Группа изобретений относится к медицине, а именно лекарственным средствам, предназначенным для борьбы с инфекциями, вызываемыми грамотрицательными бактериями. Бактерицидная фармацевтическая композиция для местного применения в форме геля имеет следующий состав, мас. %: рекомбинантный модифицированный эндолизин LysECD7-SMAP - 0,2-1%, Гидроксиэтилцеллюлоза - 1%, Полиэтиленгликоль 1500 (ПЭГ 1500) - 1,5%, фосфатный буферный раствор рН=7,5 - 96,5-97,3%. Указанная композиция применяется в качестве антимикробного средства, направленного против чувствительных видов бактерий Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Achromobacter spp, Burkholderia cepacia complex, Enterobacter spp, Staphylococcus aureus и Listeria monocytogenes. Бактерицидная композиция обладает выраженной специфической фармакологической (антибактериальной) активностью в отношении грамотрицательных бактерий при местном применении, включая бактерии с множественной лекарственной устойчивостью, и способна обеспечить очистку раны за счет оттока гнойного содержимого. 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 4 пр.

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицине, а именно лекарственным средствам, предназначенным для борьбы с инфекциями, вызываемыми грамотрицательными бактериями.

Уровень техники

Устойчивость бактерий к существующим антимикробным средствам является одной из основных проблем современности в области здравоохранения. Горизонтальный перенос генов позволяет бактериям быстро приобретать новые механизмы резистентности, что, наряду с неправильным использованием и злоупотреблением антибиотиками среди населения, а также в сельском хозяйстве и промышленности, приводит к появлению штаммов, частично или полностью невосприимчивых к антибиотикам. Всемирная организация здравоохранения обращает особое внимание на патогены группы ESKAPE, к которым относятся Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae и другие представители Enterobacteriaceae. Данные бактерии способны приобретать устойчивость сразу к нескольким антибактериальным средствам и чаще других вызывают опасные для жизни пациентов инфекции, в том числе и внутрибольничные. Перечисленные обстоятельства диктуют актуальность и востребованность разработки новейших средств, обладающих антибактериальными свойствами в отношении данных патогенных микроорганизмов.

Из уровня техники из патента RU 2301057 C1 20.06.2007 известен дезинфицирующий гель. Известный гель относится к области косметологии, в частности к средствам для ухода за кожей, и может быть использован для ухода за кожей лица, рук, ног и других частей тела. Гель дезинфицирующий содержит гидроксиэтилцеллюлозу или метилцеллюлозу, пропиленгликоль, глицерин, пищевую органическую кислоту - молочную, или яблочную, или янтарную, соединение полигуанидина или его синергетическую смесь с полимерным четвертичным аммониевым соединением (ПЧАС), парфюмерную композицию и воду, при этом в качестве ПЧАС используют полиэтиленпирролидинийхлорид, дополнительно содержит пропиленгликоль и неонол.

Однако известный гель не содержит в составе компонентов белковой природы, в частности эндолизинов, обладает неспецифической антибактериальной активностью по отношению к различным бактериям и вирусам и не может быть применен для лечения и профилактики раневых или ожоговых инфекций.

Кроме того, из уровня техники известно применение альфа-дефензин-1 (HNP-1), который обладает бактерицидным действием в отношении большинства бактерий и грибов [Ericksen В. et al. Antibacterial Activity and Specificity of the Antibacterial Activity and Specificity of the Six Human α-Defensins // Antimicrob. Agents Chemother. 2005. Vol. 49, №1. P. 8-15]. HNP-1 представляет собой полипептид, состоящий из 30 аминокислотных остатков (аминокислотная последовательность ACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC). При этом механизм действия HNP-1 связан с непосредственным воздействием на мембрану микробной клетки - образование пор, утечка клеточного содержимого и последующий лизис бактерии. Считается, что специфическое разрушение микробной стенки обусловлено электростатическим притяжением положительно заряженного HNP-1 и отрицательно заряженной мембраны [Kagan В.L. et al. Antimicrobial defensin peptides form voltage-dependent ion-permeable channels in planar lipid bilayer membranes // Proc Natl Acad Sci USA. National Academy of Sciences, 1990. Vol. 87, № January. P. 210-214].

