Штамм mycobacterium tuberculosis 326/18/47 в-9673 для оценки эффективности противотуберкулезных препаратов и дезинфицирующих средств

Изобретение относится к области биотехнологии и касается штамма Mycobacterium tuberculosis 326/18/47, предназначенного для проведения научно–исследовательских работ при диагностике штаммов с устойчивостью к деламаниду. Штамм может найти применение в медицине при оценке эффективности противотуберкулезных препаратов, дезинфицирующих средств и создании диагностических тест-систем. 3 пр.

 

Область техники

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и медицине и касается штамма Mycobacterium tuberculosis 326/18/47 В-9673, предназначенного для проведения научно - исследовательских работ при диагностике штаммов с устойчивостью к деламаниду. Штамм может найти применение в медицине при оценке эффективности противотуберкулезных препаратов и дезинфицирующих средств.

Уровень техники

На сегодняшний день отмечается рост случаев туберкулеза, вызванного Mycobacterium tuberculosis complex с лекарственной устойчивостью. Широкое распространение возбудителя с резистентностью к противотуберкулезным препаратам способствует сохранению резервуара инфекции в обществе и дальнейшему его распространению. Выявление штаммов Mycobacterium tuberculosis, обладающих множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) и широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ) к противотуберкулезным препаратам (ПТП) является основной проблемой в лечении лекарственно устойчивого туберкулеза (ЛУ ТБ) [Цыбикова Э.Б., Сон И.М., Владимиров А.В. Смертность от туберкулеза и ВИЧ-инфекции в России. Tuberculosis and Lung Diseases, Vol. 98, No. 6, 2020; Васильева И.А., Белиловский Е.М., Борисов С.Е., Стерликов С.А. Туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя в странах мира и в Российской Федерации. Tuberculosis and Lung Diseases, Vol. 95, No. 11, 2017]. Современные исследования эволюции микобактерий туберкулеза (МБТ) показали, что горизонтальный перенос генов приводит к широкому генетическому разнообразию, и в первую очередь, к закреплению ЛУ к основным, а в некоторых случаях и к резервным ПТП [Stinsona K., Kurepina N., Amour Venter, Mamoru Fujiwara, Masanori Kawasaki et al. MIC of Delamanid against Mycobacterium tuberculosis Clinical Isolates and a Proposed Critical Concentration. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, June 2016 Volume 60 Number 6]. На сегодняшний день имеется достаточно большой арсенал средств для диагностики туберкулеза (ТБ): ускоренные методы для идентификации фенотипической принадлежности микобактерий (МБ), успехи достигнуты в создании высокоспецифических молекулярно-генетических методов определения ЛЧ. В то же время для решения проблем туберкулеза на уровне практического здравоохранения на передний план выходят задачи, связанные с экспериментальной медициной, одной из направлений которых является оценка эффективности традиционной терапии и разработка новых схем лечения на примере экспериментального МЛУ ТБ. Прогресс в этой области можно ожидать в двух областях: исследование генетического аппарата микобактерий на обнаружение генов, ответственных за МЛУ ТБ к ПТП и доклинические исследования, обуславливающие проведение эксперимента с моделированием лекарственно-устойчивой формы возбудителя заболевания.

В современных доклинических исследованиях, прежде всего, используют контрольный тест-штамм H37Rv, вызывающего типичное течение туберкулеза и клинические штаммы, предназначенные для лабораторных исследований, в том числе молекулярно-генетических. Так, А.Ю. Савченко, М.С. Буренков и их соавторы поставили серию экспериментов на мышах, зараженных лабораторным штаммом M. tuberculosis, устойчивого к полихимиотерапии [Савченко А.Ю., Буренков М.С., Байдин П.С., Раменская Г.В., Перова Н.В., Кукес В.Г. Противотуберкулезная активность на фоне лекарственной устойчивости возбудителя в эксперименте как основа перспективы использования препарата тиозонид // Сибирский медицинский журнал. The Siberian Medical Journal. - 2020. - 35(1) - С. 125-32]. В частности, экспериментальную оценку эффективности лечения и переносимости терапии ТБ осуществляли на примере экспериментального МЛУ ТБ, стимулированного в результате инфицирования мышей лабораторными штаммами М. tuberculosis МS-115 c МЛУ (устойчив к рифампицину, изониазиду, стрептомицину, этамбутолу и пиразинамиду) и штамма М. tuberculosis CN-40, устойчивого к изониазиду. В результате проведенного эксперимента была проведена оценка ЛЧ к тестируемому ПТП (определены показатели минимальных ингибирующих концентраций), переносимость терапии подопытными животными (высеваемость МБТ до и после эксперимента, оценен индекс поражения внутренних органов), рассчитан индекс эффективности лечения. Однако используемые штаммы М. tuberculosis МS-115 и М. tuberculosis CN-40 не обладают устойчивостью к таким противотуберкулезным препаратам, как моксифлоксацин и деламанид, что делает невозможным применение полученных данных в условиях ШЛУ ТБ и оценке эффективности новейших ПТП.

