Живой аттенуированный штамм вируса желтой лихорадки, адаптированный к росту в клетках vero, и вакцинная композиция, содержащая его

Авторы патента:

C12N7/08 - путем серийного пересева вирусов

C12N2770/24134 - Микроорганизмы или ферменты; их композиции (биоциды, репелленты или аттрактанты или регуляторы роста растений, содержащие микроорганизмы, вирусы, микробные грибки, ферменты, агенты брожения или вещества, получаемые или экстрагируемые из микроорганизмов или из материала животного происхождения A01N 63/00; пищевые составы A21,A23; лекарственные препараты A61K; химические аспекты или использование материалов для бандажей, перевязочных средств, впитывающих подкладок или хирургических приспособлений A61L; удобрения C05); размножение, консервирование или сохранение микроорганизмов (консервирование живых тканей или органов людей или животных A01N 1/02); мутации или генная инженерия; питательные среды (среды для микробиологических испытаний C12Q)

A61P31/14 - против вирусов РНК

A61K39/12 - вирусные антигены

A61K2039/5254 - Лекарства и медикаменты для терапевтических, стоматологических или гигиенических целей (изготовление специальных лекарственных форм A61J; химические аспекты или использование материалов для дезодорации воздуха, для дезинфекции или стерилизации или для бандажей, перевязочных средств, впитывающих прокладок или хирургических приспособлений A61L; соединения как таковые C01, C07,C08,C12N; мыла C11D; микроорганизмы как таковые C12N)

Владельцы патента RU 2788130:

САНОФИ ПАСТЕР (FR)

Изобретение относится к биотехнологии. Настоящее изобретение относится к живому аттенуированному штамму вируса желтой лихорадки, адаптированному к росту в клетках Vero, полученному из исходного субштамма вируса желтой лихорадки 17D, который не адаптирован к росту в клетках Vero, где указанный живой аттенуированный штамм вируса желтой лихорадки является менее нейровирулентным, чем указанный исходный субштамм вируса желтой лихорадки 17D. Изобретение расширяет арсенал средств защиты пациентов от инфекции вируса желтой лихорадки. 8 н. и 9 з.п. ф-лы, 15 ил., 18 табл., 7 пр.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к живому аттенуированному штамму вируса желтой лихорадки (YFV) и путям его применения для получения вакцинной композиции против инфекции, вызванной YFV.

В частности, живой аттенуированный штамм YFV адаптирован к росту в клетках Vero и был получен из исходного живого аттенуированного штамма YFV, который не адаптирован к росту в клетках Vero, а скорее адаптирован к росту в яйцах с развивающимся эмбрионом. Живой аттенуированный штамм YFV дополнительно характеризуется сниженной нейровирулентностью по сравнению с исходным живым аттенуированным штаммом YFV.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Желтая лихорадка представляет собой вирус-опосредованное и смертельное заболевание, которое распространено в более чем 50 странах, расположенных в тропических районах Африки, Центральной и Южной Америки.

Желтая лихорадка представляет собой острое вирусное геморрагическое заболевание, при этом у некоторых пациентов наблюдается желтуха, что объясняет использование термина "желтый". Признаки желтой лихорадки могут включать лихорадку, головную боль, желтуху, мышечную боль, тошноту, рвоту и усталость. Кроме того, у небольшой части пациентов, которые инфицированы вирусом, развиваются тяжелые симптомы, и примерно половина из них умирает в течение 7-10 дней.

Вирус желтой лихорадки (YFV) принадлежит к семейству Flaviviruses, среди которых другими представителями являются вирус лихорадки денге (DV), вирус японского энцефалита (JEV), вирус клещевого энцефалита (TBEV), вирус лихорадки Западного Нила (WNV) и вирус Зика (ZV). YFV состоит из липопротеиновой оболочки, окружающей нуклеокапсид, состоящий из капсидного белка и однонитевой положительно-полярной РНК, длина которой составляет 10862 нуклеотида. Между 5'-нетранслируемой (5' UTR) и 3'-нетранслируемой областями (3' UTR) РНК кодирует, от 5'- к 3'-концу, три структурных белка, а именно, капсидный белок (белок C), премембранный/мембранный белок (белок prM/M), оболочечный белок (белок E) и восемь неструктурных (NS) белков, а именно, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, пептид P2k, белки NS4B и NS5.

YFV дикого типа в основном переносится москитами Aedes spp. в Африке и Haemogogus и Sabethes spp. в Южной Америке, и существуют отличные от человека приматы-хозяева, которые различаются в зависимости от географического региона. Передача YFV в основном осуществляется в соответствии с двумя эпидемиологическими паттернами: (1) городским паттерном и (2) лесным паттерном (также известным как цикл джунглей или лесной). Несмотря на два паттерна передачи, было выявлено только одно клинически значимое заболевание, которое является причиной инфицирования одним и тем же вирусом. На американском континенте YFV в настоящее время циркулирует посредством эндемического лесного паттерна, что приводит в результате к нескольким сотням сообщений в год об инфицировании работников лесного хозяйства, не имеющих иммунитета. Параллельно вирус циркулирует в Африке посредством как городского, так и лесного паттернов, и периодически выходит за пределы своего эндемического паттерна, инфицируя большие количества не имеющих иммунитета людей в ходе крупных эпидемий.

