Фармацевтическая композиция, содержащая антитела к pcsk-9, и ее применение



C07K2317/94 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2782792:

ЦЗЯНСУ ХЭНЖУЙ МЕДИСИН КО., ЛТД. (CN)
ШАНХАЙ ХЭНЖУЙ ФАРМАСЬЮТИКАЛ КО., ЛТД (CN)

Группа изобретений относится к области составления фармацевтических препаратов. Предложена фармацевтическая композиция, содержащая антитело к PCSK-9 или его антигенсвязывающий фрагмент в концентрации от 1 мг/мл до 150 мг/мл, гистидиновый буфер в концентрации от 5 мМ до 30 мМ, трегалозу или сахарозу в концентрации от 10 мг/мл до 75 мг/мл, полисорбат 80 или полисорбат 20 в концентрации от 0,05 мг/мл до 0,6 мг/мл, pH от 5,5 до 6,5. Антитело к PCSK-9 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14 соответственно, и LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17 соответственно. Также предложены лиофилизированный состав и восстановленный раствор на основе указанной композиции. Изобретения обеспечивают получение стабильных составов, которые применимы в лечении PCSK-9-опосредованного заболевания или нарушения. 4 н. и 24 з.п. ф-лы, 2 ил., 14 табл., 14 пр.

 

Данная заявка испрашивает приоритет по заявке на патент Китая № CN201710519829.6, поданной 30 июня 2017 г. Полное содержание вышеупомянутой заявки включено в данный документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение принадлежит к области составления фармацевтических препаратов, в частности относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело к PCSK-9 и его антигенсвязывающий фрагмент, и их применению в качестве лекарственного препарата.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Гиперхолестеринемия является заболеванием с аномальным метаболизмом липидов, характеризующимся повышенным уровнем холестерина в сыворотке крови. Ее основным проявлением является повышенный уровень холестерина в сыворотке крови, который вызывает агрегацию холестерина в кровеносных сосудах и, следовательно, приводит к возникновению атеросклероза. Многочисленные результаты клинических и экспериментальных исследований доказали, что аномальный метаболизм липидов тесно связан с возникновением и развитием ишемической болезни сердца. Следовательно, снижение концентрации холестерина в крови стало основным средством лечения и предупреждения атеросклероза.

С быстрым улучшением уровня жизни, дислипидемия также стала основным фактором, угрожающим жителям городов и деревень в Китае. В соответствии со статистикой 2012, приблизительно 40% смертей в год в Китае были связаны с сердечно-сосудистыми заболеваниями. В настоящее время смертность от дислипидемии среди взрослых в Китае составляет 18,6%, при этом согласно оценкам от дислипидемии страдают 160 миллионов человек. Значения заболеваемости для разных типов дислипидемии являются следующими: 2,9% для гиперхолестеринемии, 11,9% для гипертриглицеридемии, 7,4% для липопротеинемии, обусловленной нехваткой липопротеинов высокой плотности, и 3,9% для незначительно повышенного уровня холестерина в крови. В «Консенсусе китайских экспертов по предупреждению и борьбе с хроническими заболеваниями», достигнутом Отраслевым комитетом по профилактике и контролю хронических заболеваний, Комитет экспертов по профилактике и контролю заболеваний, Министерство здравоохранения, 2012, было указано, что в Китае 33 миллиона человек страдают от гиперхолестеринемии, однако с точки зрения локальных областей заболеваемость дислипидемией гораздо серьезнее, чем вышеприведенные данные.

В настоящее время лекарственные препараты, применяемые в клинических условиях для контроля уровней липидов, главным образом направлены на статины. Lipitor®, являющийся наиболее широко применяемым и наиболее продаваемым лекарственным препаратом для снижения уровня холестерина, снижает уровень выработки холестерина путем блокирования эффекта фермента, обеспечивающего выработку холестерина в печени, и повышает уровень поглощения холестерина из крови печенью, тем самым снижая концентрацию холестерина в крови. Однако, для Lipitor® характерны свои недостатки. Во-первых, из данных будет понятно, что Lipitor® может снижать уровни липопротеинов низкой плотности на 30-40%, но у многих пациентов по-прежнему не удается достичь эффективного снижения уровней липидов в крови (концентрации липопротеинов низкой плотности < 50 мг/дл). Во-вторых, имеется отличие в проценте положительных клинических ответов на Lipitor® среди пациентов разных рас. По этим причинам пациентам по-прежнему нужно более эффективное лекарство для снижения уровня липидов в крови.

Как аутосомно-доминантное моногенное наследственное заболевание, наследственная гиперхолестеринемия (FM) клинически характеризуется значительным повышением уровня общего холестерина (TC) и холестерина липопротеинов низкой плотности (LDL-c) в крови, наличием ксантелазм, роговичной дуги и развитием преждевременного сердечно-сосудистого заболевания. Мутации гена рецептора липопротеинов низкой плотности (рецептор LDL, LDLR) вызывают дефицит LDLR или его отсутствие. Следовательно, LDL-c не транспортируется в печень для деградации, что приводит к повышению уровня LDL-c в крови. В настоящее время определено, что с возникновением FM коррелируют три гена: ген LDLR, ген аполипопротеина B100 и ген пропротеиновой конвертазы субтилизин-кексинового типа 9 (PCSK9).

Как пропротеиновая конвертаза, пропротеиновая конвертаза субтилизин-кексинового типа 9 (PCSK9), принадлежит к подсемейству протеазы K в секреторном семействе Bacillus subtilis. Кодируемый белок синтезируется в виде растворимого профермента и подвергается внутримолекулярному процессингу в эндоплазматическом ретикулуме путем автокатализа. В соответствии с результатами экспериментов, PCSK9 может способствовать деградации рецептора LDL и таким образом повышать содержание холестерина LDL в плазме крови. Рецептор LDL опосредует процесс эндоцитоза LDL в печени, который представляет собой основной путь удаления LDL из циркуляционной системы. Было обнаружено, что мутации гена PCSK9 определили у 12,5% пациентов с гиперхолестеринемией (ADH). Существуют различные типы мутаций PCSK9. В соответствии с разными воздействиями мутаций на уровень LDL-c, регулируемый посредством PCSK9, мутации можно разделить на два типа: тип с потерей функции и тип с приобретением функции. Среди них мутации с потерей функции связаны с низким уровнем холестерина в крови и предотвращают возникновение атеросклеротической болезни сердца. Частота возникновения мутаций PCSK9, связанных с низким уровнем холестерина, выше в африканских популяциях, чем в других расах. Мутации PCSK9, являющиеся мутациями с приобретением функции, обеспечивают повышение уровня холестерина в плазме крови путем повышения функции PCSK9 и снижения экспрессии LDLR, что может приводить к тяжелой гиперхолестеринемии и преждевременной ишемической атеросклеротической болезни сердца. В настоящее время обнаружено, что мутации PCSK9, являющиеся мутациями с приобретением функции, включают D374Y, S127R, F216L, N157K, R306S и т.д. По сравнению с PCSK9 дикого типа, у мутантов с D374Y содержание LDLR на клеточной поверхности снижалось на 36%, а у мутантов с S127R - снижалось на 10%.

Однако, антитела становятся нестабильными из-за их больших молекулярных масс, сложных структур и подверженности деградации, полимеризации или нежелательной химической модификации. Для создания антител, которые пригодны для введения, сохраняют свою стабильность во время хранения и последующего применения и оказывают лучшие эффекты, особенно важным является изучение стабильных составов на основе антител.

В настоящее время несколько компаний занимаются разработкой антител к PCSK-9 и фармацевтических составов, таких как составы на основе CN 103717237 A, CN 104364266 A и т.д. Однако, для новых антител к PCSK-9 по-прежнему остается необходимым разработать фармацевтическую композицию (состав) содержащую антитело к PCSK-9, которое является более подходящим для введения.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую антитело к PCSK9 или его антигенсвязывающий фрагмент, и буфер, где буфер предпочтительно представляет собой гистидиновый буфер или сукцинатный буфер, или фосфатный буфер, или цитратный буфер, более предпочтительно гистидиновый буфер, наиболее предпочтительно буфер на основе гистидина гидрохлорида.

В альтернативном варианте осуществления, где концентрация антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента в фармацевтической композиции составляет от приблизительно 1 мг/мл до 150 мг/мл, предпочтительно от 30 мг/мл до 100 мг/мл, более предпочтительно от 50 мг/мл до 60 мг/мл, наиболее предпочтительно 50 мг/мл. Неограничивающие примеры таких концентраций антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента включают 45 мг/мл, 46 мг/мл, 47 мг/мл, 48 мг/мл, 49 мг/мл, 50 мг/мл, 51 мг/мл, 52 мг/мл, 53 мг/мл, 54 мг/мл, 55 мг/мл, 56 мг/мл, 57 мг/мл, 58 мг/мл, 59 мг/мл или 60 мг/мл.

В альтернативном варианте осуществления концентрация буфера составляет от приблизительно 5 мМ до 50 мМ, предпочтительно от 5 мМ до 30 мМ, неограничивающие примеры концентраций буфера включают 10 мМ, 12 мМ, 14 мМ, 16 мМ, 18 мМ, 20 мМ, 22 мМ, 24 мМ, 26 мМ, 28 мМ и 30 мМ, более предпочтительно от 10 мМ до 15 мМ, наиболее предпочтительно 10 мМ.

В альтернативном варианте осуществления значение pH буфера в фармацевтической композиции составляет от приблизительно 5,5 до 6,5, предпочтительно от приблизительно 6,0 до 6,5, неограничивающие примеры значения pH буфера включают приблизительно 6,0, приблизительно 6,1, приблизительно 6,2, приблизительно 6,3, приблизительно 6,4 или приблизительно 6,5.

Более того, в альтернативном варианте осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит сахарид. «Сахарид» в данном документе включает общепринятое соединение (CH2O)n и его производные, в том числе моносахариды, дисахариды, трисахариды, полисахариды, сахарные спирты, восстанавливающие сахара, невосстанавливающие сахара и т.д. Примеры сахаридов в данном документе включают глюкозу, сахарозу, трегалозу, лактозу, фруктозу, мальтозу, декстран, глицерин, эритрит, глицерин, арабит, силит, сорбит, маннит, мелибиозу, мелезитозу, рафинозу, маннотриозу, стахиозу, мальтозу, лактулозу, мальтулозу, сорбит, мальтит, лактит, изо-мальтулозу и т.д. Предпочтительным сахаридом в данном документе является невосстанавливающий дисахарид, более предпочтительно трегалоза или сахароза.

В альтернативном варианте осуществления, где концентрация сахарида в фармацевтическом препарате составляет от приблизительно 10 мг/мл до 75 мг/мл, предпочтительно от 20 мг/мл до 60 мг/мл, более предпочтительно от приблизительно 20 мг/мл до 40 мг/мл, наиболее предпочтительно 25 мг/мл. Неограничивающие примеры концентрации сахарида включают 20 мг/мл, 21 мг/мл, 22 мг/мл, 23 мг/мл, 24 мг/мл, 25 мг/мл, 26 мг/мл, 27 мг/мл, 28 мг/мл, 29 мг/мл, 30 мг/мл, 31 мг/мл, 32 мг/мл, 33 мг/мл, 34 мг/мл, 35 мг/мл, 36 мг/мл, 37 мг/мл, 38 мг/мл, 39 мг/мл или 40 мг/мл.

В альтернативном варианте осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит поверхностно-активное вещество. В данном документе «поверхностно-активное вещество» может быть выбрано из группы, состоящей из полисорбата 20, полисорбата 80, полоксамера, Triton, додецилсульфата натрия, лаурилсульфата натрия, октилгликозида натрия, лаурилсульфобетаина, миристилсульфобетаина, линолеилсульфобетаина, стеарилсульфобетаина, лаурилсаркозина, миристилсаркозина, линолеилсаркозина, стеарилсаркозина, линолеилбетаина, миристилбетаина, цетилбетаина, лаурамидопропилбетаина, кокамидопропилбетаина, линолеамидопропилбетаина, миристамидопропилбетаина, пальмидопропилбетаина, изостеарамидопропилбетаина, миристамидопропилдиметиламина, пальмидопропилдиметиламина, изостеарамидопропилдиметиламина, метил-кокоил таурата натрия, метил-олеилтаурата натрия, полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля и сополимеров этилена и пропиленгликоля и т.д. Предпочтительным поверхностно-активным веществом в данном документе является полисорбат 20 или полисорбат 80, более предпочтительно полисорбат 80.

В альтернативном варианте осуществления концентрация поверхностно-активного вещества в фармацевтической композиции составляет от приблизительно 0,05 мг/мл до 1,0 мг/мл, предпочтительно от 0,1 мг/мл до 0,4 мг/мл, неограничивающие примеры концентрации поверхностно-активного вещества включают 0,1 мг/мл, 0,15 мг/мл, 0,2 мг/мл, 0,25 мг/мл, 0,3 мг/мл, 0,35 мг/мл, 0,4 мг/мл, еще более предпочтительно от 0,1 мг/мл до 0,3 мг/мл, более предпочтительно от 0,1 мг/мл до 0,2 мг/мл, наиболее предпочтительно 0,2 мг/мл.

В альтернативном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит:

(a) 1-150 мг/мл антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента;

(b) 5-30 мМ гистидинового буфера, pH приблизительно 5,5-6,5, более предпочтительно приблизительно 6,0-6,5;

(c) 10-75 мг/мл сахарозы; и

(d) 0,05-0,6 мг/мл полисорбата 80.

В альтернативном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит:

(a) 50 мг/мл антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента;

(b) 5-20 мМ гистидинового буфера;

(c) 25 мг/мл сахарозы; и

(d) 0,1-0,3 мг/мл полисорбата 80.

В альтернативном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит:

(a) 1-150 мг/мл антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента и

(b) 5-30 мМ гистидинового буфера; и pH фармацевтической композиции составляет приблизительно 6,0-6,5.

В альтернативном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит:

(a) 1-150 мг/мл антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента;

(b) 5-30 мМ гистидинового буфера;

(c) 10-75 мг/мл сахарозы; и

(d) 0,05-0,6 мг/мл полисорбата 80; и pH фармацевтической композиции составляет приблизительно 6,0-6,5, а гистидиновый буфер предпочтительно представляет собой буфер на основе гистидина гидрохлорида.

В альтернативном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит:

(a) 50 мг/мл антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента,

(b) 5-20 мМ гистидинового буфера,

(c) 25 мг/мл сахарозы и

(d) 0,1-0,3 мг/мл полисорбата 80; и pH фармацевтической композиции составляет приблизительно 6,0-6,5, и гистидиновый буфер предпочтительно представляет собой буфер на основе гистидина гидрохлорида.

В альтернативном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит:

(a) 50 мг/мл антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента;

(b) 10 мМ гистидинового буфера;

(c) 25 мг/мл сахарозы; и

(d) 0,2 мг/мл полисорбата 80, и pH фармацевтической композиции составляет 6,3±0,1, и гистидиновый буфер предпочтительно представляет собой буфер на основе гистидина гидрохлорида.

В альтернативном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит:

(a) 150 мг/мл антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента;

(b) 30 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида;

(c) 75 мг/мл сахарозы; и

(d) 0,6 мг/мл полисорбата 80; конечное значение pH фармацевтической композиции составляет 6,3.

В альтернативном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит:

(a) 50 мг/мл антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента;

(b) 10 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,0;

(c) 25 мг/мл сахарозы; и

(d) 0,2 мг/мл полисорбата 80.

В альтернативном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит:

(a) 150 мг/мл антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента;

(b) 20 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,5; и

(c) 70 мг/мл сахарозы.

В альтернативном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит:

(a) 150 мг/мл антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента;

(b) 20 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,5; и

(c) 70 мг/мл дигидрата α,α-трегалозы.

В альтернативном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит:

(a) 50 мг/мл антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента;

(b) 20 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,0;

(c) 25 мг/мл сахарозы; и

(d) 0,2 мг/мл полисорбата 80.

В альтернативном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит:

(a) 50 мг/мл антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента;

(b) 20 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,5;

(c) 25 мг/мл сахарозы; и

(d) 0,2 мг/мл полисорбата 80.

