Способ получения природных клеток-киллеров и композиция для лечения рака

Изобретение относится к биотехнологии. Раскрыт способ получения природных клеток-киллеров. Способ включает выделение одноядерных клеток периферической крови (РВМС) из образца крови; выделение по меньшей мере одной из клеток CD56+ и/или клеток CD3-/CD56+ из PBMC; и совместное культивирование по меньшей мере одной из клеток CD56+ и/или клеток CD3-/CD56+ с комбинацией питающих клеток в присутствии по меньшей мере двух цитокинов, отличающийся тем, что комбинация питающих клеток содержит облученные клетки Jurkat и облученные клетки непрерывной линии лимфоцитов, трансформированных вирусом Эпштейна-Барра (EBV-LCL), а по меньшей мере двумя цитокинами являются IL-2 и IL-21. Также раскрыта композиция для введения пациенту, нуждающемуся в лечении NK-клетками, включающая: NK-клетки, размноженные в культуре в соответствии с указанным способом; и фармацевтически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что размноженные NK-клетки имеют более высокий уровень цитотоксичности и/или противораковой активности. Кроме того, описан способ размножения NK-клеток в культуре, включающий: выделение одноядерных клеток периферической крови (РВМС) из образца крови; выделение по меньшей мере одной из клеток CD56+ и/или CD3-/CD56+ из PBMC; и совместное культивирование по меньшей мере одной из клеток CD56+ и/или CD3-/CD56+ с комбинацией питающих клеток в присутствии по меньшей мере двух цитокинов, отличающийся тем, что комбинация питающих клеток содержит облученные клетки Jurkat и облученные клетки непрерывной линии лимфоцитов, трансформированных вирусом Эпштейна-Барра (EBV-LCL), а по меньшей мере двумя цитокинами являются IL-2 и IL-21 и при этом питающие клетки и цитокины добавляют через определенные промежутки времени на протяжении всего размножения в культуре. Изобретение позволяет получать природные клетки-киллеры высокой чистоты. 7 н. и 31 з.п. ф-лы, 9 табл., 21 пр., 14 ил.

 

ВКЛЮЧЕНИЕ ПРИЗНАКОВ ПУТЕМ ССЫЛКИ НА ПРИОРИТЕТНЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно заявке на патент Кореи № KR-10-2018-0012938, поданной 1 февраля 2018 г., заявке на патент Кореи № KR-10-2018-0012942, поданной 1 февраля 2018 г., заявке на патент Кореи № KR-10-2019-0001981, поданной 7 января 2019 г., и заявке на патент Кореи № KR-10-2019-0001983, поданной 7 января 2019 г., содержание которых полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Область техники

[0002] Настоящее изобретение относится к способу получения природных клеток-киллеров высокой чистоты.

Описание предшествующего уровня техники

[0003] Организм человека защищен от патогенов с помощью иммунного ответа, координированного иммунной системой, которая состоит из многих клеток, связанных с иммунитетом, химических медиаторов, таких как цитокины и др. Лейкоциты, особенно лимфоциты, играют важную роль в такой иммунной системе. Лимфоциты участвуют как во врожденном, так и в приобретенном иммунитете.

[0004] Природные клетки-киллеры (NK-клетки) - это тип врожденных иммунных клеток, которые, как известно, специфично убивают рак, распознают и убивают вирусы, бактерии и т.д., и убивают патогены с помощью ферментов, таких как перфорин и гранзимы, или путем взаимодействия Fas-FasL. Что касается онкобольных, сообщалось, что снижение цитотоксичности этих NK-клеток в раковых клетках связано с появлением различных типов рака, таких как рак легкого (Carrega P, et al., Cancer, 2008: 112: 863-875), рак печи (Jinushi M, et al., J Hepatol., 2005: 43; 1013-1020), рак молочной железы (Bauernhofer T, et al., Eur J Immunol., 2003: 33: 119-124), рак матки (Mocchegiani E., et al., Br j Cancer., 1999: 79: 244-250), рак крови (Tajima F., et al., Lekemia 1996: 10: 478-482) и т.п. Соответственно, для терапии рака желательно усилить цитотоксичность NK-клеток касательно раковых клеток.

[0005] Для получения терапевтического эффекта от опосредованного NK-уничтожением раковых клеток необходимо большое количество NK-клеток, имеющих высокую чистоту, но получить большое количество крови от онкобольных нелегко, и доля NK-клеток в крови невелика, всего около 5-20%. Таким образом, использовать NK-клетки как иммунотерапевтическое средство было трудно.

[0006] В результате этого желательно эффективно размножать и пролиферировать только NK-клетки, но при обычном способе пролиферации NK-клеток нужно применять различные дорогие цитокины в высокой концентрации, поэтому соответствующая терапия доступна только для некоторых финансово стабильных пациентов. Кроме того, согласно традиционным методами пролиферации NK-клеток, другие типы (например, Т-клетки, В-клетки и т.п.) иммунных клеток могут присутствовать вместе с NK-клетками, и аллогенное введение NK-клеток, содержащих Т-клетки, может вызвать болезнь трансплантат против хозяина (GVHD), а аллогенное введение NK-клеток, содержащих В-клетки, субъектам с несовместимой группой крови может вызвать синдром В-лимфоцитов-пассажиров, и, как следствие, противораковый эффект не будет максимизироваться.

[0007] Кроме того, в дополнение к размножению и пролиферации NK-клеток, очень желательно поддерживать функции NK-клеток до тех пор, пока размноженные и пролиферованные NK-клетки фактически не используются. Как следствие проводится разработка композиции, способной содействовать пролиферации NK-клеток, увеличивая выработку цитокинов, таких как TNF-, INF- и GM-CSF, полученных из NK-клеток, и повышение цитотоксичности NK-клеток касательно раковых клеток.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0008] Эта заявка касается способов получения природных киллеров с высокой чистотой и клеточной терапевтической композиции для лечения рака, содержащей высокоочищенные природные клетки-киллеры и цитокины. Любые признаки, структуры или этапы, раскрытые в этом документе, могут быть заменены или объединены с любыми другими признаками, структурами или этапами, раскрытыми в этом документе, или могу бать пропущены. Далее, для обобщения раскрытия, в данном документе были описаны некоторые аспекты, преимущества и особенности изобретений. Нужно понимать, что необязательно любые или все подобные преимущества достигаются в соответствии с любым конкретным вариантом изобретения, раскрытым в этом документе. Никакие отдельные аспекты этого раскрытия не являются существенными или незаменимыми.

В варианте осуществления изобретения раскрыто способ получения природных клеток-киллеров. Способ включает: выделение мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) из образца крови, выделение по меньшей мере одной из клеток CD5+ и/или клеток CD3-/CD56+ из PBMC; и совместное культивирование по меньшей мере одной из клеток CD56+ и/или клеток CD3-/CD56+ с комбинацией питающих клеток в присутствии цитокина.

[0010] В некоторых вариантах осуществления изобретения выделение по меньшей мере одной клетки CD56+ и/или клеток CD3-/CD56+ из PBMC проводят с применением хотя бы одной микросферы CD56 и микросферы CD3. В некоторых вариантах осуществления изобретения цитокин выбран из группы, состоящей из IL-2, IL-21, IL-15, Flt3-L, SCF, IL-7, IL-18, IL-4, интерферонов I типа, GM-CSF, IGF 1 и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления изобретения цитокин может быть добавлен в концентрации 50-1000 МЕ/мл.

[0011] В некоторых вариантах осуществления изобретения комбинация питающих клеток содержит облученные клетки Jurkat и облученные клетки непрерывной линии лимфоцитов (EBV-LCL), трансформированных вирусом Эпштейна-Барра. В различных вариантах изобретения соотношение облученных клеток Jurkat и облученных клеток EBV-LCL может составлять приблизительно 1:0,1-5. Каждая из облученных клеток Jurkat и облученных клеток EBV-LCL может быть получена путем облучения 50-500 Гр.

[0012] В некоторых вариантах осуществления изобретения совместное культивирование может включать совместное культивирование в течение 1-50 дней.

[0013] В некоторых вариантах осуществления изобретения способ может дополнительно включать совместное культивирование по меньшей мере одной клетки CD56+ и/или клеток CD3-/CD56+ с комбинацией питающих клеток в присутствии первого цитокина в течение первого периода; и впоследствии совместное культивирование по меньшей мере одной из клеток CD56+ и/или клеток CD3-/CD56+ с комбинацией питающих клеток в присутствии второго цитокина в течение второго периода. В вариации, второй цитокин может быть добавлен один раз или более в течение 0-6 дней второго периода. Второй цитокин может быть добавлен один раз или более в течение первых шести дней каждого четырнадцатидневного цикла в течение второго периода. Первым цитокином может быть IL-2. Вторым цитокином может быть IL-21. Второй цитокин может быть добавлен в концентрации 10-100 нг/мл.

[0014] В некоторых вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере, одну клетку CD56+ и/или клетку CD3-/CD56+ и комбинацию питающих клеток совместно культивируют в соотношении приблизительно 1:1-100 клеток CD56+ и/или клеток CD3-/CD56+ к питающим клеткам.

В некоторых вариантах изобретения раскрыта композиция, изготовленная способом.

В варианте осуществления изобретения раскрыто композицию для лечения рака у пациента, нуждается в этом. В состав входят: эффективное количество природных клеток-киллеров CD56+, полученных из периферической крови, где эффективное количество находится в диапазоне от приблизительно 1×10⁶ до приблизительно 5×10⁸ клеток на кг массы тела пациента, и где природные клетки-киллеры CD56+ имеют чистоту по меньшей мере приблизительно 90%; IL-2 в концентрации 50-50000 МЕ/мл; и фармацевтически приемлемый носитель.

[0017] В некоторых вариантах осуществления изобретения цитокин может быть выбран из группы, состоящей из IL-2, IL-21, IL-15, Flt3-L, SCF, IL-7, IL-18, IL-4, интерферонов типа I, GM-CSF, IGF 1 и их комбинации. В вариации цитокин может быть IL-2. Цитокин может иметь концентрацию 50-50000 МЕ/мл.

[0018] В некоторых вариантах осуществления изобретения рак выбран из группы, состоящей из: рака крови, рака желудка, рака поджелудочной железы, холангиокарциномы, рака толстой кишки, рака молочной железы, рака печени, рака яичников, рака легкого, рака почки, рака предстательной железы и нейробластомы.

[0019] В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция содержит менее чем приблизительно 1% Т-клеток.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0020] Различные варианты осуществления изобретения изображаются на сопроводительных графических материалах для иллюстративных целей и ни в коем случае не должны трактоваться как ограничение объема вариантов осуществления изобретения. Кроме того, различные признаки различных раскрытых вариантов осуществления изобретения могут быть объединены для формирования дополнительных вариантов осуществления изобретения, которые являются частью этого раскрытия.

[0021] Фиг. 1A иллюстрирует график, показывающий скорость роста NK-клеток, полученных из PBMC, клеток CD56+ и клеток CD3-/CD56+.

[0022] Фиг. 1B иллюстрирует графики, показывающие скорость роста NK-клеток, полученных из PBMC, и клеток CD56+ с обработкой IL-21 и без нее.

[0023] Фиг. 2 иллюстрирует график, показывающий чистоту NK-клеток CD3-/CD56+, полученных из PBMC, или клеток CD56+ клеток с обработкой IL-21 и без нее.

[0024] На Фиг. 3 изображена конструкция пластины для анализа противораковой активности клеток NK.

[0025] Фиг.4 иллюстрирует графики, показывающие кратковременную цитотоксичность NK-клеток, полученных из PBMC, и клеток CD56+ для различных соотношений эффекторные клетки: клетки-мишень (E: T).

[0026] Фиг. 4В иллюстрирует графики, показывающие длительную цитотоксичность NK-клеток, полученных из PBMC, и клеток CD56+ против AGS, A549 и MDA-MB-231.

[0027] Фиг. 5A-5B иллюстрируют графики, показывающие скорость роста NK-клеток, полученных при обработке IL-21 в течение различных периодов времени.

[0028] Фиг. 6 иллюстрирует графики, показывающие скорость роста NK-клеток, полученных при обработке IL-21 с различными концентрациями.

