Способ приготовления коллагенового порошка медицинского назначения из кожи животных

Настоящее изобретение относится к области медицины и раскрывает способ производства коллагенового порошка медицинского назначения из кожи животных, включающий механическое освобождение жирных остатков из коллагенового сырья, его промывку, обработку коллагенового сырья щелочным элементом, обработку сырья кислотой и последующую промывку водой, отжим и промывание материала водой, удаление воды из полученного матричного продукта и сушку матрицы в растянутой форме для получения мембраны, при этом в качестве исходного сырья используют кожу кролика, а полученную в результате обработки мембрану, после сушки шлифуют с двух сторон, после чего подвергают шоковой заморозке в жидком азоте, затем, в замороженном состоянии, измельчают в мельнице, а полученный коллагеновый порошок стерилизуют альфа излучением. Техническим результатом настоящего изобретения является гипоаллергенность и хорошая приживляемость получаемого коллагенового порошка. 1 пр.

 

Способ относится к области медицины, в частности, ветеринарии, и может быть использован для оптимизации регенерации мягких тканей в пластической хирургии, травматологии и восстановлении кожных дефектов, стоматологии, челюстно-лицевой хирургии.

Известно, что для восстановления костной и мягких тканей используют аутогенные, аллогенные, ксеногенные и аллопластические материалы.

Наиболее значимым недостатком аллотрансплантатов является биологическая несовместимость тканей донора и реципиента, длительность сроков заготовки, возможность инфицирования вирусом гепатита, ВИЧ-инфекции.

Недостаток ксеногенных материалов определяется необходимостью тщательной обработки исходного сырья специальными растворителями, или термообжигом для предотвращения иммунологических реакций.

Из уровня техники известны способы производства материалов на основе коллагена, например, патент 2288001, МПК A61L 27/10 , опубл. «Способ и мембрана для регенерации слизистой оболочки», который применяют для ускорения заживления слизистой оболочки. Способ заключается в том, что на участок поврежденной слизистой оболочки накладывают мембрану, состоящую из очищенного коллагенового материала, полученного из природной ткани, содержащей коллаген, а именно, кожи свиньи, и дают возможность восстанавливаться слизистой оболочке на этом участке, а также регенерирующему слизистую оболочку препарату и к применению очищенного коллагенового материала, полученного из природной ткани, содержащей коллаген, для изготовления, регенерирующего слизистую оболочку, препарата. Недостатком способа является то, что мембрана, изготовленная из кожи свиньи, имеет волокнистую поверхность и направлена, в основном, на регенерацию тканей кожи, при этом тип сушки и дезинфекции не подходит кроликовой коже, так как разные виды животных имеют разный специфический аминокислотный состав и химическую инертность.

Известен, также, способ получения остеопластического материала, по патенту №2624873, МПК A61L27/10, опубл. 7.07.2017, включающий получение остеопластического материала в виде многослойных гранул из рентгеноконтрастных в-трикальцийфосфата 20% и гидроксиапатита 80% в полилактидгликолидной матрице с добавлением во внутренний слой гиалуроновой кислоты, а во внешний слой - гидрокортизона, хлоргексидина и лидокаина. Способ получения остеопластического материала характеризуется тем, что процесс нанесения слоев осуществляют в грануляторе в псевдоожиженном слое за три этапа. Осуществление изобретения позволяет получить остеопластический материал в виде многослойных гранул, обладающих бактериостатическим и бактерицидным действием и пролонгированным выделением активных действующих веществ. Недостатком является специфическое назначение и применение продукта (в стоматологии, челюстно-лицевой хирургии) сложность и дороговизна его осуществления.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ, известный из патента US 5028695A, МПК С07К15/20, согласно которому, способ состоит, в основном, из таких стадий, как механическое освобождение жирных остатков из коллагенового сырья и промывка сырья; обработка коллагенового сырья сильнодействующим щелочным элементом; обработка обработанного щелочью сырья сильной кислотой и последующая промывка обработанных материалов водой; - усадка промытого материала путем добавления к нему неорганического солевого раствора; набухание сморщенного материала путем отжима неорганического солевого раствора и промывание материала водой; удаление воды из полученного матричного продукта путем добавления растворителя; и сушка матрицы в растянутой форме для получения мембраны, в которой интегральная когезия волокон матрицы мембраны соответствует когезии коллагенового исходного материала. К недостатком известного способа можно отнести дороговизну сырья, получаемого из кожи свиньи, невозможность достаточно чистотой обработки сырья, потерю части полезных свойств порошка, а также жесткое воздействие на коллагеновые связи в процессе его изготовления, и, кроме того, длительность процесса получения конечного продукта.