В альтернативном варианте осуществления антитело к PCSK-9 или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтической композиции содержат HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательности под SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14 соответственно, и

LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательности под SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17 соответственно.

В альтернативном варианте осуществления антитело к PCSK-9 или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтической композиции выбраны из группы, состоящей из антитела мыши, химерного антитела и гуманизированного антитела, предпочтительным является гуманизированное антитело.

В альтернативном варианте осуществления легкая цепь антитела к PCSK-9 в фармацевтической композиции характеризуется по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью легкой цепи антитела h001-4-YTE, при этом тяжелая цепь антитела к PCSK-9 в фармацевтической композиции характеризуется по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью тяжелой цепи антитела h001-4-YTE. Легкая цепь антитела h001-4-YTE имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 30, а тяжелая цепь антитела h001-4-YTE имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 32.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает способ получения фармацевтической композиции, описанной выше, включающий стадию замены исходного раствора для антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента буфером. Предпочтительно буфер представлен гистидиновым буфером, более предпочтительно буфером на основе гистидина гидрохлорида. Концентрация буфера предпочтительно составляет от приблизительно 5 мМ до 30 мМ, и неограничивающие примеры концентрации буфера включают 5 мМ, 6 мМ, 7 мМ, 8 мМ, 9 мМ, 10 мМ, 12 мМ, 14 мМ, 16 мМ, 18 мМ, 20 мМ, 22 мМ, 24 мМ, 26 мМ, 28 мМ и 30 мМ, более предпочтительно от 10 мМ до 15 мМ; при этом pH буфера составляет от приблизительно 6,0 до 6,5, неограничивающие примеры включают 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4 и 6,5.

Кроме того, способ получения фармацевтической композиции, описанной выше, дополнительно включает стадию добавления сахарозы и полисорбата 80 к раствору, полученному на стадии замены, а затем доведения до конечного объема буфером, где концентрация буфера составляет предпочтительно от 10 мМ до 20 мМ, неограничивающие примеры концентрации буфера включают 10 мМ, 12 мМ, 14 мМ, 16 мМ, 18 мМ и 20 мМ; при этом pH буфера составляет приблизительно 6,0-6,5, неограничивающие примеры pH буфера включают 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4 и 6,5.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает способ получения лиофилизированного состава, содержащего антитело к PCSK-9, который включает стадию лиофилизации фармацевтической композиции, описанной выше.

В альтернативном варианте осуществления способ получения лиофилизированного состава, содержащего антитело к PCSK-9, включает последовательные стадии предварительного замораживания, первичного высушивания и вторичного высушивания, при этом предварительное замораживание представляет собой замораживание от 5°C до -40°C - -50°C, наиболее предпочтительно -45°C, без требования в отношении поддержания вакуума. Температура первичного высушивания составляет от -14°C до 0°C, наиболее предпочтительно -5°C; давление вакуума составляет от 0,1 мБар до 0,5 мБар, наиболее предпочтительно 0,3 мБар. Температура вторичного высушивания составляет от 20°C до 30°C, предпочтительно 25°C, давление вакуума составляет от 0,1 мБар 0,5 мБар, наиболее предпочтительно 0,3 мБар, и давление вакуума снижают до значения от 0,005 мБар до 0,02 мБар, наиболее предпочтительно 0,01 мБар.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает лиофилизированный состав, содержащий антитело к PCSK-9, полученный способом получения лиофилизированного состава, содержащего антитело к PCSK9, описанное выше.

В некоторых вариантах осуществления лиофилизированный состав стабилен при 2-8°C в течение по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев или по меньшей мере 24 месяцев. В некоторых вариантах осуществления лиофилизированный состав стабилен при 40°C в течение по меньшей мере 7 дней, по меньшей мере 14 дней или по меньшей мере 28 дней.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает способ получения раствора, восстановленного из лиофилизированного состава, содержащего антитело к PCSK-9, который включает стадию восстановления лиофилизированной композиции, описанной выше, при этом растворитель для восстановления выбран без ограничения из воды для инъекций, физиологического раствора или раствора глюкозы.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает раствор, восстановленный из лиофилизированного состава, содержащего антитело к PCSK-9, полученный способом получения раствора, восстановленного из лиофилизированного состава, содержащего антитело к PCSK-9, описанное выше.

В альтернативном варианте осуществления восстановленный раствор, содержащий антитело к PCSK-9 по настоящему изобретению, содержит этот компонент, в концентрации, в 2-5 раз превышающей концентрацию этого компонента в фармацевтической композиции до лиофилизации, предпочтительно в 3 раза.

В альтернативном варианте осуществления восстановленный раствор содержит антитело к PCSK-9 по настоящему изобретению, где концентрация антитела к PCSK9 или антигенсвязывающего фрагмента составляет от приблизительно 120 мг/мл до 200 мг/мл, наиболее предпочтительно 150 мг/мл.

В альтернативном варианте осуществления в случае восстановленного раствора, содержащего антитело к PCSK-9 по настоящему изобретению, pH фармацевтической композиции составляет приблизительно 6,0-6,5, предпочтительно 6,4. Значение pH восстановленного раствора зависит от значения pH буфера, применяемого при составлении лекарственного средства. Если pH лекарственного средства составляет 6,0, конечное значение pH восстановленного раствора составляет 6,3±1.

В альтернативном варианте осуществления в случае восстановленного раствора, содержащего антитело к PCSK-9 по настоящему изобретению, концентрация буфера составляет от приблизительно 15 мМ до 45 мМ, предпочтительно 30 мМ.

В альтернативном варианте осуществления восстановленный раствор, содержащий антитело к PCSK-9 по настоящему изобретению, дополнительно содержит дисахарид, где дисахарид предпочтительно выбран из группы, состоящей из трегалозы и сахарозы, наиболее предпочтительно сахарозу.

В альтернативном варианте осуществления в случае восстановленного раствора, содержащего антитело к PCSK-9 по настоящему изобретению, концентрация дисахарида составляет от приблизительно 55 мг/мл до95 мг/мл, предпочтительно приблизительно 75 мг/мл.

В альтернативном варианте осуществления восстановленный раствор, содержащий антитело к PCSK-9 по настоящему изобретению, дополнительно содержит поверхностно-активное вещество, где поверхностно-активное вещество представляет собой предпочтительно полисорбат, более предпочтительно полисорбат 80.

В альтернативном варианте осуществления в случае восстановленного раствора, содержащего антитело к PCSK-9 по настоящему изобретению, концентрация поверхностно-активного вещества составляет от приблизительно 0,4 мг/мл до 0,8 мг/мл, предпочтительно 0,6 мг/мл.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает продукт или набор, содержащий контейнер, содержащий любую из стабильных фармацевтических композиций, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления это стеклянный флакон.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает применение фармацевтической композиции, или лиофилизированного состава, или раствора, восстановленного из лиофилизированного состава, описанных выше, при составлении лекарственного препарата для лечения опосредованного PCSK9 заболевания или нарушения, где заболевание или нарушение предпочтительно представляет собой заболевание, связанное с холестерином; более предпочтительно выбрано из группы, состоящей из гиперхолестеринемии, заболевания сердца, метаболического синдрома, диабета, ишемической болезни сердца, апоплексии, сердечно-сосудистого заболевания, болезни Альцгеймера и общей дислипидемии; наиболее предпочтительно гиперхолестеринемии, дислипидемии, атеросклероза, CVD или ишемической болезни сердца.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает способ лечения и предупреждения связанных с PCSK-9 заболевания или нарушения, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, или лиофилизированного состава, или раствора, восстановленного из лиофилизированного состава, описанных выше, где заболевание или нарушение предпочтительно представляет собой заболевание, связанное с холестерином; более предпочтительно выбрано из группы, состоящей из гиперхолестеринемии, заболевания сердца, метаболического синдрома, диабета, ишемической болезни сердца, апоплексии, сердечно-сосудистого заболевания, болезни Альцгеймера и общей дислипидемии; наиболее предпочтительно гиперхолестеринемии, дислипидемии, атеросклероза, CVD или ишемической болезни сердца.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает продукт, содержащий контейнер, содержащий фармацевтическую композицию, или лиофилизированный состав, или раствор, восстановленный из лиофилизированного состава, описанные выше.

Следует понимать, что одно, несколько или все признаки различных вариантов осуществления, описанных в данном документе, могут быть объединены с образованием других вариантов осуществления настоящего изобретения. Эти и другие аспекты настоящего изобретения будут очевидными для специалиста в данной области техники. Эти и другие варианты осуществления настоящего изобретения дополнительно описаны в подробном описании, приведенном ниже.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Терминология

Чтобы облегчить понимание настоящего изобретения, некоторые технические и научные термины специально определены ниже. Кроме терминов, конкретно определенных в других местах в данном документе, все другие технические и научные термины, используемые в данном документе, должны рассматриваться как имеющие то же значение, которое обычно известно специалисту в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение.

Применяемый в данном документе термин «буфер» относится к буферному раствору, который противостоит изменениям рН благодаря действию его компонентов, являющихся кислотами и сопряженными с ними основаниями. Примеры буферов, которые контролируют рН в подходящем диапазоне, включают ацетатный буфер, сукцинатный буфер, глюконатный буфер, гистидиновый буфер, оксалатный буфер, лактатный буфер, фосфатный буфер, цитратный буфер, тартратный буфер, фумаратный буфер, глицилглициновый буфер и другие буферы на основе органических кислот.

«Гистидиновый буфер» представляет собой буфер, содержащий ионы гистидина. Примеры гистидиновых буферов включают буфер на основе гистидина гидрохлорида, буфер на основе гистидина ацетата, буфер на основе гистидина фосфата и буфер на основе гистидина сульфата и т.д., предпочтительно буфер на основе гистидина гидрохлорида. Буфер на основе гистидина гидрохлорида получают с помощью гистидина и хлористоводородной кислоты или гистидина и гистидина гидрохлорида.

«Цитратный буфер» представляет собой буфер, который содержит цитрат-ионы. Примеры цитратного буфера включают буфер на основе лимонной кислоты и цитрата натрия, буфер на основе лимонной кислоты и цитрата калия, буфер на основе лимонной кислоты и цитрата кальция и буфер на основе лимонной кислоты и цитрата магния и т.д. Предпочтительным цитратным буфером является буфер на основе лимонной кислоты и цитрата натрия.

«Сукцинатный буфер» представляет собой буфер, который содержит сукцинат-ионы. Примеры сукцинатного буфера включают буфер на основе янтарной кислоты и сукцината натрия, буфер на основе янтарной кислоты и сукцината калия, буфер на основе янтарной кислоты и сукцината кальция и т.д. Предпочтительным сукцинатным буфером является буфер на основе янтарной кислоты и сукцината натрия.

«Фосфатный буфер» представляет собой буфер, который содержит фосфат-ионы. Примеры раствора фосфатного буфера включают буфер на основе динатрия гидрофосфата и дигидрофосфата натрия и буфер на основе динатрия гидрофосфата и дигидрофосфата калия, и т.д. Предпочтительным фосфатным буфером является буфер на основе динатрия гидрофосфата и дигидрофосфата натрия.

«Ацетатный буфер» представляет собой буфер, который содержит ацетат-ионы. Примеры ацетатного буфера включают буфер на основе уксусной кислоты и ацетата натрия, буфер на основе уксусной кислоты и гистидина, буфер на основе уксусной кислоты и ацетата калия, буфер на основе уксусной кислоты и ацетата кальция и буфер на основе уксусной кислоты и ацетата магния и т.д. Предпочтительным ацетатным буфером является буфер на основе уксусной кислоты и ацетата натрия.

«Фармацевтическая композиция» относится к фармацевтической композиции, содержащей смесь одного или более соединений в соответствии с настоящим изобретением или их физиологически/фармацевтически приемлемой соли или продукта с другими химическими компонентами, такими как физиологически/фармацевтически приемлемые носители и вспомогательные вещества. Фармацевтическая композиция предназначена для поддержания стабильности активного ингредиента, представляющего собой антитело, и обеспечения введения в организм за счет способствования поглощению активного ингредиента и тем самым осуществлению биологического эффекта. Применяемые в данном документе термины «фармацевтическая композиция» и «состав» не являются взаимоисключающими.

«Лиофилизированный состав» означает состав или фармацевтическую композицию, полученные с помощью стадии вакуумного сублимационного высушивания из фармацевтической композиции в форме жидкости или раствора или состава в виде жидкости или раствора.

Лиофилизация настоящего изобретения включает предварительное замораживание, первичное высушивание и вторичное высушивание. Целью предварительного замораживания является замораживание продукта с получением кристаллического твердого вещества. Температура предварительного замораживания и скорость предварительного замораживания являются двумя важными технологическими параметрами. В настоящем изобретении температуру предварительного замораживания устанавливают на -45°C, а скорость предварительного замораживания устанавливают на 1°C/мин. Первичное высушивание также известно как сублимация, что является основной стадией лиофилизации. Ее целью является поддержание формы продукта при удалении льда из продукта, и сведение к минимуму повреждения продукта. Если температура и степень вакуумирования первого высушивания не являются подходящими, это приведет к разрушению продукта. Более высокая температура и степень вакуумирования увеличивают эффективность лиофилизации, но в то же время повышают риск разрушения продукта. Температура первичного высушивания по настоящему изобретению может являться стандартной температурой в данной области техники, например от -27°C до 0°C, предпочтительно от -14°C до -5°C. Вторичное высушивание также известно как десорбция, которая является основной стадией для удаления связанной воды из продукта путем создания глубокого вакуума (0,01 мБар) и повышения температуры (20-40°C). Поскольку большинство биологических продуктов являются чувствительными к температуре, температуру вторичного высушивания устанавливают на уровне нижней точки температурного диапазона, т.е. 25°C. Время лиофилизации зависит от морозильной камеры, дозы лиофилизированного состава и контейнера с лиофилизированной композицией. Такая регулировка времени лиофилизации хорошо известна специалистам в данной области техники.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению способна обеспечивать стабильный эффект: антитело в составе фармацевтической композиции по сути сохраняет свою физическую стабильность, и/или химическую стабильность, и/или биологическую активность при хранении, предпочтительно, фармацевтическая композиция по сути сохраняет свою физическую стабильность, химическую стабильность и биологическую активность при хранении. Время хранения в большинстве случаев выбирают на основе предварительно определенного срока годности фармацевтической композиции. В настоящее время существует ряд аналитических методик измерения стабильности белков, с помощью которых измеряют стабильность после хранения в течение выбранного периода времени при выбранной температуре.

«Стабильный» фармацевтический состав на основе антитела представляет собой фармацевтический состав на основе антитела, в котором не наблюдается каких-либо значительных изменений при хранении при температуре охлаждения (2-8°C) в течение по меньшей мере 3 месяцев, предпочтительно 6 месяцев, и более предпочтительно 1 года, и даже более предпочтительно вплоть до 2 лет. Дополнительно, «стабильный» жидкий состав предусматривает таковой, проявляющий требуемые свойства после хранения в течение периодов, включающих 1 месяц, 3 месяца или 6 месяцев, при значениях температуры, включающих 25°C и 40°C. Типичными критериями приемлемости при определении стабильности являются следующие: деградация мономера антитела, измеренная посредством SEC-HPLC, как правило составляет не более чем приблизительно 10%, предпочтительно приблизительно 5%. Фармацевтический состав на основе антитела при визуальном анализе является бесцветным или от прозрачного до слегка опалесцирующего. Концентрация, pH и осмоляльность состава характеризуются погрешностью не более +/-10%. Как правило, наблюдается отсечение, составляющее не более чем приблизительно 10%, предпочтительно приблизительно 5%. Как правило, агрегации подвергается не более чем приблизительно 10%, предпочтительно приблизительно 5%.

Антитело «сохраняет свою физическую стабильность» в фармацевтическом составе, если оно не проявляет значительного повышения агрегации, осаждения и/или денатурации при визуальной оценке цвета и/или прозрачности, или при измерении с помощью светорассеяния в УФ диапазоне, эксклюзионной хроматографии (SEC) и динамического светорассеяния (DLS). Изменения конформации белка можно оценить с помощью флуоресцентной спектроскопии, с помощью которой определяют третичную структуру белка, и с помощью FTIR-спектроскопии, с помощью которой определяет вторичную структуру белка.