В настоящее время не существует противовирусных препаратов для лечения желтой лихорадки, и вакцинация имеет решающее значение в предупреждении этого заболевания. В связи с этим еще в 1930-х годах были разработаны два вида живых аттенуированных вакцин против YFV.

Первая соответствует французской нейротропной вакцине (FNV), которая была получена из французского висцеротропного вируса дикого типа (FVV, выделенный из Mayali в Сенегале в 1928 году), и он был пассирован в головном мозге мыши. Однако быстро было доказано, что FNV является слишком нейровирулентным, что привело к обострению заболеваемости поствакцинальным энцефалитом у детей, и от него отказались в начале 1980-х годов (Barrett, 2017).

Второй подход соответствует штамму "17D", который был получен из штамма Asibi дикого типа (выделенного из человека с легкой формой заболевания, "м-ра Асиби", в Гане в 1927 году) и пассирован в тканях мыши и цыпленка. Вакцинный штамм 17D утратил как висцеротропизм, так и нейровирулентность (Monath, 2005).

В настоящее время шесть стран производят вакцинные композиции живого аттенуированного YFV из субштаммов, полученных из штамма 17D, а именно, Бразилия (субштамм 17DD), Китай (субштамм 17D-204), Франция (субштамм 17D-204 Stamaril®), Россия (субштамм 17D-213), Сенегал (субштамм 17D-204) и США (субштамм 17D-204 YF-VAX®) (Barrett, 2017).

На сегодняшний день все коммерчески доступные вакцины получают в куриных яйцах с развивающимся эмбрионом, при этом данный производственный процесс в прошлом осложнялся проблемами надежности (Barrett, 2017). В частности, имеет место дефицит вакцин против YFV из-за проблем изготовления. Действительно, во время эпидемий 2016 года в Анголе и Демократической Республике Конго нехватка доступных партий вакцины впервые привела к необходимости разделения доз для адаптации к условиям чрезвычайной ситуации (Barrett; 2017). Кроме того, вакцина против YFV, полученная на развивающихся куриных яйцах с развивающимся эмбрионом, противопоказана людям, имеющим аллергию на яйца.

Альтернативой производству вакцин на основе яиц с развивающимся эмбрионом является использование подходящих клеточных линий для пассирования вируса, таких как клеточные линии млекопитающих. Среди клеточных линий млекопитающих клеточная линия Vero является одной из наиболее изученных, обеспечивая при этом стабильность и хорошо обоснованные показатели качества и количества выхода вирусов. Клетки Vero получили одобрение FDA и используются во всем мире. Например, клетки Vero использовались для получения вакцины против японского энцефалита (выпускаемой под торговой маркой IXIARO®), против вируса гриппа, против полиовируса и против вируса бешенства.

В прошлом и в настоящее время появлялись стратегии использования клеток Vero для получения вакцин против YFV, и следует отметить, что эти стратегии ориентированы лишь на возможность получения вакцин против YFV на основе инактивированного вируса (Hayes, 2010; Beasley et al., 2013; Pereira et al., 2015). Тем не менее, хотя инактивированная вакцина против желтой лихорадки теоретически может казаться более безопасной, вряд ли она будет полностью соответствовать долговременной защите, обеспечиваемой однократной дозой современных живых аттенуированных вакцин против желтой лихорадки (Hayes, 2010). Кроме того, в контексте недавних эпидемий желтой лихорадки живые аттенуированные вакцины кажутся более подходящими для обеспечения высокого охвата населения долгосрочным защитным иммунитетом против желтой лихорадки в эндемичных районах.

Конкретные ограничения живого аттенуированного вируса для использования в вакцине заключаются в том, чтобы поддерживать его аттенуацию, т.е. чтобы вирус желтой лихорадки был по меньшей мере таким же аттенуированным с точки зрения нейровирулентности и висцеротропизма, как и существующие на рынке живые аттенуированные вакцины против желтой лихорадки; при этом чтобы он был и достаточно иммуногенным, чтобы защитить пациентов от соответствующего заболевания. В данном отношении достижение обеих характеристик, т.е. аттенуации и иммуногенности, для данного штамма желтой лихорадки не было легко выполнимым, как можно увидеть, например, в Monath, 2005.

Соответственно, из-за различных препятствий, связанных с получением живых аттенуированных вакцин против YFV на основе куриных яиц с развивающимся эмбрионом, остается потребность в альтернативных способах получения живых аттенуированных вакцин против YFV.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте настоящее изобретение относится к живому аттенуированному штамму вируса желтой лихорадки, адаптированному к росту в клетках Vero, полученному из исходного субштамма вируса желтой лихорадки 17D, который не адаптирован к росту в клетках Vero, где указанный живой аттенуированный штамм вируса желтой лихорадки является менее нейровирулентным, чем указанный исходный субштамм вируса желтой лихорадки 17D.