Задачей изобретения является повышение качества коллогенового порошка из кожи животных, обладающего бактерицидными и бактериостатическими действиями, сепаративными и гипоаллергенными свойствами для изготовления продукции медицинского назначения и возможность сохранения максимального количества полезных свойств продукта.

Задача решается за счёт того, что коллагеновый порошок изготавливают из кожи кролика, которую обрабатывают известным способом, после чего шлифуют, а полученный коллагеновый полуфабрикат в виде высушенной мембраны, выдерживают в жидком азоте, после чего, измельчают до порошкообразного состояния.

Технический результат от использования коллагенового порошка, изготовленного по предлагаемому способу, заключается в том, что из кожи кролика получают материал гипоаллергенный, хорошо приживляемый и недорогой, а способ его приготовления с использованием шоковой заморозки полуфабриката, как и измельчение в замороженном состоянии, позволяет сохранить, практически, все полезные качества полученного продукта, кроме того, снижается стоимость продукта.

Сущностью способа является то, что способ производства коллагенового порошка из кожи животных, включает механическое освобождение жирных остатков из коллагенового сырья, и его промывку, обработку коллагенового сырья щелочным элементом, обработку обработанного щелочью сырья кислотой и последующую промывку обработанных материалов водой, усадку промытого материала путем добавления к нему неорганического солевого раствора, отжим неорганического солевого раствора и промывание материала водой; удаление воды из полученного матричного продукта и сушку матрицы в растянутой форме для получения мембраны. При этом в качестве исходного сырья используют кожу кролика, а в процессе изготовления порошка, после сушки мембраны, её шлифуют с двух сторон, после чего подвергают шоковой заморозке в жидком азоте, затем, в замороженном состоянии, измельчают до порошкообразного состояния.

Способ реализуется следующим образом.