Антитело «сохраняет химическую стабильность» в фармацевтическом составе, если оно не проявляет значительных химических изменений. Химическую стабильность можно оценить путем выявления и количественного определения химически измененных форм белка. Процессы деградации, которые часто изменяют химическую структуру белка, включают гидролиз или отсечение (оцениваемые такими способами, как эксклюзионная хроматография и SDS-PAGE и т.д.), окисление (оцениваемое такими способами, как пептидное картирование в сочетании с масс-спектроскопией или MALDI/TOF/MS и т.д.), дезамидирование (оцениваемое такими способами, как ионообменная хроматография, капиллярное изоэлектрическое фокусирование, пептидное картирование, измерение содержания изоаспарагиновой кислоты и т.д.) и изомеризацию (оцениваемую с помощью измерения содержания изоаспарагиновой кислоты, пептидного картирования, и т.д.).

Антитело «сохраняет свою биологическую активность» в фармацевтическом составе, если значение биологической активности антитела в рассматриваемый момент времени находится в предварительно определенном диапазоне значений биологической активности, демонстрируемом на момент получения фармацевтического состава. Биологическая активность антитела может быть определена, например, с помощью анализа связывания антигена.

Применяемый в данном документе однобуквенный код и трехбуквенный код для аминокислот являются такими, как описано в J. Biol. Chem, 243, (1968) p. 3558.

Применяемый в данном документе термин «антитело» относится к иммуноглобулину, структуре, состоящей из четырех пептидных цепей, в которой две идентичные тяжелые цепи соединены дисульфидными связями с двумя идентичными легкими цепями.

В настоящем изобретении легкая цепь антитела, упомянутая в данном документе, также содержит константную область легкой цепи, которая предусматривает κ-, λ-цепь человека или мыши или их вариант.

В настоящем изобретении тяжелая цепь антитела, упомянутая в данном документе, также содержит константную область тяжелой цепи, которая предусматривает IgG1, 2, 3, 4 человека или мыши или их вариант.

Вариабельная область (Fv-область) содержит приблизительно 110 аминокислот вблизи N-конца тяжелой и легкой цепи антитела. Константная область (C-область), содержащая оставшиеся аминокислоты вблизи С-конца антитела, является относительно стабильной. Вариабельная область содержит три гипервариабельные области (HVR) и четыре относительно консервативные каркасные области (FR). Три гипервариабельные области, которые определяют специфичность антитела, также называют областями, определяющими комплементарность (CDR). Каждая из вариабельных областей легкой цепи (LCVR) и вариабельных областей тяжелой цепи (HCVR) состоит из трех CDR-областей и четырех FR-областей, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Три CDR легкой цепи обозначаются как LCDR1, LCDR2 и LCDR3; три CDR тяжелой цепи обозначаются как HCDR1, HCDR2 и HCDR3. Число и расположение аминокислотных остатков CDR в LCVR- и HCVR-областях антитела или антигенсвязывающего фрагмента в данном документе соответствуют известным критериям нумерации по Kabat (LCDR1-3, HCDE2-3) или соответствуют критериям нумерации по Kabat и Chothia (HCDR1).

Антитело по настоящему изобретению включает антитело мыши, химерное антитело или гуманизированное антитело, предпочтительно гуманизированное антитело.

Термин «антитело мыши» в настоящем изобретении относится к моноклональному антителу к PCSK9 человека, полученному в соответствии со знаниями и навыками в уровне техники. При получении подвергающемуся испытанию объекту инъецируют антиген PCSK9, а затем выделяют гибридому, экспрессирующую антитело, которое обладает необходимыми последовательностями или функциональными характеристиками.

Термин «химерное антитело» обозначает антитело, образованное путем слияния вариабельной области антитела мыши с константной областью антитела человека, что может обеспечивать ослабление иммунного ответа, вызываемого антителами мыши. Чтобы сконструировать химерное антитело, сначала создают гибридому, которая секретирует специфические моноклональные антитела мыши, затем ген вариабельной области клонируют из клеток гибридомы мыши. Затем при необходимости клонируют ген константной области антитела человека. Ген вариабельной области мыши лигируют с геном константной области человека с образованием химерного гена, который затем встраивают в вектор для экспрессии человеческих последовательностей, и, наконец, молекулу химерного антитела экспрессируют в эукариотической или прокариотической промышленной системе. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения легкая цепь химерного антитела к PCSK9 дополнительно содержит константные области легкой цепи из κ-, λ- цепей человека или их варианта. Тяжелая цепь химерного антитела к PCSK9 дополнительно содержит константные области тяжелой цепи из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека или их вариантов. Константная область антитела человека может быть выбрана из константной области тяжелой цепи из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека или их вариантов, при этом предпочтительно предусматривается константная область тяжелой цепи из IgG2, или IgG4 человека, или IgG4 человека, лишенная ADCC-токсичности (антителозависимой клеточной цитотоксичности) в результате мутации аминокислоты.

Термин «гуманизированное антитело», также известный как CDR-привитое антитело, относится к антителу, полученному путем прививания последовательностей CDR мыши в каркас вариабельной области антитела человека, а именно к антителу, полученному из разных типов каркасных последовательностей антител человека. Гуманизированное антитело позволяет преодолеть недостаток, состоящий в сильном опосредованном антителами ответе, индуцируемом химерным антителом, которое несет большое количество компонентов белка мыши. Такие каркасные последовательности могут быть получены из общедоступной базы данных ДНК, охватывающей последовательности генов антител зародышевой линии или опубликованные ссылки. Например, последовательности ДНК генов тяжелой и легкой цепи зародышевой линии человека можно найти в базе данных последовательностей генов зародышевой линии человека «VBase» (доступной на сайте www.mrccpe.com.ac.uk/vbase), а также в Kabat, EA, et al, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Чтобы избежать снижения активности при уменьшении иммуногенности, каркасные последовательности в вариабельной области антитела человека подвергают минимальным обратным мутациям для поддержания активности. Гуманизированное антитело по настоящему изобретению также включает гуманизированное антитело, для которого созревание аффинности CDR обеспечивали с применением фагового дисплея.

«Антитело к PCSK-9» представляет собой антитело, которое специфически связывается с PCSK-9, в том числе без ограничения серию h001 гуманизированных антител к PCSK-9 из PCT/CN2016/111053. При этом в случае серии h001 гуманизированных антител к PCSK-9 скрининг проводили на мышах, иммунизированных с помощью PCSK-9 человека, и осуществляли преобразование путем гуманизации.

«Антигенсвязывающий фрагмент» в настоящем изобретении относится к Fab-фрагменту, Fab'-фрагменту или F(ab')2-фрагменту, обладающему антигенсвязывающей активностью, а также scFv-фрагменту, связывающимся с PCSK9 человека, и другим фрагментами, способными к связыванию с PCSK9, которые образованы VH- и VL-областями антител, связывающих PCSK9; он содержит одну или более CDR-областей, выбранных из группы, состоящей из антител под SEQ ID NO: 12 - SEQ ID NO: 17, описанных в настоящем изобретении. Не имея константной области, Fv-фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, что представляет собой минимальный фрагмент антитела, обладающий всеми антигенсвязывающими сайтами. Обычно Fv антитела дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL и способно к образованию структуры, необходимой для связывания антигена. Также, разные линкеры могут применяться для соединения вариабельных областей из двух антител с образованием полипептидной цепи, называемой одноцепочечным антителом или одноцепочечным Fv (scFv). Термин «связывающийся с PCSK-9» в данном изобретении означает способность к взаимодействию с PCSK-9 человека. Термин «антигенсвязывающие сайты» в настоящем изобретении относится к непрерывным или прерывающимся, трехмерным сайтам на антигене, распознаваемым антителом или антигенсвязывающим фрагментом по настоящему изобретению.

Способы получения и осуществления очистки антител и антигенсвязывающих фрагментов хорошо известны из уровня техники и могут быть найдены, например, в Antibody Experimental Technology Guide of Cold Spring Harbor, разделы 5-8 и 15. Антитело или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению подвергают конструированию методами генной инженерии с введением одной или более каркасных областей (FR) человека в CDR-область, полученную от организма, отличного от человека. Последовательности FR зародышевой линии человека можно получить из базы данных генов вариабельных областей зародышевой линии человека ImMunoGeneTics (IMGT) с помощью программного обеспечения MOE от IMGT на их веб-сайте или из The Immunoglobulin FactsBook, 2001ISBN012441351.

Сконструированное антитело или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению могут быть получены и очищены с применением общепринятых способов. Например, последовательности cDNA, кодирующие тяжелую цепь и легкую цепь, могут быть клонированы в вектор экспрессии GS и подвергнуты рекомбинации. Вектор экспрессии рекомбинантного иммуноглобулина может быть стабильно трансфицирован в клетку линии CHO. В качестве более рекомендованного способа, хорошо известного из уровня техники, экспрессирующие системы на основе клеток млекопитающих обеспечивают гликозилирование антител, обычно на высококонсервативном N-конце в Fc-области. Могут быть получены клоны, стабильно экспрессирующие антитела, специфически связывающиеся с PCSK-9. Положительные клоны могут быть размножены в бессывороточной культуральной среде для продукции антител в биореакторах. Культуральную среду, в которую было секретировано антитело, можно подвергать очистке с помощью общепринятых методик. Например, очистку можно осуществлять с помощью FF-колонки, заполненной сефарозой с белком A или G, которая была уравновешена соответствующим буфером. Колонку промывают для удаления компонентов с неспецифическим связыванием. Связанное антитело элюируют градиентом pH и затем объединяют, и фрагменты антитела определяют с помощью SDS-PAGE. Антитело может быть отфильтровано и концентрировано с применением общепринятых методик. Растворимый агрегат и мультимеры могут быть эффективно удалены с помощью общепринятых методик, в том числе эксклюзионной или ионообменной хроматографии. Полученный продукт может быть подвергнут немедленному замораживанию, например при -70°C, или может быть лиофилизирован.

«Консервативные модификации» или «консервативная замена или замещение» относятся к замещению аминокислот в белке на другие аминокислоты, имеющие аналогичные характеристики (например, заряд, размер боковой цепи, гидрофобность/гидрофильность, конформацию и жесткость каркаса и т.д.), вследствие чего изменения часто могут быть выполнены без изменения биологической активности белка. Специалистам в данной области техники известно, что, как правило, замещение одной аминокислоты в несущественных областях полипептида по сути не изменяет биологическую активность полипептида (см., например, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Ed.)). Кроме того, замещение структурно или функционально аналогичных аминокислот с меньшей вероятностью нарушают биологическую активность.

«Идентичность» аминокислот относится к сходству последовательностей между двумя белковыми последовательностями или между двумя полипептидными последовательностями. Если положение в обеих из двух сравниваемых последовательностей занимает один и тот же аминокислотный остаток, тогда молекулы являются одинаковыми в этом положении. Примерами алгоритмов, подходящих для определения процента идентичности последовательностей и процента сходства последовательностей, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, которые описаны в Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 и Altschul et al, (1977) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, соответственно. Программное обеспечение для выполнения анализов BLAST доступно в Национальном центре биотехнологической информации (www.ncbi.nlm.nih.gov/).

«Введение» и «обработка», в случае применения по отношению к животному, человеку, экспериментальному субъекту, клетке, ткани, органу или биологической жидкости, относится к приведению в контакт экзогенного фармацевтического, терапевтического, диагностического средства или композиции с организмом животного, человека, субъекта, клеткой, тканью, органом или биологической жидкостью. «Введение» и «обработка» могут относиться, например, к терапевтическим, фармакокинетическим, диагностическим, исследовательским и экспериментальным способам. Обработка клетки охватывает приведение реагента в контакт с клеткой, а также приведение реагента в контакт с жидкостью, где жидкость находится в контакте с клетками. «Введение» и «обработка» также означают обработку in vitro и ex vivo, например, клетки, реагентом, диагностическим средством, связывающим соединением или другой клеткой. «Лечение» при применении к человеку, ветеринарному или исследовательскому субъекту, относится к терапевтическому лечению, профилактическим или превентивным мерам, к исследовательским и диагностическим путям применения.

«Лечить» означает осуществлять введение терапевтического средства, такого как композиция, содержащая любое из связывающих соединений по настоящему изобретению, внутренне или наружно пациенту, имеющему один или более симптомов заболевания, в отношении которого данное средство обладает известной терапевтической активностью. Как правило, терапевтическое средство вводят в количестве, эффективном для ослабления одного или более симптомов заболевания у подвергаемых лечению субъекта или популяции, с тем, чтобы вызвать регрессию или подавить прогрессирование такого(-их) симптома(-ов) до любой клинически измеримой степени. Количество терапевтического средства, которое является эффективным для ослабления любого конкретного симптома заболевания (также называемое «терапевтически эффективным количеством») может варьировать в зависимости от множества факторов, таких как стадия заболевания, возраст, вес пациента, а также способность лекарственного средства вызывать требуемый ответ у пациента. Произошло ли ослабление симптома заболевания, можно оценить с помощью любого клинического измерения, обычно применяемого врачами или другими квалифицированными медицинскими работниками для оценки тяжести или статуса прогрессирования этого симптома. Хотя варианты осуществления настоящего изобретения (например, способ лечения или изделия промышленного производства) могут не быть эффективным в отношении ослабления представляющего(-их) интерес симптома(-ов) заболевания у каждого пациента, он должен ослаблять представляющий(-е) интерес целевой(-ые) симптом(-ы) заболевания у статистически значимого числа пациентов, что определяется с помощью любого статистического теста, известного из уровня техники, такого как критерий Стьюдента, критерий хи-квадрат, U-критерий Манна-Уитни, критерий Крускала-Уоллиса (H-критерий), критерий Джонкхиера-Терпстра и критерий Уилкоксона.

«Эффективное количество» охватывает количество, достаточное для обеспечения улучшения в отношении симптома или признака заболевания или для их предупреждения. Эффективное количество также означает количество, достаточное для обеспечения возможности или облегчения диагностики. Эффективное количество для конкретного пациента или субъекта ветеринарии может варьировать в зависимости от факторов, таких как состояние, подлежащее лечению, общее состояние здоровья пациента, путь и доза введения и тяжесть побочных эффектов. Эффективное количество может представлять собой максимальную дозу или протокол введения доз, позволяющие избегать значительных побочных эффектов или токсических эффектов.

"Значение Tm" относится к температуре тепловой денатурации белка, а именно к температуре, при которой половина белка разворачивается, и пространственная структура белка в это время разрушается, следовательно, чем выше значение Tm, тем выше термостабильность белка.

«Замена» относится к замене системы растворителя, которая растворяет белки антител. Например, буферную систему стабильного состава применяют для замены системы растворителей с высоким содержанием соли или гипертонической системы растворителя, содержащей белок антитела, в физических режимах работы. При этом физические режимы работы включают без ограничения ультрафильтрацию, диализ или восстановление после центрифугирования.

ПРИМЕРЫ И ИСПЫТАНИЯ

Далее настоящее изобретение дополнительно подробно описано со ссылкой на следующие примеры, однако эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

В примерах настоящего изобретения, где не описаны конкретные условия, эксперименты обычно проводят в стандартных условиях, или в условиях, предложенных производителями материалов или продуктов. Если источник реагентов конкретно не указан, реагенты являются коммерчески доступными стандартными реагентами.

ПРИМЕРЫ

Получение антигена PCSK-9 и антитела к PCSK-9

Пример 1. Получение антигена PCSK9 и испытуемого белка

Разработка белка и его экспрессия

Пропротеиновую конвертазу субтилизин/кексинового типа 9 UniProt (PCSK9 человека, номер Uniprot: Q8MBP7) применяли в качестве шаблона при разработке аминокислотных последовательностей антигена и испытуемого белка PCSK9 по настоящему изобретению. Белки PCSK9 подвергали слиянию с разными метками, такими как His-метка или иммуностимулирующий пептид, такой как пептид PADRE, затем подвергали клонированию в векторах pTT5 (Biovector, № по кат.: 102762) или векторах pTargeT (Promega, A1410) соответственно. Затем белки PCSK9 транзиентно экспрессировали в клетках линии 293 или стабильно экспрессировали в клетках линии CHO-S и подвергали очистке. Наконец, получали антиген и испытуемый белок по настоящему изобретению.

