуществления расстройство ЦНС связано с генетическим дефектом, ассоциированным с функцией мотонейрона, например, мутированным геном SOD1 или мутированным геном гентингтина (HTT). Примеры включают ALS, болезнь Гентингтона, наследственную спастическую параплегию; летальный врожденный синдром контрактуры, основной боковой склероз; спинную яремную мышечную атрофию, летальный врожденный синдром контрактуры и спинную мышечную атрофию.

В других вариантах осуществления расстройство ЦНС связано с депривацией кислорода и/или глюкозы, например, травмой головного мозга. Примеры включают ишемический инсульт и сосудистую деменцию.

В других вариантах осуществления расстройство ЦНС связано с дисфункцией митохондрий, например, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, HD, ALS, миоклоническая эпилепсия и рассеянный склероз.

В других вариантах осуществления расстройство ЦНС связано с β-амилоидной токсичностью, например, AD, синдром Дауна, спорадический миозит с телами включения (sIBM) и спорадическая церебральная амилоидная ангиопатия (CAA).

Кроме того, расстройство ЦНС может быть заболеванием, связанным со стриатонигральной дегенерацией, например, MSA-P.

Соединение бензоата лития или композиция, включающая таковое, могут также использоваться для облегчения боли у пациента. Например, пациент может страдать от боли, вызванной различными факторами, включая нейропатическую боль, комплексный регионарный болевой синдром или боль, связанную с диабетической невропатией, воспалением или остеопорозом.

Любой из способов, описанных здесь, может дополнительно включать введение пациенту дополнительного фармацевтического агента, которое может быть агентом против расстройства ЦНС или аналгезирующим средством. Примеры включают нейролептики, выбранные из бутирофенона, фентиазина, флуфеназина, перфеназина, прохлорперазина, тиоридазина, трифторперазина, мезоридазина, промазина, трифлупромазина, левомепромазина, прометазина, тиоксантена, хлорпротиксена, флупентиксола, тиотиксена, зуклопентиксола, клозапина, оланзапина, рисперидона, кветиапина, зипрасидона, амисулприда, асенапина, палиперидона, арипипразола, частичного агониста допамин, ламотригина, мемантина, тетрабеназина, каннабидиола, LY2140023, дроперидола, пимозида, бутаперазина, карфеназина, ремоксипирида, пиперацетазина, сулпирида, акампросата и тетрабеназина; антидепрессант или стабилизатор настроения, выбранный из группы, состоящей из флуоксетина, пароксетина, эсциталопрама, циталопрама, сериралина, флувоксамина, венлафаксина, милнаципрама, дулоксетина, миртазапина, миансерина, ребоксетина, бупропиона, амитриптилина, нортриптилина, протриптилина, десипрамина, тримипрамина, амоксапина, бупропиона, бупропиона sr, s-циталопрама, кломипрамина, десипрамина, доксепина, изокарбоксазида, велафаксина xr, транилципрмина, тразодона, нефазодона, фенеизина, ламатрогина, лития, топирамата, габапентина, карбамазепина, оксакарбазепина, валпората, мапротилина, миртазапина, брофаромина, гепирона, моклобемида, изониазида и ипрониазида; лекарственное средство для улучшения когнитивной фукнции и/или ингибирования нейродегенерации, выбранное из группы, состоящей из арицепта, дoнeпeзила, такрина, ривастигмина, мeмантина, физостигмина, ниcoтина, арecoлина, хупeрзина альфа, сeлeгилина, рилузола, витамина C, витамина E, каротиноидов, Ginkgo biloba; анальгетиков, выбранных из гидрокодон-ацетоаминофена, Lyrica, трамадола, Neurontin, оксикодона, габапентина, Percocet, OxyContin, Vicodin, Vicodin ES, Vicodin HP, метадона, Norco, Ultram, Celebrex, напроксена, напроксена натрия, оксикодон-ацетоаминофена, Nucynta, Dilaudid, Opana ER, морфия, MS Contin, ибупрофена, Roxicodone, этодолака, Kadian, Opana, Endocet, гидроморфона, Aleve, Ultracet, ацетоаминофена, трамадол-ацетоаминофена, гидрокодон-ибупрофена, Vicoprofen, трансдермального Butrans, перорального прегабалина, диклофенака калия, ацетоаминофен-кодеина, Tylenol-Codeine #3, тайленола, Embeda, кеторолака, Demerol, Excedrin Migraine, Advil PM, Nucynta ER, Naprosyn, Ponstel, внутриоболочкового Prialt, оксиморфона, Zipsor, назального Sprix, аспирина, Methadose, Gralise, Cambia, инъекционного Demerol, пентазоцин-налоксона, Lortab Elixir, Percogesic, эпидурального энтанил цитрата, Dolophine, Zorvolex, назального буторфанол тартрата, Methadone Intensol, кетопрофена, меперидина, Advil, Tylenol PM Extra Strength, целекоксиба, Reprexain, Xodol 10/300, Zohydro ER, внутривенного фентанила, внутримышечного морфия, внутривенного морфия, инъекционного Dilaudid, Lorcet Plus, Advil Migraine, Hysingla ER, дифлунисала, внутривенного гидроморфона, кодеин сульфата, тапентадола, инъекционного Buprenex, инъекционного метадона, Trezix, инъекционного морфия, перорального Nalfon, инъекционного фентанила, Tylenol-Codeine #4, Zamicet, инъекционного кетамина, инъекционного гидроморфона, салицилата магния, трансдермального бупренорфина, инъекционного Duramorph, мефенамовой кислоты, Advil Liqui-Gel, Tylenol Extra Strength, инъекционного кеторолака, Ibuprofen PM, Gralise 30-Day Starter Pack, Motrin IB, внутривенного морфия, инъекционного бупренорфина HCl, ректального морфия, перорального меклофенамата, оксикодон-аспирина, внутримышечного кеторолака, Anaprox DS, внутривенного фентанила в 0,9% хлориде натрия, Hycet, внутриоболочкового зиконотида, Percogesic Extra Strength, Xartemis XR, Naprelan CR, аспирин-ацетоаминофен-кофеина, инъекционного оксиморфона, леворфанол тартрата, инъекционного Demerol, гидрокодон битартрата, инъекционного налбуфина, ректального гидроморфона, трансдермального фентанил HCl, внутривенного метадона, Q-PAP, дифенилгидрамин-ацетоаминофена, Alka-Seltzer, инъекционного меперидина, инъекционного гидроморфона, Dologesic, ректального ацетоаминофена, дигидрокодеин-ацетаминофен-кофеина, Endodan, Ibuprofen IB, Vanquish, Xodol 7.5/300, Xodol 5/300, внутривенного Ofirmev, буккального Belbuca, внутривенного кетамина, перорального Ecotrin, инъекционного Opana, перорального Diskets, Lortab 10-325, фенилтолоксамин-ацетоаминофена, Relagesic, буторфанол тартрата, Synalgos-DC, инъекционного Talwin, ректального Feverall, фенопрофена, Mediproxen, Athenol, Midol PM, Bufferin, Dologen, Wal-Profen, перидурального клонидина, Pamprin Max, внутривенного ибупрофена, субмикронизированного диклофенака, Lortab 7,5-325, Oxaydo, инъекционного Alfenta, инъекционного Sublimaze, Lorcet HD, Tactinal, инъекционного пентазоцин лакатата, Anacin, дигидрокодеин-аспирин-кофеина, Provil, Anacin Maximum Strength, внутривенного меперидина в 0,9% хлорида натрия, инъекционного Infumorph P/F, ибупрофена-ифенилгидрамин цитрата, внутривенного гидроморфона в 0,9% хлорида натрия, Primlev, назального кеторолака, инъекционного Ketalar, инъекционного алфентанила, хлорфенирамин-ацетоаминофена, Nortemp, ректального Acephen, инъекционного Astramorph, Masophen, внутривенного Ultiva, внутривенного ремифентанила, перидурального Duraclon, Extraprin, ацетоаминофен-пириламин малеата, внутривенного ремифентанила в 0,9% хлорида натрия, бромфенирамин-ацетоаминофена, внутривенного диклофенака, напроксен-дифенилгидрамина, субмикронизированного индометацина, бупренорфина. Любое вещество против расстройства ЦНС или аналгезирующее средство, известное в данной области техники, могут быть использованы совместно с соединением бензоата лития для достижения намеченных терапевтических эффектов.

Соединение бензоата лития и композиции, включающие такое соединение, описанные здесь, могут быть введены любым путем, включая энтеральный (например, пероральный), парентеральный, внутривенный, внутримышечный, внутриартериальный, костномозговой, внутриоболочковый, подкожный, внутрижелудочковый, чрескожный, межкожный, подкожный, кожный, ректальный, внутривлагалищный, внутрибрюшинный, топический (как в форме порошков, мазей, кремов и/или капель). Специфично рассматриваемыми путями являются пероральное введение, внутривенное введение (например, системная внутривенная инъекция), регионарное введение через кровь и/или лимфу и/или прямое введение в поврежденное место. В целом самый подходящий путь введения будет зависеть от множества факторов, включая природу агента (например, его стабильность в среде желудочно-кишечного тракта) и/или состояние пациента (например, в состоянии ли пациент переносить пероральное введение).

