Оптический сенсор для тушения флуоресценции оптически активных аминокислот тромбоцитов и способ его получения

Изобретение «Оптический сенсор для тушения флуоресценции оптически активных аминокислот тромбоцитов и способ его получения относится к области физики, а именно к оптике, и представляет собой устройство - оптический сенсор, основанный на эффекте тушения флуоресценции и применяемый для анализа аминокислотного состава тромбоцитов. Сенсор способен определять тушить флуоресценцию сильнофлуоресцирующих соединений до 34% базовой интенсивности. Сенсор включает в себя коллоидный раствор аблированных в ультрачистой воде платиновых наночастиц, которые смешиваются с тромбоцитарной массой для осуществления последующей спектральной и время-разрешенной детекции с помощью спектрофлуориметра. Изобретение может быть использовано в физике, биофизике, медицине. 2 н.п. ф-лы.

 

Изобретение относится к области физики, а именно к оптике, и представляет собой устройство - оптический сенсор, основанный на эффекте тушения флуоресценции оптически активных аминокислот тромбоцита посредством концентрационного тушения наночастицами химически и биологически инертной платины. Изобретение может быть использовано в физике, медицине, биофизике.

Известны работы, являющиеся предпосылками заявляемого изобретения. Нижеприведенные примеры составляют часть предпосылок заявляемого изобретения и/или раскрывают методики, которые можно применять к некоторым аспектам заявляемого изобретения.

В частности, в работе (Akbay N. et al. Metal-enhanced intrinsic fluorescence of nucleic acids using platinum nanostructured substrates // Chemical physics letters. - 2012. - T. 548. - C. 45-50) предложен метод оптической детекции ДНК, используя эффект металл-усиленной флуоресценции платины. Представлены экспериментальные и расчетные исследования, показывающие влияние наночастиц Pt на эмиссию флуорофоров в УФ-диапазоне. В работе было проведено моделирование монетообразных наночастиц, и были изучены различные размеры наночастиц, изменяющиеся в зависимости от высоты частиц. Мы заметили, что разделенные полумонеты обеспечивают более сильное усиление ближнего поля по сравнению с монетоподобными наночастицами платины. Моделирование показало, что степень усиления излучения флуоресценции от флуорофоров, расположенных между полумонетами, увеличивается с уменьшением расстояния между полумонетами. Эти результаты показывают, что величина усиления достаточно сильно зависит от величины промежутка между полумонетами. Экспериментальные исследования показали, что присутствие наночастиц Pt приводит к увеличению интенсивности флуоресценции четырех нуклеотидов GMP, ТМР, UMP, СМР и G-квадруплекса ДНК. GMP и UMP показали самый высокий коэффициент усиления в присутствии наноструктур платины. Впервые показано, что экспериментальные и численные результаты позволяют предположить, что наноструктуры платины потенциально могут быть использованы для усиления собственной эмиссии нуклеиновых кислот. В работе (Di Mauro A. et al. Effect of Pt nanoparticles on the photo-catalytic activity of ZnO nanofibers // Nanoscale research letters. - 2015. - T. 10. - №. 1. -C. 1-7) показаны перспективы применения наночастиц платины в применении к нанотрубкам ZnO в смеси с наночастицами платины. В работе продемонстрировано увеличение степени фотодеградации комплеса Pt-ZnO на порядка 40% благодаря плазмонной энергии наночастиц платины. Показано увеличение флуоресценции красителя, находящегося в контакте с комплексом. В работе (Langhammer С. et al. Plasmonic properties of supported Pt and Pd nanostructures // Nano letters. - 2006. - T. 6. - №.4. - C. 833-838) представлены результаты исследований поверхностного плазмонного резонанса, индуцируемого на платиновых и палладиевых нанодисках. Показано, что плазмонный резонанс может быть индуцирован в ультрафиолетовой и видимой областях спектра. Авторы работы продемонстрировали возможность настройки максимума плазмонного резонанса в зависимости от метода изготовления структур.

