Способ количественной оценки резервуара вич и днк-калибратор для его осуществления

Изобретение относится к области медицины и молекулярной биологии, к биотехнологии. Описан способ количественной оценки резервуара ВИЧ, включающий выделение ДНК из образца биологического материала, проведение реакции ПЦР в режиме «реального времени» с использованием ДНК-калибратора с известной концентрацией, построение калибровочных графиков и определение размера резервуара ВИЧ, где при проведении ПЦР в режиме «реального времени» используют высококопийное и низкокопийное разведения ДНК-калибратора, представляющего собой плазмиду с известной концентрацией гена β-глобина человека и гена pol ВИЧ, при этом каждое разведение калибратора используется по меньшей мере в двух повторах. Кроме того, представлен ДНК-калибратор для реализации способа по пп. 1-3, представляющий собой плазмиду со встроенным фрагментом гена pol ВИЧ и гена β-глобина человека, где последовательность гена pol ВИЧ выбрана из SEQ ID NO: 1, а последовательность гена β-глобина человека выбрана из SEQ ID NO: 2. Изобретение расширяет арсенал средств для диагностики ВИЧ. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 7 ил., 3 табл., 3 пр.

 

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам определения размеров вирусного резервуара и его составляющих.

Появление и внедрение антиретровирусной терапии (АРВТ) в практику лечения людей, живущих с ВИЧ, позволило перевести заболевание в хроническую форму. Продолжительность жизни людей с ВИЧ-инфекцией, имеющих высокую приверженность, не отличается от продолжительности жизни людей, живущих без ВИЧ. Но, в настоящее время, полное излечение от ВИЧ инфекции невозможно по причине существования резервуара ВИЧ.

Резервуар ВИЧ - совокупность ДНК ВИЧ в латентных клетках-мишенях организма больного ВИЧ инфекцией, в результате возобновления репликации которой могут возникнуть новые нормальные вирусные частицы. К клеткам-мишеням относятся клетки, несущие на своей поверхности рецептор CD⁴⁺, - субпопуляции Т-лимфоцитов, моноциты, макрофаги, эозинофилы, дендритные клетки, клетки микроглии центральной нервной системы. Существование резервуара является главной причиной необходимости в пожизненной антиретровирусной терапии, потому что в случае ее прерывания через какое-то время вирус, находящийся в латентном состоянии, возобновляет репликацию после исчезновения давления в виде лекарства, и вирусная нагрузка начинает возрастать.

Известно, что все формы провирусной ДНК играют свою роль в репликации ВИЧ и патофизиологии. Так, дефектные провирусы участвуют в патогенезе заболевания, продуцируя вирусные компоненты, тем самым вызывая гиперактивацию иммунитета, и из всего провируса в организме процент дефектного достигает 97%. Следовательно, необходим маркер, который позволяет количественно определять все формы ДНК ВИЧ, включая стабильные интегрированные провирусы и неинтегрированные формы, включая внехромосомные 2-LTR, 1-LTR и линейные формы. Все эти формы сосуществуют в инфицированных клетках во время репликации вируса, и их уровни могут варьироваться у разных пациентов в зависимости от стадии заболевания ВИЧ.

Простые, быстрые, точные и воспроизводимые способы количественной оценки вирусного резервуара необходимы как для понимания клинической картины течения заболевания, так и для оценки эффективности действия лекарств, предназначенных для излечения от ВИЧ-инфекции.

До недавнего времени окончательным способом и «золотым стандартом» количественной оценки вирусного резервуара считался QVOA (Quantitative Viral Outgrowth Assay) [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16061962/]. QVOA выполняется на высокоочищенных покоящихся CD⁴⁺ Т-клетках, при этом создаются условия для их индукции и пролиферации, вызывающей репликацию ВИЧ. В результате дальнейших исследований стало ясно, что этот метод недооценивает фактический размер вирусного резервуара, потому как не все CD⁴⁺ Т-лимфоциты пролиферируют после первого раунда активации. Дополнительный рост также происходит после четвертого раунда активации клеток. Эти провирусы теоретически могут быть источником повторного распространения ВИЧ у инфицированных людей. К тому же, этот метод оказался дорогим, трудоемким, время затратным и неприменимым для клинических исследований в условиях большого потока.

