Применение т5 промотора для экспрессии гена бета-литической протеазы lysobacter capsici vkm b-2533т и штамм l. capsici blp pт5-продуцент данной протеазы

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению бета-литической протеазы Blp. Предложена плазмидная ДНК pBBR1-MCS5blp-P_T5, обеспечивающая экспрессию бета-литической протеазы Blp и содержащая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, включающую последовательность промотора Т5, гена blp, кодирующего Blp из L. capsici VKM В-2533^T, и последовательность терминатора транскрипции lambda t₀. Также предложен штамм L. capsici blp P_T5, являющийся продуцентом бета-литической протеазы Blp и полученный путем трансформации штамма L. capsici VKM В-2533^T плазмидной ДНК pBBR1-MCS5blp-P_T5. Изобретение позволяет получить Blp с выходом 43.99±3,79 мг/л. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 2 пр.

 

Область техники

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению бета-литической протеазы Blp из штаммов-продуцентов данной протеазы.

Уровень техники

Проблема распространения экстремально устойчивых к антибиотикам бактерий, в т.ч. значительно осложняющих течение вирусных заболеваний, требует поиска новых антимикробных агентов и разработки новых лекарственных препаратов. В качестве альтернативы антибиотикам выступают бактериолитические ферменты. Внеклеточные бактериолитические ферменты бактерий гидролизуют пептидогликан - основной структурный компонент клеточных стенок бактерий, приводя к лизису клеток-мишеней. Изучение этих ферментов в качестве основы антимикробных лекарственных средств затруднено отсутствием эффективной экспрессионной системы для них. Большинство ранее созданных систем экспрессии для бактериолитических ферментов имели ряд сложно решаемых проблем: 1) отсутствие секреции целевых белков из рекомбинантного штамма; 2) формирование телец-включения с невозможностью рефолдинга белков; 3) «токсичность» бактериолитических ферментов для рекомбинантных штаммов, приводящая к лизису их клеток. Решить эти проблемы возможно созданием гомологичной системы экспрессии для бактериолитических ферментов бактерий рода Lysobacter.

Бета-литическая протеаза (ЕС 3.4.24.32) (Blp) является бактериолитическим ферментом, обладающим сильным литическим эффектом в отношении живых клеток различных штаммов Staphylococcus aureus, включая MRSA, Micrococcus luteus В-1813^T, Kocuria rosea Ac-2200^Т. В связи с этим Blp представляет огромный интерес для биомедицины [1]. Согласно классификации базы данных протеаз MEROPS, Blp относится к семейству металлопротеаз М23А клана МО. Blp была впервые выделена в 1965 г. из культуральной жидкости почвенной бактерии Myxobacter 495 (в настоящее время Myxobacter 495 классифицируют как L. enzymogenes). В 2020 г. Blp была выделена из L. capsici VKM В-2533^T [2] и детально охарактеризована [1]. Blp L. capsici VKM В-2533^T представляет собой секретируемый белок молекулярной массой 19 кДа. Установлено, что для проявления бактериолитической активности оптимальными условиями являются: рН 9.0, концентрации буфера 5.0 мМ, температуры 50°С. Температура полуинактивации фермента составила 57°С. Фермент стабилен при рН от 4 до 7 и от 10 до 11. Установлено, что в присутствии 1% раствора Triton Х-100 активность фермента сохраняется. При такой же концентрации SDS и Н₂О₂ активность фермента снижается вдвое. Методом спот-теста показано, что Blp гидролизует казеин, гемоглобин, эластин, желатин, коллаген, азофибрин. Фермент лизирует живые клетки метициллинрезистентного стафилококка с высокой эффективностью (MIC - 2.85 мкг/мл). Впервые установлен тип гидролизуемых связей Blp в субстратах (миоглобин, гемоглобин, овальбумин, овомукоид): Gly-Ala; Gly-Lys; Gly-Ser; Gly-Thr; Lys-Glu; Glu-Leu; Ser-Lys; Phe-Thr; Ala-Val; Ala-Ala; Ala-His; Ala-Ser; Val-Ser [l].

В настоящее время для Blp создана система экспрессии на основе штамма Escherichia coli BL21 (DE3) (pLysE, рЕТ - 19mod-Bl) [2]. Однако получение рекомбинантного белка в данной системе значительно осложняется необходимостью проведения процедуры рефолдинга, небольшим выходом и значительной потерей его активности в процессе ренатурации. Решением обозначенных проблем может стать создание гомологичной системы экспрессии для Blp.