Для приготовления коллагенового порошка для медицинских целей, выбирают шкурку кролика любой породы, в возрасте 3-4 месяца, так как к этому возрасту заканчивается первая возрастная линька. Кожу кролика (чистую, белого цвета без каких-либо пигментных пятен) после убоя готовят для дальнейшей обработки: удаляют грязь, остатки крови, мяса, жира и охлаждают в расправленном виде. Затем шкурки консервируют для транспортировки и хранения. Для консервации используют натрия хлорид (поваренную соль) 500 -600 г на 1 шкурку, исходя из веса кролика. Далее материал помещают в морозильную камеру. Срок хранения материала не более 6 месяцев. Затем производят удаление натрия хлорид, низкомолекулярных фракций белка, остатков крови и т.д. На этой стадии осуществляют процесс отмоки. Отмока – процесс размачивания в растворе консервированной кожи с целью переведения её в парное состояние (с целью дополнительного удаления грязи, крови, прирезей и остатков жира?). Замороженное сырье подготавливают (материал помещают в холодильник и дают ему медленно разморозиться). Затем промывают проточной водой в пластиковой или эмалированной таре (материал не должен окисляться) для удаления консервантов. После промывания материал сутки выдерживают в обессоленной воде комнатной температуры, по истечению суток материал промывают не менее 5 раз холодной водой. Подготовленные таким образом (очищенные и обессоленные), шкурки загружают в центрифугу. В центрифуге шкурки промывают до прозрачности используемой воды. Контроль за прозрачностью осуществляют визуально. После промывания шкурок, в ёмкость с водой комнатной температуры заливают 2% раствор натрия хлорида, добавляют смачиватель-обезжириватель (ПАВ) и перемешивают до полного растворения компонентов. В полученный раствор погружают сырьё и периодически перемешивают в течение 3 – 4 часов (на данном этапе происходит удаление крови и быстрорастворимых белков). Затем осуществляют мездрение – механическую обработку с целью удаления внутренних слоёв кожно-мышечной и жировой ткани, остатков мяса, сала, сухожилий, плёнки и подкожной клетчатки, а также её разрыхление. Сырьё достают из ёмкости и дают стечь раствору. Затем шкурки обезжиривают на колоде традиционным в кожевенном производстве способом. После этого, в ёмкость добавляют натрия хлорид, а при необходимости (в случае если шкурки плохо обезжирили на предыдущем шаге) добавляют ПАВ и раствор аммиака и перемешивают до полного растворения компонентов. В полученный раствор загружают сырьё, и выдерживают в течение 3 – 4 часов, перемешивая каждый час. После чего шкурки выдерживают в растворе в течение 24 часов. После вымачивания сырьё загружают в центрифугу, добавляют поликарбоксилаты (стиральный порошок без отдушек), и запускают работу центрифуги на малых оборотах (таким образом сырьё прополаскивают и отжимают). Далее производят процесс золения (удаление оставшегося шерстного покрова). Золение, это обработка отмоченного сырья известковым молоком или с добавлением едких или сульфидных щелочей – активаторов. Ослабление волоса основано на гидролизе белков базального и слизистого слоев эпидермиса и на размягчении кератина луковиц шерсти под действием зольной жидкости, содержащей едкие и сульфидные реагенты. Благодаря гидролитическому распаду, связь между дермой и эпидермисом нарушается, волосяной покров легко удаляется механическим путём. На этой стадии готовят раствор из известкового молока, и натрия сернокислого девятиводного (в соотношении - NaCl : Ca(OH)₂ : Na₂(SO₄)₂ = 2:5:0,1 мас.%). В приготовленный таким образом раствор сырьё помещают на 48 часов. После выдержки в растворе сырье достают, удаляют шерстный покров, несколько раз промывают холодной водой (10-20°С). После этого, сырьё помещают в раствор (400 г натрия хлорид, 20 г сернокислого аммония, 10 л воды) и выдерживают в течение 24 часов. Затем дают сырью стечь. После этого сырьё загружают в центрифугу, промывают, прополаскивают и отжимают. Последняя стадия обработки сырья - пикелерование – т.е. уплотнение коллагена сырья. Пикелерование производят путём обработки коллагенового сырья раствором поваренной соли и кислоты. В результате пикелерования шкурок происходит разделение волокон дермы на более мелкие структурированные элементы и вымывание из кожи веществ, склеивающих волокна при последующей сушке. Благодаря этому, снижается способность волокон мездры к склеиванию, т.е. коллагеновое сырье приобретает ценные свойства – потяжку и эластичность. Результат действия пикельного раствора – пучки волокон расщеплены на отдельные тонкие волоконца. Одновременно, при пикелеровании происходит частичное консервирование белков, кожа приобретает слабокислую реакцию, что необходимо для процесса дубления. Происходит, также, обезвоживание коллагенового сырья и его уплотнение. После этого сырьё отмывают от остатков кислот. Контроль готовности сырья осуществляют путём перегибания шкурки: когда в месте сгиба шкурки образовывается белая полоса, это свидетельствует об обезвоживании и достаточной пропикелерованности сырья. В результате перечисленных действий получают коллагеновый полуфабрикат. Далее следует механическая обработка полуфабриката, лиофильная сушка и фасовка. Полученный из шкурок кроликов коллагеновый полуфабрикат подвергают максимальной растяжке, закрепляют на фанерных щитах, и оставляют сушиться в естественных условиях. После растяжки и лиофильной сушки, полученный материал шлифуют до гладкой поверхности с одной стороны и бархатистой поверхности – с другой, затем разминают до мягкого состояния. В результате шлифования коллагеновый полуфабрикат имеет гладкую с одной стороны, и бархатистую с другой стороны, поверхности. Последней стадией является стадия получения готового продукта, собственно, порошка на основе коллагена. Коллагеновый полуфабрикат в виде высушенных и отшлифованных шкурок опускают в жидкий азот (происходит резкое охлаждение для сохранения полезных свойств). В замороженном виде полуфабрикат измельчают до порошкообразного состояния. Полученный коллагеновый порошок стерилизуют любым из известных способов, например, альфа-излучением или иным способом. Например, используют следующий способ стерилизации: в тару загружают 0,9% натрия хлорид, 25 г ледяной уксусной кислоты, ПАВ (2 г/л), 10л обессоленной воды. В этот раствор загружают сырьё (мембрану) и выдерживают в течение 24 часов, при периодическом перемешивании. После стерилизации сырьё высушивают, без подогрева, для равномерного распределения кислот по всем тканям (растягивают на фанере, накрывают плёнкой, и выдерживают в течение 2 суток). Готовую продукцию (коллагеновый порошок) отправляют на исследование, где её проверяют, на дисперсность, на наличие микробиотических агентов, на загрязнение. В завершение процесса продукцию расфасовывают и упаковывают в стерильную пластиковую тару посредством упаковочной машины с дозатором.