На смену QVOA пришли способы на основе ПНР, например, такие как IPDA и Q4PCR, нацеленные на несколько областей провирусной ДНК, тем самым пытаясь исключить из анализа дефектные провирусы, содержащие гипермутации, вставки, делеции и др. Коллектив BEAT-HIV Martin Delaney Collaboratory выпускает рекомендации, отдавая приоритет IPDA или Q4PCR для измерения размера резервуара ВИЧ в крови и тканях во время клинических испытаний, связанных с лечением ВИЧ [Recommendations for measuring HIV reservoir size in cure-directed clinical trials. Mohamed Abdel-Mohsen, Douglas Richman, The BEAT-HIV Delaney Collaboratory to Cure HIV-1 infection, https://www.nature.com/articles/s41591-020-1022-1]. Эти способы позиционируются, как дешевые, быстрые и простые по сравнению с QVOA, позволяющие оценить уровень репликативно-компетентного вируса. Из минусов исследователи выделяют высокую вариабельность от пациента к пациенту, так как в некоторых случаях при использовании разных комбинаций праймеров, после проверки секвенированием, наблюдалась значительная частота ложного обнаружения, провирусы признавались за интактные, либо вообще не давали сигнала. Объясняется это полиморфизмом последовательностей в провирусных геномах и требованием гибридизации с третьим или четвертым зондом, что снижает чувствительность.

В настоящее время количественная оценка резервуара ВИЧ, как маркера для мониторинга течения инфекции и определения эффективности терапии, широко не используется в клинической практике по причине отсутствия быстрых, точных и экономичных способов оценки. Для этих целей используются такие маркеры, как вирусная нагрузки и иммунный статус. Вместе с тем, количественная оценка резервуара ВИЧ в дальнейшем позволит точнее спрогнозировать момент наступления стадии СПИД, а также продолжительность жизни ВИЧ-инфицированного пациента с момента отмены или симплификации АРВ-терапии.

На решение упомянутых задач направлено заявляемое изобретение. Настоящее техническое решение позволяет количественно, быстро, воспроизводимо в условиях потока проводить количественную оценку резервуара ВИЧ путем проведения ПНР в режиме «реального времени» за счет использования в ПНР ДНК-калибраторов с известной концентрацией гена β-глобина человека и гена pol ВИЧ. При этом, используют высококопийное и низкокопийное разведение плазмиды со встроенными фрагментами гена β-глобина человека и гена pol ВИЧ.

Два разных разведения калибраторов - высококопийные и низкокопийные, необходимы для того, чтобы построить калибровочный график, при этом для построения калибровочного графика используется среднее значение Ct для по меньшей мере двух повторов низкокопийного и по меньшей мере двух повторов высококопийного разведений калибраторов.

Для реализации заявляемого способа применяют ДНК-калибратор, который представляет из себя плазмиду со встроенным фрагментом гена pol ВИЧ и гена β-глобина человека. При этом:

- фрагмент гена pol ВИЧ характеризуется, имеет или содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из:

• SEQ ID NO: 1 или

• идентичные SEQ ID NO: 1 по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%;

- фрагмент гена β-глобина человека характеризуется, имеет или содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из:

• SEQ ID NO: 2 или

• идентичные SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.

Результатом является точное число участвовавших в ПНР копий гена β-глобина человека и копий ДНК ВИЧ, оцененных по гену pol ВИЧ.

Размер резервуара ВИЧ рассчитывается как логарифм отношения, оцененного по гену pol ВИЧ числа копий провирусной ДНК ВИЧ, умноженного на 10⁶, к 0,5 числа копий гена β-глобина человека.

Данный способ был разработан на базе ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора. При разработке данного способа использовали 393 образца, из них 194 (49,4%) от мужчин и 199 (50,6%) от женщин. Возраст варьировал от 13 до 73 лет (медиана 30 лет). Обследование проводилось в соответствии с законодательством РФ, международными этическими нормами и нормативными документами ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора при наличии письменного согласия пациентов.

Для осуществления данного способа допускается использование биологического материала, содержащего клетки человека, которые предположительно могут содержать в себе ВИЧ, например такие, как кровь, гомогенат внутренних органов, мазок со стенки буккального эпителия, ликвор. Забор образцов биологического материала осуществляется согласно стандартным протоколам.

