Штамм бактерий bacillus subtilis subsp. inaquosorum, обладающий антагонистическим действием в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов
Владельцы патента RU 2787384:
Синица Александр Владимирович (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм Bacillus subtilis subsp. Inaquosorum, депонированный во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина, обособленного подразделения Федерального исследовательского центра «Пущинский научный центр биологических исследований Российской Академии наук» (ВКМ ИБФМ ФИЦ ПНЦБИ РАН) под регистрационным номером ВКМ В-3536D. Заявленный штамм обладает антагонистическим действием в отношении широкого ряда патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. При этом штамм нетоксичен для клеток млекопитающих. Это обеспечивает возможность использования заявленного штамма для создания пробиотиков и метабиотиков. 2 н.п. ф-лы, 4 табл., 6 пр.
Область техники
[0001] Настоящие изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к получению штамма Bacillus subtilis subsp. inaquosorum, подходящего для создания пробиотиков и метабиотиков за счет антагонистического действия в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.
Уровень техники
[0002] Пробиотические микроорганизмы являются непатогенными и нетоксикогенными для человека микроорганизмами, которые способны восстанавливать нормальную микрофлору органов за счет усиления роста симбиотических бактерий и/илиподавления роста патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. В составе пробиотиков и метабиотиков часто используют бактерии Bacillus subtilis (B. subtilis) и их метаболиты. B. subtilis представляют вид факультативно аэробной спорообразующейих почвенной бактерий, положительных по Граму. На сегодняшний день вид Bacillus subtilis - один из наиболее известных и тщательно изученных представителей рода бацилл (Bacillus). Вид B. subtilis в настоящее время включает четыре подвида: Subtilis, Inaquosorum, Spizizenii и Stercoris [1]. Большинство бактерий вида B. subtilis не относятся к патогенным для человека микроорганизмам. Отсутствие патогенности и токсичности у штаммов B. subtilis и их метаболитов позволяет считать их наиболее перспективными в качестве основы пробиотиков и метабиотиков нового поколения [2].
[0003] Известно широкое применение метаболитов штаммов B. subtilis в качестве компонентов композиций для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта, в частности для коррекции дисбиотических нарушений микробиоценоза кишечника [3-5]. В патентах приводятся композиции, в состав которых входят метаболиты пробиотического штамма бактерий B. subtilis ВКПМ № В-2335 (RU2589818; опубл.: 10.07.2016; МПК: A61K35/02; A61K35/74; A61K36/899; A61K47/48; A61K9/48). Данный штамм использовали при создании препарата «Биоспорин» в 1991г. [6]. Однако описанный штамм B. subtilis ВКПМ № В-2335 обладает недостаточно высокой эффективностью применения.
[0004] В данном изобретении предлагается новый штамм, относящийся к подвиду B. subtilis subsp. inaquosorum.
[0005] Известны несколько штаммов подвида B. subtilis subsp. inaquosorum: DV7-B-4, DSM 22148, KCTC 13429, BGSC 3A28, NRRL B-23052, CIP 110137, которые выделены из почвы [7]. В патенте KR101635987 (опубл.: 07.07.2016; МПК: A61K35/74; A61K36/48; A61P1/16) описан состав композиции для профилактики и лечения заболеваний печени, включающий ферментированный соевый продукт, полученный с использованием B. subtilis subsp. inaquosorum FA0718 (Accession No. KCCM 11280P) в качестве активного ингредиента [8]. Ферментированный соевый продукт, полученный с использованием B. subtilis subsp. inaquosorum ингибирует фиброз печени, обладая активностью, ингибирующей экспрессию альфа-SMA.
[0006] Известно применение штамма B. subtilis subsp. inaquosorum DE111 совместно со штаммом HU Biol-II при производстве пробиотического средства для человека. [9, 10].
[0007] В качестве ближайшего аналога заявляемого штамма рассмотрен штамм Bacillus subtilis subsp. inaquosorum KCTC 13429T [11], который обладает высоким генетическим сходством с заявленным штаммом. Однако в уровне техники не найдено примеров применения штамма KCTC 13429T для производства эффективных лекарственных средств, обладающих антагонистическим действием в отношении патогенных микроорганизмов.
