Способ создания токсической модели атрофии зрительного нерва

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и предназначено для создания токсической модели атрофии зрительного нерва с целью последующего изучения патологического процесса, разработки способов диагностики и лечения. Для этого в течение 24 часов до введения метанола вводится предварительно внутрь крысам Аминофиллин в расчете на вес экспериментального животного в концентрации 10 мкг/кг 3 раза в день. Последний прием Аминофиллина производится за 8 часов до инъекции раствора метанола. Далее путем инъекции в ретробульбарное пространство крысы вводится 92% раствор метанола, разведенный 0,9% раствором натрия хлорида в пропорции 1:1. После инъекции метанола в течение последующих 24 часов внутрь вводится Аминофиллин в расчете на вес экспериментального животного в концентрации 10 мкг/кг 3 раза в день, причем первое введение осуществляется через 2 часа после инъекции. Изобретение обеспечивает достоверно производимую атрофию зрительного нерва, вызванную токсическим воздействием метаболитов метанола на волокна зрительного нерва. 6 ил., 1 пр., 1 табл.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии и предназначено для создания токсической модели атрофии зрительного нерва с целью последующего изучения патологического процесса, разработки способов диагностики и лечения.

Атрофия зрительного нерва представляет собой патологию органа зрения, характеризующейся стойким снижением остроты зрения. Данное заболевание всегда вторично, развивается в следствие многих заболеваний глаз, в том числе наследственных, ишемических, травматических и токсических [Самойлов А.Н., Бариева А.М. Характеристика токсического действия при острых отравлениях метанолом и этанолом Офтальмологические ведомости. - 2020. - Т. 13. - № 1. - С. 65-70.]. Атрофия зрительного нерва относится к поздним стадиям изменений, происходящих в зрительном нерве в результате аксональной дегенерации в пути между сетчаткой и латеральным коленчатым телом, проявляющейся нарушением зрительной функции [Chane JW. Optic nerve disorders: diagnosis and management. Springer-Verlag New York; 2014. Р. 185-186.]. Наиболее часто пациенты отмечают снижение остроты зрения, нарушение цветоощущения, появление центральных и парацентральных скотом, сужение полей зрения. При офтальмоскопии визуализируется бледность диска зрительного нерва, инструментальные методы позволяют выявить нарушение проведения нервного импульса по зрительному нерву, дефекты в полях зрения, истончение нейроэпителия сетчатой оболочки [Wang AG. Emergency neuroophthalmology. Rapid case demonstration. Springer Singapore; 2018. Р.]. На современном этапе медицины вопрос о своевременной диагностики и лечении атрофии зрительного нерва остается актуальным, создание новых моделей атрофии зрительного нерва может способствовать более детальному изучению патогенеза, течения патологического процесса и разработки методик диагностики и лечения.

Известны разные способы моделирования атрофии зрительного нерва у экспериментальных животных различной этиологии и формирование дегенеративных процессов в волокнах зрительного нерва, близкого к клиническому.

Известен отечественный запатентованный способ создания модели частичной атрофии зрительного нерва (Патент RU №2399100, МПК G09B23/28, А16F 9/00 - 10.09.2010, Бюл. № 25). Экспериментальную модель острой ишемии в сосудах сетчатки и зрительного нерва вызывали путем фотодинамического воздействия на область диска зрительного нерва (ДЗН) и магистральных сосудов. Экспериментальным животным внутривенно (в ушную вену) вводили фотосенсибилизатор хлоринового ряда - «Фотодитазин» в дозе 2,4 мг/кг веса, через 15 минут транспупиллярно проводили лазерное облучение ДЗН с плотностью энергии 200-250 Дж/см², диаметр пятна лазерного излучения составлял 3 мм. Метод позволяет достичь развития ишемической атрофии зрительного нерва.

Недостаток метода - сложность проведения, требуется наличие навыков работы на лазерной аппаратуре.