Экстракцию тотальной ДНК из анализируемых образцов биологического материала осуществляли при помощи комплекта реагентов «АмплиСенс® РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, РФ). Концентрацию ДНК ВИЧ в клетках крови определяли методом ПНР в режиме «реального времени» с учетом результатов анализа в количественном формате. Для проведения ПНР в режиме «реального времени» используют набор реагентов, содержащий в своем составе ПЦР-смесь с праймерами специфичными к фрагменту гена pol ВИЧ и фрагменту гена β-глобина человека, например «АмплиСенс®ДНК-ВИЧ-FL» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, РФ). Постановку и анализ результатов амплификации проводили на приборе с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени» «Rotor-Gene Q» (Qiagen, ФРГ) в соответствии с инструкцией производителя. Расчет концентрации вируса выполняли в логарифмах копий на стандартное количество (10⁶) клеток человека, оцененное по β-глобиновому гену, учитывая копийность искомых генов-мишеней: однокопийный для специфической мишени вируса (участок генома ВИЧ) и двухкопийный для β-глобинового гена (участок ДНК генома человека).

В целях подтверждения реализации заявляемого способа дополнительно проводили эксперименты по проверке линейности и воспроизводимости полученных результатов посредством тестирования стандартных образцов с известной концентрацией гена β-глобина человека и гена pol ВИЧ.

Заявляемое решение реализуется следующим образом:

Методом экстракции получают ДНК из клеток, содержащихся в биологическом материале. Для экстракции может быть использован любой коммерческий комплект реагентов, например «АмплиСенс® РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, РФ). В результате проведенной экстракции получают элюат, содержащий ДНК человека и провирусную ДНК ВИЧ.

Элюат используется для постановки ПНР в режиме «реального времени» с применением ДНК-калибраторов, представляющих собой плазмиду со встроенным фрагментом гена pol ВИЧ (данный ДНК-калибратор позволяет количественно оценивать копии ВИЧ, участвовавшие в ПЦР) и плазмиду со встроенным фрагментом гена β-глобина человека (данный ДНК-калибратор позволяет количественно оценивать копии β-глобина человека, и соответственно, клеток, участвовавшие в ПЦР).

Для достижения точности калибровки и минимизации эффекта разброса значений Ct необходимо использовать высококопийный калибратор и низкокопийный калибратор, по меньшей мере, в двух повторах каждый.

Два разных разведения калибраторов - высококопийное и низкокопийное, необходимы для того, чтобы построить калибровочный график, при этом для построения калибровочного графика используется среднее значение Ct для по меньшей мере двух повторов низкокопийного и по меньшей мере двух повторов высококопийного разведений калибраторов.

Для реализации заявляемого способа предлагается к использованию ДНК-калибратор, который представляет собой:

- плазмиду со встроенным фрагментом гена pol ВИЧ, который характеризуется, имеет или содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из:

• SEQ ID NO: 1 или

• идентичные SEQ ID NO: 1 по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%;

- плазмиду со встроенным фрагментом гена β-глобина человека, который характеризуется, имеет или содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из:

• SEQ ID NO: 2 или

• идентичные SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.

Заявляемый ДНК-калибратор представляет собой плазмиду со встроенным фрагментом гена pol ВИЧ, выбранную из SEQ ID NO: 1, и со встроенным фрагментом гена β-глобина человека, выбранную из SEQ ID NO: 2, что позволяет одновременно количественно оценивать копии ВИЧ и копии β-глобина человека, и соответственно, клеток, участвовавшие в ПНР.

Заявляемый ДНК-калибратор используется, по меньшей мере, в двух повторах низкокопийного и, по меньшей мере, в двух повторах высококопийного разведений для целей построения калибровочных графиков.

На основании полученных в ПНР значений порогового цикла Ct (пересечение кривой флуоресценции с установленной пороговой линией) и, исходя из известных значений высококопийного и низкокопийного калибраторов со встроенным фрагментом гена pol ВИЧ и высококопийного и низкокопийного калибраторов со встроенным фрагментом гена β-глобина человека, происходит построение калибровочных графиков для каждого канала детекции (рисунок 1. Калибровочные графики. (а) строится на основании значений концентрации и порогового цикла для высококопийного и низкокопийного калибраторов со встроенным фрагментом гена β-глобина человека. (б) строится на основании значений концентрации и порогового цикла для высококопийного и низкокопийного калибраторов со встроенным фрагментом гена pol ВИЧ).