Однако применение нативных дефензинов in vivo приводит к их быстрой инактивации и, как следствие, короткому периоду действия.

Описание изобретения

Заявленный бактерицидный гель имеет следующий состав, мас. %:

- рекомбинантный модифицированный эндолизин LysECD7-SMAP - 0,2-1%,

- Гидроксиэтилцеллюлоза - 1%,

- Полиэтиленгликоль 1500 (ПЭГ 1500) - 1,5%,

- фосфатный буферный раствор рН=7,5 - 96,5-97,3%.

Задачами настоящего бактерицидного геля являются лечение и профилактика различных видов раневых и ожоговых инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями, чувствительными к действию эндолизина LysECD7-SMAP.

В частности, LysECD7-SMAP активен в отношении возбудителей различных инфекций, в том числе обладающих множественной лекарственной устойчивостью, включая Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Achromobacter spp, Burkholderia cepacia complex и Enterobacter spp. Кроме того, возможно применение препаратов на его основе в отношении Staphylococcus aureus и Listeria monocytogenes.

Действующее вещество композиции - эндолизин - разрушает клеточную стенку грамположительных и грамотрицательных бактерий, вызывая их гибель. Вспомогательное вещество - ПЭГ 1500 - способствуют оттоку гнойного содержимого и очистке раны.

Технический результат заключается в использовании фармацевтической композиции, обладающей выраженной специфической фармакологической (антибактериальной) активностью в отношении грамотрицательных бактерий при местном применении, включая бактерии с множественной лекарственной устойчивостью, и способен обеспечить очистку раны за счет оттока гнойного содержимого.

Раскрытие изобретения

Указанный технический результат реализуется за счет определенного состава геля, а также определенных дозировок ингредиентов, входящих в состав геля.

А именно, бактерицидный гель имеет следующий состав, мас. %: рекомбинантный модифицированный эндолизин LysECD7-SMAP - 0,2-1%, Гидроксиэтилцеллюлоза - 1%, Полиэтиленгликоль 1500 (ПЭГ 1500) - 1,5%, фосфатный буферный раствор рН=7,5 - 96,5-97,3%.

Пример 1

Действующим веществом в композиции является модифицированный эндолизин LysECD7-SMAP, который имеет имеющий аминокислотную последовательность, представленную в таблице 1.

Эндолизин получают биотехнологическим путем посредством создания генетической конструкции для экспрессии в штамме Е. coli B121(DE3)pLysS. Исходная кодирующая последовательность LysECD7-SMAP была искусственно синтезирована в векторе pALTA-LysECD7-SMAP и интегрирована в экспрессионный вектор рЕТ-42b (+), в результате чего получали плазмиду pET42b-LysECD7-SMAP.

Субстанцию белка получают по следующей технологии: культивирование клеток-продуцентов Е. coli в ферментере с индукцией экспрессии белка, получение растворимых фракций лизатов биомассы клеток продуцента, их трехстадийная хроматографическая очистка (катионообменная хроматография на носителе Capto SP Impres, с последующей двухэтапной гель-эксклюзионной хроматографией на носителях Superdex 75 и Sephadex G25) и концентрирование препарата до концентрации 20 мг/мл.

Затем подготавливают гелевую основу, содержащую гидроксиэтилцеллюлозу (ГЭЦ) и полиэтиленгликоль 1500 (ПЭГ 1500), которые стерилизуют автоклавированием. После стерилизации гелевой основе давали остыть до комнатной температуры и вносили полученную ФС модифицированного эндолизина LysECD7-SMAP при помощи механического дозатора постепенно при постоянном перемешивании в соответствующем объеме для приготовления ГЛФ с конечными концентрациями активного вещества от 0,2 до 1%.