В другом аспекте настоящее изобретение дополнительно относится к живому аттенуированному штамму вируса желтой лихорадки, содержащему нуклеиновую кислоту, которая содержит:

i) мутацию в кодоне аминокислоты в положении 480 оболочечного белка (E), которая приводит в результате к замене аминокислоты валина на лейцин, или

ii) мутацию в кодоне аминокислоты в положении 65 неструктурного белка 2A (NS2a), которая приводит в результате к замене аминокислоты метионина на валин.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к живому аттенуированному штамму вируса желтой лихорадки, который содержит оболочечный белок, содержащий мутацию в положении 480, которая приводит в результате к замене аминокислоты валина на лейцин.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к живому аттенуированному штамму вируса желтой лихорадки, который содержит оболочечный белок, содержащий остаток лейцина в положении в белке, которое соответствует положению 480 в SEQ ID NO. 15.

В другом аспекте настоящее изобретение дополнительно относится к живому аттенуированному штамму вируса желтой лихорадки, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую:

(i) оболочечный белок, содержащий мутацию в положении 480, которая приводит в результате к замене аминокислоты валина на лейцин, и

(ii) белок NS2a, содержащий мутацию в положении 65, которая приводит в результате к замене аминокислоты метионина на валин.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к живому аттенуированному штамму вируса желтой лихорадки, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую:

(i) оболочечный белок, который содержит остаток лейцина в положении в белке, которое соответствует положению 480 в SEQ ID NO. 15, и

(ii) белок NS2a, который содержит остаток валина в положении в белке, которое соответствует положению 65 в SEQ ID NO. 16.

В другом аспекте настоящее изобретение также относится к иммуногенной композиции, содержащей живой аттенуированный штамм вируса желтой лихорадки в соответствии с настоящим изобретением и фармацевтически приемлемый носитель.

В еще одном аспекте настоящее изобретение дополнительно относится к способу получения живого аттенуированного штамма вируса желтой лихорадки, адаптированного к росту в клетках Vero, предусматривающему стадии:

- а) очистки вирусной геномной РНК исходного живого аттенуированного штамма вируса желтой лихорадки, который не адаптирован к росту в клетках Vero и который необязательно адаптирован к росту в яйцах;

- b) трансфекции клеток Vero вирусной геномной РНК, очищенной на стадии а), в результате чего получают трансфицированные клетки Vero;

- c) выращивания трансфицированных клеток Vero, полученных на стадии b), в культуральной среде, в результате чего получают, а затем выделяют первую популяцию вируса желтой лихорадки;

- d) амплификации выделенной первой популяции вируса желтой лихорадки, полученной в конце стадии c), в 2 раза или больше в свежих клетках Vero, в результате чего получают вторую популяцию вируса желтой лихорадки;

- e) клонирования второй популяции вируса желтой лихорадки, полученной на стадии d), посредством двух или больше последовательных клонирований методом бляшкообразования с использованием клеток Vero, в результате чего получают множество клонов вируса желтой лихорадки;

- f) амплификации отдельно каждого из выделенных клонов вируса желтой лихорадки, полученных в конце стадии e), в 2 раза или больше в свежих клетках Vero, в результате чего получают множество штаммов вируса желтой лихорадки; и

- g) отбора из указанного множества штаммов вируса желтой лихорадки, выделенных на стадии f), одного или нескольких живых аттенуированных штаммов вируса желтой лихорадки, которые являются менее нейровирулентными, чем исходный живой аттенуированный штамм вируса желтой лихорадки, согласно тесту с определением дозы, летальной для 50% мышей (MLD₅₀).

В другом аспекте настоящее изобретение также относится к живому аттенуированному штамму вируса желтой лихорадки, получаемому посредством способа в соответствии с настоящим изобретением.

В другом аспекте настоящее изобретение также относится к живому аттенуированному штамму вируса желтой лихорадки в соответствии с настоящим изобретением для использования в получении вакцины.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к вакцине, содержащей живой аттенуированный штамм вируса желтой лихорадки в соответствии с настоящим изобретением, для использования в предупреждении инфекции, вызванной вирусом желтой лихорадки.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фигура 1: диаграмма, иллюстрирующая получение живого аттенуированного штамма вируса желтой лихорадки, адаптированного к росту в клетках Vero (vYF), на стадии доматочной посевной серии (pMSL).

Фигура 2: диаграмма, иллюстрирующая анализ висцеротропизма на мышиной модели A129.

Фигура 3: графики, иллюстрирующие виремию, измеряемую с помощью qRT-PCR YF-NS5 в сыворотках, собранных в D4 и D6 (день 4 и день 6) от мышей A129, иммунизированных в D0 PBS (белый столбец); эталонной вакциной Stamaril® (черные столбцы) или кандидатными вакцинами vYF pMSL, полученными из линии дифференцировки Stamaril® (TV2212, TV2232 и TV2241; темно-серые столбцы) или из линии дифференцировки YF-VAX® (TV3111, TV3112 и TV4221; светло-серые столбцы).