PCSK9 с His-меткой, PCSK9-His6, применяемый в качестве иммуногена для иммунизации мышей или реагента для выявления:

MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARAQEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHLAQASQELQHHHHHH

SEQ ID NO: 1

Примечание: последовательность, выделенная подчеркиванием, представляет собой сигнальный пептид, а часть, выделенная курсивом, представляет собой последовательность His-метки (His6-метка).

PCSK9 с пептидом PADRE и His-меткой, PCSK9-PADRE-His6, который применяют в качестве иммуногена, содержащего пептид PADRE, который может вызывать иммунизацию:

MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARAQEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHLAQASQELQGSGAKFVAAWTLKAAAHHHHHH

SEQ ID NO: 2

Примечание: последовательность, выделенная подчеркиванием, представляет собой сигнальный пептид, последовательность, выделенная двойным подчеркиванием, представляет собой линкер, последовательность, выделенная пунктирной линией, представляет собой пептид PADRE, а часть, выделенная курсивом, представляет собой His6-метку.

Слитый белок на основе His-метки и PCSK9 с сайтом расщепления с помощью TEV, PCSK9-TEV-His6, N-PCSK9 (N-концевой домен PCSK9), может быть получен путем расщепления с помощью TEV и может применяться в качестве иммуногена:

MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARAQEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHENLYFQGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHLAQASQELQHHHHHH

SEQ ID NO: 3

Примечание: последовательность, выделенная подчеркиванием, представляет собой сигнальный пептид, последовательность, выделенная двойным подчеркиванием, представляет собой сайт расщепления с помощью TEV, а часть, выделенная курсивом, представляет собой His6-метку.

Мутантный белок PCSK9-D374Y с His-меткой, PCSK9-D374Y-His6, который применяют в качестве испытуемого реагента:

MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARAQEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSYCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHLAQASQELQHHHHHH

SEQ ID NO: 4

Примечание: последовательность, выделенная подчеркиванием, представляет собой сигнальный пептид, а часть, выделенная курсивом, представляет собой His6-метку.

Белок PCSK9, слитый с пептидом BP15, являющимся акцептором биотина, и His-меткой, PCSK9-BP15-His6, в качестве испытуемого реагента; пептид BP15 может подвергаться биотинилированию во время экспрессии, что позволяет избежать необходимости мечения биотином in vitro и возможных конформационных изменений.

MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARAQEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHLAQASQELQGSTSGSGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH

SEQ ID NO: 5

Примечание: последовательность, выделенная подчеркиванием, представляет собой сигнальный пептид, последовательность, выделенная двойным подчеркиванием, представляет собой пептид, являющийся акцептором биотина, а часть, выделенная курсивом, представляет собой His6-метку.

PCSK9-Y является аббревиатурой мутантного белка PCSK9 D374Y, слитого с пептидом BP15, являющимся акцептором биотина, и His-меткой, PCSK9-D374Y-BP15-His6, который применяют в качестве испытуемого белка:

MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARAQEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSYCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHLAQASQELQGSTSGSGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH

SEQ ID NO: 6

Примечание: последовательность, выделенная подчеркиванием, представляет собой сигнальный пептид, последовательность, выделенная двойным подчеркиванием, представляет собой пептид, являющийся акцептором биотина, и часть, выделенная курсивом, представляет собой His6-метку.

Внеклеточный домен белка LDLR, представляющего собой рецептор PCSK9, с Flag-меткой и His-меткой, LDLR-ECD-Flag-His6, применяемый в качестве испытуемого реагента:

MGPWGWKLRWTVALLLAAAGTAVGDRCERNEFQCQDGKCISYKWVCDGSAECQDGSDESQETCLSVTCKSGDFSCGGRVNRCIPQFWRCDGQVDCDNGSDEQGCPPKTCSQDEFRCHDGKCISRQFVCDSDRDCLDGSDEASCPVLTCGPASFQCNSSTCIPQLWACDNDPDCEDGSDEWPQRCRGLYVFQGDSSPCSAFEFHCLSGECIHSSWRCDGGPDCKDKSDEENCAVATCRPDEFQCSDGNCIHGSRQCDREYDCKDMSDEVGCVNVTLCEGPNKFKCHSGECITLDKVCNMARDCRDWSDEPIKECGTNECLDNNGGCSHVCNDLKIGYECLCPDGFQLVAQRRCEDIDECQDPDTCSQLCVNLEGGYKCQCEEGFQLDPHTKACKAVGSIAYLFFTNRHEVRKMTLDRSEYTSLIPNLRNVVALDTEVASNRIYWSDLSQRMICSTQLDRAHGVSSYDTVISRDIQAPDGLAVDWIHSNIYWTDSVLGTVSVADTKGVKRKTLFRENGSKPRAIVVDPVHGFMYWTDWGTPAKIKKGGLNGVDIYSLVTENIQWPNGITLDLLSGRLYWVDSKLHSISSIDVNGGNRKTILEDEKRLAHPFSLAVFEDKVFWTDIINEAIFSANRLTGSDVNLLAENLLSPEDMVLFHNLTQPRGVNWCERTTLSNGGCQYLCLPAPQINPHSPKFTCACPDGMLLARDMRSCLTEAEAAVATQETSTVRLKVSSTAVRTQHTTTRPVPDTSRLPGATPGLTTVEIVTMSHQALGDVAGRGNEKKPSSVRDYKDDDDKHHHHHH

SEQ ID NO: 7

Примечание: последовательность, выделенная подчеркиванием, представляет собой сигнальный пептид, последовательность, выделенная двойным подчеркиванием, представляет собой Flag-метку, и часть, выделенная курсивом, представляет собой His6-метку.

LCDR-Fc, слитый белок на основе усеченного внеклеточного домена LDLR с Fc hIgG1(с активностью связывания PCSK9), LDLR-sECD -Fc (hIgG1), применяемый в качестве испытуемого реагента:

MEFGLSWLFLVAILKGVQCGTNECLDNNGGCSHVCNDLKIGYECLCPDGFQLVAQRRCEDIDECQDPDTCSQLCVNLEGGYKCQCEEGFQLDPHTKACKEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 8

Примечание: последовательность, выделенная подчеркиванием, представляет собой сигнальный пептид, последовательность, выделенная двойным подчеркиванием, представляет собой усеченный внеклеточный домен LDLR с активностью связывания PCSK9 (LDLR-sECD), а часть, выделенная курсивом, представляет собой hIgG1-Fc.

Слитый белок в большей степени усеченного внеклеточного домена LDLR с Fc-фрагментом hIgG1 (с активностью связывания PCSK9), LDLR-ssECD -Fc (hIgG1), применяемый в качестве испытуемого реагента:

MEFGLSWLFLVAILKGVQCGTNECLDNNGGCSHVCNDLKIGYECLCPDGFQLVAQRRCEDIDEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 9

Примечание: последовательность, выделенная подчеркиванием, представляет собой сигнальный пептид, последовательность, выделенная двойным подчеркиванием, представляет собой в большей степени усеченный внеклеточный домен LDLR с активностью связывания PCSK9 (LDLR-ssECD), а часть, выделенная курсивом, представляет собой hIgG1-Fc.

Пример 2. Очистка рекомбинантных белков на основе PCSK9 и рекомбинантных белков на основе LDLR, и очистка гибридомных рекомбинантных антител

1. Стадии очистки рекомбинантных белков с His-меткой:

Образцы супернатанта с клеток, осуществляющих экспрессию, центрифугировали при высокой скорости центрифугирования и удаляли примеси. Буфер заменяли на PBS и добавляли имидазол до конечной концентрации 5 мМ. Никелевую колонку уравновешивали с помощью 2-5 колоночных объемов раствора PBS, содержащего 5 мМ имидазола. После замены буфера образец супернатанта загружали в колонку для аффинной хроматографии с иммобилизованными ионами металла (IMAC). Колонка промывали раствором PBS, содержащим 5 мМ имидазола до тех пор, пока показания при A280 не снижались до базового уровня. Затем хроматографическую колонку промывали с помощью PBS+ 10 мM имидазола для удаления неспецифически связывающихся белков и собирали элюат. Целевой белок элюировали с помощью раствора PBS, содержащего 300 мМ имидазола, и собирали элюируемые фракции, соответствующие его пику. Собранный элюат концентрировали и дополнительно очищали посредством гель-хроматографии на Superdex 200 (GE) с применением PBS в качестве подвижной фазы. Фракции, соответствующие пику мультимера, отбрасывали, а элюируемые фракции, соответствующие пику целевого белка, собирали. Полученные белки идентифицировали с помощью электрофореза, пептидного картирования и LC-MS. Получили PCSK9-His6 (SEQ ID NO:1), PCSK9-PADRE-His6 (SEQ ID NO: 2), PCSK9-TEV-His6 (SEQ ID NO: 3), PCSK9-D374Y-His6 (SEQ ID NO: 4), PCSK9-BP15-His6 (SEQ ID NO: 5) и PCSK9-D374Y-BP15-His6 (SEQ ID NO: 6) и их применяли в качестве иммуногенов или испытуемого белка по настоящему изобретению. PCSK9-TEV-His6 подвергали очистке и расщеплению ферментом TEV. Фермент TEV, неполностью расщепленный PCSK9-TEV-His6 или фрагмент C-концевого домена с His-меткой удаляли из полученного продукта на колонке IMAC. Элюат с IMAC концентрировали с получением сегмента PCSK9 только с N-концевым доменом (сокращенно N-PCSK9) и использовали его в качестве иммуногена для иммунизации мышей.

2. Стадии очистки рекомбинантного белка LDLR-ECD-Flag-His6 (SEQ ID NO: 7) с His-меткой и Flag-меткой

Образцы центрифугировали при высокой скорости для удаления примесей и затем концентрировали до необходимого объема. Колонку для аффинной хроматографии с антителами к Flag уравновешивали с помощью 2-5 колоночных объемов буфера 0,5×PBS. После удаления примесей образцы супернатанта с клеток, осуществляющих экспрессию, загружали в колонку. Колонку промывали с помощью 0,5×PBS до тех пор, пока показатель при A280 не снижался до базового уровня. Колонку промывали с помощью PBS, содержащего 0,3 M NaCl, и примесные белки элюировали и собирали. Целевые белки элюировали с помощью 0,1 M уксусной кислоты (pH 3,5-4,0) и собирали с последующим доведением pH до нейтрального. Собранный элюат концентрировали и дополнительно очищали посредством гель-хроматографии на Superdex 200 (GE) с применением PBS в качестве подвижной фазы. Фракцию, соответствующую пику мультимера, удаляли, а элюируемые фракции, соответствующие пику целевого белка, собирали. Полученные белки идентифицировали с помощью электрофореза, пептидного картирования и LC-MS, и разливали на аликвоты для последующего применения. LDLR-ECD-Flag-His6 (SEQ ID NO: 7) с FLAG/His6-метками получали и применяли для испытания эффективности функционирования антитела по настоящему изобретению.

3. Стадии очистки слитого белка на основе Fc и LDLR

Образцы супернатанта с клеток, осуществляющих экспрессию, центрифугировали при высокой скорости для удаления примесей, и затем образцы концентрировали до необходимого объема и загружали в колонку с белком A. Колонку промывали с помощью PBS до тех пор, пока показатель при A280 не снижался до базового уровня. Целевые белки элюировали с помощью 100 мМ ацетата натрия, pH 3,0, и затем нейтрализовали с помощью 1 M Tris-HCl. Элюируемые образцы надлежащим образом концентрировали и подвергали дополнительной очистке с помощью гель-хроматографии на Superdex 200 (GE), предварительно уравновешенной с помощью PBS. Собирали фракции, соответствующие пикам без мультимеров. Данный способ применяли для очистки LDLR-sECD -Fc (hIgG1) (SEQ ID NO: 8) и LDLR-ssECD -Fc (hIgG1) (SEQ ID NO: 9), оба из которых могут применяться для испытания эффективности функционирования антител к PCSK9.

Пример 3. Получение гибридомных моноклональных антител к PCSK9 человека

1. Иммунизация

Моноклональные антитела человека к PCSK9 получали путем иммунизации мышей. Самок белых мышей линии SJL возрастом 6 недель (Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., номер лицензии на животноводство: SCXK (Пекин) 2012-0001) применяли в данном эксперименте и выращивали в лаборатории SPF. После покупки мышей содержали в лаборатории в течение 1 недели с применением цикла свет/темнота 12/12 часов при температуре 20-25°C и влажности 40-60%. Мышей, которые адаптировались к окружающей среде, иммунизировали в соответствии с двумя следующими схемами, по 6-10 особей на группу. Иммуногены представляли собой PCSK9-His6 (SEQ ID NO: 1) с меткой His, PCSK9-PADRE-His6 (SEQ ID NO: 2) и N-PCSK9 (SEQ ID NO: 3) человека.

Схема A: эмульгирование с адъювантом Фрейнда (номер серии Sigma: F5881/F5506). Полный адъювант Фрейнда (CFA) применяли для первичной иммунизации, а неполный адъювант Фрейнда (IFA) применяли для бустерной иммунизации. Соотношение антигена к адъюванту составляло 1:1, 100 мкг/мышь при первичной иммунизации, и 50 мкг/мышь при бустерной иммунизации. На день 0 каждой мыши внутрибрюшинно (IP) вводили 100 мкг эмульгированных антигенов, после первичной иммунизации один раз в две недели, в общей сложности в течение 6-8 недель.

Схема B. Мышей подвергали перекрестной иммунизации с помощью Titermax (номер серии Sigma: T2684) и квасцов (номер партии Thremo: 77161). Соотношение антигена и адъюванта (Titermax) составляло 1:1, и соотношение антигена и адъюванта (квасцы) составляло 3:1, 10-20 мкг/мышь при первичной иммунизации, и 5 мкг/мышь при бустерной иммунизации. На день 0 каждой мыши внутрибрюшинно (IP) вводили 20/10 мкг эмульгированных антигенов, после первичной иммунизации раз в неделю, с попеременным применением Titermax и квасцов в общей сложности в течение 6-11 недель. Спустя четыре недели после иммунизации антиген вводили в дорсальную часть или внутрибрюшинно, в соответствии с состоянием набухания дорсальной и брюшной области.

2. Слияние клеток

Для слияния спленоцитов выбирали мышей с высокими титрами антител в сыворотке (см. испытания 1 и 2, метод ELISA для выявления связывания с PCSK9) и с титрами антител, проявляющими тенденцию к стабильному уровню. За 72 часа до слияния, выбранных мышей иммунизировали путем внутрибрюшинной инъекции PCSK9-His6 из расчета 10 мкг/мышь. Для получения клеток гибридомы лимфоциты селезенки и клетки миеломы Sp2/0 (ATCC® CRL-8287™) подвергали слиянию с помощью оптимизированной PEG-опосредованной процедуры слияния. Слитые клетки гибридомы ресуспендировали в полной среде HAT (среда RPMI-1640, содержащая 20% FBS, 1×HAT и 1×OPI) и затем вносили аликвоты в 96-луночные планшеты для культивирования клеток (1×105/150 мкл/лунка) с последующей инкубацией при 37°C и 5% CO2. На день 5 после слияния добавляли полную среду HAT по 50 мкл/лунка и инкубировали при 37°C и 5% CO2. В период со дня 7 по день 8 после слияния, в зависимости от плотности роста клеток, всю среду заменяли на полную среду HT (среда RPMI-1640, содержащая 20% FBS, 1×HT и 1×OPI), по 200 мкл/лунка, и инкубировали при 37 C и 5% CO2.

3. Скрининг клеток гибридомы

В период со дня 10 по день 11 после слияния, в зависимости от плотности роста клеток, проводили анализы ELISA для выявления связывания с PCSK9 или PCSK9-Y (см. испытания 1 и 2). Положительные клетки при испытании с помощью ELISA выявляли как те, которые обеспечивали блокирование связывания PCSK9 или PCSK9-Y с LDLR при ELISA (см. испытания 3 и 4). Среду в положительных лунках заменяли, и клетки распределяли по 24-луночным планшетам в соответствии с плотностью роста клеток. После повторного испытания штаммы клеток, перенесенные в 24-луночный планшет, сохраняли и осуществляли их первое субклонирование. Положительные клетки, определенные с помощью скрининга после первого субклонирования (см. испытания 1 и 2), сохраняли и осуществляли их второе субклонирование. Положительные клетки, определенные с помощью скрининга после второго субклонирования (см. испытания 1 и 2), сохраняли и обеспечивали осуществление ими экспрессии белка. После нескольких слияний получали клетки гибридомы, способные к блокированию связывания PCSK9 или PCSK9-Y с LDLR.