Пример 2

Оценка спектра действия и степени антибактериальной активности ГЛФ на основе LysECD7-SMAP проводилась в экспериментах in vitro в отношении широкого спектра различных представителей как грамотрицательных, так и грамположительных бактерий. Каждый вид был представлен 4-5 штаммами или клиническими изолятами с различной степенью устойчивости к антибиотикам. В концентрации 100 мкг/мл эндолизин действовал на 47 штаммов из 59 исследуемых с активностью выше 33,33%.

При этом спектр активности и эффективность в отношении грамотрицательных штаммов были ожидаемо выше, чем по отношению к грамположительным бактериям. Особенно ярко выраженная активность была отмечена к представителям таких видов, как Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Achromobacter spp, Burkholderia cepacia complex и Enterobacter spp, медианное значение антибактериальной активности к ним составляло более 50%, а для двух видов - 100% (фиг. 1).

Также LysECD7-SMAP проявлял выраженную активность по отношению к грамположительным Staphylococcus aureus и Listeria monocytogenes. Таким образом, в спектр антибактериальной активности модифицированного эндолизина входят практически все представители социально значимой группы патогенных бактерий ESKAPE, а также другие важные возбудители инфекционных заболеваний различной этиологии.

Пример 3

Самцам крыс линии «Вистар» (8-10 недель, 180-210 г) за сутки до начала эксперимента удаляли шерстный покров машинкой для стрижки. Термические ожоги IIIБ степени на правом боку животных под наркозом производили контактным высокотемпературным способом с использованием металлической пластины. К коже на 4 сек прикладывали разогретую до 300°С медную пластину (площадь поверхности 150 мм²). Для восстановления водно-элекролитного баланса после ожогового стресса подкожно вводили 1 мл физиологического раствора. Через 5 минут на поверхность раны наносили суспензию P. aeruginosa Ts 38-16 в дозе 2×10¹⁰ КОЕ/крысу.

Спустя 24 ч начинали лечение накожным нанесением ГЛФ или плацебо в соответствии с планом эксперимента. Лечение проводили ежедневно, 5 дней, 2 раза в сутки.

На 1, 3 и 7 сутки изучали патоморфологические изменения ожоговой поверхности и измеряли ее площадь, а также оценивали микробную нагрузку в области ожога. Смывы с ожоговой поверхности осуществляли ватным тампоном, смоченным физиологическим раствором. Для этого по поверхности раны проводили 10 раз ватным тампоном и помещали его в пробирку, содержащую 1 мл физиологического раствора, выдерживали 30 минут и проводили высев на чашки с агаром в объеме 100 мкл и инкубировали при температуре 37°С в течение 18 часов.

На 7 день методом CO₂-ингаляции проводили эвтаназию животных, извлекали кожный лоскут области ожога и селезенку, гомогенизировали их в ступке с 1 мл физиологического раствора и высевали по 100 мкл на плотную питательную среду с дальнейшим культивированием в течение 18 ч при температуре 37°С для оценки их обсемененности.

При оценке результатов исследования действия ГЛФ «Гель бактерицидный с эндолизином», содержащего модифицированный эндолизин LysECD7-SMAP в различных концентрациях, с учетом динамики изменения площади ожогов и бактериальной нагрузки раневой поверхности, было установлено, что эффективностью обладают ГЛФ в концентрациях 5 и 10 мг/г (фиг. 2). При этом, данные ГЛФ обеспечивают снижение обсемененности и повышение скорости заживления инфицированной раны после термического ожога в модели синегнойной ожоговой инфекции у крыс.

Пример 4

Действие исследуемой ГЛФ при инфицировании трофической язвы изучали на негенетической модели стрептозотоцинового сахарного диабета у мышей линии BALB/с. Для моделирования сахарного диабета 2 типа у экспериментальных животных индуцировали гипергликемическое состояние. Для этого самцам мышей линии BALB/с (18-20 г) перед началом эксперимента убирали корм на 12 часов, после чего вводили стрептозотоцин (СТЗ) в количестве 150 мг/кг веса. До введения, спустя 24 часа и спустя трое суток после введения измеряли уровень глюкозы в крови для подтверждения диагноза. В эксперимент брались животные с показателем содержания глюкозы ≥15 ммоль/л.