Целью настоящего изобретения являются разработка новой генетической конструкции плазмидной ДНК и нового рекомбинантного штамма L. capsici blp P_T5 с высокой эффективностью получения секретируемой бета-литической протеазы Blp с молекулярной массой 19 кДа.

Технический результат состоит в том, что использование заявленной нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO: 1) для получения рекомбинантного штамма L. capsici blp P_T5 в девять раз повышает эффективность получения секретируемого белка Blp с молекулярной массой 19 кДа по сравнению с выходом Blp из L. capsici FKMB-2533^Т дикого типа.

Применение Т5 промотора для экспрессии гена blp и рекомбинантный штамм L. capsici blp P_T5 обеспечивают возможность успешного получения белка Blp с молекулярной массой 19 кДа в активном виде.

Сущность изобретения

Одним из аспектов изобретения является нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 1), включающая последовательность промотора Т5, гена blp, кодирующего Blp из L. capsici VKM В-2533^T, и последовательность терминатора транскрипции lambda t₀.

Другим аспектом изобретения является штамм L. capsici blp P_T5-продуцент бета-литической протеазы Blp, содержащий нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 1).

Перечень фигур

Фиг. 1. Физическая карта SEQ ID NO: 1.

Обозначения: промотор Т5, ген blp, кодирующий бета-литическую протеазу, и lambda t₀ терминатор транскрипции.

Описание изобретения

Способ получения рекомбинантного штамма L. capsici blp P_T5 и получение бета-литической протеазы Blp включает в себя несколько основных этапов:

а) Выбор нуклеотидных последовательностей промотора Т5, гена blp и терминатора lambda t₀, входящих в перечень последовательности SEQ ID NO: 1.

б) Клонирование нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 в плазмидный вектор.

в) Культивирование экспрессионного штамма L. capsici blp P_T5 и очистка бета-литической протеазы Blp.

Возможность осуществления предлагаемого изобретения подтверждается приведенными ниже примерами, которые включают, но не ограничивают других вариантов.

Пример 1. Получение генетической конструкции pBBR1-MCS5blp-P_T5

1. Для создания экспрессионного вектора pBBR1-MCS5blp-P_T5 ампликон, полученный в результате ПЦР со специфическими праймерами к фрагменту, содержащему Т5 промотор - gfp - терминатор lambda t₀ с плазмиды pTurboGFP-B (размер ампликона составляет 1063 п.о.), был клонирован в плазмиду PBBR1-MCS5 [3], обработанную по сайтам рестрикции KpnI/XbaI.

2. Лигирующая смесь была трансформирована в Escherichia coli XL1-Blue. Отбор клонов осуществляли на селективной агаризованной среде LB (г/л): триптон - 10; дрожжевой экстракт - 5, NaCl - 10, рН 7.0-8.0. Агаризованная среда содержала антибиотик гентамицин в концентрации 5-30 мкг/мл.

3. Затем в плазмиду PBBR1-MCS5gfp-P_T5, обработанную по сайтам рестрикции BamHI/HindIII, был клонирован ген blp, амплифицированный с геномной ДНК L. capsici со специфическими праймерами (размер ампликона 1143 п.о.).

4. Для получения искомых ампликонов были использованы специфические олигонуклеотиды:

for Т5 pr (KpnI): GGTACC GTG CCA ССТ GAC GTC ТАА G

rev T5pr (XbaI): TCTAGA CTG AAA АТС TCG CCA AGC TAG С

T5_blp_for_BamHI: GGA ТСС ATG AAG GCG ATT TCG GGA GC

T5_blp_rev_HindIII: AAG CTT TCA GTT CGG GCC TGG G

5. Трансформация выделенной плазмиды PBBR1-MCS5blp-P_T5 осуществлялась в компетентные клетки L. capsici VKM В-2533^T. Отбор клонов L. capsici blp Р_Т5 проводился на селективной агаризованной среде LB. Агаризованная среда содержала антибиотик гентамицин в концентрации 5-30 мкг/мл.

6. Анализ клонируемой последовательности ДНК проводился методом секвенирования. Нуклеотидная последовательность промотора Т5 (45 п.о.), гена blp (1143 п.о.) и терминатора lambda t₀ (95 п.о.) представлена в перечне последовательностей SEQ ID NO: 1, и на фиг.1.