[0029] Фиг. 7A иллюстрирует график, показывающий кратковременную цитотоксичность NK-клеток, образующихся при обработке IL-21 в течение различных периодов времени и для различных соотношений E:Т.

[0030] Фиг. 7B-7C иллюстрируют графики, показывающие длительную цитотоксичность NK-клеток, полученных при обработке IL-21 в течение различных периодов времени, против клеток AGS, A549 и MDA-MB-231.

[0031] Фиг. 8А иллюстрирует графики, показывающие кратковременную цитотоксичность NK-клеток, полученных путем обработки IL-21 с различными концентрациями для различных соотношений E:T.

[0032] Фиг. 8B иллюстрирует графики, показывающие длительную цитотоксичность NK-клеток, полученных при обработке IL-21 в различных концентрациях против клеток AGS, A549 и MDA-MB-231.

[0033] Фиг. 9 иллюстрирует графики, показывающие скорость роста NK-клеток со стимулированием питающими клетками.

[0034] Фиг. 10A иллюстрирует графики, показывающие скорость роста NK-клеток, полученных из PBMC пациента с раком с обработкой IL-21 или без нее.

[0035] Фиг. 10B иллюстрирует график, показывающий чистоту NK-клеток CD3-/CD56+, полученных из PBMC пациентов с раком с обработкой IL-21 или без нее.

[0036] Фиг. 10С иллюстрирует график, показывающий кратковременную цитотоксичность NK-клеток, полученных из PBMC с обработкой IL-21 или без нее против клеток K562.

[0037] Фиг. 10D иллюстрирует графики, показывающие длительную цитотоксичность NK-клеток, полученных из PBMC с обработкой IL-21 или без нее против клеток AGS, A549 и MDA-MB-231.

[0038] Фиг. 11 иллюстрирует графики, показывающие скорость выживания NK-клеток, обработанных IL-2 или необработанных IL-2.

[0039] Фиг. 12 иллюстрирует графики, показывающие цитотоксичность NK-клеток, обработанных IL-2 или необработанных IL-2, против клеток рака при различных соотношениях E:T.

[0040] Фиг. 13 иллюстрирует фотографии остальных NIH: клеток OVCAR-3, обработанных NK-клетками, обработанными IL-2 или без такой обработки.

[0041] Фиг. 14 иллюстрирует фотографии остальных клеток AGS, обработанных NK-клетками, обработанными IL-2 или без такой обработки.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0042] Изобретателями был разработан способ получения NK-клеток высокой чистоты без использования дорогих цитокинов. Изобретатели обнаружили, что после выделения клеток CD56+ из мононуклеарных клеток периферической крови, когда клетки CD56+, выделенные из мононуклеарных клеток периферической крови, совместно культивируются с питающими клетками в присутствии цитокинов, могут быть получены NK-клетки CD56+ высокой чистоты. Кроме того, авторы изобретения разработали клеточную терапевтическую композицию для лечения рака, содержащую NK-клетки, которые эффективно используются для аллогенной терапии. В результате изобретатели обнаружили, что при добавлении определенного цитокина к NK-клеткам CD56+, выделенным из мононуклеаров периферической крови, проявляется высокая выживаемость и высокая противораковоя активность. Итак, изобретатели стремились разработать способ размножения NK-клеток и предоставить клеточную терапевтическую композицию для лечения рака, содержащуб размноженные NK-клетки CD56+ из периферической крови вместе с цитокинами.

[0043] Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения способ получения NK-клеток высокой чистоты может включать: выделение мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) из образца крови ("Первый этап выделения") выделения клеток, выбранных из группы, состоящей из клеток CD56+ и клеток CD3-/CD56+ из мононуклеаров периферической крови («Второй этап выделения»); и совместное культивирование клеток, выбранных из группы, состоящей из клеток CD56+ и клеток CD3-/CD56+, вместе с питающими клетками в присутствии цитокина ( "Этап культивирования»). Каждый этап описан в данном документе более подробно. Клетки CD3-/CD56+, полученные согласно раскрытым способам, могут проявлять не только более высокую чистоту и высокую противораковую активность, но и другие отличные характеристики, такие как наличие различных поверхностных маркеров или активированных рецепторов, например, одного или более из CD16, CD25, CD27, CD28, CD69, CD94/NKG2C, CD94/NKG2E, CD266, CD244, NKG2D, KIR2S, KIR3S, Ly94D, NCR, IFN-a, IFN-b, CXCR3, CXCR4, CX3CR1, CD62L и CD57, по сравнению с NK-клетками, производимыми из мононуклеарных клеток периферической крови без выделения клеток CD56+.

Первый этап выделения

[0044] В этом документе "образец крови" может представлять собой цельную кровь периферической крови или лейкоциты, выделенные из периферической крови с помощью лейкафереза, но не ограничиваться этим. Кроме того, периферическая кровь может быть получена от нормального человека, пациента, имеющего риск рака, или онкологического пациента, но источник периферической крови этим не ограничивается.

[0045] В этом документе термин "лейкаферез" может касаться метода выборочного удаления (выделения) лейкоцитов из собранной крови и последующего введения крови пациенту, а в некоторых вариантах осуществления изобретения лейкоциты, выделенные способом, могут использоваться без дополнительных методов, таких как метод градиента плотности фиколла-гипака.

[0046] В этом документе термин "мононуклеарная клетка периферической крови" может использоваться как взаимозаменяемый с "PBMC", "мононуклеарная клетка" или "моноцит", и может касаться мононуклеарной клетки, выделенной из периферической крови, которая обычно используется для противораковой иммунотерапии. Одноядерные клетки периферической крови можно получить из собранной крови человека с помощью известных методов, таких как метод градиента плотности фиколла-гипака.

[0047] В некоторых вариантах осуществления изобретения мононуклеарные клетки периферической крови могут быть аутологичными, но аллогенные мононуклеарные клетки периферической крови могут также использоваться для получения NK-клеток высокой чистоты для противораковой иммунотерапии согласно описанным в данном документе методам. Далее, в некоторых вариантах осуществления изобретения, мононуклеарные клетки периферической крови могут быть получены от нормального человека, но одноядерные клетки периферической крови также могут быть получены от пациента, имеющего риск рака, и/или онкологического пациента.

[0048] В этом документе термин "клетки CD56+" может использоваться как взаимозаменяемый с "клетки NK CD56+" или "клетки природных киллеров CD56+", а термин "клетки CD3-/CD56+" может использоваться как взаимозаменяемый с "NK-клетки CD3-/CD56+ ". Клетки CD56+ или CD3-/CD56+ могут включать клетки, у которых на клеточной поверхности экспрессируется гликопротеин CD56, или, кроме того, клетки, у которых гликопротеин CD3 не экспрессируется, тогда как гликопротеин CD56 экспрессируется. Даже тот же тип иммунных клеток может иметь различия в типе CD, прикрепленном к поверхности клетки и скорости экспрессии, и, следовательно, их функции могут быть разными.

Второй этап выделения

[0049] В некоторых вариантах осуществления изобретения выделение природных клеток-киллеров CD56+ из образца крови может быть осуществлено методом выделения с использованием хотя бы одного ингредиента, выбранного из группы, состоящей из микросфер CD56 и микросфер CD3, или методом изоляции с использованием оборудования, такого как CliniMACS, сортировщика клеток проточной цитометрии и тому подобное.

[0050] Например, метод изоляции с использованием микросфер CD56 и/или микросфер CD3 может быть выполнен путем добавления микросфер CD56 в PBMC, а затем удаления неспецифического связывания, или выполнен путем добавления микросфер CD3 к PBMC для удаления специфического связывания, а потом снова добавления микросфер CD56 для удаления неспецифического связывания. В некоторых случаях путем выделения клеток CD56+ и/или клеток CD3-/CD56+ из PBMC могут быть удалены Т-клетки или другие неприродные клетки-киллеры.

Этап культивирования

[0051] В этом документе термин "цитокин" может касаться имуноактивного соединения, которое может быть использовано для индуцирования мононуклеарных клеток периферической крови к дифференцировке в NK-клетки.

[0052] В некоторых воплощениях изобретения цитокином может быть интерлейкин-2 (IL-2), IL-15, IL-21, FMS-образный лиганд тирозинкиназы 3 (Flt3-L), фактор стволовых клеток (SCF), IL-7, IL-18, IL-4, интерфероны типа I, гранулоцит-макрофаговый колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF 1), но не ограничиваться ими.

[0053] В некоторых воплощениях изобретения цитокин может использоваться в концентрации 50-1000, 50-900, 50-800, 50-700, 50-600, 50-550, 100-550, 150-550, 200-550, 250-550, 300-550, 350-550, 400-550, 450-550 МЕ/мл. Обычные методы пролиферации NK-клеток используют высокие концентрации различных цитокинов. И наоборот, в некоторых вариантах осуществления способа пролиферации NK-клеток, описанного здесь, потому что с клетками CD56+ высокой чистоты могут быть использованы два типа питающих клеток, NK-клетки с высоким выходом и высокой чистотой могут пролиферировать, используя только низкие концентрации одного цитокина.

[0054] В этом документе термин "питающая клетка" может касаться клетки, которая не делится и не пролиферирует, но имеет метаболическую активность, производя различные метаболиты и, таким образом, способствует пролиферации клеток-мишеней.

[0055] В некоторых вариантах изобретения питающей клеткой может быть по меньшей мере одна, выбранная из группы, состоящей из облученных клеток Jurkat, облученных клеток непрерывной линии лимфоцитов, трансформированных вирусом Эпштейна-Барра (EBV-LCL), и PBMC, HFWT, RPMI 1866, Daudi, MM-170, K562 или клеток, генетически модифицированных путем нацеливания на K562 (например, лиганд K562-mbIL-15-41BB). Например, в одном варианте осуществления изобретения питающими клетками могут быть облученные клетки Jurkat и клетки EBV-LCL.

[0056] В этом документе термин "клетка Jurkat" или "клеточная линия Jurkat" может касаться клеточной линии рака крови (имортализованого острого Т-клеточного лейкоза), которая была разработана доктором Артуром Вайсом из Калифорнийского университета в Сан-Франциско. Клетки Jurkat, в которых экспрессируются разные рецепторы хемокинов и которые способны продуцировать IL-2, обычно не рассматриваются как возможный кандидат питающих клеток для противораковой иммунотерапии, поскольку MHC класса I, который является естественным ингибитором активации клеток-киллеров, сильно экспрессируется на клеточной поверхности. Клетки Jurkat можно получить в ATCC (ATCC TIB-152).

[0057] В этом документе термин "клетка EBV-LCL" или "клеточная линия EBV-LCL" относится к трансформированной лимфоцитами непрерывной линии вируса Эпштейна-Барра (EBV-LCL) (DMKoelle et al., J Clin Invest, 1993: 91: 961-968), которая представляет собой В-клеточную линию, которая получается путем заражения В-клеток человека вирусом Эпштейна-Барра в пробирке. Клетки EBV-LCL могут быть непосредственно подготовлены и использованы в общей лаборатории методом добавления циклоспорина А в процессе заражения EBV в PBMC. В некоторых воплощениях изобретения клетку EBV-LCL можно получить с помощью следующих этапов. 30×10⁶ PBMC добавляют к 9 мл культуральной среды, смесь добавляют в культуральную колбу Т25, а затем добавляют 9 мл супернатанта EBV. Добавляют 80 мкл циклоспорина А (50 мкг/мл), а затем культивируют при 37°С. Через 7 дней из культуры удаляют половину супернатанта, добавляют свежую питательную среду, а затем добавляют 40 мкл циклоспорина А. Тот самый процесс можно повторять один раз в 7 дней до 28 дней культивирования. Клеточная линия может быть пригодной для использования через 28 дней культивирования, и с этого времени клеточная линия может культивироваться в культуральной среде без добавления циклоспорина А.

[0058] Клетки Jurkat и EBV-LCL могут использоваться как питающие клетки после облучения.