Фигура 4: графики, иллюстрирующие вирусную нагрузку, измеряемую с помощью qRT-PCR YF-NS5 в образцах печени, собранных в D6 и D11 от мышей A129, иммунизированных в D0 PBS (белый столбец); эталонной вакциной Stamaril® (черные столбцы) или кандидатными вакцинами vYF pMSL, полученными из линии дифференцировки Stamaril® (TV2212, TV2232 и TV2241; темно-серые столбцы) или из линии дифференцировки YF-VAX® (TV3111, TV3112 и TV4221; светло-серые столбцы).

Фигура 5: графики, иллюстрирующие вирусную нагрузку, измеряемую с помощью qRT-PCR YF-NS5 в образцах головного мозга, собранных в D6 и D11 от мышей A129, иммунизированных в D0 PBS (белый столбец); эталонной вакциной Stamaril® (черные столбцы) или кандидатными вакцинами vYF pMSL, полученными из линии дифференцировки Stamaril® (TV2212, TV2232 и TV2241; темно-серые столбцы) или из линии дифференцировки YF-VAX® (TV3111, TV3112 и TV4221; светло-серые столбцы).

Фигура 6: графики, иллюстрирующие вирусную нагрузку, измеряемую с помощью qRT-PCR YF-NS5 в образцах селезенки, собранных в D6 и D11 от мышей A129, иммунизированных в D0 PBS (белый столбец); эталонной вакциной Stamaril® (черные столбцы) или кандидатными вакцинами vYF pMSL, полученными из линии дифференцировки Stamaril® (TV2212, TV2232 и TV2241; темно-серые столбцы) или из линии дифференцировки YF-VAX® (TV3111, TV3112 и TV4221; светло-серые столбцы).

Фигура 7: графики, иллюстрирующие кривые выживаемости Каплана-Мейера после однократной иммунизации мышей A129 Stamaril® штаммами vYF TV221, TV2241, TV3111, TV3112, TV4221 (пунктирные линии) или TV2232 (сплошная линия).

Фигура 8: диаграмма, иллюстрирующая анализ иммуногенности на модели хомяка.

Фигура 9: графики, иллюстрирующие титры нейтрализующих антител, специфических в отношении живого аттенуированного штамма вируса желтой лихорадки, измеряемые с помощью анализа серонейтрализации на клетках Vero в сыворотке, собранной в D26 от хомяков, иммунизированных в D0 2,5 или 5,5 log₁₀ CCID₅₀/доза штаммов vYF (TV2212, TV2232, TV2241, TV3111, TV3112 и TV4221) или эталонной вакциной Stamaril®. Горизонтальная линия представляет порог ответивших на обработку.

Фигура 10: графики, иллюстрирующие титры нейтрализующих антител, специфических в отношении живого аттенуированного штамма вируса желтой лихорадки, измеряемые с помощью анализа серонейтрализации на клетках Vero в сыворотке, собранной в D41 от хомяков, иммунизированных в D0 и D26 2,5 или 5,5 log₁₀ CCID₅₀/доза штаммов vYF (TV2212, TV2232, TV2241, TV3111, TV3112 и TV4221) или эталонной вакциной Stamaril®. Горизонтальная линия представляет порог ответивших на обработку.

Фигура 11: графики, иллюстрирующие реакцию нейтрализующих антител у обезьян, вакцинированных штаммом vYF TV3112, по сравнению с существующими вакцинами Stamaril® и YF-VAX®. Горизонтальная линия представляет предел выявления.

Фигура 12: графики, иллюстрирующие YF-специфические ответы IgM из В-клеток памяти в периферической крови обезьян, вакцинированных живым аттенуированным штаммом vYF TV3112, по сравнению с существующими эталонными вакцинами Stamaril® и YF-VAX®. Результаты выражены в виде процента клеток, секретирующих антитела IgM, в общей популяции IgM.

Фигура 13: графики, иллюстрирующие YF-специфические ответы IgG из В-клеток памяти в периферической крови обезьян, вакцинированных живым аттенуированным штаммом vYF TV3112, по сравнению с существующими эталонными вакцинами Stamaril® и YF-VAX®. Результаты выражены в виде процента клеток, секретирующих антитела IgG, в общей популяции IgG.

Фигура 14: графики, иллюстрирующие IFN-γ (верхние панели) и IL-2 (нижние панели) специфические Т-клеточные ответы в периферической крови обезьян, вакцинированных штаммом vYF TV3112, при стимуляции оболочечным белком (ENV; левые панели) или стимуляции неструктурным белком 3 (NS3; правые панели) и сравнение с существующими вакцинами Stamaril® и YF-VAX®.