Одним из способов создания атрофии зрительного нерва является ишемическая модель атрофии зрительного нерва с использованием диодного лазера [Chen CS, Johnson MA, Flower RA, Slater BJ, Miller NR, Bernstein SL. A primate model of nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2008; 49: 2985-2992.]. Метод заключался в следующем: самцов макак-резусов (макака мулатта; возраст 4-6 лет; вес 6-10 кг) первоначально анестезировали кетамином 10 мг и ксилазином 2 мг/кг, интубировали и поддерживали ингаляционной смесью изофлурана, кислорода и закиси азота. Внутриглазную часть диска зрительного нерва визуализировали с помощью контактной линзы Glasser monkey (Ocular Instruments, Inc., Бельвью, Вашингтон), и ишемическую модель атрофии зрительного нерва индуцировали внутривенным введением красителя Rose Bengal в дозе 2,5 мг/кг. Rose Bengal был фотоактивирован в оптическом диске с помощью неодим-иттрий-алюминиевого граната (Nd:YAG), диодного лазера с удвоенной частотой (532 нм) с размером пятна 1,06 мм, мощностью 200 МВт, в течение времени от 7 до 10 секунд. Для фиктивной обработки использовались идентичные освещение и мощность лазерного излучения без красителя RB.

Основным недостатком является сложность проведения и требует специального материально-технического оснащения.

Травматическая модель атрофии зрительного нерва предусматривает иссечение зрительного нерва [N Rodríguez-Muela, F Germain, G Marin, PS Fitze and P Boya, Autophagy promotes survival of retinal ganglion cells after optic nerve axotomy in mice. Cell Death and Differentiation (2012) 19, 162-169]. Для достижения дегенеративных процессов в зрительном нерве необходимо в ведение анестезии внутрибрюшинной (внутривенной) инъекцией 80 мг/кг раствора хлоргидрата кетамина (Merial, Барселона, Испания) и 10 мг/кг 2% хлоргидрата ксилацина (Bayer, Барселона, Испания). Левые зрительные нервы были интраорбитально рассечены на расстоянии 1 мм от глазного яблока, а правые глаза использовались в качестве контроля. Были приняты меры предосторожности, чтобы не повредить кровеносные сосуды, и это было подтверждено офтальмоскопией глазного дна. Ретроградное маркирование проводилось путем помещения кусочка губчатой ткани, поглощенной 0,1% флуоресцентным индикатором DTMR (Молекулярные зонды, Пейсли, Великобритания), на культю зрительного нерва после операции.

Недостаток метода заключается в необходимости проведении оперативного вмешательства экспериментальных животных для иссечения зрительного нерва.

Метод создания митохондриальной дисфункции в волокнах зрительного нерва заключается в следующем: после местной анестезии аметокаином, в склере глазного яблока экспериментальной крысы был сделан небольшой прокол. Через прокол вводили микроиглу с тупым концом 32 калибра, прикрепленную к шприцу Гамильтона объемом 10 мл, вводили в стекловидное тело обоих глаз 3 мл AAV2/2-OPA1-iso 1 или AAV2/2-OPA1-iso 7 (1 109 векторных геномов) плюс 1 108 AAV2/2 CAG-EGFP медленно, в течение 2 минут. После интравитреальной инъекции путем внутрибрюшинной инъекции вводили реверсивный анестетик (гидрохлорид атипамезола, 1,33 мг/кг массы тела). Температуру тела поддерживали с помощью гомеотермического нагревательного устройства. 3 недели спустя 0,6 мл 1,5 мм ротенона в ДМСО вводили тем же методом интравитреальной инъекции в один глаз [Daniel M. Maloney, Naomi Chadderton, Sophia Millington-Ward, Arpad Palfi, Ciara Shortall, James J. O’Byrne, Lorraine Cassidy, David Keegan, Peter Humphries, Paul Kenna and Gwyneth Jane Farrar. Optimized OPA1 Isoforms 1 and 7 Provide Therapeutic Benefit in Models of Mitochondrial Dysfunction. Frontiers in Neuroscience, November 2020].