[0059] В некоторых воплощениях изобретения облученные клетки Jurkat и облученные клетки EBV-LCL могут использоваться при количественном соотношении 1:0,1-5, 1:0,1-4, 1:0,1-3, 1:0,1- 2, 1:0,1-1,5, 1:0,5-1,5, 1:0,75-1,25, 0,1-5:1, 0,1-4:1,0 , 1-3:1,0, 1-2:1, 0,1-1,5:1, 0,5-1,5:1 или 0,75-1,25:1. Например, облученные клетки Jurkat и облученные клетки EBV-LCL могут использоваться при количественном соотношении 1:1.

[0060] В некоторых воплощениях изобретения облученные клетки Jurkat и облученные клетки EBV-LCL могут быть получены обработкой с облучением 50-500, 50-400, 50-300, 50-200, 50-150, 70-130, 80-120 или 90-110 Гр. Например, облученные клетки Jurkat и/или облученные клетки EBV-LCL могут быть получены обработкой клеток Jurkat и/или клеток EBV-LCL с облучением 100 Гр.

[0061] В некоторых вариантах изобретения культивирование может проводиться в течение 1-50, 1-42, 1-40, 1-35, 1-20, 1-19, 1-18, 1-17, 1-16, 1-15 или 1-14 дней.

[[0062] В некоторых вариантах осуществления изобретения этап культивирования может дополнительно включать следующие этапы: совместное культивирование с питающими клетками и первым цитокином ("первый этап культивирования") и дальнейшее совместное культивирование после добавления второго цитокина ("второй этап культивирования")

[0063] Второй этап культивирования может включать одно добавление второго цитокина или несколько его добавлений между 0-6 днем культивирования. Например, второй этап культивирования может включать добавление второго цитокина один раз на каждый день 0 и день 3 культивирования.

[0064] Второй этап культивирования может включать добавление второго цитокина и питающих клеток в течение первых 6 дней 14-дневного цикла культивирования. Например, второй этап культивирования может включать добавление питающих клеток в течение 14-дневного цикла и добавление второго цитокина на 3 и 6 день каждого цикла один раз в день.

[0065] В некоторых воплощениях изобретения первым цитокином может быть IL-2. В некоторых вариантах осуществления изобретения вторым цитокином может быть IL-21. В некоторых вариантах осуществления изобретения второй цитокин может быть использован в концентрации 10-1000, 10-500, 10-100, 20-100, 30-100, 40-100, 50-100 или 10-50 нг/мл. В некоторых воплощениях изобретения культивирование с добавлением второго цитокина один или несколько раз в сутки 0-6 может проявлять замечательную пролиферацию и/или противораковую активность. В некоторых вариантах изобретения культивирование с добавлением питающих клеток и второго цитокина в течение шести дней в 14-дневном цикле может проявлять высокую пролиферацию и/или противораковую активность.

[0066] В некоторых вариантах осуществления изобретения совместное культивирование может осуществляться путем включения мононуклеарных клеток периферической крови и питающих клеток (например, клеток Jurkat и клеток EBV-LCL) при соотношении 1:1-100, 1:1-90, 1:1- 80, 1:1-70, 1:10-65, 1:20-65, 1:30-65, 1:40-65, 1:50-65 или 1:55-65.

[0067] Совместное культивирование можно проводить в среде, и любая подходящая среда, обычно используемая для индукции и пролиферации мононуклеарных клеток периферической крови в NK-клетки, может быть использована без ограничения как такуя среда. Например, как такая среда может быть использована среда RPMI-1640, DMEM, x-vivo10, x-vivo20 или SCGM Cellgro. Кроме того, условия культивирования, такие как температура, могут соответствовать любым соответствующим условиям культивирования мононуклеарных клеток периферической крови, известным в данной области техники.

[0068] В некоторых вариантах осуществления изобретения в продуцируемых NK-клетках соотношение или чистота NK-клеток CD56+ может составлять 85% или более, 90% или более, или 95% или более, или 98% или более относительно всех клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения в пределах произведенных NK-клеток соотношение Т-клеток ко всем клеткам может составлять 15% или менее, 10% или менее, 5% или меньше, 2% или меньше, 1% или меньше.

Клеточная терапевтическая композиция для лечения рака

[0069] Согласно некоторым воплощениям изобретения клеточная терапевтическая композиция для лечения рака может содержать клетки NK CD56+, полученные из периферической крови, и цитокин.

[0070] В этом документе термин "полученные из периферической крови" может означать, что клетки происходят из "цельной крови периферической крови" или "лейкоцитов, выделенных из периферической крови с помощью лейкафереза". Клетки NK CD56+, происходящие из периферической крови, могут использоваться как взаимозаменяемые с NK CD56+, полученными из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC).

[0071] В некоторых воплощениях цитокин может использоваться в концентрации 18-180000, 20-100000, 50-50000, 50-1000, 50-900, 50-800, 50-700, 50-600, 50 550, 100-550, 150-550, 200-550, 250-550, 300-550, 350-550, 400-550, 450-550 МЕ/мл. Когда цитокин используется в этих диапазонах, он может подавлять апоптоз NK-клеток, входящих в состав лечения рака, и повышать противораковую активность NK-клеток.

[0072] В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция может содержать IL-2 как цитокин.

[0073] В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки NK CD56+ могут быть получены, как описано в другом месте в этом документе. Например, NK-клетки CD56+ могут быть получены путем совместного культивирования с питающими клетками (например, облученными клетками Jurkat и облученными клетками EBV-LCL). В некоторых воплощениях изобретения соотношение NK-клеток CD56+ ко всем клеткам (чистота) может составлять 85% или более, 90% или более, 95% или более, или 98% или более.

[0074] В некоторых воплощениях изобретения рак может быть раком крови, раком желудка, поджелудочной железы, холангиокарциномой, раком толстой кишки, раком молочной железы, раком печени, раком яичников, раком легких, раком почек, раком простаты или нейробластомой, но не ограничиваться ими .

[0075] В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция может не включать Т-клетки или может включать только следовое количество Т-клеток. Например, соотношение Т-клеток ко всем клеткам в композиции может быть менее 15%, менее 10%, менее 5%, менее 2%, менее 1% или меньше.

[0076] В этом документе термин "Т-клетка" относится к лимфоцитам, полученным из тимуса, которые могут «запоминать» ранее встреченные антигены и предоставлять информацию В-клеткам, тем самым облегчая выработку антител и играя важную роль в клеточной иммунной системе. Поскольку эти Т-клетки могут различать очень незначительные различия между разными антигенами, чтобы вызвать иммунный ответ на аллогенные антигены, аутологическая терапия возможна, но для аллогенной терапии могут существовать ограничения. Соответственно, клеточная терапевтическая композиция без Т-клеток может быть пригодной для аллотрансплантации.

[0077] В этом документе термин "клеточное терапевтическое средство" относится к лекарственному средству, используемому для лечения, диагностики и профилактики с помощью ряда действий, таких как пролиферация и скрининг аутологичных, аллогенных и ксеногенных живых клеток in vitro для восстановления функций клеток и тканей или изменения биологических характеристик клеток другими методами. Клеточные терапевтические средства регулировались как лекарственные средства с 1993 года в США и с 2002 года в Корее. Эти клеточные терапевтические агенты можно в основном классифицировать по двум отраслям, это, во-первых, терапевтические средства для стволовых клеток для регенерации тканей или восстановления функций органов, а во-вторых, терапевтические средства для иммунных клеток для регуляции иммунного ответа, такого как угнетение иммунного ответа или усиление иммунного ответа in vivo.

[0078] Описанный в данном документе способ введения клеточных терапевтических композиций может осуществляться любым подходящим путем до тех пор, пока композиция не достигнет ткани-мишени. Введение может быть парентеральным введением, например, внутрибрюшинным введением, внутривенным введением, внутримышечным введением, подкожным введением или внутрикожным введением, но не ограничивается ими.

[0079] Клеточная терапевтическая композиция, описанная в этом документе, может быть составлена в соответствующей форме вместе с фармацевтически приемлемым носителем, пригодным или, как правило, применяемым для клеточной терапии. Термин "фармацевтически приемлемая" относится к композиции, которая является физиологически приемлемой и, как правило, не вызывает аллергической реакции, такой как желудочно-кишечные расстройства, головокружение и т.д., или подобные реакции на них при введении в организм человека. Фармацевтически приемлемый носитель может включать, например, парентеральное введение носителей, таких как вода, соответствующие масла, физиологический раствор, водная глюкоза и гликоль и т.д., а также дополнительно включать стабилизаторы и консерванты. Соответствующий стабилизатор включает антиоксидант, такой как гидросульфит натрия, сульфит натрия или аскорбиновая кислота, сахароза, альбумин и др. Соответствующий консервант включает ДМСО, глицерин, этиленгликоль, сахарозу, трегалозу, декстрозу, поливинилпирролидон и тому подобное.

[0080] Клеточная терапевтическая композиция может также вводиться любым устройством, в котором клеточный терапевтический агент может двигаться к клетке-мишени.

[0081] Клеточная терапевтическая композиция может содержать терапевтически эффективное количество клеточного терапевтического агента для лечения заболеваний. Термин "терапевтически эффективное количество" означает количество активного ингредиента или клеточной терапевтической композиции, которая вызывает биологические или медицинские реакции в тканевых системах, животных или людях, которые рассматриваются исследователями, ветеринарами, врачами или другими клиницистами, и включает количество стимулирующих облегчения симптомов заболеваний или расстройств, подлежащих лечению. Для специалистов в данной области будет очевидно, что клеточный терапевтический агент, входящий в клеточную терапевтическую композицию, может быть изменен в соответствии с желаемым эффектом. Итак, оптимальное содержание клеточного терапевтического агента может быть легко определено специалистами в данной области и может быть скорректировано по различным факторам, включая тип заболевания, тяжесть заболевания, содержание других ингредиентов, содержащихся в композиции, тип рецептуры, возраст, вес, общее состояние здоров’я, пол и диета пациента, время введения, способ введения, коэффициент секреции композиции, период лечения и одновременно используемые препараты. Важно включить количество, способное получить максимальный эффект минимальным количеством без побочных эффектов, учитывая все факторы. Например, клеточная терапевтическая композиция может содержать клеточный терапевтический агент в количестве от 1×10⁶ до 5×10⁸ клеток на кг веса.

Способ профилактики или лечения рака

[0082] Далее, согласно другому аспекту изобретения предлагается способ профилактики или лечения рака, который включает введение терапевтической композиции клеток против рака, содержит природные клетки-киллеры CD56+, полученные из периферической крови, и цитокины, субъекту. Термин "субъект" относится к млекопитающему, которое является субъектом для лечения, наблюдения или тестирования, и преимущественно человека. Субъект может быть больным раком крови, раком желудка, поджелудочной железы, холангиокарциномой, раком толстой кишки, раком молочной железы, раком печени, раком яичников, раком легких, раком почек, раком простаты или нейробластомой, но не ограничиваться этим.

[0083] В некоторых воплощениях изобретения, в случае взрослого человека, клеточная терапевтическая композиция может вводиться от одного до нескольких раз в день. Клеточную терапевтическую композицию можно вводить ежедневно или с интервалом 2-180 дней. Клеточный терапевтический агент, входящий в композицию, может содержать от 1×10⁶ до 1×10¹¹ природных клеток-киллеров CD56+, полученных из периферической крови, например, приблизительно от 1×10⁶ до 1×10⁸ NK-клеток на кг массы тела. В некоторых вариантах осуществления изобретения природные клетки-киллеры CD56+, полученные из периферической крови, в клеточной терапевтической композиции имеют по меньшей мере приблизительно 90% чистоты. В некоторых вариантах осуществления изобретения цитокин представляет собой IL-2 в концентрации приблизительно от 50 до 50000 МЕ/мл.

[0084] В некоторых вариантах осуществления изобретения клеточную терапевтическую композицию согласно этому изобретению можно вводить любым подходящим способом, таким как введение через ректальный, внутривенный, внутриартериальный, внутрибрюшной, внутримышечный, интрастернальный, чрескожный, местный, внутриглазной или внутрикожный путь. В некоторых вариантах осуществления изобретения NK-клетки, входящие в композицию, могут быть аллогенными, то есть полученными от человека, отличного от субъекта, который лечится. В некоторых вариантах осуществления изобретения человек может быть нормальным человеком или больным раком. В некоторых вариантах осуществления изобретения NK-клетки, входящие в композицию, могут быть аутологичными, то есть полученными от субъекта, который лечится.