Пример 2. Культивирование экспрессионного штамма и очистка бета-литической протеазы

1. Для культивирования штамма L. capsici blp P_T5 использовали ферментер АНКУМ-2М (СКБ БП, Пущино) с рабочим объемом 5 л. В качестве питательной среды использовали жидкую среду, в состав которой входят (г/л): глюкоза - 5, пептон - 2, дрожжевой экстракт - 2, Na₂HPO₄ × 12H₂O - 4.2, KH₂PO₄ - 1, KCl - 0.6, MgSO₄ × 7Н₂) - 5, рН 7.0-8.0. Жидкая среда содержала антибиотик гентамицин в концентрации 5-30 мкг/мл. Культивирование проводили в течение 20-38 ч при температуре 25-35°С, с перемешиванием при частоте вращения вала мешалки 800 об/мин, концентрация растворенного кислорода была не ниже 30%.

2. После окончания культивирования клетки L. capsici удаляли центрифугированием при 5000×g и 4°С в течение 20 мин. Фракционирование белков культуральной жидкости проводили сульфатом аммония при 80% насыщения. Осадки фракций получали центрифугированием при 25 960×g при 4°С в течение 60 мин. Осадок фракции 80% насыщения растворяли в 50 мМ Tris-HCl, рН 7.0-9.0, диализовали с использованием диализного мешка с размером пор 10 кДа против этого же буфера при 4°С в течение ночи.

3. После диализа проводили катионообменную хроматографию на колонке с Toyopearl СМ-650М (Tosoh, Япония), уравновешенной 50 мМ Трис-HCl, рН 7.0-9.0. После промывки колонки проводили изократическую элюцию 0.3 М NaCl в этом же буфере. Литически активные фракции элюции объединяли и диализовали против 50 мМ Трис-HCl, рН 7.0-9.0. После диализа вновь проводили катионообменную хроматографию на колонке ENrich S (Bio-Rad, США), уравновешенной этим же буфером, с использованием хроматографической системы NGC (Bio-Rad, США). После промывки колонки проводили элюцию в линейном градиенте NaCl от 0 до 1 М.

4. После катионообменной хроматографии литически активные фракции объединяли и проводили гель-фильтрацию с использованием хроматографической системы NGC (Bio-Rad, США) и колонки HiLoadl6/60 (Superdex 75) (Amersham Biosciences, Швеция), уравновешенной 50 мМ Трис-HCl, 0.5 М NaCl, рН 7.0-9.0.

5. Полученные фракции Blp анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Бактериолитическую активность электрофоретически гомогенных препаратов определяли турбидиметрическим методом. В качестве субстрата использовали автоклавированные или живые клетки S. aureus 209Р. Клетки стафилококка суспендировали в 10 мМ Трис-HCl рН 7.0-9.0 до значения оптической плотности OD₅₄₀=0.5. К 0.950 мл субстрата добавляли 50 мкл ферментного препарата и инкубировали при 37°С в течение 5 мин. Реакцию останавливали помещением пробирок в лед и измеряли поглощение суспензии при 540 нм. За единицу бактериолитической активности (ЛЕ) принимали такое количество фермента, которое приводило к уменьшению поглощения клеточной суспензии на 0.01 о.е. при 37°С за 1 мин.

В соответствии с описаниями объектов изобретения возможно обеспечить воспроизводимость получения биологически активной бета-литической протеазы Blp и использовать ее в качестве компонента лекарственных средств. Полученный экспрессионный штамм L. capsici blp P_T5 позволяет получить Blp с выходом 43.99±3,79 мг/j;. Таким образом, создана первая гомологичная система экспрессии для бактериолитических белков Lysobacter.

Источники информации

1. Afoshin A.S., Konstantinov М.А., Toropygin I.Y., Kudryakova I.V., Vasilyeva N.V. β Lytic Protease of Lysobacter capsici VKM B-2533^Т // Antibiotics (Basel). - 2020a. - V.9. - №11. - p. 744.

2. Afoshin A.S., Kudryakova I.V., Borovikova A.O., Suzina N.E., Toropygin I.Y., Shishkova N.A., Vasilyeva N.V. Lytic potential of Lysobacter capsici VKM B-2533^Т: bacteriolytic enzymes and outer membrane vesicles // Sci Rep. - 2020b. - V. 10. - №1. - p. 9944.

3. Kovach M. E., Elzer P. H., Hill D. S., Robertson G. Т., Farris M. A., Roop R. M. 2^nd, Peterson K. M. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes // Gene. - 1995. - V.166. - №1. - p. 175-176.

