Способ оценки степени экспозиции токсических веществ на работников нефтехимических производств

Изобретение относится к медицине, а именно к медицине труда, может быть использовано для оценки степени экспозиции токсических веществ на работников нефтехимических производств, в том числе при прохождении периодического медицинского осмотра. Проводят выделение мононуклеарных клеток периферической крови, которые наносят на предметное стекло в 1% легкоплавкой агарозе, лизируют в щелочном растворе, проводят гель-электрофорез, после чего микропрепараты фиксируют 15 минут в 70% этаноле, высушивают на воздухе при комнатной температуре и окрашивают в 0,5% водном растворе бромистого этидия. Полученные «ДНК-кометы» исследуют с помощью флуоресцентного микроскопа, подсчитывают относительное содержание ДНК в хвосте «комет», после чего у индивидов, имеющих процент «комет» с разрывами ДНК от 0,00 до 19,99%, определяют низкую степень экспозиции токсических веществ на работника; от 20,00 до 39,99% - среднюю степень экспозиции токсических веществ; от 40,00 до 100,00% определяют высокую степень экспозиции токсических веществ. Использование изобретения повышает точность оценки за счет раннего определения повреждений ДНК. 6 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к медицине труда, может быть использовано для оценки степени экспозиции токсических веществ на работников нефтехимических производств, в том числе при прохождении периодического медицинского осмотра.

При периодических медицинских осмотрах представляется актуальным выявление ранних изменений, обнаруживаемых в организме человека вследствие воздействия вредных факторов рабочей среды и трудовой деятельности, для своевременного осуществления профилактических мер и сохранения здоровья работников. Ранние изменения состава крови давно используются в качестве маркеров физиологических и патологических состояний организма.

Работники современных нефтехимических производств при выполнении рабочих операций испытывают на себе воздействие вредных факторов рабочей среды и трудового процесса, и часто подвергаются влиянию разнообразных химических веществ, поступающих в организм в основном из воздуха рабочей зоны и через незащищенные участки кожи, что делает необходимым проведение профилактических мероприятий и использование средств индивидуальной защиты.

Важным для определения профессиональной вредности является оценка степени экспозиции работника нефтехимического производства вредными промышленными веществами такими, как ароматические (бензол и его производные), непредельные (с одной или двумя связями С=С) и предельные углеводороды, бензины, окись этилена, окись пропилена, нефрас и др. нефтехимическими веществами. Но оценка степени экспозиции токсичными веществами трудоемка и предполагает индивидуальное обследование каждого рабочего места (которое, как правило, не имеет точных границ в пространственно-временном описании), определение (качественное и количественное) выраженности, частоты, продолжительности и путей воздействия вредных веществ, находящихся в окружающей среде. Для предотвращения вреда здоровью работника нефтехимического производства существует потребность в быстром скрининговом тесте, позволяющем оценить клеточный ответ организма индивида на контакт с используемыми на производстве токсичными веществами для определения эффективности используемых и необходимости проведения дополнительных профилактических мероприятий.

Известен способ прогнозирования преморбидного состояния при воздействии химических загрязнителей производственной среды путем исследования мочи и крови по уровню железоиндуцированной хемилюминесценции [патент RU 2178563, 2002]. Недостатком способа является невозможность прогнозирования процессов, сопряженных с патофизиологическими изменениями в организме, не влияющими на уровень железоиндуцированной хемилюминесценции мочи и крови.

Известен способ определения чувствительности мембран эритроцитов к воздействию тяжелых металлов, включающий проверку действия химических веществ на фиксированных клетках крови, что сокращает возможности оценки биологического действия исследуемых соединений [патент RU 2332668, 2008]. Недостатком метода является то, что для испытаний использованы растворы солей 4 тяжелых металлов (сульфаты марганца, никеля и цинка, нитрат свинца) и не учитывается действие остальных химических соединений. Кроме того, отсутствие чувствительности мембран эритроцитов не означает, что остальные клетки и ткани организма человека окажутся нечувствительными к тяжелым металлам, метод продолжителен во времени и составляет сложность его скорая реализация одним человеком.

Известен способ выявления ранних признаков хронического воздействия винилхлорида, заключающийся в том, что в сыворотке крови работающих определяют содержание интерлейкина 4, белка S-100β, уровень аутоантител к белку S-100, аутоантител к вольтаж-зависимому Ca-каналу, аутоантител к глутаматным рецепторам, аутоантител к γ-аминомасляной кислоте-рецепторам, аутоантител к дофаминовым рецепторам, рассчитывают диагностические коэффициенты F₁ и F₂ и при значении F₁ меньше F₂ диагностируют ранние изменения в нервной системе при хроническом воздействии винилхлорида, при F₁ больше или равно F₂ - делают заключение об отсутствии признаков хронического воздействия винилхлорида [патент RU 2485514, 2013]. Недостатком способа является невозможность его применения для диагностики ранних признаков интоксикации химическими соединениями, встречающимися на остальных нефтехимических производствах. Также для его реализации требуются дорогостоящие реагенты: наборы для определения аутоантител к белкам-маркерам и соответствующее оборудование. Необходимость измерения большого числа показателей требует длительного времени, в течение которого возможны искажения результата.