[0085] В некоторых воплощенияхизобретения NK-клетки, раскрытые в этом документе, и клеточная терапевтическая композиция, содержащая NK-клетки, раскрытые в этом документе, могут быть использованы для лечения заболевания или состояния, отличного от рака. Сообщалось, что NK-клетки играют важную роль в регуляции иммунной системы, например, регулируя Т-клетки, таким образом клеточная терапевтическая композиция, содержащая NK-клетки, может вводиться для лечения состояний, связанных с иммунной системой. Например, клеточная терапевтическая композиция может вводиться для лечения нейродегенеративных расстройств (например, болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона) или аутоиммунных заболеваний (например, ревматоидного артрита, рассеянного склероза, псориаза, спондилоартропатий, SLE, синдрома Шегрена, системного склероза).

Положительные эффекты

[0086] Особенности и преимущества этого изобретения обобщены следующим образом:

[0087] (а) Изобретение относится к способу получения природных клеток-киллеров.

[0088] (b) В соответствии со способом получения природных клеток-киллеров, поскольку природные клетки-киллеры высокой чистоты, из которых удалены Т-клетки и т.п., могут быть получены без использования различных дорогих цитокинов, можно усилить эффект профилактики и лечения рака, в частности, аллогенной терапии с использованием природных клеток-киллеров.

[0089] (c) Изобретение относится к клеточной терапевтической композиции против рака, содержащий клетки NK CD56+ периферической крови и цитокины.

[0090] (d) Композиция согласно этому изобретению содержит природные клетки-киллеры высокой чистоты с минимальным содержанием (например, менее чем приблизительно 1 %) Т-клеток, и, следовательно, композиция может быть эффективно использована для аллогенной терапии, а также аутологичной терапии.

ПРИМЕРЫ

[0091] Следующие примеры приводятся для иллюстрации определенных конкретных особенностей и/или вариантов осуществления изобретения. Эти примеры не следует толковать как ограничение раскрытия конкретными описанными признаками или вариантами осуществления.

Пример 1. Получение природных клеток-киллеров (NK) CD56+

[0092] Клетки CD56+ и клетки CD3-/CD56+ были выделены из РВМС следующим методом. Сначала РВМС выделяли из крови методом градиента плотности фиколла-гипака, а затем подсчитывали клетки.

Пример 1-1. Приготовление для получения клеток CD56+

[0093] К подсчитанным PBMC добавляли буфер MACS (1x PBS + 0,5% HSA) и суспендировали, и с микросферами CD56 (Miltenyi Biotec) добавляли к 1-20 мкл 1,0×10⁷ PBMC, а затем инкубировали при 2-8°C в течение 5-30 минут. После инкубации добавляли буфер MACS и перемешивали, а затем смесь центрифугировали (600 x г) для осаждения клеток. После центрифугирования супернатант удаляли, а клетки суспендировали, добавляя буфер MACS, и добавляли в колонку, соединенную с сепаратором MACS. Буфер MACS пропускали через колонку для удаления неспецифического связывания. Колонку отделяли от сепаратора MACS и переносили в коническую колбу объемом 15 мл, а затем добавляли буфер MACS для выделения клеток CD56+, присоединенных к колонке.

Пример 1-2. Приготовление для получения клеток CD3-/CD56+

[0094] К подсчитанным PBMC добавляли буфер MACS (1x PBS ± 0,5% HSA) и суспендировали, и с микросферами CD3 (Miltenyi Biotec) добавляли к 1-20 мкл 1,0×10⁷ PBMC, а затем инкубировали при 2-8ºС в течение 5-30 минут. После инкубации добавляли буфер MACS и перемешивали, а затем смесь центрифугировали (600 x г) для осаждения клеток. После центрифугирования супернатант удаляли, а клетки суспендировали, добавляя буфер MACS, и добавляли в колонку, соединенную с сепаратором MACS. Буфер MACS пропускали через колонку для сбора CD3-клеток. К собранным CD3-клеткам добавляли буфер MACS (1х PBS + 0,5% HSA) и суспендировали, а также добавляли микросферы CD56 (Miltenyi Biotec), чтобы достичь концентрации от 1 до 20 мкл 1,0×10⁷ CD3-клеток, а затем инкубировали при 2-8ºС течение 5-30 минут. После инкубации добавляли буфер MACS и перемешивали, а затем смесь центрифугировали (600 x г) для осаждения клеток. После центрифугирования супернатант удаляли, а клетки суспендировали, добавляя буфер MACS, и добавляли в колонку, соединенную с сепаратором MACS. Буфер MACS пропускали через колонку для удаления неспецифического связывания. Колонку отделяли от сепаратора MACS и переносили в коническую колбу объемом 15 мл, а затем добавляли буфер MACS для выделения клеток CD3-/CD56+, присоединенных к колонке.

Пример 1-3. Получение NK-клеток с использованием клеток CD56+ и CD3-/CD56+

[0095] Клетки CD56+ или клетки CD3-/CD56+, выделенные из РВМС, как в Примерах 1-1 и 1-2, добавляли в среду RPMI-1640, содержащую 10% FBS, добавленную с IL-2 в концентрации 500 МЕ/мл вместе с подготовленной комбинацией питающих клеток (клеток Jurkat и EBV-LCL), облученных излучением 100 Гр, а затем совместно культивировали в инкубаторе при 37°C и в атмосфере 5% CO₂. Соотношение (клетки CD56+ и/или клетки CD3-/CD56+):( клетки Jurkat):( клеток EBV-LCL) составляло приблизительно 1:30:30.

[0096] Тем временем клетки Jurkat можно получить из ATCC (ATCC TIB-152), а клетки EBV-LCL готовили следующим методом: 30×10⁶ PBMC добавляли в 9 мл культуральной среды, смесь переносили в культуральную колбу Т25, а затем добавляли 9 м супернатанта EBV. Добавляли 80 мкл циклоспорина А, а затем культивировали при 37°С. Через 7 дней культивирования удаляли половину супернатанта, добавляли свежую культуральную среду, а затем добавляли 40 мкл циклоспорина А. Тот же процесс, что и на 7-й день, повторяли один раз в 7 дней в течение 28 дней культивирования. Клеточная линия была пригодной для использования через 28 дней культивирования, и с этого времени клеточную линию культивировали в культуральной среде без добавления циклоспорина А.

Пример 2. Производство клеток природного киллера (NK) CD56+ (обработанных IL-2/IL-21)

[0097] NK-клетки получали, используя тот же способ, что описан в Примере 1 (1-1-1-3), за исключением добавления IL-2 (500 МЕ/мл) и IL-21 (50 нг/мл) вместо IL-2 (500 МЕ/мл).

Сравнительный пример 1. Производство клеток природных киллеров (NK) без этапа выделения клеток CD56+ (обработанных IL-2)

[0098] PBMC выделяли из крови с помощью метода градиента плотности фиколла-гипака. PBMC добавляли в среду RPMI-1640, содержащую 10% FBS, добавленной с IL-2 в концентрации 500 МЕ/мл, вместе с подготовленными питающими клетками (клетки Jurkat и клетки EBV-LCL), облученными излучением 100 Гр, а затем культивировали в инкубаторе при 37ºС и в атмосфере 5% СО₂.

Сравнительный пример 2. Производство клеток природных киллеров (NK) без этапа выделения клеток CD56+ (обработанных IL-2 / IL-21)

[0099] Клетки NK получали, используя тот же метод, что был в Сравнительном примере 1, за исключением добавления IL-2 (500 МЕ/мл) и IL-21 (50 нг/мл) вместо IL-2 (500 МЕ/мл ).

Сравнительные примеры 3 и 4. Производство клеток природных киллеров (NK) без этапа выделения клеток CD56+

[0100] NK-клетки получали, используя подобные методы Сравнительных примеров 1 и 2, соответственно, за исключением того, что соотношение PBMC:(клетки Jurkat):(клетки EBV-LCL) составляло 1:0,5:0,5.

Экспериментальный пример 1. Подтверждение пролиферативной способности NK-клеток

[0101] По каждой из NK-клеток, культивируемых в инкубаторе с CO₂ согласно Примерами 1, 2 и Сравнительным примерам 1, 2, на 6 день культивирования в культуральной колбе T25 клетки переносили в мешок обьемом 350 мл, исходя из концентрации 1,0×10⁵ - 2,0×10⁶ клеток/мл, и дополнительно культивировали в течение 4 дней. На 10 день культивирования клетки переносили в мешок объемом 1 л, исходя из концентрации 1,0×10⁵ - 2,0×10⁶ клеток/мл, а затем культивировали в течение 4 дней. Наконец, на 14 день культивирования клетки переносили в мешок объемом 1 л, исходя из концентрации 1,0×10⁵ - 2,0×10⁶ клеток/мл, а затем культивировали в течение 3-6 дней.

[0102] Фиг. 1А иллюстрирует увеличение в несколько раз NK-клеток при культивировании. Как проиллюстрировано на Фиг. 1А и в Таблице 1 ниже, NK-клетки CD56+ (CD56+ и CD3-/CD56+) Примера 1 пролиферировали 2675 и 1903 раза соответственно на 17-й день по сравнению с Днем 0, тогда как клетки PBMC Сравнительного примера 1 пролиферировали 1768 раз в 17-тый день по сравнению с Днем 0.

Таблица 1

	Кратность размножения
День 0	День 6	День 10	День 14	День 17
PBMC	1	2	52	608	1768
CD56+	1	8	188	1311	2675
CD3-/CD56+	1	6	142	966	1903

[0103] Фиг. 1В иллюстрирует кратность увеличения и уровень удвоения популяции (PDL) клеток NK. Далее, как проиллюстрировано на Фиг. 1B, PBMC из Сравнительного примера 1 (PBMC без IL-21) и Сравнительного примера 2 (PBMC без IL-21) пролиферировали соответственно 243 и 1248 раз по сравнению с Днем 0, тогда как клетки NK CD56+ из Примера 1 (CD56 без IL-21 ) и из Примера 2 (CD56 без IL-21) пролиферировали соответственно 2990 и 20434 раза по сравнению с Днем 0.

Экспериментальный пример 2. Подтверждение чистоты NK-клеток CD56+

[0104] NK-клетки из Примеров 1, 2 и Сравнительных примеров 1, 2 промывали один раз окрасочным буфером FACS и суспендировали в 100 мкл, а затем відерживали при температуре от 2 до 8 °С в течение 20-30 минут в темноте после смешивания с моноклональным антителом, связывающимся с флуоресценцией. После одного дополнительного промывания клетки суспендировали в 300-500 мкл красящего буфера FACS, а затем получали и анализировали от 10000 до 100000 клеток на пробирку с помощью панели CD56-FITC/CD3-PE/CD20-PerCP5/CD14-APC проточного цитометра. Чистоту NK-клеток CD56+ определяли как соотношение клеток, введенных в область CD3-/CD56+ после гейтинга FSC/SSC, и дальше было подтверждено, что CD20 и CD14 не экспрессируются в клетках области CD3-/CD56+.

[0105] Как показано на Фиг. 2, чистота NK-клеток из Сравнительного примера 1 (PBMC без IL-21) и Сравнительного примера 2 (PBMC без IL-21) составила 84,2% и 84,7% соответственно, тогда как чистота NK-клеток из Примера 1 ( CD56 без IL-21) и Примера 2 (CD56 без IL-21) составила 98,6% и 99,2% соответственно.

Экспериментальный пример 3. Подтверждение цитотоксичности NK-клеток касательно раковых клеток

[0106] Во-первых, подтверждена цитотоксичность против клеток K562 (рак крови, ATCC® CCL-243 ™), хроническая клеточная линия миелолейкоза.

[0107] Перед использованием в эксперименте клетки K562 готовили путем культивирования клеток K562, взвешенных в среде RPMI-1640, содержащей 10% FBS, при 37 ± 1°C с интервалом в три дня в течение 7 дней или более.