[0008] В настоящее время существует необходимость в расширении арсенала штаммов B. subtilis, обладающих широким антагонистическим действием в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.
Термины и сокращения
[0009] Культуральная жидкость - жидкая среда, получаемая при культивировании различных про- и эукариотических клеток in vitro и содержащая остаточные питательные вещества и продукты метаболизма этих клеток [12].
[0010] Культуральная суспензия - жидкая среда, получаемая при культивировании различных про- и эукариотических клеток in vitro и содержащая культивируемые клетки и/или споры.
[0011] Метабиотики - вещества, являющиеся структурными компонентами пробиотических микроорганизмов и/или их метаболитов, которые способны оптимизировать физиологические функции, метаболические, эпигенетические, информационные, регуляторные, транспортные, иммунные, нейрогормональные, и/или поведенческие реакции, связанные с деятельностью симбиотической (индигенной) микрофлоры организма-хозяина [13].
[0012] Пермеат - фаза, прошедшая через мембрану в процессе мембранного разделения, основанного на преимущественной проницаемости одного или нескольких компонентов жидкой либо газовой смеси, а также коллоидной системы, через разделительную перегородку-мембрану. При этом задержанная фаза называется концентратом [14].
[0013] Пробиотики - функциональный пищевой ингредиент в виде полезных для человека непатогенных и нетоксикогенных живых микроорганизмов, обеспечивающий при систематическом употреблении в пищу в виде препаратов или в составе пищевых продуктов благоприятное воздействие на организм человека в результате нормализации состава и/или повышения биологической активности нормальной микрофлоры кишечника [15].
[0014] Тангенциальная ультрафильтрация - ультрафильтрация, в процессе которой фильтруемая жидкость движется параллельно мембране.
[0015] Ультрафильтрация - процесс мембранного разделения, а также фракционирования и концентрирования веществ, осуществляемый путем фильтрования жидкости под действием разности давлений до и после мембраны. При этом размер выделяемых частиц (т.е. частицы какого размера не проходят через фильтр, а остаются в концентрате) составляет приблизительно 0,001-0,05 мкм (5-500 кДа).
[0016] КОЕ - колониеобразующая единица.
[0017] об/об/мин - объем подаваемый на объем рабочий в минуту.
Сущность изобретения
[0018] Задачей настоящего изобретения является выделение нового штамма бактерий Bacillus subtilis для создания пробиотиков и метабиотиков.
[0019] Данная задача решается заявленным изобретением за счет достижения такого технического результата, как обнаружение нового штамма Bacillus subtilis subsp. inaquosorum ВКМ В-3536D с возможностью применения для создания пробиотиков и метабиотиков.
[0020] Заявленный технический результат достигается за счет того, что штамм Bacillus subtilis subsp. inaquosorum ВКМ В-3536D (далее B. subtilis ВКМ В-3536D) обладает антагонистическим действием в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, а также адаптацией штамма B. subtilis ВКМ В-3536D для культивирования в лабораторных и промышленных питательных средах.
Подробное описание изобретения
[0021] В приведенном ниже подробном описании реализации изобретения приведены многочисленные детали реализации, призванные обеспечить отчетливое понимание настоящего изобретения. Однако, квалифицированному в предметной области специалисту, очевидно, каким образом можно использовать настоящее изобретение, как с данными деталями реализации, так и без них. В других случаях хорошо известные методы, процедуры и компоненты не описаны подробно, чтобы не затруднять излишне понимание особенностей настоящего изобретения.
[0022] Кроме того, из приведенного изложения ясно, что изобретение не ограничивается приведенной реализацией. Многочисленные возможные модификации, изменения, вариации и замены, сохраняющие суть и форму настоящего изобретения, очевидны для квалифицированных в предметной области специалистов.
[0023] Заявленный штамм B. subtilis депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина, обособленного подразделения Федерального исследовательского центра «Пущинский научный центр биологических исследований Российской Академии наук» под регистрационным номером ВКМ В-3536D.
[0024] Заявленный штамм выделен из природных источников Ленинградской области. При этом заявленный штамм получил название B. subtilis SA44. В настоящей заявке преимущественно используется название штамма в соответствии с номером, полученном при депонировании. Однако следует понимать, что названия «B. subtilis ВКМ В-3536D» и «B. subtilis SA44» обозначают один и тот же штамм.