Точное количество соединения бензоата лития, требуемое для достижения эффективного количества, варьирует от пациента к пациенту и зависит, например, от вида, возраста и общего состояния пациента, серьезности побочных эффектов или нарушения, идентичности конкретного соединения бензоата лития, способа введения, и т.п. Эффективное количество может быть включено в единственную дозу (например, единственная пероральная доза) или многократные дозы (например, многократные пероральные дозы). В некоторых вариантах осуществления, когда многократные дозы вводят пациенту или ими обрабатывают биологический образец, ткань или клетку, любые две дозы многократных доз включают отличающиеся или по существу одни и те же количества соединения бензоата лития, описанного здесь. В некоторых вариантах осуществления, когда многократные дозы вводят пациенту или ими обрабатывают биологический образец, ткань или клетку, частота введения многократных доз пациенту или нанесения многократных доз на ткань или клетку составляет три дозы в сутки, две дозы в сутки, одну дозу в сутки, одну доза через день, одну доза каждый третий день, одну доза каждую неделю, одну доза раз в две недели, одну доза раз в месяц или одну доза через месяц. В некоторых вариантах осуществления частота введения многократных доз пациенту или нанесения многократных доз на ткань или клетку составляет одну дозу в сутки. В некоторых вариантах осуществления частота введения многократных доз пациенту или нанесения многократных доз на ткань или клетку составляет две дозы в сутки. В некоторых вариантах осуществления, когда многократные дозы вводят пациенту или ими обрабатывают биологический образец, ткань или клетку, интервал между первой дозой и последней дозой многократных доз составляет один день, два дня, четыре дня, одну неделю, две недели, три недели, один месяц, два месяца, три месяца, четыре месяца, шесть месяцев, девять месяцев, один год, два года, три года, четыре года, пять лет, семь лет, десять лет, пятнадцать лет, двадцать лет или целую жизнь пациента, биологического образца, ткани или клетки. В некоторых вариантах осуществления, интервал между первой дозой и последней дозой многократных доз составляет три месяца, шесть месяцев или один год. В некоторых вариантах осуществления, интервал между первой дозой и последней дозой многократных доз составляет целую жизнь пациента, биологического образца, ткани или клетки. В некоторых вариантах осуществления, доза (например, единственная доза или любая доза многократных доз), описанная здесь, составляет независимо от 1 мг до 3 мг, от 3 мг до 10 мг, от 10 мг до 30 мг, от 30 мг до 100 мг, от 100 мг до 300 мг, от 300 мг до 1000 мг или от 1 г до 10 г, включительно, соединения бензоата лития, описанного здесь. В некоторых вариантах осуществления доза, описанная здесь, включает независимо от 3 мг до 10 мг, включительно, соединения бензоата лития, описанного здесь. В некоторых вариантах осуществления доза, описанная здесь, включает независимо от 10 мг до 30 мг, включительно, соединения бензоата лития, описанного здесь. В некоторых вариантах осуществления доза, описанная здесь, включает независимо от 30 мг до 100 мг, включительно, соединения бензоата лития, описанного здесь. В некоторых вариантах осуществления доза, описанная здесь, включает независимо от 100 мг до 300 мг, включительно, соединения бензоата лития, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления доза, описанная здесь, включает независимо от 300 мг до 1000 мг, включительно, соединения бензоата лития, описанного здесь.

Диапазоны дозы, как описано здесь, относятся к введению фармацевтических композиций по изобретению взрослому. Количество, вводимое, например, ребенку или подростку, может быть определено врачом или специалистом в данной области техники и может быть ниже или таким же, как вводимое взрослому.

Бензоат лития или композиция, включающая таковой, как описано здесь, могут быть введены в комбинации с одним или более дополнительными фармацевтическими агентами (например, терапевтически и/или профилактически активными агентами), пригодными для использования в лечении, снижении риска или задержки начала любого из целевых заболеваний/состояний, как описано здесь. Бензоат лития или композиция, включающая таковой, могут быть введены в комбинации с дополнительными фармацевтическими агентами, улучшающими их активность (например, активность (например, потенциал и/или эффективность) в лечении и/или снижении риска психоневрологического нарушения у пациента), улучшающими биодоступность, повышающими уровень безопасности, уменьшающими лекарственную резистентность, уменьшающими и/или изменяющими метаболизм, ингибирующими экскрецию и/или изменяющими распределение в организме пациента, биологическом образце, ткани или клетке. Следует также понимать, что используемая терапия может достигнуть желаемого эффекта в отношении того же нарушения и/или она может достигать различных эффектов. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, описанная здесь, включающая соединение бензоата лития, описанное здесь, и дополнительный фармацевтический агент, показывает синергический эффект, отсутствующий в фармацевтической композиции, включающий одно из соединения бензоата лития и дополнительного фармацевтического агента, но не оба.

Бензоат лития или композиция, включающая таковой, могут быть введены одновременно с, до или после одного или более дополнительных фармацевтических агентов, которые могут быть использованы как, например, комбинированная терапия в лечении и/или снижении риска психоневрологического нарушения у пациента. Фармацевтические агенты включают терапевтически активные агенты. Фармацевтические агенты также включают профилактически активные агенты. Фармацевтические агенты включают малые органические молекулы, такие как соединения лекарственного средства (например, соединения, апробированные для человеческого или ветеринарного использования U.S. Food and Drug Administration в Code of Federal Regulations (CFR)), пептиды, белки, углеводы, моносахариды, олигосахариды, полисахариды, нуклеопротеиды, мукопротеины, липопротеины, синтетические полипептиды или белки, антитела, малые молекулы, связанные с белками, такими как антитела, гликопротеиды, стероиды, нуклеиновые кислоты, ДНК, РНК, нуклеотиды, нуклеозиды, олигонуклеотиды, антисмысловые олигонуклеотиды, липиды, гормоны, витамины и клетки. В некоторых вариантах осуществления дополнительный фармацевтический агент является фармацевтическим агентом, пригодным для использования в лечении и/или снижении риска психоневрологического нарушения у пациента. В некоторых вариантах осуществления дополнительный фармацевтический агент является фармацевтическим агентом, апробированным контролирующим органом (например, US FDA) для лечения и/или снижения риска психоневрологического нарушения у пациента. Каждый дополнительный фармацевтический агент может быть введен в дозе и/или по схеме, определенных для этого фармацевтического агента. Дополнительные фармацевтические агенты могут также быть введены вместе друг с другом и/или с бензоатом лития или композицией, включающей таковой, описанными здесь, в единственной дозе, или введены отдельно в различных дозах. Особая комбинация для использования в режиме должна учитывать совместимость соединения бензоата лития, описанного здесь, с дополнительным фармацевтическим агентом(ами) и/или желаемым терапевтическим и/или профилактическим эффектом, который будет достигнут. В целом ожидается, что дополнительный фармацевтический агент(ы) в комбинации используется на уровнях, не превышающих уровни, на которых они используются индивидуально. В некоторых вариантах осуществления уровни, используемые в комбинации, будут ниже, чем используемые индивидуально.

В некоторых вариантах осуществления дополнительный фармацевтический агент является агентом для лечения психоневрологического нарушения. В некоторых вариантах осуществления соединеня бензоата лития, описанные здесь, или фармацевтические композиции могут быть введены в комбинации с терапевтическим средством для лечения расстройства центральной нервной системы или облегчения боли.

Не вдаваясь в дальнейшие детали, можно считать, что специалист, на основе приведенного описания, может использовать настоящее изобретение в полном объеме. Следующие конкретные варианты осуществления должны, поэтому, быть истолкованы как просто иллюстративные, но не ограничивающие настоящее раскрытие каким бы то ни было образом. Все публикации, процитированные здесь, включены посредством ссылок в отношении целей или объектов, упомянутых здесь.

Примеры

Чтобы настоящее раскрытие могло быть более полно понято, сформулированы следующие примеры. Синтетические и биологические примеры, описанные в этой заявке, предлагаются для иллюстрации соединений бензоата лития, композиций, включающих таковой, и способов по изобретению и ни в каком случае не должны быть истолкованы как ограничение их объема.

Пример 1: бензоат лития защищает первичные кортикальные нейроны от токсичности 3-NP

Митохондриальная дисфункция участвует в патогенезе многих нейродегенеративных нарушений, а также повреждений нейронов, таких как болезнь Гентингтона (HD), MSA, перивентрикулярная лейкомаляция, атаксия Фридриха, болезнь Гоше, субарахноидальное кровотечение, перинатальная гипоксическая ишемическая энцефалопатия, прогрессирующий надъядерный паралич (PSP), внутричерепная гипертензия, спорадическая болезнь Крейтцфельда-Якоба, поздняя дискинезия, синдром Ретта и различные заболевания мотонейронов: ALS, основной боковой склероз, наследственный спастический парапарез, прогрессирующий яремный паралич (у некоторых имеется мутация SOD1), спинная мышечная атрофия, связанная с X-хромосомой спинобульбарная мышечная атрофия (болезнь Кеннеди). 3-нитропропионовая кислота (3-NP) является необратимым ингибитором митохондриального комплекса II и обычно используется как в in vivo, так и в in vitro модели для исследований дисфункции митохондрий. 3-NP может также вызывать окисление белка in vivo и таким образом может использоваться в качестве агента для стимуляции окислительного стресса и/или сверхпродукции реактивных форм кислорода (ROS), которые, как известно, связаны с различными расстройствами центральной нервной системы, такими как множественная системная атрофия (MSA) и судороги. В этом примере нейропротективный эффект бензоата лития был исследован на 3-NP-индуцированной токсичности в первичной кортикальной культуре.