Фигура 15: графики, иллюстрирующие вирусную нагрузку в органах обезьян, вакцинированных живым аттенуированным штаммом vYF TV3112, по сравнению с существующими эталонными вакцинами Stamaril® и YF-VAX®. Светло-серые столбцы и кружки представляют результаты, полученные на обезьянах, вакцинированных Stamaril®; средне-серые столбцы и квадраты представляют результаты обезьян, вакцинированных YF-VAX®; темно-серые столбцы и треугольники представляют результаты от обезьян, вакцинированных живым аттенуированным штаммом vYF TV3112. Горизонтальная линия представляет предел выявления.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предусмотрены живые аттенуированные штаммы YFV, адаптированные к росту в клетках Vero, которые были получены из исходного живого аттенуированного штамма YFV, который адаптирован к росту в яйцах с развивающимся эмбрионом. Живые аттенуированные штаммы YFV были отобраны в связи с их пониженной нейровирулентностью в тесте LD₅₀ у мыши (MLD₅₀) по сравнению с исходным живым аттенуированным штаммом YFV.

Как станет ясно из настоящего изобретения, получение YFV с помощью пассирования на клетках Vero позволяет получать стабильные, хорошо воспроизводимые, с высоким стандартным качеством и количеством живые аттенуированные штаммы YFV, которые впоследствии являются подходящими для получения вакцины против инфекции YF.

• Различные определения

В объеме настоящего изобретения "YFV" относится к вирусу желтой лихорадки, в то время как термин "vYF" обозначает адаптированный к клеткам Vero вирус желтой лихорадки, т.е. вирус желтой лихорадки, адаптированный к росту в клетках Vero.

Следовательно, в объеме настоящего изобретения предполагается, что "вирус желтой лихорадки, адаптированный к клеткам Vero" (vYV) и "вирус желтой лихорадки, адаптированный к росту в клетках Vero", представляют собой взаимозаменяемые выражения.

В объеме настоящего изобретения вирус, адаптированный к росту в клетках Vero, представляет собой вирус, который претерпел по меньшей мере 3 последовательные пассажа на клетках Vero. В некоторых вариантах осуществления вирус претерпел приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 последовательных пассажей на клетках Vero.

Под "пассажем" можно понимать любую стадию, на которой вирус проходит по меньшей мере один цикл репликации в клетках Vero, в частности, любую стадию трансфекции, амплификации или клонирования вируса в клетках Vero.

Выражение "живой аттенуированный вирус желтой лихорадки", используемое в данном документе, имеет общепринятое значение, известное специалисту в данной области. В некоторых вариантах осуществления это выражение относится к живому вирусу желтой лихорадки, имеющему ослабленную нейровирулентность и/или ослабленный висцеротропизм.

В объеме настоящего изобретения термин "нейровирулентность" предполагается для обозначения способности вируса проходить через гематоэнцефалический барьер (нейроинвазивность), реплицироваться в ткани головного мозга (нейротропизм) и вызывать воспаление, повреждение нейронов и энцефалит (нейровирулентность stricto sensu).

В объеме настоящего изобретения термин "висцеротропизм" относится к способности вируса реплицироваться в экстраневральных тканях, вызывать виремию и повреждать жизненно важные органы, в том числе печень (Monath, 2005).

В некоторых вариантах осуществления указанный живой аттенуированный вирус желтой лихорадки является по меньшей мере таким же аттенуированным, как и один из коммерчески доступных живых аттенуированных вакцинных штаммов желтой лихорадки, например Stamaril® или YF-VAX®.

В некоторых вариантах осуществления указанный живой аттенуированный вирус желтой лихорадки характеризуется нейровирулентностью, по меньшей мере такой же аттенуированной, как и у одного из коммерчески доступных живых аттенуированных вакцинных штаммов желтой лихорадки, например Stamaril® или YF-VAX®.

В некоторых вариантах осуществления указанный живой аттенуированный вирус желтой лихорадки характеризуется висцеротропизмом, по меньшей мере таким же аттенуированным, как и у одного из коммерчески доступных живых аттенуированных вакцинных штаммов желтой лихорадки, например, Stamaril® или YF-VAX®.

В некоторых вариантах осуществления указанный живой аттенуированный вирус желтой лихорадки характеризуется нейровирулентностью и висцеротропизмом, по меньшей мере такими же аттенуированными, как и у одного из коммерчески доступных живых аттенуированных вакцинных штаммов желтой лихорадки, например, Stamaril® или YF-VAX®.

Термины "содержащий"/"содержит"/"содержать"/"содержащийся" включают соответственно "включающий"/"включает"/"включать"/"включенный", а также соответственно "состоящий"/"состоит"/"состоять"/"состоявший", например, композиция, "содержащая" компонент X, может состоять исключительно из компонента X или может включать один или несколько дополнительных компонентов, например, компонент X и компонент Y.