С помощью упомянутых графиков на основании полученных в ПЦР значений Ct для исследуемых образцов вычисляется точное число копий целевого аналита по каждому из каналов детекции.

Результатом является точное число копий гена β-глобина человека и провирусной ДНК ВИЧ, оцененной по гену pol ВИЧ, участвовавших в ПНР.

Полученные значения используются для расчета размера резервуара ВИЧ. Размер резервуара ВИЧ рассчитывается как логарифм отношения, оцененного по гену pol ВИЧ числа копий провирусной ДНК ВИЧ, умноженного на 10⁶, к 0,5 числа копий гена β-глобина человека.

Упомянутый выше расчет можно выразить следующей формулой:

где:

LR - размер резервуара, логарифм копий провирусной ДНК ВИЧ на 10⁶ клеток;

C_hiv - число копий провирусной ДНК ВИЧ в ПЦР;

C_β-glob - число копий β-глобина в ПНР.

Поскольку частота инфицированных клеток мала, а у пациентов на длительной эффективной терапии она может снизиться до минимального уровня, цель состоит в том, чтобы количественно оценить, в том числе, редко встречающиеся инфицированные клетки. Используя заявляемый ДНК-калибратор для построения калибровочных графиков достаточно среднего значения Ct для, по меньшей мере, двух повторов низкокопийного и среднего значения Ct для, по меньшей мере, двух повторов высококопийного разведения.

Заявляемое изобретение поясняется рисунками, где:

Рисунок 1. Калибровочные графики, (а) строится на основании значений концентрации и порогового цикла для высококопийного и низкокопийного калибраторов со встроенным фрагментом гена β-глобина человека, (б) строится на основании значений концентрации и порогового цикла для высококопийного и низкокопийного калибраторов со встроенным фрагментом гена pol ВИЧ.

Рисунок 2. Графики накопления флуоресцентного сигнала для образцов от пациента А и калибраторов, (а) канал, детектирующий сигнал для фрагмента гена β-глобина человека; (б) канал, детектирующий сигнал для фрагмента гена pol ВИЧ.

Рисунок 3. Калибровочные графики, пациент А. (а) канал, детектирующий сигнал для фрагмента гена β-глобина человека; (б) канал, детектирующий сигнал для фрагмента гена pol ВИЧ.

Рисунок 4. Графики накопления флуоресцентного сигнала для образцов от пациента Б и калибраторов, (а) канал, детектирующий сигнал для фрагмента гена β-глобина человека; (б) канал, детектирующий сигнал для фрагмента гена pol ВИЧ.

Рисунок 5. Калибровочные графики, пациент Б. (а) канал, детектирующий сигнал для фрагмента гена β-глобина человека; (б) канал, детектирующий сигнал для фрагмента гена pol ВИЧ.

Рисунок 6. Графики накопления флуоресцентного сигнала для образцов от пациента В и калибраторов. (а) канал, детектирующий сигнал для фрагмента гена β-глобина человека; (б) канал, детектирующий сигнал для фрагмента гена pol ВИЧ.

Рисунок 7. Калибровочные графики, пациент В. (а) канал, детектирующий сигнал для фрагмента гена β-глобина человека; (б) канал, детектирующий сигнал для фрагмента гена pol ВИЧ.

Примеры осуществления:

Пример 1. Пациент А, мужчина, 35 лет, ИФА+16.05.2019.

В качестве биологического материала использована цельная кровь. Отбор образцов биологического материала и получение клеток осуществлялись согласно стандартному протоколу. Экстракция проводилась методом преципитации с использованием комплекта реагентов «АмплиСенс® РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, РФ). В результате проведенной экстракции получили элюат, в котором содержались ДНК человека и провирусная ДНК ВИЧ.