В 1994 году были изучены травматическая и токсическая модели атрофии зрительного нерва [Гаджиева, Нурия Саниевна. Метод одномоментной сочетанной электрической и лазерной стимуляции зрительного нерва в лечении атрофий различного генеза: автореферат дис. … кандидата медицинских наук: 14.00.08. - Москва, 1994. - 23 с.: ил.]. Травматическая модель заключалась в сдавлении зрительного нерва на различных уровнях (экспериментальные животных оперировались под общей анестезией гексекалом (1мг/кг) и ретробульбарной новокаиновой блокадой. На основании данных морфологических и электроретинографических методов исследования (зрительные вызванные потенциалы) была диагностирована атрофия зрительного нерва различной степени. В токсической модели частичной атрофии зрительного нерва использовался метанол в разведении 1:1, спиртовой 1 мл раствор вводили ретробульбарно от 2 до 10 раз до появления симптома «паралича зрачка» (свидетельствует о токсическом поражении нервных волокон. Зрительные вызванные потенциалы при токсической модели атрофии зрительного нерва отличались большим разбросом показателей, что затрудняло статистическую обработку материала. На основании морфологического исследования материала было выявлено гомогенное разволокнение нервной ткани, отсутствие в ней клеточных элементов.

Данный метод взят за прототип.

Объединяющем преимуществом всех методов заключается в заявленной авторами надежности воспроизведения методов. Однако не все способы являются доступными для осуществления: для ряда экспериментальных моделей необходимо дорогостоящее оснащение операционной, специальных навыков для работы на оборудовании, в некоторых случаях способы трудоемки для осуществления.

Задачей заявляемого изобретения является разработка малотравматичной доступной достоверно воспроизводимой экспериментальной модели атрофии зрительного нерва у лабораторных крыс, позволяющий расширить возможности для исследования патологического процесса и разработки новых подходов к диагностике и лечению атрофии зрительного нерва.

Техническим результатом заявленного изобретения является достоверно производимая атрофия зрительного нерва, вызванный токсическим воздействием метаболитов метанола на волокна зрительного нерва.

Технический результат заявленного изобретения достигается за счет того, что для создания токсической модели атрофии зрительного нерва, включающий введение инъекций метанола, особенность заключается в том, что в течение 24 часов до введения метанола вводится предварительно внутрь крысам Аминофиллин в расчете на вес экспериментального животного в концентрации 10 мкг/кг 3 раза в день, последний прием Аминофиллина производился за 8 часов до инъекции раствора метанола, далее путем инъекции в ретробульбарное пространство крысы вводится 92% раствор метанола, разведенный 0,9% раствором натрия хлорида в пропорции 1:1, после инъекции метанола в течение последующих 24 часов внутрь вводится Аминофиллин в расчете на вес экспериментального животного в концентрации 10 мкг/кг 3 раза в день, причем первое введение осуществляется через 2 часа после инъекции.

Преимуществом, обеспечиваемым приведенной совокупностью признаков, являются достоверность воспроизведения, легкость выполнения, малоинвазивная методика.

Детали, признаки, а также преимущества настоящего изобретения следуют из нижеследующего описания реализации заявленного технического решения с использованием чертежей, на которых показано:

Фиг. 1 - Гистологическое исследование препаратов токсической модели атрофии зрительного нерва с использованием Аминофиллина. Окраска Гематоксилином и Эозином.

Фиг. 2 - Гистологическое исследование препаратов токсической модели атрофии зрительного нерва без использования Аминофиллина. Окраска Гематоксилином и Эозином.

Фиг. 3 - Гистологическое исследование препаратов контрольной группы. Окраска Гематоксилином и Эозином.

Фиг. 4 - Исследование количества миелина в препаратах контрольной группы.

Фиг. 5 - Исследование количества миелина в препаратах токсической модели атрофии зрительного нерва без использования Аминофиллина.

Фиг. 6 - Исследование количества миелина в препаратах с использованием Аминофиллина. Окраска Гематоксилином и Эозином.