Известно изобретение «Применение органических красителей в качестве средства для лечения онкологических заболеваний» (патент №RU 2354384 С1). В патенте приведены подходы к тушению оптических аминокислот, в частности триптофанов различными веществами. В дополнение к тушению кислородом и йодид-ионами триптофан тушится такими веществами, как акриламид, сукцинимид, пероксид водорода, дихлорацетамид, пиридингидрохлорид, цистеин, хлорированные углеводороды, NO₃^-, IO₃^-, Cs⁺, Cu²⁺, Pb²⁺, Cd²⁺ и Mn²⁺. Показано, что эта чувствительность к различного рода тушителям обусловлена склонностью возбужденного индольного ядра донировать электроны во время нахождения в возбужденном состоянии. Поскольку белки содержат три аминокислотных остатка, которые могут давать вклад в ультрафиолетовую флуоресценцию: тирозин (Tyr), триптофан (Trp) и фенилаланин (Phe). Флуоресценция белков обычно возбуждается в максимуме поглощения при 280 нм или больших длинах волн. Максимум испускания триптофана в воде находится при 348 нм и сильно зависит от полярности. (Интернет, www.enzyme.chem.msu.ru глава 11. Флуоресценция белков). В патенте приведены подходы использования красителей с низким порогом активации для терапии раковых опухолей. В частности, предлагается применение широко доступных и недорогих веществ (красителей), не токсичных и не вызывающих побочных явлений при их использовании в фармацевтически приемлемых дозах, сокращении сроков лечения, увеличении эффективности лечения.

Недостатком данного изобретения является невозможность прямого анализа концентрационного содержания флуоресцентных аминокислот в опухолях и невозможность подавления их флуоресценции для анализа других и малофлуоресцентных составляющих клеточной мембраны.

Известно изобретение «Способ и устройство для анализа взаимодействий биологических молекул на биологическом микрочипе на основе флуоресценции амин-кислотных остатков триптофана» (патент №RU 2588816 С2), в котором предлагается способ и устройство для анализа взаимодействий между биологическими молекулами (нуклеиновыми кислотами, углеводородами, липидами, пептидами и белками), иммобилизованными в ячейках биологического микрочипа, и молекулами, флуоресцирующими в УФ области спектра, включая белки, пептиды, гликопротеины, протеогликаны и другие соединения, последовательность которых содержит один или более аминокислотных остатков триптофана (Trp). Биологические молекулы, например, молекулы нуклеиновых кислот, иммобилизованные в разных ячейках биочипа, взаимодействуют с раствором анализируемого вещества, например, белка, аминокислотная последовательность которого содержит один или более аминокислотных остатков триптофана (Trp). Интенсивность флуоресценции флуорофор-содержащих аминокислотных остатков триптофана на биочипе измеряют в УФ области спектра (300-400 нм) с помощью специализированного анализатора биочипов, приспособленного для работы в УФ диапазоне (возбуждение 250-300 нм, флуоресценция 300-400 нм). Применение изобретения позволяет исключить использование флуоресцентных меток для регистрации связывания и анализировать взаимодействие биологических молекул, с биологическими молекулами на биочипе по УФ флуоресценции природного флуорофора - аминокислотного остатка триптофана.

Недостатком предложенного решения является невозможность тушения флуоресценции данных остатков высокофлуоресцентной аминокислоты для анализа иных низкофлуоресцирующих аминокислот в диапазоне длин волн возбуждения 250-300 нм.

Известно изобретение «Гибридный полипептид, презентующий аминокислотные последовательности и его применение» №RU (11) 2630660 (13) С2, в котором, в одной из стадий применяется сходный эффект тушения флуоресценции, необходимый для синтеза. В частности, применяется температурно-зависимое тушение собственной флуоресценции триптофана при 350 нм, обусловленной сольватохромным эффектом, которое будет существенно ослабевать при нахождении триптофана внутри свернутого белка FKBP12. При изменении температуры от 25°С до 85°С не было выявлено других пиков в спектре испускаемой флуоресценции, но было обнаружено температуро-зависимое тушение флуоресценции при 350 нм. Эмиссии при длине волны 320 нм, являющейся показателем структурной целостности FKBP12, зарегистрировано не было.

