Связывающая dpp3 молекула, направленная на специфические эпитопы dpp3 и связывающаяся с ними, и ее применение для профилактики или лечения заболеваний/острых состояний, которые связаны с окислительным стрессом

Изобретение относится к области биохимии, в частности к связывающей дипептидилпептидазу-3 (DPP3) молекуле. Указанная связывающая DPP3 молекула демонстрирует аффинность с DPP3 таким образом, что константа аффинности составляет по меньшей мере 10^-7 M^-1, и при этом указанная связывающая DPP3 молекула блокирует биоактивность DPP3 по меньшей мере на 10%. Изобретение эффективно для профилактики или лечения заболеваний или острых состояний у пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом. 10 з.п. ф-лы, 6 ил., 7 табл., 3 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

В первом главном аспекте изобретения предметом изобретения является связывающая молекула, направленная на белок дипептидилпептидазу-3 (DPP3) или его функциональные производные и связывающаяся с ними.

В другом варианте осуществления первого главного аспекта изобретения представлена вышеупомянутая связывающая молекула для применения с целью профилактики или лечения заболеваний или острых состояний у пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом.

В другом варианте осуществления первого главного аспекта изобретения представлена вышеупомянутая связывающая молекула для применения с целью профилактики или лечения заболеваний или острых состояний у пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом, и при этом указанные заболевания выбирают из группы, включающей нейродегенеративные заболевания, метаболический синдром, сердечно-сосудистые заболевания, аутоиммунные заболевания, воспалительные болезни легких, болезни почек, болезни печени, болезни органов пищеварения, вирусные инфекционные заболевания, рак, воспаление, сепсис, септический шок и SIRS.

Во втором главном аспекте настоящего изобретения представлена связывающая молекула, которая направлена на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывается с ним, и при этом указанная связывающая молекула распознает и связывается по меньшей мере с тремя аминокислотами SEQ ID NO.: 2, и при этом эпитоп содержится в DPP3, который показан в SEQ ID NO.: 1.

Приведенный ниже текст относится к приведенному выше второму главному аспекту изобретения:

Дополнительным предметом изобретения является вышеупомянутая связывающая молекула, направленная на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывающаяся с ним, при этом указанная связывающая молекула направлена на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 3 и связывается с ним, и при этом указанная связывающая молекула распознает и связывается по меньшей мере с тремя аминокислотами SEQ ID NO.: 3, и при этом эпитоп содержится в DPP3, который показан в SEQ ID NO.: 1.

Дополнительным предметом изобретения является вышеупомянутая связывающая молекула, направленная на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывающаяся с ним, при этом указанная связывающая молекула направлена на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 4 и связывается с ним, и при этом указанная связывающая DPP3 молекула распознает и связывается по меньшей мере с тремя аминокислотами SEQ ID NO.: 4, и при этом эпитоп содержится в DPP3, который показан в SEQ ID NO.: 1.

Дополнительным предметом изобретения является вышеупомянутая связывающая молекула, направленная на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывающаяся с ним, при этом указанную связывающую молекулу выбирают из группы, включающей антитело или фрагмент антитела или не-Ig скаффолд, и при этом эпитоп содержится в DPP3, который показан в SEQ ID NO.: 1.

В третьем главном аспекте изобретения упомянутой выше связывающей молекулой согласно второму главному аспекту изобретения, которая направлена на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывается с ним, является связывающая дипептидилпептидазу-3 (DPP3) молекула, направленная на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывающаяся с ним, при этом указанный эпитоп содержится в белке DPP3 или его функциональных производных, и при этом указанная связывающая DPP3 молекула распознает и связывается по меньшей мере с тремя аминокислотами SEQ ID NO.: 2.

Дополнительным предметом изобретения является вышеупомянутая связывающая молекула согласно третьему аспекту изобретения, направленная на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывающаяся с ним, при этом указанной связывающей молекулой является моноклональное антитело или фрагмент моноклонального антитела, и при этом определяющие комплементарность области (CDR) в тяжелой цепи содержат последовательности:

SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 8 и/или SEQ ID NO.: 9,

а определяющие комплементарность области в легкой цепи содержат последовательности:

SEQ ID NO.: 10, KVS и/или SEQ ID NO.: 11.

Дополнительным предметом изобретения является вышеупомянутая связывающая молекула согласно третьему аспекту изобретения, направленная на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывающаяся с ним, при этом указанной связывающей молекулой является гуманизированное моноклональное антитело или фрагмент гуманизированного моноклонального антитела, при этом тяжелая цепь содержит последовательность:

SEQ ID NO.: 12

и при этом легкая цепь содержит последовательность:

SEQ ID NO.: 13.

Дополнительным предметом изобретения является любая вышеупомянутая связывающая молекула, направленная на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывающаяся с ним, для применения с целью профилактики или лечения заболеваний или острых состояний у пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом, и при этом эпитоп содержится в DPP3, который показан в SEQ ID NO.: 1.

Конкретным предметом настоящего изобретения является связывающая молекула, конкретно связывающая дипептидилпептидазу-3 (далее DPP3) молекула, направленная на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывающаяся с ним, при этом указанный эпитоп содержится в белке DPP3 или его функциональных производных, и при этом указанная связывающая DPP3 молекула распознает и связывается по меньшей мере с тремя аминокислотами (aa), предпочтительно по меньшей мере с 4 aa SEQ ID NO.: 2.

Дополнительным предметом настоящего изобретения является связывающая молекула, конкретно связывающая DPP3 молекула, направленная на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывающаяся с ним, при этом указанный эпитоп содержится в белке DPP3 или его функциональных производных, и при этом указанная связывающая DPP3 молекула распознает и связывается по меньшей мере с тремя аминокислотами (aa), предпочтительно по меньшей мере с 4 aa SEQ ID NO.: 2, для применения с целью профилактики или лечения заболеваний или острых состояний пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом.

Также, предметом настоящего изобретения является связывающая молекула, конкретно антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3, связывающиеся с эпитопом согласно SEQ ID NO.: 2, при этом указанный эпитоп содержится в белке DPP3 или его функциональных производных, или не-Ig скаффолд против DPP3, связывающийся с эпитопом согласно SEQ ID NO.: 2, при этом указанный эпитоп содержится в белке DPP3 или его функциональных производных, и при этом указанное антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3 или не-Ig скаффолд против DPP3 распознает и связывается по меньшей мере с тремя аминокислотами (aa), предпочтительно по меньшей мере с 4 aa SEQ ID NO.: 2.

С учетом приведенного выше контекста предметом настоящего изобретения также является связывающая молекула согласно изобретению, конкретно антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3, связывающиеся с эпитопом согласно SEQ ID NO.: 2, при этом указанный эпитоп содержится в белке DPP3 или его функциональных производных, или не-Ig скаффолд против DPP3, связывающийся с эпитопом согласно SEQ ID NO.: 2, при этом указанный эпитоп содержится в белке DPP3 или его функциональных производных, и при этом указанное антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3 или не-Ig скаффолд против DPP3 распознает и связывается по меньшей мере с тремя аминокислотами (aa), предпочтительно по меньшей мере с 4 aa SEQ ID NO.: 2, для применения с целью профилактики или лечения заболеваний или острых состояний пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом.

Дополнительным предметом настоящего изобретения является способ профилактики или лечения заболеваний или острых состояний пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом, отличающийся тем, что указанному пациенту в фармацевтически эффективных количествах вводят связывающую молекулу, направленную на DPP3 и связывающуюся с ним, или связывающую молекулу, направленную на SEQ ID.: 2 в качестве эпитопа, который содержится в белке DPP3 или его функциональных производных, и связывающуюся с ним, или антитело против DPP3, или фрагмент антитела против DPP3, связывающиеся с DPP3, или не-Ig скаффолд против DPP3, направленный на SEQ ID.: 2 в качестве эпитопа, который содержится в белке DPP3 или его функциональных производных, и связывающийся с ним.

Предметом настоящего изобретения кроме того является фармацевтическая композиция, содержащая связывающую молекулу, направленную на DPP3 и связывающуюся с ним, или связывающую молекулу, направленную на SEQ ID.: 2 в качестве эпитопа, который содержится в белке DPP3 или его функциональных производных, и связывающуюся с ним, или антитело против DPP3, или фрагмент антитела против DPP3, связывающиеся с DPP3, или не-Ig скаффолд против DPP3, направленный на SEQ ID.: 2 в качестве эпитопа, который содержится в белке DPP3 или его функциональных производных, и связывающийся с ним, для применения с целью профилактики или лечения заболеваний или острых состояний пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом.

Еще одним предметом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая связывающую молекулу согласно изобретению или связывающую DPP3 молекулу согласно изобретению, конкретно антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3, связывающиеся с DPP3, или не-Ig скаффолд против DPP3, связывающийся с DPP3, для применения с целью профилактики или лечения заболеваний или острых состояний пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом, как описано выше, и при этом указанная фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное лекарственное вещество, которое можно использовать, например, в качестве основного лекарственного препарата в способах лечения заболевания или острого состояния, и при этом указанное лечение в качестве побочного эффекта вызывает окислительный стресс, и, таким образом, указанная связывающая молекула или связывающая DPP3 молекула, антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3, связывающиеся с DPP3, или не-Ig скаффолд против DPP3, связывающийся с DPP3, могут выступать в качестве дополнительного лекарственного препарата, который снижает или регулирует указанный вызванный окислительный стресс.

Дополнительным вариантом осуществления изобретения является набор, содержащий связывающую молекулу или связывающую DPP3 молекулу согласно изобретению, конкретно антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3, связывающиеся с DPP3, или не-Ig скаффолд против DPP3, связывающийся с DPP3, для применения с целью профилактики или лечения заболеваний или острых состояний пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом, как описано выше, и при этом указанная фармацевтическая композиция необязательно содержит по меньшей мере одно дополнительное фармацевтически активное лекарственное вещество, которое можно использовать, например, в качестве основного лекарственного препарата в способах лечения заболевания или острого состояния, и при этом указанное лечение в качестве побочного эффекта вызывает окислительный стресс, и, таким образом, указанная связывающая DPP3 молекула, антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3, связывающиеся с DPP3, или не-Ig скаффолд против DPP3, связывающийся с DPP3, могут выступать в качестве дополнительного лекарственного препарата, который снижает или регулирует указанный вызванный окислительный стресс.

Модулирующие антитело, фрагмент, скаффолд против DPP3

Кроме того, предметом настоящего изобретения является связывающая молекула согласно изобретению, или антитело против DPP3, или фрагмент антитела против DPP3, связывающиеся с DPP3, или не-Ig скаффолд против DPP3, связывающийся с DPP3, как описано выше, для применения в качестве лекарственного препарата, при этом указанная связывающая молекула, или антитело, или указанный фрагмент антитела, или указанный не-Ig скаффолд представляет собой модулирующую связывающую молекулу, антитело или фрагмент или скаффолд.

В предпочтительном варианте осуществления указанное модулирующее антитело против DPP3 или фрагмент модулирующего антитела против DPP3 или модулирующий не-Ig скаффолд используют для профилактики или лечения заболеваний или острого состояния у пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом.

Кроме того, согласно изобретению указанное модулирующее антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3 или модулирующий не-Ig скаффолд согласно изобретению регулирует биоактивность DPP3.

В контексте изобретения биоактивность DPP3 можно определить как ферментативную активность DPP3 или регулирующую активность DPP3 на пути окислительного стресса.

Согласно изобретению указанное модулирующее антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3 или модулирующий не-Ig скаффолд согласно изобретению может усиливать биоактивность DPP3.

В другом варианте осуществления изобретения указанное модулирующее антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3 или модулирующий не-Ig скаффолд согласно изобретению может уменьшать биоактивность DPP3.

В другом конкретном варианте осуществления в контексте настоящего изобретения «модулирующее» антитело против DPP3 или фрагмент модулирующего антитела против DPP3 или модулирующий не-Ig скаффолд, как описано выше, представляет собой антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3 или модулирующий не-Ig скаффолд против DPP3, который блокирует биоактивность DPP3 по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно > 50%, наиболее предпочтительно на 100%.

В конкретном варианте осуществления модулирующая связывающая молекула или модулирующее антитело против DPP3 или фрагмент модулирующего антитела против DPP3 или модулирующий не-Ig скаффолд против DPP3 согласно настоящему изобретению используют для профилактики или лечения заболеваний или острого состояния пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом.

Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является набор или анализ, содержащий описанную выше связывающую молекулу или антитело против DDP3 и/или фрагмент антитела против DPP3, связывающиеся с DPP3, или не-Ig скаффолд против DPP3, связывающийся с DPP3, для применения с целью профилактики или лечения заболевания или острого состояния пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом.

Предшествующий уровень техники

Дипептидилпептидаза-3 (DPP3)

Дипептидилпептидаза-3 - также известная, как дипептидиламинопептидаза III, дипептидилариламидаза III, дипептидилпептидаза III, энкефалиназа B или ангиотензиназа эритроцитов; краткое название: DPP3 или DPPIII - представляет собой металлопептидазу, которая удаляет дипептиды из физиологически активных пептидов, таких как энкефалины и ангиотензины. Далее выражение «DPP3» будет использоваться по всему тексту в качестве сокращенной формы описанной выше дипептидилпептидазы-3.

Сперва идентифицировали DPP3, и его активность измерили в экстрактах из очищенной бычьей передней доли гипофиза Ellis & Nuenke, 1967. Фермент, который приведен как EC 3.4.14.4, имеет молекулярную массу приблизительно 83 кДа и является очень консервативным у прокариот и эукариот (Prajapati & Chauhan, 2011).

Аминокислотная последовательность человеческого варианта DPP3 представлена в SEQ ID NO.: 1. DPP3 представляет собой в основном цитозольную пептидазу, которая экспрессируется повсеместно. Несмотря на отсутствие сигнальной последовательности в нескольких исследованиях сообщалось о мембранной активности (Lee & Snyder, 1982).

DPP3 представляет собой цинкозависимую экзопептидазу, относящуюся к семейству M49 пептидаз. Он имеет широкую субстратную специфичность к олигопептидам из трех или четырех до десяти аминокислот разных составов, а также способен расщепляться после пролина. Известно, что DPP3 гидролизирует дипептиды с N-конца их субстратов, включая ангиотензин II, III и IV; ангиотензин 1-7 (Cruz-Diaz et al. 2016); Leu- и Met-энкефалин; эндоморфин 1 и 2. Металлопептидаза DPP3 имеет оптимальное значение своей активности при pH 8,0-9,0, и ее можно активировать путем добавления ионов двухвалентных металлов, таких как Co²⁺ и Mg²⁺. Структурный анализ DPP3 выявил каталитические мотивы HELLGH (hDPP3 450-455) и EECRAE (hDPP3 507-512), а также следующие аминокислоты, которые важны для связывания и гидролиза субстрата: Glu 316, Tyr 318, Asp 366, Asn 391, Asn 394, His 568, Arg 572, Arg 577, Lys 666 и Arg 669 (Prajapati & Chauhan, 2011; Kumar et al. 2016; нумерация относится к последовательности DPP3 человека, см. SEQ ID NO.: 1). Учитывая все известные аминокислоты или области последовательности, которые участвуют в связывании и гидролизе субстрата, активный участок DPP3 человека можно определить как область между аминокислотами 316 и 669.

Последние исследования DPP3 показывают его роль в качестве части метаболизма белка, но также его участие в регулировании кровяного давления, регулировании обезболивания, воспалительных процессов и окислительного стресса (Prajapati & Chauhan, 2011).

Также в нескольких публикациях было показано, что DPP3 представляет собой перспективный биомаркер. Было показано, что активность DPP3 повышается в гомогенатах опухолей яичников и эндометрия. Активность DPP3 еще увеличивается в зависимости от тяжести/злокачественности указанных опухолей (Šimaga et al. 1998 и 2003). Иммунный гистологический анализ и анализ western blot клеточных линий глиобластомы также выявили повышенные уровни DPP3 (Singh et al. 2014).

Также DPP3 был предложен в качестве потенциального маркера артериального риска (US 2011008805) и в качестве маркера ревматоидного артрита (US 2006177886). В заявке на получение патента WO 2005/106486 описаны экспрессия и активность DPP3 в качестве диагностического маркера и DPP3 в качестве терапевтической мишени во всех типах заболеваний вследствие повсеместной экспрессии DPP3 в клетке или на ее поверхности. В EP 1498480 упоминается потенциальное диагностическое и терапевтическое применение гидролитических ферментов, включая DPP3.

Соответствующий предшествующий уровень техники можно дальше кратко изложить следующим образом:

В WO 2005/106486 в общем описан способ скрининга терапевтических средств, который может быть полезным при лечении заболеваний, включая сердечно-сосудистые заболевания, инфекции, респираторные заболевания, рак, эндокринные заболевания, заболевания обмена веществ, гастроэнтерологические заболевания, воспаление, гематологические заболевания, заболевания опорно-двигательного аппарата, неврологические и урологические заболевания. В указанном способе скрининга тестируемое соединение вводят в контакт с полинуклеотидом DPP3, и обнаруживают связывание между указанным тестируемым соединением и указанным полинуклеотидом DPP3. Кроме того, в документе в общем описаны соединения, которые могут связываться и/или активировать или ингибировать активность DPP3. Кроме того, в изобретении описаны фармацевтические композиции, которые содержат такие соединения.

В Liu et al. 2007 описана взаимосвязь между активацией антиоксидант-ответственного элемента (ARE) и сверхэкспрессией DPP3 и Sequestome 1 в клетках IMR-32. Сверхэкспрессия DPP3 и Sequestome 1 стимулировала транслокацию Nrf2 и приводила к повышенным уровням NAD(P)H:хинон оксиредуктазы 1, белка, который транскрипционно регулируется ARE.

Hast et al. 2013 описывают сравнение спектра взаимодействующих с KEAP1 белков с геномным профилем 178 плоскоклеточных карцином легких с характеристикой в Атласе Ракового Генома и раскрывают амплификацию и сверхэкспрессию иРНК гена DPP3 в опухолях с высокой активностью Nrf2, но с отсутствием стабилизирующих Nrf2 мутаций. Они дополнительно описывают, что происходящие в опухоли мутации в KEAP1 являются гипоморфными применительно к ингибированию Nrf2, и что сверхэкспрессия DPP3 в присутствии этих мутаций дополнительно способствует активации Nrf2.

Сверхэкспрессия DPP3

Таким образом, согласно предшествующему уровню техники известно, что сверхэкспрессия внутриклеточного DPP3 тесно связана с регулированием окислительного стресса. DPP3 идентифицирован, как активатор антиоксидант-ответственного элемента (ARE) при объективном скрининге библиотеки кДНК, состоящей из приблизительно 15000 полноразмерных экспрессирующихся у человека кДНК (Liu et al. 2007).

DPP3 разрушают комплекс KEAP1-Nrf2 за счет конкуренции с Nrf2 относительно участка связывания KEAP1 (Hast et al. 2013). Это разрушение предотвращает распад NRF2, а впоследствии приводит к транслокализации Nrf2 в ядро и активации ARE. Сверхэкспрессия DPP3 в клетках нейробластомы (Liu et al. 2007), в клетках HEK293T (Hast et al. 2013) или в клетках рака молочной железы MCF7 (Lu et al. 2017) активирует опосредованную Nrf2 транскрипцию. Активные и неактивные варианты DPP3 сверхэкспрессировались в клетках MCF7 и показали одинаковое регуляторное влияние на окислительный стресс (Lu et al. 2017). Hast et al. (2013) также показали эффект потери функции: сайленсинг DPP3 с использованием специфической опосредованной Nrf2 транскрипции siRNA снизился до уровней сайленсинга Nrf2.

Хотя DPP3 известен, как внутриклеточный белок, активность DPP3 также была обнаружена в некоторых текучих средах организма: ретроплацентарной сыворотке (Shimamori et al. 1986), семенной плазме (Vanha-Perttula et al. 1988) и CSF (Aoyagi et al. 1993). В CSF имелись повышенные уровни активности DPP3, измеренные у пациентов, страдающих от болезни Альцгеймера (AD, Aoyagi et al. 1993).

Известно, что DPP3 экспрессируется в виде мембранного, внутриклеточного или находящегося в кровотоке DPP3.

DPP3 был предложен не только в качестве потенциального биомаркера, но также в качестве потенциальной терапевтической мишени вследствие его способности расщеплять некоторые биоактивные пептиды. Вирус гриппа A изменяет уровни DPP3 хозяина для собственной репликации (исследования на клеточных культурах, Meliopoulos et al. 2012). Вообще ферменты разложения энкефалина и/или ангиотензина, включая DPP3, обладают терапевтическим потенциалом в качестве мишеней для лечения боли, сердечно-сосудистых заболеваний (CVD) и рака и соответствующих ингибиторов в качестве потенциальных методов лечения боли, психических заболеваний и CVD (Khaket et al. 2012, Patel et al. 1993, Igic et al. 2007).

Ингибирование DPP3

Активность DPP3 можно неспецифически ингибировать с помощью разных общих ингибиторов протеаз (например, PMSF, TPCK), сульфидрильных реагентов (например, pHMB, DTNB) и металлохелаторов (EDTA, o-фенантролин) (Abramić et al. 2000, EP 2949332).

Активность DPP3 кроме того можно специфически ингибировать с помощью соединений разных типов: эндогенный ингибитор DPP3 представляет собой пептид спинорфин. Было получено несколько синтетических производных спинорфина, например, тинорфин, которые в разной степени продемонстрировали ингибирование активности DPP3 (Yamamoto et al. 2000). Другими опубликованными пептидными ингибиторами DPP3 являются пропиоксатин А и B (US 4804676) и аналоги пропиоксатина (Inaoka et al. 1988).

DPP3 также можно ингибировать посредством небольших молекул, таких как флуостатины и производные бензимидазола. Флуостатины A и B представляют собой антибиотики, продуцируемые видом Streptomyces TA-3391, которые являются нетоксичными и сильно ингибируют активность DPP3. На данный момент было синтезировано и опубликовано 20 разных производных бензимидазола (Agić et al. 2007; Rastija et al. 2015), из которых два соединения 1' и 4' демонстрируют наиболее сильный ингибирующий эффект (Agić et al. 2007). Было показано, что некоторые дипептидилгидроксамовые кислоты также ингибируют активность DPP3 (Cvitešić et al. 2016).

Окислительный стресс

Окислительный стресс отражает дисбаланс между системным проявлением активных форм кислорода (далее ROS)/активных форм азота (далее RNS) и антиоксидантов в пользу избыточного образования свободных радикалов. Это процесс ведет к окислению биомолекул с последующей потерей их биологических функций и/или гомеостатическими дисбалансами, проявлением которых является возможное окислительное повреждение клеток и тканей. Накопление ROS/RNS может приводить к ряду вредных действий, таких как перикисное окисление липидов, окисление белков и повреждение ДНК (включая повреждение оснований и разрывы нитей). Кроме того, некоторые активные окислительные формы выступают в качестве клеточных посредников при передаче сигналов окисления-восстановления. Таким образом, окислительный стресс может вызывать разрушения нормальных механизмов клеточной передачи сигналов.

«ROS» и «RNS» представляют собой термины, совместно описывающие свободные радикалы и другие нерадикальные активные производные, которые также называются оксиданты. Радикалы являются менее устойчивыми, чем нерадикальные формы, хотя их активность обычно является более сильной. Молекула с одним или более непарными электронами в ее наружной оболочке называется свободным радикалом. Свободные радикалы образуются из молекул за счет разрыва химической связи таким образом, чтобы каждый фрагмент содержал один электрон, за счет расщепления радикала с образованием еще одного радикала, а также посредством окислительно-восстановительных реакций. Свободные радикалы, относящиеся к окислительному стрессу, включают гидроксил (OH•), супероксид (O₂•ˉ), оксид азота (NO•), диоксид азота (NO₂•), пероксил (ROO•) и липидный пероксил (LOO•). Также, пероксид водорода (H₂O₂), озон (O₃), синглетный кислород (¹O₂), гипохлористая кислота (HOCl), азотистая кислота (HNO₂), пероксинитрит (ONOOˉ), азотистый ангидрид (N₂O₃), липидный пероксид (LOOH) не являются свободными радикалами и обычно называются оксиданты, но могут легко приводить к реакциям свободно-радикального присоединения в живых организмах.

Образование ROS и RNS может происходить в клетках двумя путями: посредством ферментативных и не ферментативных реакций. Ферментативные реакции, генерирующие свободные радикалы, включают реакции, вовлеченные в дыхательную цепь, фагоцитоз, синтез простагландинов и систему цитохрома P450. Свободные радикалы можно получать в результате не ферментативных реакций кислорода с органическими соединениями, а также реакций, инициируемых ионизирующей радиацией. Не ферментативный процесс также может происходить во время окислительного фосфорилирования (то есть аэробного дыхания) в митохондриях. Для обзора см. Pham-Huy et al. 2008. Int J Biomed Sci 4 (2): 89-96.

Заболевания, связанные с окислительным стрессом

С учетом указанного выше и в контексте настоящего изобретения окислительный стресс связан с рядом заболеваний, включая, но без ограничения нейродегенеративные заболевания, метаболический синдром, сердечно-сосудистые заболевания, аутоиммунные заболевания, воспалительные болезни легких, болезни почек, болезни печени, болезни органов пищеварения, вирусные инфекционные заболевания, рак и воспаление, и, таким образом, связан с ними.