[0108] Подготовленные клетки K562 суспендировали в среде RPMI-1640 в концентрации 1,0×10⁶ клеток/мл и добавляли флуоресцентный материал (кальцеин-АМ) при концентрации 4 мкм. Клетки K562 красили при 37±1°C в течение 30 минут, а затем инвертировали с интервалом в десять минут. Клетки K562, окрашенные флуоресцентным материалом, центрифугировали при 3300 об/мин в течение 3 минут, трижды промывали, а затем суспендировали в среде SNK, содержащей 10% FBS, в количестве 1,0×10⁶ клеток/мл. Клетки K562 переносили в круглодонный микропланшет (96 лунок) в количестве 1,0×10⁴ клеток на лунку.

[0109] NK-клетки из Экспериментального примера 1 (эффекторные клетки) на 14-20 день культивирования суспендировали и разбавляли в среде RPMI-1640, содержащей 10% FBS, в количестве 1,0×106 клеток/мл, 3,0×105 клеток/мл, 1,0×105 клеток/мл и 0,5×105 клеток/мл соответственно.

[0110] Разведенные эффекторные клетки переносили в планшет, инокулированный клетками-мишенями (клетками К562), при количестве 100 мкл на лунку в трех повторностях (трипликация) соответственно. В этом случае соотношение эффекторных клеток и клеток-мишеней показано в Таблице 2 ниже.

Таблица 2

Эффектор : Мишень	Эффекторные клетки	Клетки-мишени
10 : 1	1,0×105	1,0×104
3 : 1	3,0×104	1,0×104
1: 1	1,0×104	1,0×104
0,5 : 1	0,5×104	1,0×104

[0111] Конструкция пластины, используемой в этом эксперименте, показана на Фиг. 3, к негативной контрольной группе (Спонтанная) добавляли окрашенные флуоресценцией живые клетки K562, а в положительной контрольной группе (Максимальное высвобождение) K562 были полностью убиты с помощью TX-100 и демонстрировали максимальную флуоресценцию.

[0112] Планшет, инокулированный клетками-мишенями и эффекторными клетками, центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 минут, культивировали при 37±1 °C в течение 3-4 часов, а затем снова центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 минут. После центрифугирования 80 мкл супернатанта переносили в темный планшет (на 96 лунок), а затем измеряли количество флуоресценции с помощью флуоресцентного считывателя микропланшетов и рассчитывали цитотоксичность касательно раковых клеток, используя Уравнение 1 ниже.

Уравнение 1

Цитотоксичность = (Тестовое высвобождение - Спонтанное высвобождение) / (Максимальное высвобождение - Спонтанное высвобождение) × 100

[0113] Фиг. 4А и Таблица 3 ниже показывают % лизиса клеток К562 при различном соотношении Е:Т. Как проиллюстрировано на Фиг. 4А и в Таблице 3 ниже, сравнительно со Сравнительным примером 3 (PBMC без IL-21) и Сравнительным примером 4 (PBMC без IL-21) клетки CD56+, культивируемые согласно Примеру 1 (CD56+ без IL-21) и Примеру 2 ( CD56+ с IL-21), проявляли высокую противораковую активность.

Таблица 3

	% лизиса
E:T (10:1)	E:T (3:1)	E:T (1:1)	E:T (0,5:1)
PBMC(W/O IL-21)	97,5	94,6	75,3	60,0
PBMC(W/ IL-21)	102,3	97,1	84,8	66,9
CD56+(W/O IL-21)	103,3	99,9	83,8	67,4
CD56+(W/ IL-21)	102,9	100,7	87,7	80,0

[0114] Далее подтверждается цитотоксичность против солидных опухолевых клеток, которые, как известно, имеют большую толерантность к NK-клеткам. AGS (рак желудка, ATCC® CRL-1739™), A549 (рак легких, ATCC® CRL-185™) и MDA-MB0231 (рак молочной железы, ATCC® HTB-26™) использовали как клеточные линии солидной опухоли.

[0115] Каждую клетку солидной опухоли метили зеленым флуоресцентным маркером, используя длительный индикаторный набор CYTO-ID® Green (Enzo Life Sciences Inc.), переносили на планшет и культивировали в течение 24 часов. На следующий день NK-клетки и раковые клетки реагировали в течение 48 часов в соотношении 0,5:1. Через 48 часов цитотоксичность подтверждали измерением количества клеток, проявляющих зеленую флуоресценцию, с помощью проточного цитометра.

[0116] Как показано на Фиг. 4B по сравнению со Сравнительным примером 1 (PBMC без IL-21) и Сравнительным примером 2 (PBMC без IL-21), клетки CD56+, культивируемые согласно Примеру 1 (CD56+ без IL-21) и Примеру 2 (CD56+w/IL-21), проявляли высокую противораковую активность.

Экспериментальный пример 4. Сравнение пролиферативной способности NK-клеток в зависимости от времени и количества обработок IL-21

[0117] Для оценки пролиферативной способности NK-клеток в зависимости от времени и количества обработок IL-21 были проведены эксперименты, как указано ниже.

[0118] NK-клетки CD56+ производили по методу Примера 1, но обрабатывали IL-21 (50 нг/мл) в течение 0-6-го дня (группа D0-6), 6-10-го дня (группа D6-10 ), 10-14-го дня (группа D10-14) или 14-17-го дня (группа D-14-17), пролиферативную способность NK-клеток CD56+ сравнивали, используя метод согласно Экспериментальному примеру 1.

[0119] NK-клетки обрабатывали IL-21: для группы D0-6 - дважды в день 0 и 3; для группы D6-10 - один раз в день 6; для группы D10-14 - один раз в день 10; для группы D14-17 - один раз в день 14. Для контрольной группы клетки NK не обрабатывали IL-21.

[0120] Как показано на Фиг. 5А и в Таблице 4, группы D10-14 и D14-17 не проявляли значительной разницы в пролиферативной способности по сравнению с контрольной группой, тогда как группа D0-6 и группа D6-10 проявляли повышенную способность к пролиферации по сравнению с контрольной группой. Особенно, группа D0-6 демонстрировала большой прирост в размножении.

Таблица 4

	Кратность размножения
контроль	D0-6	D6-10	D10-14	D14-17
Донор 1	2996	21859	6388	2894	2330

[0121] Для оценки пролиферативной способности NK-клеток в зависимости от количества обработок IL-21 были проведены эксперименты, описанные ниже.

[0122] Клетки NK CD56+ получали по методу Примера 1, но обрабатывали IL-21 (50 нг/мл) в течение 0-3 дня (группа D0-3), 3-6 дня (группа D3-6), или 0- 6 день (группа D0-6), пролиферативную способность NK-клеток CD56+ сравнивали, используя метод согласно Экспериментальному примеру 1.

[0123] NK-клетки обрабатывали IL-21: для группы D0-3 - один раз в день 0; для группы D3-6 - один раз в день 3; для группы D0-6 - дважды в день 0 и 3. Для контрольной группы клетки NK не обрабатывали IL-21.

[0124] Как показано на Фиг. 5В и в Таблице 5, каждая группа, которая обрабатывалась IL-21 на предыдущей стадии культивирования, демонстрировала увеличенную кратность размножения по сравнению с контрольной группой. Особенно, группа D0-6 демонстрировала наибольший прирост размножения.

Таблица 5

	Кратность размножения
контроль	D0-3	D3-6	D0-6
Донор 1	2996	16420	4360	21859

Экспериментальный пример 5. Сравнение пролиферативной способности NK-клеток в зависимости от концентрации обработки IL-21

[0125] Клетки NK CD56+ получали по методу Примера 1, но дважды обрабатывали IL-21 с концентрацией 0 нг/мл, 10 нг/мл, 30 нг/мл, 50 нг/мл или 100 нг/мл, пролиферативную способность NK- клеток CD56+ сравнивали, используя метод согласно Экспериментальному примеру 1.

[0126] Как показано на Фиг. 6, даже при обработке IL-21 с концентрацией 10 нг/мл, NK-клетки демонстрировали большую кратность размножения по сравнению с NK-клетками без обработки IL-21, и кратность размножения NK-клеток увеличивалось с увеличением концентрации IL-21, увеличиваясь между 10 нг/мл и 50 нг/мл. Однако при обработке IL-21 с концентрацией 100 нг/мл NK-клетки не проявляли значительной разницы в размножении по сравнению с NK-клетками, обработанными IL-21 с концентрацией 50 нг/мл.

Экспериментальный пример 6. Сравнение цитотоксичности NK-клеток в зависимости от времени и количества обработок IL-21

[0127] Для оценки цитотоксичности NK-клеток против раковых клеток взависимости от времени и количества обработок IL-21 были проведены эксперименты, описанные ниже.

[0128] NK-клетки CD56+ производили по методу Примера 1, но обрабатывали IL-21 (50 нг/мл) в течение 0-6-го дня (группа D0-6), 6-10-го дня (группа D6-10 ), 10-14-го дня (группа D10-14) или 14-17-го дня (группа D-14-17), цитотоксичность клеток NK CD56+ против клеток рака крови (клетки K562, CCL-243 ™) сравнивали с помощью способа согласно Экспериментальному примеру 3.

[0129] NK-клетки обрабатывали IL-21: для группы D0-6 - дважды в день 0 и 3; для группы D6-10 - один раз в день 6; для группы D10-14 - один раз в день 10; для группы D14-17 - один раз в день 14. Для контрольной группы клетки NK не обрабатывали IL-21.

[0130] Как показано на Фиг. 7А и в Таблице 6, все группы NK-клеток, которые обрабатывались IL-21, кроме группы D14-17, проявляли большую противораковую активность по сравнению с контрольной группой.

Таблица 6

	соотношение E:T
10:1	3:1	1:1	0.5:1
Контроль (не обраб.)	98,8	96,9	73,1	55,1
D0-6	98,6	97,0	77,8	68,4
D6-10	96,78	99,1	80,3	69,8
D10-14	98,4	96,6	68,5	52,4
D14-17	104,5	98,8	79,1	68,8

[0131] Далее, для каждой из полученных групп клеток NK CD56+ цитотоксичность клеток NK CD56+ против клеток солидной опухоли сравнивали, используя метод согласно Экспериментальному Примеру 3. AGS (рак желудка, ATCC® CRL-1739™), A549 (рак легких, ATCC® CRL-185™) и MDA-MB0231 (рак молочной железы, ATCC® HTB-26™) использовали как клеточные линии солидных опухолей.

[0132] Как показано на Фиг. 7B, NK-клетки, обработанные IL-21 во время предыдущей стадии культивирования (группа D0-6), проявляли наибольшую противораковую активность в отношении всех трех типов клеток солидных опухолей.

[0133] Для оценки цитотоксичности NK-клеток в зависимости от количества обработок IL-21 были проведены эксперименты, как указано ниже.

[0134] NK-клетки CD56+ производили по методу Примера 1, но обрабатывали IL-21 (50 нг/мл) в течение 0-3-го дня (группа D0-3), 3-6-го дня (группа D3-6 ) или 0-6-го дня (группа D0-6), цитотоксичность клеток NK CD56+ против клеток солидных опухолей сравнивали, используя метод согласно Экспериментальному примеру 3. AGS (рак желудка, ATCC® CRL-1739 ™), A549 (рак легких, ATCC® CRL-185™) и MDA-MB0231 (рак молочной железы, ATCC® HTB-26™) использовали как клеточные линии солидных опухоли.

[0135] NK-клетки обрабатывали IL-21: для группы D0-3 - один раз в день 0; для группы D3-6 - один раз в день 3; для группы D0-6 - дважды в день 0 и 3. Для контрольной группы клетки NK не обрабатывали IL-21.

[0136] Как показано на Фиг. 7C, каждая группа, обработанная IL-21 на предыдущих этапах культивирования, проявляла большую противораковую активность по сравнению с контрольной группой.

Экспериментальный пример 7. Сравнение цитотоксичности NK-клеток в зависимости от концентрации обработки IL-21

[0137] Клетки NK CD56+ получали по методу Примера 1, но дважды обрабатывали IL-21 с концентрацией 0 нг/мл, 10 нг/мл, 30 нг/мл, 50 нг/мл или 100 нг/мл, цитотоксичность клеток NK CD56+ против клеток рака крови (клетки K562, CCL-243™) сравнивали, используя метод согласно Экспериментальному примеру 3.