Способ осуществляется следующим образом:

В течение 24 часов до введения метанола вводится предварительно внутрь крысам Аминофиллин в расчете на вес экспериментального животного (средний вес 500-700 г) в концентрации 10 мкг/кг 3 раза в день, последний прием Аминофиллина производился за 8 часов до инъекции раствора метанола. Далее путем инъекции в ретробульбарное пространство крысы вводится 92% раствор метанола, разведенный 0,9% раствором натрия хлорида в пропорции 1:1. После инъекции метанола в течение последующих 24 часов внутрь вводится Аминофиллин в расчете на вес экспериментального животного в концентрации 10 мкг/кг 3 раза в день, первое введение осуществляется через 2 часа после инъекции. Данная модель за счет токсического действия метанола позволяет добиться атрофии зрительного нерва.

Результатом вышеописанного алгоритма явилась атрофия зрительного нерва.

Применение Аминофиллина позволило ускорить всасываемость метанола и его метаболизм, что в свою очередь привело к развитию атрофии зрительного нерва больше по площади в более короткий срок по сравнению с группой животных, кому был введен метанол без предварительного введения Аминофиллина.

Клинический пример.

Экспериментальные животные были разделены на четыре группы: контрольная группа; животные; животные, которым делалась инъекция в ретробульбарное пространство метанола; животные, которым за 24 часа до и 24 часа после введения метанола вводился внутрь Аминофиллин в концентрации 10 мкг/кг

В ходе создания модели атрофии зрительного нерва оценивалось поведение животных (способность найти выход из клетки), окраска материала гематоксилином и эозином, окраска метиленовым синим после 30 суток после введения метанола.

Проведен статистический анализ времени нахождения выхода из клетки крысами (Таблица 1).

Количественные показатели, имеющие нормальное распределение, описывались с помощью средних арифметических величин (M) и стандартных отклонений (SD), границ 95% доверительного интервала (95% ДИ).

По данным таблицы наглядно видно увеличение среднего времени нахождения выхода из клетки крысами, которым за 24 часа до и 24 часа после введения метанола вводился per os Аминофиллин в концентрации 10 мкг/кг, по сравнению с группой крыс, которым делалась инъекция в ретробульбарное пространство метанола без использования Аминофиллина

Таблица 1 - Описательное сравнение времени нахождения выхода из клетки крысами двух моделей атрофии зрительного нерва (без использования Аминофиллина и с использованием Аминофиллина)

Показатели M ± SD 95% ДИ n min max
Время до введения метанола 35 ± 18 8 - 63 4 18 59
Время после введения метанола 70 ± 34 15 - 124 4 42 120
Время до введения метанола +per os Аминофиллин 21 ± 12 2 - 39 4 6 31
Время после введения метанола +per os Аминофиллин 129 ± 30 82 - 177 4 103 172

Гистологические исследование препаратов модели атрофии зрительного нерва с использованием Аминофиллина показали наличие кровоизлияние в паренхиму нервных волокон (Фиг. 1), что свидетельствует о повреждении волокон. При инъекции метанола без предварительного введения Аминофиллина на гистологических препаратах явно выраженных изменений в структуре зрительного нерва не выявлено (Фиг. 2).

Для морфологического исследования зрительный нерв выделяли на уровне ретробульбарного пространства. Полученные образцы фиксировали глутаровым альдегидом с последующей постфиксацией четырёхокисью осмия. После обезвоживания осуществляли заливку в смолу Эпон 812. Полутонкие срезы готовили на ультрамикротоме LKB-3 («LKB», Швеция) и окрашивали метиленовым синим. Оцифровку микропрепаратов проводили с помощью микроскопа Olympus BX51WI («Olympus Corp.», Япония) с камерой AxioCam MRm («Carl Zeiss Microscopy GmbH», Германия). Морфометрический анализ оцифрованных препаратов проводили в программе ImageJ. Было изучено количество миелиновых волокон в исследуемых препаратах, что отражает степень повреждения зрительного нерва и отличается в контрольной и исследуемых группах. Так, в контрольной группе (Фиг. 4) количество миелина наибольшее количество. В группе, где экспериментальным животным производилась инъекция метанола в ретробульбарное пространство без предварительного введения Аминофиллина (Фиг. 5) количество миелина снижено, однако в модели с использование Аминофиллина (Фиг. 6) отмечалось наибольшее снижение миелиновых волокон и разволокнение нервной ткани.