Согласно предшествующему уровню техники известно, что внутриклеточный DPP3 тесно связан с регулированием окислительного стресса. DPP3 идентифицирован, как активатор антиоксидант-ответственного элемента (ARE) при объективном скрининге библиотеки кДНК, состоящей из приблизительно 15000 полноразмерных экспрессирующихся у человека кДНК (Liu et al. 2007; см. Также выше). ARE регулирует экспрессию ряда цитопротекторных антиоксидантных ферментов и скэвенджеров, вносящих вклад в эндогенную защиту от окислительного стресса. Это антиоксидантное действие DPP3 обусловлено вмешательством DPP3 с путем передачи сигнала KEAP1-Nrf2. Nrf2 представляет собой фактор транскрипции, который регулирует базальную и индуцированную экспрессию множества зависимых от антиоксидант-ответственного элемента генов для регулирования физиологических и патофизиологических результатов воздействия оксиданта. В нормальных условиях или условиях без стресса Nrf2 связывается с Kelch-подобным-ECH-ассоциированным протеином 1 (KEAP1) посредством своего ETGE и своего DLG мотива. Внутри этого кластера белков Nrf2 содержится в цитоплазме, быстро убиквитинируется и расщепляется протеасомой. При окислительном стрессе Nrf2 не расщепляется, но вместо этого транслоцируется в ядро, где он связывается с промотором ДНК и вызывает экспрессию множества зависимых от антиоксидант-ответственного элемента (ARE) генов. Множество химических средств, включая фитохимические средства и производные (CDDO, сульфорафан), терапевтические средства (олтипраз, ауранофин), средств воздействия на окружающую среду (паракват, арсеник) и эндогенные химические средства [NO, 15d-PGJ2, нитро жирные кислоты и 4-гидроксиноненал (4-HNE)], индуцируют гены ARE через Nrf2 (Ma 2013).

Краткое описание изобретения

С учетом указанного выше авторы изобретения неожиданно и с удивлением обнаружили, что окислительный стресс также можно снижать или регулировать с помощью связывающей молекулы, направленной на белок DPP3 или его функциональные производные и связывающейся с ними.

Авторы изобретения также обнаружили, что окислительный стресс также можно снижать или регулировать с помощью связывающей молекулы, направленной на эпитоп SEQ ID NO.: 2 и связывающейся с ним, при этом эпитоп содержится в белке DPP3.

Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили связывающую дипептидилпептидазу-3 (далее DPP3) молекулу, направленную на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывающуюся с ним, при этом указанный эпитоп содержится в белке DPP3 или его функциональных производных, и при этом указанная связывающая DPP3 молекула распознает и связывается по меньшей мере с тремя аминокислотами (aa), предпочтительно по меньшей мере с 4 aa SEQ ID NO.: 2.

В приведенном выше контексте авторы изобретения конкретно обнаружили, что окислительный стресс можно уменьшать или регулировать с помощью антитела против DPP3 или фрагмента антитела против DPP3, направленного на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывающегося с ним, при этом указанный эпитоп содержится в белке DPP3 или его функциональных производных, и при этом указанная связывающая DPP3 молекула распознает и связывается по меньшей мере с тремя аминокислотами (aa), предпочтительно по меньшей мере с 4 aa SEQ ID NO.: 2, или не-Ig скаффолд против DPP3 направлен на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывается с ним, при этом указанный эпитоп содержится в белке DPP3 или его функциональных производных, и при этом указанная связывающая DPP3 молекула распознает и связывается по меньшей мере с тремя аминокислотами (aa), предпочтительно по меньшей мере с 4 aa SEQ ID NO.: 2.

Таким образом, в настоящем изобретении представлены раскрытая в данном документе связывающая молекула и антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3, связывающиеся с DPP3, или не-Ig скаффолд против DPP3, связывающийся с DPP3, для применения в способах профилактического лечения или лечения заболеваний или острых состояний пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом.

Кроме того, с представленными в данном документе связывающей молекулой, связывающей DPP3 молекулой, а конкретно с антителом против DPP3 или фрагментом антитела против DPP3, связывающимся с DPP3, или не-Ig скаффолдом против DPP3, связывающимся с DPP3, авторы изобретения обнаружили связывающую DPP3 молекулу, которая быстро уменьшает или регулирует окислительный стресс в клетках млекопитающих при определении с помощью способов измерений соответствующих биомаркеров, как дополнительно изложено ниже.

Еще одним предметом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая связывающую молекулу согласно изобретению, связывающую DPP3 молекулу согласно изобретению, а конкретно содержащая антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3, связывающиеся с DPP3, или не-Ig скаффолд против DPP3, связывающийся с DPP3, согласно изобретению для применения в способах профилактики или лечения заболеваний или острых состояний пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом.

Следовательно, раскрытые в данном документе фармацевтические композиции также предназначены для применения с целью профилактики или лечения симптомов или синдромов или проблем, связанных с патологическими и острыми состояниями и заболеваниями, которые опосредует окислительный стресс.

Заболевания, связанные с окислительным стрессом

Как упоминалось выше, возникновение окислительного стресса связано с рядом заболеваний или расстройств, которые согласно изобретению включают:

нейродегенеративные заболевания, при этом указанные нейродегенеративные заболевания можно выбрать из группы, включающей болезнь Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона (PD), болезнь Хантингтона (HD), боковой амиотрофический склероз (ALS) и рассеянный склероз (MS)),

метаболический синдром, при этом указанный метаболический синдром можно выбрать из группы, включающей инсулинорезистентность, ожирение, гипергликемию, дислипидемию, гипертонию и диабет,

сердечно-сосудистые заболевания, при этом указанные сердечно-сосудистые заболевания можно выбрать из группы, включающей атеросклероз, гипертонию, сердечную недостаточность, ишемическую болезнь сердца, церебральное ишемическое поражение, инсульт и инфаркт миокарда,

аутоиммунные заболевания, при этом указанные аутоиммунные заболевания можно выбрать из группы, включающей ревматоидный артрит, системную красную волчанку,

воспалительные болезни легких, при этом указанные воспалительные болезни легких можно выбрать из группы, включающей COPD, астму,

болезни почек, при этом указанные болезни почек можно выбрать из группы, включающей нефротоксичность (лекарственную болезнь почек), острое поражение почек (AKI), хроническое заболевание почек (CKD), диабетическую нефропатию, терминальную почечную недостаточность (ESRD),

болезни печени при этом указанные болезни печени можно выбрать из группы, включающей гепатотоксичность, вирусный гепатит, цирроз,

болезни органов пищеварения, при этом указанные болезни органов пищеварения можно выбрать из группы, включающей воспалительное заболевание кишечника, например, язвенный колит, болезнь Крона, гастрит, панкреатит и язвенную болезнь желудка и 12-перстной кишки,

вирусные инфекционные заболевания, при этом указанные вирусные инфекционные заболевания можно выбрать из группы, включающей гемоконтактный вирусный гепатит (B, C и D), вирус иммунодефицита человека (HIV), грипп A, вирус Эпштейна-Барра, респираторно-синцитиальный вирус,

рак, при этом указанный рак можно выбрать из группы, включающей рак предстательной железы, рак молочной железы, рак легких, колоректальный рак, рак мочевого пузыря, рак яичников, рак кожи, рак желудка, рак печени,

и воспаление, и

сепсис, септический шок и SIRS.

С учетом указанного выше и в контексте настоящего изобретения подробный список заболеваний и их связь с окислительным стрессом представлена в таблице 1 ниже:

Более подробно:

Предполагается, что окислительный стресс важен при неврологических и нейродегенеративных заболеваниях, включая боковой амиотрофический склероз (ALS), болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, депрессию, рассеянный склероз, позднюю дискинезию (TD), эпилепсию и острые заболевания центральной нервной системы, такие как поражения спинного мозга и/или травматическое повреждение головного мозга. Головной мозг человека уязвим для окислительного стресса вследствие множества фактов, таких как (i) метаболизм катехоламинов; (ii) снижение антиоксидантов; (iii) наличие переходных металлов; (iv) возникновение травмы/повреждения головного мозга; а также (v) головной мозг представляет собой орган, которому частично требуется больше кислорода и (vi) экспрессирует низкие уровни антиоксидантных ферментов, которые участвуют в образовании ROS. Вследствие окислительно-восстановительного дисбаланса в головном мозге одной из наиболее пораженных структур является липидная мембрана (Rao и Balachandran 2002. Nutritional Neuroscience 5: 291-309). Обычным признаком этих заболеваний является окислительное повреждение нейронов, которое может быть причиной дисфункции или гибели нейронных клеток, что способствует патогенезу заболевания.

Болезнь Альцгеймера (AD), наиболее распространенное нейродегенеративное заболевание, отличается прогрессирующим ухудшением поведения, познания и функциональности, что значительно ухудшает повседневную жизнедеятельность. Многочисленные экспериментальные и клинические исследования показали, что окислительное повреждение играет ключевую роль в потере нейронов и прогрессировании деменции при болезни Альцгеймера. Выработка β-амилоида (Aβ), токсичного пептида, часто встречающегося в головном мозге пациентов с болезнью Альцгеймера, обусловлена окислительным стрессом и играет важную роль в нейродегенеративных процессах. Кроме того, белки Aβ могут непосредственно инициировать образование свободных радикалов посредством активации NADPH-оксидазы. Кроме того, воспаление отвечает за повышенную экспрессию цитокинов, уровни ROS и клеточную токсичность, усугубляя за счет этого прогрессирование AD. Для обзора см. Liu et al. 2017. Oxidative Medicine and Cellular Longevity 2525967; Manoharan et al. 2016. Oxid Med Cell Longev 8590578.

Болезнь Хантингтона (HD) представляет собой прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, связанное с неустойчивым распространением цитозиновых, адениновых, гуаниновых (CAG) повторов в гене HTT. Распространение повторов CAG внутри экзона 1 гена HTT вызывает мутацию, которая приводит к удлинению полиглутаминового тракта, что приводит к выработке белка HTT, который подвержен агрегации. Агрегаты mHTT накапливаются по всему головному мозгу пораженных людей, что может мешать процессу регулирования качества белка и транскрипции. Эти изменения потенциально отвечают за аберантные двигательные и когнитивные проблемы в HD. Хотя на ранних стадиях HD не часто сообщают об окислительном повреждении, его предполагают в качестве одного из главных механизмов развития HD. Повышенный окислительный стресс играет критическую роль на поздней стадии патогенеза HD. Нарушение цепи транспорта электронов и митохондриальная дисфункция являются главными механизмами, вовлеченными в опосредованный ROS этиопатогенез HD. Дисфункция компонентов окислительного фосфорилирования была документально подтверждена в тканях головного мозга пациентов с HD. У пациентов с HD обнаружен повышенный уровень маркеров окислительного стресса, сопровождающийся снижением антиоксидантного статуса по сравнению со здоровыми субъектами. Для обзора см. Liu et al. 2017. Oxidative Medicine and Cellular Longevity 2525967; Manoharan et al. 2016. Oxid Med Cell Longev 8590578.

Болезнь Паркинсона (PD), наиболее обычное нейродегенеративное заболевание пожилых людей, отличается прогрессирующей потерей мышечного контроля. PD преобладает на 6^ом десятке жизни, и мужчины в 1,5-2 раза чаще заражаются этим заболеванием, чем женщины. Фактором риска идентифицируют травму головы, болезнь или воздействие токсинов окружающей среды. Это нейродегенеративное заболевание характеризуется тремором, ригидностью, брадикинезией и нарушением баланса. PD также вызывает когнитивные, психиатрические, вегетативные и сенсорные нарушения. Патология PD характеризуется постепенной и избирательной потерей дофаминергических нейронов в компактной части черного вещества. Дисбаланс в метаболизме допамина вследствие окислительного стресса был признан одним из факторов, способствующих развитию этого заболевания. Главные патологические открытия включают наличие в черном веществе телец Леви и потерю нервных клеток в частях его вентральной группы. В нескольких исследованиях сообщалось о нарушенной дыхательной цепи и мутациях соматической митохондриальной ДНК в головном мозге пациентов с PD, что свидетельствует о большой роли окислительного метаболизма в PD. Усиленный метаболизм допамина в головном мозге пациентов с PD может быть причиной накопления в головном мозге токсичных радикалов, таких как гидроксил. Накопление железа в нейронах в активной форме окисления-восстановления играет решающую роль в патогенезе этого заболевания. Отмечалось накопление железа в черном веществе у пациентов с диагностированной PD, что свидетельствует о критической роли вызванного железом перекисного окисления липидов в патогенезе PD. В черном веществе было показано двукратное увеличение окисления белков пациентов с PD по сравнению со здоровыми субъектами. Отмечалось накопление гидроксильного радикала у пациентов с PD вследствие пониженного содержания в головном мозге глутатиона. Причиной прогрессирования PD может быть пониженная активность антиоксидантных ферментов и не ферментативных антиоксидантов. Для обзора см. Liu et al. 2017. Oxidative Medicine and Cellular Longevity 2525967; Manoharan et al. 2016. Oxid Med Cell Longev 8590578.

Боковой амиотрофический склероз (ALS) отличается прогрессирующей потерей двигательных нейронов в переднем роге спинного мозга. Его классифицируют либо как семейный, либо как спорадический в зависимости от наличия четко определенного наследственного генетического элемента. Спорадический ALS (sALS) обычно появляется в возрасте 50-60 лет. Начало sALS неизвестно, и, таким образом, идентификация причинных генов и факторов окружающей среды остается неясной. При семейном ALS приблизительно 20% случаев обусловлены мутациями SOD1. Функции SOD1 разнообразны и включают удаление избыточного супероксидного радикала, модулирующего клеточное дыхание, энергетический обмен и посттрансляционную модификацию. Дисфункция SOD ведет к потере антиоксидантной способности. Кроме того, при ALS часто наблюдали повышенные уровни ROS и связанных с ROS повреждений. Повышенные маркеры повреждения ROS были обнаружены в биологических текучих средах пациентов со спорадическим ALS, а также в ткани после смерти. Для обзора см. Liu et al. 2017. Oxidative Medicine and Cellular Longevity 2525967.

Рассеянный склероз (MS) представляет собой многофакторное заболевание центральной нервной системы (ЦНС), при котором и воспалительные и нейродегенеративные процессы происходят одновременно. В ходе заболевания воспаление уменьшается, тогда как дегенерация ЦНС прогрессирует. Воспалительный компонент при MS важен не только вследствие потери аксонов и нейронов, но также вследствие того, что он запускает дегенеративный каскад на ранней стадии MS. Индукция активации микроглии и митохондриальная дисфункция играют в воспалительных процессах особую роль. Микроглия, активированная T-лимфоцитами, высвобождает протеолитические ферменты, цитокины, продукты окисления и свободные радикалы. Также важно, что митохондриальная дисфункция приводит к повышенной выработке активных форм кислорода (ROS), которые вредны для нейронов и глии. С другой стороны, окислительный стресс повреждает митохондрии, что разрушает транспорт аденозинтрифосфата вдоль аксона, а впоследствии приводит к нейродегенерации. Окислительный стресс связан с нарушением регуляции аксональной биоэнергетики, вызванной цитокинами синаптической гипервозбудимостью, ненормальным накоплением железа и балансом оксидантов/антиоксидантов. Маркеры окислительного стресса, оцениваемые в сыворотке, эритроцитах CSF, слюне и моче, в будущем могут иметь диагностические свойства, тогда как антиоксиданты могут иметь клиническое применение. Для обзора см. Adamczyk and Adamczyk-Sowa 2016. Oxidative Medicine and Cellular Longevity 1973834.

Окислительный стресс связан с метаболическим синдромом и его отдельными составляющими патологиями, например, ожирением, инсулинорезистентностью, дислипидемией, нарушенной переносимостью глюкозы и высоким кровяным давлением. Метаболический синдром определяется критериями всемирной организации здравоохранения (Alberti and Zimmet 1998. Diabet Med. 15:539-553; World Health Organization. 1999. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications: report of a WHO Consultation. Часть 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus. Geneva, Switzerland: World Health Organization), которые требуют наличия инсулинорезистентности, выявляемой с помощью одного из следующего: (1) диабет II типа; (2) нарушение глюкозы натощак; (3) нарушение переносимости глюкозы или (4) для людей с нормальными уровнями глюкозы натощак (< 110 мг/дл), поглощением глюкозы ниже самого низкого квартиля для базовой популяции исследования в условиях гиперинсулинемии, эугликемии, и двух из следующего: (1) кровяное давление: ≥140/90 мм.рт.ст.; (2) дислипидемия: триглицериды (TG): ≥1,695 ммоль/л и холестерин липопротеинов высокой плотности (HDL-C) ≤0,9 ммоль/л (мужчины), ≤1,0 ммоль/л (женщины); (3) центральное ожирение: соотношение талии и бедер > 0,90 (мужчины); > 0,85 (женщины) или индекс массы тела > 30 кг/м²; (4) микроальбуминурия: соотношение выделения альбумина с мочой ≥20 мкг/мин или соотношение альбумин:креатинин ≥30 мг/г.

Повышенный окислительный стресс играет центральную роль в метаболическом синдроме и составляющих его патологий и может быть объединяющим фактором в прогрессировании этого заболевания. Кроме того, окислительный стресс идентифицирован как главный механизм микро- и макрососудистых осложнений в метаболическом синдроме. Для обзора см. Hutcheson and Rocic 2012. Exp Diabetes Res. 2012:271028.

Существует большое число доказательств, что избыточное продуцирование митохондриальных ROS (преимущественно супероксид-анионов) связано с диабетом и диабетическими осложнениями. Было высказано предположение, что глюкоза может непосредственно стимулировать избыточное продуцирование ROS, и также было показано, что высокий уровень глюкозы (HG) активирует различные ферментативные каскады в митохондриях, включая активацию NADPH-оксидазы, разобщение NO-синтаз и стимулирование ксантиноксидазы. Гликированные белки также могут быть промоторами образования ROS, что позволяет предположить, что при диабете за избыточное продуцирование ROS и окислительный стресс могут отвечать разные источники. Для обзора см. Pitocco et al. 2013. Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 21525-21550.

Кроме того, окислительный стресс играет важную роль в патогенезе и развитии сердечно-сосудистых заболеваний, включая гипертонию, дислипидемию, атеросклероз, инфаркт миокарда, стенокардию и сердечную недостаточность (Elahi et al. 2009. Oxidative Medicine and Cellular Longevity 2(5): 259-269). Одним из ключевых понятий опосредованного свободными радикалами патогенеза сердечно-сосудистого заболевания является эндотелиальная дисфункция, вследствие которой нарушается регуляция микросреды сосудистых стенок. Например, считается, что активность ROS в стенке сосуда способствует образованию окисленных LDL, главного фактора патогенеза атеросклероза. Окислительный стресс также играет роль в ишемическом каскаде вследствие реперфузионного повреждения кислорода после гопоксии. Этот каскад включает как инсульт (Chen et al. 2011. Antioxidants and Redox Signaling 14(8): 1505-1517), так и инфаркт миокарда (MI) (Hori и Nishida et al. 2009. Cardiovascular Research 81: 457-464). Во время ишемии/реперфузии головного мозга происходит множество вредных процессов, включая избыточное продуцирование оксидантов, инактивацию систем детоксикации и расходвание антиоксидантов. Эти изменения вызывают нарушение нормальной антиокислительной защитной способности ткани головного мозга (Chen et al. 2011. Antioxidants and Redox Signaling 14(8): 1505-1517). Для дополнительного обзора см. Elahi et al. 2009. Oxidative Medicine and Cellular Longevity 2(5): 259-269.

Ряд экспериментальных и клинических исследований продемонстрировали повышенное образование ROS при сердечной недостаточности (HF) и показали, что окислительный стресс связан с патофизиологией HF в сердце, а также в скелетных мышцах. Высокая метаболическая активность богатого митохондриями миокарда делает эти выводы интуитивно очевидными. Окислительный стресс явно активирует в изолированных клетках сердца такие процессы, как изменения экспрессии генов и гибели клеток, которые в настоящее время являются признанными компонентами ремоделирования миокарда и сердечной недостаточности. Кроме того, было проведено множество исследований на животных моделях, которые демонстрируют терапевтическое действие антиоксидантов на прогрессирование сердечной недостаточности. Для обзора см. Tsutsui et al. 2011. Am J Physiol Heart Circ Physiol 301: H2181-H2190.

Считается, что избыточный окислительный стресс играет важную роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний. Множество исследований показывают, что лимфоциты T и B участвуют в патогенезе аутоиммунных заболеваний путем выработки аутоантител и ROS под влиянием окружающей среды и генетическим влиянием. Окислительный стресс участвует в аутоиммунных заболеваниях (ревматоидный артрит, системная красная волчанка, псориаз и целиакия), где он играет важную роль в процессе заболевания. Окислительный стресс усиливается при системной красной волчанке (SLE) и способствует нарушению регуляции иммунной системы, ненормальной активации и обработке сигналов гибели клеток, выработке аутоантител и сопутствующим смертельным исходам. Митохондриальная дисфункция в T-клетках способствует высвобождению легко диффундирующих воспалительных гидропероксидов липидов, которые распространяют окислительный стресс в другие внутриклеточные органеллы и через кровоток. Окислительная модификация аутоантигенов запускает аутоиммунитет, и степень такой модификации сывороточных белков демонстрирует поразительную корреляцию с активностью заболевания и повреждением органов при SLE (Perl 2013. Nat Rev Rheumatol. 9(11): 674-686). Ревматоидный артрит (RA) представляет собой аутоиммунное заболевание, отличающееся хроническим воспалением суставов и ткани вокруг суставов с инфильтрацией макрофагов и активированных T-клеток. Патогенез этого заболевания обусловлен образованием ROS и RNS на участке воспаления. RA является одним из состояний, которые индуцируют окислительный стресс. Пятикратное увеличение митохондриальной выработки ROS в цельной крови и моноцитов у пациентов с RA по сравнению со здоровыми субъектами позволяет предположить, что окислительный стресс является патогенным признаком при RA. Свободные радикалы косвенно участвуют в повреждении суставов, потому что они также играют важную роль в качестве дополнительных посредников в воспалительном и иммунологическом клеточном ответе при RA. Воздействие T-клеток на повышенный окислительный стресс становится невосприимчивым к некоторым стимулам, включая стимулы роста и гибели и может навсегда сохранять ненормальный иммунный ответ. С другой стороны, свободные радикалы могут непосредственно разрушать суставной хрящ, атакуя его протеогликан и ингибируя его синтез (для обзора см. Flores et al. 2016. Biomed Res Int. 2016:6097417).

В настоящее время существуют убедительные доказательства, что воспалительные болезни легких, такие как астма и хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), характеризуются системным и местным хроническим воспаление и окислительным стрессом. Важным источником повышенного окислительного стресса дыхательных путей является привелечение воспалительных клеток в дыхательные пути после воздействия инициирующих факторов. Эти активированные клетки могут генерировать анион супероксид посредством пути восстановленной никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADPH) оксидазы. Митохондриальная дисфункция в эпителиальных клетках дыхательных путей, которая происходит в ответ на механические стимулы и стимулы окружающей среды, также может способствовать образованию анион супероксида и окислительного стресса дыхательных путей. Субъекты с астмой имеют больший системный и повышенный окислительный стресс дыхательных путей, который связан с повышением тяжести астмы. Как и при астме субъекты с COPD имеют повышенный окислительный стресс дыхательных путей и нитрозативный стресс. Пациенты с COPD имеют большую степень иммуноокрашивания для нитротирозина в эпителии дыхательных путей и воспалительные клетки в мокроте. Также для пациентов с COPD был описан существенный дисбаланс в метаболизме тиолов дыхательных путей, который может быть связан с изменениями транскрипции при последующих окислительно-восстановительных процессах и провоспалительными явлениями. Для обзора см. Holguin 2013. Ann Am Thorac Soc 10 Supplement: S150-S157.

Воспалительное заболевание кишечника (IBD) представляет собой неизлечимое хроническое воспалительное заболевание кишечника в желудочно-кишечном (GI) тракте, которое сильно влияет на качество жизни. Болезнь Крона (CD) и язвенный колит (UC) являются основными типами IBD. CD может возникать в любой области желудочно-кишечного тракта с вовлечением подвздошной кишки и толстой кишки с перерывом на трансмуральное воспаление, тогда как UC неизменно поражает только толстую кишку и прямую кишку и ограничен слизистой оболочкой. Накопленные данные как из экспериментальных моделей, так и из клинических исследований показывают, что передача сигналов при окислительном стрессе участвует и способствует развитию IBD через несколько уровней функции. Окислительный стресс ведет к повреждениям слоя слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта и бактериальной инвазии, что, в свою очередь, стимулирует иммунный ответ и инициирует IBD. Во время воспаления иммунные клетки, такие как лейкоциты, моноциты и нейтрофилы усиливают выработку ROS во время дыхательного метаболизма, метаболизма простагландинов и лейкотриенов, что приводит к дополнительным повреждениям тканей. Для обзора см. Tian et al. 2017. Oxid Med Cell Longev 4535194.