[0138] Как показано на Фиг. 8А, большинство NK-клеток, обработанных IL-21, проявляли большую цитотоксичность по сравнению с NK-клетками, не оброботанными IL-21, при обработке IL-21 с концентрацией 100 нг/мл NK-клетки не проявляли существенной разницы в размножении по сравнению с NK-клетками, не обработанными IL-21.

[0139] NK-клетки CD56+ получали по методу Примера 1, но дважды обрабатывали IL-21 с концентрацией 0 нг/мл, 10 нг/мл, 30 нг/мл, 50 нг/мл или 100 нг/мл, цитотоксичность клеток NK CD56+ против клеток солидной опухоли (клетки K562, CCL-243™) сравнивали, используя метод согласно Экспериментальному примеру 3. AGS (рак желудка, ATCC® CRL-1739™), A549 (рак легких, ATCC® CRL-185™) и MDA-MB0231 (рак молочной железы, ATCC® HTB-26™) использовали как клеточные линии солидных опухолей.

[0140] Как показано на Фиг. 8B, NK-клетки, обработанные IL-21 с концентрацией 50 нг/мл, проявляли наибольшую противораковую активность.

Экспериментальный пример 8. Сравнение пролиферативной активности NK-клеток в зависимости от количества обработок питающими клетками

[0141] Чтобы проанализировать, многократная обработка питающими клетками поддерживать пролиферацию NK-клеток, NK-клетки во время культивирования обрабатывали питающими клетками в интервале 14 дней, а размножение NK-клеток контролировали в течение 42 дней.

[0142] Для дальнейшего анализа увеличения размножения NK-клеток в зависимости от обработки IL-21, NK-клетки обрабатывали IL-21 (50 нг/мл) дважды через 3 дня, в течение шести дней от каждой обработки питающими клетками (0-6, 14 20, 28-34 день).

[0143] Как показано на Фиг. 9, при обработке питающими клетками дважды или более и IL-21 вместе, NK-клетки демонстрировали существенно увеличенную кратность размножения, а NK-клетки, обработанные IL-21, демонстрировали большую кратность размножения на 42-й день по сравнению с NK-клетками, которые не обрабатывались IL-21 (приблизительно 3,4×10¹⁰ по сравнению с приблизительно 5,3×10⁸).

Экспериментальный пример 9. Подтверждение эффекта культивирования NK-клеток с помощью крови определенных онкологических больных

[0144] NK-клетки CD56+ получали по методу Примера 1 в течение 17 дней, за исключением того, что использовали PBMC больных раком прямой кишки. Пролиферативную способность и чистоту продуцируемых NK-клеток измеряли с помощью методов согласно Экспериментальным примерам 1 и 2.

[0145] Для некоторых групп NK-клетки обрабатывали IL-21 с концентрацией 50 нг/мл дважды (день 0 и день культивирования) для подтверждения эффекта обработки IL-21.

[0146] Как показано на Фиг. 10А, количество NK-клеток, необработанных IL-21, выросло в 8 раз с 0-го дня, тогда как при обработке IL-21 количество NK-клеток выросло в 1461 раз с 0-го дня.

[0147] Далее, как проиллюстрировано на Фиг. 10В, чистота NK-клеток, необработанных IL-21 составляла всего 84,2%, тогда как при обработке IL-21 чистота NK-клеток составила 99,19%.

[0148] Далее, цитотоксичность NK-клеток, обработанных IL-21, и NK-клеток, необработанных IL-21, касательно раковых клеток крови (клетки K562, CCL-243™) сравнивали, используя метод согласно Экспериментальному примеру 3. Как проиллюстрировано на Фиг. 10C, NK-клетки, обработанные IL-21, проявляли большую противораковую активность по сравнению с NK-клетками, не обработанными IL-21.

[0149] Кроме того, для каждой из NK-клеток, обработанных IL-21, и NK-клеток, необработанных IL-21, цитотоксичность NK-клеток в отношении клеток солидной опухоли сравнивали, используя метод согласно Экспериментальному примеру 3. AGS (рак желудка, ATCC® CRL-1739™), A549 (рак легких, ATCC® CRL-185™) и MDA-MB-231 (рак молочной железы, ATCC® HTB-26™) использовали как солидные клеточные линии. Как проиллюстрировано на Фиг. 10D, NK-клетки, обработанные IL-21, проявляли большую противораковую активность по сравнению с NK-клетками, не обработанными IL-21.

[0150] Соответственно, используя методы, изложенные в этом документе, можно получать NK-клетки даже для определенных больных раком, которые обычно не демонстрируют достаточного роста NK-клеток.

Экспериментальный пример 10. Подтверждение уровня выживания NK-клеток в терапевтической композиции

[0151] Касательно каждой из NK-клеток, культивируемых в инкубаторе с CO₂ согласно Примерам 1, 2, на 6-й день культивирования клетки переносили в мешок обьемом 350 мл, исходя из концентрации от 1,0×105 до 2,0×10⁶ клеток/мл, и дополнительно культивировали в течение 4 дней. На 10 день культивирования клетки переносили в мешок объемом 1 л, исходя из концентрации от 1,0×10⁵ до 2,0×10⁶ клеток/мл, а затем культивировали в течение 3-6 дней.

[0152] Клетки NK CD56+ на 14-20-й день культивирования промывали трижды, а затем суспендировали в основном соединении (физиологический раствор и раствор Хартмана), содержащем 1% альбумина, с количеством 2×10⁷ клеток/мл. Клетки хранили при 4°C в течение 48 часов, а затем измеряли уровень выживания клеток.

[0153] Далее, для сравнения влияния IL-2, клетки NK CD56+ промывали и суспендировали в основном составе, содержащем 1% альбумина (физиологический раствор, раствор Хартмана или солевой раствор, забуференный фосфатом), а затем добавляли IL-2 при концентрации 500 МЕ/мл. После выдерживания при температуре 4°С в течение 48 часов измеряли уровень выживания клеток.

[0154] По 100 мкл каждой композиции брали для получения в общей сложности 2×10⁶ клеток NK CD56+, промывали один раз 1 мл буфера для окрашивания FACS, центрифугировали и суспендировали в 100 мкл буфера связывания аннексина V. В суспензию добавляли 5 мкл аннексина V -FITC и 5 мкл 7-AAD (Biolegend) и хорошо перемешивали, хранили в темном месте и реагировали при комнатной температуре в течение 15 минут, а затем добавляли 400 мкл буфера связывания аннексина V перед проточной цитометрией и перемешивали в течение 5 секунд. Затем получили и проанализировали от 10000 до 100000 клеток на пробирку. Порог определяли, устанавливая пробирку, которая не была окрашена аннексином V-FITC и 7-AAD как отрицательный контроль, а уровень выживания был представлен в процентах доли клеток, в которых аннексин V- FITC или 7-AAD были отрицательными.

[0155] Как показано на Фиг. 11, при обработке IL2 (W/IL2) апоптоз NK-клеток CD56+ подавлялся.

Экспериментальный пример 11. Подтверждение цитотоксичности NK-клеток в терапевтической композиции

[0156] Касательно каждой из NK-клеток, культивируемых в инкубаторе с CO₂ согласно Примерами 1, 2, на 6 день культивирования клетки переносили в мешок обьемом 350 мл, исходя из концентрации от 1,0×10⁵ до 2,0×10⁶ клеток/мл и дополнительно культивировали в течение 4 дней. На 10 день культивирования клетки переносили в мешок объемом 1 л, исходя из концентрации от 1,0×10⁵ до 2,0×10⁶ клеток/мл, а затем культивировали в течение 4 дней. Наконец, на 14 день культивирования клетки переносили в мешок объемом 1 л, исходя из концентрации от 1,0×10⁵ до 2,0×10⁶ клеток/мл, а затем культивировали в течение 3-6 дней.

[0157] Перед использованием в эксперименте линии раковых клеток готовили путем суспендирования в следующих условиях и субкультивированием при 37±1ºС с интервалом в три дня в течение 1 недели или более:

[0158] CCRF-SB (рак крови, ATCC® CCL-120™), AGS (рак желудка, ATCC® CRL-1739™) и MIA-PACA2 (рак поджелудочной железы, ATCC® CRL 1420™): среда RPMI + 10% FBS,

[0159] SNU245 (холангиокарцинома, KCLB №00245), HCT15 (рак толстой кишки, ATCC® CCL-225™) и NIH: OVCAR-3 (рак яичников, ATCC® HTB-161™): среда RPMI + 10% FBS + 25 мМ HEPES и

[0160] MDA-MB-231 (рак молочной железы, ATCC® HTB-26™): среда DMEM + 10% FBS.

[0161] Линии раковых клеток (за исключением клеточных линий рака крови) во время культивирования отделяли от культурального сосуда с использованием трипсина и суспендировали в среде до концентрации 5×10⁴ клеток/мл, а затем переносили в 24-луночный планшет по 1 мл на лунку и прикрепляли на одни сутки. Чтобы отличить от NK-клеток, клеточную линию рака крови, представляющую собой взвешенную клеточную культуру, обозначали зеленой флуоресценцией, суспендировали в среде до концентрации 5×10⁴ клеток/мл и переносили в 24-луночный планшет по 1 мл на лунку.

[0162] Во-первых, в 24-луночный планшет, инокулированный AGS (рак желудка, ATCC® CRL-1739™), MIA-PACA2 (рак поджелудочной железы, ATCC® CRL-1420™), SNU245 (холангиокарцинома, KCLB № 00245), HCT15 (рак толстой кишки, ATCC® CCL-225™) и MDA-MB-231 (рак молочной железы, ATCC® HTB-26) среди клеточных линий, добавляли клетки NK CD56+ через день для наблюдения за цитотоксичностью, а соотношение эффекторных клеток (NK-клетки CD56+) и клеток-мишеней (клеточные линии рака) приведены в Таблице 7 ниже.

Таблица 7

Эффектор : Мишень	Эффекторная клетка	Клетка-мишень
0 : 1	0	5×104
1 : 1	5×104	5×104
1 : 10	5×103	5×104
1 : 20	2,5×103	5×104

[0163] Планшеты, инокулированные эффекторными клетками и клетками-мишенями, культивировали при 37±1°C в течение 1-3 дней и в это время с целью наблюдения того, влияет ли обработка IL-2 на повышение противораковой активности, к экспериментальной группе дополнительно добавляли 500 МЕ/мл IL-2. К отрицательной контрольной группе NK-клетки CD56+ (эффекторные клетки) не добавляли и реакции противораковой активности не было.

[0164] Через 1-3 дня после посева клетки трижды промывали RPMI для удаления NK-клеток CD56+, присутствующих во взвешенной форме, а затем клеточные линии рака, которые остались в лунках, отделяли с помощью трипсина, окрашенного трипановым синим, и посчитали. Впоследствии планшет, инокулированный клетками-мишенями и эффекторными клетками, культивировали при 37±1°С в течение 1-3 дней, а затем клетки, меченные зеленой флуоресценцией, присутствующие в 24 лунках, подсчитывали с помощью проточного цитометра.

[0165] Цитотоксичность для клеточной линии рака рассчитывали, используя Уравнение 2 ниже.

Уравнение 2

Цитотоксичность = (среднее количество флюоресценции + клетки в лунках с NK-клетками) / (среднее количество флюоресценции + клетки в лунках только с клетками-мишенями) × 100

[0166] В результате, как проиллюстрировано на Фиг. 12, было подтверждено, что цитотоксичность против раковых клеток повышается при совместной обработке с IL2 (W/IL2) по сравнению с тем, когда обрабатывали только клетками NK CD56+ (W/O IL2).

[0167] Далее клетки NK CD56+ добавляли в 24-луночный планшет с прикрепленными клетками NIH: OVCAR-3 (рак яичников, ATCC® HTB-16™), чтобы наблюдать цитотоксичность; соотношение клеток-мишеней (клеточные линии рака) и эффекторных клеток (NK-клетки CD56+) показаны в Таблице 8 ниже.

Таблица 8

Эффектор : Мишень	Эффекторная клетка	Клетка-мишень
0 : 1	0	5×104
1 : 1	5×104	5×104
0.1 : 1	5×103	5×104
0,05 : 1	2,5×103	5×104

[0168] Планшет, инокулированный эффекторными клетками и клетками-мишенями, культивировали при 37±1°С в течение 1 суток, и для того, чтобы наблюдать, повышается ли противораковая активность благодаря IL-2, к экспериментальной группе добавляли 500 МЕ/мл IL- 2. В группу с отрицательным контролем клетки NK CD56+ не добавляли и не было реакции противораковой активности.