Для постановки ПНР в режиме «реального времени» использовали набор реагентов «АмплиСенс® ДНК-ВИЧ-FL», ПЦР-смесь в составе которого содержит праймеры, специфичные к фрагменту гена pol ВИЧ и фрагменту гена β-глобина человека и ДНК-калибраторы, представляющие собой плазмиду со встроенным фрагментом гена pol ВИЧ, выбранным из SEQ ID NO: 1, и со встроенным фрагментом гена β-глобина человека, выбранным из SEQ ID NO: 2. Подготовили высококопийные и низкопийные разведения калибраторов, то есть 86700 и 185 для ДНК-калибратора, представляющего собой плазмиду со встроенным фрагментом гена pol ВИЧ, соответственно, и 25000 и 250 для ДНК-калибратора, представляющего собой плазмиду со встроенным фрагментом гена β-глобина человека, соответственно. Провели ПЦР реакцию в соответствие с инструкцией к набору реагентов в двух повторах для исследуемого образца.

В результате проведенной ПЦР были получены значения порогового цикла Ct, равные 17,08 и 16,91; 23,79 и 23,85 для высококопийного и низкокопийного разведения ДНК-калибратора, представляющего собой плазмиду со встроенным фрагментом гена β-глобина человека, соответственно, и равные 16,92 и 17,04; 26,23 и 26,12 для высококопийного и низкокопийного разведения ДНК-калибратора, представляющего собой плазмиду со встроенным фрагментом гена pol ВИЧ, соответственно, а также графики накопления флуоресцентного сигнала, включая значения Ct для каждого из повторов (представлены на рисунке 2. Графики накопления флуоресцентного сигнала для образцов от пациента А и калибраторов. (а) канал, детектирующий сигнал для фрагмента гена β-глобина человека; (б) канал, детектирующий сигнал для фрагмента гена pol ВИЧ).

С использованием значений порогового цикла Ct и, исходя из известных значений калибраторов, были получены средние Ct, равные 16,995 и 23,82 для высококопийного и низкокопийного разведения ДНК-калибратора, представляющего собой плазмиду со встроенным фрагментом гена β-глобина человека, соответственно, и равные 16,98 и 26,175 для высококопийного и низкокопийного разведения ДНК-калибратора, представляющего собой плазмиду со встроенным фрагментом гена pol ВИЧ, соответственно, и построены калибровочные графики (представлены на рисунке 3. Калибровочные графики, пациент А. (а) канал, детектирующий сигнал для фрагмента гена β-глобина человека; (б) канал, детектирующий сигнал для фрагмента гена pol ВИЧ).

С помощью полученных графиков на основании полученных в ПНР значений Ct для исследуемого образца вычисляется точное число копий гена β-глобина человека и ДНК ВИЧ, участвовавших в ПЦР.

Полученные значения использовали для расчета размера клеточного резервуара ВИЧ. Для расчета применили формулу:

где:

LR - размер резервуара, логарифм копий провирусной ДНК ВИЧ на 10⁶ клеток;

C_hiv - число копий провирусной ДНК ВИЧ в ПЦР;

C_β-glob - число копий β-глобина в ПНР.

Результаты количественной оценки резервуара ВИЧ отражены в таблице 1 «Расчет размера клеточного резервуара для пациента А»

Таким образом, заявляемый способ позволяет оценить размер резервуара ВИЧ и в дальнейшем интерпретировать для оценки эффективности АРВ-терапии и мониторинга течения инфекции.

Пример 2. Пациент Б, женщина, 43 года, ИФА+11.10.2016.

В качестве биологического материала использован мазок со стенки буккального эпителия. Отбор образцов биологического материала и получение клеток осуществлялись согласно стандартному протоколу. Экстракция проводилась методом преципитации с использованием комплекта реагентов «АмплиСенс® РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, РФ). В результате проведенной экстракции получили элюат, в котором содержались ДНК человека и провирусная ДНК ВИЧ.

Для постановки ПНР в режиме «реального времени» использовали набор реагентов «АмплиСенс® ДНК-ВИЧ-FL», ПЦР-смесь в составе которого содержит праймеры, специфичные к фрагменту гена pol ВИЧ и фрагменту гена β-глобина человека и ДНК-калибраторы, представляющие собой плазмиду со встроенным фрагментом гена pol ВИЧ, выбранным из SEQ ID NO: 1, и со встроенным фрагментом гена β-глобина человека, выбранным из SEQ ID NO: 2. Подготовили высококопийные и низкопийные разведения калибраторов, то есть 86700 и 185 для ДНК-калибратора, представляющего собой плазмиду со встроенным фрагментом гена pol ВИЧ, соответственно, и 25000 и 250 для ДНК-калибратора, представляющего собой плазмиду со встроенным фрагментом гена β-глобина человека, соответственно. Провели ПНР реакцию в соответствие с инструкцией к набору реагентов в двух повторах для исследуемого образца.