Целиакия (CD) представляет собой иммуноопосредованное хроническое воспалительное заболевание верхней тонкой кишки, вызванное глютеном и родственными проламинами у генетически восприимчивых людей. Как и при других аутоиммунных состояниях в патогенез CD могут быть вовлечены факторы окружающей среды, генетические и иммунологические факторы. В дополнение к этому окислительный стресс также вовлечен в патогенез CD. Например, активация ксантиноксидазы является одним из механизмов избыточного продуцирования ROS в слизистой оболочке тонкой кишки пациентов с целиакией. Для обзора см. Patlevic et al. 2016. Integr Med Res 5: 250-258.

Гастрит определяют, как воспаление слизистой оболочки желудка, и он возникает в нескольких состояниях, включая заражение H. pylori, применение НПВП, употребление алкоголя и стресс. Язвенная болезнь (PUD) возникает в проксимальном отделе желудочно-кишечного тракта и часто связана с хроническим гастритом. Язвы желудка и 12-перстной кишки представляют собой наиболее распространенные и хронические PUD. Гастрит и язвенную болезнь вызывает множество факторов, как эндогенных, так и экзогенных, и свободные радикалы тесно связаны с обоими состояниями. Существует несколько факторов, вносящих вклад в накопление ROS в желудке. Снижение уровней антиоксидантного фермента SOD и поглощения антиоксидантных витаминов участвуют в накоплении ROS, связанных с гастродуоденальными воспалительными заболеваниями. Вызванное этанолом воспаление желудка связано с повышенным образованием супероксида. При хроническом воспалении, таком как наблюдают при гастрите, вызванном H. Pylori, и IBD, фагоцитарные лейкоциты являются основным источником ROS. Во время воспаления в слизистую оболочку желудка проникают значительные количества нейтрофилов и/или макрофагов, генерируя большие количества ROS. Для обзора см. Bhattacharyya et al. 2014. Physiol Rev 94: 329-354.

Окислительный стресс также играет критическую роль в болезнях печени, наподобие вирусного гепатита (типа A, B и C) и цирроза печени. Было четко установлено, что гепатит C связан с сильным окислительным стрессом. Он был выявлен в тканях печени и в образцах сыворотки/плазмы крови пациентов с хроническим гепатитом C с использованием множества методик, включая прямое измерение ROS, количественное определение ДНК, продукты окисления липидов и белков, а также путем оценки общего состояния оксидантов/антиоксидантов или уровней отдельных антиоксидантов. Скрининг биопсии печени носителей вируса хронического гепатита C выявил существенное повышение уровней радикалов кислорода и маркеров стресса малондиальдегида (MDA) и 4-гидроксиноненала-(HNE)- и других аддуктов белков. Кроме того, сыворотка/плазма таких пациентов отличается повышенными уровнями большой группы маркеров окислительного стресса, таких как MDA, липидные пероксиды, содержанием карбонила белков или тиоредоксина (для обзора см. Ivanov et al. 2017. Oncotarget, 2017, Vol. 8, (№ 3), pp: 3895-3932).

Пациенты с хроническим гепатитом B демонстрируют признаки выраженного окислительного стресса. Уровни радикалов кислорода в образцах печени этих пациентов превышают уровни у здоровых людей. Пациенты с гепатитом B демонстрируют признаки окислительного стресса не только в печени, но также в плазме/сыворотке. Хронический гепатит B сопровождается увеличением общего оксидантного статуса и сопутствующим снижением общего антиоксидантного статуса. Плазма/сыворотка этих пациентов также отличается повышенными уровнями ROS, включая H₂O₂, и продуктами окисления липидов и белков. Окислительный стресс это не только признак хронической инфекции HBV и прогрессирующего заболевания печени; он также наблюдается при остром гепатите B и гепатите B неизвестного происхождения, а также при бессимптомном заражении HBV. Инфекция гепатита B неизвестного происхождения отличается повышенными уровнями ROS в лимфоцитах и последующим повреждением ДНК. Однако, наиболее сильные изменения были описаны у пациентов с гепатитом B с циррозом печени и с острым хроническим гепатитом B с печеночной недостаточностью (для обзора см. Ivanov et al. 2017. Oncotarget, 2017, Vol. 8, (No. 3), pp: 3895-3932).

Цирроз представляет собой осложнение многих форм хронических заболеваний печени и представляет собой позднюю стадию фиброза, на которой регенеративное узелковое образование окружено фиброзными полосами печени. При циррозе окислительный стресс, вызванный в основном избыточным продуцированием активных форм кислорода, который является критическим фактором эндотелиальной дисфункции и обусловлен нарушением баланса между оксидантными и антиоксидантными ферментами. Повышенное образование супероксида в присутствии эквимолярных концентраций NO будет приводить к образованию сильнодействующих ROS и активных форм азота. Для обзора см. Vairappan 2015. World J Hepatol 27; 7(3): 443-459.

Гепатотоксичность подразумевает химическое повреждение печени. Лекарственная болезнь печени является причиной острых и хронических заболеваний печени. Лекарственная болезнь печени является причиной 5% всех случаев госпитализации и 50% всех случаев острой печеночной недостаточности. Печень является наиболее часто поражаемым органом с точки зрения лекарственной токсичности. Выработка форм радикалов, конкретно ROS и RNS, была предложена в качестве раннего проявления лекарственной гепатотоксичности и в качестве индикатора потенциальной гепатотоксичности. Было обнаружено, что многие лекарственные вещества могут вызывать окислительный стресс, включая увеличение клеточных оксидантов и перикисного окисления липидов, истощение антиоксидантов в печени, таких как противовоспалительные лекарственные вещества, противоболевые лекарственные вещества, противораковые лекарственные вещества и антидепрессанты (Li et al. 2015. Int. J. Mol. Sci. 16: 26087-26124). В причинение повреждения печени вовлечено более чем 900 лекарственных веществ, которые включены в данный документ посредством ссылки ((https://livertox.nlm.nih.gov/; Björnsson 2016. Int. J. Mol. Sci. 17: 224).

В патогенезе алкогольной болезни печени (ALD) прямое следствие метаболизма этанола также, по-видимому, связано с выработкой ROS, повреждением митохондрий и стеатозом, которые являются обычными признаками острого и хронического воздействия алкоголя (Li et al. 2015. Int. J. Mol. Sci. 16: 26087-26124).

Как острое поражение почек (AKI), так и хроническое заболевание почек (CKD), которые приводят к снижению функции почек, представляют собой взаимозависимые факторы риска повышенной смертности. Если не лечить с течением времени, терминальная стадия почечной недостаточности (ESRD) является неизбежным результатом. Острые и хронические болезни почек возникают отчасти вследствие дисбаланса между молекулярными механизмами, которые управляют окислительным стрессом, воспалением, аутофагией и гибелью клеток. Многочисленные исследования показывают, что окислительный стресс и его системные эффекты играют ключевую роль в развитии AKI. Недавнее исследование продемонстрировало повышенную экспрессию тиоредоксина 1 мочи (TRX1) в виде биомаркера окислительного стресса применительно к повреждению почек. Диабетическая нефропатия (DN) представляет собой разрушительное осложнение при диабете и основную причину CKD. В почках митохондриальная дыхательная цепь и NADPH-оксидазы (NOX) являются главными общими источниками ROS, и было продемонстрировано, что NOX вызывают окислительный стресс, усиливая сосудистую дисфункцию и фиброз при CKD. Для обзора см. Sureshbabu et al. 2015. Redox Biology 4: 208-214.

Лекарственная болезнь почек (нефротоксичность) является серьезной проблемой в клинической практике и составляет 19%-26% случаев острого поражения почек (AKI) у госпитализированных пациентов. Кроме того, AKI является причиной тяжелого состояния, связанного с высокой вероятностью развития прогрессирующего хронического заболевания почек или терминальной почечной недостаточности, что приводит к высокой смертности. Большинство лекарственных веществ, вызывающих нефротоксичность, оказывают токсическое воздействие за счет одного или нескольких обычных патогенных механизмов. К ним относятся измененная внутригломерулярная гемодинамика, токсичность для клеток почечного канальца, воспаление, кристаллическая нефропатия, рабдомиолиз и тромботическая микроангиопатия. AKI включает в себя острый канальцевый некроз (ATN) и острый интерстициальный нефрит (AIN). Механизмом в основе ATN является окислительный стресс. Проксимальная канальцевая токсичность развивается вследствие прямого нефротоксичного воздействия, такого как митохондриальная дисфункция, ингибирование лизосомальной гидролазы, повреждение фосфолипидов и повышенная концентрация внутриклеточного кальция, что приводит к образованию активных форм кислорода (ROS) с опасным окислительным стрессом (Hosohata 2016. Int. J. Mol. Sci. 17: 1826).

Лекарствами, потенциально вредными для почек (нефротоксичными), являются например, противомикробные средства, типа антибиотиков (например, стрептомицин, гентамицин), или противовирусные средства (например, ацикловир, фоскарнет) или противогрибковые средства (например, амфотецерин B), анальгетики, нестероидные противовоспалительные лекарственные вещества (НПВП) (например, ибупрофен, напроксен), мочегонные средства, ингибиторы протонной помпы, химиотерапевтические вещества (например, цисплатин), контрастные красители, сердечно-сосудистые средства, наподобие ингибиторов АПФ или статинов, антидепрессанты, иммуносупрессанты (например, циклоспорин A) и антигистаминные средства (для ссылки см. Naughton 2008. Am Fam Physician. 2008;78(6):743-750, Table 1; Hosohata 2016. Int. J. Mol. Sci. 17: 1826).

В карциногенезе высокореактивные гидроксильные радикалы вызывают окислительное повреждение ДНК и пероксинитрит, который вызывает как окислительное повреждение, так и нитрование оснований ДНК. Большинство мутаций, вызванных ROS, по-видимому, связаны с модификацией гуанина, вызывая трансверсии гуанин (G) → тимин (T). Если это относится к критическим генам, таким как онкогены или гены-супрессоры опухоли, это может привести к возникновению или прогрессированию рака. Высокий метаболизм раковых клеток обычно связан с увеличением ROS; однако, такие уровни менее вредны в раковых клетках, чем они были бы в нормальных клетках. Например, хотя уровень ROS увеличивается в незначительной степени, онкогенные клетки могут индуцировать новый окислительно-восстановительный баланс, который приводит к клеточной адаптации и пролиферация. Особенно важны ROS, создаваемые дыхательной цепью в митохондриях и Nox ферментами в цитоплазме. Фактически, белки Nox в настоящее время считаются онкогенными белками, а митохондриальная дисфункция связана с онкогенезом. Окислительный стресс связан со всеми стадиями карциногенеза, и существует зависимая от дозы связь между уровнем постоянного или хронического окислительного стресса и стадией опухоли. Во время процесса карциногенеза нормальные клетки трансформируются в ненормальные клетки вследствие ряда структурных изменений и мутаций в экспрессии генов. В специальной литературе карциногенез описан с тремя основными стадиями: возникновение, развитие и прогрессирование. Утверждается, что все эти стадии связаны с участием ROS и RNS. ROS имеют важную роль в патофизиологических состояниях, участвующих в неоваскуляризации. Например, генерирующие ROS ферменты, такие как NADPH-оксидазы (например, Nox: Nox1-5), активируют пути передача сигналов окисления-восстановления, которые в конечном счете приводят к ангиогенезу. Для обзора см. Kruk and Aboul-Einein 2017. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 17: 904-919; Sosa et al. 2013. Ageing Research Reviews 12: 376- 390.

Рак предстательной железы является наиболее часто диагностируемым некожным злокачественным новообразованием у мужчин. Это многоочаговая болезнь заявленного типа, при которой образуются солидные опухоли железистого происхождения. Рак предстательной железы - это, главным образом, заболевание старения, причем в большинстве случаев встречается у мужчин старше 55 лет. За последнее десятилетие была выявлена связь между риском развития рака простаты и окислительным стрессом, а эпидемиологические, экспериментальные и клинические исследования однозначно доказали роль окислительного стресса в развитии и прогрессировании этого заболевания, как правило, связанную со сдвигом антиоксидантно-прооксидантного баланса в сторону усиления окислительного стресса. Факторы окружающей среды, такие как диета, воспаление и изменения клеточных функций, относящихся к NAD(P)H-оксидазе, андрогенная передача сигналов, мутации митохондриальной ДНК, старение и окислительно-восстановительный дисбаланс являются возможными механизмами, способствующими увеличению выработки ROS. Это повышение ROS может дополнительно стимулировать пролиферацию клеток, вызывать соматические мутации ДНК и способствовать генетической нестабильности, остановке клеточного цикла, старению, а в раковых клетках может вызывать усиление ангиогенеза и подвижности. В частности повышенное образование ROS при экспрессии Nox при раке предстательной железы может приводить к образованию злокачественного фенотипа путем модуляции различных сигнальных каскадов. Для обзора см. Khandrika et al. 2009. Cancer Lett. 282(2): 125-136; Kruk and Aboul-Einein 2017. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 17: 904-919; Sosa et al. 2013. Ageing Research Reviews 12: 376- 390.

Избыточная выработка ROS в клетках рака молочной железы включает: сильную экспрессию фосфорилазы тимина, приводящую к распаду тимидина на тимин и 2-дезокси-D-рибозофосфат; окисление паноксильных радикалов 17-эстрадиола в лактопероксидазу, участвующую в метаболизме эстрогенов и воспалении. В дополнение к увеличению свободных радикалов антиоксидантные изменения связаны с риском развития рака молочной железы, например, было обнаружено, что уровни SOD и GPX в крови выше, чем у здоровых женщин, в ответ на увеличение выработки супероксида и пероксида водорода. При раке молочной железы ген-супрессор опухоли, ген 1 рака молочной железы (BRCA1), мутирует в 40-50% случаев наследственного рака молочной железы и отсутствует или экспрессируется на низких уровнях в 30-40% случаев спорадического рака молочной железы. BRCA1 является геном общего контроля, ответственным за восстановление ДНК, и он способен активировать несколько генов, участвующих в антиоксидантном ответе, путем регулирования активности факторов транскрипции Nrf2 и NfκB. Помимо ингибирующего действия BRCA1 на выработку ROS BRCA1 также снижает уровни нитрования белка из-за накопления RNS в клетках и усиливает процессы восстановления ДНК, что в конечном итоге помогает справиться с окислительным стрессом. Для обзора см. Nourazarian et al. 2014 Asian Pac J Cancer Prev, 15 (12): 4745-4751; Kruk and Aboul-Einein 2017. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 17: 904-919; Sosa et al. 2013. Ageing Research Reviews 12: 376- 390.

Легкие человека постоянно подвергаются воздействию окислителей, загрязняющих воздух, в дополнение к эндогенно генерируемым ROS и RNS, которые участвуют в физиологических биохимических механизмах и нормальных клеточных сигнальных путях. Обычно считается, что курение табака является ключевым фактором риска развития рака легких. Как клинические, так и экспериментальные исследования неизменно показывают важную роль OS в раке легких. Имеются данные, подтверждающие важность окислительного стресса и его взаимосвязь с увеличением частоты злокачественных респираторных заболеваний вследствие воспаления, активации факторов транскрипции и повреждения ДНК. Во время воспаления усиленная выработка ROS вызывает повреждение ДНК, ингибирование апоптоза и активацию протоонкогенов путем инициирования путей передачи сигналов. Воспалительные клетки особенно эффективны в выработке ROS и других активных форм, таким образом увеличивая окислительное повреждение и способствуя механизмам канцерогенеза. Предполагается, что способность вдыхаемых частиц или волокнистой пыли проникать в дыхательную систему и достигать альвеол легких с выработкой ROS и других окислителей или свободных радикалов является основным фактором, влияющим на их патогенный потенциал. Были изучены синергетические механизмы вдыхания твердых частиц (проникающих глубоко в альвеолы легких) и других компонентов загрязнения воздуха (озон, оксид азота, сажа, тяжелые металлы, PAH) и табачного дыма. Пористые поверхности частиц в воздухе обеспечивают благодатную почву для катализа повышенной выработки ROS или других вредных окислителей, которые являются потенциальными инициаторами канцерогенеза в легких. Для обзора см. Valavanidis et al. 2013. Int. J. Environ. Res. Public Health 10: 3886-3907; Kruk and Aboul-Einein 2017. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 17: 904-919; Sosa et al. 2013. Ageing Research Reviews 12: 376- 390.

Колоректальный рак (CRC) является одним из самых распространенных видов рака в мире, с самыми высокими показателями заболеваемости в западных странах. Рак толстой кишки происходит из эпителиальных клеток, которые выстилают кишечник. Эти клетки быстро делятся и имеют высокую скорость метаболизма, которая была обнаружена как потенциальный фактор, который может быть ответственным за повышенное окисление ДНК. Было обнаружено, что колоректальные опухоли человека (аденомы и карциномы) имеют повышенные уровни различных маркеров окислительного стресса, такие как повышенные уровни оксида азота (NO), 8-oxodG в ДНК, липидных пероксидов, глутатионпероксидазы (GPx), каталазы (CAT) и снижение метилирования цитозина в ДНК. Помимо липидных модификаций также была обнаружена повышенная активация лейкоцитов в канцерогенной ткани, что указывает на возможный вклад воспалительных клеток в дальнейший окислительный стресс. Кроме того, было показано, что уровни антиоксидантных витаминов A, C, E в плазме крови пациентов с колоректальным раком были статистически ниже по сравнению со здоровыми людьми. Для обзора см. Perse 2013. BioMed Research International 725710; Kruk and Aboul-Einein 2017. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 17: 904-919; Sosa et al. 2013. Ageing Research Reviews 12: 376-390.

В промышленно развитых странах рак мочевого пузыря является четвертым наиболее часто встречающимся злокачественным новообразованием. Недавние исследования указывают на участие окислительного и нитрозативного стресса в формировании и развитии этого заболевания. Окслительно-восстановительные инарушения характерны как для возникновения, так и для развития рака мочевого пузыря. Наблюдаются изменения активности факторов транскрипции, таких как ядерный фактор NF-kB; факторы транскрипции: AP-1, Nrf2 и STAT3 и индуцируемый гипоксией фактор HIF-1α. Кроме того, исследования указывают на роль окислительного стресса в регуляции каскада МАРК и его участие в канцерогенезе мочевого пузыря. Оксид азота также играет важную роль в биологии опухолей. Многочисленные исследования показывают, что рак мочевого пузыря характеризуется усиленной выработкой NO. В отличие от ROS, избыточное продуцирование которого происходит в результате воздействия канцерогенного ксенобиотика, при воспалении вырабатывается высокий уровень оксида азота. Поэтому устойчивая активность iNOS играет важную роль в канцерогенезе, связанном с воспалительным ответом, характерным также для рака мочевого пузыря. Для обзора см Sawicka et al. 2015. Postepy Hig Med Dosw 69: 744-752.

Рак яичников является пятой по значимости причиной смерти от рака; ведущая причина смерти от гинекологических злокачественных новообразований и второе наиболее часто диагностируемое гинекологическое злокачественное заболевание. Подавляющее большинство случаев рака яичников происходит из поверхностного эпителия яичников. Метастазирование происходит путем отделения отдельных клеток или скоплений клеток от первичной опухоли с последующей имплантацией на перитонеальную мезотелиальную выстилку. Рак яичников, эндометрия и шейки матки представляют собой большую проблему в онкологии из-за их диагностики на поздней стадии. Результаты исследований показали, что окислительный стресс играет причинную роль в канцерогенезе двух подтипов рака яичников: светлоклеточной карциномы и карциномы эндометриоза. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что у пациентов с раком яичников снижается уровень циркулирующих антиоксидантов и повышается уровень окислительного стресса. Сообщалось, что ткани и клетки эпителиального рака яичника (EOC) проявляют прооксидантное состояние, характеризующееся повышенной экспрессией ключевых прооксидантных ферментов и сниженной экспрессией антиоксидантных ферментов. В частности, в клетках и тканях EOC проявляется повышенная экспрессия iNOS, MPO, NAD(P)H-оксидазы, а также повышение уровней NO. Более того, в клетках EOC проявляется более низкий апоптоз.

Сообщалось, что рак эндометрия связан с заболеванием эндометриозом, а высокий уровень гемосидерина или гема со свободным железом в кистах эндометрия считается основным фактором, ответственным за развитие окислительного стресса и хроническое воспаление.

Рак шейки матки является вторым наиболее распространенным раком у женщин во всем мире, и является объектом интенсивных исследований. В нескольких экспериментальных исследованиях предполагалось участие окислительного стресса в шейном отделе шейки матки, что свидетельствует о том, что антиоксиданты могут изменять окислительно-восстановительный баланс в раковых клетках шейки матки, ингибировать факторы транскрипции AP-1 и NF-κB или вызывать апоптоз клеток. Для обзора см. Saed et al. 2017. Gynecologic Oncology 145: 595-602; Kruk and Aboul-Einein 2017. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 17: 904-919; Sosa et al. 2013. Ageing Research Reviews 12: 376-390.

Окислительное повреждение, вызванное OS, также было связано с лейкозом, и в сыворотке пациентов с хроническим лимфоцитарным лейкозом были обнаружены пониженные уровни антиоксидантов и окислительно-модифицированных ДНК и липидов, вызванные высокой выработкой ROS. Кроме того, было обнаружено, что клетки хронического лейкоза способны адаптироваться к внутриклеточным OS посредством активизации стресс-чувствительной гемооксигеназы-1, подтверждающей участие ROS в патогенезе лейкоза. Кроме того, истощение GSH в лимфоцитах при хроническом лимфоцитарном лейкозе было продемонстрировано у пациентов с лейкозом B. Для обзора см. Kruk and Aboul-Einein 2017. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 17: 904-919.

Рак желудочно-кишечного тракта (GC) является одним из наиболее частых заболеваний среди населения. Это четвертый по частоте рак и вторая по распространенности причина смертности от рака в мире. Основным фактором риска развития рака желудочно-кишечного тракта является хроническое воспаление, вызванное ростом бактерий. Например, считается, что заражение Helicobacter pylori, которое увеличивает выработку активных форм кислорода и азота в желудке человека, играет важную роль в развитии рака желудочно-кишечного тракта. Было показано, что продукты окисления белка были значительно выше у пациентов с GC. Более того, было обнаружено, что антиоксидантный потенциал SOD и каталазы был ниже в тканях рака желудочно-кишечного тракта по сравнению с контрольными здоровыми тканями. Для обзора см. Kruk and Aboul-Einein 2017. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 17: 904-919; Ma et al. 2013. Oxidative Medicine and Cellular Longevity 543760.

В канцерогенез печени вовлечено много факторов, в том числе инфекция вируса гепатита B (HBV) и вируса гепатита C (HCV), злоупотребление алкоголем и неалкогольная жировая болезнь печени (NAFLD), афлатоксин B1, ожирение, диабет, пищевые привычки и накопление железа. В целом, окислительный стресс может быть вызван любым опасным или воспалительным сигналом и влияет на множество клеток в печени. Повреждение печени может быть острым или хроническим воспалительным процессом. В среде локального воспаления активируются многие типы клеток печени, такие как синусоидальные эндотелиальные клетки печени (LSEC), звездчатые клетки печени (HSC), дендритные клетки (DC) и клетки Купфера (KC). Эти клетки продуцируют многие виды иммунных медиаторов, цитокинов и хемокинов, которые также могут приводить к созданию окислительного стресса. В последние годы расширяются исследования взаимосвязи между окислительным стрессом и звездчатыми клетками печени. Доказано, что эти клетки играют центральную роль в процессе фиброза печени и могут вызывать выработку коллагена после активации в организме свободных радикалов, которые вырабатываются ROS и супероксид-анионами, и в дальнейшем вызывать повреждение клеток печени.

Известно, что более 80% случаев HCC связано с хронической инфекцией HBV или HCV. Хроническое воспаление, связанное с HBV и HCV, и фиброз печени обычно индуцируются окислительным стрессом, который способствует патогенезу гепатокарциногенеза. Инфекция HBV приводит к активации макрофагов с образованием различных провоспалительных цитокинов, таких как IL-1β, IL-6, CXCL-8 и TNF-α. Такое постоянное аномальное продуцирование цитокинов и, как следствие, выработка ROS оказывают влияние на гепатокарциногенез. Индуцированный HCV окислительный стресс способствует развитию гепатоцеллюлярной карциномы (HCC). Кроме того, уровни маркеров оксидативного стресса у пациентов с хроническим гепатитом С положительно коррелируют с вероятностью развития HCC и могут служить прогностическими маркерами рецидива HCC у пациентов с хроническим гепатитом С, перенесших трансплантацию печени. Канцерогенез организуют несколько опосредованных ROS процессов. Для обзора см. Wang et al. 2016. Oxidative Medicine and Cellular Longevity 7891574.

Кожа является основной поверхностью отделения от окружающей среды для организма, которая случайно или по роду занятий подвергается воздействию ряда химических мутагенов и канцерогенов. Рак кожи представляет собой серьезную и растущую проблему общественного здравоохранения. На его долю приходится более 40% всех новых диагнозов рака. 80% случаев рака кожи обусловлены базальноклеточным раком (BCC); еще 16% - плоскоклеточным раком (SCC), а 4% - меланомой. Большое количество доказательств указывает на то, что повреждение ДНК может вызывать УФ и, как следствие, обнаруживаются разрывы нитей ДНК и перекрестные связи ДНК. Важным процессом при раке кожи является образование пероксида водорода меланоцитами и снижение активности каталазы. Более того, есть данные, показывающие, что мутации в нескольких генах, связанных с меланомой, являются результатом окислительного стресса. Для обзора см. Kruk and Aboul-Einein 2017. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 17: 904-919; Narendhirakannan. 2013. Ind J Clin Biochem 28(2):110-115.