За сутки до начала эксперимента удаляли шерстный покров машинкой для стрижки. На спине животных с использованием биопсийного инструмента диаметром 4 мм были созданы по 2 раны, путем оттягивания кожи и последующего штампования. Биопсийный инструмент проникал через эпидермис, дерму и подкожную клетчатку, при этом фасция сохранялась интактной. Спустя 5 минут на поверхность раны наносили суспензию P. aeruginosa Ts 38-16 в дозе 6,5×10⁵ КОЕ/животное.

Спустя еще 24 ч начинали лечение накожным нанесением ГЛФ или плацебо в соответствии с планом эксперимента. Лечение проводили ежедневно, 5 дней, 1 или 2 раза в сутки.

На 1, 3 и 7 сутки изучали патоморфологические изменения раневой поверхности и измеряли ее площадь. После эвтаназии методом CO₂-ингаляции на 1, 3 и 7 дни брали пробы крови из сердца, извлекали кожные лоскуты областей раны и гомогенизировали их в ступке с 1 мл физиологического раствора и высевали разведения на плотную питательную среду с дальнейшим культивированием в течение 18 ч при температуре 37°С для оценки их обсемененности.

При оценке результатов исследования, с учетом динамики изменения площади ран, бактериальной нагрузки и гистологического исследования, был выявлен непосредственный эффект исследуемых дозировок ГЛФ на ранозаживление при образовании хронических ран. Показано изменение в обсемененности раны и достоверное снижение бактериальной нагрузки как в гомогенатах кожных лоскутов, так и в крови животных.

Заявленный гель может быть получен специалистом на практике и при его использование обеспечивает реализацию заявленного назначения. Возможность осуществления на практике следует из того, что для каждого ингредиента, включенного в формулу изобретения на основании описания, известен материальный эквивалент, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «промышленная применимость» для изобретения и критерию «полнота раскрытия» для изобретения.

1. Бактерицидная фармацевтическая композиция для местного применения в форме геля имеет следующий состав, мас. %: рекомбинантный модифицированный эндолизин LysECD7-SMAP - 0,2-1%, Гидроксиэтилцеллюлоза - 1%, Полиэтиленгликоль 1500 (ПЭГ 1500) - 1,5%, фосфатный буферный раствор рН=7,5 - 96,5-97,3%.

2. Применение бактерицидной композиции по п. 1 в качестве антимикробного средства, направленного против чувствительных видов бактерий Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Achromobacter spp, Burkholderia cepacia complex, Enterobacter spp, Staphylococcus aureus и Listeria monocytogenes.

Изобретение относится к биотехнологии. Раскрыт способ получения природных клеток-киллеров.

Специально разработанные липосомы для лечения бактериальных инфекций // 2780026

Группа изобретений относится к области медицины и фармацевтики, а именно к пустым липосомам для применения при лечении или предотвращении бактериальной инфекции, где липосомы содержат холестерин в количестве 40 мас.% или более и сфингомиелин; а также к применению указанных липосом для лечения или предотвращения бактериальной инфекции; и к способу лечения или предотвращения бактериальной инфекции, включающему введение нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества указанных пустых липосом.

Проп-2-ин-1-ил-(2z)-2-[(3-альфа, 4-альфа, 8-альфа, 11-альфа, 14-бета, 16-бета)-16-(ацетилокси)-3,11-дигидрокси-4,8,10,14-тетраметилгонан-17-илиден]-6-метилгепт-5-еноат, способ получения и антимикробные свойства // 2780014

Изобретение относится к области синтеза биологически активных аналогов природных соединений, а именно к получению нового представителя ацетиленовых производных фузидовой кислоты - проп-2-ин-1-ил-(2Z)-2-[(3α, 4α, 8α, 11α, 14β, 16β)-16-(ацетилокси)-3,11-дигидрокси-4,8,10,14-тетраметилгонан-17-илиден]-6-метилгепт-5-еноата, обладающего высокой антибактериальной активностью по отношению к Staphylococcus aureus (MRSA) при низкой токсичности, проявляющего минимальное гемолитическое действие при максимально тестируемой концентрации.