[0025] Штамм B. subtilis ВКМ В-3536D является диким штаммом с неизменными свойствами. Заявленный штамм представлен подвижными эндоспорообразующими грамположительными палочками. Они образуют круглые, выпуклые, складчатые колонии беловатого цвета, диаметром 2 - 3 мм. Размер клеток составляет 0.6-0.8μ х 1.8-2.8 μ. Клеточная стенка и реакция по Граму - Грам-положительная. Споры овальные, спорангий не раздут, диаметр спор равен диаметру клетки, расположены центрально и парацентрально. Образуют перитрихиальное жгутикование.
[0026] Штамм B. subtilis ВКМ В-3536D может расти при 55°С на питательной среде с 7% NaCl и рН 5.7. Заявленный штамм обладает следующими биохимическими признаками:
• оксидазо- и каталазо- положительный;
• аэроб, но способен расти в анаэробных условаиях;
• реакция Вогкс-Проскауэра (V-P) - положительная;
• утилизирует цитрат, продуцирует нитраты из нитритов;
• образует кислоту из глюкозы, арабинозы, ксилозы, маннитола;
• гидролизует желатин, казеин и крахмал.
[0027] В рамках заявленного изобретения штамм B. subtilis ВКМ В-3536D был адаптирован под культивирование в лабораторных и промышленных питательных средах. В одном варианте реализации штамм B. subtilis ВКМ В-3536D культивируют на твердой питательной среде. При этом может быть использован питательный агар, например, питательный агар BBL® или питательный агар DIFCO®. При этом культивирование штамма на твердой питательной среде проводят посевом с использованием метода штрихов.
[0028] В другом варианте реализации штамм B. subtilis ВКМ В-3536D культивируют в жидкой питательной среде. При этом жидкая среда для культивирования штамма B. subtilis ВКМ В-3536D может иметь исходный рН 7,0±0,2. В состав жидкой питательной среды входят: пептон, дрожжевой экстракт, глюкоза, сульфат магния, сульфат марганца, хлорид кальция, калиевые соли ортофорсфорной кислоты и вода.
[0029] Существенным фактором для формирования спор, составляющих основу биомассы штамма B. subtilis ВКМ В-3536D в культуральной суспензии, является соотношение источника углерода (глюкоза) и аминного азота (пептон). В предпочтительном варианте реализации указанное соотношение составляет приблизительно 4:1. Пептон может быть получен из молока, мяса животных и/или из дрожжей.
[0030] В одном варианте реализации питательная среда может дополнительно включать факторы роста и/или специальные добавки. В предпочтительном варианте реализации питательная среда не включает дополнительных компонентов.
[0031] При глубинном культивировании в жидкой питательной среде штамм B. subtilis ВКМ В-3536D вносят в жидкую питательную среду в количестве приблизительно 0,5% объема жидкой питательной среды. Полученную смесь инкубируют при температуре 36-38°С при постоянном перемешивании и аэрации. Инкубацию проводят до достижения рН 8,5-8,9 культуральной жидкости и/или до достижения созревания более 90%. В предпочтительном варианте реализации культивирование проводят в ферментере. При этом коэффициент заполнения ферментера может составлять от приблизительно 60% до приблизительно 70%. Указанный коэффициент заполнения, с одной стороны, позволяет избежать нежелательного пенообразования, и с другой стороны, позволяет максимально эффективно использовать оборудование для получения биомассы штамма. Это особенно актуально при использовании штамма для получения пробиотиков и/или метабиотиков в промышленных количествах. В результате культивирования получают культуральную суспензию, биомасса которой преимущественно представлена спорами штамма B. subtilis ВКМ В-3536D. Далее культуральная суспензия штамма B. subtilis ВКМ В-3536D может быть использована для создания пребиотиков и/или метабиотиков, или может храниться для последующего культивирования штамма.
[0032] Способ хранения штамма B. subtilis ВКМ В-3536D в одном варианте реализации включает периодический пересев штамма B. subtilis ВКМ В-3536D с последующим хранением при 4-6°С. В другом варианте реализации штамм B. subtilis ВКМ В-3536D хранят в лиофилизированном состоянии.