Недостатком данного изобретения является применение температурного тушения, поскольку воздействие высоких температур, описанных в патенте однозначно изменит оптические свойства объектов, заявляемых в составе данного решения.

За прототип выбрано изобретение «Фосфолипидная композиция и способ ее получения» (патент №RU 2119791 C1, A61K 9/127 (1995.01), содержащее сходный с используемым в заявленном способе метод проявления изолированных флуоресцентных групп в глубине фосфолипидной композиции G-CSF и DOPG. В частности, в патенте применяется тушение триптофановой флуоресценции иодидом калия на поверхности композиции. В тоже самое время в глубине композиции тушение не происходит, поскольку иодид калия не может проникать через липидные мембраны. Показано, что эффективное тушение триптофанной флуоресценции иодидом показывает доступность групп основной массе водного растворителя, в то время как защита от иодидного гашения наблюдается в случае, когда триптофаны протеина изолированы от водного растворителя.

Основным недостатком изобретения является применения йодида калия в качестве тушителя, поскольку иодид калия является лекарственным средством и активным химическим веществом, которое, вступая во взаимодействие с белковыми и клеточными биологическими структурами, может оказывать влияние на них и изменять их, оказывая, таким образом, влияние на спектры флуоресценции.

Несовершенство данного изобретения заключается в технологической и экспериментальной сложности изготовления подобной композиции. Другим недостатком изобретения является использования соединений (в частности иодида калия) которое является слаботоксичным лекарственным средством и может изменять нативное состояние тромбоцита при его анализе in vitro. Вышеизложенное ограничивает применение данного изобретения для точной диагностики аминокислотного и иного оптически активных соединений биомолекул in vitro.

Задачей заявляемого изобретения является создание и применение сферических наночастиц платины для регистрации тушения флуоресценции тромбоцитов (до 34% процентов от контрольной), основанной на отклике флуоресцентных агентов тромбоцитарной массы и оптически активных аминокислот. Тушение происходит посредством образования комплексов с платиновыми наночастицами, полученными методом фемтосекундной лазерной абляции из металлической пластины платины. Данное изобретение позволяет тушить флуоресценцию оптически-активных аминокислот (триптофана, тирозина, фенилаланина), содержащихся в клетках и белках живых организмов и использовать этот эффект для анализа иных низкофлуоресцентных соединений.

Поставленная задача решается тем, что создается оптический сенсор на базе химически и биологически инертной платины, который используется для уменьшения интенсивности сильнофлуоресцентных оптически активных аминокислотных остатков тромбоцитарной массы до порядка 34% от первоначального значения. Сенсор синтезируется из пластины металла с помощью фемтосекундного лазера и стабилизированной в водной фазе, согласно изобретению, включает в себя коллоидный водный раствор стабилизированных наночастиц платины размером 51 нм, помещенных в пластиковую пробирку, изготовленных методом фемтосекундной лазерной абляции из металлической пластины в жидкой фазе.

В способе получения оптического сенсора для уменьшения интенсивности сильнофлуоресцентных оптически активных аминокислотных остатков тромбоцитарной массы, при котором, создают сферическую наноструктуру, содержащую коллоидный раствор платиновых наночастиц, согласно изобретению, помещают металлическую пластину химически чистой платины, чистотой 99,99% размером 1x1 см в кварцевую кювету с водой, имеющей удельное сопротивление 18,2 MΩ/см, затем воздействуют на данную пластину фемтосекундным лазером с длиной волны λ=1032 нм, мощностью импульса 15 мкДж и длительностью импульса 280 фс в течение времени от 1 до 7 минут. В результате чего синтезируется стабилизированный коллоидный раствор платиновых наночастиц средним размером 51 нм и объемом 1,5 мл.

Созданный заявляемым способом оптический сенсор позволяет получать ослабленный по интенсивности (потушенный) и повторяемый сигнал флуоресценции от тромбоцитов и оптически активных аминокислот (триптофана, тирозина, фенилаланина), содержащихся в них.