Опыт Павлова М.В. и его коллег [Павлова М.В., Виноградова Т.И., Заболотных Н.В., Ершова Е.С., Сапожникова Н.В. и др. Перспективы использования противотуберкулезных препаратов нового поколения в терапии туберкулеза с лекарственной устойчивостью возбудителя (экспериментально-клиническое исследование) // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. - 2018. - Т. 16. - № 4. - С. 33-40] также убедительно продемонстрировал экспериментально-клиническое исследование применения ПТП нового поколения в терапии туберкулеза легких с МЛУ возбудителя с различными сочетаниями мутаций в генах. В данном случае, была проведена серия опытов, где для моделирования ЛУ туберкулеза использовали штаммы из коллекции ФГБУ «СПб НИИ фтизиопульмонологии» Минздрава России: штамм № 9660 с ЛУ к изониазиду, рифампицину, стрептомицину этионамиду, канамицину с сочетанными мутациями в генах rpoB (резистентность к рифампицину), katG, inhA, ahpC (устойчивость к изониазиду) и штамм № 2712, резистентный к изониазиду, рифампицину, этамбутолу, стрептомицину, канамицину, капреомицину и амикацину с мутациями в генах rpoB, katG и ahpC. Эффективность проводимой противотуберкулезной терапии с учетом спектра лекарственной чувствительности МБТ оценивали на лабораторных животных, инфицированных ЛУ МБТ. На фоне МЛУ-ТБ были выявлены интегральные показатели терапевтической эффективности использования комбинаций основных и резервных ПТП, разработана оптимальная схема терапии ЛУ ТБ, в том числе подобранной с учетом спектра ЛУ клинических штаммов, использованных для моделирования экспериментального туберкулеза у мышей. Однако в спектр устойчивости используемых штаммов не входят препараты фторхинолоновой группы (II ряд), например моксифлоксацин, а также современный ПТП деламанид, что делает невозможным применение полученных данных в условиях лечения ТБ с ШЛУ в РФ и использования более новых ПТП и их комбинаций.

Если в предыдущем примере рассматривали показатели бремени моделирования ТБ МЛУ, то с недавнего времени стали появляться публикации, с расшифровкой геномной последовательности М. tuberculosis в зависимости от генотипа и типа мутаций, определяющих ЛУ к ПТП. Молекулярно-эпидемиологические исследования M. tubercosis свидетельствуют, что в генетически неоднородной российской популяции возбудителя туберкулеза доминирует генотип Beijing, с эпидемически распространенными вариантами которого тесно ассоциировано развитие множественной (МЛУ) и широкой лекарственной устойчивости (ШЛУ) [Зинченко Ю.С., Басанцова Н.Ю., Старшинова А.Я., Умутбаева Г.Б., Чурилов Л.П. Туберкулез сегодня: основные направления исследований по профилактике, диагностике и лечению // Российские биомедицинские исследования. - 2018. - Т. 3. - С. 24-34]. Необходимо принять во внимание выявление мутаций, определяющих ЛУ к новому классу лекарственных средств - деламаниду и претоманиду, разработанным для лечения пациентов с высокой невосприимчивостью к противотуберкулезной терапии [Евдокимова Н. Е., Винокурова М. К., Жданова С. Н., Огарков О. Б., Кравченко А. Ф., Савилов Е. Д. Результаты лечения новых случаев туберкулеза легких в зависимости от основных генотипов Mycobacterium tuberculosis в Республике Саха (Якутия) // Туберкулез и болезни легких. - 2021. - Т. 99 - № 1. - С. 41-47], т.к. применение данных препаратов было одобрено в рекомендациях ВОЗ для лечения МЛУ ТБ [WHO Consooidated Guidelines on Tuberculosis, Module 4, ISBN 9789289054942, ISBN: 9789240007048]. В клинических рекомендациях РФ, утвержденных в 2022 году также в режим химиотерапии рекомендован деламанид при лечении МЛУ и пре-ШЛУ ТБ, а для лечения ШЛУ ТБ является одним из основных препаратов [Министерство Здравоохранения Российской Федерации. Клинические рекомендации «Туберкулез у взрослых». Документ доступен по адресу: https://cr.minzdrav.gov.ru/schema/16_2].