[0033] Способ выделения метаболитов штамма B. subtilis ВКМ В-3536D включает следующие этапы. Штамм B. subtilis ВКМ В-3536D культивируют в жидкой питательной среде, как указано выше. Затем культуральную суспензию подвергают центрифугированию на проточной центрифуге. При этом происходит отделение основного количества биомассы B. subtilis ВКМ В-3536D от культуральной жидкости, включающей метаболиты штамма B. subtilis ВКМ В-3536D. Полученную культуральную жидкость подвергают ультрафильтрации. В предпочтительном варианте реализации применяют тангенциальную ультрафильтрацию.
[0034] Штамм B. subtilis ВКМ В-3536D может применяться для получения пробиотиков и/или метабиотиков, действие которых основано на подавлении широкого ряда патогенных и/или условно патогенных микроорганизмов. Указанный ряд включает, но не ограничивается этим: Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Streptococcuss alivarius, Streptococcus mitis.
Описание реализации изобретения
[0035] Пример 1. Генетический анализ B. subtilis ВКМ В-3536D.
[0036] Для идентификации заявленного штамма было проведено выделение ДНК из культуры клеток ВКМ В-3536D [16]. Затем на приборе GeneAmp PCR System 2700 (“Applied Biosystems”, США) методом ПЦР амплифицировали фрагмент гена gyrB с использованием универсальных праймеров Up1F и UP2R. Определение нуклеотидной последовательности продукта ПЦР проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с праймером Up1S и последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer. Нуклеотидную последовательность фрагмент гена gyrB заявленного штамма B. subtilis ВКМ В-3536D сравнивали с нуклеотидными последовательностями аналогичных фрагментов гена gyrB штаммов B. subtilis subsp. inaquosorum KCTC 13429T, B. subtilis subsp. spizizenii TU-B-10T, B. subtilis DSM 10T. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов гена gyrB выполняли в программе BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Определение филогенетического положения штаммов и процента сходства проводили с использованием программы TaxonDC 1.3.1 [17]. Филогенетический анализ показал высокое сходство заявленного штамма B. subtilis ВКМ В-3536D с типовым штаммом B. subtilis subsp. inaquosorum KCTC 13429T - 99.34% (Таблица 1).
[0037]
| Таблица 1. Сравнение штаммов по сходству нуклеотидных последовательностей фрагмента гена gyrB. | |||
| ° | CP029465.1:4794-5714 B. subtilis subsp. inaquosorum KCTC 13429T |
CP002905.1:5204-6124 B. subtilis subsp. spizizenii TU-B-10T |
CP060710.1:5241-6161 B. subtilis DSM 10T |
|
B. subtilis
ВКМ В-3536D |
99.34% | 95.58% | 94.57% |
[0038] Пример 2. Получение биомассы штамма B. subtilis ВКМ В-3536D.
[0039] Процесс глубинного культивирования вели в ферментере Р1000 фирмы Bioengineering (Швейцария) объемом 1000 дм3 с коэффициентом заполнения 0,6. В процессе культивирования поддерживали температуру 37±1°С. Скорость перемешивания составляля 250 об/мин. Начальная скорость аэрации составляла 0,2 об/об/мин, через 16 часов роста скорость изменяли до значения 0,5 об/об/мин. Процесс глубинного культивирования велит в течение 32 часов.
[0040] Пример 3. Исследование штамма B. subtilis ВКМ В-3536D на антагонистическую активность.
[0041] Антагонистическую активность штамма B. subtilis ВКМ В-3536D исследовали методом перпендикулярных штрихов. Для этого на поверхность агаризованной среды Луриа-Бертани в чашке Петри штрихом рассевали штамм B. subtilis ВКМ В-3536D, взятый из культуральной суспензии, полученной в Примере 2. Посев делали по диаметру чашки Петри, которую затем помещали на сутки в термостат при температуре 37°С. После завершения роста штамма B. subtilis ВКМ В-3536D и диффузии продуцируемого вещества в агаризованную среду, перпендикулярно к выросшему штриху, подсевали штрихами тест-культуры, начиная от краев чашки. Чашки помещали в термостат на 48 часов. Наличие антагонистической активности фиксировали, измеряя зоны задержки роста тест-культур.