Заявленный способ основан на создании структуры с использованием эффекта концентрационного тушения флуоресценции биосовместимыми и инертными наночастицами платины и последующей чувствительной детекции такого тушения аминокислот, находящихся в составе тромбоцита. Способ заключается в получении платиновых наночастиц методом фемтосекундной лазерной абляции и применении их в детекции флуоресцении тромбоцитарной массы. Первым этапом, пластину из химически чистой платины размером 1x1 см (чистота 99,99%) помещали в кварцевую кювету со сверхчистой водой (Millipore Direct 3-UV, Merck) и фемтосекундной лазерной установкой Avesta ТЕТА-25/30 (ООО «Авеста», Россия). На установке был смонтирован компрессор ТЕТА (система усилителя ТЕТА Yb), который использовался для абляции. Энергия и длительность импульса лазерного луча на λ=1032 нм составляли 15 мкДж и 280 фс соответственно. Частота повторения и количество импульсов задавались внешним генератором. Объем раствора в кювете составлял 1,5 мл, время абляции варьировали от 1 до 7 минут. Общий объем каждого образца составлял 1,5 мл. Толщина слоя дистиллированной воды над поверхностью металлической пластины составляла 1 мм. Каждый пакет лазерных импульсов фокусировался на новое место пластины. Для проведения абляции кювета устанавливалась на прецизионный моторизованный позиционер 8 MTF-102LS05 (Standa, Литва), управляемый программой XILab. После абляции раствор приобретал слегка серый цвет. Гидродинамический радиус полученных НЧ был измерен методом динамического рассеяния света на установке PhotoCorr Complex (ООО «ФотоКорр», Россия) и достигал в максимуме распределения 51 нм. Плазмонная активность наночастиц проверялась на спектрофотометре UV-2600 (Shimadzu, Япония), где и была зарегистрирована полоса поглощения плазмонов платины в максимуме при λ=251 нм. После синтеза наночастиц и для проведения измерений флуоресценции, времени жизни и квантового выхода было наночастицы платины и тромбоциты были разделены на две пробирки по 15 мкл каждая. Затем для получения той же концентрации тромбоцитов в первую пробирку добавляли 15 мкл водного раствора хлорида натрия, а во вторую - 15 мкл коллоидного раствора НЧ платины. После этого каждый образец слегка встряхивали. В результате для экспериментальной части готовилось 30 экспериментальных образцов (15 образцов без наночастиц платины и 15 образцов с наночастицами платины). Мы использовали прозрачные кварцевые кюветы и подложки в ультрафиолетовом и видимом диапазонах для всех экспериментов со спектральным и временным разрешением. Прозрачное УФ-видимое кварцевое стекло размером 4×4×1 мм помещалось в кварцевый держатель размером 30×20×3 мм. Все кварцевые кюветы и держатели очищали изопропиловым спиртом, промывали водой Milli-Q (18,2 МОм/см) и сушили при комнатной температуре в закрытом чистом боксе. Затем на каждую из двух подложек наносили по 5 мкл образца и оставляли в покое до полного высыхания (~30 мин), после чего осуществляли флуоресцентную съемку контролей и экспериментальных образцов, анализируя затем, изменения флуоресценции, квантового выхода и времени жизни флуоресценции.

1. Оптический сенсор для тушения флуоресценции оптически активных аминокислот тромбоцитов, состоящий из коллоидного раствора наночастиц металла, отличающийся тем, что изготавливается из химически и биологически инертной платины, размером 51 нм, находящейся в состоянии коллоидного раствора в пробирке.

2. Способ получения оптического сенсора для тушения флуоресценции оптически активных аминокислот тромбоцитов, при котором создают наночастицу платины, отличающийся тем, что пластину из химически чистой платины размером 1×1 см помещают в кварцевую кювету с водой, имеющей удельное сопротивление 18,2 MΩ/см, и аблируют с помощью фемтосекундных импульсов энергией 15 мкДж, длительностью импульса 280 фс, длиной волны λ=1032 нм, получая таким образом в течение времени от 1 до 7 минут коллоидный раствор наночастиц платины объемом 1,5 мл.