Клон гибридомы mAb-001 получали путем скрининга на основании анализа блокирования и анализа связывания. Антитела дополнительно получали посредством способа культивирования клеток в бессывороточной среде, и антитело очищали в соответствии с примером очистки для применения в примере испытания.

Последовательность вариабельной области антитела мыши из клона гибридомы mAb-001 была следующей:

> mAb-001 VH

QVHLQQSGAELAKPGASVKLSCKASGYTFNDYWMHWVKERPGQGLEWIGYINPSSGFTKYHQNFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTYDDSAVYYCARQYDYDEDWYFDVWGTGTTVTVSS

SEQ ID NO: 10

> mAb-001VL

DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNFLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGRGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSFNLFTFGSGTKLEIK

SEQ ID NO: 11

Примечание: порядок расположения FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, где часть, выделенная курсивом, представляет собой последовательность FR, а выделенная подчеркиванием представляет собой последовательность CDR.

Таблица 1. Последовательности CDR-области тяжелой цепи и легкой цепи антитела к PCSK-9 mAb-001

Пример 4. Гуманизация гибридомного моноклонального антитела к PCSK9 человека

1. Выбор каркаса, подлежащего гуманизации, для гибридомного клона mAb-001

Путем выравнивания по базе данных генов вариабельных областей тяжелой и легкой цепей зародышевой линии человека IMGT с помощью программного обеспечения MOE от IMGT в качестве матриц были отобраны гены вариабельных областей тяжелой и легкой цепи с высокой гомологией с mAb-001 соответственно. CDR таких двух антител мыши были соответственно привиты в соответствующие матрицы антител человека с образованием последовательностей вариабельной области с порядком расположения FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. При этом аминокислотные остатки были пронумерованы и аннотированы в соответствии с системой нумерации по Kabat.

Матрицами гуманизированной легкой цепи антитела мыши mAb-001 являются IGKV1-39*01 и hjk2.1, а матрицами гуманизированной тяжелой цепи являются IGHV1-2*02 и hjh2. Последовательность вариабельной области гуманизированного антитела h001-1, полученного в результате гуманизации, является следующей:

> h001-1 VH

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYWMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSSGFTKYHQNFKDRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARQYDYDEDWYFDVWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO: 18

> h001-1 VL

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNSRTRKNFLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSFNLFTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO: 24

Примечание: порядок расположения в вариабельной области FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, где часть, выделенная курсивом, представляет собой последовательность FR, а выделенная подчеркиванием представляет собой последовательность CDR.

2. Выбор матрицы и разработка обратной мутации для клона гибридомы mAb-001 показаны в таблице 2. Комбинации гуманизированных последовательностей из клонов гибридомы после обратной мутации показаны в таблице 4.

Таблица 2. Выбор матрицы и разработка обратной мутации

Примечание: например, в соответствии с системой нумерации по Kabat, S66D означает, что в результате обратной мутации S в положении 66 подвергалось замене на D.

«Привиты» означает, что CDR из антитела мыши были привиты в последовательности FR-области зародышевой линии человека, и специфические последовательности мутантных вариабельных областей показаны в таблице 3.

Таблица 3. Последовательности вариабельной области каждого мутанта

Примечание: части последовательностей, выделенные подчеркиванием, представляют собой CDR-области.

Таблица 4. Комбинации гуманизированных последовательностей антител мыши mAb-001

Примечание: в вышеприведенной таблице показаны комбинации вариабельных областей гуманизированного антитела, полученные путем объединения различных последовательностей и мутированных последовательностей на их основе. Например, h001-1 обозначает, что вариабельная область гуманизированного антитела h001-1 состоит из легкой цепи h001_VL1 и тяжелой цепи h001_VH.1A, и т.д.

3. Вышеприведенные гуманизированные последовательности объединяли с образованием антитела, где константная область тяжелой цепи получена из IgG1 человека, а константная область легкой цепи получена из каппа-цепи человека. Получали соответствующее гуманизированное антитело, и полученные антитела к PCSK9 по настоящему изобретению характеризовались относительно высокой активностью связывания с PCSK9 и PCSK9-, а также могли эффективно блокировать связывание PCSK9/PCSK9-Y с LDLR.

Пример 5. Конструирование и экспрессия гуманизированных антител к PCSK9 человека в форматах IgG1 и IgG1-YTE

Способ конструирования и экспрессии гуманизированных антител к PCSK9 человека включает следующее.

1. Разработка праймеров. Несколько праймеров были разработаны с применением доступного онлайн программного обеспечения DNAWorks (v3.2.2, http://helixweb.nih.gov/dnaworks/) для синтеза фрагментов генов, содержащих VH/VK, необходимых для рекомбинации: 5'-сигнальный пептид длиной -30 п.о. + VH/VK +CH1/CL длиной 30 п.о.- 3'. Принцип разработки праймеров является следующим: если целевой ген 2 отличается от целевого гена 1 на 2 аминокислоты, разрабатывают другой праймер, специфичный к сайту мутации, как показано на фиг. 1.

2. Сплайсинг фрагментов: в соответствии с инструкциями по эксплуатации ДНК-полимеразы PrimeSTAR GXL компании TaKaRa проводили двухстадийную ПЦР-амплификацию с несколькими праймерами, разработанными выше, и получали фрагменты генов, содержащие VH/VK, необходимые для рекомбинации.

3. Конструкция вектора экспрессии pHr (с сигнальным пептидом и фрагментом гена константной области (CH1-FC/CL)) и ферментативное расщепление с помощью рестриктаз.

Вектор экспрессии pHr (с сигнальным пептидом и фрагментом гена константной области (CH1-FC/CL)) разрабатывали и конструировали с применением свойств определенных сайт-специфических рестрикционных ферментов, таких как BsmBI, у которых последовательность распознавания отличается от сайта расщепления, как показано на фиг. 2. Вектор расщепляли с применением BsmBI и липкие концы восстанавливали для последующего применения.

4. Конструкция рекомбинантного вектора экспрессии VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr.

VH/VK, содержащие фрагменты гена, необходимые для рекомбинации, и восстановленный вектор экспрессии pHr (с сигнальным пептидом и фрагментом гена константной области (CH1-FC/CL)) подвергали расщеплению ферментом BsmBI, добавляли к компетентным клеткам DH5 альфа в соотношении 3:1, инкубировали на ледяной бане при 0°C в течение 30 мин., и подвергали тепловому шоку в течение 90 секунд при 42°C. Затем добавляли 5-кратный объем среды LB, инкубировали при 37°C в течение 45 мин., вносили в планшет LB-Amp, и культивировали при 37°C в течение ночи. Отдельные клоны отбирали и отправляли для секвенирования с получением целевых клонов.

Антитело по данному изобретению может быть разработано и сконструировано в соответствии с вышеуказанным способом, но не ограничивается им. Принимая h001-4 в качестве примера, антитело и его варианты были разработаны для получения: 1) h001-4-WT: h001-4 в формате IgG, т.е. комбинация гуманизированной последовательности h001-4, объединяющая константную область тяжелой цепи, полученную из IgG1 человека, с константной областью легкой цепи, полученной из каппа-цепи человека; 2) h001-4-YTE: h001-4 в формате IgG1-YTE, т.е. комбинация гуманизированной последовательности h001-4, объединяющая константную область тяжелой цепи мутантного IgG1 человека (мутация YTE) с константной областью легкой цепи, полученной из каппа-цепи человека. Мутантный IgG1 человека также может предусматривать формы с другими мутациями.

Последовательности сконструированных и экспрессируемых гуманизированных антител к PCSK9 человека (в их форматах IgG1 и IgG1-YTE) являются следующими.

H001-4 в формате IgG1, константная область его тяжелой цепи получена из IgG1 человека, а константная область легкой цепи получена из легкой каппа-цепи человека.

Аминокислотная последовательность тяжелой цепи (IgG1 человека) являются следующей:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYWMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSSGFTKYHQNFKDRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARQYDYDEDWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 28

Последовательность ДНК тяжелой цепи являются следующей:

ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTCGCGATTCTTAAGGGTGTCCAGTGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCGAGCGTAAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGATACACCTTCACCGACTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCAGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGCTACATCAACCCCAGCAGCGGCTTTACCAAGTATCACCAGAACTTCAAAGACAGGGTGACCATGACCAGGGACACCAGCATCAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGCAATACGACTACGACGAGGACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCCAAGGAACCACCGTGACTGTGAGCAGCGCTTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

SEQ ID NO: 29

h001-4-каппа

Аминокислотная последовательность легкой цепи является следующей:

DIVMSQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNSRTRKNFLAWYQQKPGKSPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSFNLFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 30

Последовательность ДНК легкой цепи является следующей:

ATGGACATGCGCGTGCCCGCCCAGCTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCGCGATGCGACATCGTGATGTCTCAGAGCCCATCTAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTAACCATCACCTGCAAGAGCAGCCAAAGCCTGCTGAACAGCAGGACCCGCAAGAACTTCCTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGtctCCCAAGTTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGGGAGAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGCTCCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCTAGTCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCAAGCAGAGCTTCAATCTGTTCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA

SEQ ID NO: 31

Легкая цепь h001-4-IgG1-YTE представляет собой h001-4-каппа: SEQ ID NO: 30)

Аминокислотная последовательность тяжелой цепи IgG1-YTE является следующей:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYWMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSSGFTKYHQNFKDRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARQYDYDEDWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 32

Последовательность ДНК тяжелой цепи является следующей:

ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTCGCGATTCTTAAGGGTGTCCAGTGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCGAGCGTAAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGATACACCTTCACCGACTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCAGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGCTACATCAACCCCAGCAGCGGCTTTACCAAGTATCACCAGAACTTCAAAGACAGGGTGACCATGACCAGGGACACCAGCATCAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGCAATACGACTACGACGAGGACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCCAAGGAACCACCGTGACTGTGAGCAGCGCTTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCTACATCACCCGGGAGCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

SEQ ID NO: 33

Примечание: последовательность, выделенная подчеркиванием, представляет собой последовательность ДНК сигнального пептида.

Типичный процесс получения фармацевтической композиция (состава) на основе антитела

Стадия 1. Брали некоторое количество образца очищенного антитела к PCSK-9 (такого как h001-4-YTE) и растворитель заменяли (предпочтительно с помощью ультрафильтрации) 6-кратным объемом буфера, не содержащего антитело (такого как 10 мМ буфер на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,0), с помощью ультрафильтрационной мембраны до тех пор, пока белок не был сконцентрирован до 60 мг/мл (±2 мг/мл). Добавляли некоторый объем исходного раствора сахарозы и перемешивали до достижения конечной концентрации сахарозы 25 мг/мл. Добавляли некоторый объем исходного раствора Tween-80 и перемешивали до достижения конечной концентрации Tween-80 0,2 мг/мл. Добавляли 10 мМ гистидинового буфера (pH 6,0) для доведения белка до концентрации 50 мг/мл (±5 мг/мл). Значение pH конечного продукта составляло приблизительно 6,3 ± 0,1 (другие составы, подлежащие испытанию, или стабильные составы следует готовить аналогичным образом).

После того, как продукт был отфильтрован, отбирали образцы контроля в процессе производства, чтобы определить его стерильность. Лекарственное средство пропускали через фильтрующий элемент на основе PVDF с размером пор 0,22 мкм и собирали фильтрат.

Стадия 2. Объем загрузки регулировали до 3,6 мл, фильтрат вносили во флаконы вместимостью 6 мл, прикрытые пробкой, определяли разницу загрузки с помощью отбора образцов для контроля в процессе производства в начале, середине и конце стадии заполнения соответственно.

Стадия 3. После розлива и укупорки раствор помещали в камеру для лиофилизации и лиофилизировали. Процесс лиофилизации включал предварительное замораживание, первичное высушивание и вторичное высушивание. После завершения процесса лиофилизации лиофилизированный порошок укупоривали под вакуумом.

Время лиофилизации можно регулировать в зависимости от конкретной ситуации. Tип лиофилизатора, объем загрузки лиофилизированного лекарственного препарата и контейнер, в котором содержится лиофилизированный лекарственный препарат, будут влиять на время лиофилизации. Такое регулирование времени широко известно специалистам в данной области техники.

Стадия 4. Включали укупорочную машину, добавляли алюминиевые крышки и таким образом выполняли укупорку.

Стадия 5. Визуальный осмотр применяли для подтверждения того, что продукт не имел таких дефектов, как разрушение и неточный объем загрузка. Распечатывали и наклеивали этикетку на флакон; распечатывали этикетку на коробку, коробку складывали, упаковывали и на коробку наклеивали этикетку.

Пример 6. Скрининг буферной системы

Получали образцы состава на основе антитела к PCSK9 с концентрацией белка 1 мг/мл со следующими буферными растворами:

1) 20 мМ лимонная кислота-цитрат натрия, pH 4,0;

2) 20 мМ лимонная кислота-цитрат натрия, pH 4,5;

3) 20 мМ лимонная кислота-цитрат натрия, pH 5,0;

4) 20 мМ лимонная кислота-цитрат натрия, pH 5,5;

5) 20 мМ лимонная кислота-цитрат натрия, pH 6,0;

6) 20 мМ дигидрофосфат натрия-динатрия гидрофосфат, pH 6,0;

7) 20 мМ дигидрофосфат натрия-динатрия гидрофосфат, pH 6,5;

8) 20 мМ дигидрофосфат натрия-динатрия гидрофосфат, pH 7,0;

9) 20 мМ дигидрофосфат натрия-динатрия гидрофосфат, pH 7,5;

10) 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5;

11) 20 мМ Tris-HCl, pH 8,0;

12) 20 мМ Tris-HCl, pH 8,5.

Термическую стабильность антитела к PCSK9 в каждом образце состава определяли методом дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC). Анализ средней температуры термической денатурации (Tm) антитела к PCSK-9 показал, что оно проявляло большую термическую стабильность при pH ≥ 6,0. Результаты показаны в таблице 5. Следовательно, для последующих исследований выбрали буферы со значениями pH 6,0-6,5, такие как буфер на основе гистидина гидрохлорида, буфер на основе дигидрофосфата натрия и динатрия гидрофосфата, буфер на основе янтарной кислоты и сукцината натрия и буфер на основе лимонной кислоты и цитрата натрия.

Таблица 5. Результаты скрининга с использованием DSC антитела H001-4-YTE в разных буферных системах и при разных значениях pH

Примечание: н.п. означает, что ингредиент не добавляли.

Получали образцы состава на основе антитела к PCSK9 с концентрацией белка 1 мг/мл со следующими буферными растворами:

1) 20 мМ гистидина гидрохлорид, pH 6,0;

2) 20 мМ гистидина гидрохлорид, pH 6,5;

3) 20 мМ дигидрофосфат натрия-динатрия гидрофосфат, pH 6,0;

4) 20 мМ дигидрофосфат натрия-динатрия гидрофосфат, pH 6,5;

5) 20 мМ янтарная кислота-сукцинат натрия, pH 6,0;

6) 20 мМ лимонная кислота-цитрат натрия, pH 6,0;

7) 20 мМ лимонная кислота-цитрат натрия, pH 6,5.

Термическую стабильность антитела к PCSK9 в каждом образце состава определяли методом дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC). Анализ средней температуры термической денатурации (Tm) антитела к PCSK-9 показал (см. таблицу 6), что антитело к PCSK-9 характеризовалось несколько более высокой стабильностью в гистидиновой, фосфатной и сукцинатной буферных системах по сравнению с таковой в цитратной буферной системе.

Таблица 6. Результаты скрининга с использованием DSC антитела H001-4-YTE в разных буферных системах и при разных значениях pH

Примечание: н.п. означает, что ингредиент не добавляли.

Пример 7. Скрининг сахаров в составе

Получали образцы состава на основе антитела к PCSK9 с концентрацией белка 150 мг/мл со следующими буферными растворами:

1) 20 мМ гистидина гидрохлорид, 70 мг/мл сахарозы, pH 6,5;

2) 20 мМ гистидина гидрохлорид, 70 мг/мл дигидрата α,α-трегалозы, pH 6,5.