Комплекс для усиления иммунного ответа // 2779622

Группа изобретений относится к фармацевтической промышленности, а именно к продукту для потенцирования иммунного ответа. Комбинированный продукт для потенцирования иммунного ответа, содержащий полиинозиновую-полицитидиловую кислоту (PIC), катионный стабилизатор и растворимую соль кальция в жидкой реакционной системе; при этом катионный стабилизатор представляет собой привитой сополимер олигосахарида хитозана и метоксиполиэтиленгликоля (COS-g-MPEG), где олигосахарид хитозана характеризуется молекулярным весом, составляющим 5 кДа или меньше; полиинозиновая-полицитидиловая кислота предварительно нагрета при температуре от 88 до 90°С в течение от 70 до 120 минут, соотношение PIC к COS-g-MPEG в комбинированном продукте составляет от 1:0,8 до 1:6,4.

Средство для приготовления противомикробного лечебного раствора (варианты), способ организации средства для приготовления противомикробного лечебного раствора (варианты) // 2779613

Изобретения относятся к средству для быстрого приготовления антибактериального лечебного раствора, содержащему комбинацию нитрофурала и фуразидина в качестве действующих веществ, которое проявляет антибактериальное действие против Bacillus cereus, Esherichia coli, Salmonella abony, Staphylococcus aureus, и к способу организации средства для приготовления антибактериального лечебного раствора.

Макроциклические антибиотики широкого спектра // 2779477

Изобретение относится к антибактериальным соединениям формулы V, где значения R1-R18, R27, R28, X, Y, Z, q, p указаны в формуле изобретения, которые характеризуются широким спектром биоактивности. Соединения действуют путем ингибирования бактериальной сигнальной пептидазы 1 типа (SpsB), жизненно важного белка у бактерий.

Антибактериальные композиции и способы // 2779346

Изобретение относится к области медицины, а именно к инфектологии и терапии, и предназначено для лечения бактериальной инфекции. Способ лечения бактериальной инфекции у субъекта осуществляют путем парентерального введения активных ингредиентов.

Соединения и способы лечения инфекций // 2779024

Группа изобретений относится к фармацевтической химии и включает соединения, указанные в п.1 формулы изобретения, их применение и антибактериальную композицию на их основе. Технический результат – соединения по п.1, применяемые для лечения или профилактики бактериальной колонизации или инфекции у субъекта, причем указанная бактериальная инфекция вызвана грамположительными или грамотрицательными бактериями.

Катионный пептид, проявляющий антибактериальные свойства // 2778856

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к модифицированным вариантам пептида кателицидина, и может быть использовано в медицине и ветеринарии как антимикробное средство. Предложены модифицированные пептиды, обладающие антимикробной активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Связывающие элементы с измененными диверсифицированными доменами остова // 2778694

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая способ скрининга, слитый белок для связывания с молекулой-мишенью (варианты), связывающий элемент для связывания с молекулой мишенью, способ получения библиотеки связывающих элементов, библиотеку связывающих элементов и способ получения связывающего элемента.

Биодеградируемый имплантат для локальной иммунотерапии онкологических больных // 2780932

Изобретение относится к биотехнологии, медицине и ветеринарии, а именно к онкологии, разработке погружных медицинских изделий для персонализированной терапии, в частности для местной циторедуктивной терапии пациентов с солидными опухолями путем паратуморальной имплантации изделия. Биодеградируемый имплантат для локальной иммунотерапии онкологических больных представляет собой скаффолд из биодеградируемого сплава на основе железа и марганца, изготовленный в виде пластины с прорезями продолговатой формы, формирующими резервуары для действующей композиции, заполненные мобилизирующей клетки средой на основе гидрогеля и биомедицинским клеточным продуктом на основе аутологичных или аллогенных Т-лимфоцитов и натуральных киллеров, активированных ex vivo.