Von Groote-Bidlingmaier F. et al. (2019), опубликовали данные по выявлению мутаций, определяющую устойчивость к деламаниду для изолятов МБТ, выявленных из различных географических регионов. Конечной целью исследования стало установление вариаций МИК для деламанида, в том числе выявлен предполагаемый механизм резистентности - мутация одного из пяти генов коэнзима F₄₂₀: ddn (Rv3547), fgd1 (Rv0407), fbiA (Rv3261), fbiB (Rv3262) и fbiC (Rv1173) [Kelly Stinson, Natalia Kurepina, Amour Venter, Mamoru Fujiwara et al. MIC of Delamanid (OPC-67683) against Mycobacterium tuberculosis Clinical Isolates and a Proposed Critical Concentration. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. June 2016 Volume 60 Number 6]. Этот целенаправленный подход оказался вполне логичными с точки зрения современной молекулярной генетики и обеспечил значимый вклад в установление понятий, свидетельствующих об устойчивости к антибиотикам молекулярными методами исследования.

Вышеуказанное свидетельствует о потребности в тест-штаммах, определяющих ЛУ к ПТП нового поколения, выражающуюся в необходимости проведения сравнительных молекулярно-генетических исследований клинических изолятов с контрольными штаммами, имеющие мутации к определенному спектру ПТП. Данная точка зрения подтверждается и тем, что существует значительный риск неполного выявления спектра ЛУ МБТ на этапе назначения лечения, чему причиной являются характеристики самих тест-систем и/или отсутствие повсеместного доступа к тестированию на лекарственную чувствительность (ТЛЧ) к современным препаратам для лечения МЛУ-ТБ. Это может привести к назначению заведомо неэффективных схем и дальнейшей амплификации ЛУ МБТ. Это предполагает новую парадигму, заключающиеся внедрением в работу бактериологических лабораторий тест-штаммов, имеющих мутации к новым и перепрофилированным ПТП.

Кроме того, на этапах разработки новых противотуберкулезных препаратов и дезинфицирующих средств необходимо наличие контрольных штаммов с новыми генетическими свойствами.

Технической проблемой, решаемой заявляемым изобретением, является выделение штамма, пригодного для разработки новых противотуберкулезных препаратов и оценки их эффективности, стандартизации оценки действия дезинфицирующих средств, а также удовлетворяет потребность в контрольных штаммах при молекулярно-генетических исследованиях ШЛУ туберкулеза.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом предлагаемого изобретения является расширение ассортимента (панели) штаммов Mycobacterium tuberculosis complex для проведения научных исследований на этапе моделирования ТБ с МЛУ в опытах с животными, в том числе в лабораторных исследованиях - при определении ЛЧ к существующим препаратам первого/второго ряда выбора и специально разработанным ПТП, использующихся в особых случаях для лечения ЛУ ТБ (на примере деламанида). Указанный технический результат изобретения достигается использованием штамма M. tuberculosis 326/18/47 В-9673 для фенотипических и молекулярно-генетических исследований в лабораторной диагностике ЛУ ТБ МЛУ.

Штамм Mycobacterium tuberculosis 326/18/47, депонирован в государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» (Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ФБУН ГНЦ ПМБ) с присвоенным идентификатором B-9673.

Описание штамма

Штамм был выделен из мокроты пациента в лаборатории клинической микробиологии отдела лабораторных исследований Федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный медицинский исследовательский центр фтизиопульмонологии и инфекционных заболеваний» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «НМИЦ ФПИ» МЗ РФ), г. Москва. Штамм, выделенный из мокроты пациента, имеет мутации, ассоциированные с лекарственной устойчивостью к деламаниду, который пациент не получал. Кроме того, выявлена устойчивость к другим противотуберкулезным препаратам рифампицину, изониазиду, этамбутолу, стрептомицину, этионамиду, пиразинамиду, моксифлоксацину в низкой концентрации (0,25 мкг\мл) и при этом чувствительный к высокой концентрации моксифлоксацина (1,0 мкг\мл) при сохраненной чувствительности к офлоксацину и левофлоксацину. Выявленная лекарственная устойчивость вызывает трудности при формировании режимов химиотерапии туберкулеза и требует персонифицированного подхода, а также представляет научный интерес.

