Способ определения функциональных показателей регионарного кровообращения в эксперименте
Владельцы патента RU 2785488:
Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение "Федеральный Научно-Клинический Центр Реаниматологии и Реабилитологии" (ФНКЦ РР) (RU)
Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для исследования функциональных показателей регионарного кровообращения. На проксимальный отдел хвоста экспериментального животного накладывают манжету хвостового сфигмоманометра. Устанавливают датчик ЛДФ на поверхности хвоста животного дистально от уровня расположения манжеты. После регистрации базовой ЛДФ манжету надувают до давления 200-220 мм рт.ст. и удерживают раздутой в течение 3 минут. После сдувания манжеты проводят регистрацию ЛДФ в течение еще 6 минут. Таким образом были исследованы показатели средней величины перфузии, среднего квадратичного отклонения амплитуды колебаний кровотока, коэффициент вариации кровотока, максимальный кровоток после снятия окклюзии и время достижения максимального кровотока. Способ позволяет определить функциональные показатели регионарного кровообращения экспериментального животного в условиях сохраненного сознания, отсутствия инвазивности, а также максимально плотного контакта с исследуемыми слоями и безболезненности для животного за счет совокупности приемов заявленного изобретения. 3 ил., 1 табл.
Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной медицине, и может быть использовано для исследования функциональных показателей регионарного кровообращения, в частности для оценки резерва капиллярного кровотока, сосудистой реактивности и ряда других. Способ осуществляют путем определения показателей реактивной гиперемии в коже хвоста крысы с помощью неинвазивной окклюзионной пробы в сочетании с лазерной допплеровской флоуметрией (ЛДФ).
Использование в экспериментальных исследованиях на животных малоинвазивных функциональных проб позволяет, с одной стороны, более полно охарактеризовать работу сердечнососудистой системы при той или иной функциональной нагрузке, а с другой стороны, придерживаться биоэтического принципа минимизации болезненных процедур у животных и повысить клиническую релевантность исследования [Директива 2010/63/EU; Roustit M, Cracowski JL., 2012; Крупаткин А.И., Сидоров В.В., 2013].
Уровень техники
Известны примеры использования в научных исследованиях окклюзионной функциональной пробы в сочетании с ЛДФ и другими методами регистрации периферического кровотока (УЗИ, фотоплетизмография и др.) для оценки структурно-функциональных характеристик микроциркуляторного русла.
В частности известен ряд способов, предусматривающих проведение окклюзионной пробы с целью определения параметров регионарного кровообращения.
Известен способ проведения окклюзионной пробы с помощью раздувания пневматической манжеты на бедре крысы. При этом кровоток в мышце дистально от места окклюзии регистрируют с помощью ЛДФ (Souza-Silva E, Ascenso R, Tonussi CR, da Silva-Santos JE. Detection of blood flow perfusion and post occlusive reactive hyperemia in the skeletal muscle of rats. Life Sci. 2021 May 4:119571. doi: 10.1016/j.lfs.2021.119571. Epub ahead of print. PMID: 33961851). Недостатками и ограничительными характеристиками данной методики являются ее инвазивность, а также то, что методика применима только на наркотизированных крысах.
Известен также способ проведения окклюзионной пробы на задней конечности крысы с помощью раздувания пневматической манжеты, которую накладывают на бедро животного [Yuan X, Wu Q, Shang F, Li B, Liu M, Wang B, Sheng Y, Zhang H, Xiu R. A comparison of the cutaneous microvascular properties of the Spontaneously Hypertensive and the Wistar-Kyoto rats by Spectral analysis of Laser Doppler. Clin Exp Hypertens. 2019;41(4):342-352. doi: 10.1080/10641963.2018.1481424. Epub 2018 Jun 25. PMID: 29939761]. Кровоток регистрируют на подошвенной поверхности задней лапы животного с помощью ЛДФ. При этом оптический зонд для ЛДФ устанавливают на расстоянии около 1 мм от кожных покровов. Недостатками и ограничительными характеристиками данной методики является то, что методика применима только на наркотизированных крысах, а также то, что между анализируемыми покровами и используемом датчиком имеется расстояние 1 мм, которое влияет на стабильность и повторяемость получаемых результатов.