В результате проведенной ПНР были получены значения порогового цикла Ct, равные 17,08 и 16,91; 23,79 и 23,85 для высококопийного и низкокопийного разведения ДНК-калибратора, представляющего собой плазмиду со встроенным фрагментом гена β-глобина человека, соответственно, и равные 16,92 и 17,04; 26,23 и 26,12 для высококопийного и низкокопийного разведения ДНК-калибратора, представляющего собой плазмиду со встроенным фрагментом гена pol ВИЧ, соответственно, а также графики накопления флуоресцентного сигнала, включая значения Ct для каждого из повторов (представлены на рисунке 4. Графики накопления флуоресцентного сигнала для образцов от пациента Б и калибраторов. (а) канал, детектирующий сигнал для фрагмента гена β-глобина человека; (б) канал, детектирующий сигнал для фрагмента гена pol ВИЧ).

С использованием значений порогового цикла Ct и, исходя из известных значений калибраторов, были получены средние Ct, равные 16,995 и 23,82 для высококопийного и низкокопийного разведения ДНК-калибратора, представляющего собой плазмиду со встроенным фрагментом гена β-глобина человека, соответственно, и равные 16,98 и 26,175 для высококопийного и низкокопийного разведения ДНК-калибратора, представляющего собой плазмиду со встроенным фрагментом гена pol ВИЧ, соответственно, и построены калибровочные графики (представлены на рисунке 5. Калибровочные графики, пациент Б. (а) канал, детектирующий сигнал для фрагмента гена β-глобина человека; (б) канал, детектирующий сигнал для фрагмента гена pol ВИЧ).

С помощью полученных графиков на основании полученных в ПЦР значений Ct для исследуемого образца вычисляется точное число копий гена β-глобина человека и ДНК ВИЧ, участвовавших в ПЦР.

Полученные значения использовали для расчета размера клеточного резервуара ВИЧ. Для расчета применили формулу

где:

LR - размер резервуара, логарифм копий провирусной ДНК ВИЧ на 10⁶ клеток;

C_hiv - число копий провирусной ДНК ВИЧ в ПЦР;

C_β-glob - число копий β-глобина в ПНР.

Результаты количественной оценки резервуара ВИЧ отражены в таблице 2 «Расчет размера клеточного резервуара для пациента Б»

Таким образом, предлагаемое решение позволяет оценить размер резервуара ВИЧ и в дальнейшем интерпретировать для оценки эффективности АРВ-терапии и мониторинга течения инфекции.

Пример 3. Пациент В, женщина, 32 года, ИФА+17.12.15.

В качестве биологического материала использован ликвор. Отбор образцов биологического материала и получение клеток осуществлялись согласно стандартному протоколу. Экстракция проводилась методом преципитации с использованием комплекта реагентов «АмплиСенс® РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, РФ). В результате проведенной экстракции получили элюат, в котором содержались ДНК человека и провирусная ДНК ВИЧ.

Для постановки ПНР в режиме «реального времени» использовали набор реагентов «АмплиСенс® ДНК-ВИЧ-FL», ПЦР-смесь в составе которого содержит праймеры, специфичные к фрагменту гена pol ВИЧ и фрагменту гена β-глобина человека и ДНК-калибраторы, представляющие собой плазмиду со встроенным фрагментом гена pol ВИЧ, выбранным из SEQ ID NO: 1, и со встроенным фрагментом гена β-глобина человека, выбранным из SEQ ID NO: 2. Подготовили высококопийные и низкопийные разведения калибраторов, то есть 86700 и 185 для ДНК-калибратора, представляющего собой плазмиду со встроенным фрагментом гена pol ВИЧ, соответственно, и 25000 и 250 для ДНК-калибратора, представляющего собой плазмиду со встроенным фрагментом гена β-глобина человека, соответственно. Провели ПНР реакцию в соответствие с инструкцией к набору реагентов в двух повторах для исследуемого образца.