Для идентификации штамма было проведено полногеномное секвенирование с использованием прибора MGISEQ-200RS (BGI, Китай), а также MALDI-TOF типирование (Bruker Daltonik MALDI Biotyper (Германия).

Характеристика штамма. Культурально-морфологические особенности штамма: тонкие прямые или слегка изогнутые палочки длиной 1-10 мкм, гомогенные или зернистые с незначительно закругленными концами, спор и капсул не образует, кислотоустойчивы, плохо красятся анилиновыми красителями, по Цилю-Нильсену окрашиваются в ярко-красный цвет. Растут при температуре 37°С в аэробных и факультативно-анаэробных условиях в течении нескольких недель. На яичных средах Левенштейна-Йенсена, Финна II рост отмечается на 14-21 сутки в виде сухого морщинистого налета кремового цвета. На среде Middlebrook 7H10 Agar Base с ростовой добавкой ОАDC Growth Supplement через 14-28 сутки образуется шероховатые плоские колонии кремового цвета с фистончатым краем. Для выращивания культуры использовали жидкие среды DifcjoDubo Broh или Difco Middltbrook 7H9 Broth (Bacton, Dikinson and Company, Sparks, USA). Культура вырастала до формирования мутности за 2 недели при температуре 37°С в шейкере при перемешивании. Условия хранения: в фосфатном солевом буфере с 0.05% Tween80 и 0.01% БСА при -80°С, или в лиофилизированном виде.

Штамм чувствителен к офлоксацину, моксифлоксацину в концентрации 1,0 мкг/мл, левофлоксацину, канамицину, амикацину, капреомицину, ПАСК, линезолиду, протионамиду, бедаквилину. Устойчивый к рифампицину, изониазиду, этамбутолу, стрептомицину, этионамиду, пиразинамиду, моксифлоксацину в концентрации 0,25 мкг/мл.

Генетика штамма. Выявлено 10 синонимичных SNP мутаций; 13 несинонимичных SNP мисенс мутаций, расположенных в генах Rv0667 (rpoB) (Ser450Leu) и Rv0668 (rpoC) (Gly333Ala) - ассоциированные с устойчивостью к рифампицину, Rv1908c (katG) (Ser315Thr, Arg463Leu) - ассоциированные с устойчивостью к изониазиду, Rv2043c (pncA) (Asp63Ala) - ассоциированная с устойчивостью к пиразинамиду, Rv0682 (rspL) (Lys43Arg) и Rv3919c (gidB) (Glu92Asp) - ассоциированные с устойчивостью к стрептомицину, Rv3795 (embB) (Asp354Ala) - ассоциированная с устойчивостью к этамбутолу, Rv0006 (gyrA) (Glu21Gln; Ser95Thr; Gly668Asp) - ассоциированные с устойчивостью к фторхинолонам; 2 делеции, ассоциированные с устойчивостью к этионамиду в генах Rv3855 (ethR) (4327549…4328198) и Rv3854c (ethA) (4326004…4327547); 1 несинонимичная SNP нонсенс мутация, ассоциированная с устойчивостью к деламаниду, в гене Rv3547 (ddn) (Trp88stop).

Изобретением подтверждается следующими примерами.

Пример 1

Оценку эффективности ПТП проводили методом теста на лекарственную чувствительность (ТЛЧ) на жидких средах с использованием системы Bactec MGIT 960. Для этого исследования был использован заявляемый мультирезистентный штамм Mycobacterium tuberculosis 326/18/47 В-9673, т.к. обладает устойчивостью к широкому спектру ПТП (рифампицину, изониазиду, этамбутолу, стрептомицину, этионамиду, пиразинамиду, моксифлоксацину в низкой концентрации). Также был взят штамм Mycobacterium tuberculosis H37Rv из коллекции ГИСК им. Тарасевича, фенотипически чувствительный к известным ПТП.

В качестве контрольных ПТП были взяты амикацин, изониазид, левофлоксацин и рифампицин.