Материалы и методы:

Подготовка первичной культуры

Первичные кортикальные культуры получали из эмбриональных мозгов крысы Sprague Dawley (SD) в эмбриональный день 18 (E18). Клетки сохраняли в нейробазальной среде, дополненной B27 (GIBCO/Life Technologies Thermo Fisher Scientific Corporation) при 37°C в течение 7 дней для обеспечения роста дендритов перед экспериментированием.

Препараты и реактивы

3-NP (Cat. No. 73803, Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) растворяли в буферизованном фосфатом солевом растворе (PBS) в качестве 1 М сток-раствора и доводили до pH 7,4 с использованием 10 М гидроксида натрия. Сток-раствор 3-NP затем распределяли на аликвоты по 1 мл, защищали от света и сохраняли при -20°C до использования. Бензоат лития (LiBen), бензоат натрия (NaBen) и хлорид лития (LiCl) воссоздавали в стерильной ddH₂O для создания сток-растворов 50 мкМ перед хранением при 4°C до использования.

Окрашивание Хехста

Окрашивание Хехста используется для оценки степени выживания клеток. Клетки фиксировали в 4%-м параформальдегиде (PFA) в буферизованном фосфатом солевом растворе (PBS), инкубировали с Hoechst 33342, разбавленном в PBS (1:1000) в течение 5-15 минут. Окрашивание Хехста используется для оценки степени выживания клеток после экспонирования к 2,5 мМ 3-NPм в течение 24 часов.

Иммуноцитохимия и софокусная микроскопия

Клетки фиксировали в 4%-м PFA и промывали в PBS, блокировали 2%-м бычьим сывороточным альбумином (BSA) и обработали 0,03% Triton X-100 в PBS, после чего инкубировали с моноклональным антителом мыши к ассоциированному с микротрубочками белку-2 (MAP 2) в разведении 1:150 (Cat. No. MAB378, CHEMICON International, Inc., Темекула, Калифорния, США). Козьи Alexa конъюгированные с флуоресцентным агентом вторичные антитела к IgG мыши (Cat. No. A11003, Термо Научный) в разведении 1:500 наносили для распознавания первичных антител MAP-2. Для софокусной микроскопии покровные стекла наблюдали под лазерным сканирующим софокусным микроскопом (Zeiss LSM700; Oberkochen, Германия), оборудованным наборами фильтров для детекции соответствующих флуоресцентных сигналов.

Детекция клеточных реактивных форм кислорода (ROS)

Реактивные формы кислорода(ROS) детектировали на первичной кортикальной нейронной культуре с помощью CellROX Oxidative Reagents (номер по каталогу 10444, Life Technologies Corp. США). Для изучения терапевтических эффектов бензоата лития культивируемые клетки обрабатывали бензоатом лития (0, 0,5, 1 или 3 мМ) в течение 24 часов. Клетки затем подвергали воздействию 2,5 мМ 3-NP в течение 24 часов. Затем добавляли 2 мМ реактива CellROX и затем инкубировали в течение 10 часов. CellROX Green Reagent является красителем ДНК и при окислении он связывается с ДНК; таким образом, его сигнал локализуется в ядре и митохондрии. ROS был определен количественно интенсивностью флуоресценции. Образцы наблюдали под лазерным сканирующим софокусным микроскопом Zeiss LSM700 (Zeiss, Германия), оборудованным наборами фильтров для детекции флуоресцентного сигнала.

Анализ данных

Множественные группы сначала анализировали односторонним дисперсионным анализом (ANOVA) с последующим апостериорным анализом Student-Newman-Keuls. P-значение менее 0,05 считали значимым.

Результаты:

Выживаемость клеток первичной кортикальной культуры, предобработанной бензоатом лития

Для анализа выживания клеток первичные кортикальные нейроны, выращенные на покровных стеклах с 24 лунками были предобработаны бензоатом лития (1 или 3 мМ) в течение 24 часов. Клетки затем подвергали действию 2,5 мМ 3-NP в течение 24 часов. Как показано на Фигуре 1, группа A, обработка 3-NP вызывала гибель клеток первичных кортикальных нейронов, в то время как обработка бензоатом лития (в количестве 1 мМ или 3 мМ) в значительной степени защищала первичные кортикальные нейроны от гибели, вызванной токсичностью 3-NP. Никакого различия не наблюдалось в кортикальной культуре, обработанной только бензоатом лития, но не 3-NP. Эти результаты показывают, что бензоат лития спасает нейроны от 3-NP-индуцированной гибели.

Количественный анализ также проводили для оценки степени гибели клеток. По меньшей мере три видимых области были рандомизированно выбраны, и усредненные числа мертвых клеток и все ядра на видимую область на каждом покровном стекле были вычислены. Как показано на Фигуре 1, группа B, экспозиция к 3-NP с сильным действием подняло индекс гибели первичных кортикальных нейронов с 0,1 до 0,4, в то время как предварительная обработка бензоатом лития (3 мМ в течение 24 часов) существенно уменьшила индекс гибели обработанных 3-NP клеток до менее 0,2. Сокращение индекса гибели показывает защитный эффект бензоата лития в отношении нейронов.

Для иммуноцитохимического анализа нейроны обрабатывали бензоатом лития, 3-NP или обоими, как описано выше, инкубировали с моноклональным антителом мыши к MAP-2. MAP-2 является нейронным белком, обнаруживаемым в теле нейронных клеток и дендритах. Анализ софокусный микроскопией раскрыл, что защитные эффекты бензоата лития на первичные кортикальные культуры, подвергнутые действию 3-NP, были, по меньшей мере частично, связаны с защитой нейронов (ФИГУРА 1, группа C).

Детекция клеточных реактивных форм кислорода(ROS) в кортикальной культуре, предобработанной бензоатом лития

Кроме того, 3-NP вызывает продукцию реактивных форм кислорода (ROS), коррелирующую с митохондриальной дисфункцией. Общая и митохондриальная продукция ROS могла быть определена количественно реактивами CellROX. ФИГУРА 2, группы А-В показывают интенсивность флуоресценции (%) ROS с 3-NP в различных концентрациях в кортикальных клетках. 3-NP увеличивала более чем на 50% продукцию ROS, значительно уменьшенную обработкой бензоата лития. Этот эффект мог наблюдаться особенно при 0,5 мМ (p <0,0001) (ФИГУРА 2, группы A и B), показывая, что бензоат лития даже устраняли или ингибировал продукцию ROS назад к базальному уровню. Для сравнения эффекта уменьшения ROS бензоатом лития бензоат натрия и хлорид лития также инкубировали за 24 часа до экспозиции 3-NP в первичной кортикальной культуре. Как показано на Фигуре 2, группа C, бензоат натрия и хлорид лития могли также уменьшать количество клеточного ROS. Однако эффект сокращения ROS намного более значителен при использовании бензоата лития, чем в случае бензоата натрия и хлорида лития (ФИГУРА 2, группа B).

Взятый вместе, результаты, полученные в этом примере, показывают, что обработка бензоатом лития обеспечивает защиту нейронов от митохондриальной дисфункции, вызванной экспозицией 3-NP. Кроме того, результаты исследований ROS раскрывают антиоксидантную способность бензоата лития, которая значительно лучше, чем у бензоата натрия и хлорида лития, что позволяет предположить, что потенциальный укрепляющий митохондрии механизм бензоата лития уменьшал гибель нейронных клеток. ROS-опосредованное повреждение митохондрий, играющее важную роль в патогенезе нейродегенеративных нарушений, таких как болезнь Гентингтона (Reddy et al., Trends Mol Med. 2008 Feb;14(2):45-53), MSA, перивентрикулярная лейкомаляция, атаксия Фридриха, болезнь Гоше, субарахноидальное кровотечение, перинатальная гипоксическая ишемическая энцефалопатия, прогрессирующий надъядерный паралич (PSP), внутричерепная гипертензия, спорадическая болезнь Крейтцфельда-Якоба, поздняя дискинезия, синдром Ретта и различные заболевания мотонейронов: ALS, основной боковой склероз, наследственный спастический парапарез, прогрессирующий яремный паралич (у некоторых имеется мутация SOD1), спинная мышечная атрофия, связанная с X-хромосомой спинобульбарная мышечная атрофия (болезнь Кеннеди). Далее, известно, что окислительный стресс и/или сверхпродукция ROS связаны с расстройствами ЦНС, таким как MSA и судороги. Fullner et al., Front Neurosci., 10:99 (2016) and Bhowmik et al., Br. J. Pharmacol. 167(7):1398-1414 (2012). Соответственно, бензоат лития может быть эффективным в лечении этих расстройств ЦНС, связанных с дисфункцией митохондрий, окислительным стрессом, и/или сверхпродукцией ROS, например, HD, MSA и судороги.

Пример 2: бензоат лития улучшает резервную респираторную способность для функции митохондрии

В этом примере демонстрировали исследования митохондриальной функции, улучшенной бензоатом лития. В дополнение к защите митохондрии от дисфункции при нейродегенеративном заболевании, таком как болезнь Гентингтона (HD), бензоатом лития, уровень потребления кислорода (OCR) кортикальных нейронов, обработанных бензоатом лития, был исследован в этом примере.

Материалы и методы

Получение первичной культуры

Получение первичной кортикальной культуры осуществляли как описано ранее, но клетки высевали на 96-луночные микропланшеты XF для клеточной культуры. В день теста культуральные среды заменяли на Среду для количественного определения XF (Seahorse Biosciences, США). До теста планшеты переносили в инкубатор с дополнением CO2 при 37°C и сохраняли в течение 1 часа. Полный OCR был вычислен.