[0042]
| Таблица 2. Результаты исследования на антагонистическую активность штамм ВКМ В-3536D. | |||||
| Объект исследования | Зона задержки роста, мм | ||||
| Staphylococcus aureus | Listeria monocytogenes | Escherichia coli | Pseudomonas aeruginosa | Salmonella typhimurium | |
|
B. subtilis ВКМ В-3536D |
10 | 17 | 25 | 30 | 28 |
[0043] В результате исследования было установлена выраженная способность культуральной жидкости, содержащей штамм B. subtilis ВКМ В-3536, к подавлению роста патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Это говорит о том, что заявленный штамм B. subtilis ВКМ В-3536D может быть использован в производстве пробиотиков.
[0044] Пример 4. Выделение метаболитов B. subtilis ВКМ В-3536D из культуральной суспензии.
[0045] Культуральную суспензию B. subtilis ВКМ В-3536D, полученную как описано в Примере 1, подвергали центрифугированию на проточной суперцентрифуге Sharpless AS-26. Полученную культуральную жидкость подвергали ультрафильтрации на установке тангенциальной ультрафильтрации в две стадии. На первой стадии использовали фильтрующую мембрану АР-3-100. При этом получали концентрат 1с порогом отсечения 100 кДа, включающий высокомолекулярную фракцию метаболитов. Количество концентрата №1 составляло 1,5-2% от исходного объема культуральной жидкости. Пермеат, полученный после первой стадии фильтрации, вновь подвергали тангенциальной ультрафильтрации с использованием фильтрующей мембраны АР-3-5. В результате получали концентрат №2 с порогом отсечения 5 кДа. Полученный концентрат №2 составлял около 10% от исходного объема культуральной жидкости. Полученный концентрат №2 включал в себя метаболиты B. subtilis ВКМ В-3536D.
[0046] Пример 5. Исследование воздействия метаболитов B. subtilis ВКМ В-3536D на индикаторные культур.
[0047] Изучение способности метаболитов B. subtilis ВКМ В-3536D подавлять рост индикаторных культур проводили с использованием адаптированного метода стандартных дисков для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Использованные в данном примере индикаторные культуры представлены патогенными и условно-патогенными для человека микроорганизмами. Для реализации метода индикаторные культуры помещали на поверхность агаризованной питательной среды Луриа-Бертани в чашке Петри в количестве 107 КОЕ. После застывания чашки Петри подсушивали в течение 15 минут при 37°С. Затем на поверхность питательной среды с индикаторными культурами в виде капель диаметром 5±1 мм наносили по 10 мкл концентратов №1 и №2, полученных в Примере 3. Затем чашки Петри оставляли при комнатной температуре до полного впитывания капель и затем инкубировали при 37°С в течение 24-48 часов. Детекцию результатов проводили путем измерения зоны задержки роста индикаторных культур вокруг области нанесения концентратов, включающих метаболиты B. subtilis ВКМ В-3536D. Появление зон, свободных от индикаторных культур, вокруг области нанесения концентратов указывает на антагонистическое действие метаболитов B. subtilis ВКМ В-3536 в отношении указанных в Таблице 3 индикаторных культур. Величина зон, свободных от индикаторных культур, указывает на эффективность антагонистического действия метаболитов B. subtilis ВКМ В-3536.