В данном контексте "CCID₅₀" относится к дозе инфицирования клеточной культуры на 50%, т. е. количеству вируса, достаточному для того, чтобы вызвать цитопатический эффект в 50% инокулированных реплицированных клеточных культур, как определено в анализе конечной точки разбавления в однослойных клеточных культурах.

В соответствии со стандартными определениями Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), настоящее изобретение относится к следующим определениям (WHO Technical report series, No. 872, 1998).

Термины "маточная посевная серия" ("MSL") или "первичная посевная серия", используемые в данном документе, относятся к количеству вирусной суспензии, которая была обработана за один производственный цикл и имеет однородный состав.

Термины "рабочая посевная серия" ("WSL") или "вторичная посевная серия", используемые в данном документе, относятся к количеству вирусной суспензии, которая была обработана за один производственный цикл, и которая является однородной по составу, полностью охарактеризована и представляет собой только один пассаж из MSL. В объеме настоящего изобретения материал, извлеченный из WSL, используется для инокуляции яиц с развивающимся эмбрионом или подходящих клеточных линий при получении вакцины.

Термин "бляшкообразующая единица" (БОЕ), используемый в данном документе, относится к наименьшему количеству вирусной суспензии, которая будет образовывать бляшки в однослойных клеточных культурах.

Термин "медианная летальная доза у мыши" (LD₅₀ или MLD₅₀ мыши), используемый в данном документе, относится к количеству вирусной суспензии, которая будет приводить к уничтожению 50% мышей, инъецированных ей.

Живой аттенуированный YFV, адаптированный к росту в клетках Vero (также обозначаемый как "вирус vYF" в случае вируса YF, адаптированного к клеткам Vero)

В одном аспекте настоящее изобретение относится к живому аттенуированному штамму вируса желтой лихорадки, адаптированному к росту в клетках Vero, полученному из исходного субштамма вируса желтой лихорадки 17D, который не адаптирован к росту в клетках Vero. В различных вариантах осуществления указанный живой аттенуированный штамм вируса желтой лихорадки является менее нейровирулентным, чем указанный исходный субштамм вируса желтой лихорадки 17D.

В некоторых вариантах осуществления исходный штамм вируса желтой лихорадки представляет собой живой аттенуированный штамм вируса желтой лихорадки, адаптированный к росту в яйцах.

В некоторых вариантах осуществления яйца представляют собой куриные яйца с развивающимся эмбрионом.

"Субштамм 17D" представляет собой штамм желтой лихорадки, имеющий среди своих предшественников штамм 17D.

Термин "штамм 17D" имеет общепринятое значение, известное специалисту в данной области. В некоторых вариантах осуществления "штамм 17D" относится к штамму желтой лихорадки, который был выделен у человека с легкой формой болезни, "м-ра Асиби", в Гане в 1927 году, и был пассирован 18 раз в измельченной ткани эмбриона мыши, а затем пассирован 58 раз в измельченной ткани куриного эмбриона, как описано в Monath (2005).

В некоторых вариантах осуществления субштамм 17D охватывает субштамм 17D-204, субштамм 17DD и/или субштамм 17D-213, как описано в Monath (2005). В иллюстративном варианте осуществления последовательность РНК штамма YFV 17D-204 (номер доступа в Genbank X03700), ранее раскрытая Rice et al. в 1985 году, может быть представлена последовательностью РНК под SEQ ID NO. 1.

В некоторых вариантах осуществления исходный штамм вируса желтой лихорадки представляет собой субштамм вируса желтой лихорадки 17D-204.

В некоторых вариантах осуществления исходный штамм вируса YFV представляет собой штамм YF-VAX®, полученный из YFV 17D-204, являющийся эталонным штаммом YFV, используемым в коммерчески доступной вакцине YF-VAX®.

В иллюстративном варианте осуществления последовательность РНК штамма YF-VAX®, полученного из YFV 17D-204, может быть представлена последовательностью РНК под SEQ ID NO. 2.

В некоторых вариантах осуществления исходный штамм вируса YFV представляет собой штамм Stamaril®, полученный из YFV 17D-204, являющийся эталонным штаммом YFV, используемым в коммерчески доступной вакцине Stamaril®.

В иллюстративном варианте осуществления последовательность РНК штамма Stamaril®, полученного из YFV 17D-204, может быть представлена последовательностью РНК под SEQ ID NO. 3.

В иллюстративном варианте осуществления исходный субштамм вируса желтой лихорадки 17D содержит последовательность РНК SEQ ID NO. 2.

В иллюстративном варианте осуществления исходный субштамм вируса желтой лихорадки 17D содержит последовательность РНК SEQ ID NO. 3.

В иллюстративном варианте осуществления последовательность РНК штамма YFV 17D-213 (номер доступа в Genbank U17067), ранее раскрытая Dos Santos et al. в 1995 году, может быть представлена последовательностью РНК под SEQ ID NO. 4, и последовательность РНК штамма YFV 17DD (номер доступа в Genbank U17066), также ранее раскрытая Dos Santos et al. в 1995 году, может быть представлена последовательностью РНК под SEQ ID NO. 5.