Митохондриальное дыхание

Набор XF Cell Mito Stress Test kit (Seahorse Biosciences, США) использовали для измерения митохондриальной активности кортикальных нейронов, предобработанных бензоатом лития (LiBen, 3 мМ), бензоатом натрия (NaBen, 3 мМ) или хлоридом лития (LiCl, 3 мМ) в течение 24 часов. Онкостатин M (OSM) вводили как группу сравнения, которая могла бы предотвратить митохондриальную дисфункцию. XF Cell Mito Stress Test модулирует дыхание, которое нацелено на компоненты цепи переноса электронов (ETC) в митохондрии для раскрытия основных параметров метаболической функции. Модуляторы (олигомицин, FCCP и смесь ротенона и антимицина A) последовательно вводят для измерения продукции ATФ, максимального дыхания и немитохондриального дыхания. Утечку протонов и резервную респираторную способность затем вычисляют с помощью этих параметров.

Результаты

Детекция Митохондриального дыхания в кортикальной культуре, предобработанной бензоатом лития, бензоатом натрия и хлоридом лития

После предварительной обработки OSM, LiBen, NaBen или LiCl в первичной кортикальной культуре, митохондриальное дыхание было исследовано с использованием набора XF Cell Mito Stress Test kit, как описано выше. Как показано на Фигуре 3, группа A, максимальное дыхание не имело никаких различий среди групп, что показывает, что общая функция митохондрий для достижения максимального уровня респираторных является одной и той же. В различных состояниях, обусловленных инъекцией модуляторов (олигомицин, FCCP и смесь ротенона и антимицина A), основное дыхание, резервная респираторная способность, утечка протонов и продукция ATФ были определены и показаны на Фигуре 3, группы B и C.

Предварительная обработка LiBen (3 мМ) уменьшала больше базального OCR, чем другие группы, что показывает более низкую энергетическую потребность клеток в базовых условиях. Увеличение резервной респираторной способности LiBen (3 мм) продемонстрировало лучшую адаптируемость клеток, также указывая лучшую способность отвечать на энергетические потребности. Несмотря на то, что NaBen (3 мМ) и LiCl (3 мМ) имели ту же тенденцию увеличивать резервную респираторную способность клеток, они являются менее эффективными, чем LiBen (3 мМ).

LiBen показал лучшие уровни уменьшения утечки протонов и продукции ATФ, чем NaBen или LiCl (ФИГУРА 3). Утечка протонов отражает митохондриальное повреждение. Таким образом, результаты показывают, что LiBen защищает клетки от повреждения митохондрий. ATФ, продуцируемый митохондрией, используется для восполнения энергетической потребности клеток. Его продукция была уменьшена бензоатом лития, что показывает более низкую энергетическую потребность как основное дыхание.

Суммируя вышесказанное, бензоат лития уменьшает базовую энергетическую потребность нейронов, защищает их от утечки протонов и улучшает адаптируемость к требованиям активности митохондрий путем увеличения резервной респираторной способности. Эти улучшения функций митохондрий позволяют предположить, что бензоат лития может помочь лечить заболевания, связанные с дисфункцией митохондрий, включая болезнь Гентингтона (HD), рассеянный склероз (SCA), боковой амиотрофический склероз (ALS), кардиомиопатию, хромосомную миопатию, сахарный диабет и глухоту (DAD), наследственную оптическую невропатию Лебера (LHON), синдром Ли, невропатию, атаксию, пигментный ретинит и птоз (NARP), мионейрогенную желудочно-кишечную энцефалопатию (MNGIE), миоклоническую эпилепсию с разорваными красными волокнами (MERRF) и хромосомную миопатию, энцефаломиопатию, лактацидоз, инсультоподобные симптомы (MELAS).

Пример 3: Бензоат лития уменьшает прогрессию заболевания при боковом амиотрофическом склерозе (ALS)

Боковой амиотрофический склероз (ALS) является фатальным нейродегенеративным нарушением, характеризующимся масштабной потерей мотонейронов; симптомы ALS начинаются с прогрессивной слабости, атрофии скелетных мышц и паралича, в конечном счете приводящих к смерти. Сообщалось, что по меньшей мере некоторые семейные случаи ALS являлись результатами миссенс-мутации в гене SOD1 человека, соответственно, трансгенные мыши, имеющие мутантную форму гена SOD1 были установлены в качестве модели для воспроизведения человеческих симптомов ALS. В этом примере трансгенные мыши B6SJL-Tg (SOD1*G93A) 1Gur/J, несущие аминокислотную замену Gly93→Ala в гене SOD1 использовались для исследования эффекта бензоата лития у пациентов с ALS.

Материалы и методы

Животное и условия размещения

Все животные, используемые в примерах настоящего раскрытия, были размещены в виварии при контролируемой температуре (24-25°C) и 12:12 цикле свет-темнота. Стандартная лабораторная еда и водопроводная вода были доступны ad libitum. Процедуры экспериментов были одобрены Institutional Animal Care and Use Committee и проводились в соответствии с национальными инструкциями по защите животных. Трансгенные мыши B6SJL-Tg (SOD1*G93A) 1Gur/J были приобретены в Jackson Laboratory (США).

В контингенте 1, трансгенные самки и однопометные животные дикого типа были рандомизированно разделены на следующие группы: носитель (дикий тип, обработка солевым раствором, n=5), носитель-ALS (SOD1 (G93A) трансгенные мыши, обработанные солевым раствором, n=6), лекарственное средство-ALS (SOD1 (G93A) трансгенные мыши, обработанные бензоатом лития, n=6). Начало заболевания у B6SJL-Tg (SOD1*G93A) 1Gur/J мышей произошло в пределах возраста 80-90 дней, в то время как прогрессивная клиническая слабость, сопровождаемая параличом и смертью, произошла на 135-140 день.

В контингенте 2, трансгенные самцы и однопометные животные дикого типа были рандомизированно разделены на 3 группы, как в контингенте 1: носитель (n=5), носитель-ALS (n=6) и лекарственное средство-ALS (n=11). Начало заболевания произошло в пределах возраста 110-120 дней, в то время как прогрессивная клиническая слабость, сопровождаемая параличом и смертью, произошла в пределах 150-155 дней.

Введение лекарственного средства

В контингенте 1, схема приема лекарственного средства инициировалась спустя 8 недель после рождения и продолжалась до конца исследования. Бензоат лития внутрибрюшинно вводили в дозе 256 мг/кг массы тела/сутки. Группы носителя получали инъекции того же объема солевого раствора.

Схема приема лекарственного средства для контингента 2 совпадала с таковой для контингента 1, кроме того, что введение начинале в возрасте 10 недель.

Животное поведенческие задачи

Различные поведенческие задачи обычно проводяли, начиная с возраста 50 дней (контингент 1) или возраста 13 недель (контингент 2) до смерти для оценки эффектов лекарственного средства на неврологические расстройства.

Контингент 1

Открытое поле является поведенческой задачей для животных, которая может контролировать полную непосредственную двигательную активность. Каждое животное помещали в пустую тестовую арену (пластмассовые коробки 60 см x 60 см) на 1 час, и его активность оценивали с помощью системы мониторинга активности Животных VersaMax (AccuScan Instruments, Inc Колумбус Огайо, США). Общее пройденное расстояние, число вставаний на задние лапы и время стояния на задних лапах были проанализированы. Тест открытого поля проводили 1-2 раза в неделю.

Контингент 2

В задаче открытого поля каждое животное помещали в пустую тестовую арену (пластмассовые коробки 43,2 см x 21,6 см) на 1 час, и его активность оценивали с помощью системы Photobeam Activity System (San Diego Instruments, США). Общее пройденное расстояние количество подъемов на задние лапы (прерывание луча) было проанализировано. Тест открытого поля проводили один раз в неделю.

Тест вращающегося барабана, требующего, чтобы животные балансировали и ходили на вращающемся цилиндре, является широко используемым тестом для измерения скоординированных моторных навыков. Мышей помещали на автоматический вращающийся аппарат с 5 каналами (PanLab/Harvard Apparatus). До экспериментов все мыши были обучены на постоянной скорости (8 об/мин) в День -5, -4, -3 для акклиматизации мышей к аппарату. После учебных семинаров моторная координация была оценена при 16 об/мин в течение максимум 5 минут. Три испытания (с интервалами в 10 минут) проводили с каждым животным в сутки. Тест вращающегося барабана проводили один раз в неделю, и самое долгое время удерживания для каждого животного было зарегистрировано.

Тест висения выполняется с мышиными моделями нервно-мышечных нарушений для демонстрации ухудшений нервно-мышечных функций. Металлическую проволочную сетку (сетка 1 см x 1 см шириной, 0,2 см диаметром) фиксировали горизонтально на 30 см выше стола. Одной мыши давали захватить проволочную сетку, в то время как сетку переворачивали. Время ожидания падения регистрировали, когда животное падало, и максимальное время 180 с было назначено для анализа. Было две процедуры для каждого животного с интервалом в 30 минут, и более длительное время было зарегистрировано. Тест висения проводили один раз в неделю.

Масса тела

Для каждого животного массу тела измеряли еженедельно, начиная с возраста в 10 недель. Потеря массы тела указывает неспособность получать пищу или воду вследствие ухудшению моторной функции, произошедшего во время прогрессии заболевания, или любого недомогания.