Возможность практического применения подтверждается примерами конкретной реализации предлагаемого способа.

Пример получения коллагенового порошка медицинского назначения из шкуры кролика.

Для приготовления коллагенового порошка брали шкурки трехмесячных кроликов, удаляли грязь, остатки крови, мяса, жира и охлаждали в расправленном виде. Затем шкурки консервировали в натрия хлориде (поваренная соль), 500 - 600 г. на 1 шкурку,(≈ 600 г на 1,8 кг), для дальнейшего хранения (2 недели) и транспортировки. Затем материал подготавливали для дальнейшей работы, размораживали, механическим путем удаляли остатки соли, жира остатков крови и т.д. Затем промывали проточной водой в пластиковой ёмкости для удаления остатков консерванта. В течение суток материал держали в обессоленной воде, по истечению этого срока промывали 5 раз проточной холодной водой, до тех пор, пока вода не стала прозрачной. После данной манипуляции шкурки загружали в центрифугу. В центрифуге шкурки промывали до прозрачности используемой воды. После промывания шкурки погружали в раствор 2% натрия хлорида и смачивателя-обезжиривателя (ПАВ) комнатной температуры. Оставляли на 4 часа. После этого производили удаление внутренних слоёв кожно-мышечной и жировой ткани. Затем осуществляли удаление внутренних слоёв кожно-мышечной и жировой ткани, остатков мяса, сала, сухожилий, плёнки и подкожной клетчатки, а также её разрыхление. Сырье вынимали из ёмкости, для того чтобы стек раствор. Затем шкурки обезжиривали на колоде традиционным в кожевенном производстве способом. Затем в раствор натрия хлорида загружали сырье и выдерживали 4 часа, перемешивая, каждый час и оставляли в растворе на 24 часа. После вымачивания сырьё загружали в центрифугу, добавляли стиральный порошок без отдушек, и запускали работу на малых оборотах для полоскания и отжимания. После отжимания удаляли оставшийся шерстный покров методом золения. Затем, несколько раз промывали холодной водой до прозрачности воды. После этого, сырьё помещали в раствор (400 г натрия хлорид, 20 г сернокислого аммония, 10 л воды) на 24 часа. Давали стечь раствору. После этого сырьё загружали в центрифугу для промывания и отжима. Затем проводили пикелерование. Контроль готовности полуфабриката осуществляли путём перегибания шкурки. Образованная в месте сгиба белая полоса свидетельствовала о достаточной пропикелерованности сырья. Полученный из шкурок кроликов коллагеновый полуфабрикат закрепляли на фанерных щитах, и оставляли сушиться в естественных условиях. После растяжки и лиофильной сушки, полученный материал шлифовали при помощи шлифовальной машинки и разминали вручную до мягкого состояния. В результате шлифования коллагеновый полуфабрикат приобрел гладкую с одной стороны, и бархатистую с другой стороны, поверхности. Коллагеновый полуфабрикат, в виде высушенных и отшлифованных шкурок, опускали в жидкий азот. В замороженном виде полуфабрикат измельчали в измельчителе, до порошкообразного состояния, с размером частиц примерно 1,5 мм. Полученный коллагеновый порошок стерилизовали альфа излучением.

Пример применения коллагенового порошка, полученного предлагаемым способом, и его эффективность по сравнению с другими способами лечения.