Известен способ диагностики нарушений клеточного иммунитета у работников химических производств при воздействии формальдегида, характеризующийся тем, что производят отбор пробы венозной крови у работников, устанавливают в ней концентрацию формальдегида, определяют количество лимфоцитов, затем устанавливают критериальный показатель, по которому судят о нарушении клеточного иммунитета. В качестве основных параметров Т-клеточного иммунитета определяют в процентах число активированных Т-лимфоцитов CD3⁺CD95⁺ и также определяют в процентах число Т-регуляторных лимфоцитов CD4⁺CD25⁺CD127^-, а в качестве критериального показателя используют интегральный показатель, равный отношению установленного процента числа CD3⁺CD95⁺ - лимфоцитов к проценту числа CD4⁺CD25⁺CD127^- - лимфоцитов. При значении этого интегрального показателя, равного и более 40, диагностируют нарушение клеточного иммунитета у работников химических производств при воздействии формальдегида [патент RU 2539391, 2015].

Известен способ оценки влияния метанола на иммунный статус работников химического производства, включающий отбор пробы венозной крови у работников, установление в ней фактического содержания метанола и лабораторных иммунологических показателей, внутриклеточных маркеров апоптоза: белка bax и белка bcl2. Причем после установления в пробе крови фактического содержания метанола производят его сравнение с величиной фоновой концентрации путем определения коэффициента, равного их соотношению: С1/С2, где С1 - фактическое содержание метанола в крови; С2 - фоновая концентрация метанола, затем рассчитывают критериальный коэффициент, равный соотношению указанных bax/bcl2, далее рассчитывают информационный индекс клеточной гибели по формуле. При значении указанного индекса клеточной гибели более 6, при одновременном содержании метанола в крови выше его фоновой концентрации, оценивают состояние иммунного статуса работника химического производства от воздействия метанола как иммунодефицитное [патент RU 2546524, 2015].

Наиболее близким аналогом изобретения является способ диагностики комбинированного воздействия ароматических углеводородов, оксидов олефинов и их смеси на работников нефтехимических и химических производств, заключающийся в том, что у работников нефтехимических и химических производств в сыворотке периферической крови спектрофотометрическим методом определяют активность каталазы, аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы и количественное содержание перекисей в липидах, при снижении активности каталазы, увеличении активности аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы и количественного содержания перекисей в липидах диагностируют комбинированное воздействие смеси ароматических углеводородов и оксидов олефинов [патент RU 2488827, 2013]. Недостатком прототипа является то, что исследуемые показатели являются относительно стабильными и меняются только при наличии значительных патологических изменений, вызванных воздействием химических веществ.

Задачей изобретения является разработка способа оценки степени экспозиции токсичными химическими веществами работников нефтехимических производств.

Техническим результатом изобретения является повышение точности оценки за счет раннего определения повреждений ДНК.

Предлагаемый способ оценки степени экспозиции токсичными химическими веществами работников нефтехимических производств осуществляется следующим образом. Мононуклеарные клетки периферической крови выделяют у работника нефтехимического производства методом экстракции в градиенте фиколла (1,077 г/см³) из 2 мл крови по Boyum с последующей промывкой в фосфатном солевом буферном растворе, содержащем 1% ЭДТА. Свежевыделенную клеточную суспензию используют для приготовления микропрепаратов в 1% легкоплавкой агарозе. Из каждого образца выделенных клеток, полученного от одного работника, готовят по 3 микропрепарата. Перед нанесением на предметное стекло 100 мкл суспензии клеток прогревают при +37°С и смешивают со 100 мкл 2% легкоплавкой агарозы в равных пропорциях. Микропрепараты мононуклеарных клеток погружают в охлажденный лизирующий солевой раствор (рН10-11) и инкубируют в холодильнике при температуре +5-+10°С не менее 1,5 ч. Далее микропрепараты погружают на 25 минут в охлажденный щелочной буферный раствор (рН>13). В дальнейшем в течение 20 минут проводят гель-электрофорез ДНК изолированных клеток, ранее заключенных в 1% легкоплавкую агарозу и на предметных стеклах, при напряженности электрического поля 0,9-1 В/см. По окончании электрофореза микропрепараты фиксируют 15 минут в 70% этаноле, высушивают на воздухе при комнатной температуре и окрашивают в 0,5% водном растворе бромистого этидия. Полученные таким образом микропрепараты «комет» исследуют с помощью флуоресцентного микроскопа (при увеличении 100× или 200×) и фотографируют с использованием цифровой камеры, подключенной к компьютеру. Базовые принципы методики получения и анализа изображений комет описаны в литературе [Tice R.R., Agurell Е., Anderson D., Burlinson В., Hartmann A., Kobayashi H., Miyamae Y., Rojas E., Ryu J.C., Sasaki Y.F. Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environ Mol Mutagen. 2000. V.35. N.3. P.206 221 (https://doi.org/10.1002/(sici)1098-2280(2000)35:3<206::aid-em8>3.0.co;2-j); Collins A.R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 2004. V.26. N.3. P.249 - 261 (https://doi.Org/10.1385/MB:26:3:249)]. На каждом микропрепарате образца мононуклеарных клеток, полученного от одного работника, фотографируют не менее 50 «комет». Далее подсчитывают относительное содержание ДНК в хвостах «комет» (в процентах) с использованием любой доступной версии программного обеспечения, используемого для анализа изображений ДНК «комет» (ImageJ, CaspLab, OpenComet, Comet Assay IV и т.п.). Если процент содержания ДНК в хвосте «кометы» больше 5%, то ее причисляют к «кометам» с повышенной выраженностью разрывов ДНК (далее, «комет» с разрывами ДНК). Затем определяют процент таких «комет» у каждого работника.