Выживание

Дата и причина смерти были зарегистрированы для каждой мыши. Животных пристально мониторили и подвергали эвтаназии, если устанавливалась неизбежность смерти, которую определяли как неспособность мышей перевернуться спустя 30 секунд после того, как их клали на бок, в соответствии с критериями тяжелой заболеваемости. Умирающие мыши были зарегистрированы как ''мертвые'', и их умерщвляли с использованием углекислого газа.

Результаты

Производительность двигательной активности у обработанных бензоатом лития трансгенных мышей SOD1

В контингенте 1, тест открытого поля использовался для исследования общей подвижности различных групп мышей. ФИГУРА 4, группы A и B являются линейными графиками, суммирующими число движений по вставанию на задние лапы и время стояния на задних лапах, соответственно, покрывающими трансгенных мышей ALS, обработанных солевым раствором или бензоатом лития во время периода тестирования. Эти данные продемонстрировали, что функции задних конечностей мышей ALS, обработанных бензоатом лития, были значительно улучшены по сравнению с их однопометными контрольными животными с возраста приблизительно 90 дней до возраста приблизительно 130 дней. Как описано выше, эти результаты позволяют предположить, что лечение бензоатом лития может улучшить функцию задних конечностей во время прогрессии заболевания, особенно на ранних стадиях прогрессии заболевания. Таким образом, ожидается, что бензоат лития покажет терапевтическую эффективность в лечении ALS.

Что касается контингента 2, ФИГУРА 4, группы C - F являются линейными графиками, суммирующими результаты теста висения, теста вращающегося барабана, активности по вставанию на задние лапы и пройденную дистанцию, соответственно, для мышей дикого типа и трансгенных мышей ALS, обработанных солевым раствором, и мышей ALS, обработанных бензоатом лития, во время периода тестирования. Эти данные продемонстрировали, что двигательные функции мышей ALS, обработанных бензоатом лития, были улучшены по сравнению с их однопометными контрольными животными с возраста приблизительно 133 дня до возраста приблизительно 147 дней. Эти результаты позволяют предположить, что лечение бензоатом лития улучшает двигательные функции и/или облегчают скоординированный дефицит двигательной функции во время прогрессии заболевания у SOD1^G93A трансгенных мышей. Таким образом, ожидается, что бензоат лития покажет терапевтическую эффективность или задержит прогрессию дефицита двигательной функции при ALS.

Изменение массы тела и выживаемость обработанных бензоатом лития трансгенных мышей SOD1

Как показано на Фигуре 4, группы G и H, изменение массы тела и пропорция мышей, оставшихся в живых в течение времени мышей с ALS, обработанных бензоатом лития, были также улучшены по сравнению с мышами ALS, обработанными носителем.

Пример 4: бензоат лития защищает первичные кортикальные нейроны от депривации кислорода и глюкозы

Повреждения головного мозга в центральной нервной системе (ЦНС) вследствие бедного тока крови и глюкозы, поставляемых мозговым тканям во множестве состояний, включают ишемический/геморрагический инсульт, сосудистую деменцию, судороги, травматическое повреждение головного мозга (TBI), повреждения спинного мозга и инфекцию и т.д. Распространены инвалидность и даже смерть после повреждений головного мозга. Несмотря на то, что смертность была уменьшена за последние десятилетия; инвалидность все еще остается непобежденной. Новые методы лечения для защиты, восстановления нейронов или развития нейропластичности необходимы для пациентов, страдающих или подвергающихся риску повреждений головного мозга.

Материалы и методы

Получение первичной культуры и модели OGD

Депривация кислорода-глюкозы (OGD) является обычной и утвержденной клеточной моделью, используемой для повреждений головного мозга, таких как связанные с инсультом исследования. Первичные кортикальные культуры получали как описано ранее. Для стимуляции модели OGD нейробазальную среду, дополненную B27 (GIBCO/Life Technologies Thermo Fisher Scientific Corporation), удаляли из культур, и затем их ополаскивали средой Neurobasal-A (без D-глюкозы и пирувата натрия [GIBCO/Life Technologies Thermo Fisher Scientific Corporation]). Культивируемые клетки сохраняли в увлажненном инкубаторе при 37°C с 5% CO₂ в течение 1 ч для потребления глюкозы и пирувата. Культуры затем помещали в анаэробную среду 95% N_2-5% CO₂ на 4 часа. Концентрацию кислорода проверяли кислородным газоанализатором (Proox-110, Демотт-Стрит, Лакона, Нью-Йорк, США), поддерживая равно приблизительно 1,0% в течение эксперимента.

Применение лекарственного средства

Кортикальную культуру обрабатывали бензоатом лития с различными условиями, включая: (1) полную обработку бензоатом лития (0, 0,3, 1, 3, 5 мМ) в течение 53 часов (включая предварительную обработку в течение 24 часов, привыкание в течение 1 часа, депривацию кислорода-глюкозы в течение 4 часов и реперфузию после обработки в течение 24 часов) (ФИГУРА 5, группа A); (2) последующую обработку бензоатом лития (0, 0,3, 0,5, 1, 3, 5 мМ) в течение 48 часов реперфузии (ФИГУРА 5, группа B).

Тест MTT

Тест MTT использовался для оценки степени выживания клеток. MTT (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид) добавляли к культуре, инкубировали при 37°C в течение 4 часов. Нерастворимые фиолетовые продукты формазана вырабатывались живыми клетками. Колориметрический метод использовался для определения количества выживших клеток, и ʺвыживание клеток (%)ʺ было определено как средние числа выживших клеток.

Результаты

Выживание клеток обработанной бензоатом лития первичной кортикальной культуры

Как показано на Фигуре 6, группа A, выживание клеток первичных кортикальных клеток было уменьшено приблизительно на 50% в условиях депривации кислорода-глюкозы, в то время как лечение бензоатом лития, включая перед депривацией в течение полных 53 часов (ФИГУРА 5, группа A) и после депривации кислорода и глюкозы в течение 48 часов (ФИГУРА 5, группа B), в значительной степени защитило первичные кортикальные клетки от гибели. Согласно результату на Фигуре 6, группа B, бензоат лития показал эффект защиты клеток на всех уровнях дозы.

Защита клеток кортикальной культуры OGD бензоатом лития указывает свой потенциальный терапевтический эффект на повреждения головного мозга, включая ишемический/геморрагический инсульт, сосудистую деменцию (VD), травматическое повреждение головного мозга (TBI), эпилепсию и также повреждения спинного мозга.

Пример 5: бензоат лития уменьшает гибель клеток и поведенческие нарушения, вызванные токсичностью MPTP

Болезнь Паркинсона (PD) является прогрессивным нейродегенеративным нарушением, прежде всего вследствие повреждения к нигростриатального допаминергического пути. В этом примере 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (MPTP) использовался для индукции патологических изменений, подобных человеческой идиопатической болезни Паркинсона как в клеточной модели, так и в модели животных.

Материалы и методы

Клеточная культура и применение лекарственного средства

SH-SY5Y, человеческую клеточную линию нейробластомы, инкубировали с MPTP (750 мкМ) в течение 24 часов. Бензоат лития/бензоат натрия (0, 0,3, 1, 3 мМ) использовали в различных условиях на клетках SH-SY5Y, включая предварительную обработку в течение 24 часов, предварительную обработку и комбинированное лечение в течение 48 часов и 24-часовое последующее лечение (ФИГУРА 7). Тест MTT использовался для оценки степеней выживания клеток, как описано выше.

Модель животных и схемы приема лекарственных средств

Животных размещали и сохраняли в тех же условиях, как описано выше. Мыши C57BL/6J мужского пола (возраст: 12 недель) были рандомизированно распределены на 2 группы - контрольную, получающую носитель, и MPTP-индуцированную группу. Мышам MPTP-индуцированной группы внутрибрюшинно вводили MPTP (30 мг/кг массы тела/сутки) в течение пяти недель, в то время как животные в контрольной группе носителя получали инъекции того же объема солевого раствора. После 5 недель экспозиции MPTP проводили тест с шестом для объяснения эффекта MPTP-индуцированного расстройства. Мыши с поведенческим расстройством были рандомизированно разделены на две группы с разной обработкой солевым раствором и бензоатом лития (256 мг/кг массы тела/сутки).

Поведенческий тест

Тест с шестом использовался для измерения степени брадикинезии, типичного симптома паркинсонизма. Животных помещали головой вверх около вершины шеста с грубой поверхностью (1 см в диаметре и 60 см в высоту). Время, потраченное на переворот головой вниз (Tturn) и общее время, потраченное для спуска вниз на пол (TLA), было зарегистрировано. Когда мышь не смогла перевернуться головой вниз, Tturn принимали за 60 секунд (значение по умолчанию). TLA принимали за 120 секунд, когда мышь не повернулась и свалилась с шеста.

Результаты

Эффект лечения бензоатом лития на первичную кортикальную культуру, подвергнутую действию MPTP

Как показано на Фигуре 8, экспозиция MPTP (750 мкМ) вызвала приблизительно 50% сокращение числа клеток. Предварительная обработка и постобработка всеми лекарственными средствами в течение 24 часов смогли в значительной степени защитить клетки SH-SY5Y от MPTP-индуцированной гибели клеток. Сравнивая защитный эффект бензоата лития (1 мМ), бензоата натрия (1 мМ) и хлорида лития (1 мМ), бензоат лития имел лучшую производительность в отношении улучшения выживания клеток, чем другие две группы (ФИГУРА 8, группы A-B). Для бензоата лития этот эффект был самым очевидным в дозе 1 мМ (ФИГУРА 9, p <0,0001).