Таким образом, заявленная методика позволяет произвести атрофию зрительного нерва токсического генеза у лабораторных крыс с минимизацией инвазивных вмешательств, без необходимости специального оборудования и практических навыков для создания модели повреждения нервных волокон в зрительном нерве, дополнительно применение Аминофиллина позволяется ускорить процесс абсорбции и метаболизма метанола, что способствует сокращению времени для развития атрофии зрительного нерва у экспериментальных животных.

Способ создания токсической модели атрофии зрительного нерва, включающий введение инъекций метанола, отличающийся тем, что в течение 24 часов до введения метанола вводится предварительно внутрь крысам Аминофиллин в расчете на вес экспериментального животного в концентрации 10 мкг/кг 3 раза в день, последний прием Аминофиллина производился за 8 часов до инъекции раствора метанола, далее путем инъекции в ретробульбарное пространство крысы вводится 92% раствор метанола, разведенный 0,9% раствором натрия хлорида в пропорции 1:1, после инъекции метанола в течение последующих 24 часов внутрь вводится Аминофиллин в расчете на вес экспериментального животного в концентрации 10 мкг/кг 3 раза в день, причем первое введение осуществляется через 2 часа после инъекции.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии. Самцам мышей линии С57ВL/6 сначала воспроизводят хроническую нейрогенную боль.

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии. Способ включает моделирование внутримозгового кровоизлияния у крыс путём инъекции аутокрови 0,11 мл крови/100 г веса крысы в область внутренней капсулы правого полушария головного мозга.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной хирургии и фармакологии. В брыжейке позади общего желчного протока делают окно, через которое проводят латексный жгут.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в патологической анатомии и физиологии для проведения экспериментальных исследований на лабораторных животных. Устройство содержит вертикальную стойку и ограничивающую среду.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к токсикологии и экологии, и может быть использовано для моделирования хронической токсической коагулопатии у экспериментальных животных. Для этого ежедневно один раз в сутки в течение 60 дней вводят через зонд в желудок крысы раствор хлорида ртути в дозе 0,5 мг/кг в пересчете на металл.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для моделирования злокачественного ишемического инсульта в бассейне средней мозговой артерии. На шее экспериментального животного – кролика - выполняют срединный разрез.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для исследования функциональных показателей регионарного кровообращения. На проксимальный отдел хвоста экспериментального животного накладывают манжету хвостового сфигмоманометра.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для исследования функциональных показателей регионарного кровообращения. На проксимальный отдел хвоста экспериментального животного накладывают манжету хвостового сфигмоманометра.

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии и офтальмологии. Выполняют внутримышечное введение 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния 5-гидрокси-3-пиридинокарбоноата в дозе 25,5 мг/кг через 60 мин после моделирования эксайтотоксического повреждения сетчатки.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и ветеринарии. Крысам в течение 3-х дней ежедневно внутрибрюшинно вводят ципрофлоксацин в дозе 10 мг/кг непосредственно перед воздействием в течение 3 мин ультрафиолетовых лучей от ультрафиолетовой горелки ДРТ-240-1, встроенной в стеклянную камеру, не пропускающую ультрафиолетовые лучи.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к токсикологии и экологии, и может быть использовано для моделирования хронической токсической коагулопатии у экспериментальных животных. Для этого ежедневно один раз в сутки в течение 60 дней вводят через зонд в желудок крысы раствор хлорида ртути в дозе 0,5 мг/кг в пересчете на металл.
Наверх