В иллюстративном варианте осуществления последовательность РНК штамма Asibi (номер доступа в Genbank KF769016) может быть представлена последовательностью РНК под SEQ ID NO. 6.

В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный штамм вируса желтой лихорадки является менее нейровирулентным, чем исходный субштамм вируса желтой лихорадки 17D согласно тесту с определением дозы, летальной для 50% мышей (MLD₅₀).

В некоторых вариантах осуществления соответствующий тест летальной дозы 50 у мыши (MLD₅₀) осуществляют в соответствии с протоколом, раскрытым на странице 68 WHO Technical report series, № 872, 1998 (включен посредством ссылки).

В объеме настоящего изобретения MLD₅₀ представляет собой количество вирусной суспензии, которое, по оценкам, вызывает смертельный специфический энцефалит у 50% мышей, подвергнутых интрацеребральной вакцинации.

В некоторых вариантах осуществления соответствующие серийные разбавления восстановленной вакцины осуществляют в фосфатном буфере, 0,75% сывороточном альбумине.

В иллюстративном варианте осуществления мышам в возрасте 4-6 недель вводят интрацеребрально под анестезией экстемпоральное разбавление вакцины. Для каждого разбавления используют группы из по меньшей мере 6 мышей каждая, и при этом серия разбавлений должна приводить к смертности после инокуляции, охватывающей диапазон 0-100%. Случаи смерти фиксируют в течение 21 дня. Мышей, умирающих от не связанных причин, исключают как из числителя, так и из знаменателя расчетов смертности. Мыши, парализованные на двадцать первый день, считаются живыми.

В определенных вариантах осуществления нейровирулентность согласно тесту с определением дозы, летальной для 50% мышей (MLD₅₀) может быть измерена с помощью параметра log₁₀ MLD₅₀/мл.

В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный штамм YFV в соответствии с настоящим изобретением достигает log₁₀ MLD₅₀/мл, который равен 4 или меньше, равен 3,5 или меньше, равен 3 или меньше или равен 2,5 или меньше согласно тесту с определением дозы, летальной для 50% мышей (MLD₅₀).

В одном варианте осуществления живой аттенуированный штамм вируса желтой лихорадки в соответствии с настоящим изобретением адаптирован к росту в клетках VERO, является менее нейровирулентным, чем его исходный субштамм вируса желтой лихорадки 17D, и по меньшей мере также аттенуирован в отношении висцеротропизма, как и его исходный субштамм вируса желтой лихорадки 17D.

В одном варианте осуществления живой аттенуированный штамм вируса желтой лихорадки в соответствии с настоящим изобретением адаптирован к росту в клетках VERO, является менее нейровирулентным, чем его исходный субштамм вируса желтой лихорадки 17D, по меньшей мере также аттенуирован в отношении висцеротропизма, как и его исходный субштамм вируса желтой лихорадки 17D, и является по меньшей мере таким же иммуногенным, как и его исходный субштамм вируса желтой лихорадки 17D.

В различных вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрен живой аттенуированный штамм YFV, содержащий последовательность РНК под SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 или SEQ ID NO. 5, где один или несколько нуклеотидов являются мутированными.

В объеме настоящего изобретения выражение "один или несколько нуклеотидов" охватывает 2, 3, 4, 5 или больше нуклеотидов.

Другими словами, выражение "один или несколько нуклеотидов" предполагается для охвата 1 нуклеотида, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 и 15 или больше нуклеотидов.

В некоторых вариантах осуществления мутация представляет собой замену нуклеотида.

В некоторых других вариантах осуществления мутация не охватывает вставку нуклеотида и делецию нуклеотида.

В некоторых вариантах осуществления замена нуклеотида является молчащей. В качестве альтернативы замена нуклеотида может способствовать замене аминокислоты.

В одном варианте осуществления два нуклеотида являются мутированными в последовательности РНК под SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 или SEQ ID NO. 5.

В другом варианте осуществления три нуклеотида являются мутированными в последовательности РНК под SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 или SEQ ID NO. 5.

В дополнительном варианте осуществления четыре нуклеотида являются мутированными в последовательности РНК под SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 или SEQ ID NO. 5.

В дополнительном варианте осуществления пять нуклеотидов являются мутированными в последовательности РНК под SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 или SEQ ID NO. 5.

В другом аспекте настоящее изобретение также относится к живому аттенуированному штамму вируса желтой лихорадки, который содержит последовательность РНК, выбранную из SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 и SEQ ID NO. 5, где по меньшей мере нуклеотид в положении 2411, положении 3701 или положении 6496 является мутированным.

В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный штамм YFV содержит последовательность РНК, выбранную из SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 и SEQ ID NO. 5, где по меньшей мере нуклеотид в положении 2411 и нуклеотид в положении 3701 являются мутированными.

В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный штамм YFV содержит последовательность РНК, выбранную из SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 и SEQ ID NO. 5, где по меньшей мере нуклеотид в положении 3701 и нуклеотид в положении 6496 являются мутированными.