Эффект лечения бензоатом лития на MPTP-индуцированную токсичность у мышей

Результаты теста с шестом регистрировали до и после медикаментозного лечения. До инъекции MPTP все мыши были обучены на шесте в течение недели. Данные на Фигуре 10, группы A-B, демонстрируют, что MPTP-индукция приводила к более длительному времени переворота (Tturn) и общему времени спуска (TLA), тогда как лечение бензоатом лития значительно уменьшало и время переворота (Tturn), и общее время спуска (TLA). Результаты теста с шестом на MPTP-индуцированных мышах улучшались при введении бензоата лития, оставаясь паталогическими без лечения бензоатом лития.

Эти результаты показывают, что лечение бензоатом лития может предотвратить MPTP-индуцированную гибель клеток и поведенческие расстройства, и следовательно, бензоат лития может быть терапевтическим агентом для лечения болезни Паркинсона.

Пример 6: Бензоат лития уменьшает расстройства, вызванные MPTP плюс интоксикация 3-NP

Стриатонигральная дегенерация (SND) является Паркинсонизмом, связанным с множественной системной атрофией (MSA-P), являющейся следствием комбинированной дегенерации допаминергических нейронов в компактной части черного вещества (SNc) и нейронов, выходящих из стриатума. SNc показывает специфическую чувствительность к ингибированию MPTP митохондриального комплекса I. 3-нитропропионовая кислота (3-NP), с другой стороны, является ингибитором митохондриального дыхания за счет необратимого ингибирования сукцинатдегидрогеназы (SDH) и вызывает селективные поражения стриатума у большинства видов. Для воссоздания нейропатологических признаков SND/MSA-P была установлена система ʺдвойной токсин-двойное поражениеʺ, объединяющая MPTP плюс интоксикация 3-NP у мышей C57BL/6,.

Материалы и методы

Животное и условия содержания

Самцов мышей C57BL/6J (возраст 8-12 недель) рандомизированно разделяли на 2 группы - контрольную, получающую носитель, и MPTP/3-NP-индуцированную группы. MPTP и 3-NP вводили во время 9-дневного периода интоксикации. 3-NP вводили внутрибрюшинно каждые 12 ч (суммарная доза 450 мг/кг за 9 дней) и MPTP внутрибрюшинно в количестве 10 мг/кг/сутки (суммарная доза 90 мг/кг за 9 дней). После 9 дней MPTP/3-NP интоксикации мыши, выполняющие тест на вращающемся барабане более чем с 20%-м ухудшением, были рандомизированно разделены на две группы, получающие либо солевой раствор, либо бензоат лития (256 мг/кг массы тела/сутки) в течение одной недели.

Поведенческий тест

Моторную активность в тесте на вращающемся барабане измеряли до и после хронической индукции MPTP/3-NP, соответственно. Время, проведенное на барабане на каждом уровне скорости вращения, указывает двигательную активность. Мыши были обучены на скорости, составляющей от 4 до 10 об/мин в течение 5 минут перед проведением теста (-7, -5, -3 Дня). Во время теста все животные начинали тест при 4 об/мин, и скорость увеличивали от 4 до 20 об/мин за 5 минут, причем каждую мышь подвергали трем испытаниям в сутки с интервалом между тестами 10 минут. Среднее время ожидания каждой мыши перед падения вычисляли. Мышей тестировали с 1- или 2-недельными интервалами, и они не требовали переобучения.

Результаты

Производительность в тесте на вращающемся барабане на MPTP плюс 3-NP у мышей, получающих лечение бензоатом лития

Как показано на Фигуре 12, группы A-B, время удерживания на вращающемся барабане мышей с 9 днями MPTP плюс экспозиция 3-NP было значительно уменьшено по сравнению с начальным или с контрольной группой. Улучшение на Фигуре 12B было вычислено как время удерживания (секунды) на 7-й день лечения, разделено на 0-й день лечения. После одной недели лечения бензоатом лития время удерживания на барабане MPTP/3-NP мышей после интоксикации было значительно улучшено по сравнению с мышами, получавшими солевой раствор, что продемонстрировало его потенциальный терапевтический эффект в отношении стриатонигральной дегенерации, особенно MSA-P.

Пример 7: бензоат лития облегчает страдание от острой боли

Боль является серьезной клинической проблемой, оказывающей влияние на качество жизни пациента. Международная Ассоциация по Исследованию Боли (IASP) определяет боль как неприятный сенсорный и эмоциональный опыт, связанный с фактическим или потенциальным повреждением ткани или описанный с точки зрения такого повреждения (IASP 1979). Множество животных моделей боли разрабатываются для соответствующих клинических состояний в целях исследовать их механизмы и методы лечения.

В этом примере процедура лечения острой боли была использована для исследования эффекта бензоата лития на животном. Схема эксперимента показана на Фигуре 13. Базовый механический порог Фон Фрэя для каждой мыши был проверен за 24 часа до лечения бензоатом лития. Затем после инъекции бензоата лития Фон Фрэй проверяли в этот момент времени, через 30 минут, 60 минут, 90 минут и 120 минут.

Материалы и методы

Животное и введение лекарственного средства

Животных размещали и сохраняли в тех же условиях, как описанные выше. Самцов мышей C57BL/6J (возраст 8 недель) рандомизированно разделяли на 2 группы, контрольную PBS (n=10) и группу бензоат лития (n=10). Каждой мыши в группе бензоата лития внутрибрюшинно вводили дозу 256 мг/кг, тогда как мыши в контрольной группе PBS получали инъекции PBS того же объема.

Поведенческие тесты

Анализ Фон Фрэя используется для оценки механической ноцицепции. Мышь помещают в маленькую коробку (10 см x 6 см x 10,5cm) на ограниченной области проволочной сетки (65 см x 21 см x 31 см) (2450 Electronic Von Frey Anesthesiometer, IITC, США). Мышь держат в коробке в течение 60 минут для акклиматизации. Когда тестируемая мышь успокаивается, специальный наконечник с электродом внутри используют для тыкания в заднюю лапу. Силу медленно увеличивают, чтобы ткнуть мышь и измерить механический порог, вызывающий реакцию отдергивания лапы.

Результаты

Антиноцицептивный эффект бензоата лития

Как показано на Фигуре 14, предварительное введение бензоата лития облегчало острую механически вызванную боль, исследованную в тесте Фон Фрэя. Этот эффект был очевиден через 30 минут после введения и длился до 60 минут. Тест Фон Фрэя позволяет измерить кожную гипералгезию или аллодинию, имитируя клинические состояния, такие как нейропатическая боль, послеоперационная боль, воспаление или остеоартрит. Поэтому бензоат лития может использоваться для лечения пациентов, страдающих от этих типов боли.

Пример 8: бензоат лития имеет лучшую биодоступность для подъема бензоата, чем бензоат натрия

В этом примере in vivo сравнивали фармакокинетику бензоата лития и бензоата натрия.

Материалы и методы

Животное и введение лекарственного средства

Самцов крыс Sprague-Dawley с массой тела от 240 до 260 г были рандомизированно разделяли на две группы. Крысы Группы 1 (n=6) были обработаны единственной дозой бензоата натрия (NaBen, 287,9 мг/кг) и карбоната лития (Li₂CO₃, 74,2 мг/кг), тогда как крысы Группы 2 (n=6) были обработаны бензоатом лития (LiBen, 255,3 мг/кг). Эти два режима обеспечивают одну и ту же молярную концентрацию лития и бензоата. Химические соединения растворяли в PBS и затем вводили пероральным скармливанием. Всех крыс держали натощак в течение ночи со свободным доступом к воде перед экспериментами. После введения единственной дозы лекарственных средств образцы крови собирали в этот момент времени, через 0, 5, 15, 30, 60, 90, 120, 240, 360, 720 и 1440 минут.

Сбор образцов плазмы

Образцы крови собирали в пробирки, покрытые гепарином натрия, из яремной вены катетеризованных крыс. Затем образцы крови сохраняли на льду и центрифугировали при 2500 x g в течение 15 минут при 4°C. Супернатант собирали и затем сохраняли в замороженном виде при -80°C до последующей обработки.

Определение количества бензойной кислоты

Плазменная концентрация бензойной кислоты была определена LC/MS/MS. Хроматографическое разделение осуществляли на колонке ODS 5 мкм (4,6×150 мм, Biosil). Подвижная фаза состояла из смеси 1% подвижной фазы A и 99% подвижной фазы B. Подвижная фаза A содержит ацетонитрил (ACN)/H₂O/1M NH₄HCO₃₌25/75/0,5 (об./об.); подвижная фаза B содержит H₂O/1M NH₄HCO₃₌100/0,5 (об./об.). Элюент имел скорость потока 1 мл/мин. Объем инъекции составлял 50 мкл, и температура колонки составляла 23°C. Все растворители имели качество ВЭЖХ.

Анализ данных

Выстраивали график плазменной концентрации бензойной кислоты по отношению ко времени. Фундаментальные фармакокинетические параметры были получены из некомпартментального анализа (NCA) данных плазмы с использованием WinNonlin.