Реактивные формы, возникающие во время заражения, могут иметь серьезные последствия для болезни, если они будут высвобождаться в какой-либо степени. Окислительный стресс может вызывать побочные эффекты в различных органах. В ходе гипоксии развитие окислительного стресса может ускоряться. Гипоксия является известным осложнением инфекционных заболеваний. Гипоксия не является специфической для одного заболеванию. Грипп, вирусный гепатит и туберкулез - все это примеры инфекционных заболеваний, при которых происходит гипоксия. Прямое образование активных форм кислорода может быть инициирована металлами. В одном примере железо, медь и кадмий могут катализировать развитие окислительного стресса по реакции Фентона, в которой пероксид водорода превращается в гидроксильный радикал и гидроксид-анион. Тяжелые металлы участвуют в патологических процессах, связанных с инфекциями, как и в других патологиях. Как уже упоминалось, печени, поврежденные вирусным гепатитом, уязвимы для тяжелых металлов из-за неправильных процессов элиминирования. Клинические исследования пациентов с вирусными гепатитами A, B, C, D и E показали, что накопление меди и железа вызывает окислительный стресс и окислительное повреждение тканей печени пациентов. Как и гепатит, СПИД сопровождается дисбалансом в окислительном гомеостазе. У ВИЧ-инфицированных пациентов распространены повышенные маркеры окислительного повреждения мишеней в организме и накопления активных форм кислорода. Антиоксиданты в крови снижаются в течение длительного времени у инфицированных людей. Для обзора см. Pohanka 2013. Folia Microbiol 58: 503-513.

Сепсис и септический шок остаются основной причиной смерти в отделениях интенсивной терапии для взрослых. Широко признано, что сепсис и септический шок вызывают в основном грамотрицательные бактерии и их эндотоксины. Эндотоксин или липополисахарид (LPS) играют важную роль в реакции хозяина и запускают воспалительные процессы, вызванные заражением грамотрицательными бактериями. Выработка нейтрофилами и макрофагами кислородных радикалов, таких как активные формы кислорода (ROS), NO (оксид азота) и пероксинитрит, способствуют экспрессии генов провоспалительных медиаторов. ROS и RNS являются антимикробными агентами, продуцируемыми этими лейкоцитами, которые могут непосредственно уничтожать микробные патогены. Во время сепсиса избыточная выработка ROS и RNS угрожает целостности различных биомолекул, включая белки, липиды, а также липопротеины, окислению белков и ДНК, что приводит к повреждению тканей путем перекисного окисления липидов клеточных мембран, окисления белков и разрывов нитей ДНК. Эти механизмы способствуют полиорганной недостаточности во время сепсиса, что приводит к депрессии миокарда, гепатоцеллюлярной дисфункции, эндотелиальной дисфункции и гипочувствительности сосудистого катехоламина. В качестве основного источника выработки ROS митохондрии особенно подвержены повреждениям, вызванным ROS. Такое повреждение может вызвать изменение проницаемости митохондрий, вызванное открытием пор переходной проницаемости с неспецифической высокой проводимостью во внутренней мембране митохондрий. Сами ROS также предоставляют сигнал, приводящий к индукции аутофагии, апоптоза и некроза. Чрезмерная выработка ROS и истощение аденозинтрифосфата в результате разрыва окислительного фосфорилирования способствуют гибели некротических клеток. Высвобождение цитохрома-с после митохондриального набухания активирует каспазы и инициирует апоптотическую гибель клеток. Для обзора см. Kaymak et al. 2011. FABAD J. Pharm. Sci. 36: 41-47.

Таким образом, в другом конкретном варианте осуществления изобретения раскрытая в данном документе связывающая DPP3 молекула, конкретно, представленное в данном документе антитело против DDP3 и/или фрагмент антитела против DPP3 или не-Ig скаффолд против DPP3, которые связываются с эпитопом согласно SEQ ID NO.: 2, который содержится в белке DPP3 или его функциональных производных, предназначены для применения с целью профилактики или лечения заболевания или острого состояния пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом, указанное заболевание выбирают из группы, включающей описанные выше нейродегенеративные заболевания, метаболический синдром, сердечно-сосудистые заболевания, аутоиммунные заболевания, воспалительные болезни легких, болезни почек, болезни печени, болезни органов пищеварения, вирусные инфекционные заболевания, рак, воспаление, сепсис, септический шок и SIRS.

В другом конкретном варианте осуществления указанное заболевание выбирают из группы, включающей нейродегенеративные заболевания (например, болезнь Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона (PD), болезнь Хантингтона (HD), боковой амиотрофический склероз (ALS) и рассеянный склероз (MS)), метаболический синдром (включая инсулинорезистентность, ожирение, гипергликемию, дислипидемию, гипертонию и диабет), сердечно-сосудистые заболевания (например, атеросклероз, гипертонию, сердечную недостаточность, ишемическую болезнь сердца, церебральное ишемическое поражение/инсульт и инфаркт миокарда), аутоиммунные заболевания (например, ревматоидный артрит и системную красную волчанку), воспалительные болезни легких (например, COPD, астму), болезни почек (включая нефротоксичность (лекарственную болезнь почек), острое поражение почек (AKI), хроническое заболевание почек (CKD), диабетическую нефропатию, терминальную почечную недостаточность (ESRD)), болезни печени (например, гепатотоксичность, вирусный гепатит, цирроз), болезни органов пищеварения (включая воспалительное заболевание кишечника, например, язвенный колит, болезнь Крона; гастрит, панкреатит и язвенную болезнь), вирусные инфекционные заболевания (например, гемоконтактный вирусный гепатит (B, C и D), вирус иммунодефицита человека (HIV), грипп A, вирус Эпштейна-Барра, респираторно-синцитиальный вирус)), рак (например, рак предстательной железы, рак молочной железы, рак легких, колоректальный рак, рак мочевого пузыря, рак яичников, рак кожи, рак желудка, рак печени) и воспаление, сепсис, септический шок и SIRS.

В другом конкретном варианте осуществления изобретения раскрытая в данном документе связывающая DPP3 молекула, конкретно, представленное в данном документе антитело против DDP3 и/или фрагмент антитела против DPP3 или не-Ig скаффолд против DPP3, которые связываются с эпитопом согласно SEQ ID NO.: 2, который содержится в белке DPP3 или его функциональных производных, предназначены для применения с целью профилактики или лечения острого состояния, при этом указанное острое состояние можно выбрать из группы, включающей гепатотоксичность и токсичность для почек.

Токсичность, обусловленная употреблением алкоголя, хроническим воздействием сигаретного дыма и побочными эффектами лечения разными лекарственными веществами

В контексте настоящего изобретения окислительный стресс и последующая токсичность также могут быть вызваны хроническим употреблением алкоголя, хроническим воздействием сигаретного дыма и побочными эффектами лечения разными лекарственными веществами (обзор в Deavall et al. 2012, см. Таблица 2 ниже).

Ацетаминофен - широко используемый анальгетик и жаропонижающий препарат - является прототипическим гепатотоксикантом для лекарственной болезни печени, который связан с передачей сигналов KEAP-Nrf2 (Ma, 2013). Другие терапевтические средства, вызывающие окислительный стресс, включают олтипраз и ауранофин (Ma, 2013).

Согласно настоящему изобретению специалисту в данной области хорошо известно, что наличие и степень окислительного стресса можно определять и измерить количественно с помощью анализов подходящих биомаркеров, известных в данной области. Соответствующие примеры этих маркеров приведены ниже, но их не следует истолковывать, как ограничение возможностей измерения окислительного стресса согласно изобретению:

Маркеры окислительного стресса для оценки: Сыворотки, Эритроцитов, CSF, Слюны, Мочи

Свободные радикалы могут повреждать биологические молекулы, включая нуклеиновые кислоты, белки и липиды. Продукты этих реакций могут стать маркерами окислительного стресса. Сыворотка является наиболее распространенным материалом для оценки компонентов окислительного стресса. Она позволяет оценивать большинство ферментов, субстратов и продуктов окислительно-восстановительных реакций. Эти ферменты включают ксантиноксидазу, NOS, липоксигеназу, циклооксигеназу, миелопероксидазу, пропилолигопептидазу, никотинамидадениндинуклеотидфосфатоксидазу 1 (NOX1) и NADPH-зависимую оксидазу. Ниже перечислены маркеры окислительного повреждения липидов: изопростаны (IsoP-простагландинподобные вещества), например, 8-изо-простагландин (F2α-8-изо-PGF2α), который является продуктом перикисного окисления липидов арахидоновой кислоты, малондиальдегид (MDA), образование флуоресцентных ковалентных аддуктов пероксидированных липидов-белков и увеличение конъюгированного диена. Окислительный стресс предусматривает окисление белков и гликоокисление. Ниже приведены результаты этой реакции: содержание гликофоров, общий уровень продуктов окисления белков (AOPP), карбонилы белков, уровень дитирозина, N'-формилкинуренин и сниженный уровень тиоловых групп белков сыворотки. Другими специфическими маркерами окисления белков являются тирозин (маркер для гидроксильного радикала) и 3-нитротирозин (маркер для RNS). Кроме того, 3-нитротирозин является специфический маркер вызванного пероксинитритом клеточного повреждения. Другие индикаторы в сыворотке включают кинуренин, N'-формилкинуренин, тиоредоксин и 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозин.

Соответствующие измерения биомаркеров окислительного стресса у людей обобщены в Ilaria Marrocco, Fabio Altieri и Ilaria Peluso; обзорная статья: Measurement and Clinical Significance of Biomarkers of Oxidative Stress in Humans; Oxidative Medicine and Cellular Longevity Volume 2017 (2017), Article ID 6501046, 32 страницы.

Кроме того, согласно настоящему изобретению специалисту в данной области хорошо известно, что биоактивность DPP3, на который воздействует раскрытая в данном документе связывающая DPP3 молекула, можно измерять, например, для ингибирования посредством подходящих анализов, известных в данной области. Соответствующие примеры приведены ниже, но их не следует истолковывать, как ограничение возможностей определения биоактивности DPP3:

Способ обнаружения и измерения ингибирования DPP3

Ингибирование активности DPP3 в жидкофазном анализе с помощью связывающей молекулы можно определить следующим образом: Образцы крови (например, сыворотку, гепаринизированную плазму, Li-плазму, цитрат-плазму, цельную кровь) пациентов перед и после обработки антител против DPP3 инкубируют в жидкофазном анализе со специфическими DPP3 субстратами. Анализ активности DPP3 в специфической жидкой фазе для определения ингибирующей способности ингибирующих DPP3 антител в образцах крови включает следующие этапы:

- Добавление 20 мкл образца крови в 200 мкл 50 мМ Tris-HCl, pH 7,5 в черном не связывающем микротитровальном планшете (96-луночном). Причем, специалисту в данной области известно, что буферные условия, концентрации и pH и т.д. Можно варьировать.

- Добавление флуорогенного субстрата Arg-Arg-βNA (20 мкл, 2 мМ).

- Инкубация при 37°С и мониторинг образования свободных βNA в микропланшетном флуорометре Twinkle LB 970 (Berthold Technologies GmbH) в течение 1 часа. Флуоресценцию βNA обнаруживают по возбуждению при 340 нм и путем измерения излучения при 410 нм.

- Вычисляют уклоны (в RFU/мин) повышения флуоресценции разных образцов.

- Анализ значений активности DPP3 перед и после обработки антител против DPP3.

В отличие от этого твердофазный анализ представляет собой анализ, в котором соответствующие явления связывание происходят в твердой фазе. Ингибирование активности DPP3 в твердофазном анализе с помощью связывающей молекулы можно определять следующим образом: Образцы крови (например, сыворотку, плазму, цельную кровь) пациентов перед и после обработки антител против DPP3 вводят в контакт с иммобилизованной захватывающей связывающей молекулой для анализа активности захватывания фермента (ECA) в твердой фазе. Предпочтительно, в качестве захватывающей связывающей молекулы для ECA выбирают молекулу с наименьшей ингибирующей способностью. Захватывающая связывающая молекула должна ингибировать активность DPP3 менее чем на 50%, предпочтительно менее чем на 40%, предпочтительно менее чем на 30%. Анализ активности DPP3 в специфической жидкой фазе для определения ингибирующей способности возможных захватывающих связывающих молекул подробно описан в примере 1 ниже.

ECA для определения ингибирующей способности ингибирующих DPP3 антител в образцах крови включает следующие этапы:

- Введение указанного образца в контакт с захватывающей связывающей молекулой, которая связывается с полноразмерным DPP3, но предпочтительно ингибирует активность DPP3 в жидкофазном анализе менее чем на 50%, предпочтительно менее чем на 40%, более предпочтительно на 30%

- Выделение DPP3, связанного с указанной захватывающей связывающей молекулой, из образца текучей среды организма,

- Добавление субстрата DPP3 к указанному выделенному DPP3,

- Количественное определение активности DPP3 путем измерения преобразования субстрата DPP3,

- Оценка измеренных сигналов и анализ значений активности DPP3 перед и после обработки антител против DPP3.

Способ определения активного DPP3 можно осуществлять в виде жидкофазного анализа и в виде твердофазного анализа. Ингибирование активности DPP3 можно определять в жидкостном анализе согласно описанному выше методу.

В еще одном варианте осуществления анализ захватывания или связывания можно проводить для обнаружения и/или количественной оценки протеазной активности DPP3. Например, антитело, реагирующее с белком DPP3, но не влияющее на активность пептидазы, можно иммобилизировать на твердой фазе. Для обнаружения тестируемый образец пропускают через иммобилизованное антитело, и DPP3, при наличии, связывается с антителом и сам иммобилизуется. Затем можно добавить субстрат, и можно обнаружить продукт реакции, чтобы показать наличие или количество DPP3 в тестируемом образце. Для целей настоящего описания термин «твердофазный» можно использовать для обозначения любого материала или сосуда, в котором или на котором можно проводить анализ, и включает, но без ограничения, пористые материалы, непористые материалы, пробирки, лунки, стекла и т.д.

Кроме того, согласно настоящему изобретению специалисту в данной области хорошо известно, что аффинность связывания раскрытой в данном документе связывающей DPP3 молекулы с DPP3 можно измерять с помощью различных, подходящих анализов, известных в данной области. Соответствующие примеры приведены ниже, но их не следует истолковывать, как ограничение возможностей измерения аффинности связывания раскрытой в данном документе связывающей DPP3 молекулы с DPP3:

Способ измерения аффинности связывания связывающей DPP3 молекулы согласно изобретению с эпитопом согласно последовательности SEQ ID NO.: 2

Аффинность связывания связывающей DPP3 молекулы с эпитопом согласно SEQ ID NO.: 2 согласно изобретению можно определять согласно примеру 1 и как дополнительно изложено ниже:

анализ связывания можно проводить для обнаружения и/или количественной оценки антитела, связывающегося с иммунизирующим пептидом (то есть SEQ ID NO.: 2). Например, этот иммунизирующий пептид можно иммобилизировать на твердой фазе. Тестируемый образец (например, раствор антител) пропускают через иммобилизованный иммунизирующий пептид, и можно обнаружить связанное антитело. Для целей настоящего описания термин «твердофазный» можно использовать для обозначения любого материала или сосуда, в котором или на котором можно проводить анализ, и включает, но без ограничения, пористые материалы, непористые материалы, пробирки, лунки, стекла и т.д.

Иллюстративные способы обнаружения:

- Мечение антитела перед введением в контакт с твердой фазой и обнаружением соответствующей метки (флуоресцентной, хемилюминесцентной, ферментативной и т.д.)

- Использование меченого вторичного антитела против конкретной Fc-части образца-антитела. Инкубация связанного с твердой фазой антитела со вторичным антителом (например, против человеческого IgG, против мышиного IgG) и обнаружение соответствующей метки (флуоресцентной, хемилюминесцентной, ферментативной и т.д.)

- Использование меченого антитела в качестве конкурента за твердофазное связывание (например, меченого AK1967).

- Количественная оценка аффинности связывания путем уменьшения сигнала.

Подробное описание изобретения

Связывающая молекула, направленная против находящегося в кровотоке, внутриклеточного, мембранного DPP3

В другом варианте осуществления изобретения раскрытая в данном документе связывающая молекула согласно изобретению и связывающая DPP3 молекула, конкретно, антитела против DPP3, фрагменты антител против DPP3 или не-Ig скаффолды против DPP3 способны связывать находящийся в кровотоке DPP3, и, таким образом, направлены против находящегося в кровотоке DPP3.

В еще одном варианте осуществления изобретения раскрытая в данном документе связывающая молекула согласно изобретению и связывающая DPP3 молекула, конкретно, антитела против DPP3, фрагменты антител против DPP3 или не-Ig скаффолды против DPP3 способны связывать внутриклеточный DPP3, и, таким образом, направлены против внутриклеточного DPP3.

В еще одном варианте осуществления изобретения раскрытая в данном документе связывающая молекула согласно изобретению, связывающая DPP3 молекула, конкретно, антитела против DPP3, фрагменты антител против DPP3 или не-Ig скаффолды против DPP3 способны связывать мембранный DPP3, и, таким образом, направлены против мембранного DPP3.

Также предметом настоящего изобретения являются раскрытая в данном документе связывающая молекула согласно изобретению, связывающая DPP3 молекула, конкретно, антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3 или не-Ig скаффолд против DPP3 для применения с целью профилактики или лечения заболеваний или острых состояний у пациента, при этом указанные заболевания или острые состояния связаны с окислительным стрессом, и при этом указанная связывающая молекула, связывающая DPP3 молекула, конкретно, антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3 или не-Ig скаффолд против DPP3 направлены на эпитоп SEQ ID NO.: 2 и связываются с ним, при этом указанный эпитоп содержится в находящемся в кровотоке белке DPP3 или его функциональных производных.

Также предметом настоящего изобретения являются раскрытая в данном документе связывающая молекула согласно изобретению, связывающая DPP3 молекула, конкретно, антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3 или не-Ig скаффолд против DPP3 для применения с целью профилактики или лечения заболеваний или острых состояний у пациента, при этом указанные заболевания или острые состояния связаны с окислительным стрессом, и при этом указанная связывающая молекула, связывающая DPP3 молекула, конкретно, антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3 или не-Ig скаффолд против DPP3 направлены на эпитоп SEQ ID NO.: 2 и связываются с ним, при этом указанный эпитоп содержится во внутриклеточном белке DPP3 или его функциональных производных.

Также предметом настоящего изобретения являются раскрытая в данном документе связывающая молекула согласно изобретению, связывающая DPP3 молекула, конкретно, антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3 или не-Ig скаффолд против DPP3 для применения с целью профилактики или лечения заболеваний или острых состояний у пациента, при этом указанные заболевания или острые состояния связаны с окислительным стрессом, и при этом указанная связывающая DPP3 молекула, конкретно, антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3 или не-Ig скаффолд против DPP3 направлены на эпитоп SEQ ID NO.: 2 и связываются с ним, при этом указанный эпитоп содержится в мембранном белке DPP3 или его функциональных производных.

Предметом настоящего изобретения, кроме того, является способ регуляции и/или профилактики или лечения окислительного стресса у пациента, имеющего хроническое или острое заболевание или острое состояние, отличающийся тем, что указанному пациенту в фармацевтически эффективных количествах вводят связывающую молекулу согласно изобретению или связывающую DPP3 молекулу согласно изобретению, конкретно, антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3 или не-Ig скаффолд против DPP3. Согласно изобретению указанным пациентом является пациент, нуждающийся в регуляции и/или профилактике или нуждающийся в лечении окислительного стресса.

Фармацевтическая композиция

Еще одним предметом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая раскрытую в данном документе связывающую молекулу согласно изобретению или связывающую DPP3 молекулу, конкретно, содержащая антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3 или не-Ig скаффолд против DPP3 для применения с целью профилактики или лечения заболеваний или острых состояний пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная фармацевтическая композиция представляет собой раствор, предпочтительно готовый к использованию раствор.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная фармацевтическая композиция представляет собой раствор, предпочтительно готовый к использованию раствор, содержащий PBS при pH 7,4.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная фармацевтическая композиция находится в высушенном состоянии, которое нужно восстановить перед использованием.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная фармацевтическая композиция находится в лиофилизированном состоянии, которое нужно восстановить перед использованием.

Пути введения

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанную фармацевтическую композицию, которую следует использовать для профилактики и/или лечения заболевания или острого состояния пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом, вводят перорально, накожно, подкожно, внутрикожно, сублингвально, внутримышечно, внутриартериально, интрацеребрально, интрацеребровентрикулярно, внутривенно или посредством центральной нервной системы (ЦНС) или посредством внутрибрюшинного введения.

Набор

Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является набор или анализ, содержащий раскрытую в данном документе связывающую молекулу согласно изобретению или связывающую DPP3 молекулу, конкретно, содержащий антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3 или не-Ig скаффолд против DPP3 для применения с целью профилактики или лечения заболевания или острого состояния пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом.

Специфически связывающиеся антитела

Согласно изобретению «антитело против DPP3» представляет собой антитело, которое специфически связывается с DPP3, «фрагмент антитела против DPP3» представляет собой фрагмент указанного антитела против DPP3, при этом указанный фрагмент специфически связывается с DPP3. «Не-Ig скаффолд против DPP3» представляет собой не-Ig скаффолд, который специфически связывается с DPP3.

В контексте изобретения «специфическое связывание с DPP3» может также допускать связывание также с другими антигенами. Это означает, что эта специфичность не исключает, что связывающая молекула может перекрестно реагировать с другими белками или полипептидами или пептидами, которые содержат эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2, против которого связывающая молекула была взята. Это конкретно включает функциональные варианты DPP3, которые также содержат эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2. Это также относится к специфичности фрагмента антитела против DPP3 или не-Ig скаффолда против DPP3 согласно изобретению.

Антитело

«Антитело» согласно настоящему изобретению представляет собой белок, содержащий один или более полипептидов, по существу закодированных генами иммуноглобулина, который специфически связывает антиген. Распознанные гены иммуноглобулина включают гены константной области каппа, лямбда, альфа (IgA), гамма (IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄), дельта (IgD), эпсилон (IgE) и мю (IgM), а также множество генов вариабельной области иммуноглобулина. Полноразмерные легкие цепи иммуноглобулинов обычно составляют приблизительно 25 кДа или 214 аминокислот в длину.

Полноразмерные тяжелые цепи иммуноглобулинов обычно составляют приблизительно 50 кДа или 446 аминокислот в длину. Легкие цепи кодирует ген вариабельной области на NH₂-конце (приблизительно 110 аминокислот в длину) и ген константной области каппа или лямбда на COOH-конце. Тяжелые цепи аналогичным образом кодирует ген вариабельной области (приблизительно 116 аминокислот в длину) и один из других генов константной области.

Основной структурной единицей антитела обычно является тетрамер, который состоит из двух идентичных пар цепей иммуноглобулина, причем каждая пара имеет одну легкую и одну тяжелую цепь. В каждой паре вариабельные области легкой и тяжелой цепей связываются с антигеном, а константные области опосредуют эффекторные функции. Иммуноглобулины также существуют в множестве других форм, включая, например, Fv, Fab и F(ab')₂, а также бифункциональные гибридные антитела и одиночные цепи (например, Lanzavecchia et al. Eur. J. Immunol. 17:105,1987; Huston et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883, 1988; Bird et al. Science 242:423-426, 1988; Hood et al. Immunology, Benjamin, N.Y. 2nd ed. 1984; Hunkapiller and Hood, Nature 323:15-16,1986).

Вариабельная область легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина содержит каркасную область, прерываемую тремя гипервариабельными областями, также называемыми определяющие комплементарность области (CDR) (см. Sequences of Proteins of Immunological Interest, E. Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Services, 1983). Как отмечено выше, CDR главным образом отвечают за связывание с эпитопом антигена. Иммунный комплекс представляет собой антитело, такое как моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело, или функциональный фрагмент антитела, специфически связывающегося с антигеном.

«Химерные антитела» представляют собой антитела, гены легкой и тяжелой цепей которых были сконструированы, обычно путем генной инженерии, из генов вариабельной и константной областей иммуноглобулина, относящихся к разным видам. Например, вариабельные сегменты генов из мышиного моноклонального антитела можно соединить с человеческими константными сегментами, такими как каппа и гамма 1 или гамма 3. В одном примере терапевтическое химерное антитело, таким образом, представляет собой гибридный белок, состоящий из вариабельного или антигенсвязывающего домена из мышиного антитела и константного или эффекторного домена из человеческого антитела, хотя можно использовать другие виды млекопитающих, или вариабельную область можно получить с помощью молекулярных методик. Способы получения химерных антител хорошо известны в данной области, например, см. Патент США № 5807715. «Гуманизированный» иммуноглобулин представляет собой иммуноглобулин, содержащий человеческую каркасную область и одну или более CDR из нечеловеческого (например, мышиного, крысиного или синтетического) иммуноглобулина. Нечеловеческий иммуноглобулин, обеспечивающий CDR, называется «донор», а человеческий иммуноглобулин, обеспечивающий каркас, называется «акцептор».

В одном варианте осуществления изобретения все CDR происходит из донорского иммуноглобулина в гуманизированном иммуноглобулине. Константные области не обязательно должны присутствовать, но если они имеются, они должны быть по существу идентичны константным областям человеческого иммуноглобулина, то есть идентичны по меньшей мере приблизительно на 85-90%, например, приблизительно на 95% или более. Следовательно, все части гуманизированного иммуноглобулина, возможно, за исключением CDR, по существу идентичны соответствующим частям последовательностей натуральных человеческих иммуноглобулинов.