[0169] После 1 дня культивирования клетки трижды промывали RPMI для удаления NK-клеток CD56+, присутствующих во взвешенной форме, а затем линии раковых клеток, оставшихся в лунках, фотографировали с помощью камеры.

[0170] В результате, как проиллюстрировано на Фиг. 13, цитотоксичность против раковых клеток была увеличена, когда клеточные линии рака обрабатывали вместе с IL2 (+ IL2) по сравнению с тем, когда клеточные линии рака обрабатывали только клетками NK CD56+ (-IL2).

[0171] Далее клетки NK CD56+ добавляли в 24-луночный планшет с прикрепленными клетками AGS (рак желудка, ATCC® CRL-1739™), чтобы наблюдать цитотоксичность; соотношение клеток-мишеней (линии раковых клеток) и эффекторных клеток (NK-клетки CD56+) показаны в Таблице 9 ниже.

Таблица 9

Эффектор : Мишень	Эффекторная клетка	Клетка-мишень
0: 1	0	5×104
1: 1	5×104	5×104
0,1: 1	5×103	5×104
0,05: 1	2.5×103	5×104

[0172] Планшет, инокулированный эффекторными клетками и клетками-мишенями, культивировали при 37±1°C в течение 1 суток, и для того, чтобы наблюдать, повышается ли противораковая активность благодаря IL-2, к экспериментальной группе добавляли 500 МЕ/ мл IL- 2. В группу с отрицательным контролем клетки NK CD56+ не добавляли и не было реакции противораковой активности.

[0173] После 1 дня культивирования клетки трижды промывали RPMI для удаления NK-клеток CD56+, присутствующих во взвешенной форме, а затем клеточные линии рака, оставшиеся в лунках, фотографировали с помощью камеры.

[0174] В результате, как проиллюстрировано на Фиг. 14, цитотоксичность против раковых клеток была повышена, когда клеточные линии рака обрабатывали вместе с IL2 (+IL2) по сравнению с тем, когда линии раковых клеток обрабатывали только клетками NK CD56+ (-IL2).

Экспериментальный пример 12. Подтверждение противоракового действия NK-клеток на моделях животных

[0175] NK-клетки CD56+ получали согласно методам Примеров 1, 2 и Сравнительных примеров 1, 2 в течение 17 дней, за исключением того, что применяли PBMC от больных раком прямой кишки. Касательно каждой из NK-клеток, культивируемых в инкубаторе с CO₂ согласно Примерам 1, 2 и Сравнительным примерам 1, 2, на 6-й день культивирования в культуральной колбе Т25 клетки переносили в мешок объемом 350 мл, исходя из концентрации от 1 0×10⁵ до 2,0×10⁶ клеток/мл, и дополнительно культивировали в течение 4 дней. На 10 день культивирования клетки переносили в мешок объемом 1 л, исходя из концентрации 1,0×10⁵ - 2,0×10⁶ клеток/мл, а затем культивировали в течение 4 дней. Наконец, на 14 день культивирования клетки переносили в мешок объемом 1 л, исходя из концентрации от 1,0×10⁵ до 2,0×10⁶ клеток/мл, а затем дополнительно культивировали в течение 3-6 дней.

[0176] Животные модели рака человека конструировали путем ксенотрансплантации клеточной линии рака человека мышам. Использовали такие клеточные линии рака человека: AGS (рак желудка), MIA-PACA2 (рак поджелудочной железы), SNU245 (холангиокарцинома), HCT15 (рак толстой кишки) и NIH: OVCAR-3 (рак яичников) и MDA-MB-231 (рак молочной железы). После ксенотрансплантации рака мышей группировали в случайном порядке и обозначали. Контрольной группе вводили 200 мкл раствора Гартмана в хвостовую вену. Группе, обработанной NK-клетками (+ IL-2), пять раз вводили 1×10⁷ NK-клеток /200 мкл и 500 МЕ/ мл IL-2 через 2-3 дня с интервалом в 1 неделю после ксенотрансплантации рака в хвостовую вену. Группе, обработанной NK-клетками (-IL-2), пять раз вводили 1×10⁷ NK-клеток / 200 мкл с интервалом в 2-3 дня через 1 неделю после ксенотрансплантации рака в хвостовую вену.

[0177] Для отслеживания роста опухоли в течение исследуемого периода времени мышей трижды в неделю тестировали по поводу массы тела и объема опухоли. Длину главной и малой осей измеряли с помощью штангенциркуля, а объем опухоли определяли согласно следующему уравнению (Уравнение 3).

Уравнение 3

Объем опухоли (мм³) = (длина главной оси (мм)) × (длина малой оси (мм)) 2 × 0,5

[0178] Группа, обработанная NK-клетками (-IL-2), демонстрировала снижение роста опухоли после 8-ми недельного лечения примерно на 50% по сравнению с контрольной группой, несмотря на люциферазные изображения для каждого типа рака. Группа, получающая NK-клетки (+IL-2), демонстрировала снижение роста опухоли примерно на 60 % по сравнению с контрольной группой для каждого типа рака.

Экспериментальный пример 13. Подтверждение противоракового действия NK-клеток у онкологических больных

[0179] NK-клетки CD56+ получали согласно методам Примеров 1, 2 и Сравнительных примеров 1, 2 в течение 18 дней, за исключением того, что использовали PBMC от больных раком прямой кишки. Касательно каждой из NK-клеток, культивируемых в инкубаторе с CO₂ согласно Примерам 1, 2 и Сравнительным примерам 1, 2, на 6-й день культивирования в культуральной колбе Т25 клетки переносили в мешок объемом 350 мл, исходя из концентрации от 1 0×10⁵ до 2,0×10⁶ клеток/мл, и дополнительно культивировали в течение 4 дней. На 10 день культивирования клетки переносили в мешок объемом 1 л, исходя из концентрации 1,0×10⁵ - 2,0×10⁶ клеток/мл, а затем культивировали в течение 4 дней. Наконец, на 14 день культивирования клетки переносили в мешок объемом 1 л, исходя из концентрации 1,0×10⁵ - 2,0×10⁶ клеток/мл, а затем культивировали в течение 3-6 дней.

[0180] Больных раком прямой кишки группировали случайным образом и обозначали. Контрольной группе не вводили NK-клетки. Группе, обработанной NK-клетками (+IL-2), трижды вводили 1-3×10⁷ NK-клеток /кг массы тела и 500 МЕ/мл IL-2 с интервалом в шесть недель внутривенно. Группе, обработанной NK-клетками (-IL-2), шесть раз вводили 1-3 × 10⁷ NK-клеток /кг массы тела с интервалом в шесть недель внутривенно.

[0181] Рост опухоли контролировали через 1, 3, 6, 12 месяцев. Через 12 месяцев в группе, обработанной NK-клетками (-IL-2), наблюдалось общее уменьшение размера опухоли, а у группы, обработанной NK-клетками (+IL-2), наблюдалось дальнейшее общее уменьшение размера опухоли.

Экспериментальный пример 14. Подтверждение противоракового действия NK-клеток у пациентов с болезнью Альцгеймера

[0182] NK-клетки CD56+ получали согласно методам Примеров 1, 2 и Сравнительных примеров 1, 2 в течение 18 дней, за исключением того, что использовали PBMC от больных раком прямой кишки. Касательно каждой из NK-клеток, культивируемых в инкубаторе с CO₂ согласно Примерам 1, 2 и Сравнительным примерам 1, 2, на 6-й день культивирования в культуральной колбе Т25 клетки переносили в мешок объемом 350 мл, исходя из концентрации от 1 0×10⁵ до 2,0×10⁶ клеток/мл и дополнительно культивировали в течение 4 дней. На 10 день культивирования клетки переносили в мешок объемом 1 л, исходя из концентрации 1,0×10⁵ - 2,0×10⁶ клеток/мл, а затем культивировали в течение 4 дней. Наконец, на 14 день культивирования клетки переносили в мешок объемом 1 л, исходя из концентрации 1,0×10⁵ - 2,0×10⁶ клеток/мл, а затем культивировали в течение 3-6 дней.

[0183] Пациентов с болезнью Альцгеймера группировали случайным образом и обозначали. Контрольной группе не вводили NK-клетки. Группе, обработанной NK-клетками, шесть раз вводили 1-3×10⁷ NK-клеток /кг массы тела и 500 МЕ/мл IL-2 с интервалом в неделю внутривенно.

[0184] Когнитивные функции пациентов контролировали через 1, 3, 6, 12 месяцев. Через 12 месяцев группа, которая получала NK-клетки, демонстрировала улучшенные когнитивные функции.

Экспериментальный пример 15. Подтверждение противоракового действия NK-клеток у пациентов с аутоиммунным заболеванием

[0185] NK-клетки CD56+ получали согласно методам Примеров 1, 2 и Сравнительных примеров 1, 2 в течение 18 дней, за исключением того, что применяли PBMC от больных раком прямой кишки. Касательно каждой из NK-клеток, культивируемых в инкубаторе с CO₂ согласно Примерам 1, 2 и Сравнительным примерам 1, 2, на 6-й день культивирования в культуральной колбе Т25 клетки переносили в мешок объемом 350 мл, исходя из концентрации от 1 0×10⁵ до 2,0×10⁶ клеток/мл, и дополнительно культивировали в течение 4 дней. На 10 день культивирования клетки переносили в мешок объемом 1 л, исходя из концентрации 1,0×10⁵ - 2,0×10⁶ клеток/мл, а затем культивировали в течение 4 дней. Наконец, на 14 день культивирования клетки переносили в мешок объемом 1 л, исходя из концентрации 1,0×10⁵ - 2,0×10⁶ клеток/мл, а затем культивировали в течение 3-6 дней.

[0186] Пациентов с рассеянным склерозом случайно группировали и обозначали. Контрольной группе не вводили NK-клетки. Группе, обработанной NK-клетками, шесть раз вводили 1-3×10⁷ NK-клеток /кг массы тела и 500 МЕ/мл IL-2 с интервалом в неделю внутривенно.

[0187] Когнитивные функции пациентов контролировали через 1, 3, 6, 12 месяцев. Через 12 месяцев группа, которая получала NK-клетки, демонстрировала улучшенные когнитивные функции.

Терминология

[0188] Вышеприведенное описание демонстративных вариантов осуществления изобретения представлено лишь с целью иллюстрации и описания изобретения и никоим образом не ограничивает изобретение точными раскрытыми формами. В свете вышеуказанного учения возможно много модификаций и вариаций. Предполагается, что могут быть сделаны различные комбинации, подкомбинации специфических признаков и аспектов вариантов осуществления изобретения, раскрытых выше, и они охватываются одним или более изобретениями. Кроме того, раскрытие в этом документе любого конкретного признака, аспекта, метода, свойства, характеристики, качества, атрибута, элемента или тому подобного в связи с вариантом осуществления изобретения может быть использовано во всех других вариантах осуществления изобретения, изложенных в данном документу. Соответственно, следует понимать, что различные признаки и аспекты раскрытых вариантов осуществления изобретения могут комбинироваться или заменять друг друга для того, чтобы сформировать различные режимы раскрытых изобретений. Таким образом, предполагается, что объем раскрытых в этом документе изобретений не должен быть ограничен конкретными раскрытыми вариантами, описанными выше. Более того, хотя изобретение подвергается различным модификациям и альтернативным формам, конкретные примеры показаны на чертежах и подробно описаны в данном документе. Следует понимать, однако, что изобретение не ограничивается конкретными раскрытыми формами или методами, а наоборот, изобретение охватывает все модификации, эквиваленты и альтернативы, подпадающие под дух и объем различных вариантов осуществления изобретения, приведенных в описании и указанных в добавленной формуле изобретения. Любые методы, раскрытые в этом документе, не должны выполняться в указанном порядке. Раскрытые в данном документе методы включают определенные действия, совершаемые практиком; однако они могут также включать любые указания третьих сторон по этим действиям, явно или неявно. Диапазоны, раскрытые в этом документе, также охватывают любые и все перекрытия, поддиапазоны и их комбинации.