Результаты

Плазменная концентрация бензойной кислоты по отношению ко времени

Пиковая плазменная концентрация (Cmax) и время к Cmax (Tmax) бензойной кислоты наблюдали с помощью анализа ВЭЖХ. Вычисляли T_1/2, область под кривой (AUC) и другие фармакокинетические параметры. Как показано на Фигуре 15, группы A-B и в Таблице 1, ниже, Cmax бензойной кислоты после единственного введения NaBen и Li₂CO₃ (Группа 1) составляла 71378 нг/мл в 0,139 ч, и введение LiBen (Группа 2) приводило к 109321 нг/мл в 0,19 ч, соответственно. Бензойная кислота в обеих группах быстро достигала пика в плазме через приблизительно 10 минут (ФИГУРА 15). Для AUCInf (область под кривой зависимости «концентрация-время» от ноля времени до бесконечности) значение 41577 ч*нг/мл было вычислено в Группе 1, и 62874 ч*нг/мл в Группе 2. Далее, наблюдали, что бензойная кислота быстро удалялась из плазмы с периодом полужизни 1,45 ч у крыс Группы 1 (NaBen+Li₂CO₃) и 2,52 часа у крыс Группы 2 (LiBen). Плазменная концентрация в обеих Группах 1 и 2 снижалась приблизительно до ноля через 12 часов. Следовательно, это представляет собой неожиданное открытие, что значения Cmax, AUC и T_1/2 бензойной кислоты в случае LiBen были намного выше, чем те, которые обеспечивает NaBen+Li₂CO₃, что означает, что лечение LiBen имеет лучшую биодоступность, высвобождая большее количество бензойной кислоты в плазму, производя лучшую экспозицию для организма.

Таблица 1. Параметры фармакокинетики бензойной кислоты

	Tmax (ч)	Cmax(нг/мл)	Т1/2 (ч)	AUClast (ч*нг/мл)	AUCInf (ч*нг/мл)	AUC Extr (%)	MRT (ч)	AUC/D (ч*кг*нг/мл/мг)
NaBen+Li2CO3	0,139	71378	1,46	39201	41577	7,76	1,68	110,8
LiBen	0,19	109321	2,52	62059	62874	2,63	0,75	245,1

Плазменная кинетика лития

Плазменную концентрацию лития детектировали с помощью ICP-MS. Как показано на Фигуре 16 и в Таблице 2, ниже, Cmax лития в Группе 2 (LiBen) была значительно выше, чем в Группе 1 (NaBen и Li₂CO₃), кроме того, AUC был также выше с LiBen, чем с NaBen+Li₂CO_3. В целом, Liben имеет лучший фармакокинетический профиль, чем комбинация NaBen+Li₂CO_3.

Таблица 2. Параметры фармакокинетики лития

	Tmax (мин)	Cmax (мМ)	Т1/2 (ч)	AUC0->t
NaBen+Li2CO3	222,5	0,906	539,68	605,87
LiBen	132,5	1,717	469,62	620,59

Пример 9: бензоат лития защищает первичные кортикальные нейроны от повреждения бета-амилоидом

Aβ является главным нейротоксичным компонентом в сенильных бляшках, наблюдаемых в мозге пациентов с болезнью Альцгеймера (AD). Синтетический Aβ25-35, как также известно, вызывает митохондриальную дисфункцию. Поэтому в этом примере бензоат лития использовался для исследования потенциальных цитопротекторных действий против Aβ25-35 в первичной кортикальной культуре. Кроме того, эффекты бензоата натрия и хлорида лития при том же состоянии были также исследованы, что раскрывает экстраординарную потенциальную эффективность бензоата лития при болезни Альцгеймера.

Материалы и методы

Первичная кортикальная культура и введение лекарственного средства

Первичные кортикальные культуры были получены, как описано ранее. Aβ25-35 (Cat. No. A4559, Sigma) растворяли в обработанной в автоклаве ddH₂O для создания сток-раствора 2 мМ, разделяли на аликвоты и немедленно сохраняли при -80°C до использования. За один день до эксперимента аликвоты Aβs инкубировали в 37°C при течение 24 ч для обеспечения агрегации.

Иммуноцитохимический анализ

Клетки фиксировали в 4%-м PFA и промывали в PBS, блокировали 2%-м бычьим сывороточным альбумином (BSA) и 0,03% Triton X-100 в PBS и затем инкубировали с моноклональным антителом мыши к ассоциированному с микротрубочками белку-2 (MAP-2) (Cat. No. MAB378, 1:150, CHEMICON International, Inc., Темекула, Калифорния, США); поликлональным антителом кролика к GFAP (Cat. No. Z0334, 1:600, DakoCytomation Denmark A/S, Дания). Козьи вторичные Alexa конъюгированные с флуоресцентным агентом антитела к IgG мыши (1:500; Cat. No. A11003, Thermo Scientific); вторичные Alexa конъюгированные с флуоресцентным агентом антитела к IgG кролика (1:500; Thermo Scientific) вводили, соответственно, для распознавания первичных антител MAP-2 и GFAP.

Мечение клеток BrdU и иммуноцитохимический анализ

Первичные кортикальные культуры были получены из эмбриональных мозгов крыс Spragu-Dawley (SD) с эмбрионального дня 18 (E18). Среду удаляли из клеток и заменяли метящим раствором BrdU, и инкубировали при 37°C в течение 4 дней с последующей обработкой Aβ25-35 в течение 2 дней. Клетки фиксировали в 4%-м PFA и промывали в PBS, блокировали 2%-м бычьим сывороточным альбумином (BSA) и 0,03% Triton X-100 в PBS, промывали 2н. HCl и буфером фосфат/лимонная кислота (pH 7,4). Затем добавляли первичное антитело анти-BrdU (1:250, Thermo Scientific) или первичное антитело анти-NeuN (1:300, Abcam). Козьи вторичные Alexa конъюгированные с флуоресцентным агентом антитела к IgG крысы (1:200; Thermo Scientific); вторичные Alexa конъюгированные с флуоресцентным агентом антитела к IgG мыши (1:500;) вводили для распознавания первичных антител BrdU и NeuN, соответственно.

Флуоресцентная микроскопия

Покровные стекла наблюдали под цифровым флуоресцентным микроскопом (Olympus BX61; Япония), оборудованным наборами фильтров для детекции соответствующих сигналов флуоресценции.

Анализ данных

Множественные группы были сначала проанализированы односторонним дисперсионным анализом (ANOVA) с последующим апостериорным анализом Student-Newman-Keuls. P-значение менее 0,05 считали значимым.

Результаты

Лечение бензоатом лития на кортикальных клетках раскрыло нейропротективный эффект против цитотоксичности Aβ.

Первичные кортикальные нейроны подвергали дествию 10 мкМ Aβ 25-35 в течение 2 дней и затем проводили лечение бензоатом лития (1 мМ), бензоатом натрия (1 мМ) или хлоридом лития (1 мМ) в течение 4 дней. Результат анализа выживания клеток показан на Фигуре 17, где показано, что экспозиция к действию 25-35 Aβ приводит к масштабной гибели клеток (p <0,0001); однако все лекарственные средства показывают улучшение в отношении выживания кортикальных клеток. Особенно хлорид лития и бензоат лития показали статистическое улучшение по сравнению с отсутствием медикаментозного лечения, кроме того, бензоат лития уменьшает гибель клеток в результате токсичности 25-35 Aβ в намного большей степени, чем другие два лекарственных средства (p <0,0001).

Согласно нейропротективному эффекту бензоата лития, механизм защиты кортикальных клеток от токсичности бета-амилоида был исследован следующим образом.

Нейропротективный эффект бензоата лития опосредуется не рецептором NMDA

Во-первых, путь рецептора N-метил-D-аспартата (также известный как рецептор NMDA) был изучен для бензоата лития, бензоата натрия и хлорида лития. Рецептор NMDA является специфическим ионотрофным глутаматным рецептором в нейронных клетках, опосредующим высокую проницаемость для кальция. Считается, что экситотоксичность, вызванная чрезмерным притоком кальция, является главным механизмом гибели центральных нейронов, связанным со многими нейродегенеративными заболеваниями, включая болезнь Альцгеймера. Кроме того, недавние исследования показывают, что опосредуемая рецептором NMDA глутаматная нейротоксичность может вызвать Aβ-индуцированную гибель клеток.

Дизоцилпин (также известный как MK-801) является неконкурентным антагонистом рецептора NMDA, который широко использовался для изучения механизма рецептора NMDA. В этом исследовании применение MK801 могла раскрыть, были ли нейропротективные эффекты лекарственных опосредованы рецептором NMDA. Как показано на Фигуре 18, группа A, последующее лечение лекарственными средствами, включая бензоат лития (0,5 мМ) и бензоат натрия (1 мМ) могло увеличить выживание клеток в кортикальных клетках, подвергнутых действию Aβ25-35, тогда как этот защитный эффект бензоата натрия блокировался MK801 (10мкМ) (ФИГУРА 18, группа B). Никаких очевидных различий не наблюдалось в отношении бензоата лития с или без обработки MK801, что показывает, что нейропротективный эффект бензоата лития не опосредуется через путь рецептора NMDA.

Вторая часть исследования механизма была сосредоточена на нейрогенезе. Ухудшение нейрогенеза во взрослом гиппокампе было важным признаком патогенеза болезни Альцгеймера. Бромдезоксиуридин (5-брома-2'-дезоксиуридин, также известный как BrdU) является синтетическим аналогом тимидина, который может заменить тимидин во время синтеза ДНК; поэтому он обычно используется в качестве маркера для генеза клеток. В этом исследовании первичные кортикальные клетки, подвергнутые воздействию Aβ25-35, подвергали последующей обработке бензоатом лития, бензоатом натрия или хлоридом лития в количестве 0,5 или 1 мМ в течение 4 дней. Колокализация NeuN (маркер нейронных клеток) и BrdU представляет нейрогенез в кортикальной культуре в иммуноцитохимическом анализе.