В результате проведенной ПНР были получены значения порогового цикла Ct, равные 17,08 и 16,91; 23,79 и 23,85 для высококопийного и низкокопийного разведения ДНК-калибратора, представляющего собой плазмиду со встроенным фрагментом гена β-глобина человека, соответственно, и равные 16,92 и 17,04; 26,23 и 26,12 для высококопийного и низкокопийного разведения ДНК-калибратора, представляющего собой плазмиду со встроенным фрагментом гена pol ВИЧ, соответственно, а также графики накопления флуоресцентного сигнала, включая значения Ct для каждого из повторов (представлены на рисунке 6. Графики накопления флуоресцентного сигнала для образцов от пациента В и калибраторов. (а) канал, детектирующий сигнал для фрагмента гена β-глобина человека; (б) канал, детектирующий сигнал для фрагмента гена pol ВИЧ).

С использованием значений порогового цикла Ct и, исходя из известных значений калибраторов, были получены средние Ct, равные 16,995 и 23,82 для высококопийного и низкокопийного разведения ДНК-калибратора, представляющего собой плазмиду со встроенным фрагментом гена β-глобина человека, соответственно, и равные 16,98 и 26,175 для высококопийного и низкокопийного разведения ДНК-калибратора, представляющего собой плазмиду со встроенным фрагментом гена pol ВИЧ, соответственно, и построены калибровочные графики (представлены на рисунке 7. Калибровочные графики, пациент В. (а) канал, детектирующий сигнал для фрагмента гена β-глобина человека; (б) канал, детектирующий сигнал для фрагмента гена pol ВИЧ).

С помощью полученных графиков на основании полученных в ПЦР значений Ct для исследуемого образца вычисляется точное число копий гена β-глобина человека и ДНК ВИЧ, участвовавших в ПНР.

Полученные значения использовали для расчета размера клеточного резервуара ВИЧ. Для расчета применили формулу

где:

LR - размер резервуара, логарифм копий провирусной ДНК ВИЧ на 10⁶ клеток;

C_hiv - число копий провирусной ДНК ВИЧ в ПЦР;

C_β-glob - число копий β-глобина в ПНР.

Результаты количественной оценки резервуара ВИЧ отражены в таблице 3 «Расчет размера клеточного резервуара для пациента В»

Полученный результат может свидетельствовать об эффективности проводимой АРВ-терапии и подавленном течении инфекции.

Таким образом, заявляемые способ и ДНК-калибраторы для его осуществления позволяют в короткие сроки проводить количественную оценку размера резервуара ВИЧ в условиях потока с получением точного результата.

--->

Перечень последовательностей

<110> ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора

<120>

<160>

<210> SEQ ID NO: NO 1

<211> 1618

<212> DNA

<213>

<400> SEQUENCE 1 (proviral HIV DNA, pol):