[0189] Варианты осуществления изобретения были выбраны и описаны для того, чтобы объяснить принципы изобретения и их практическое применение, чтобы активизировать других квалифицированных специалистов в использовании изобретения и различных вариантов его осуществления и с различными модификациями, которые подходят для конкретного предполагаемого использования. Альтернативные варианты воплощения изобретения станут очевидными для специалистов в данной области, для которых изобретение определяется добавленной формулой изобретения, а не предыдущим описанием и демонстративными вариантами его осуществления, описанными в этом документе.

[0190] Условная речь, такая как "может", "мог", если специально не указано иное или в контексте понимается другое, как правило, предназначена для передачи того, что определенные варианты осуществления включают, хотя другие варианты воплощения не включают, определенные признаки, элементы и/или этапы. Таким образом, такая условная речь, как правило, не предусматривает, что признаки, элементы и/или этапы каким образом нужны для одного или нескольких вариантов осуществления изобретения.

[0191] Термины "содержат", "включают", "имеют" и т.п., являются синонимами и используются включительно, открыто, и не исключают дополнительных элементов, особенностей, действий, операций и тому подобное. Кроме того, термин "или" употребляется в включающем смысле (а не в его исключительном значении), так что при использовании, например, для объединения списка элементов, термин "или" означает один, некоторые или все элементы в списке.

[0192] Диапазоны, раскрытые в этом документе, также охватывают любые и все перекрытия, поддиапазоны и их комбинации. Речь типа "до", "по меньшей мере", "больше", "меньше", "между" и т.п., включает указанное количество.

[0193] Числа, которым предшествует такой термин, как "примерно", "приблизительно" и "по существу", как использовали в этом документе, включают приведенные цифры (например, примерно 10% = 10%), а также представляют сумму, близкую указанной сумме, и все еще выполняющую нужную функцию или достигающую желаемого результата. Например, термины "примерно", "приблизительно" и "по существу" могут касаться суммы, которая находится в пределах менее 10%, в пределах менее 5%, в пределах менее 1%, в пределах менее 0,1% и меньше 0, 01% от указанной суммы.

[0194] Термин "в целом", как используется в данном описании, представляет собой стоимость, сумму или характеристику, которая преимущественно включает или имеет тенденцию к определенной величине, сумме или характеристике. В качестве примера, в определенных вариантах осуществления изобретения термин "в целом равномерное" относится к величине, сумме или характеристике, отклоняющейся от равномерной на меньше чем 20%, меньше чем 15%, меньше чем 10%, меньше чем 5%, меньше чем 1%, меньше чем 0,1% и меньше чем 0,01%.

[0195] Диапазоны, раскрытые в этом документе, также охватывают любые и все перекрытия, поддиапазоны и их комбинации. Речь, к примеру "до", "по меньшей мере", "больше", "меньше", "между" и т.п., включает указанное количество. Числа, которым предшествует такой термин как "примерно" или "близко", включают приведенные числа. Например, "примерно 5,0 см" включает "5,0 см".

[0196] Некоторые варианты осуществления изобретения были описаны в связи со схематичными графическими изображениями. Однако следует понимать, что схематические графические изображения рисуются не в масштабе. Расстояния есть только иллюстративными и не обязательно несут точное соотношение с фактическими размерами и расположением изображенных устройств.

[0197] Для целей настоящего раскрытия в данном документе описаны некоторые аспекты, преимущества и новые особенности. Следует понимать, что не обязательно все такие преимущества могут быть достигнуты в соответствии с любым конкретным воплощением. Таким образом, например, специалисты в данной области поймут, что раскрытие может быть воплощено или совершенно таким образом, чтобы достичь одного преимущества или группы преимуществ, как излагается в этом документе, не обязательно достигая других преимуществ, как это может быть изложено или предложено в этом документе.

[0198] Более того, хотя в данном документе описаны иллюстративные варианты осуществления изобретения, объем любого и всех вариантов его осуществления, имеет эквивалентные элементы, модификации, пропуски, комбинации (например, аспекты различных вариантов осуществления), адаптации и/или изменения, которые оценят специалисты в данной области техники, исходя из этого раскрытия. Ограничения в формуле изобретения следует толковать в общем, исходя из языка, используемого в формуле изобретения, и не ограничиваясь примерами, описанными в этом документе, или при рассмотрении заявки, которые следует толковать как неисключительные. Кроме того, действия раскрытых процессов и методов могут быть изменены любым способом, включая переупорядочивание действий и/или вставку дополнительных действий и/или удаления действий. Таким образом, предполагается, что описание и примеры будут считаться только иллюстративными, причем настоящий объем и дух указываются в формуле изобретения и их полном объеме эквивалентов.

1. Способ размножения природных клеток-киллеров (NK) в культуре, включающий: выделение одноядерных клеток периферической крови (РВМС) из образца крови; выделение по меньшей мере одной из клеток CD56+ и/или клеток CD3-/CD56+ из PBMC; и совместное культивирование по меньшей мере одной из клеток CD56+ и/или клеток CD3-/CD56+ с комбинацией питающих клеток в присутствии по меньшей мере двух цитокинов; при этом комбинация питающих клеток содержит облученные клетки Jurkat и облученные клетки непрерывной линии лимфоцитов, трансформированных вирусом Эпштейна-Барра (EBV-LCL), а по меньшей мере двумя цитокинами являются IL-2 и IL-21.

2. Способ по п. 1, в котором выделение по меньшей мере одной из клеток CD56+ и/или CD3-/CD56+ из РВМС проводят с применением хотя бы одной из микросфер CD56 и микросфер CD3.

3. Способ по п. 1, в котором по меньшей мере два цитокина дополнительно содержат один или более цитокинов, выбранных из группы, состоящей из IL-2, IL-21, IL-15, Flt3-L, SCF, IL-7, IL-18, IL-4, интерферона типа I, GM-CSF, IGF 1 и их комбинации.

4. Способ по п. 1, в котором IL-2 добавляют в концентрации 50-1000 МЕ/мл.

5. Способ по п. 1, в котором IL-21 добавляют в концентрации 10-100 нг/мл.

6. Способ по п. 1, в котором соотношение облученных клеток Jurkat и облученных клеток EBV-LCL составляет приблизительно 1:0,1-5 или 0,1-5:1.

7. Способ по п. 1, в котором совместное культивирование представляет собой совместное культивирование в течение 1-50 дней.

8. Способ по п. 1, в котором совместное культивирование по меньшей мере одной из клеток CD56+ и/или CD3-/CD56+ с комбинацией питающих клеток проводят при соотношении 1:1-100 клеток CD56+ и/или клеток CD3-/CD56+ и питающих клеток.

9. Способ по п. 1, который дополнительно включает: совместное культивирование по меньшей мере одной из клеток CD56+ и/или CD3-/CD56+ с комбинацией питающих клеток в присутствии IL-2 в течение первого периода; и совместное культивирование по меньшей мере одной из клеток CD56+ и/или CD3-/CD56+ с комбинацией питающих клеток в присутствии IL-21 в течение второго периода.

10. Способ по п. 9, в котором IL-21 добавляют больше одного раза в течение дня 0-6 второго периода.

11. Способ по п. 9, в котором второй IL-21 и комбинацию питающих клеток добавляют больше одного раза в течение дня 0-6 второго периода.

12. Способ по п. 9, в котором IL-21 добавляют больше одного раза в течение первых шести дней каждого четырнадцатидневного цикла в течение второго периода.

13. Композиция, изготовленная способом по п. 1.

14. Способ размножения NK-клеток в культуре, включающий: выделение одноядерных клеток периферической крови (РВМС) из образца крови, выделение по меньшей мере одной из клеток CD56+ и/или CD3-/CD56+ из PBMC; и совместное культивирование по меньшей мере одной из клеток CD56+ и/или CD3-/CD56+ с комбинацией питающих клеток в присутствии по меньшей мере двух цитокинов; при этом комбинация питающих клеток содержит облученные клетки Jurkat и облученные клетки непрерывной линии лимфоцитов, трансформированных вирусом Эпштейна-Барра (EBV-LCL), а по меньшей мере двумя цитокинами являются IL-2 и IL-21 и при этом питающие клетки и цитокины добавляют через определенные промежутки времени на протяжении всего размножения в культуре.

15. Способ по п. 14, в котором выделение по меньшей мере одной из клеток CD56+ и/или CD3-/CD56+ из РВМС проводят с применением хотя бы одной из микросфер CD56 и микросфер CD3.

16. Способ по п. 14, в котором IL-21 добавляют в концентрации 10-100 нг/мл.

17. Способ по п. 14, в котором IL-21 добавляют один раз или больше в течение каждого из следующих периодов: день 0-6; день 14-20 и день 28-34.

18. Способ по п. 14, в котором совместное культивирование включает совместное культивирование в течение 1-50 дней.

19. Клеточная терапевтическая композиция, содержащая: эффективное количество по меньшей мере одной из NK-клеток CD56+ и/или CD3-/CD56+, при этом чистота NK-клеток в клеточной терапевтической композиции составляет по меньшей мере 90% относительно других клеток в клеточной терапевтической композиции; IL-2 в концентрации 50-50000 МЕ/мл; и фармацевтически приемлемый носитель, при этом клеточная терапевтическая композиция составлена в форме, пригодной для введения пациенту-человеку, нуждающемуся в NK-клеточной терапии.

20. Композиция по п. 19, в которой IL-2 присутствует в количестве 50-1000 МЕ/мл.

21. Композиция по п. 20, которая не содержит IL-21.

22. Композиция по п. 21, которая находится при температуре 2-8°C.

23. Композиция по п. 22, которая находится при температуре приблизительно 4°C.

24. Композиция по п. 19, в которой IL-2 присутствует в количестве приблизительно 500 МЕ/мл.

25. Композиция по п. 19, в которой терапевтически эффективное количество составляет от 1×10⁶ до 1×10¹¹ NK-клеток на кг массы тела человека.

26. Композиция по п. 25, которая находится при температуре приблизительно 4°C.

27. Мешок, содержащий клеточную композицию, которая содержит: от 1×10⁶ до 1×10¹¹ NK-клеток на кг массы тела человека, при этом NK-клетки являются клетками CD56+ и/или CD3-/CD56+, полученными из одноядерных клеток периферической крови (РВМС), имеют чистоту по меньшей мере приблизительно 90%, при этом меньше, чем 1% клеток в мешке являются Т-клетками; IL-2 в концентрации 50-50000 МО/мл; и фармацевтически приемлемый носитель, содержащий раствор Гартмана, альбумин, DMSO, и не содержит IL-21.

28. Клеточная композиция, содержащая по меньшей мере одну из NK-клеток CD56+ и/или CD3-/CD56+, при этом чистота NK-клеток составляет по меньшей мере 90% относительно других клеток в клеточной композиции; IL-2 в концентрации 50-50000 МЕ/мл; и фармацевтически приемлемый носитель, содержащий DMSO, и не содержит IL-21, при этом клеточная композиция составлена в форме, пригодной для введения пациенту-человеку.

29. Композиция по п. 28, в которой IL-2 присутствует в количестве 50-1000 МЕ/мл.

30. Композиция по п. 29, которая дополнительно содержит раствор Гартмана.

31. Композиция по п. 30, которая дополнительно содержит альбумин.

32. Композиция по п. 31, в которой альбумин присутствует в количестве 1%.

33. Композиция по п. 31, в которой IL-2 присутствует в количестве 500 МЕ/мл.

34. Композиция по п. 31, которая находится при температуре 2-8°C.

35. Композиция по п. 31, которая находится при температуре приблизительно 4°C.

36. Клеточная композиция, содержащая по меньшей мере одну из NK-клеток CD56+ и/или CD3-/CD56+, при этом чистота NK-клеток составляет по меньшей мере 90% относительно других клеток в клеточной композиции; IL-2 в концентрации 50-50000 МЕ/мл; и фармацевтически приемлемый носитель, при этом клеточная композиция составлена в форме, пригодной для введения пациенту-человеку.

37. Композиция по п. 36, в которой клетки сохраняются по меньшей мере 24 часа.

38. Композиция по п. 36, в которой клетки сохраняются по меньшей мере 48 часов.