ФИГУРА 19, группы А-К, показывает, что экспозиция к Aβ25-35 уменьшило эффект нейрогенеза, но все лекарственные средства могли обратить это повреждение. Очевидно, что бензоат лития (0,5 мМ) имеет непревзойденную продуктивность в отношении нейрогенеза (p <0,0001) которая значительно больше, чем у двух других лекарственных средств.

Экспрессия GFAP была уменьшена в обработанных бензоатом лития кортикальных нейронов после экспозиции к Aβ25-35

Глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) является белком промежуточного филамента, экспрессируемым клетками в ЦНС и также известен как маркер созревания астроцитов. Повышающая регуляция GFAP, указывающая на глиоз, обычно наблюдается после поражения ЦНС; поэтому экспрессия GFAP может быть полезной для понимания статуса неврологических заболеваний. На Фигуре 20, группы A-B, экспозиция Aβ25-35 в кортикальной культуре увеличило число GFAP-позитивных клеток (p <0,0001), тогда как последующее лечение бензоатом лития (0,5 мМ) и хлоридом лития (1 мМ) значительно уменьшало этот эффект. Однако бензоат натрия (1 мМ) не влиял на экспрессию GFAP при экспозиции Aβ25-35. Одновременно LiBen имеет лучший эффект, чем LiCl.

В целом, результаты этих исследований позволяют предположить терапевтический потенциал бензоата лития против Aβ25-35, опосредованный через повышающую регуляцию нейрогенеза и сокращение GFAP-позитивных клеток, но не через путь рецептора NMDA. Эти эффекты раскрывают эффективность бензоата лития для лечения болезни Альцгеймера.

Пример 10: Бензоат лития улучшает выживаемость при болезни Гентингтона (HD)

Болезнь Гентингтона (HD) вызывается экспансией нестабильных повторов CAG в экзоне 1 гена гентингтина (HTT), кодирующего удлиненный повтор полиглутамина (polyQ-HTT) (Cell. 1993 Mar 26;72(6):971-83). B6CBA-Tg (HD экзон 1) 62Gpb/3J мыши (также известный как B6CBA-R6/2 мыши), который экспрессирует трансген, кодирующий экзон 1 человеческого мутанта HTT, заболевают прогрессирующим и смертельным неврологическим заболеванием, напоминающим человеческую HD, и широко используются для исследования нейродегенерации при HD.

Материалы и методы

Животное и условия содержания

Животных, используемые в примерах настоящего раскрытия, размещали в виварии при контролируемой температуре (24-25°C) и 12:12 цикле свет-темнота. Стандартный лабораторный корм и водопроводная вода были доступны ad libitum. Процедуры экспериментов были одобрены Institutional Animal Care and Use Committee и выполнялись в соответствии с национальными инструкциями по защите животных. Трансгенные мыши B6CBA-Tg (HDexon1) 62Gpb/3J были приобретены в Jackson Laboratory (США).

Трансгенные самки и однопометные животные дикого типа обоих полов была рандомизированно разделены на следующие группы: носитель (дикий тип, обработка солевым раствором), носитель-HD (HDexon1 трансгенные мыши, обработанные солевым раствором), лекарственное средство-HD (HDexon1 трансгенные мыши, обработанные бензоатом лития).

Введение лекарственного средства

Схему приема лекарственного средства инициировали спустя 11 недель после рождения и продолжали до конца исследования. Бензоат лития вводили внутрибрюшинно в дозе 256 мг/кг массы тела/сутки. Мыши группы носителя получали инъекции того же объема солевого раствора.

Выживание

Дата и причина смерти были зарегистрированы для каждой мыши. Животных тщательно мониторили и подвергали эвтаназии, если животное призавалось умирающим, что определяли как неспособность мышей перевернуться спустя 30 секунд после того, как их помещали на бок, в соответствии с критериями тяжелой заболеваемости. Умирающие мыши были зарегистрированы как ''мертвые'', и их умерщвляли с использованием углекислого газа.

Результаты

Выживаемость обработанных бензоатом лития трансгенных мышей HDexon1

Дата и причина смерти были зарегистрированы для каждой мыши. Данные о выживании были проанализированы для исследования эффектов лекарственного средства. Как показано на Фигуре 21, пропорция оставшихся в живых в течение времени трансгенных мышей HDexon1, обработанных бензоатом лития, была улучшена по сравнению с мышами дикого типа и трансгенными мышами HDexon1, обработанными носителем.

Эквиваленты и объем

В формуле изобретения формы единственного числа означают один или больше чем один, если не указано иное или если иное не очевидно из контекста. Пункты или описания, включающие «или» между одним или более членами группы, считают удовлетворенными, если один, больше чем один или все члены группы присутствуют, используются или иначе относятся к данному продукту или способу, если не указано иное или если иное не очевидно из контекста. Изобретение включает варианты осуществления, в которых точно один член группы присутствует, используется или иначе относится к данному продукту или способу. Изобретение включает варианты осуществления, в которых больше чем один или все члены группы присутствуют, используются или иначе относятся к данному продукту или способу.

Кроме того, изобретение охватывает все варианты, комбинации и перестановки, в которых одно или более ограничений, элементов, пунктов и описательных терминов из одного или более пунктов формулы изобретения вводятся в другой пункт. Например, любой пункт, зависимый от другого пункта, может быть изменен путем включения одного или более ограничений, имеющихся в любом другом пункте, зависимом от того же основного пункта. Если элементы представлены как списки, например, в формате группы Маркуша, каждая подгруппа элементов также раскрыта, и любой элемент(ы) может быть исключен из группы. Следует понимать, что, в целом, если изобретение или аспекты изобретения относится/относятся к включению определенных элементов и/или признаков, некоторые варианты осуществления изобретения или аспекты изобретения состоят или состоят по существу из таких элементов и/или признаков. В целях простоты эти варианты осуществления не были специфично сформулированы здесь in haec verba. Также следует отметить, что термины «включающие» и «содержащие» являются открытыми и допускают включение дополнительных элементов или стадий. Если приведены диапазоны, включены их граничные значения. Кроме того, если не указано иное или иное не очевидно из контекста и понимания специалиста в данной области техники, значения, выраженные как диапазоны, могут принимать любое определенное значение или поддиапазон в установленных диапазонах в различных вариантах осуществления изобретения до десятой от единицы нижней границы диапазона, если из контекста ясно не следует иное.

В этой заявке имеются ссылки на различные выданные патенты, опубликованные заявки на патенты, журнальные статьи и другие публикации, которые все включены в настоящее описание путем ссылки. Если будет конфликт между какой-либо из включенных ссылок и настоящим описанием, то описание должно превалировать. Кроме того, любой частный вариант осуществления настоящего изобретения, попадающий в предшествующий уровень техники, может быть явно исключен из одного или более пунктов формулы изобретения. Поскольку такие варианты осуществления считаются известными специалисту, они могут быть исключены, даже если исключение не сформулировано здесь явно. Любой частный вариант осуществления изобретения может быть исключен из любого пункта формулы изобретения, по любой причине, связанной или нет с существованием предшествующего уровня техники.

Специалисту будет понятно, или он будет в состоянии установить, используя не более, чем обычное экспериментирование, множество эквивалентов частных вариантов осуществления, описанных здесь. Объем настоящих вариантов осуществления, описанных здесь, не может быть ограничен приведенным выше описанием, а определяется приложенной формулой изобретения. Специалисту будет понятно, что различные изменения и модификации этого описания могут быть сделаны без отхода от духа или объема настоящего изобретения, определенного в следующей формуле изобретения.

1. Способ защиты кортикальных нейронов от митохондриальной дисфункции, токсичности или депривации кислорода и глюкозы, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества бензоата лития, где эффективное количество бензоата лития составляет от 100 до 1000 мг.

2. Способ по п.1, в котором эффективное количество бензоата лития составляет от 300 до 1000 мг.

3. Способ по п.1 или 2, в котором эффективное количество бензоата лития представляет собой единственную дозу.

4. Способ по любому из пп.1-3, в котором субъект страдает болезнью Гентингтона, болезнью Паркинсона, индуцированными митохондриальными дисфункциями расстройствами ЦНС, болезнью Альцгеймера и боковым амиотрофическим склерозом (ALS).

5. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что субъект страдает сосудистой деменцией, деменцией с тельцами Леви (LBD) и лобно-височной деменцией (FTD) или множественной системной атрофией.

6. Способ по любому из пп.1-3, в котором субъект страдает заболеванием ЦНС, связанным с окислительным стрессом и/или сверхпродукцией реактивных форм кислорода.

7. Способ по любому из пп.1-6, в котором пациентом является человек, имеющий или подозреваемый в наличии заболевания центральной нервной системы.

8. Способ по любому из пп.1-7, в котором бензоат лития вводят системным путем.

9. Способ по п.8, в котором системный путь является пероральным введением или парентеральным введением.

10. Способ по любому из пп.1-9, в котором пациенту вводят бензоат лития с частотой от четырех раз в сутки до одного раза в месяц.

11. Способ по любому из пп.1-10, в котором пациент проходит лечение от другого заболевания ЦНС.

12. Способ по любому из пп. 1-11, в котором бензоат лития составляют в композицию, которая является фармацевтической композицией, продуктом лечебного питания или диетическим продуктом.