«Гуманизированное антитело» согласно изобретению представляет собой антитело, содержащее иммуноглобулин с гуманизированной легкой цепью и гуманизированной тяжелой цепью. Гуманизированное антитело связывается с тем же антигеном, что донорское антитело, которое обеспечивает CDR. Акцепторный каркас гуманизированного иммуноглобулина или антитела может иметь ограниченное количество заменителей аминокислот, взятых из донорского каркаса. Гуманизированные или другие моноклональные антитела могут иметь дополнительные консервативные замены аминокислот, которые по существу не оказывают влияния на связывание антигена или другие функции иммуноглобулина. Иллюстративными консервативными заменами являются такие замены, как gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; и phe, tyr. Гуманизированные иммуноглобулины можно сконструировать посредством генной инженерии (например, см. Патент США № 5585089). Человеческое антитело представляет собой антитело, в котором гены легкой и тяжелой цепей имеют человеческое происхождение. Человеческие антитела можно создавать, используя известные в данной области способы. Человеческие антитела можно получать путем иммортализации человеческих B-клеток, секретирующих интересующие антитела. Иммортализацию можно осуществлять, например, путем заражения EBV или путем слияния человеческих B-клеток с миеломными или гибридомными клетками для получения триомной клетки. Человеческие антитела также можно получать с помощью методов фагового дисплея (см. Например, Dower et al. PCT публикация № WO 91/17271; McCafferty et al. PCT публикация № WO 92/001047; и Winter, PCT публикация № WO 92/20791) или выбирать из комбинаторной библиотеки человеческих моноклональных антител (см. Morphosys website). Человеческие антитела также можно получать путем применения трансгенных животных, носителей человеческого гена иммуноглобулина (например, см. Lonberg et al. PCT публикация № WO 93/12227; и Kucherlapati, PCT публикация № WO 91/10741).

Таким образом, антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3 согласно изобретению могут иметь форматы, известные в данной области. Примерами являются, но без ограничения, человеческие антитела, моноклональные антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, антитела с привитой CDR или фрагменты антител.

Моноклональное антитело

В конкретном варианте осуществления изобретения антителом против DPP3 является моноклональное антитело или его фрагмент. В одном варианте осуществления изобретения антителом против DPP3 или фрагментом антитела против DPP3 является человеческое или гуманизированное антитело или полученное из них. В одном конкретном варианте осуществления одну или более (мышиных) CDR прививают в человеческое антитело или фрагмент антитела.

В предпочтительном варианте осуществления антителами согласно настоящему изобретению являются полученные рекомбинантно антитела, например, IgG, обычный полноразмерный иммуноглобулин, или фрагменты антител, содержащих по меньшей мере F-вариабельный домен тяжелой и/или легкой цепи, например, химически соединенные антитела (со связыванием фрагментов антиген), включая, но без ограничения Fab-фрагменты, включая Fab-миниантитела, одноцепочечное Fab-антитело, моновалентное Fab-антитело с метками эпитопов, например, Fab-V5Sx2; бивалентный Fab (миниантитело), димеризованное с доменом CH3; бивалентный Fab или многовалентный Fab, например, образованный посредством мультимеризации с помощью гетерологичного домена, например, посредством димеризации доменов dHLX, например, Fab-dHLX-FSx2; F(ab')2-фрагменты, scFv-фрагменты, мультимеризированные многовалентные и/или многоспецифические scFv-фрагменты, бивалентные и/или биспецифические диатела, BITE® (биспецифический рекрутер T-клеток), трифункциональные антитела, поливалентные антитела, например, из другого класса, чем G; однодоменные антитела, например, нанотела, полученные из верблюжьих или рыбьих иммуноглобулинов и множества других.

Не-Ig скаффолды

В дополнение к антителам против DPP3 или фрагментам антител против DPP3 в данной области хорошо известны другие биополимерные скаффолды, так называемые не-Ig скаффолды, которые образуют комплекс с молекулой-мишенью и которые используют для получения узкоспецифических к мишеням биополимеров. Примерами являются аптамеры, шпигельмеры, антикалины и конотоксины.

Не-Ig скаффолдами в контексте изобретения могут быть белковые скаффолды, которые можно использовать в качестве имитаторов антител, так как они способны связываться с лигандами или антигенами. Не-Ig скаффолды можно выбрать из группы, включающей не-Ig скаффолды на основе тетранектина (например, описанный в US 2010/0028995), фибронектиновые скаффолды (например, описанные в EP 1266 025; скаффолды на основе липокалина (например, описанные в WO 2011/154420); убиквитиновые скаффолды (например, описанные в WO 2011/073214), трансферриновые скаффолды (например, описанные в US 2004/0023334), белковые скаффолды (например, описанные в EP 2231860), скаффолды на основе анкириновых повторов (например, описанные в WO 2010/060748), микробелковые (предпочтительно микробелки, образующие цистиновый узел) скаффолды (например, описанные в EP 2314308), скаффолды на основе домена Fyn SH3 (например, описанные в WO 2011/023685), скаффолды на основе EGFR-A-домена (например, описанные в WO 2005/040229) и скаффолды на основе домена Kunitz (например, описанные в EP 1941867). Не-Ig скаффолды могут представлять собой пептидные или олигонуклеотидные аптамеры. Аптамеры обычно создают, отбирая их из большого пула случайных последовательностей, и они представляют собой либо короткие цепочки олигонуклеотидов (ДНК, РНК или XNA; Xu et al. 2010, Deng et al. 2014), либо короткие вариабельные пептидные домены, прикрепленные к белковому скаффолду (Li et al. 2011).

Фрагменты и белки слияния

В альтернативном варианте осуществления формат антитела против DPP3 выбирают из группы, включающей Fv-фрагмент, scFv-фрагмент, Fab-фрагмент, scFab-фрагмент, F(ab)₂-фрагмент и белок слияния scFv-Fc. В другом предпочтительном варианте осуществления формат антитела выбирают из группы, включающей scFab-фрагмент, Fab-фрагмент, scFv-фрагмент и их конъюгаты с оптимизированной биодоступностью, такие как пегилированные фрагменты.

Моноклональные/поликлональные антитела

В контексте изобретения термин «антитело» обычно включает в себя моноклональные и поликлональные антитела и их связывающие фрагменты, в частности Fc-фрагменты, а также так называемые «одноцепочечные антитела» (Bird et al. 1988), химерные, гуманизированные, в частности антитела с привитой CDR, и ди- или тетратела (Holliger et al. 1993). Также включены иммуноглобулиноподобные белки, которые выбирают с помощью методик, включая, например, фаговый дисплей, для специфического связывания с интересующей молекулой, содержащейся в образце. В этом контексте термин «специфическое связывание» относится к антителам, полученным из интересующей молекулы, или их фрагментам. Антитело считается специфическим, если его аффинность с интересующей молекулой или ее вышеупомянутым фрагментом по меньшей мере предпочтительно в 50 раз выше, более предпочтительно в 100 раз выше, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз выше, чем по отношению к другим молекулам, содержащимся в образце, содержащем интересующую молекулу. В данной области хорошо известно, как получать антитела и отбирать антитела с заданной специфичностью.

В конкретном варианте осуществления изобретения указанное антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3, связывающиеся с эпитопом согласно SEQ ID NO.: 2, при этом указанный эпитоп содержится в белке DPP3 или его функциональных производных, представляет собой моноклональное антитело или фрагмент моноклонального антитела. В одном варианте осуществления изобретения антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3, связывающиеся с эпитопом согласно SEQ ID NO.: 2, при этом указанный эпитоп содержится в белке DPP3 или его функциональных производных, представляет собой человеческое или гуманизированное антитело или полученный из них или гуманизированный фрагмент антитела.

В одном конкретном варианте осуществления одну или более (мышиных) CDR прививают в человеческое антитело или фрагмент антитела.

Модулирующее антитело против DPP3

В конкретном варианте осуществления указанная связывающая DPP3 молекула согласно изобретению, конкретно, указанное антитело против DPP3, фрагмент антитела против DPP3 или не-Ig скаффолд против DPP3, представляет собой модулирующую связывающую DPP3 молекулу, антитело против DPP3, фрагмент антитела против DPP3 или не-Ig скаффолд против DPP3.

Модулирующая связывающая DPP3 молекула, антитело против DPP3, фрагмент антитела против DPP3 или не-Ig скаффолд против DPP3 изобретения может действовать ингибирующим образом и может блокировать биоактивность DPP3 приблизительно до 100%, предпочтительно по меньшей мере более чем до 90%, более предпочтительно по меньшей мере до 80, или 70, или 60, или 50, или 40, или 30, или 20, или 10% при определении посредством описанного выше способа обнаружения и измерения ингибирования DPP3; то есть измерения влияния связывающей DPP3 молекулы на биоактивность DPP-3.

В другом конкретном варианте осуществления модулирующая связывающая DPP3 молекула, антитело против DPP3, фрагмент антитела против DPP3 или не-Ig скаффолд против DPP3 изобретения может действовать с повышающей регуляцией и, таким образом, может усиливать биоактивность DPP3 по меньшей мере до 50%, предпочтительно по меньшей мере более чем до 60%, более предпочтительно по меньшей мере более чем до 70%, более предпочтительно по меньшей мере более чем до 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере более чем до 90%, еще более so предпочтительно по меньшей мере до 95% при определении посредством описанного выше способа обнаружения и измерения ингибирования DPP3; то есть измерения влияния связывающей DPP3 молекулы на биоактивность DPP-3.

Синтез антител против DPP3

Антитела против DPP3 согласно настоящему изобретению можно синтезировать следующим образом:

Синтезировали пептиды DPP3 для иммунизации, см. Таблицу 3 ниже, (JPT Technologies, Berlin, Germany) с дополнительным N-концевым остатком цистеина (если в выбранной последовательности DPP3 цистеин отсутствует) для конъюгации пептидов с альбумином бычьей сыворотки (BSA). Пептиды ковалентно связывали с BSA с использованием связывающего геля Sulfolink (Perbio-science, Bonn, Germany). Процедуру соединения проводили согласно инструкции Perbio. Рекомбинантный GST-hDPP3 получали с помощью USBio.

Мышам Balb/c в 0 день внутрибрюшинно (i.p.) инъецировали 84 мкг GST-hDPP3 или 100 мкг конъюгатов DPP3-пептид-BSA (эмульсифицированных в адъюванте TiterMax Gold), на 14 день - 84 мкг или 100 мкг (эмульсифицированных в полном адъюванте Фрейнда), а на 21 и 28 день - 42 мкг или 50 мкг (в неполном адъюванте Фрейнда). На 49 день животное получало внутривенную (i.v.) инъекцию 42 мкг GST-hDPP3 или 50 мкг конъюгатов DPP3-пептид-BSA, растворенных в солевом растворе. Через три дня мышей умерщвляли, и проводили слияние иммунных клеток.

Спленоциты иммунизированных мышей и клетки клеточной линии SP2/0 миеломы сливали с 1 мл 50% полиэтиленгликоля в течение 30 с при 37°C. После промывания клетки высевали на 96-луночные планшеты для клеточных культур. Гибридные клоны отбирали путем выращивания на среде HAT [культуральной среде RPMI 1640, дополненной 20% фетальной телячьей сывороткой и дополненной HAT]. Через одну неделю среду HAT заменяли средой HT на три цикла с последующим возвратом к нормальной среде для клеточных культур.

Через две недели после слияния супернатанты клеточных культур первоначально скринировали на IgG антитела, связывающие рекомбинантный DPP3. Вследствие этого, рекомбинантный меченый GST DPP3 (USBiologicals, Salem, USA) иммобилизировали в 96-луночных планшетах (100 нг/лунку) и инкубировали с 50 мкл супернатанта клеточных культур на лунку в течение 2 часов при комнатной температуре. После промывания планшета добавляли 50 мкл/лунку POD-кроличьих антител против мышиного IgG и инкубировали в течение 1 ч при RT.

После следующего этапа промывания в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора хромогена (3,7 мМ o-фенилендиамин в буфере цитрат/гидрофосфат, 0,012% H₂O₂), инкубировали в течение 15 минут при RT, и хромогенную реакцию останавливали путем добавления 50 мкл 4N серной кислоты. Выявляли поглощение при 490 мм.

Положительные тестируемые микрокультуры переносили на 24-луночные планшеты для размножения. После повторного тестирования отобранные культуры клонировали и реклонировали с использованием метода предельного разведения, и определяли изотипы.

Антитела, возникающие против меченого GST DPP3 человека или DPP3-пептидов, получали с помощью стандартных способов получения антител (Marx et al. 1997) и очищали посредством белка A. На основе гель-электрофорезного анализа в присутствии додецилсульфата натрия чистота антител составляла ≥90%.

Гуманизация мышиных антител

Гуманизацию мышиных антител можно проводить согласно следующему методу:

Для гуманизации антитела мышиного происхождения последовательность антитела анализируют на структурное взаимодействие каркасных областей (FR) с определяющими комплементарность областями (CDR) и антигеном. На основе структурного моделирования выбирают подходящую FR человеческого происхождения, и в человеческую FR трансплантируют последовательности мышиных CDR. Для восстановления структурного взаимодействия, которое было уничтожено за счет переключения видов для последовательностей FR, можно вводить варианты в аминокислотной последовательности CDR или FR. Этого восстановления структурного взаимодействия можно добиться с помощью случайного подхода с использованием библиотек фагового дисплея или посредством направленного подхода, управляемого молекулярным моделированием (Almagro JC, Fransson J. 2008. Humanization of antibodies. Front Biosci. 2008 Jan 1;13:1619-33).

Антитела с привитыми CDR

В еще одном аспекте изобретения предметом является человеческое антитело против DPP3 с привитыми CDR или фрагмент антитела против DPP3, который направлен на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывается с ним, при этом указанный эпитоп содержится в белке DPP3 или его функциональных производных, и при этом указанное человеческое антитело против DPP3 с привитыми CDR или фрагмент антитела против DPP3 содержит вариабельную область тяжелой цепи (H цепи) антитела, содержащую:

SEQ ID NO.: 5

и/или дополнительно содержит вариабельную область легкой цепи (L цепи) антитела, содержащую:

SEQ ID NO.: 6.

Дополнительным предметом настоящего изобретения в еще одном аспекте является человеческое антитело против DPP3 с привитыми CDR или фрагмент антитела против DPP3, который направлен на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывается с ним, при этом указанный эпитоп содержится в белке DPP3 или его функциональных производных, и при этом указанное человеческое антитело против DPP3 с привитыми CDR или фрагмент антитела против DPP3 содержит вариабельную область тяжелой цепи (H цепи) антитела, содержащую:

SEQ ID NO.: 12

и/или дополнительно содержит вариабельную область легкой цепи (L цепи) антитела, содержащую:

SEQ ID NO.: 13.

В одном конкретном варианте осуществления изобретения предметом настоящего изобретения является человеческое моноклональное антитело против DPP3 или фрагмент моноклонального антитела против DPP3, который направлен на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывается с ним, при этом указанный эпитоп содержится в белке DPP3 или его функциональных производных, и при этом тяжелая цепь содержит по меньшей мере одну CDR из:

SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 8 или SEQ ID NO.: 9,

и при этом легкая цепь содержит по меньшей мере одну CDR из:

SEQ ID NO.: 8, KVS или SEQ ID NO.: 11.

С учетом приведенного выше контекста вариабельную область можно соединить с любым подклассом константных областей (IgG, IgM, IgE. IgA) или только скаффолды, Fab-фрагменты, Fv, Fab и F(ab)2. В примере 3 ниже использовали вариант мышиного антитела с остовом IgG2a. Для химеризации и гуманизации использовали остов человеческого IgG1κ.

Связывание Эпитопа

Для связывания эпитопа имеют значение только определяющие комплементарность области (CDR). CDR для тяжелой цепи и легкой цепи мышиного антитела против DPP3 согласно настоящему изобретению (AK1967) показаны в SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8 и SEQ ID NO. 9 для тяжелой цепи, а SEQ ID NO. 10, последовательность KVS и SEQ ID NO. 11 для легкой цепи, соответственно.

Участки связывания эпитопов

Согласно изобретению представленная в данном документе связывающая DPP3 молекула, конкретно, представленные в данном документе антитела против DPP3, фрагменты антител против DPP3 и не-Ig скаффолды против DPP3 направлены на SEQ ID NO.: 1 и связываются с ней, и при этом указанная связывающая DPP3 молекула, антитело против DPP3, фрагмент антитела против DPP3 и не-Ig скаффолд против DPP3 распознает и связывается по меньшей мере с тремя aa, предпочтительно по меньшей мере с 4 aa, более предпочтительно по меньшей мере с 5 aa, еще более предпочтительно по меньшей мере с 6 aa указанной SEQ ID NO.:1.

Согласно изобретению представленная в данном документе связывающая DPP3 молекула, конкретно, представленные в данном документе антитела против DPP3, фрагменты антител против DPP3 и не-Ig скаффолды против DPP3 направлены на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связываются с ним, при этом указанный эпитоп содержится в белке DPP3 или его функциональных производных, и при этом указанная связывающая DPP3 молекула, антитело против DPP3, фрагмент антитела против DPP3 и не-Ig скаффолд против DPP3 распознает и связывается по меньшей мере с тремя aa, предпочтительно по меньшей мере с 4 aa, более предпочтительно по меньшей мере с 5 aa, еще более предпочтительно по меньшей мере с 6 aa SEQ ID NO.: 2.

В еще одном аспекте изобретения представленная в данном документе связывающая DPP3 молекула, конкретно, представленные в данном документе антитела против DPP3, фрагменты антител против DPP3 и не-Ig скаффолды против DPP3 направлены на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 3 и связываются с ним, и при этом указанный эпитоп согласно SEQ ID NO.: 3 содержится в белке DPP3 или его функциональных производных, и при этом указанная связывающая DPP3 молекула, антитело против DPP3, фрагмент антитела против DPP3 и не-Ig скаффолд против DPP3 распознает и связывается по меньшей мере с тремя aa, предпочтительно по меньшей мере с 4 aa, более предпочтительно по меньшей мере с 5 aa, еще более предпочтительно с 6 aa SEQ ID NO.: 3.

В еще одном аспекте изобретения представленная в данном документе связывающая DPP3 молекула, конкретно, представленные в данном документе антитела против DPP3, фрагменты антител против DPP3 и не-Ig скаффолды против DPP3 направлены на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 4 и связываются с ним, и при этом указанный эпитоп согласно SEQ ID NO.: 4 содержится в белке DPP3 или его функциональных производных, и при этом указанная связывающая DPP3 молекула, антитело против DPP3, фрагмент антитела против DPP3 и не-Ig скаффолд против DPP3 распознает и связывается по меньшей мере с тремя aa, предпочтительно с четырьмя aa SEQ ID NO.: 4.

Ингибитор или эффектор биоактивности DPP3

В конкретном варианте осуществления изобретения представленная в данном документе связывающая DPP3 молекула, конкретно, представленные в данном документе антитела против DPP3, фрагменты антител против DPP3 и не-Ig скаффолды против DPP3, которые направлены на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связываются с ним, при этом указанный эпитоп содержится в белке DPP3 или его функциональных производных, могут выступать в качестве ингибитора или эффектора биоактивности DPP3.

Таким образом, представленная в данном документе связывающая DPP3 молекула, конкретно, представленные в данном документе антитела против DPP3, фрагменты антител против DPP3 и не-Ig скаффолды против DPP3, которые направлены на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связываются с ним, при этом указанный эпитоп содержится в белке DPP3 или его функциональных производных, полезны для профилактики или лечения заболевания или острого состояния у пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом согласно изобретению.

Аффинность

В конкретном варианте осуществления изобретения представленная в данном документе связывающая DPP3 молекула, конкретно, представленные в данном документе антитела против DPP3, фрагменты антител против DPP3 и не-Ig скаффолды против DPP3, которые направлены на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связываются с ним, при этом указанный эпитоп содержится в белке DPP3 или его функциональных производных, демонстрируют аффинность с DPP3 таким образом, что константа аффинности составляет по меньшей мере 10^-7 M^-1, предпочтительно по меньшей мере 10^-8 M^-1, более предпочтительно константа аффинности составляет по меньшей мере 10^-9 M^-1, наиболее предпочтительном константа аффинности составляет по меньшей мере 10^-10 M^-1 при определении посредством способов измерения аффинности связывания связывающей DPP3 молекулы согласно изобретению с эпитопом согласно последовательности SEQ ID NO.: 2, как описано выше.

Таким образом, специалисту в данной области известно, что можно рассматривать возможность компенсации пониженной аффинности путем применения повышенной дозы связывающей молекулы; например, антитела против DPP3 или фрагмента антитела против DPP3 или не-Ig скаффолда против DPP3, и эта мера не приведет к выходу за границы изобретения.

Комбинации лекарственных веществ

В другом варианте осуществления изобретения представленная в данном документе связывающая DPP3 молекула, конкретно, представленное в данном документе антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3 или не-Ig скаффолд против DPP3 можно использовать в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным лекарственным веществом, которые в качестве побочного эффекта вызывает окислительный стресс.

Такие лекарственные вещества вводят в качестве основного лекарственного препарата для применения с целью профилактики или лечения первичного заболевания, и их можно выбрать из группы, включающей противомикробные средства, наподобие антибиотиков (например, стрептомицин, гентамицин) или противовирусные средства (например, ацикловир, фоскарнет) или противогрибковые средства (например, амфотецерин B), анальгетики, нестероидные противовоспалительные лекарственные вещества (НПВП) (например, ибупрофен, напроксен), мочегонные средства, ингибиторы протонной помпы, химиотерапевтические вещества (например, цисплатин), контрастные красители, сердечно-сосудистые средства, наподобие ингибиторов АПФ или статинов, антидепрессанты, иммуносупрессанты (например, циклоспорин A) и антигистаминные средства. Таким образом и согласно изобретению представленная в данном документе связывающая DPP3 молекула, конкретно, представленное в данном документе антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3 или не-Ig скаффолд против DPP3, связывающиеся с DPP3, можно использовать в качестве дополнительного лекарственного препарата либо в комбинации, либо в качестве отдельного лекарственного вещества для профилактики или лечения вызванной окислительным стрессом и приобретенной токсичности в качестве вторичного заболевания.

Селективная/специфическая связывающая молекула

В предпочтительном варианте осуществления изобретения представленная в данном документе связывающая DPP3 молекула является фармацевтически приемлемой, селективной и/или специфической для эпитопа согласно SEQ ID NO.: 2, который содержится в белке DPP3 или его функциональных производных.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения представленная в данном документе связывающая DPP3 молекула является ингибирующей связывающей молекулой, которая является фармацевтически приемлемой, селективной и/или специфической для эпитопа согласно SEQ ID NO.: 2, который содержится в белке DPP3 или его функциональных производных.

В одном аспекте изобретения селективные и специфические ингибиторы DPP3 не связываются с другими белками/пептидами/ферментами или связываются другими белками/пептидами/ферментами, и не ингибируют любой другой фермент/протеазу/пептидазу, не являющиеся DPP3. Вследствие этого, предпочтительные ингибиторы биоактивности DPP3 в контексте изобретения представляют собой специфические антитела против DPP3, фрагменты антител или не-Ig скаффолды, связывающиеся с DPP3.

Моноспецифическое антитело

Моноспецифическое антитело против DPP3 или фрагмент моноспецифического антитела против DPP3 или не-Ig моноспецифический скаффолд против DPP3 в контексте изобретения означает, что указанное антитело или фрагмент антитела или не-Ig скаффолд специфически связывается с одной конкретной областью, содержащей по меньшей мере 3 аминокислоты, предпочтительно по меньшей мере 4 aa внутри мишени DPP3.

В контексте изобретения моноспецифическое антитело против DPP3 или фрагмент моноспецифического антитела против DPP3 или не-Ig моноспецифический скаффолд против DPP3 представляют собой антитела против DPP3 или фрагменты антител против DPP3 или не-Ig скаффолды против DPP3, которые все имеют аффинность с тем же антигеном, что и мишень, которая согласно изобретению представляет собой эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2, который содержится в белке DPP3 или его функциональных производных.

В другом конкретном варианте осуществления моноспецифическое антитело против DPP3 или фрагмент моноспецифического антитела против DPP3 или не-Ig моноспецифический скаффолд против DPP3 представляют собой антитела против DPP3 или фрагменты антител против DPP3 или не-Ig скаффолды против DPP3, которые все имеют аффинность с тем же антигеном, что и мишень, которая согласно изобретению представляет собой эпитоп согласно SEQ ID NO.: 3, который содержится в белке DPP3 или его функциональных производных.

В другом варианте осуществления моноспецифическое антитело против DPP3 или фрагмент моноспецифического антитела против DPP3 или не-Ig моноспецифический скаффолд против DPP3 представляют собой антитела против DPP3 или фрагменты антител против DPP3 или не-Ig скаффолды против DPP3, которые все имеют аффинность с тем же антигеном, что и мишень, которая согласно изобретению представляет собой эпитоп согласно SEQ ID NO.: 4, который содержится в белке DPP3 или его функциональных производных.

Моноспецифические антитела также можно вырабатывать иным образом, чем вырабатывая их в обычной зародышевой клетке.