Каждый состав фильтровали и разливали во флаконы вместимостью 2 мл по 0,5 мл на флакон и флакон укупоривали пробкой. Образцы поочередно подвергали воздействию высокой температуры 40°С, низкой температуры, света и циклов замораживания-оттаивания (образцы помещали в условия с температурой -20°С на 24 ч., а затем извлекали и помещали в условия с комнатной температурой до полного оттаивания и перемешивали образец, что составляло один цикл). Результаты показали, что сахароза и трегалоза оказывают аналогичное воздействие на стабильность антитела к PCSK-9. Сахарозу выбрали в качестве стабилизатора для антитела к PCSK-9, результаты приведены в таблице 7.

Таблица 7. Результаты ускоренного эксперимента для H001-4-YTE с разными сахарами

Получали образцы состава на основе антитела к PCSK9 с концентрацией белка 150 мг/мл со следующими буферными растворами:

1) 20 мМ гистидина гидрохлорида, 0 мг/мл сахарозы, pH 6,5;

2) 20 мМ гистидина гидрохлорида, 10 мг/мл сахарозы, pH 6,5;

3) 20 мМ гистидина гидрохлорида, 40 мг/мл сахарозы, pH 6,5;

4) 20 мМ гистидина гидрохлорида, 70 мг/мл сахарозы, pH 6,5.

Значение осмотического давления указывает на то, что осмотическое давление соответствует минимальному требованию в отношении подкожных инъекций, если концентрация сахарозы составляет ≥70 мг/мл. Состав на основе антитела к PCSK-9 по настоящему изобретению получали способом, предусматривающим лиофилизацию при низкой концентрации и восстановление при высокой концентрации (лиофилизации подвергали трехкратный объем исходного раствора, для восстановления применяли один объем воды для инъекций, и если не указано иное, в настоящем изобретении вышеуказанное соотношение является принятым для выполнения лиофилизации). Если концентрация сахарозы в конечном составе (восстановленном составе) составляет 75 мг/мл, это не только соответствует требованию в отношении осмотического давления при инъекции, но также облегчает получение такой концентрации сахарозы из концентрации исходного раствора, которая составляет 25 мг/мл, и при этом концентрация сахарозы 25 мг/мл легко подвергается лиофилизации.

Таблица 8. Результаты определения соотношения концентрации сахарида и осмотического давления для состава на основе H001-4-YTE

Примечание: н.п. означает, что ингредиент не добавляли.

Пример 8. Скрининг поверхностно-активных веществ в составах

Получали образцы состава на основе антитела к PCSK9 с концентрацией белка 150 мг/мл со следующими буферными растворами:

1) 20 мМ гистидина гидрохлорида, pH 6,5;

2) 20 мМ гистидина гидрохлорида, 0,2 мг/мл полисорбата 20, pH 6,5;

3) 20 мМ гистидина гидрохлорида, 0,4 мг/мл полисорбата 80, pH 6,5.

Образец каждого состава фильтровали и вносили во флаконы вместимостью 2 мл по 0,5 мл на флакон, и флакон укупоривали пробкой. Образцы помещали во встряхиватель, поддерживающий постоянную температуру 25°C, и встряхивали при 300 об./мин. Результаты анализа внешнего вида показали, что поверхностно-активные вещества эффективно предотвращали агрегацию антител к PCSK-9. В отношении H001-4-YTE между полисорбатом 20 и полисорбатом 80 значительных отличий не наблюдали. Полисорбат 80 выбрали в качестве стабилизатора состава на основе антитела к PCSK-9.

Таблица 9. Влияние поверхностно-активного вещества на агрегацию H001-4-YTE при встряхивании при 300 об./мин., 25°C

Пример 9. Скрининг и подтверждение буферной системы в составе

Образцы состава, содержащие 25 мг/мл сахарозы, 0,2 мг/мл полисорбата 80 и 50 мг/мл антитела, получали с применением буферного раствора, содержащего 20 мМ гистидина гидрохлорид или 20 мМ янтарной кислоты-сукцината натрия при pH 6,0 или 6,5. Каждый состав фильтровали и разливали во флаконы из нейтрального боросиликатного стекла вместимостью 6 мл по 3,6 мл на флакон для лиофилизации, и флакон укупоривали пробкой из галогенированного бутилкаучука, который применяли для лиофилизированного стерильного порошка. Лиофилизированный продукт хранили при 2-8°С, 25°С и 40°С, и затем восстанавливали водой для инъекций для анализа стабильности. Результаты показали, что антитело к PCSK9 было очень стабильным при 2-8°С и 25°С. Однако, внешний вид восстановленной композиции в день 0 показал, что буфер с янтарной кислотой при рН 6,0 характеризовался значительным уровнем опалесценции по сравнению с системой на основе His (не указано в таблице), поэтому гистидиновую систему выбрали в качестве буферной системы для антитела к PCSK-9.

Таблица 10. Стабильность лиофилизированного порошка H001-4-YTE при различных температурах

Пример 10. Комплексный скрининг компонентов состава

Образцы состава на основе антитела к PCSK-9, содержащие 50 мг/мл антитела к PCSK-9 и 25 мг/мл сахарозы, получали со следующими буферами с разными значениями рН, разной ионной силой и содержащими разные концентрации поверхностно-активных веществ:

1) 10 мМ гистидина гидрохлорида, 0,1 мг/мл полисорбата 80, pH 6,5;

2) 10 мМ гистидина гидрохлорида, 0,3 мг/мл полисорбата 80, pH 6,0;

3) 10 мМ гистидина гидрохлорида, 0,2 мг/мл полисорбата 80, pH 5,5;

4) 15 мМ гистидина гидрохлорида, 0,3 мг/мл полисорбата 80, pH 5,5;

5) 10 мМ гистидина гидрохлорида, 0,2 мг/мл полисорбата 80, pH 6,0;

6) 15 мМ гистидина гидрохлорида, 0,3 мг/мл полисорбата 80, pH 6,5;

7) 15 мМ гистидина гидрохлорида, 0,2 мг/мл полисорбата 80, pH 6,0;

8) 5 мМ гистидина гидрохлорида, 0,3 мг/мл полисорбата 80, pH 5,5;

9) 15 мМ гистидина гидрохлорида, 0,1 мг/мл полисорбата 80, pH 5,5;

10) 5 мМ гистидина гидрохлорида, 0,1 мг/мл полисорбата 80, pH 6,0;

11) 5 мМ гистидина гидрохлорида, 0,2 мг/мл полисорбата 80, pH 6,5.

Образец каждого состава фильтровали и разливали во флаконы из нейтрального боросиликатного стекла вместимостью 6 мл по 3,6 мл на флакон для лиофилизации, и флакон укупоривали пробкой из галогенированного бутилкаучука, который применяли для лиофилизированного стерильного порошка. Лиофилизированный продукт хранили при 40°С для анализа на стабильность. Данные анализа, основанного на определении отличий мономерного состава с помощью SEC, показали, что антитело к PCSK-9 в составе, содержащем 10 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида с pH 6,0, 0,2 мг/мл полисорбата 80, было более стабильным при концентрации белка 50 мг/мл и концентрации сахарозы 25 мг/мл. После лиофилизации и восстановления, концентрацию каждого компонента конечного состава (150 мг/мл белка, 75 мг/мл сахарозы, 30 мМ буфер на основе гистидина гидрохлорида и 0,6 мг/мл полисорбата 80) определяли как трехкратную концентрацию лекарственного средства перед лиофилизацией, pH 6,3 ± 0,1.

Таблица 11. Результаты эксперимента с воздействием на H001-4-YTE высокой температуры

Пример 11. Оптимизация температуры первичного высушивания

Образцы состава на основе антитела к PCSK9 с концентрацией антитела к PCSK9, составляющей 50 мг/мл, 25 мг/мл сахарозы, 0,2 мг/мл полисорбата 80 получали с использованием 10 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида при pH 6,0. Антитело вносили во флакон вместимостью 6 мл по 3,6 мл на флакон и лиофилизировали при температуре первичного высушивания, составляющей -14°С и -5°С соответственно, и флакон укупоривали пробкой для лиофилизации. Сравнивали восстановленные образцы до и после лиофилизации. Результаты показали, что температура -5°C является предпочтительной для первичного высушивания при лиофилизации.

Таблица12. Сравнение образцов H001-4-YTE, полученных с применением разных способов высушивания, до и после лиофилизации.

Пример 12. Определение совместимости между составом и контейнерами из различных материалов

Получали H001-4-YTE в концентрации 50 мг/мл в растворе, содержащем 10 мМ гистидина гидрохлорида, pH 6,0, с 25 мг/мл сахарозы и 0,2 мг/мл полисорбата 80. Образцы состава разливали в стеклянные колбы, пакеты для хранения жидкостей и контейнеры из нержавеющей стали вместимостью 316 л и оставляли при 2-8°C на 24 часа. Анализ содержания и чистоты белка показал, что H001-4-YTE является стабильным на протяжении 24 часов. Состав являлся совместимым с контейнером из нержавеющей стали вместимостью 316 л, стеклянной колбой и пакетом для хранения жидкостей.

Таблица 13. Стабильность H001-4-YTE при контакте с разными материалами

Пример 13. Определение совместимости состава с различными фильтрами

Получали H001-4-YTE в концентрации 50 мг/мл в растворе, содержащем 10 мМ буфер на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,0, с 25 мг/мл сахарозы и 0,2 мг/мл полисорбата 80. Образец состава пропускали через PES-фильтры и PVDF-фильтры с размером пор 0,22 мкм, и образцы собирали через 30 мин. и через 1 ч. для испытания. Анализ содержания белка, внешнего вида и чистоты показал, что H001-4-YTE являлся стабильным в течение 1 часа с момента контакта с фильтром. Состав является совместимым как с PES-, так и с PVDF-фильтрами.

Таблица 14. Стабильность H001-4-YTE при применении разных материалов фильтрующих мембран

Пример 14. Другие составы, являющиеся альтернативными по отношению к данному составу

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно применять в качестве исходного раствора для получения фармацевтического состава или непосредственно в качестве раствора для инъекций. Если фармацевтическую композицию по настоящему изобретению применяют в качестве исходного раствора для получения фармацевтического препарата, лиофилизированный состав получают посредством способа лиофилизации и восстанавливают в растворе для инъекций для клинического применения. Лиофилизированный состав по настоящему изобретению получают в соответствии со способом, предусматривающим лиофилизацию при низкой концентрации и восстановление при высокой концентрации, то есть раствор фармацевтического состава с низкой концентрацией лиофилизируют с получением лиофилизированного состава, и лиофилизированный состав восстанавливают с получением фармацевтической композиции с более высокой концентрацией для клинического применения. Лиофилизированный состав обладает большей стабильностью при хранении, чем жидкий состав. Чем выше концентрация каждого компонента исходного раствора для получения фармацевтического состава, используемого для получения лиофилизированного препарата, тем дольше время лиофилизации. При комплексном рассмотрении показателей процесса лиофилизации, концентрация каждого компонента исходного раствора для получения фармацевтического состава после восстановления обычно в 2-5 раз превышает концентрацию компонента в растворе для инъекций до восстановления, и в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения превышение является 3-кратным.

Стабильный фармацевтический состав, предусмотренный настоящим изобретением, содержит белок, представляющий собой антитело к PCSK-9 (неограничивающий вариант осуществления, такой как h001-4-YTE), в комбинации с любым из следующих стабильных буферов:

(1) 150 мг/мл антитела h001-4-YTE, 75 мг/мл сахарозы, 0,6 мг/мл полисорбата 80 и 30 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,4;

(2) 150 мг/мл антитела h001-4-YTE, 75 мг/мл сахарозы, 0,6 мг/мл полисорбата 80 и 30 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,2;

(3) 150 мг/мл антитела h001-4-YTE, 75 мг/мл сахарозы, 0,6 мг/мл полисорбата 80 и 30 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,3;

(4) 50 мг/мл антитела h001-4-YTE, 25 мг/мл сахарозы, 0,2 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,4;

(5) 50 мг/мл антитела h001-4-YTE, 25 мг/мл сахарозы, 0,2 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,3;

(6) 50 мг/мл антитела h001-4-YTE, 25 мг/мл сахарозы, 0,2 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,2;

(7) 50 мг/мл антитела h001-4-YTE, 25 мг/мл сахарозы, 0,2 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, конечное значение pH 6,1;

(8) 50 мг/мл антитела h001-4-YTE, 25 мг/мл сахарозы, 0,2 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,0;

(9) 50 мг/мл антитела h001-4-YTE, 25 мг/мл сахарозы, 0,2 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,5;

(10) 50 мг/мл антитела h001-4, 25 мг/мл сахарозы, 0,2 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,3;

(11) 50 мг/мл антитела h001-4, 25 мг/мл сахарозы, 0,2 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,2;

(12) 50 мг/мл антитела h001-4, 25 мг/мл сахарозы, 0,2 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,4;

(13) 50 мг/мл антитела h001-4-YTE, 25 мг/мл сахарозы, 0,1 мг/мл полисорбата 80 и 20 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,3;

(14) 50 мг/мл антитела h001-4-YTE, 25 мг/мл сахарозы, 0,2 мг/мл полисорбата 80 и 15 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,2;

(15) 50 мг/мл антитела h001-4-YTE, 25 мг/мл сахарозы, 0,2 мг/мл полисорбата 80 и 20 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,4.

(16) 30 мг/мл антитела h001-4-YTE, 10 мг/мл сахарозы, 0,05 мг/мл полисорбата 80 и 5 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 5,5;

(17) 70 мг/мл антитела h001-4-YTE, 75 мг/мл сахарозы, 0,6 мг/мл полисорбата 80 и 30 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,5;

(18) 45 мг/мл антитела h001-4-YTE, 20 мг/мл сахарозы, 0,1 мг/мл полисорбата 80 и 8 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,0;

(19) 55 мг/мл антитела h001-4-YTE, 40 мг/мл сахарозы, 0,3 мг/мл полисорбата 80 и 15 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,2.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть получена в форме соответствующего лиофилизированного состава с помощью процесса лиофилизации, и лиофилизированный состав может быть восстановлен водой для инъекций с получением следующей фармацевтической композиции для клинического применения:

(1) 150 мг/мл белка, представляющего собой антитело к PCSK-9, 75 мг/мл сахарозы, 0,6 мг/мл полисорбата 80 и 20 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,3 ± 0,1;

(2) 120 мг/мл белка, представляющего собой антитело к PCSK-9, 55 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,0;

(3) 200 мг/мл белка, представляющего собой антитело к PCSK-9, 95 мг/мл сахарозы, 0,8 мг/мл полисорбата 80 и 30 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,5.