Таблица. Результаты определения чувствительности Mycobacterium tuberculosis 326/18/47 и H37Rv.
Штамм M. tuberculosis	Препарат
Амикацин	Изониазид	Левофлоксацин	Рифампицин
326/18/47	Чувствительный (роста нет)	Устойчивый (рост есть)	Чувствительный (роста нет)	Устойчивый (рост есть)
H37Rv	Чувствительный (роста нет)	Чувствительный (роста нет)	Чувствительный (роста нет)	Чувствительный (роста нет)

Оценка полученных результатов определения чувствительности к штаммам M. tuberculosis: исследуемый препарат не эффективен в отношении M. tuberculosis.

Таким образом, предложенный штамм Mycobacterium tuberculosis позволит расширить ассортимент коллекции микроорганизмов этого вида, пригодных для контроля чувствительности в клинической практике, а также для оценки эффективности новых ПТП при их разработке.

Пример 2

Оценку эффективности дезинфицирующих средств (ДС), предлагаемых для дезинфекции объектов окружающей среды, контаминированных штаммами M. tubercul°sis, проводили методом посева на ППС согласно МУ 3.5.1.3439-17. Результаты исследования представлены в таблице.

Таблица. Результаты оценки эффективности исследуемых ДС
Штаммы M. tuberculosis	Группа дезинфицирующего средства
на основе 30% перекиси водорода и ЧАС Концентрация ДС -3% Экспозиция - 30 мин	На основе натриевой соли дихлоризоциануровой кислоты Концентрация ДС - 0,1 % Экспозиция - 30 мин	На основе натриевой соли дихлоризоциануровой кислоты Концентрация ДС - 0,1 % Экспозиция - 60 мин
326/18/47 В-9673	Нет роста	Нет роста	Нет роста
H37Rv	Нет роста	Нет роста	Нет роста

Оценка полученных результатов определения эффективности ДС: проведенные исследования чувствительности 2-х групп ДС оказались эффективными в отношении мультирезистентного штамма Mycobacterium tuberculosis 326/18/47 В-9673 и H37Rv.

Таким образом, заявляемый штамм Mycobacterium tuberculosis позволит расширить ассортимент коллекции микроорганизмов этого вида, пригодных для разработки дезинфецирующих средств.

Пример 3

Контроль качества определения механизма устойчивости к деламаниду путем детекции мутаций по данным полногеномного секвенирования.

Детекцию мутаций проводили путем анализа данных полногеномного секвенирования. Выделение ДНК из исследуемых штаммов и контрольного штамма Mycobacterium tuberculosis 326/18/47 В-9673 проводили с использованием набора Qiagen DNeasy Blood&Tissue Extraction Kit (Qiagen, Нидерланды) согласно инструкции производителя. Образцы фрагментировали ультразвуком с помощью соникатора Covaris, а затем готовили библиотеки для секвенирования с помощью набора MGI Library Prep Set (BGI, Китай). Промежуточные измерения концентраций дцДНК и оцДНК проводили с помощью флуориметра Qubit (ThermoFisher, США). Распределение ДНК по длине фрагмента в библиотеках анализировали на приборе Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, США). Полногеномное секвенирование образцов проводили на приборе MGISEQ-200RS (BGI, Китай). Первичная обработка данных проводилась с помощью basecalling-программы производства BGI, входящей в пакет программ, поставляемых с секвенатором. Устойчивость к противотуберкулезным препаратам определяли с помощью пайплайнов MTBseq и TBprofiler.

Контрольный штамм Mycobacterium tuberculosis 326/18/47 В-9673 проявлял заявленные свойства: стабильно обнаруживалась мутация в хромосомном гене Rv3547 (ddn) вида Trp88stop, связанная с сильной устойчивостью к деламаниду.

Для обеспечения достоверной диагностики туберкулеза необходимо проводить контроль качества. Предлагаемый штамм Mycobacterium tuberculosis 326/18/47 В-9673 обладает стабильными свойствами, позволяющими контролировать этап определения механизма устойчивости (мутация в хромосомном гене Rv3547 (ddn) вида Trp88stop) молекулярными методами.

Таким образом, предложенный штамм Mycobacterium tuberculosis 326/18/47 В-9673 позволит расширить ассортимент коллекции микроорганизмов этого вида, пригодных для разработки противотуберкулезных препаратов, дезинфицирующих средств, для контроля этапа определения механизма устойчивости к деламаниду молекулярными методами и разработки новых диагностических тест-систем.

Штамм Mycobacterium tuberculosis 326/18/47, депонирован в государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» с присвоенным регистрационным номером B-9673, для оценки эффективности противотуберкулезных препаратов, дезинфицирующих средств и диагностических тест-систем.