Перечисленные выше известные способы проведения окклюзионной пробы с одной стороны реализуются на наркотизированных крысах, с другой стороны, являются инвазивными методиками, что существенно ограничивает их применение в экспериментальной медицине.
Способов проведения окклюзионной пробы на крысах (экспериментальных животных), предусматривающих возможность наблюдения за крысой в активном состоянии в динамике, а также неинвазивность самой методики при плотном соприкосновении с исследуемыми поверхностями, в доступной авторам информационной базе данных не обнаружено.
Раскрытие сущности изобретения
Заявляемое изобретение направлено на решения задачи определения функциональных показателей регионарного кровообращения крысы (экспериментального животного), в условиях сохраненного сознания, отсутствия инвазивности, а также максимально плотного контакта с исследуемыми слоями и безболезненности для животного. Необходимым этапом решения указанной задачи является проведение окклюзионной функциональной пробы на крысах (экспериментальных животных).
Использование в экспериментальной практике заявляемого способа позволяет достичь нескольких технических (лечебных) и экономических результатов:
- возможность использовать как применительно к наркотизированному животному, так и к бодрствующему животному, а также возможность установить плотный контакт с анализируемыми поверхностями за счет использования фиксатора для иммобилизации лабораторного животного;
- возможность повторного использования экспериментальных животных.
Окклюзионную функциональную пробу в сочетании с ЛДФ используют в клинической функциональной диагностике и научных исследованиях для оценки резерва капиллярного кровотока, сосудистой реактивности и ряда других функциональных показателей регионарного кровообращения [Крупаткин А.И., 2013; Сагайдачный А.А., 2018]. В основе этого теста лежит анализ выраженности и длительности реактивной гиперемии в коже конечности после снятия временной (в течение 1-3 минут) окклюзии кровотока в ней.
Таким образом, экспериментальные возможности предлагаемой методики удовлетворяют требованиям регламентирующих документов о гуманном отношении к животным, а также позволяют использовать заявляемый способ в различных экспериментах (с и без использования наркоза, в динамике и одномоментно и т.д.), что обеспечивает сопоставимость получаемых результатов и возможность сравнения различных экспериментальных групп с общими анализируемыми параметрами.
Краткое описание иллюстраций.
На Фиг. 1 представлен общий вид эксперимента, проводимого с участием наркотизированной крысы.
Обозначения:
1 - монитор отражения измеряемых показателей;
2 - оптический зонд ЛДФ (ООО НПП «ЛАЗМА», Россия);
3 - манометр;
4 - манжета хвостового сфигмоманометра;
5 - подогреваемая платформа;
6 - термодатчик.
На Фиг. 2 представлен общий вид эксперимента, проводимого с участием крысы в условиях сохраненного сознания.
Обозначения:
7 - фиксатор для иммобилизации лабораторного животного (рестрейнер);
2 - оптический зонд ЛДФ (ООО НПП «ЛАЗМА», Россия);
3 - манометр;
4 - манжета хвостового сфигмоманометра.
На Фиг. 3 представлен пример ЛДФ-граммы с окклюзионной пробой.
Обозначения:
8 - значение кровотока в исходном состоянии
9 - резкое снижение перфузии во время раздувания манжеты до 200-220 мм рт.ст. в течение 3 минут
10 - динамика кровотока после снятия окклюзии (реактивная гиперемия).
Описание процедуры эксперимента.
При выполнении эксперимента с участием наркотизированного лабораторного животного его фиксируют в положении на спине на подогреваемой платформе.
При выполнении эксперимента с участием лабораторного животного в условиях сохраненного сознания для его иммобилизации используют фиксатор (рестрейнер).