[0048]
| Таблица 3. Задержка роста индикаторных культур при воздействии метаболитов B.subtilis ВКМ В-3536. | ||
| Индикаторная культура | Зона задержки роста за пределами капли концентрата | |
| Концентрат №1 | Концентрат №2 | |
| Escherichia coli DH5α | 1 мм* | - |
| Staphylococcus aureus 3.2 | 2 мм | 2 мм |
| Staphylococcus aureus 4.1 | 3 мм | 2 мм |
| Staphylococcus epidermidis 3.1 | 4 мм | 4 мм |
| Streptococcus agalactiae 42 | 1 мм | 2 мм |
| Streptococcus agalactiae 30 | 1 мм | 1 мм |
| Streptococcus agalactiae 9177 | 1 мм | 1 мм |
| Enterococcus faecium 24 | 1 мм | 2 мм |
| Enterococcus faecalis 4387 | 1 мм | 1 мм |
| Enterococcus faecalis 4661 | 1 мм | 1 мм |
| Streptococcuss salivarius 1453 | 0,5мм* | 0,5мм* |
| Streptococcus gordonii 221 | - | - |
| Streptococcus mitis cl.is. 1 | 1 мм* | 1 мм* |
| Klebsiella oxytoca cl.is. | - | - |
| Pseudomonas spp. cl.is. | - | - |
* - бактериостатическое действие
«-» - задержка роста не наблюдалась
[0049] В результате исследования было установлена выраженная способность метаболитов штамма B. subtilis ВКМ В-3536 к подавлению роста патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Причем способностью к подавлению роста обладали как концентрат №1, включающий высокомолекулярные метаболиты весом более 100кДа, так и концентрат №2, включающий метаболиты весом 5-100кДа. Оба концентрата обладали способность задерживать рост 11 из 15 исследованных индикаторных культур. Это дает возможность использовать штамм B. subtilis ВКМ В-3536D для производства метабиотиков.
[0050] Пример 6. Исследование цитотоксичности штамма B. subtilis ВКМ В-3536D в отношении клеток млекопитающих.
[0051] Потенциальную цитотоксичность штамма B. subtilis ВКМ В-3536D оценивали согласно рекомендациям Европейского Агентства по безопасности пищевых продуктов (EFSA) для характеризации микроорганизмов используемых в качестве кормовых добавок или штаммов-продуцентов (EFSA FEEDAP Panel) [18]. Штамм B. subtilis ВКМ В-3536D выращивали в сердечно-мозговом бульоне при 30°С в течение 6 ч. Клетки отделяли от культуральной жидкости центрифугированием.
[0052] Анализ цитотоксичности на клетках Vero (клеточная линия почечного эпителия зеленой мартышки) проводили по методу Roberts et al., 2021 с модификациями [19]. Клетки Vero инкубировали с культуральной жидкостью. Степень поврежденности клеток Vero оценивали по выделению клетками фермента лактат-дегидрогеназы. Цитотоксичность выражали в процентах от токсичности детергента Triton-X100, вызывающего выход из клеток лактат-дегидрогеназы за счет перфорации клеточных мембран. В качестве контрольных штаммов использовали цитотоксичный и нецитотоксичный штаммы рода Bacillus. В Таблице 4 представлены средние значения 3 (штамм ВКМ В-3536D) или 2 (контрольные штаммы) экспериментов. Каждый эксперимент проводился в двух повторах.
[0053]
| Таблица 4. Цитотоксичность штамма B. subtilis ВКМ В-3536D в отношении клеток Vero. | ||
| Штамм | Цитотоксичность, %* | Токсичность ** |
| B. subtilis ВКМ В-3536D | 4,6 | Не токсичен |
| Нетоксичный штамм Bacillus | 2,0 | Не токсичен |
| Токсичный штамм Bacillus | 84,1 | Токсичен |
* % цитотоксичности вычисляли, принимая за 100% количество лактат-дегидрогеназы, выделяемой клетками, обработанными Triton-X100.
** Интерпретация результатов: 0-20% - не токсичный, 20-100% - токсичный.
[0054] Из представленных результатов видно, что цитотоксичность культуральной жидкости штамма B. subtilis ВКМ В-3536D не превышает границы в 20%. Таким образом, штамм B. subtilis ВКМ В-3536D не является токсичным в отношении клеток Vero, и может считаться безопасным для клеток млекопитающих. Это дает возможность использовать штамм B. subtilis ВКМ В-3536D для производства метабиотиков.
[0055] В настоящих материалах заявки представлено предпочтительное раскрытие осуществления заявленного технического решения, которое не должно использоваться как ограничивающее иные, частные воплощения его реализации, которые не выходят за рамки испрашиваемого объема правовой охраны и являются очевидными для специалистов в соответствующей области техники.
Источники информации
1. Dunlap C. A. et al. Promotion of Bacillus subtilis subsp. inaquosorum, Bacillus subtilis subsp. spizizenii and Bacillus subtilis subsp. stercoris to species status Epub 2019 Nov 12.