С учетом приведенного выше контекста дополнительные предпочтительные варианты осуществления в рамках настоящего изобретения последовательно пронумерованы ниже:

1. Связывающая молекула, направленная на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывающаяся с ним, и при этом указанная связывающая молекула распознает и связывается по меньшей мере с тремя аминокислотами SEQ ID NO.: 2, и при этом указанный эпитоп содержится в SEQ ID NO.: 1, которая соответсвует аминокислотной последовательности DPP3.

2. Связывающая молекула согласно варианту осуществления 1, направленная на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывающаяся с ним, при этом указанная связывающая молекула направлена на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 3 и связывается с ним, и при этом указанная связывающая молекула распознает и связывается по меньшей мере с тремя аминокислотами SEQ ID NO.: 3, и при этом указанный эпитоп содержится в SEQ ID NO.: 1, которая соответсвует аминокислотной последовательности DPP3.

3. Связывающая молекула согласно варианту осуществления 1 или варианту осуществления 2, направленная на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывающаяся с ним, при этом указанная связывающая молекула направлена на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 4 и связывается с ним, и при этом указанная связывающая молекула распознает и связывается по меньшей мере с тремя аминокислотами SEQ ID NO.: 4, и при этом указанный эпитоп содержится в SEQ ID NO.: 1, которая соответсвует аминокислотной последовательности DPP3.

4. Связывающая молекула по любому из вариантов осуществления 1-3, направленная на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывающаяся с ним, при этом указанную связывающую молекулу выбирают из группы, включающей антитело или фрагмент антитела или не-Ig скаффолд, и при этом указанный эпитоп содержится в SEQ ID NO.: 1, которая соответсвует аминокислотной последовательности DPP3.

5. Связывающая молекула по любому из предыдущих вариантов осуществления, направленная на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывающаяся с ним, при этом указанной связывающей молекулой является связывающая дипептидилпептидазу-3 (DPP3) молекула, направленная на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывающаяся с ним, при этом указанный эпитоп содержится в белке DPP3 или его функциональных производных, и при этом указанная связывающая DPP3 молекула распознает и связывается по меньшей мере с тремя аминокислотами SEQ ID NO.: 2.

6. Связывающая молекула по любому из предыдущих вариантов осуществления, направленная на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывающаяся с ним, при этом указанной связывающей молекулой является моноклональное антитело или фрагмент моноклонального антитела, и при этом определяющие комплементарность области (CDR) в тяжелой цепи содержат последовательности:

SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 8 и/или SEQ ID NO.: 9,

а определяющие комплементарность области в легкой цепи содержат последовательности:

SEQ ID NO.: 10, KVS и/или SEQ ID NO.: 11.

7. Связывающая молекула по любому из предыдущих вариантов осуществления, направленная на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывающаяся с ним, при этом указанной связывающей молекулой является человеческое моноклональное антитело или фрагмент человеческого моноклонального антитела, при этом тяжелая цепь содержит последовательность:

SEQ ID NO.: 12

и при этом легкая цепь содержит последовательность:

SEQ ID NO.: 13.

8. Связывающая молекула по любому из предыдущих вариантов осуществления, направленная на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывающаяся с ним, для применения с целью профилактики или лечения заболеваний или острых состояний у пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом.

9. Связывающая молекула согласно варианту осуществления 8, направленная на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывающаяся с ним, для применения с целью профилактики или лечения заболеваний или острых состояний у пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом, при этом указанные заболевания выбирают из группы, включающей нейродегенеративные заболевания, метаболический синдром, сердечно-сосудистые заболевания, аутоиммунные заболевания, воспалительные болезни легких, болезни почек, болезни печени, болезни органов пищеварения, вирусные инфекционные заболевания, рак, воспаление, сепсис, септический шок и SIRS.

10. Связывающая молекула согласно варианту осуществления 8 или 9, направленная на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывающаяся с ним, для применения с целью профилактики или лечения заболеваний или острых состояний у пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом, и при этом указанные:

нейродегенеративное заболевание можно выбрать из группы, включающей болезнь Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона (PD), болезнь Хантингтона (HD), боковой амиотрофический склероз (ALS) и рассеянный склероз (MS)),

метаболический синдром можно выбрать из группы, включающей инсулинорезистентность, ожирение, гипергликемию, дислипидемию, гипертонию и диабет,

сердечно-сосудистые заболевание можно выбрать из группы, включающей атеросклероз, гипертонию, сердечную недостаточность, ишемическую болезнь сердца, церебральное ишемическое поражение, инсульт и инфаркт миокарда,

аутоиммунное заболевание можно выбрать из группы, включающей ревматоидный артрит, системную красную волчанку,

воспалительное заболевание легких можно выбрать из группы, включающей COPD, астму,

заболевание почек можно выбрать из группы, включающей острое поражение почек (AKI), хроническое заболевание почек (CKD), диабетическую нефропатию, терминальную почечную недостаточность (ESRD),

заболевание печени можно выбрать из группы, включающей вирусный гепатит и цирроз,

заболевание пищеварительного тракта можно выбрать из группы, включающей воспалительное заболевание кишечника, например, язвенный колит, болезнь Крона, гастрит, панкреатит и язвенную болезнь желудка и 12-перстной кишки,

вирусное инфекционное заболевание можно выбрать из группы, включающей гемоконтактный вирусный гепатит (B, C и D), вирус иммунодефицита человека (HIV), грипп A, вирус Эпштейна-Барра, респираторно-синцитиальный вирус,

рак можно выбрать из группы, включающей рак предстательной железы, рак молочной железы, рак легких, колоректальный рак, рак мочевого пузыря, рак яичников, рак кожи, рак желудка, рак печени,

воспаление,

сепсис, септический шок, SIRS.

11. Связывающая молекула по любому из вариантов осуществления 8-10, направленная на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывающаяся с ним, для применения с целью профилактики или лечения заболеваний или острых состояний у пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом, при этом указанное заболевание выбирают из группы, включающей сепсис, септический шок и SIRS.

12. Связывающая молекула согласно варианту осуществления 8, направленная на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывающаяся с ним, для применения с целью профилактики или лечения заболеваний или острых состояний у пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом, при этом указанное острое состояние выбирают из группы, включающей нефротоксичность и гепатотоксичность.

13. Связывающая молекула по любому из вариантов осуществления 8-12, направленная на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывающаяся с ним, для применения с целью профилактики или лечения заболеваний или острых состояний у пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом, при этом связывающая молекула представляет собой антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3 или не-Ig скаффолд против DPP3, связывающиеся с эпитопом согласно SEQ ID NO.: 2, и при этом указанный эпитоп содержится в белке DPP3 или его функциональных производных, и при этом указанное антитело против DPP3 или фрагмент антитела против DPP3 или не-Ig скаффолд против DPP3 демонстрирует аффинность связывания с DPP3 по меньшей мере 10^-7 M.

14. Связывающая молекула по любому из вариантов осуществления 8 и 12, направленная на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывающаяся с ним, для применения с целью профилактики или лечения заболеваний или острых состояний у пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом, при этом указанным острым состоянием является гепатотоксичность, которая представляет собой лекарственную или алкогольную гепатотоксичность.

15. Связывающая молекула согласно варианту осуществления 8, направленная на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывающаяся с ним, для применения с целью профилактики или лечения заболеваний или острых состояний у пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом, при этом указанным острым состоянием является нефротоксичность, которая представляет собой лекарственную нефротоксичность.

16. Связывающая молекула по любому из вариантов осуществления 8-11, направленная на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывающаяся с ним, для применения с целью профилактики или лечения заболеваний или острых состояний у пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом, при этом указанное заболевание связано с окислительным стрессом в миокарде.

17. Фармацевтическая композиция, содержащая связывающую молекулу по любому из вариантов осуществления 1-7 для применения с целью профилактики или лечения заболевания или острого состояния пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом.

18. Набор, содержащий связывающую молекулу по любому из вариантов осуществления 1-16.

19. Связывающая молекула, направленная на белок DPP3 и связывающаяся с ним или его функциональными производными, для применения с целью профилактики или лечения заболеваний или острых состояний у пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом.

20. Связывающая молекула согласно варианту осуществления 19 для применения с целью профилактики или лечения заболеваний или острых состояний у пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом, при этом указанные заболевания выбирают из группы, включающей нейродегенеративные заболевания, метаболический синдром, сердечно-сосудистые заболевания, аутоиммунные заболевания, воспалительные болезни легких, болезни почек, болезни печени, болезни органов пищеварения, вирусные инфекционные заболевания, рак, воспаление, сепсис, септический шок и SIRS.

21. Связывающая молекула по любому из вариантов осуществления 19 или 20 для применения с целью профилактики или лечения заболеваний или острых состояний у пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом, и при этом указанные:

нейродегенеративное заболевание можно выбрать из группы, включающей болезнь Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона (PD), болезнь Хантингтона (HD), боковой амиотрофический склероз (ALS) и рассеянный склероз (MS)),

метаболический синдром можно выбрать из группы, включающей инсулинорезистентность, ожирение, гипергликемию, дислипидемию, гипертонию и диабет,

сердечно-сосудистые заболевание можно выбрать из группы, включающей атеросклероз, гипертонию, сердечную недостаточность, ишемическую болезнь сердца, церебральное ишемическое поражение, инсульт и инфаркт миокарда,

аутоиммунное заболевание можно выбрать из группы, включающей ревматоидный артрит, системную красную волчанку,

воспалительное заболевание легких можно выбрать из группы, включающей COPD, астму,

заболевание почек можно выбрать из группы, включающей острое поражение почек (AKI), хроническое заболевание почек (CKD), диабетическую нефропатию, терминальную почечную недостаточность (ESRD),

заболевание печени можно выбрать из группы, включающей вирусный гепатит и цирроз,

заболевание пищеварительного тракта можно выбрать из группы, включающей воспалительное заболевание кишечника, например, язвенный колит, болезнь Крона, гастрит, панкреатит и язвенную болезнь желудка и 12-перстной кишки,

вирусное инфекционное заболевание можно выбрать из группы, включающей гемоконтактный вирусный гепатит (B, C и D), вирус иммунодефицита человека (HIV), грипп A, вирус Эпштейна-Барра, респираторно-синцитиальный вирус,

рак можно выбрать из группы, включающей рак предстательной железы, рак молочной железы, рак легких, колоректальный рак, рак мочевого пузыря, рак яичников, рак кожи, рак желудка, рак печени,

воспаление,

сепсис, септический шок, SIRS.

22. Связывающая молекула по любому из вариантов осуществления 19-21, при этом указанная связывающая молекула направлена на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывается с ним, и при этом указанная связывающая молекула распознает и связывается по меньшей мере с тремя аминокислотами SEQ ID NO.: 2.

23. Связывающая молекула по любому из вариантов осуществления 19-22, при этом указанная связывающая молекула направлена на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 3 и связывается с ним, и при этом указанная связывающая молекула распознает и связывается по меньшей мере с тремя аминокислотами SEQ ID NO.: 3.

24. Связывающая молекула по любому из вариантов осуществления 19-23, при этом указанная связывающая молекула направлена на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 4 и связывается с ним, и при этом указанная связывающая DPP3 молекула распознает и связывается по меньшей мере с тремя аминокислотами SEQ ID NO.: 4.

25. Связывающая молекула по любому из вариантов осуществления 19-24, при этом указанную связывающую молекулу выбирают из группы, включающей антитело или фрагмент антитела или не-Ig скаффолд.

26. Связывающая молекула по любому из вариантов осуществления 19-25, при этом указанной связывающей молекулой является моноклональное антитело или фрагмент моноклонального антитела, и при этом определяющие комплементарность области (CDR) в тяжелой цепи содержат последовательности:

SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 8 и/или SEQ ID NO.: 9,

а определяющие комплементарность области в легкой цепи содержат последовательности:

SEQ ID NO.: 10, KVS и/или SEQ ID NO.: 11.

27. Связывающая молекула по любому из вариантов осуществления 19-26, при этом указанной связывающей молекулой является гуманизированное моноклональное антитело или фрагмент гуманизированного моноклонального антитела, при этом тяжелая цепь содержит последовательность:

SEQ ID NO.: 12,

и при этом легкая цепь содержит последовательность:

SEQ ID NO.: 13.

28. Связывающая молекула по любому из вариантов осуществления 19-27, при этом указанной связывающей молекулой является связывающая дипептидилпептидазу-3 (DPP3) молекула, направленная на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывающаяся с ним, при этом указанный эпитоп содержится в белке DPP3 или его функциональных производных, и при этом указанная связывающая DPP3 молекула распознает и связывается по меньшей мере с тремя аминокислотами SEQ ID NO.: 2.

Определения

согласно изобретению «связывающая DPP3 молекула» направлена на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывается с ним, при этом указанный эпитоп содержится в белке DPP3 или его функциональных производных, и при этом указанная связывающая DPP3 молекула распознает и связывается по меньшей мере с тремя aa SEQ ID NO.: 2 или c их соответствующей субпоследовательностью согласно SEQ ID NO'S.: 3 или 4.

Согласно изобретению связывающей DPP3 молекулой предпочтительно является антитело против DPP3, или фрагмент антитела против DPP3, или не-Ig скаффолд против DPP3, направленные на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 2 и связывающиеся с ним, при этом указанный эпитоп содержится в белке DPP3 или его функциональных производных, и при этом указанная связывающая DPP3 молекула распознает и связывается по меньшей мере с тремя aa SEQ ID NO.: 2 или с их соответствующей субпоследовательностью согласно SEQ ID NO.: 3 или 4.

В контексте изобретения «функциональное производное» белка DPP3 означает пептид, полипептид или белок, который отличается от последовательности SEQ ID NO.: 1 посредством делеции aa, добавления aa или замены конкретных aa, но сохраняет биоактивность и функцию нативного белка DPP3. Таким образом, вследствие модификации SEQ ID NO.: 1 на биоактивность и функцию можно до определенной степени влиять, но ферментативная протеазная реакция, катализируемая DDP 3, все-таки сохраняется при анализе с помощью подходящего анализа биоактивности, который описан выше или обычно известного специалисту.

Специалисту в данной области должно быть понятно, что антитело против дипептидилпептидазы-3 (DPP3) или фрагмент антитела против DPP3 или не-Ig скаффолд против DPP3 являются синонимами антитела против дипептидилпептидазы-3 (DPP3) или фрагмента антитела против дипептидилпептидазы-3 или не-Ig скаффолда против DPP3 и означает антитело против дипептидилпептидазы-3 (DPP3) или фрагмент антитела против дипептидилпептидазы-3 или не-Ig скаффолд против DPP3, связывающиеся с DPP3, соответственно.

По всему тексту термин «антитело» обычно включает моноклональные и поликлональные антитела и их связывающие фрагменты, в частности Fc-фрагменты, а также так называемые «одноцепочечные антитела» (Bird et al. 1988), химерные, гуманизированные, в частности антитела с привитой CDR, и ди- или тетратела (Holliger et al. 1993). Также включены иммуноглобулиноподобные белки, которые выбирают с помощью методов, включая, например, фаговый дисплей для специфического связывания с интересующей молекулой, содержащейся в образце.

В этом контексте термин «специфическое связывание» относится к антителам, вырабатываемым против интересующей молекулы или их фрагментам. Антитело считается специфическим, если его аффинность с интересующей молекулой или ее вышеупомянутыми фрагментами по меньшей мере предпочтительно в 50 раз выше, более предпочтительно в 100 раз выше, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз выше чем по отношению к другим молекулам, содержащимся в образце, содержащем интересующую молекулу. В данной области хорошо известно, как получать антитела и отбирать антитела с заданной специфичностью.

«Заболевания, связанные с окислительным стрессом», в контексте настоящего изобретения включают, но без ограничения, нейродегенеративные заболевания, метаболический синдром, сердечно-сосудистые заболевания, аутоиммунные заболевания, воспалительные болезни легких, болезни почек, болезни печени, болезни органов пищеварения, вирусные инфекционные заболевания, рак и воспаление, сепсис, септический шок, SIRS.

В контексте настоящего изобретения нейродегенеративные заболевания включают болезнь Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона (PD), болезнь Хантингтона (HD), боковой амиотрофический склероз (ALS) и рассеянный склероз (MS).

В контексте настоящего изобретения метаболический синдром включает инсулинорезистентность, ожирение, гипергликемию, дислипидемию, гипертонию и диабет.

В контексте настоящего изобретения сердечно-сосудистые заболевания включают атеросклероз, гипертонию, сердечную недостаточность, ишемическую болезнь сердца, церебральное ишемическое поражение/инсульт и инфаркт миокарда.

В контексте настоящего изобретения аутоиммунные заболевания включают ревматоидный артрит и системную красную волчанку.

В контексте настоящего изобретения воспалительные болезни легких включают COPD и астму.

В контексте настоящего изобретения болезни почек включают нефротоксичность (лекарственную болезнь почек), острое поражение почек (AKI), хроническое заболевание почек (CKD), диабетическую нефропатию и терминальную почечную недостаточность (ESRD).

В контексте настоящего изобретения болезни печени включают гепатотоксичность, вирусный гепатит, цирроз.

В контексте настоящего изобретения болезни органов пищеварения включают воспалительное заболевание кишечника, например, язвенный колит, болезнь Крона; гастрит, панкреатит и язвенную болезнь. В этом контексте вирусные инфекционные заболевания включают гемоконтактный вирусный гепатит (B, C и D), вирус иммунодефицита человека (HIV), грипп A, вирус Эпштейна-Барра и респираторно-синцитиальный вирус.

В контексте настоящего изобретения рак включает рак предстательной железы, рак молочной железы, рак легких, колоректальный рак, рак мочевого пузыря, рак яичников, рак кожи, рак желудка и рак печени.

«Острое состояние, связанное с окислительным стрессом», в контексте настоящего изобретения обозначает симптомы, которые появляются и изменяются или быстро ухудшаются вследствие возникновения окислительного стресса. Острое состояние, связанное с окислительным стрессом, наступает внезапно. Если не лечить, острое состояние, связанное с окислительным стрессом, может приводить к хроническому синдрому.

В отличие от этого, «хроническое состояние» или «хронический синдром», соответственно, в контексте настоящего изобретения обозначает состояние или симптом, который развивается и ухудшается в течение продолжительного периода времени, и может быть постоянным, даже при лечении.

«Окислительный стресс» отражает дисбаланс между системным проявлением активных форм кислорода (ROS)/активных форм азота (RNS) и антиоксидантами в пользу избыточного образования свободных радикалов. Этот процесс ведет к окислению биомолекул с последующей потерей их биологических функций и/или гомеостатическому дисбалансу, проявлением которых является возможное окислительное повреждение клеток и тканей. Накопление ROS/RNS может приводить к ряду вредных ээфектов, таких как перикисное окисление липидов, окисление белков и повреждение ДНК (включая повреждение оснований и разрывы нитей). Кроме того, некоторые активные окислительные формы выступают в качестве клеточных посредников при передаче сигналов окисления-восстановления. Таким образом, окислительный стресс может вызывать разрушения нормальных механизмов клеточной передачи сигналов.

«Свободный радикал в контексте настоящего изобретения представляет собой молекулу с одним или более непарными электронами в ее наружной оболочке. Свободные радикалы образуются из молекул за счет разрыва химической связи таким образом, что каждый фрагмент содержит один электрон, за счет расщепления радикала с образованием еще одного радикала, а также посредством окислительно-восстановительных реакций. Свободные радикалы, относящиеся к окислительному стрессу, включают гидроксил (OH•), супероксид (O₂•ˉ), оксид азота (NO•), диоксид азота (NO₂•), пероксил (ROO•) и липидный пероксил (LOO•). Также, пероксид водорода (H₂O₂), озон (O₃), синглетный кислород (1O2), гипохлористая кислота (HOCl), азотистая кислота (HNO₂), пероксинитрит (ONOOˉ), азотистый ангидрид (N₂O₃), липидный пероксид (LOOH), не являются свободными радикалами и обычно называются оксиданты, но могут легко приводить к реакции свободно-радикального присоединения в живых организмах.

«Основной лекарственный препарат» означает лекарственный препарат, которые действует против первопричины указанного заболевания или состояния.

«Дополнительный лекарственный препарат» означает лекарственный препарат, который улучшает состояние пациента поддерживающим образом; например, снижает или регулирует окислительный стресс, обусловленный введением основного лекарственного препарата.

В контексте изобретения обычно «биоактивность» определяют как влияние, которое оказывает вещество на живой организм или ткань или орган или функциональную единицу in vivo или in vitro (например, в анализе) после их взаимодействия.

В этом смысле и конкретно в контексте изобретения биоактивность DPP3 можно определить как ферментативную активность DPP3 или регулирующую активность DPP3 на пути окислительного стресса.

Примеры

1. Пример 1

Образование антител и определение способности связывания DPP3: получали несколько мышиных антител, которые скринировали по их способности связывать человеческий DPP3 в анализе специфического связывания (см. Таблицу 3).

1.1. Способы:

- Пептиды/конъюгаты для иммунизации:

Синтезировали пептиды DPP3 для иммунизации, см. Таблицу 3, (JPT Technologies, Berlin, Germany) с дополнительным N-концевым остатком цистеина (если в выбранной последовательности DPP3 цистеин отсутствует) для конъюгации пептидов с альбумином бычьей сыворотки (BSA). Пептиды ковалентно связывали с BSA с использованием связывающего геля Sulfolink (Perbio-science, Bonn, Germany). Процедуру соединения проводили согласно инструкции Perbio. Рекомбинантный GST-hDPP3 получали с помощью USBio (United States Biological, Salem, MA, USA).

- Иммунизация мышей, слияние и скрининг иммунных клеток:

Мышам Balb/c в 0 день внутрибрюшинно (i.p.) инъецировали 84 мкг GST-hDPP3 или 100 мкг конъюгатов DPP3-пептид-BSA (эмульсифицированных в адъюванте TiterMax Gold), на 14 день - 84 мкг или 100 мкг (эмульсифицированных в полном адъюванте Фрейнда), а на 21 и 28 день - 42 мкг или 50 мкг (в неполном адъюванте Фрейнда). На 49 день животное получало внутривенную (i.v.) инъекцию 42 мкг GST-hDPP3 или 50 мкг конъюгатов DPP3-пептид-BSA, растворенных в солевом растворе. Через три дня мышей умерщвляли, и проводили слияние иммунных клеток.

Спленоциты иммунизированных мышей и клетки клеточной линии SP2/0 миеломы сливали с 1 мл 50% полиэтиленгликоля в течение 30 с при 37°C. После промывания клетки высевали на 96-луночные планшеты для клеточных культур. Гибридные клоны отбирали путем выращивания на среде HAT [культуральной среде RPMI 1640, дополненной 20% фетальной телячьей сывороткой и дополненной HAT]. Через одну неделю среду HAT заменяли средой HT на три цикла с последующим возвратом к нормальной среде для клеточных культур.

Через две недели после слияния супернатанты клеточных культур первоначально скринировали на IgG антитела, связывающие рекомбинантный DPP3. Вследствие этого, рекомбинантный меченый GST hDPP3 (USBiologicals, Salem, USA) иммобилизировали в 96-луночных планшетах (100 нг/лунку) и инкубировали с 50 мкл супернатанта клеточных культур на лунку в течение 2 часов при комнатной температуре. После промывания планшета добавляли 50 мкл/лунку POD-кроличьих антител против мышиного IgG и инкубировали в течение 1 ч при RT. После следующего этапа промывания в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора хромогена (3,7 мМ o-фенилендиамин в буфере цитрат/гидрофосфат, 0,012% H₂O₂), инкубировали в течение 15 минут при RT, и хромогенную реакцию останавливали путем добавления 50 мкл 4N серной кислоты. Выявляли поглощение при 490 мм. Положительные тестируемые микрокультуры переносили на 24-луночные планшеты для размножения. После повторного тестирования отобранные культуры клонировали и реклонировали с использованием метода предельного разведения, и определяли изотипы.

- Получение мышиных моноклональных антител

Антитела, возникающие против меченого GST DPP3 человека или DPP3-пептидов, получали с помощью стандартных способов получения антител (Marx et al. 1997) и очищали посредством белка A. На основе гель-электрофорезного анализа в присутствии додецилсульфата натрия чистота антител составляла ≥90%.

- Получение характеристики антител - связывание с hDPP3 и/или иммунизирующим пептидом

Для анализа способности связывания DPP3/иммунизирующего пептида разными антителами и клонами антител проводили анализ связывания:

а) Твердофазный

Рекомбинантный меченый GST hDPP3 (SEQ ID NO. 1) или пептид DPP3 (иммунизирующий пептид, SEQ ID NO. 2) иммобилизировали на поверхности микротитровального планшета с высокой степенью связывания (96-луночные полистирольные микропланшеты, Greiner Bio-One international AG, Austria, 1 мкг/лунку в связывающем буфере [50 мМ Tris, 100 мМ NaCl, pH 7,8], 1ч при RT). После блокирования 5% бычьим сывороточным альбумином микропланшеты сушили в вакууме.

b) Метод нанесения метки (меченого вещества)

100 мкг (100 мкл) разных антител против DPP3 (детекторное антитело, 1 мг/мл в PBS, pH 7,4) смешивали с 10 мкл сложного эфира NHS акринидия (1 мг/мл в ацетонитриле, InVent GmbH, Germany; EP 0 353 971) и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Меченое антитело против DPP3 очищали с помощью гельфильтрационной HPLC на Shodex Protein 5 мкм KW-803 (Showa Denko, Japan). Очищенное меченое антитело разбавляли аналитическим буфером (калий фосфат 50 ммоль/л, NaCl 100 ммоль/л, Na₂-EDTA 10 ммоль/л, бычий сывороточный альбумин 5 г/л, мышиный IgG 1 г/л, бычий IgG 1 г/л, амастатин 50 мкмоль/л, лейпептин 100 мкмоль/л, pH 7,4). Итоговая концентрация составляла приблизительно 5-7*10⁶ относительных световых единиц (RLU) меченого соединения (приблизительно 20 нг меченого антитела) на 200 мкл. хемилюминесценцию сложного эфира акридия измеряли с использованием люминометра Centro LB 960 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG).