Хотя конкретные варианты осуществления настоящего изобретения были описаны выше, специалисты в данной области техники поймут, что они являются только иллюстративными. Многие изменения или модификации можно вносить в эти варианты осуществления без отступления от принципа и сути настоящего изобретения. Следовательно, объем настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ЦЗЯНСУ ХЭНЖУЙ МЕДИСИН КО., ЛТД; ШАНХАЙ ХЭНЖУЙ

ФАРМАСЬЮТИКАЛ КО., ЛТД

<120> Фармацевтическая композиция, содержащая антитела к PCSK-9, и ее

применение

<130> P19413698RU

<150> CN201710519829.6

<151> 2017-06-30

<160> 33

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 698

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PCSK9 с His-меткой, PCSK9-His6, применяемый в качестве иммуногена для

иммунизации мышей или применяемый в качестве испытуемого реагента

<400> 1

Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu

20 25 30

Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu

35 40 45

Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe

50 55 60

His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val

65 70 75 80

Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg

85 90 95

Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu

100 105 110

His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly

115 120 125

Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu

130 135 140

Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg

145 150 155 160

Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly

165 170 175

Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp

180 185 190

His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val

195 200 205

Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp

210 215 220

Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly

225 230 235 240

Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln

245 250 255

Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg

260 265 270

Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro

275 280 285

Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu

290 295 300

Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp

305 310 315 320

Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val

325 330 335

Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly

340 345 350

Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile

355 360 365

Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly

370 375 380

Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu

385 390 395 400

Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile

405 410 415

His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp

420 425 430

Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr

435 440 445

His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His

450 455 460

Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp

465 470 475 480

Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg

485 490 495

Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His

500 505 510

Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu

515 520 525

Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala

530 535 540

Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr

545 550 555 560

Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro

565 570 575

Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg

580 585 590

Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys

595 600 605

Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val

610 615 620

Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly

625 630 635 640

Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val

645 650 655

Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val

660 665 670

Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser

675 680 685

Gln Glu Leu Gln His His His His His His

690 695

<210> 2

<211> 714

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PCSK9 с пептидом PADRE и His-меткой, PCSK9-PADRE-His6, применяемый

в качестве иммуногена, где содержащийся в нем пептид PADRE может

вызывать иммунизацию

<400> 2

Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu

20 25 30

Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu

35 40 45

Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe

50 55 60

His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val

65 70 75 80

Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg

85 90 95

Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu

100 105 110

His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly

115 120 125

Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu

130 135 140

Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg

145 150 155 160

Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly

165 170 175

Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp

180 185 190

His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val

195 200 205

Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp

210 215 220

Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly

225 230 235 240

Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln

245 250 255

Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg

260 265 270

Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro

275 280 285

Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu

290 295 300

Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp

305 310 315 320

Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val

325 330 335

Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly

340 345 350

Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile

355 360 365

Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly

370 375 380

Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu

385 390 395 400

Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile

405 410 415

His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp

420 425 430

Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr

435 440 445

His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His

450 455 460

Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp

465 470 475 480

Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg

485 490 495

Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His

500 505 510

Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu

515 520 525

Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala

530 535 540

Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr

545 550 555 560

Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro

565 570 575

Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg

580 585 590

Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys

595 600 605

Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val

610 615 620

Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly

625 630 635 640

Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val

645 650 655

Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val

660 665 670

Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser

675 680 685

Gln Glu Leu Gln Gly Ser Gly Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu

690 695 700

Lys Ala Ala Ala His His His His His His

705 710

<210> 3

<211> 704

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок на основе PCSK9 с сайтом расщепления с помощью TEV и

His-меткой, PCSK9-TEV-His6, N-PCSK9 (N-концевой домен PCSK9),

применяемый в качестве иммуногена, который можно получить путем

расщепления с помощью TEV

<400> 3

Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu

20 25 30

Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu

35 40 45

Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe

50 55 60

His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val

65 70 75 80

Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg

85 90 95

Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu

100 105 110

His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly

115 120 125

Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu

130 135 140

Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg

145 150 155 160

Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly

165 170 175

Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp

180 185 190

His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val

195 200 205

Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp

210 215 220

Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly

225 230 235 240

Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln

245 250 255

Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg

260 265 270

Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro

275 280 285

Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu

290 295 300

Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp

305 310 315 320

Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val

325 330 335

Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly

340 345 350

Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile

355 360 365

Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly

370 375 380

Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu

385 390 395 400

Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile

405 410 415

His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp

420 425 430

Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr

435 440 445

His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg

450 455 460

Thr Val Trp Ser Ala His Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val

465 470 475 480

Ala Arg Cys Ala Pro Asp Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser

485 490 495

Arg Ser Gly Lys Arg Arg Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys

500 505 510

Leu Val Cys Arg Ala His Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala

515 520 525

Ile Ala Arg Cys Cys Leu Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr

530 535 540

Ala Pro Pro Ala Glu Ala Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln

545 550 555 560

Gln Gly His Val Leu Thr Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp

565 570 575

Leu Gly Thr His Lys Pro Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn

580 585 590

Gln Cys Val Gly His Arg Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His

595 600 605

Ala Pro Gly Leu Glu Cys Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro

610 615 620

Gln Glu Gln Val Thr Val Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly

625 630 635 640

Cys Ser Ala Leu Pro Gly Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val

645 650 655

Asp Asn Thr Cys Val Val Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser

660 665 670

Thr Ser Glu Gly Ala Val Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg

675 680 685

His Leu Ala Gln Ala Ser Gln Glu Leu Gln His His His His His His

690 695 700

<210> 4

<211> 698

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутантный белок PCSK9-D374Y с His-меткой, PCSK9-D374Y-His6,

применяемый в качестве испытуемого реагента

<400> 4

Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu

20 25 30

Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu

35 40 45

Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe

50 55 60

His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val

65 70 75 80

Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg

85 90 95

Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu

100 105 110

His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly

115 120 125

Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu

130 135 140

Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg

145 150 155 160

Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly

165 170 175

Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp

180 185 190

His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val

195 200 205

Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp

210 215 220

Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly

225 230 235 240

Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln

245 250 255

Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg

260 265 270

Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro

275 280 285

Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu

290 295 300

Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp

305 310 315 320

Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val

325 330 335

Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly

340 345 350

Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile

355 360 365

Ile Gly Ala Ser Ser Tyr Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly

370 375 380

Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu

385 390 395 400

Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile

405 410 415

His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp

420 425 430

Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr

435 440 445

His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His

450 455 460

Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp

465 470 475 480

Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg

485 490 495

Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His

500 505 510

Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu

515 520 525

Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala

530 535 540

Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr

545 550 555 560

Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro

565 570 575

Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg

580 585 590

Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys

595 600 605

Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val

610 615 620

Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly

625 630 635 640

Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val

645 650 655

Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val

660 665 670

Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser

675 680 685

Gln Glu Leu Gln His His His His His His

690 695

<210> 5

<211> 719

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> белок PCSK9, слитый с пептидом BP15, являющимся акцептором биотина,

и His-меткой

<400> 5

Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu

20 25 30

Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu

35 40 45

Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe

50 55 60

His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val

65 70 75 80

Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg

85 90 95

Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu

100 105 110

His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly

115 120 125

Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu

130 135 140

Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg

145 150 155 160

Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly

165 170 175

Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp

180 185 190

His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val

195 200 205

Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp

210 215 220

Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly

225 230 235 240

Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln

245 250 255

Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg

260 265 270

Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro

275 280 285

Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu

290 295 300

Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp

305 310 315 320

Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val

325 330 335

Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly

340 345 350

Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile

355 360 365

Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly

370 375 380

Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu

385 390 395 400

Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile

405 410 415

His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp

420 425 430

Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr

435 440 445

His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His

450 455 460

Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp

465 470 475 480

Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg

485 490 495

Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His

500 505 510

Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu

515 520 525

Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala

530 535 540

Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr

545 550 555 560

Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro

565 570 575

Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg

580 585 590

Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys

595 600 605

Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val

610 615 620

Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly

625 630 635 640

Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val

645 650 655

Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val

660 665 670

Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser

675 680 685

Gln Glu Leu Gln Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe

690 695 700

Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu His His His His His His

705 710 715

<210> 6

<211> 719

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутантный белок PCSK9 D374Y, слитый с пептидом BP15,

являющимся акцептором биотина, и His-меткой, PCSK9-D374Y-BP15-His6,

в качестве испытуемого белка

<400> 6

Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu

20 25 30

Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu

35 40 45

Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe

50 55 60

His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val

65 70 75 80

Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg

85 90 95

Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu

100 105 110

His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly

115 120 125

Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu

130 135 140

Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg

145 150 155 160

Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly

165 170 175

Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp

180 185 190

His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val

195 200 205

Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp

210 215 220

Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly

225 230 235 240

Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln

245 250 255

Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg

260 265 270

Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro

275 280 285

Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu

290 295 300

Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp

305 310 315 320

Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val

325 330 335

Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly

340 345 350

Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile

355 360 365

Ile Gly Ala Ser Ser Tyr Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly

370 375 380

Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu

385 390 395 400

Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile

405 410 415

His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp

420 425 430

Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr

435 440 445

His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His

450 455 460

Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp

465 470 475 480

Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg

485 490 495

Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His

500 505 510

Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu

515 520 525

Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala

530 535 540

Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr

545 550 555 560

Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro

565 570 575

Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg

580 585 590

Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys

595 600 605

Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val

610 615 620

Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly

625 630 635 640

Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val

645 650 655

Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val

660 665 670

Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser

675 680 685

Gln Glu Leu Gln Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe

690 695 700

Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu His His His His His His

705 710 715

<210> 7

<211> 802

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Внеклеточный домен белка LDLR, представляющего собой рецептор PCSK9,

с Flag-меткой и His-меткой, LDLR-ECD-Flag-His6, в качестве

испытуемого реагента

<400> 7

Met Gly Pro Trp Gly Trp Lys Leu Arg Trp Thr Val Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ala Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Asp Arg Cys Glu Arg Asn Glu Phe

20 25 30

Gln Cys Gln Asp Gly Lys Cys Ile Ser Tyr Lys Trp Val Cys Asp Gly

35 40 45

Ser Ala Glu Cys Gln Asp Gly Ser Asp Glu Ser Gln Glu Thr Cys Leu

50 55 60

Ser Val Thr Cys Lys Ser Gly Asp Phe Ser Cys Gly Gly Arg Val Asn

65 70 75 80

Arg Cys Ile Pro Gln Phe Trp Arg Cys Asp Gly Gln Val Asp Cys Asp

85 90 95

Asn Gly Ser Asp Glu Gln Gly Cys Pro Pro Lys Thr Cys Ser Gln Asp

100 105 110

Glu Phe Arg Cys His Asp Gly Lys Cys Ile Ser Arg Gln Phe Val Cys

115 120 125

Asp Ser Asp Arg Asp Cys Leu Asp Gly Ser Asp Glu Ala Ser Cys Pro

130 135 140

Val Leu Thr Cys Gly Pro Ala Ser Phe Gln Cys Asn Ser Ser Thr Cys

145 150 155 160

Ile Pro Gln Leu Trp Ala Cys Asp Asn Asp Pro Asp Cys Glu Asp Gly

165 170 175

Ser Asp Glu Trp Pro Gln Arg Cys Arg Gly Leu Tyr Val Phe Gln Gly

180 185 190

Asp Ser Ser Pro Cys Ser Ala Phe Glu Phe His Cys Leu Ser Gly Glu

195 200 205

Cys Ile His Ser Ser Trp Arg Cys Asp Gly Gly Pro Asp Cys Lys Asp

210 215 220

Lys Ser Asp Glu Glu Asn Cys Ala Val Ala Thr Cys Arg Pro Asp Glu

225 230 235 240

Phe Gln Cys Ser Asp Gly Asn Cys Ile His Gly Ser Arg Gln Cys Asp

245 250 255

Arg Glu Tyr Asp Cys Lys Asp Met Ser Asp Glu Val Gly Cys Val Asn

260 265 270

Val Thr Leu Cys Glu Gly Pro Asn Lys Phe Lys Cys His Ser Gly Glu

275 280 285

Cys Ile Thr Leu Asp Lys Val Cys Asn Met Ala Arg Asp Cys Arg Asp

290 295 300

Trp Ser Asp Glu Pro Ile Lys Glu Cys Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp

305 310 315 320

Asn Asn Gly Gly Cys Ser His Val Cys Asn Asp Leu Lys Ile Gly Tyr

325 330 335

Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys

340 345 350

Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Asp Pro Asp Thr Cys Ser Gln Leu Cys

355 360 365

Val Asn Leu Glu Gly Gly Tyr Lys Cys Gln Cys Glu Glu Gly Phe Gln

370 375 380

Leu Asp Pro His Thr Lys Ala Cys Lys Ala Val Gly Ser Ile Ala Tyr

385 390 395 400

Leu Phe Phe Thr Asn Arg His Glu Val Arg Lys Met Thr Leu Asp Arg

405 410 415

Ser Glu Tyr Thr Ser Leu Ile Pro Asn Leu Arg Asn Val Val Ala Leu

420 425 430

Asp Thr Glu Val Ala Ser Asn Arg Ile Tyr Trp Ser Asp Leu Ser Gln

435 440 445

Arg Met Ile Cys Ser Thr Gln Leu Asp Arg Ala His Gly Val Ser Ser

450 455 460

Tyr Asp Thr Val Ile Ser Arg Asp Ile Gln Ala Pro Asp Gly Leu Ala

465 470 475 480

Val Asp Trp Ile His Ser Asn Ile Tyr Trp Thr Asp Ser Val Leu Gly

485 490 495

Thr Val Ser Val Ala Asp Thr Lys Gly Val Lys Arg Lys Thr Leu Phe

500 505 510

Arg Glu Asn Gly Ser Lys Pro Arg Ala Ile Val Val Asp Pro Val His

515 520 525

Gly Phe Met Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Thr Pro Ala Lys Ile Lys Lys

530 535 540

Gly Gly Leu Asn Gly Val Asp Ile Tyr Ser Leu Val Thr Glu Asn Ile

545 550 555 560

Gln Trp Pro Asn Gly Ile Thr Leu Asp Leu Leu Ser Gly Arg Leu Tyr

565 570 575

Trp Val Asp Ser Lys Leu His Ser Ile Ser Ser Ile Asp Val Asn Gly

580 585 590

Gly Asn Arg Lys Thr Ile Leu Glu Asp Glu Lys Arg Leu Ala His Pro

595 600 605

Phe Ser Leu Ala Val Phe Glu Asp Lys Val Phe Trp Thr Asp Ile Ile

610 615 620

Asn Glu Ala Ile Phe Ser Ala Asn Arg Leu Thr Gly Ser Asp Val Asn

625 630 635 640

Leu Leu Ala Glu Asn Leu Leu Ser Pro Glu Asp Met Val Leu Phe His

645 650 655

Asn Leu Thr Gln Pro Arg Gly Val Asn Trp Cys Glu Arg Thr Thr Leu

660 665 670

Ser Asn Gly Gly Cys Gln Tyr Leu Cys Leu Pro Ala Pro Gln Ile Asn

675 680 685

Pro His Ser Pro Lys Phe Thr Cys Ala Cys Pro Asp Gly Met Leu Leu

690 695 700

Ala Arg Asp Met Arg Ser Cys Leu Thr Glu Ala Glu Ala Ala Val Ala

705 710 715 720

Thr Gln Glu Thr Ser Thr Val Arg Leu Lys Val Ser Ser Thr Ala Val

725 730 735

Arg Thr Gln His Thr Thr Thr Arg Pro Val Pro Asp Thr Ser Arg Leu

740 745 750

Pro Gly Ala Thr Pro Gly Leu Thr Thr Val Glu Ile Val Thr Met Ser

755 760 765

His Gln Ala Leu Gly Asp Val Ala Gly Arg Gly Asn Glu Lys Lys Pro

770 775 780

Ser Ser Val Arg Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys His His His His

785 790 795 800

His His

<210> 8

<211> 331

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LCDR-Fc, слитый белок на основе усеченного внеклеточного домена LDLR

с Fc hIgG1 (с активностью связывания PCSK9), LDLR -sECD CFc

(hIgG1), в качестве испытуемого реагента

<400> 8

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Asn Gly Gly Cys Ser

20 25 30

His Val Cys Asn Asp Leu Lys Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Asp

35 40 45

Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys

50 55 60

Gln Asp Pro Asp Thr Cys Ser Gln Leu Cys Val Asn Leu Glu Gly Gly

65 70 75 80

Tyr Lys Cys Gln Cys Glu Glu Gly Phe Gln Leu Asp Pro His Thr Lys

85 90 95

Ala Cys Lys Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

100 105 110

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

115 120 125

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

130 135 140

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

145 150 155 160

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

165 170 175

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

180 185 190

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

195 200 205

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

210 215 220

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

225 230 235 240

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

245 250 255

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

260 265 270

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

275 280 285

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

290 295 300

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

305 310 315 320

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 9

<211> 294

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок на основе еще более усеченного внеклеточного домена LDLR

с Fc hIgG1 (с активностью связывания PCSK9), LDLR-ssECD CFc

(hIgG1), в качестве испытуемого реагента

<400> 9

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Asn Gly Gly Cys Ser

20 25 30

His Val Cys Asn Asp Leu Lys Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Asp

35 40 45

Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu Asp Ile Asp Glu Pro

50 55 60

Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

65 70 75 80

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

85 90 95

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

100 105 110

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

115 120 125

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

130 135 140

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

145 150 155 160

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

165 170 175

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

180 185 190

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

195 200 205

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

210 215 220

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

225 230 235 240

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

245 250 255

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

260 265 270

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

275 280 285

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290

<210> 10

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 10

Gln Val His Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Asp Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Glu Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Tyr Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 11

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 11

Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Phe Asn Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 12

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 12

Asp Tyr Trp Met His

1 5

<210> 13

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 13

Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 14

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 14

Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 15

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 15

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 16

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 16

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 17

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 17

Lys Gln Ser Phe Asn Leu Phe Thr

1 5

<210> 18

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ch-001

<400> 18

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 19

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> h001-VH.1A

<400> 19

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Asp Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 20