--->

Перечень последовательностей

<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

«Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр

биологических исследований Российской академии наук» (ФИЦ ПНЦБИ РАН)

<120> Применение Т5 промотора для экспрессии гена

бета–литической протеазы Lysobacter capsici VKM B–2533^T

и штамм L. capsici blp P_T5–продуцент данной протеазы

<130>

<160> 1

<210> SEQ ID NO:1

<211> 1507

<212> ДНК

<213> Lysobacter capsici

<400> 1

tctagactga aaatctcgcc aagctagctt ggattctcac caataaaaaa

cgcccggcgg 60

caaccgagcg ttctgaacaa atccagatgg agttctgagg tcattactgg

atctatcaac 120

aggagtccaa gctcagctaa ttaagctt tca gtt cgg gcc tgg gtt

ggt gta ata gcc 178

gta gca gta gtt ctg acc gtt ctt ggt cag gta gaa ccg gct

gca gtt ggt gtc gta gct 238

gct gcc ggt cgc ggt gat gcg ata gcc cga cag gta ggt gcc

gtt gag gtg gta gaa gct 298

gcc gtt ctg ctt gag cga cca atg ctc gtg cgg acc ggt cga

gct gcc tcc gtt gca cag 358

cgc ctg cgc ctg ggt gtt ggc cgg gtt ggc gat ggc ggt gtt

cat cga cac gtt ggc gcc 418

ggt gtt gta ctg gat gtt cat cag gtg gta gta ggt cgt tga

cca acc gcc gga atg cac 478

gac ttc ggc gaa gca cga gga gtg gcg ctt gaa cga acc ggc

cgc cga cgc cga cac cca 538

ggt gcc gct ctg gtt gct gcc cca acc gcc gcc cag cga cat

gtc gag cga gga cat cgg 598

gta att gcc cga gcc ggt gtt ggt atg cgc gcc gcc gac gtg

cca gcg cgc gcc gcg cgg 658

gaa cgg gaa ctg cag cag gcc gtt ggg cga cag cgg ctg cac

gtc cgg acc ggc ctt ggc 718

gaa gcg atc gga ggt cgg ccg ggc ctg ccg cgg ttc gtt gaa

caa acg gcc gta aat cag 778

ctg gaa ttc gcc gtc gcc gcg cag cgc ggc cgc cgg ctc gct

gtc gcc ggc gcg ttc gaa 838

cag cgc ctg caa cgg gtt ggc gcg ggc cag cgt cac cgg ccc

ctt ggc gcc gtc ggg atc 898

gcg ctc gta caa cga ctc gcg cag cgc cag cgc gac ttc gcg

ggt ctg cgc gcc gaa gcc 958

gtc ggc gcg ggc cag ctt gcc gaa cgg acg gtt cga cgc gcg

ctt ggc gct gac cgc gcc 1018

gct ttg ctg ctc cat caa cgc gat cag cac ttt cgg gct gat

ccc gct gta gcc ggc cca 1078

atg cga aat ctc ttc cga atg ctt gcg cag atg cgg cgc gtg

ctt ggc cag ata ggt gtc 1138

ggt gtc gaa gtc gaa cat ctc gtc gta gga ata gac cag atc

ctc gcc cga caa ccc gcc 1198

gcg ctc cgc cgc tgc cgc ccc gcc gca gat cgc gat caa cac

gca acc ggc caa cag cgt 1258

gat tct tgc tcc cga aat cgc ctt cat gga tcc cga tcc tct

cat agttaat ttctcctc 1318

tttaatcaat tctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt gaatctatta

taattgttat 1378

ccgctcacaa agcaaataaa ttttttatga tttctcgagg tgaagacgaa

agggcctcgt 1438

gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga

cgtcaggtgg 1498

cacggtacc

1507

<---

1. Плазмидная ДНК pBBR1-MCS5blp-P_T5, обеспечивающая экспрессию бета-литической протеазы Blp, содержащая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, включающую последовательность промотора Т5, гена blp, кодирующего Blp из L. capsici ВКМ В-2533^T, и последовательность терминатора транскрипции lambda t₀.

2. Штамм L. capsici blp P_T5-продуцент бета-литической протеазы Blp, полученный путем трансформации штамма L. capsici ВКМ В-2533^T плазмидой pBBR1-MCS5blp-P_T5 по п. 1.