С) Анализ связывания hDPP3

Планшеты заполняли 200 мкл меченого и разбавленного детекторного антитела (меченого вещества) и инкубировали в течение 2-4 ч при 2-8°С. Несвязанное меченое вещество удаляли путем промывания 4 раза 350 мкл раствора для промывания (20 мМ PBS, pH 7,4, 0,1% Triton X-100). Хемилюминесценцию для хорошего связывания измеряли с использованием люминометра Centro LB 960 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG).

- Получение характеристики антител - анализ ингибирования hDPP3

Для анализа способности ингибирования DPP3 разными антителами и клонами антител проводили анализ активности DPP3 с помощью известного метода (Jones et al. 1982). Рекомбинантный меченый GST hDPP3 разбавляли аналитическим буфером (25 нг/мл GST-DPP3 в 50 мМ Tris-HCl, pH 7,5 и 100 мкм ZnCl₂), и 200 мкл этого раствора инкубировали с 10 мкг соответствующего антитела при комнатной температуре. Через 1 час предварительной инкубации в раствор добавляли флуорогенный субстрат Arg-Arg-βNA (20 мкл, 2 мМ), и отслеживали образование свободного βNA с течением времени с использованием микропланшетного флуорометра Twinkle LB 970 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG) при 37°С. Флуоресценцию βNA обнаруживали по возбуждению при 340 нм и путем измерения излучения при 410 нм. Вычисляли уклоны (в RFU/мин) увеличения флуоресценции разных образцов. Уклон GST-hDPP3 с буферным контролем принимают за 100% активность. Ингибирующую способность возможной захватывающей связывающей молекулы определяли в процентах, как снижение активности GST-hDPP3 за счет инкубации с указанной захватывающей связывающей молекулой.

1.2. Результаты:

В следующей таблице представлен отбор полученных антител и нормы их связывания в относительных световых единицах (RLU), а также их относительная ингибирующая способность (%; таблица 3). Моноклональные антитела, вырабатываемые против приведенных ниже частей DPP3, отбирали по их способности связывать рекомбинантный DPP3 и/или иммунизирующий пептид, а также по их ингибирующему потенциалу.

Все антитела, вырабатываемые против меченой GST полноразмерной формы рекомбинантного hDPP3, демонстрируют сильное связывание с иммобилизированным меченым GST hDPP3. Также антитела, вырабатываемые против пептида SEQ ID 2,связываются с GST-hDPP3. Антитела SEQ ID 2 также сильно связываются с иммунизирующим пептидом. Получена более подробная характеристика этих антител (см. Пример 2). Моноклональное антитело AK1967 со способностью ингибировать активность DPP3 на 70% выбрали в качестве возможного терапевтического антитела, а также использовали в качестве матрицы для химеризации и гуманизации.

Таблица 3: список антител, вырабатываемых против полноразмерного или последовательностей hDPP3, и их способность связывать hDPP3 (SEQ ID NO. 1) или иммунизирующий пептид (SEQ ID NO. 2) в RLU, а также максимальное ингибирование рекомбинантного GST-hDPP3.

2. Пример 2

Получали более подробную характеристику антител, вырабатываемых против SEQ ID NO. 2 (картирование эпитопов, аффинность связывания, специфичность, ингибирующий потенциал). В виде примера в данном документе показаны результаты для клона 1967 SEQ ID NO. 2 («AK1967»).

2.1. Способы:

- Определение эпитопа AK1967 на DPP3:

Для картирования эпитопа AK1967 синтезировали ряд N- или C-концевых биотинилированных пептидов (peptides&elephants GmbH, Hennigsdorf, Germany). Эти пептиды содержат последовательность полного иммунизирующего пептида (SEQ ID NO. 2) или его фрагментов с поэтапным удалением одной аминокислоты либо на C-, либо на N-конце (см. Таблицу 5 для полного списка пептидов).

а) Твердофазный

96-луночные планшеты с высокой степенью связывания покрывали 2 мкг авидина на лунку (Greiner Bio-One international AG, Austria) в связывающем буфере (500 мМ Tris-HCl, pH 7,8, 100 мМ NaCl). После этого планшеты промывали и заполняли конкретными растворами биотинилированных пептидов (10 нг/лунку; буфер - 1xPBS с 0,5% BSA)

b) Метод нанесения метки (меченого вещества)

Антитело против DPP3 AK1967 метили хемилюминесцентной меткой согласно примеру 1.

С) Анализ связывания пептидов

Планшеты заполняли 200 мкл меченого и разбавленного детекторного антитела (меченого вещества) и инкубировали в течение 4 ч при комнатной температуре. Несвязанное меченое вещество удаляли путем промывания 4 раза 350 мкл раствора для промывания (20 мМ PBS, pH 7,4, 0,1% Triton X-100). Хемилюминесценцию для хорошего связывания измеряли с использованием люминометра Centro LB 960 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG). Связывание AK1967 с соответствующими пептидами определяли путем оценки относительных световых единиц (RLU). любой пептид, который демонстрирует значительно более высокий RLU сигнал, чем при неспецифическом связывании AK1967, определяли как связывающую AK1967 молекулу. комбинаторный анализ связывающих и не связывающих пептидов выявил специфический для DPP3 эпитоп AK1967.

- Определение аффинности связывания с использованием Octet:

Эксперимент проводили с использованием Octet Red96 (ForteBio). AK1967 улавливали на биосенсорах кинетического класса антител против человеческих Fc (AHC). Загруженные биосенсоры затем погружали в серию растворов рекомбинантного меченого GST DPP3 человека (100, 33,3, 11,1, 3,7 нм). В течение 120 секунд наблюдали ассоциацию с последующим 180 секундами диссоциации. В таблице 4 показаны буферы, используемые для эксперимента. Кинетический анализ проводили с использованием модели связывания 1:1 и общего выравнивания.

Таблица 4: Буферы, использованные для измерения на Octet

- анализ Western Blot специфичности связывания AK1967:

Клетки крови из человеческой EDTA-крови промывали (3x в PBS), разбавляли в PBS и лизировали с помощью повторяющихся циклов замораживания-оттаивания. Лизат клеток крови имел концентрацию общего белка 250 мкг/мл и концентрация DPP3 10 мкг/мл. Разбавления лизата клеток крови (1:40, 1:80, 1:160 и 1:320) и очищенного рекомбинантного человеческого His-DPP3 (31,25-500 нг/мл) подвергали SDS-PAGE и Western Blot. Блоты инкубировали в 1.) блокирующем буфере (1xPBS-T с 5% сухим обезжиренным молоком), 2.) растворе первичных антител (AK1967 1:2000 в блокирующем буфере) и 3.) меченых HRP вторичных антителах (козьих антителах против мышиного IgG, 1:1000 в блокирующем буфере). Связанное вторичное антитело обнаруживали с использованием реагента для выявления Amersham ECL Western Blotting и Amersham Imager 600 UV (оба от GE Healthcare).

- анализ ингибирования DPP3:

Для анализа способности AK1967 ингибировать DPP3 проводили анализ активности DPP3 с помощью известного метода (Jones et al. 1982). Рекомбинантный меченый GST hDPP3 разбавляли аналитическим буфером (25 нг/мл GST-DPP3 в 50 мМ Tris-HCl, pH 7,5), и добавляли увеличивающиеся концентрации AK1967. В раствор добавляли флуорогенный субстрат Arg-Arg-βNA, и отслеживали образование свободных βNA с течением времени с использованием микропланшетного флуорометра Twinkle LB 970 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG) при 37°С. Флуоресценцию βNA обнаруживали по возбуждению при 340 нм и путем измерения излучения при 410 нм. Вычисляли уклоны (в RFU/мин) повышения флуоресценции разных образцов. уклон GST-hDPP3 с буферным контролем принимали за 100% активность. Ингибирующую способность AK1967 определяли как снижение в процентах активности GST-hDPP3 с помощью инкубации с указанным антителом. Полученная пониженная активность DPP3 показана на кривой ингибирования на фиг. 1C.

2.2. Результаты:

- Картирование эпитопов:

Анализ пептидов, с которыми AK1967 связывается и не связывается, для выявления последовательности DPP3 INPETG (SEQ ID NO. 3) в качестве эпитопа, необходимого для связывания AK1967 (см. Таблицу 5).

Таблица 5: пептиды, используемые для картирования эпитопа AK1967

- аффинность связывания:

AK1967 связывается с аффинностью 2,2*10^-9 M с рекомбинантным GST-hDPP3 (более подробно см. В таблице 6, а кинетические кривые см. На фиг. 1A).

Таблица 6: Кинетические Константы измерений аффинности AK1967

- Специфичность:

Единственным белком, выявленным с помощью AK1967 в качестве первичного антитела в лизате клеток крови, был DPP3 при 80 кДа (фиг. 1B). Общая концентрация белка лизата была 250 мкг/мл, тогда как оценочная концентрация DPP3 составляла приблизительно 10 мкг/мл. Даже если в лизате имеется в 25 раз больше неспецифического белка, AK1967 связывает и обнаруживает конкретно DPP3, а другое неспецифическое связывание не происходит.

- Ингибирующий потенциал:

AK1967 ингибирует 15 нг/мл DPP3 в конкретном анализе активности DPP3 с IC50 приблизительно 15 нг/мл (фиг. 1C).

3. Пример 3

Модель септического шока использовали, чтобы вызвать сердечную недостаточность у крыс, а затем получить характеристику влияния AK1967 на окислительный стресс в миокарде.

3.1. Способы:

- Дизайн Исследования

Ход исследования представлен на фиг. 2A ниже. После CLP или имитирующего хирургического вмешательства животным давали отдых в течение 20 часов со свободным доступом к воде и пище. После этого их анестезировали, проводили трахеотомию и устанавливали артериальные и венозные катетеры. Через 24 часа после хирургического вмешательства CLP вводили 2 мг/кг либо AK1967, либо среды (солевого раствора). В качестве меры безопасности инвазивно и постоянно отслеживали гемодинамику с t=0 до 3 ч.

- CLP модель септического шока

Самцов крыс Wistar (2-3 месяца, 300-400 г, размер группы указан в таблице 7) из центра d'élevage Janvier (France) случайным образом распределяли в одну из трех групп. Всех животных анестезировали с использованием кетамина гидрохлорида (90 мг/кг) и ксилазина (9 мг/кг) внутрибрюшинно (i.p.). Чтобы вызвать полимикробный сепсис, проводили лигирование и пункцию слепой кишки (CLP) с использованием протокола Риттирша с незначительной модификацией. Делали вентральный срединный разрез (1,5 см), чтобы обеспечить экстериоризацию слепой кишки. Затем слепую кишку лигировали непосредственно под илеоцекальным клапаном и один раз прокалывали иглой 18-го калибра. Затем брюшную полость закрывали двумя слоями с последующей инфузионной реанимацией (3 мл/100 г тела по весу физиологического раствора, инъецируемого подкожно), и животное возвращали в свою клетку. Имитирующих животных подвергали хирургическому вмешательству без прокола слепой кишки.

- Временные точки эксперимента и группы животных

В момент времени t=0 (исходный уровень) у всех животных CLP был септический шок и развивалось снижение функции сердца (низкое кровяное давление, низкая фракция укорочения). В этой временной точке инъецировали AK1967 (2 мг/кг) или среду (солевой раствор) (i.v.), и начинали инфузию солевого раствора. Была 1 контрольная группа и 2 группы CLP, которые приведены в таблице ниже (таблица 7). В конце эксперимента животных умерщвляли, а органы (например, сердце) собирали для следующего анализа.

Таблица 7: список экспериментальных групп

- Нанесение метки DHE ROS в миокарде

Использовали окрашивание дигидроэтидием (DHE; Sigma-Aldrich) для оценки in situ уровней супероксиданиона в миокарде. Сердечные криостатные срезы (7 мкм) желудочков инкубировали с DHE (37 мкм) в течение 30 мин в темной влажной камере. Получение флуоресцентных изображений бромистого этидия с помощью флуоресцентного микроскопа Leica проводили в идентичных условиях независимо от блока ткани. Окрашенную площадь измеряли с помощью программного обеспечения IPLab и выражали в процентах от интересующей площади (%ROI).

3.2. Результаты:

У крыс с сердечной недостаточностью, вызванной септическим шоком после хирургического вмешательства CLP, развивались большие количества активных форм кислорода (ROS) в миокарде, тогда как у животных с имитацией операции окислительный стресс почти не наблюдался (фиг. 2B и C). Лечение больных (CLP) животных с помощью AK1967 снижает уровни окислительного стресса в миокарде до уровней здоровых животных (с имитацией операции). Это сильное снижение ROS достигается только через 3 часа после лечения (фиг. 2B и C).

Ссылки

Abramić, M. et al., 2000. Human and rat dipeptidyl peptidase III: Biochemical and mass spectrometric arguments for similarities and differences. Biological Chemistry, 381(December), pp. 1233-1243.

Abramić, M., Zubanović, M. & Vitale, L., 1988. Dipeptidyl peptidase III from human erythrocytes. Biol Chem Hoppe Seyler, pp. 29-38.

Adamczyk B. et al. 2016. New Insights into the Role of Oxidative Stress Mechanisms in

the Pathophysiology and Treatment of Multiple Sclerosis. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, Vol. 2016, pp. 1-18, DOI: 10.1155/2016/1973834"

Agić, D. et al., 2007. Novel amidino-substituted benzimidazoles: Synthesis of compounds and inhibition of dipeptidyl peptidase III. Bioorganic Chemistry, 35(2), pp. 153-169.

Almagro JC, Fransson J., 2008. Humanization of antibodies. Front Biosci. 2008 Jan 1; 13:1619-33.

Aoyagi, T. et al., 1993. Enzymatic Changes in Cerebrospinal Fluid of Patients with Alzheimer-Type Dementia. J Clin Biochem Nutr, 14, pp. 133-139.

Balogun, R.A. et al., 2010. Clinical applications of therapeutic apheresis. Journal of clinical apheresis, 25(5), pp. 250-64.

Baršun, M. et al., 2007. Human dipeptidyl peptidase III acts as a post-proline-cleaving enzyme on endomorphins. Biological Chemistry, 388(3), pp. 343-348.

Bhattacharyya A. et al. 2014. Oxidative stress: An essential factor in pathogenesis of gastrointestinal mucosal diseases. Physio.l Rev. 94, pp. 329-354.

Bird et al., 1988. Single-chain antigen-binding proteins. Science 242:423-426.

Chen H. et al. 2011. Oxidative Stress in Ischemic Brain Damage: Mechanisms of Cell Death and Potential Molecular Targets for Neuroprotection. Antioxidants and redox signaling, 14, pp. 1505-1517.

Chen, W. et al., 2009. Direct interaction between Nrf2 and p21Cip1/WAF1 upregulates the Nrf2-mediated antioxidant response. Mol Cell., 34(6), pp. 663-673.

Chiba, T. et al., 2003. Inhibition of recombinant dipeptidyl peptidase III by synthetic hemorphin-like peptides. Peptides, 24(5), pp. 773-778.

Couston, R.G. et al., Adsorption behavior of a human monoclonal antibody at hydrophilic and hydrophobic surfaces. mAbs, 5(1), pp. 126-39.

Deavall, D. G. et al., 2012. Drug-induced oxidative stress and toxicity. J Toxicol, pp. 645460.

Deng, B. et al., 2014. Aptamer binding assays for proteins: The thrombin example-A review. Analytica Chimica Acta, 837, pp. 1-15.

Dhanda, S., Singh, J. & Singh, H., 2008. Hydrolysis of various bioactive peptides by goat brain dipeptidylpeptidase-III homologue. Cell biochemistry and function, 26(3), pp. 339-45.

Elahi M. M. et al. 2009. Oxidative stress as a mediator of cardiovascular disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2:5, pp. 259-269.

Ellis, S. & Nuenke, J.M., 1967. Dipeptidyl Arylamidase III of the Pituitary: Purification and Characterization. Journal of Biological Chemistry, 242(20), pp. 4623-4629.

Gamrekelashvili, J. et al., 2013. Peptidases released by necrotic cells control CD8+T cell cross-priming. journal of clinical investigation, 123(11), pp. 4755-4768.

Hartley et al, 1982. Radiology 143: 29-36

Hast B. E. et al., 2013. Proteomic analysis of ubiquitin ligase KEAP1 reveals associated proteins that inhibit NRF2 ubiquitination. Cancer Res., 73(7), pp. 2199-2210.

Hast B. E. et al., 2014. Cancer-Derived Mutations in KEAP1 Impair NRF2 Degradation but not Ubiquitination. Molecular and Cellular Pathobiology. Cancer research, 74 (3), pp. 808-817.

Holguin F. 2013. Oxidative Stress in Airway Diseases. Ann. Am. Thorac. Soc., Vol 10, Supplement, pp. S150-S157.

Holliger P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-8

Hood et al., Immunology, Benjamin, N.Y., 2nd ed., 1984

Hori M. et al. 2009, Oxidative stress and left ventricular remodelling after myocardial infarction. Cardivascular research, 81, pp. 457-464.

Hosohata K. 2016. Role of Oxidative Stress in Drug-Induced Kidney Injury. International Journal of Molecular Sciences, 17, pp. 1826-1836.

Hultschig C et al., Curr Opin Chem Biol. 2006 February; 10(1):4-10. PMID: 16376134)

Hunkapiller & Hood, 1986. The growing immunoglobulin gene superfamily. Nature 323:15-16.

Hust, M., Meyer, T., Voedisch, B., Rülker, T., Thie, H., El-Ghezal, A., Kirsch, M.I., Schütte, M., Helmsing, S., Meier, D., Schirrmann, T., Dübel, S., 2011. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. Journal of Biotechnology 152, 159-170

Huston et al., 1988. Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:5879-5883.

Hutcheson R. et al. The Metabolic Syndrome, Oxidative Stress, Environment, and Cardiovascular Disease: The Great Exploration. Experimental Diabetes Research, Vol. 2012, Article ID 271028.

Igic, R. & Behnia, R., 2007. Pharmacological, immunological, and gene targeting of the renin-angiotensin system for treatment of cardiovascular disease. Current pharmaceutical design, 13(12), pp. 1199-214.

Inaoka, Y. & Naruto, S., 1988. Propioxatins A and B, New Enkephalinase B Inhibitors, IV. Characterization of the Active Site of the Enzyme Using Synthetic Propioxatin Analogues. J. Biochem, 104(5), pp. 706-711.

Ivanov A. V. et al. 2017. Oxidative Stress in Infection and Consequent Disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, Vol. 2017, Article ID 3496043.

Ivanov A. V. et al. 2017. Oxidative stress, a trigger of hepatitis C and B virus-induced liver carcinogenesis. Oncotarget, 8, pp. 3895-3932.

Jones, T.H. & Kapralou, A, 1982. A rapid assay for dipeptidyl aminopeptidase III in human erythrocytes. Analytical biochemistry, 119(2), pp. 418-23.

Kabat et al., 1983. Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services.

Kaymak C. et al. 2011. Reactive Oxygen Species (Ros) Generation in Sepsis. FABAD J. Pharm. Sci., 36, pp. 41-47.

Khaket, T.P. et al., 2012. Enkephalin degrading enzymes: metalloproteases with high potential for drug development. Current pharmaceutical design, 18(2), pp. 220-30.

Khandrika L. et al. 2009. Role of Oxidative Stress in Prostate Cancer. Cancer Lett., 282(2), pp. 125-136.

Kim, D. & Herr, A.E., 2013. Protein immobilization techniques for microfluidic assays. Biomicrofluidics, 7(4), p.41501.Kirk-Othmer, Encyclopedia of chemical technology, 4th ed., executive editor, J. I. Kroschwitz; editor, M. Howe-Grant, John Wiley & Sons, 1993, vol. 15, p. 518-562

Kruk J. et al. 2017. Reactive Oxygen and Nitrogen Species in Carcinogenesis: Implications of Oxidative Stress on the Progression and Development of Several Cancer Types. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 17, pp. 904-919.

Kumar, P. et al., 2016. Substrate complexes of human dipeptidyl peptidase III reveal the mechanism of enzyme inhibition. Scientific Reports, 6(March), p. 23787.

Lanzavecchia, A. & Scheidegger, D., 1987. The use of hybrid hybridomas to target human cytotoxic T lymphocytes, Eur. J. Immunol. 17:105.

Lee, C.M. & Snyder, S.H., 1982. Dipeptidyl-aminopeptidase III of rat brain. Selective affinity for enkephalin and angiotensin. The Journal of biological chemistry, 257(20), pp. 12043-50.

Li S. et al. 2015. The Role of Oxidative Stress and Antioxidants in Liver Diseases. International Journal of Molecular Sciences, 16, pp. 26087-26124.

Li, J. et al., 2011. Peptide aptamers with biological and therapeutic applications. Current medicinal chemistry, 18(27), pp. 4215-22.

Liu Z. et al. 2017. Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases: From Molecular Mechanisms to Clinical Applications. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, Vol. 2017, Article ID 2525967.

Liu, Y. et al., 2007. A genomic screen for activators of the antioxidant response element. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104(12), pp. 5205-10.

Lu K. et al., 2017. NRF2 induction supporting breast cancer cell survival is enabled by oxidative stress-induced DPP3-KEAP2 interaction. OnlineFirst; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-16-2204.

Ma Q. et al., Role of Nrf2 in Oxidative Stress and Toxicity. Annu Rev Pharmacol Toxicol., 53, pp. 401-426.

Ma Y. et al. 2013, Relation between Gastric Cancer and Protein Oxidation, DNA Damage, and Lipid Peroxidation. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, Vol. 2013, Article ID 543760.

Marx et al., 1997. Monoclonal Antibody Production, ATLA 25, 121.

Mazzocco, C. et al., 2006. Identification and characterization of two dipeptidyl-peptidase III isoforms in Drosophila melanogaster. FEBS Journal, 273(5), pp. 1056-1064.

Meliopoulos, V.A. et al., 2012. MicroRNA regulation of human protease genes essential for influenza virus replication. PloS one, 7(5), p.e37169.

Müller, J. et al., 2012. Monitoring of plasma levels of activated protein C using a clinically applicable oligonucleotide-based enzyme capture assay. Journal of Thrombosis and Haemostasis, 10(3), pp. 390-398.

Müller, J. et al., 2016. Aptamer-Based Enzyme Capture Assay for Measurement of Plasma Thrombin Levels. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 1380, pp. 179-89.

Narendhirakannan R. T. et al., 2012. Oxidative Stress and Skin Cancer: An Overview. Ind. J. Clin. Biochem., 28, pp. 110-115.

Nourazarian A. R. et al., 2014. Roles of Oxidative Stress in the Development and Progression of Breast Cancer. Asian Pac. J. Cancer Prev., 15 (12), pp. 4745-4751

Ohkubo, I. et al., 1999. Dipeptidyl peptidase III from rat liver cytosol: purification, molecular cloning and immunohistochemical localization. Biological chemistry, 380(12), pp. 1421-1430.

Patel, A., Smith, H.J. & Sewell, R.D., 1993. Inhibitors of enkephalin-degrading enzymes as potential therapeutic agents. Progress in medicinal chemistry, 30, pp. 327-78.

Perl A. 2013. Oxidative stress in the pathology and treatment of systemic lupus erythematosus. Nat. Rev. Rheumatol., 9(11), pp. 674-686.

Perse M., 2013. Oxidative Stress in the Pathogenesis of Colorectal Cancer: Cause or Consequence?. BioMed Research International, Vol. 2013, Article ID 725710.

Pham-Huy et al. 2008. Free Radicals, Antioxidants in Disease and Health. Int. J. Biomed. Sci., 4 (2), pp. 89-96.

Pinheiro Da Silva, F. & Nizet, V., 2009. Cell death during sepsis: Integration of disintegration in the inflammatory response to overwhelming infection. Apoptosis, 14(4), pp. 509-521.

Pitocco et al. 2013. Oxidative Stress in Diabetes: Implications for Vascular and Other Complications. Int. J. Mol. Sci., 14, pp. 21525-21550.

Pohanka M. 2013. Role of oxidative stress in infectious diseases. A review. Folia Microbiol., 58, pp. 503-513.

Prajapati, S.C. & Chauhan, S.S., 2011. Dipeptidyl peptidase III: a multifaceted oligopeptide N-end cutter. FEBS Journal, 278(18), pp. 3256-3276.

2016, Oxidative Stress Relevance in the Pathogenesis of the Rheumatoid Arthritis: A Systematic Review. BioMed Research International Volume 2016, Article ID 6097417.

Raghupathi, R., 2004. Cell death mechanisms following traumatic brain injury. Brain pathology (Zurich, Switzerland), 14(2), pp. 215-22.