В эксперименте участвовали 15 кроликов в возрасте 1,5 месяца, которых разделили на 3 группы (n=5). К животным первой группы применяли мембрану на основе коллагена 1 типа, во второй группе применяли мембрану на основе коллагена, обогащенную стромальными клетками собаки, третья группа – контрольная, к которой применяли стандартные методы лечения. Мембрану вшивали под поврежденные ткани, соблюдая правила асептики и антисептики. Всем животным дополнительно вводили антибиотический препарат Бицилин – 3, на первые и третьи сутки после оперативного вмешательства. За животными был установлен ежедневный осмотр, с учетом изменения температурной реакции на 1, 2, 3, 10, 14 и 30 сутки после проведения операции. Швы сняли на 10-е сутки. Также воспалительная реакция учитывалась посредством проведения общеклинического анализа крови (ОКА) и биохимических показателей (БХ) на 14-е и 30-е сутки. Конечный результат приживаемости мембраны устанавливали при помощи гистологического исследования. Образец тканей брали на 30 сутки. В результате исследования установили, что животные 2 и 3 групп подверглись воздействию вторичных инфекций. Наблюдали диарею, хрипы при дыхании. Во второй группе осложнения возникли у двух из 5 животных. В третьей - у одного из 5. При этом повышение общей температуры тела на ±0,5°С было у животных первой и третьей групп, что свидетельствует о воспалительной реакции. Исследование крови показало, что уровень тромбоцитов был повышен только у одного животного в первой группе и одного – во второй и составил 623*10% и 642*10% соответственно при норме100 – 512*10% на четырнадцатые сутки исследования, а на тридцатые сутки только одно животное первой группы имело незначительное завышение уровня тромбоцитов в крови. Повышение уровня лейкоцитов свидетельствует о воспалениях, преимущественно, бактериальной природы. В ходе опыта повышение данного показателя не было установлено. Уровень базофилов был повышен у животных второй группы и достиг 8,1% у некоторых особей, при норме 2,5 – 6,0%, что свидетельствует о наличии воспалительной реакции. В первой и контрольной группах показатель находился в норме. Гистологическое исследование, которое проводили на 30-е сутки после операции, показало отсутствие некрозов и перерождения тканей. В 1 группе на гистосрезе в структуре мембраны отмечено обилие адгезирующих лейкоцитов, что свидетельствует об активном биоразложении мембраны. В структуре гистологических препаратов, полученных от животных второй группы, отмечали преобладание фибробластов, которые покрывали частички мембраны, а также наличие крупных и мелких капилляров.

Данный опыт показывает гипоаллергенность мембраны на основе коллагена 1 типа, а также эффективность её применения в пластической хирургии, для заживления обширных кожных повреждений.

Пример использования предлагаемого коллагенового порошка в лечении.

Объектом исследования являлся котёнок в возрасте 3х суток. На сагитальной плоскости шеи была обнаружена глубокая рваная рана. Повреждение обработали антисептическим раствором и закрыли коллагеновым порошком. При дальнейшем наблюдении отмечали, что животное активное, рана заживает без осложнений. Полноценная рубцовая ткань образовалась на 3-и сутки. Через 1,5 недели, у данного животного, повреждений визуально не обнаружили, воспаление и аллергические реакции отсутствовали. Пациент не испытывал болевых ощущений.

Полученный предлагаемым способом коллагеновый порошок, изготовленный из кожи кролика, позволяет получить хорошо приживляемый, гипоаллергенный материал, а способ его приготовления, с использованием шоковой заморозки полуфабриката перед измельчением, сохраняет, практически, все полезные качества полученного продукта, кроме того, снижается стоимость полученного порошка.

Таким образом, задача, стоящая перед изобретением, выполнена.

Способ производства коллагенового порошка медицинского назначения из кожи животных, включающий механическое освобождение жирных остатков из коллагенового сырья, его промывку, обработку коллагенового сырья щелочным элементом, обработку сырья кислотой и последующую промывку водой, отжим и промывание материала водой, удаление воды из полученного матричного продукта и сушку матрицы в растянутой форме для получения мембраны, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют кожу кролика, а полученную в результате обработки мембрану, после сушки шлифуют с двух сторон, после чего подвергают шоковой заморозке в жидком азоте, затем, в замороженном состоянии, измельчают в мельнице, а полученный коллагеновый порошок стерилизуют альфа излучением.