У индивидов, имеющих процент «комет» с разрывами ДНК:

1. От 0,00 до 19,99% определяют низкую степень экспозиции работника токсичными веществами;

2. От 20,00 до 39,99% определяют среднюю степень экспозиции токсичными веществами, есть необходимость в проверке качества выполнения профилактических мероприятий;

3. От 40,00 до 100,00% определяют высокую степень экспозиции токсичными веществами, есть основание исследовать условия труда определенного работника на наличие превышений ПДК химических веществ в воздухе рабочей зоны и повысить качество выполняемых профилактических мероприятий.

В Уфимском НИИ медицины труда и экологии человека были обследованы 107 работников нефтехимического производства, среди которых 82 работника (от 21 до 66 лет) имеют экспозицию токсичными химическими соединениями, а 25 работников (от 22 до 62 лет) не имели экспозиции токсичными химическими соединениями. Химический фактор включает в себя токсичные нефтехимические вещества, представленные ароматическими (бензол и его производные), непредельными (с одной или двумя связями С=С) и предельными углеводородами, бензинами и др. нефтехимическими веществами.

Средний возраст работников, контактирующих с химическим фактором, составляет 45,24±10,88 лет (95%ДИ: 42,85-47,63), а средний стаж 18,83±12,25 лет (95%ДИ: 16,13-21,52). Работники, включенные в контрольную группу и не подвергающиеся воздействию химического фактора в процессе трудовой деятельности имеют средний возраст 49,80±8,89 лет (95%ДИ: 46,13-53,47), средний стаж 19,17±12,60 лет (95%ДИ: 13,26-25,06). Сформированные группы не имеют статистически значимых различий по возрасту и стажу при сравнении с использованием t-критерия Стьюдента для независимых выборок (р>0,05).

По результатам определения процента «комет» с разрывами ДНК 71 работник имеют низкую степень экспозиции работника токсичными веществами, процент «комет» с разрывами ДНК определялся у них от 0,00 до 19,99%. 29 работников имеют среднюю степень экспозиции токсическими веществами, процент «комет» с разрывами ДНК определялся у них от 20,00 до 39,99%. 7 работников имеют высокую степень экспозиции токсическими веществами, процент «комет» с разрывами ДНК определялся у них от 40,00 до 100,00%. Распределение значений процента «комет» с разрывами ДНК в исследуемой выборке относится к ненормальным по одновыборочному критерию Колмогорова-Смирнова (р<0,05), поэтому для сравнения групп использовалась непараметрическая статистика. При множественном сравнении групп работников с разной степенью экспозиции также имеются статистически значимые отличия по Н-критерию Краскела-Уоллиса (р<0,001).

Изобретение поясняется следующими клиническими примерами.

Пример 1.

Работник Ю., 1996 г.р., стаж 8 лет, выполняет обязанности слесаря КИПиА на нефтехимическом предприятии. Проходил периодический медицинский осмотр с целью определения степени экспозиции и необходимых профилактических мероприятий. При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 2 мл венозной крови с последующим определением разрывов ДНК в мононуклеарных клетках периферической крови. Процент «комет» с разрывами ДНК составляет 0,00%, что определяет низкую степень экспозиции работника токсичными веществами и достаточность проводимых профилактических мероприятий. Химический фактор: этилен. Концентрация химического вещества в воздухе рабочей зоны на момент проверки не превышала ПДК.

Пример 2.