На проксимальный отдел хвоста экспериментального животного накладывают манжету хвостового сфигмоманометра - комплектующая деталь прибора для неинвазивного измерения артериального давления у грызунов «Систола» (ООО «Нейроботикс», Россия). Датчик прибора ЛАЗМА МЦ-3 (ООО НПП «ЛАЗМА», Россия) устанавливают на поверхности хвоста животного дистально от уровня расположения манжеты (граница проксимальной и средней трети хвоста). После регистрации базовой ЛДФ, манжету надувают до давления 200-220 мм рт.ст. и удерживают раздутой в течение 3 минут. После сдувания манжеты проводят регистрацию ЛДФ в течение еще 6 минут.
На Фиг. 3 приведен пример записи ЛДФ-граммы во время выполнения окклюзионной пробы. Отражены значения кровотока в исходном состоянии, резкое снижение перфузии во время раздувания манжеты до 200-220 мм рт.ст. в течение 3 минут и динамика кровотока после снятия окклюзии (реактивная гиперемия). Установлены: резерв капиллярного кровотока (Mmax/М %), продолжительность достижения максимального кровотока после снятия окклюзии (Tmax, с).
В ходе проведенных авторами исследований были получены и проанализированы следующие показатели: средняя величина перфузии (М, пф. ед.); среднее квадратичное отклонение амплитуды колебаний кровотока (σ, пф. ед.); коэффициент вариации перфузии (Kv, %). Методом лазерной флуоресцентной диагностики были исследованы уровень флуоресценции коферментов НАД-Н и ФАД в том же участке кожи.
Авторами были проведены эксперименты с различными наркотизирующими средствами. В группе I (n=13) проводили комбинированную анестезию тилетамин/золазепамом («Золетил 100», Virbac, Франция) из расчета 20 мг/кг + ксилазин («Ксиланит», ООО «НИТА-ФАРМ», Россия) 5 мг/кг внутримышечно. В группе II (n=10) осуществляли анестезию хлоралгидратом (Panreac, Испания) из расчета 300 мг/кг внутрибрюшинно. Группе III (n=4) измерение параметров проводили у бодрствующих крыс с использованием иммобилизирующего фиксатора.
В обеих группах животных введение анестетиков вызывало анестезию, достаточную для осуществления небольшого хирургического вмешательства с отсутствием произвольных движений и угнетением болевых рефлексов (отрицательный «пинч-тест»). При этом показатели, определяемые у животных группы III в ходе эксперимента были повторяемы в серии измерений и имели ряд достоверных отличий от групп I и II. Основные результаты исследования приведены в Таблице 1.
Таким образом, в результате проведения эксперимента была обоснованно доказана сопоставимость внутри группы анализируемых параметров, а также была получена разница по ряду показателей между группами, различающимися по средству для наркоза, что убедительно доказало повторяемость и стабильность заявляемого способа, включающего проведение окклюзионной пробы на хвосте крысы в соответствии с предлагаемой методикой.
Способ определения функциональных показателей регионарного кровообращения в эксперименте, включающий проведение окклюзионной функциональной пробы в сочетании с лазерной допплеровской флоуметрией (ЛДФ), отличающийся тем, что определяют такие показатели, как средняя величина перфузии, среднее квадратичное отклонение амплитуды колебаний кровотока, коэффициент вариации кровотока, максимальный кровоток после снятия окклюзии и время достижения максимального кровотока, для этого на проксимальный отдел хвоста иммобилизованного экспериментального животного накладывают манжету хвостового сфигмоманометра, на вентральной поверхности хвоста животного дистально от уровня расположения манжеты устанавливают датчик прибора ЛДФ, после регистрации базовой ЛДФ манжету надувают до давления 200-220 мм рт.ст. и удерживают раздутой в течение 3 минут, после сдувания манжеты проводят повторную регистрацию ЛДФ в течение 6 минут.