Rastija, V. et al., 2015. Synthesis, QSAR, and Molecular Dynamics Simulation of Amidino-substituted Benzimidazoles as Dipeptidyl Peptidase III Inhibitors. Acta Chimica Slovenica, 62, pp. 867-878.

Rittirsch, D., Huber-Lang, M., Flierl, M. Ward, P.: Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and punc-ture, Nature Protocols 4, - 31-36 (2009)

Rodrigo R. et al., 2013. Oxidative Stress and Pathophysiology of Ischemic Stroke: Novel Therapeutic Opportunities. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets, DOI: 10.2174/1871527311312050015.

Romanillos, G. et al. EP 2949332 A2

Saed G. M. et al., 2017. Updates of the role of oxidative stress in the pathogenesis of ovarian cancer. Gynecologic Oncology, 145, pp. 595-602.

Sanderink, G.J., Artur, Y. & Siest, G., 1988. Human aminopeptidases: a review of the literature. Journal of clinical chemistry and clinical biochemistry. Zeitschrift fur klinische Chemie und klinische Biochemie, 26(12), pp. 795-807.

Sawicka E. et al. 2015. The role of oxidative stress in bladder cancer, Postepy Hig Med Dosw, 69, pp. 744-752.

Schütte, M., Thullier, P., Pelat, T., Wezler, X., Rosenstock, P., Hinz, D., Kirsch, M.I.,Hasenberg, M., Frank, R., Schirrmann, T., Gunzer, M., Hust, M., Dübel, S., 2009. Identification of a putative Crf splice variant and generation of recombinant antibodies for the specific detection of Aspergillus fumigatus. PLoS One 4, e6625

Schwarz K. B. 1996, Oxidative stress during viral infection. Free Radical Biology & Medicine, 21, No. 5, pp. 641-649.

Shimamori, Y., Watanabe, Y. & Fujimoto, Y., 1986. Purification and Characterization of Dipeptidyl Aminopeptidase III from Human Placenta. Chem. Pharm. Bull., 34(8), pp. 3333-3340.

Šimaga, Š. et al., 1998. Dipeptidyl peptidase III in malignant and non-malignant gynaecological tissue. European Journal of Cancer, 34(3), pp. 399-405.

Šimaga, Š. et al., 2003. Tumor cytosol dipeptidyl peptidase III activity is increased with histological aggressiveness of ovarian primary carcinomas. Gynecologic Oncology, 91(1), pp. 194-200.

Singh, R. et al., 2014. Transcription factor C/EBP-beta mediates downregulation of dipeptidyl-peptidase III expression by interleukin-6 in human glioblastoma cells. FEBS Journal, 281, pp. 1629-1641.

Sobocanec et al., 2015. The role of 17β-estradiol in the regulation of antioxidant enzymes via the Nrf2-Keap1 pathway in the livers of CBA/H mice. Life Sciences, 130, pp. 57-65

Sobocanec et al., 2016. Prominent role of exopeptidase DPP III in estrogen-mediated protection against hyperoxia in vivo. Redox Biology, 8, pp. 49-159

Sosa et al. 2013. Oxidative stress and cancer: An overview. Ageing Research Reviews, 12, pp. 376- 390.

Sureshbabu A. 2015. Oxidative stress and autophagy: Crucial modulators of kidney injury. Redox Biology, 4, pp. 208-214.

Tian T. et al. 2017. Pathomechanisms of Oxidative Stress in Inflammatory Bowel Disease and Potential Antioxidant Therapies. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, Vol. 2017, Article ID 4535194.

Ullah A. et al. 2015. Diabetes mellitus and oxidative stress--A concise review. Saudi Pharmaceutical Journal, 24, pp. 547-553.

Vairappan B. 2015. Endothelial dysfunction in cirrhosis: Role of inflammation and oxidative stress. World Journal of Hepatology, 7 (3), pp. 443-459.

Valavanidis A. et al. 2013, Pulmonary Oxidative Stress, Inflammation and Cancer: Respirable Particulate Matter, Fibrous Dusts and Ozone as Major Causes of Lung Carcinogenesis through Reactive Oxygen Species Mechanisms. Int. J. Environ. Res. Public Health, 10, pp. 3886-3907.

Vandenberg, I., King, F. & Kuchel, P., 1985. Enkephalin Degradation by Human Erythrocytes and Hemolysates Studied Using 1H NMR Spectroscopy. Archives of Biochemistry and Biophysics, 242(2), pp. 515-522.

Vanha-Perttula, T., 1988. Dipeptidyl peptidase III and alanyl aminopeptidase in the human seminal plasma: origin and biochemical properties. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry, 177(2), pp. 179-95.

Volonte, D. et al., 2013. Inhibition of nuclear factor-erythoid 2-related factor (Nrf2) by caveolin-2 promotes stress-induced premature senescence. Molecular Biology of the Cell, 24, pp. 1852-1862.

Wang Z. et al., 2016. Oxidative Stress and Liver Cancer: Etiology and Therapeutic Targets. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, Vol. 2016, Article ID: 7891574.

Wattiaux, R. et al., 2007. Lysosomes and Fas-mediated liver cell death. The Biochemical journal, 403(1), pp. 89-95.

Wild, David (2005). The Immunoassay Handbook, Elsevier LTD, Oxford; 3rd ed., ISBN-13: 978-0080445267

Xu, Y., Yang, X. & Wang, E., 2010. Review: Aptamers in microfluidic chips. Analytica chimica acta, 683(1), pp. 12-20.

Yamamoto, Y. et al., 1998. Inhibitory action of spinorphin, an endogenous regulator of enkephalin-degrading enzymes, on carrageenan-induced polymorphonuclear neutrophil accumulation in mouse air-pouches. Life sciences, 62(19), pp. 1767-73.

Yamamoto, Y. et al., 2000. Characterization of tynorphin, a potent endogenous inhibitor of dipeptidyl peptidaseIII. Peptides, 21(4), pp. 503-8.

Zong, W.-X. & Thompson, C.B., 2006. Necrotic Cell Death as a Cell Fate. Genes & Development, 20, pp. 1-5.

Zuk et al., Enzyme Immunochromatography--A Quantitative Immunoassay Requiring No Instrumentation, Clinical Chemistry, 31 (7): 1144-1150 (1985)

Список последовательностей

SEQ ID NO. 1 - hDPP3 aa 1-737

MADTQYILPNDIGVSSLDCREAFRLLSPTERLYAYHLSRAAWYGGLAVLLQTSPEAPYIYALLSRLFRAQDPDQLRQHALAEGLTEEEYQAFLVYAAGVYSNMGNYKSFGDTKFVPNLPKEKLERVILGSEAAQQHPEEVRGLWQTCGELMFSLEPRLRHLGLGKEGITTYFSGNCTMEDAKLAQDFLDSQNLSAYNTRLFKEVDGEGKPYYEVRLASVLGSEPSLDSEVTSKLKSYEFRGSPFQVTRGDYAPILQKVVEQLEKAKAYAANSHQGQMLAQYIESFTQGSIEAHKRGSRFWIQDKGPIVESYIGFIESYRDPFGSRGEFEGFVAVVNKAMSAKFERLVASAEQLLKELPWPPTFEKDKFLTPDFTSLDVLTFAGSGIPAGINIPNYDDLRQTEGFKNVSLGNVLAVAYATQREKLTFLEEDDKDLYILWKGPSFDVQVGLHELLGHGSGKLFVQDEKGAFNFDQETVINPETGEQIQSWYRSGETWDSKFSTIASSYEECRAESVGLYLCLHPQVLEIFGFEGADAEDVIYVNWLNMVRAGLLALEFYTPEAFNWRQAHMQARFVILRVLLEAGEGLVTITPTTGSDGRPDARVRLDRSKIRSVGKPALERFLRRLQVLKSTGDVAGGRALYEGYATVTDAPPECFLTLRDTVLLRKESRKLIVQPNTRLEGSDVQLLEYEASAAGLIRSFSERFPEDGPELEEILTQLATADARFWKGPSEAPSGQA

SEQ ID NO. 2 - hDPP3 aa 474-493 (N-Cys) - иммунизационный пептид с дополнительным цистеином на N-конце

CETVINPETGEQIQSWYRSGE

SEQ ID NO. 3 - hDPP3 aa 477-482 - эпитоп AK1967

INPETG

SEQ ID NO. 4 - hDPP3 aa 480-483

ETGE

SEQ ID NO. 5 - вариабельная область мышиного AK1967 в тяжелой цепи

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMSVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWNDNKSYNPALKSRLTISRDTSNNQVFLKIASVVTADTGTYFCARNYSYDYWGQGTTLTVSS

SEQ ID NO. 6 - вариабельная область мышиного AK1967 в легкой цепи

DVVVTQTPLSLSVSLGDPASISCRSSRSLVHSIGSTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIK

SEQ ID NO. 7 - CDR1 мышиного AK1967 в тяжелой цепи

GFSLSTSGMS

SEQ ID NO. 8 - CDR2 мышиного AK1967 в тяжелой цепи

IWWNDNK

SEQ ID NO. 9 - CDR 3 мышиного AK1967 в тяжелой цепи

ARNYSYDY

SEQ ID NO. 10 - CDR1 мышиного AK1967 в легкой цепи

RSLVHSIGSTY

CDR2 мышиного AK1967 в легкой цепи

KVS

SEQ ID NO. 11 - CDR3 мышиного AK1967 в легкой цепи

SQSTHVPWT

SEQ ID NO. 12 - гуманизированное AK1967 - последовательность тяжелой цепи (остов IgG1κ)

MDPKGSLSWRILLFLSLAFELSYGQITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMSVGWIRQPPGKALEWLAHIWWNDNKSYNPALKSRLTITRDTSKNQVVLTMTNMDPVDTGTYYCARNYSYDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

SEQ ID NO. 13 - гуманизированное AK1967 - последовательность легкой цепи (остов IgG1κ)

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSRSLVHSIGSTYLYWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Краткое описание чертежей

Фиг. 1: получение характеристики AK1967

(А) Кривая ассоциации и диссоциации анализа связывания AK1967-DPP3 с использованием Octet. Биодатчики с загруженными AK1967 погружали в серию разбавленных растворов рекомбинантного меченого GST DPP3 человека (100, 33,3, 11,1, 3,7 нм), и отслеживали ассоциацию и диссоциацию.

(В) Western Blot разбавлений лизата клеток крови и обнаружение DPP3 с AK1967 в качестве первичного антитела.

(С) Кривая ингибирования нативного DPP3 из клеток крови с ингибирующим антителом AK1967. Ингибирование DPP3 с помощью специфического антитела зависит от концентрации, причем IC₅₀ составляет ~15 нг/мл при анализе с DPP3 15 нг/мл.

Фиг. 2: Влияние AK1967 на окислительный стресс у крыс с сердечной недостаточностью, вызванной септическим шоком

(А) Дизайн эксперимента исследования сердечной недостаточности крыс с септическим шоком.

(В) флуоресцентные изображения меченого DHE миокарда имитирующего, CLP и CLP AK1967 животных.

(С) Количественное определение окрашенных DHE зон, и выражение интересующей зоны в виде процентного значения (% ROI).

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Sphingotec Therapeutics GmbH

<120> связывающая dpp3 молекула, направленная на специфические эпитопы dpp3

и связывающаяся с ними, и ее применение для профилактики или лечения

заболеваний/острых состояний, которые связаны с окислительным стрессом

<130> S75179WO

<150> EP17198420.6

<151> 2017-10-25

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 737

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ala Asp Thr Gln Tyr Ile Leu Pro Asn Asp Ile Gly Val Ser Ser

1 5 10 15

Leu Asp Cys Arg Glu Ala Phe Arg Leu Leu Ser Pro Thr Glu Arg Leu

20 25 30

Tyr Ala Tyr His Leu Ser Arg Ala Ala Trp Tyr Gly Gly Leu Ala Val

35 40 45

Leu Leu Gln Thr Ser Pro Glu Ala Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Ser

50 55 60

Arg Leu Phe Arg Ala Gln Asp Pro Asp Gln Leu Arg Gln His Ala Leu

65 70 75 80

Ala Glu Gly Leu Thr Glu Glu Glu Tyr Gln Ala Phe Leu Val Tyr Ala

85 90 95

Ala Gly Val Tyr Ser Asn Met Gly Asn Tyr Lys Ser Phe Gly Asp Thr

100 105 110

Lys Phe Val Pro Asn Leu Pro Lys Glu Lys Leu Glu Arg Val Ile Leu

115 120 125

Gly Ser Glu Ala Ala Gln Gln His Pro Glu Glu Val Arg Gly Leu Trp

130 135 140

Gln Thr Cys Gly Glu Leu Met Phe Ser Leu Glu Pro Arg Leu Arg His

145 150 155 160

Leu Gly Leu Gly Lys Glu Gly Ile Thr Thr Tyr Phe Ser Gly Asn Cys

165 170 175

Thr Met Glu Asp Ala Lys Leu Ala Gln Asp Phe Leu Asp Ser Gln Asn

180 185 190

Leu Ser Ala Tyr Asn Thr Arg Leu Phe Lys Glu Val Asp Gly Glu Gly

195 200 205

Lys Pro Tyr Tyr Glu Val Arg Leu Ala Ser Val Leu Gly Ser Glu Pro

210 215 220

Ser Leu Asp Ser Glu Val Thr Ser Lys Leu Lys Ser Tyr Glu Phe Arg

225 230 235 240

Gly Ser Pro Phe Gln Val Thr Arg Gly Asp Tyr Ala Pro Ile Leu Gln

245 250 255

Lys Val Val Glu Gln Leu Glu Lys Ala Lys Ala Tyr Ala Ala Asn Ser

260 265 270

His Gln Gly Gln Met Leu Ala Gln Tyr Ile Glu Ser Phe Thr Gln Gly

275 280 285

Ser Ile Glu Ala His Lys Arg Gly Ser Arg Phe Trp Ile Gln Asp Lys

290 295 300

Gly Pro Ile Val Glu Ser Tyr Ile Gly Phe Ile Glu Ser Tyr Arg Asp

305 310 315 320

Pro Phe Gly Ser Arg Gly Glu Phe Glu Gly Phe Val Ala Val Val Asn

325 330 335

Lys Ala Met Ser Ala Lys Phe Glu Arg Leu Val Ala Ser Ala Glu Gln

340 345 350

Leu Leu Lys Glu Leu Pro Trp Pro Pro Thr Phe Glu Lys Asp Lys Phe

355 360 365

Leu Thr Pro Asp Phe Thr Ser Leu Asp Val Leu Thr Phe Ala Gly Ser

370 375 380

Gly Ile Pro Ala Gly Ile Asn Ile Pro Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Gln

385 390 395 400

Thr Glu Gly Phe Lys Asn Val Ser Leu Gly Asn Val Leu Ala Val Ala

405 410 415

Tyr Ala Thr Gln Arg Glu Lys Leu Thr Phe Leu Glu Glu Asp Asp Lys

420 425 430

Asp Leu Tyr Ile Leu Trp Lys Gly Pro Ser Phe Asp Val Gln Val Gly

435 440 445

Leu His Glu Leu Leu Gly His Gly Ser Gly Lys Leu Phe Val Gln Asp

450 455 460

Glu Lys Gly Ala Phe Asn Phe Asp Gln Glu Thr Val Ile Asn Pro Glu

465 470 475 480

Thr Gly Glu Gln Ile Gln Ser Trp Tyr Arg Ser Gly Glu Thr Trp Asp

485 490 495

Ser Lys Phe Ser Thr Ile Ala Ser Ser Tyr Glu Glu Cys Arg Ala Glu

500 505 510

Ser Val Gly Leu Tyr Leu Cys Leu His Pro Gln Val Leu Glu Ile Phe

515 520 525

Gly Phe Glu Gly Ala Asp Ala Glu Asp Val Ile Tyr Val Asn Trp Leu

530 535 540

Asn Met Val Arg Ala Gly Leu Leu Ala Leu Glu Phe Tyr Thr Pro Glu

545 550 555 560

Ala Phe Asn Trp Arg Gln Ala His Met Gln Ala Arg Phe Val Ile Leu

565 570 575

Arg Val Leu Leu Glu Ala Gly Glu Gly Leu Val Thr Ile Thr Pro Thr

580 585 590

Thr Gly Ser Asp Gly Arg Pro Asp Ala Arg Val Arg Leu Asp Arg Ser

595 600 605

Lys Ile Arg Ser Val Gly Lys Pro Ala Leu Glu Arg Phe Leu Arg Arg

610 615 620

Leu Gln Val Leu Lys Ser Thr Gly Asp Val Ala Gly Gly Arg Ala Leu

625 630 635 640

Tyr Glu Gly Tyr Ala Thr Val Thr Asp Ala Pro Pro Glu Cys Phe Leu

645 650 655

Thr Leu Arg Asp Thr Val Leu Leu Arg Lys Glu Ser Arg Lys Leu Ile

660 665 670

Val Gln Pro Asn Thr Arg Leu Glu Gly Ser Asp Val Gln Leu Leu Glu

675 680 685

Tyr Glu Ala Ser Ala Ala Gly Leu Ile Arg Ser Phe Ser Glu Arg Phe

690 695 700

Pro Glu Asp Gly Pro Glu Leu Glu Glu Ile Leu Thr Gln Leu Ala Thr

705 710 715 720

Ala Asp Ala Arg Phe Trp Lys Gly Pro Ser Glu Ala Pro Ser Gly Gln

725 730 735

Ala

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Cys Glu Thr Val Ile Asn Pro Glu Thr Gly Glu Gln Ile Gln Ser Trp

1 5 10 15

Tyr Arg Ser Gly Glu

20

<210> 3

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Ile Asn Pro Glu Thr Gly

1 5

<210> 4

<211> 4

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Glu Thr Gly Glu

1

<210> 5

<211> 116

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asn Asp Asn Lys Ser Tyr Asn Pro Ala

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Asn Asn Gln Val

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Val Thr Ala Asp Thr Gly Thr Tyr Phe

85 90 95

Cys Ala Arg Asn Tyr Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 6

<211> 112

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

Asp Val Val Val Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Ile Gly Ser Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 7

Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Ser

1 5 10

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 8

Ile Trp Trp Asn Asp Asn Lys

1 5

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 9

Ala Arg Asn Tyr Ser Tyr Asp Tyr

1 5

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 10

Arg Ser Leu Val His Ser Ile Gly Ser Thr Tyr

1 5 10

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 11

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr

1 5

<210> 12

<211> 469

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 12

Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser

1 5 10 15

Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly

20 25 30

Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe

35 40 45

Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg

50 55 60

Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asn

65 70 75 80

Asp Asn Lys Ser Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr

85 90 95

Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp

100 105 110

Pro Val Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Tyr Ser Tyr Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

130 135 140

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

145 150 155 160

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

165 170 175

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

180 185 190

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

195 200 205

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

210 215 220

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro

225 230 235 240

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

245 250 255

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

260 265 270

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

275 280 285

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

290 295 300

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

305 310 315 320

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

325 330 335

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

340 345 350

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

355 360 365

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

370 375 380

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

385 390 395 400

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

405 410 415

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

420 425 430

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

435 440 445

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

450 455 460

Ser Leu Ser Pro Gly

465

<210> 13

<211> 239

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 13

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser

20 25 30

Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Arg Ser

35 40 45

Leu Val His Ser Ile Gly Ser Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys

50 55 60

Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe

65 70 75 80

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

85 90 95

Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr

100 105 110

Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

115 120 125

Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

130 135 140

Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu

145 150 155 160

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp

165 170 175

Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp

180 185 190

Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys

195 200 205

Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln

210 215 220

Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<---

1. Связывающая дипептидилпептидазу-3 (DPP3) молекула, направленная на эпитоп иммунизационного пептида согласно SEQ ID NO.: 2 и связывающаяся с ним, и при этом указанная связывающая DPP3 молекула распознает и связывается по меньшей мере с тремя аминокислотами, конкретно по меньшей мере с четырьмя аминокислотами, более конкретно по меньшей мере с пятью аминокислотами иммунизационного пептида с SEQ ID NO.: 2, при этом указанный эпитоп содержится в SEQ ID NO.: 1, при этом указанная связывающая DPP3 молекула демонстрирует аффинность с DPP3 таким образом, что константа аффинности составляет по меньшей мере 10^-7 M^-1, и при этом указанная связывающая DPP3 молекула блокирует биоактивность DPP3 по меньшей мере на 10%.

2. Связывающая дипептидилпептидазу-3 молекула по п. 1, при этом указанная связывающая DPP3 молекула направлена на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 3 и связывается с ним, и при этом указанная связывающая DPP3 молекула распознает и связывается по меньшей мере с тремя аминокислотами, конкретно по меньшей мере с четырьмя аминокислотами, более конкретно по меньшей мере с пятью аминокислотами SEQ ID NO.: 3.

3. Связывающая дипептидилпептидазу-3 молекула по п. 1, при этом указанная связывающая DPP3 молекула направлена на эпитоп согласно SEQ ID NO.: 4 и связывается с ним, и при этом указанная связывающая DPP3 молекула распознает и связывается по меньшей мере с тремя аминокислотами, конкретно с четырьмя аминокислотами SEQ ID NO.: 4.

4. Связывающая дипептидилпептидазу-3 молекула по любому из пп. 1-3, при этом указанную DPP3 связывающую молекулу выбирают из группы, включающей антитело или фрагмент антитела или не-Ig скаффолд.

5. Связывающая дипептидилпептидазу-3 молекула по любому из пп. 1-4, при этом указанную связывающую DPP3 молекулу выбирают из группы, включающей моноспецифическое антитело или фрагмент моноспецифического антитела или не-Ig моноспецифический скаффолд.

6. Связывающая дипептидилпептидазу-3 молекула по любому из предыдущих пунктов, при этом указанной DPP3 связывающей молекулой является моноклональное антитело или фрагмент моноклонального антитела, и при этом определяющие комплементарность области (CDR) в тяжелой цепи содержат последовательности:

SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 8 и/или SEQ ID NO.: 9,

а определяющие комплементарность области (CDR) в легкой цепи содержат последовательности:

SEQ ID NO.: 10, KVS и/или SEQ ID NO.: 11.

7. Связывающая дипептидилпептидазу-3 молекула по любому из предыдущих пунктов, при этом указанной связывающей DPP3 молекулой является гуманизированное моноклональное антитело или фрагмент гуманизированного моноклонального антитела, при этом тяжелая цепь содержит последовательность:

SEQ ID NO.: 12

и при этом легкая цепь содержит последовательность:

SEQ ID NO.: 13.

8. Связывающая дипептидилпептидазу-3 молекула по любому из предыдущих пунктов для применения с целью профилактики или лечения заболеваний или острых состояний у пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом, при этом указанные заболевания выбирают из группы, включающей нейродегенеративные заболевания, метаболический синдром, сердечно-сосудистые заболевания, аутоиммунные заболевания, воспалительные болезни легких, болезни почек, болезни печени, болезни органов пищеварения, вирусные инфекционные заболевания, рак, воспаление, сепсис, септический шок и SIRS.

9. Связывающая дипептидилпептидазу-3 молекула по п. 8, при этом указанные:

нейродегенеративное заболевание можно выбрать из группы, включающей болезнь Паркинсона (PD), болезнь Хантингтона (HD), боковой амиотрофический склероз (ALS) и рассеянный склероз (MS)),

метаболический синдром можно выбрать из группы, включающей инсулинорезистентность, ожирение, гипергликемию, дислипидемию, гипертонию и диабет,

сердечно-сосудистые заболевание можно выбрать из группы, включающей атеросклероз, гипертонию, сердечную недостаточность, ишемическую болезнь сердца, церебральное ишемическое поражение, инсульт и инфаркт миокарда,

аутоиммунное заболевание можно выбрать из группы, включающей ревматоидный артрит, системную красную волчанку,

воспалительное заболевание легких можно выбрать из группы, включающей COPD, астму,

заболевание почек можно выбрать из группы, включающей острое поражение почек (AKI), хроническое заболевание почек (CKD), диабетическую нефропатию, терминальную почечную недостаточность (ESRD),

заболевание печени можно выбрать из группы, включающей вирусный гепатит и цирроз,

заболевание пищеварительного тракта можно выбрать из группы, включающей воспалительное заболевание кишечника, например, язвенный колит, болезнь Крона, гастрит, панкреатит и язвенную болезнь желудка и 12-перстной кишки,

вирусное инфекционное заболевание можно выбрать из группы, включающей гемоконтактный вирусный гепатит (B, C и D), вирус иммунодефицита человека (HIV), грипп A, вирус Эпштейна-Барра, респираторно-синцитиальный вирус,

рак можно выбрать из группы, включающей рак предстательной железы, рак молочной железы, рак легких, колоректальный рак, рак мочевого пузыря, рак яичников, рак кожи, рак желудка, рак печени,

воспаление,

сепсис, септический шок, SIRS.

10. Связывающая дипептидилпептидазу-3 молекула по любому из пп. 1-6 для применения с целью профилактики или лечения заболеваний или острых состояний у пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом, при этом указанное заболевание выбирают из группы, включающей сепсис, септический шок и SIRS.

11. Связывающая дипептидилпептидазу-3 молекула по любому из пп. 1-6 для применения с целью профилактики или лечения заболеваний или острых состояний у пациента, при этом указанное заболевание или острое состояние связано с окислительным стрессом, при этом указанное заболевание связано с окислительным стрессом в миокарде.