Работник П., 1965 г.р., стаж 35 лет, по профессии аппаратчик сжигания на нефтехимическом производстве. Проходил периодический медицинский осмотр с целью определения степени экспозиции и необходимых профилактических мероприятий. При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 2 мл венозной крови с последующим определением разрывов ДНК в мононуклеарных клетках. Процент «комет» с разрывами ДНК составляет 39,99%, что определяет среднюю степень экспозиции работника токсичными веществами и необходимость проверки качества выполнения профилактических мероприятий. При проверке качества выполнения профилактических мероприятий было обнаружено, что работник часто не использовал респиратор при нахождении на рабочем месте. Химический фактор: алканы С1-С10, бута-1,3-диен. Концентрации химических веществ в воздухе рабочей зоны на момент проверки превышают ПДК в 1,5 раза.

Пример 3.

Работник Ш., 1977 г.р., стаж 2 года, по профессии слесарь по ремонту технологического оборудования на нефтехимическом производстве. Проходил периодический медицинский осмотр с целью определения степени экспозиции и необходимых профилактических мероприятий. При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 2 мл венозной крови с последующим определением разрывов ДНК в мононуклеарных клетках периферической крови. Процент «комет» с разрывами ДНК составляет 40,00%, что определяет высокую степень экспозиции работника токсичными веществами и необходимость проверки качества профилактических мероприятий. При проверке качества выполнения профилактических мероприятий было обнаружено, что работник часто во время выполнения производственных работ использовал непрорезиненные рукавицы и надевал противогаз, который был подобран не по размеру и неплотно прилегал к коже головы. Химический фактор: стирол, этилбензол. Концентрации химических веществ в воздухе рабочей зоны химических веществ на момент проверки превышают предельно допустимые значения в 2,5 раза.

Пример 4. Работник 3., 1968 г.р., стаж 8 лет, машинист компрессорных установок на нефтехимическом производстве. Проходил периодический медицинский осмотр с целью определения степени экспозиции и необходимых профилактических мероприятий. При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 2 мл венозной крови с последующим определением разрывов ДНК в мононуклеарных клетках периферической крови. Процент «комет» с разрывами ДНК составляет 100,00%, что определяет высокую степень экспозиции работника токсичными веществами и необходимость проверки качества профилактических мероприятий. Химический фактор: нефрас, хлорметан. Обнаружено превышение ПДК в воздухе рабочей зоны нефраса в 3,5 раза, хлорметана в 2,5 раза. Работник направлен в стационар на углубленное обследование и проведение лечебно-профилактических мероприятий.

Пример 5. Работник Н., 1962 г.р., стаж 30 лет, электромонтер по ремонту и эксплуатации технологического оборудования. Проходил периодический медицинский осмотр с целью определения степени экспозиции и необходимых профилактических мероприятий. При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 2 мл венозной крови с последующим определением разрывов ДНК в мононуклеарных клетках периферической крови. Процент «комет» с разрывами ДНК составляет 19,99%, что определяет низкую степень экспозиции работника токсичными веществами и достаточность проводимых профилактических мероприятий. Химический фактор: динил, олефины С4-С10. Концентрация химических веществ в воздухе рабочей зоны на момент проверки не превышала ПДК.

Пример 6. Работник А., 1986 г.р., стаж 3 года, машинист компрессорных установок. Проходил периодический медицинский осмотр с целью определения степени экспозиции и необходимых профилактических мероприятий. При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 2 мл венозной крови с последующим определением разрывов ДНК в мононуклеарных клетках. Процент «комет» с разрывами ДНК составляет 20,00%, что определяет среднюю степень экспозиции работника токсичными веществами и необходимость проверки качества выполнения профилактических мероприятий. Химический фактор: бензины, пропилен, алкены С2-С5. Концентрация химических веществ в воздухе рабочей зоны на момент проверки не превышала ПДК. При проверке качества выполнения профилактических мероприятий было обнаружено, что работник иногда не использовал средства защиты органов дыхания.

Способ оценки степени экспозиции токсических веществ на работников нефтехимических производств, включающий исследование периферической крови, отличающийся тем, что проводят выделение мононуклеарных клеток периферической крови, которые наносят на предметное стекло в 1% легкоплавкой агарозе, лизируют в щелочном растворе, проводят гель-электрофорез, после чего микропрепараты фиксируют 15 минут в 70% этаноле, высушивают на воздухе при комнатной температуре и окрашивают в 0,5% водном растворе бромистого этидия, полученные «ДНК-кометы» исследуют с помощью флуоресцентного микроскопа, подсчитывают относительное содержание ДНК в хвосте «комет», после чего у индивидов, имеющих процент «комет» с разрывами ДНК от 0,00 до 19,99%, определяют низкую степень экспозиции токсических веществ на работника; от 20,00 до 39,99% - среднюю степень экспозиции токсических веществ; от 40,00 до 100,00% определяют высокую степень экспозиции токсических веществ.