2. Плотникова Е.Ю. Эффекты активных метаболитов Bacillus subtilis в пробиотическом продукте нового поколения РМЖ Медицинское обозрение №3, 2018.
3. Синица А. В. Препарат для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта "бактистатин". Патент РФ №2287335 (20.11.2006).
4. Синица А. В. Метабиотическая композиция для обеспечения колонизационной резистентности микробиоценоза кишечника человека. Патент РФ № 2589818, 10.07.2016.
5. Синица А. В. Синбиотическая композиция для коррекции дисбиотических нарушений микробиоценоза желудочно-кишечного тракта. Патент РФ №2592988 (27.07.2016).
6. Смирнов А.В. и др. Препарат биоспорин для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека. Авт. Свид. №1722502, 30.03.1992.
7. Bacillus inaquosorum DV7-B-4 is a facultative anaerobe, mesophilic, rod-shaped bacterium that was isolated from arid soil (https://bacdive.dsmz.de/strain/1289).
8. IL L. S. et al. compositions for preventing, improving, or treating liver disorders comprising substances of fermented soy bean using bacillus subtilis subsp. inaquosorum as an active ingredient Патент Южной Кореи № KR101635987 (B1), 2016-07-07.
9. Chinyere A. Knight et al. The first report of antifungal lipopeptide production by a Bacillus subtilis subsp. inaquosorum strain. Microbiological Research Volume 216, November 2018, Pages 40-46 (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30269855/).
10. The Bacillus subtilis strain named DE 111. https://www.fda.gov/media/132389/download
11. Hana Yi. Genomic insights into the taxonomic status of the three subspecies of Bacillus subtilis November 2013 Systematic and Applied Microbiology 37(2).
12. Словарь биотехнологических терминов / авт.-сост. В. З. Тарантул и др. - Москва: ИНИЦ Роспатента, 2005.
13. Шендеров Б. А., Ткаченко Е. И., Лазебник Л. Б., Ардатская М. Д., Синица А. В., Захарченко М. М. Метабиотики - новая технология профилактики и лечения заболеваний, связанных с микроэкологическими нарушениями в организме человека. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2018;151(3): 83-92.
14. Химическая энциклопедия. М.: Советская энциклопедия. Под ред. И. Л. Кнунянца. 1988/
15. ГОСТ Р 52349-2005 Продукты пищевые. Продукты пищевые функциональные. Термины и определения (с Изменением N 1) / ГОСТ Р от 31 мая 2005 г. № 52349-2005.
16. Ausubel F.M. et al. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley, New York (1994).
17. Tarlachkov S.V., Starodumova I.P. TaxonDC: calculating the similarity value of the 16S rRNA gene sequences of prokaryotes or ITS regions of fungi // Journal of Bioinformatics and Genomics, 2017, 3(5).
18. EFSA FEEDAP Panel (EFSA Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed), Rychen G, Aquilina G, Azimonti G, Bampidis V, Bastos ML, Bories G, Chesson A, Cocconcelli PS, Flachowsky G, Gropp J, Kolar B, Kouba M, Lopez-Alonso M, Lopez Puente S, Mantovani A, Mayo B, Ramos F, Saarela M, Villa RE, Wallace RJ, Wester P, Glandorf B, Herman L, Kärenlampi S, Aguilera J, Anguita M, Brozzi R, Galobart J, 2018. Guidance on the characterisation of microorganisms used as feed additives or as production organisms. EFSA Journal, 16(3), 5206, 24 pp. https://doi.org/10.2903/j.efsa.2018.5206.
19. Roberts PH, Davis KC, Garstka W, Bhunia AK, 2001. Lactate dehydrogenase release assay from Vero cells to distinguish verotoxin producing Escherichia coli from non-verotoxin producing strains. Journal of Microbiological Methods, 43: 171-181. https://doi.org/10.1016/S0167-7012(00)00222-0.
1. Штамм Bacillus subtilis subsp. inaquosorum, депонированный во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина, обособленного подразделения Федерального исследовательского центра «Пущинский научный центр биологических исследований Российской Академии наук» под регистрационным номером ВКМ В-3536D, обладающий антагонистическим действием в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.
2. Применение штамма ВКМ В-3536D для получения пробиотиков и/или метабиотиков.