CCTCAGGTCACTCTTTGGCAACGACCCCTCGTCACAATAAAGATAGGGGGGCAACTAAAGGAAGCTCT

ATTAGATACAGGAGCAGATGATACAGTATTAGAAGAAATGAGTTTGCCAGGAAGATGGAAACCAAAAA

TGATAGGGGGAATTGGAGGTTTTATCAAAGTAAGACAGTATGATCAGATACTCATAGAAATCTGTGGA

CATAAAGCTATAGGTACAGTATTAGTAGGACCTACACCTGTCAACATAATTGGAAGAAATCTGTTGAC

TCAGATTGGTTGCACTTTAAATTTTCCCATTAGCCCTATTGAGACTGTACCAGTAAAATTAAAGCCAG

GAATGGATGGCCCAAAAGTTAAACAATGGCCATTGACAGAAGAAAAAATAAAAGCATTAGTAGAAATT

TGTACAGAGATGGAAAAGGAAGGGAAAATTTCAAAAATTGGGCCTGAAAATCCATACAATACTCCAGT

ATTTGCCATAAAGAAAAAAGACAGTACTAAATGGAGAAAATTAGTAGATTTCAGAGAACTTAATAAGA

GAACTCAAGACTTCTGGGAAGTTCAATTAGGAATACCACATCCCGCAGGGTTAAAAAAGAAAAAATCA

GTAACAGTACTGGATGTGGGTGATGCATATTTTTCAGTTCCCTTAGATGAAGACTTCAGGAAGTATAC

TGCATTTACCATACCTAGTATAAACAATGAGACACCAGGGATTAGATATCAGTACAATGTGCTTCCAC

AGGGATGGAAAGGATCACCAGCAATATTCCAAAGTAGCATGACAAAAATCTTAGAGCCTTTTAGAAAA

CAAAATCCAGACATAGTTATCTATCAATACATGGATGATTTGTATGTAGGATCTGACTTAGAAATAGG

GCAGCATAGAACAAAAATAGAGGAGCTGAGACAACATCTGTTGAGGTGGGGACTTACCACACCAGACA

AAAAACATCAGAAAGAACCTCCATTCCTTTGGATGGGTTATGAACTCCATCCTGATAAATGGACAGTA

CAGCCTATAGTGCTGCCAGAAAAAGACAGCTGGACTGTCAATGACATACAGAAGTTAGTGGGGAAATT

GAATTGGGCAAGTCAGATTTACCCAGGGATTAAAGTAAGGCAATTATGTAAACTCCTTAGAGGAACCA

AAGCACTAACAGAAGTAATACCACTAACAGAAGAAGCAGAGCTAGAACTGGCAGAAAACAGAGAGATT

CTAAAAGAACCAGTACATGGAGTGTATTATGACCCATCAAAAGACTTAATAGCAGAAATACAGAAGCA

GGGGCAAGGCCAATGGACATATCAAATTTATCAAGAGCCATTTAAAAATCTGAAAACAGGAAAATATG

CAAGAATGAGGGGTGCCCACACTAATGATGTAAAACAATTAACAGAGGCAGTGCAAAAAATAACCACA

GAAAGCATAGTAATATGGGGAAAGACTCCTAAATTTAAACTGCCCATACAAAAGGAAACATGGGAAAC

ATGGTGGACAGAGTATTGGCAAGCCACCTGGATTCCTGAGTGGGAGTTTGTTAATACCCCTCCCTTAG

TGAAATTATGGTACCAGTTAGAGAAAGAACCCATAGTAGGAGCAGAAACCTTCT 1618 2

<210> SEQ ID NO: NO 2

<211> 300

<212> DNA

<213>

<400> SEQUENCE 2 (beta-globin, Homo sapiens):

TCTGTCTCCACATGCCCAGTTTCTATTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTGTAACCTTGATACCAA

CCTGCCCAGGGCCTCACCACCAACTTCATCCACGTTCACCTTGCCCCACAGGGCAGTAACGGC

AGACTTCTCCTCAGGAGTCAGATGCACCATGGTGTCTGTTTGAGGTTGCTAGTGAACACAGTT

GTGTCAGAAGCAAATGTAAGCAATAGATGGCTCTGCCCTGACTTTTATGCCCAGCCCTGGCTC

CTGCCCTCCCTGCTCCTGGGAGTAGATTGGCCAACCCTAGGGTGTGGC 300

<---

1. Способ количественной оценки резервуара ВИЧ, включающий выделение ДНК из образца биологического материала, проведение реакции ПЦР в режиме «реального времени» с использованием ДНК-калибратора с известной концентрацией, построение калибровочных графиков и определение размера резервуара ВИЧ, где при проведении ПЦР в режиме «реального времени» используют высококопийное и низкокопийное разведения ДНК-калибратора, представляющего собой плазмиду с известной концентрацией гена β-глобина человека и гена pol ВИЧ, при этом каждое разведение калибратора используется по меньшей мере в двух повторах.

2. Способ количественной оценки резервуара ВИЧ по п. 1, отличающийся тем, что для построения калибровочного графика используется среднее значение Ct для по меньшей мере двух повторов низкокопийного и двух повторов высококопийного разведения калибратора.

3. Способ количественной оценки резервуара ВИЧ по п. 1, отличающийся тем, что размер резервуара ВИЧ рассчитывается как логарифм отношения оцененного по гену pol ВИЧ числа копий провирусной ДНК ВИЧ, умноженного на 10⁶, к 0,5 числа копий гена β-глобина человека.

4. ДНК-калибратор для реализации способа по пп. 1-3, представляющий собой плазмиду со встроенным фрагментом гена pol ВИЧ и гена β-глобина человека, где последовательность гена pol ВИЧ выбрана из SEQ ID NO: 1, а последовательность гена β-глобина человека выбрана из SEQ ID NO: 2.