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> h001-VH.1B

<400> 20

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 21

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> h001-VH.1C

<400> 21

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Asp Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 22

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> h001-VH.1D

<400> 22

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Asp Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 23

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> h001-VH.1E

<400> 23

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Asp Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 24

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ch-001 hVL.1 (с привитыми CDR)

<400> 24

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Phe Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 25

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> h001-VL.1A

<400> 25

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Phe Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 26

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> h001-VL.1B

<400> 26

Asp Ile Gln Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Phe Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 27

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> h001-VL.1C

<400> 27

Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Phe Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 28

<211> 451

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> h001-4-IgG1

<400> 28

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 29

<211> 1413

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> h001-4-IgG1

<400> 29

atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtcgcgattc ttaagggtgt ccagtgccag 60

gtgcagctgg tgcagagcgg cgctgaggtg aagaagcccg gagcgagcgt aaaggtgagc 120

tgcaaggcca gcggatacac cttcaccgac tactggatgc actgggtgag gcaggcccca 180

ggacagggcc tggagtggat gggctacatc aaccccagca gcggctttac caagtatcac 240

cagaacttca aagacagggt gaccatgacc agggacacca gcatcagcac cgcctacatg 300

gagctgagca ggctgaggag cgacgacacc gccgtgtact actgcgccag gcaatacgac 360

tacgacgagg actggtactt cgacgtgtgg ggccaaggaa ccaccgtgac tgtgagcagc 420

gcttcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 480

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 600

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 720

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 780

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 900

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 960

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1140

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1260

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1413

<210> 30

<211> 219

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> h001-4-каппа

<400> 30

Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Phe Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 31

<211> 726

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> h001-4-каппа

<400> 31

atggacatgc gcgtgcccgc ccagctgctg ggcctgctgc tgctgtggtt ccccggctcg 60

cgatgcgaca tcgtgatgtc tcagagccca tctagcctga gcgccagcgt gggcgacagg 120

gtaaccatca cctgcaagag cagccaaagc ctgctgaaca gcaggacccg caagaacttc 180

ctggcttggt atcagcagaa gcccggcaag tctcccaagt tgctgatcta ctgggccagc 240

accagggaga gcggcgtgcc cgacaggttc agcggctccg gcagcggcac cgacttcacc 300

ctgaccatct ctagtctgca gcccgaggac ttcgccacct actactgcaa gcagagcttc 360

aatctgttca ccttcggcca gggcaccaag ctggagatca agcgtacggt ggctgcacca 420

tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg 480

tgcctgctga ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc 540

ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac 600

agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc 660

tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctcg cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag 720

tgttga 726

<210> 32

<211> 451

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тяжелая цепь h001-4-IgG1-YTE

<400> 32

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr

245 250 255

Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 33

<211> 1413

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тяжелая цепь h001-4-IgG1-YTE

<400> 33

atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtcgcgattc ttaagggtgt ccagtgccag 60

gtgcagctgg tgcagagcgg cgctgaggtg aagaagcccg gagcgagcgt aaaggtgagc 120

tgcaaggcca gcggatacac cttcaccgac tactggatgc actgggtgag gcaggcccca 180

ggacagggcc tggagtggat gggctacatc aaccccagca gcggctttac caagtatcac 240

cagaacttca aagacagggt gaccatgacc agggacacca gcatcagcac cgcctacatg 300

gagctgagca ggctgaggag cgacgacacc gccgtgtact actgcgccag gcaatacgac 360

tacgacgagg actggtactt cgacgtgtgg ggccaaggaa ccaccgtgac tgtgagcagc 420

gcttcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 480

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 600

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 720

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 780

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tctacatcac ccgggagcct 840

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 900

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 960

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1140

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1260

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1413

<---

1. Фармацевтическая композиция для лечения PCSK-9-опосредованного заболевания или нарушения, содержащая:

антитело к PCSK-9 или его антигенсвязывающий фрагмент в концентрации от 1 мг/мл до 150 мг/мл;

буфер в концентрации от 5 мМ до 30 мМ, где буфер представляет собой гистидиновый буфер;

дисахарид в концентрации от 10 мг/мл до 75 мг/мл, где дисахарид представляет собой трегалозу или сахарозу; и

поверхностно-активное вещество в концентрации от 0,05 мг/мл до 0,6 мг/мл, где поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80 или полисорбат 20;

при этом значение pH фармацевтической композиции составляет от 5,5 до 6,5; и

антитело к PCSK-9 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14 соответственно, и LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17 соответственно.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, где буфер представляет собой буфер на основе гистидина гидрохлорида.

3. Фармацевтическая композиция по п.1 или 2, где концентрация антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента составляет от 30 мг/мл до 100 мг/мл.

4. Фармацевтическая композиция по п.3, где концентрация антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента составляет от 45 мг/мл до 55 мг/мл.

5. Фармацевтическая композиция по п.4, где концентрация антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента составляет 50 мг/мл.

6. Фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, где значение pH фармацевтической композиции составляет от 6,0 до 6,5.

7. Фармацевтическая композиция по п.6, где значение pH фармацевтической композиции составляет 6,0.

8. Фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, где концентрация гистидинового буфера составляет от 5 мМ до 20 мМ.

9. Фармацевтическая композиция по п.8, где концентрация гистидинового буфера составляет от 5 мМ до 15 мМ.

10. Фармацевтическая композиция по п.9, где концентрация гистидинового буфера составляет 10 мМ.

11. Фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, где концентрация дисахарида составляет от 20 мг/мл до 40 мг/мл.

12. Фармацевтическая композиция по п.11, где концентрация дисахарида составляет 25 мг/мл.

13. Фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, где дисахарид представляет собой сахарозу.

14. Фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, где концентрация поверхностно-активного вещества составляет от 0,1 мг/мл до 0,4 мг/мл.

15. Фармацевтическая композиция по п.14, где концентрация поверхностно-активного вещества составляет от 0,1 мг/мл до 0,3 мг/мл.

16. Фармацевтическая композиция по п.15, где концентрация поверхностно-активного вещества составляет 0,2 мг/мл.

17. Фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, где поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80.

18. Фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, где антитело к PCSK-9 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи под SEQ ID NO: 18 и вариабельную область легкой цепи под SEQ ID NO:27.

19. Фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, где антитело к PCSK-9 содержит легкую цепь под SEQ ID NO: 30 и тяжелую цепь под SEQ ID NO: 28 или 32.

20. Фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, содержащая:

антитело к PCSK-9, где антитело к PCSK-9 содержит тяжелую цепь под SEQ ID NO: 32 и легкую цепь под SEQ ID NO: 30; при этом концентрация антитела к PCSK-9 составляет от 45 мг/мл до 55 мг/мл;

буфер на основе гистидина гидрохлорида, при этом концентрация буфера на основе гистидина гидрохлорида составляет от 5 мМ до 15 мМ;

дисахарид, где дисахарид представляет собой сахарозу, при этом концентрация сахарозы составляет от 20 мг/мл до 40 мг/мл;

поверхностно-активное вещество, где поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80 и концентрация полисорбата 80 составляет от 0,1 мг/мл до 0,4 мг/мл; и

значение pH фармацевтической композиции составляет от 6,0 до 6,5.

21. Фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, содержащая:

антитело к PCSK-9, где антитело к PCSK-9 содержит тяжелую цепь под SEQ ID NO: 32 и легкую цепь под SEQ ID NO: 30; при этом концентрация антитела к PCSK-9 составляет 50 мг/мл;

буфер на основе гистидина гидрохлорида, при этом концентрация буфера на основе гистидина гидрохлорида составляет 10 мМ;

дисахарид, где дисахарид представляет собой сахарозу, при этом концентрация сахарозы составляет 25 мг/мл;

поверхностно-активное вещество, где поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80 и концентрация полисорбата 80 составляет 0,2 мг/мл; и

значение pH фармацевтической композиции составляет 6,0.

22. Лиофилизированный состав для лечения PCSK-9-опосредованного заболевания или нарушения, содержащий антитело к PCSK-9, полученный посредством способа, включающего стадию сублимационного высушивания фармацевтической композиции по любому из пп.1-21, при этом сублимационное высушивание включает последовательные стадии предварительного замораживания, первичного высушивания и вторичного высушивания.

23. Восстановленный раствор для лечения PCSK-9-опосредованного заболевания или нарушения, содержащий антитело к PCSK-9, полученный посредством способа, включающего стадию восстановления лиофилизированного состава по п.22.

24. Восстановленный раствор, содержащий антитело к PCSK-9, по п.23, содержащий:

антитело к PCSK-9, где концентрация антитела к PCSK-9 составляет от 120 мг/мл до 200 мг/мл;

буфер, где буфер представляет собой гистидиновый буфер, при этом концентрация гистидинового буфера составляет от 15 мМ до 40 мМ;

дисахарид, где дисахарид представляет собой трегалозу или сахарозу, при этом концентрация дисахарида составляет от 55 мг/мл до 95 мг/мл;

поверхностно-активное вещество, где поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20 или полисорбат 80,

при этом концентрация поверхностно-активного вещества составляет от 0,4 мг/мл до 0,8 мг/мл; и

значение pH восстановленного раствора составляет от 6,0 до 6,5.

25. Восстановленный раствор, содержащий антитело к PCSK-9, по п.23, содержащий:

антитело к PCSK-9, где концентрация антитела к PCSK-9 составляет 150 мг/мл;

буфер, где буфер представляет собой гистидиновый буфер, при этом концентрация гистидинового буфера составляет 30 мМ;

дисахарид, где дисахарид представляет собой сахарозу, при этом концентрация сахарозы составляет 75 мг/мл;

поверхностно-активное вещество, где поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80, при этом концентрация полисорбата 80 составляет 0,6 мг/мл; и

при этом значение pH восстановленного раствора составляет 6,3.

26. Восстановленный раствор, содержащий антитело к PCSK-9, по п.23, содержащий:

антитело к PCSK-9, где антитело к PCSK-9 содержит тяжелую цепь под SEQ ID NO: 32 и легкую цепь под SEQ ID NO: 30; при этом концентрация антитела к PCSK-9 составляет от 120 мг/мл до 200 мг/мл;

буфер на основе гистидина гидрохлорида, при этом концентрация буфера на основе гистидина гидрохлорида составляет от 15 мМ до 40 мМ;

дисахарид, где дисахарид представляет собой сахарозу, при этом концентрация сахарозы составляет от 55 мг/мл до 95 мг/мл;

поверхностно-активное вещество, где поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80, при этом концентрация полисорбата 80 составляет от 0,4 мг/мл до 0,8 мг/мл; и

значение pH восстановленного раствора составляет от 6,0 до 6,5.

27. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.1-21, или лиофилизированного состава по п.22, или раствора, восстановленного из лиофилизированного состава, по любому из пп.23-26 в лечении PCSK-9-опосредованного заболевания или нарушения, где заболевание или нарушение представляет собой заболевание, связанное с холестерином.

28. Применение по п.27, где заболевание или нарушение выбрано из группы, состоящей из гиперхолестеринемии, заболевания сердца, метаболического синдрома, диабета, ишемической болезни сердца, апоплексии, сердечно-сосудистого заболевания (CVD), болезни Альцгеймера и общей дислипидемии.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к способу твердофазного синтеза полипептида, содержащего предварительно определенную аминокислотную последовательность, при этом способ включает циклы связывания аминокислотных структурных блоков с аминокислотной цепью, где указанные аминокислотные структурные блоки содержат незащищенную C-концевую карбоксильную группу и защищенную N-концевую аминогруппу, и где указанная аминокислотная цепь содержит незащищенную N-концевую аминогруппу, при этом по меньшей мере один цикл связывания включает следующие стадии: (a) связывание С-конца аминокислотного структурного блока с незащищенной N-концевой аминогруппой аминокислотной цепи, так чтобы между аминокислотной цепью и аминокислотным структурным блоком образовалась амидная связь, (b) приведение продукта, полученного на стадии (а), в контакт с кэппирующим реагентом, содержащим кэппирующее соединение, при этом кэппирующее соединение связывается с незащищенной N-концевой аминогруппой аминокислотной цепи, с которой на стадии (а) не был связан ни один структурный блок, и (c) удаление защитной группы с N-концевой аминогруппы аминокислотного структурного блока, где кэппирующий реагент содержит 0,5-5% об./об.

Группа изобретений относится к составам белков с низкой вязкостью. Жидкий фармацевтический состав для инъекции содержит от 183 до 215 мг/мл моноклонального антитела, имеющего молекулярную массу от 120 до 250 кДа; циметидин или его фармацевтически приемлемую соль; и фармацевтически приемлемый растворитель; где жидкий фармацевтический состав, когда находится в объеме, подходящем для инъекции, имеет абсолютную вязкость от 1 до 100 сП при 25°C, как измерено с использованием вискозиметра с конусом и плоскостью или микрожидкостного вискозиметра; и абсолютная вязкость жидкого фармацевтического состава является меньшей, чем абсолютная вязкость контрольного состава, содержащего антитело и фармацевтически приемлемый растворитель и не содержащего циметидин или его фармацевтически приемлемую соль; где абсолютная вязкость является экстраполированной вязкостью при нулевой скорости сдвига.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению полинуклеотида, кодирующего химерный антигенный рецептор (CAR), и может быть использовано для лечения рака, характеризующегося экспрессией CD20. Предложен полинуклеотид, содержащий полинуклеотидную последовательность, кодирующую CAR с SEQ ID NO:26, способный специфично связывать CD20.

Изобретение относится к области биотехнологии и биохимии, конкретно к гибридному полипептиду для связывания с ганглиозидом. Гибридный полипептид содержит легкую цепь нейротоксина клостридий (L), HN-домен нейротоксина клостридий, HCN-домен нейротоксина клостридий, HCC-домен нейротоксина клостридий с аминокислотными последовательностями, идентичными по меньшей мере на 95% последовательностям с аминокислотными остатками, соответственно, 1-448 SEQ ID NO: 1, 449-872 SEQ ID NO: 1, 873-1094 SEQ ID NO: 1, 1095-1296 SEQ ID NO: 1; и селективный, способный связываться с GM1 ганглиозидсвязывающий фрагмент с аминокислотной последовательностью, идентичной на по меньшей мере 95% последовательности с аминокислотными остатками 22-124 SEQ ID NO: 9.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены гуманизированные анти-HLA-A2 антитела.

Изобретение относится к биотехнологии. Представлен слитый белок, содержащий основной белок и один или более пептиды удлинения, где аминокислотная последовательность основного белка идентична или схожа с аминокислотной последовательностью белка крови человека или его фрагмента.

Изобретение относится к способу очистки фикоцианинов, устойчивых к кислым значениям рН. Доводят pH первичного экстракта фикоцианинов, устойчивых к кислым значениям pH, из клеток микроорганизмов, продуцирующих фикоцианины, до pH ниже 5, чтобы осадить органические вещества, отличные от фикоцианинов, устойчивых к кислым значениям pH.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению гетеродимерного биспецифического антитела, и может быть использовано для предупреждения или лечения связанных с TNFα и IL-17A заболеваний. Полученное способом восстановления-окисления гетеродимерное биспецифическое антитело состоит из двух частей: 1) TNFα антигенсвязывающая область и первая цепь Fc и 2) IL-17A антигенсвязывающая область и вторая цепь Fc.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены нейтрализующие антитела к рецептору I типа гипофизарного полипептида человека, активирующего аденилатциклазу (PAC1), а также фармацевтические композиции, содержащие такие антитела.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению производных аналогов инсулина, и может быть использовано в медицине для лечения диабета. Изобретение обеспечивает получение производных аналогов инсулина, которые имеют значимо увеличенный период полувыведения in vivo, и, таким образом, могут обеспечивать удобство пациентам с диабетом, которые самостоятельно вводят инсулин посредством инъекции.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к новому антителу, которое специфически связывается с лизил-тРНК-синтетазой, и может быть использовано в медицине. Более конкретно изобретение позволяет получить антитело, которое способно специфически связываться с N-концевым доменом фермента лизил-тРНК-синтетазы (KRS, лизил-тРНК-синтетаза), экспонированным на внеклеточной мембране.
Наверх