В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный штамм YFV содержит последовательность РНК, выбранную из SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 и SEQ ID NO. 5, где по меньшей мере нуклеотид в положении 2411, нуклеотид в положении 3701 и нуклеотид в положении 6496 являются мутированными.

В определенных вариантах осуществления нуклеотид G (гуанозин) в положении 2411 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 или SEQ ID NO. 5 замещен нуклеотидом U (уридином).

В определенных вариантах осуществления нуклеотид A (аденозин) в положении 3701 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 или SEQ ID NO. 5 замещен нуклеотидом G (гуанозином).

В определенных вариантах осуществления нуклеотид A (аденозин) в положении 6496 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 или SEQ ID NO. 5 замещен нуклеотидом G (гуанозином).

В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный штамм YFV характеризуется следующим образом:

- (i) нуклеотид G (гуанозин) в положении 2411 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 или SEQ ID NO. 5 замещен нуклеотидом U (уридином), и

- (ii) нуклеотид A (аденозин) в положении 3701 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 или SEQ ID NO. 5 замещен нуклеотидом G (гуанозином).

В некоторых других вариантах осуществления живой аттенуированный штамм YFV характеризуется следующим образом:

- (ii) нуклеотид A (аденозин) в положении 6496 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 или SEQ ID NO. 5 замещен нуклеотидом G (гуанозином).

- (i) нуклеотид A (аденозин) в положении 3701 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 или SEQ ID NO. 5 замещен нуклеотидом G (гуанозином), и

В определенных вариантах осуществления живой аттенуированный штамм YFV характеризуется следующим образом:

- (i) нуклеотид G (гуанозин) в положении 2411 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 или SEQ ID NO. 5 замещен нуклеотидом U (уридином),

- (ii) нуклеотид A (аденозин) в положении 3701 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 или SEQ ID NO. 5 замещен нуклеотидом G (гуанозином); и

- (iii) нуклеотид A (аденозин) в положении 6496 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 или SEQ ID NO. 5 замещен нуклеотидом G (гуанозином).

В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный штамм YFV дополнительно содержит мутацию, расположенную в положении 1408 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 или SEQ ID NO. 5.

В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный штамм YFV содержит последовательность РНК, выбранную в группе, содержащей SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 или SEQ ID NO. 5, где по меньшей мере нуклеотид в положении 1408 и нуклеотид в положении 2411 являются мутированными.

В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный штамм YFV содержит последовательность РНК, выбранную в группе, содержащей SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 и SEQ ID NO. 5, где по меньшей мере нуклеотид в положении 1408 и нуклеотид в положении 3701 являются мутированными.

В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный штамм YFV содержит последовательность РНК, выбранную в группе, содержащей SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 и SEQ ID NO. 5, где по меньшей мере нуклеотид в положении 1408 и нуклеотид в положении 6496 являются мутированными.

В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный штамм YFV содержит последовательность РНК, выбранную в группе, содержащей SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 и SEQ ID NO. 5, где по меньшей мере нуклеотид в положении 1408, нуклеотид в положении 2411 и нуклеотид в положении 3701 являются мутированными.

В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный штамм YFV содержит последовательность РНК, выбранную в группе, содержащей SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 и SEQ ID NO. 5, где по меньшей мере нуклеотид в положении 1408, нуклеотид в положении 2411 и нуклеотид в положении 6496 являются мутированными.

В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный штамм YFV содержит последовательность РНК, выбранную в группе, содержащей SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 и SEQ ID NO. 5, где по меньшей мере нуклеотид в положении 1408, нуклеотид в положении 3701 и нуклеотид в положении 6496 являются мутированными.

В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный штамм YFV содержит последовательность РНК, выбранную в группе, содержащей SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 и SEQ ID NO. 5, где по меньшей мере нуклеотид в положении 1408, нуклеотид в положении 2411, нуклеотид в положении 3701 и нуклеотид в положении 6496 являются мутированными.

В некоторых вариантах осуществления нуклеотид A (аденин) в положении 1408 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 или SEQ ID NO. 5 замещен нуклеотидом U (уридином).

В определенных вариантах осуществления живой аттенуированный штамм YFV характеризуется следующим образом:

- (ii) нуклеотид A (аденозин) в положении 3701 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 или SEQ ID NO. 5 замещен нуклеотидом G (гуанозином);

- (iii) нуклеотид A (аденозин) в положении 6496 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 или SEQ ID NO. 5 замещен нуклеотидом G (гуанозином); и

- (iv) нуклеотид A (аденозин) в положении 1408 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 или SEQ ID NO. 5 замещен нуклеотидом U (уридином).

В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный штамм YFV в соответствии с настоящим изобретением содержит последовательность РНК, выбранную из SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 и SEQ ID NO. 5, где по меньшей мере один или несколько нуклеотидов в положении 2411, 3701, 6496 и необязательно 1408 является/являются мутированным(-и), при условии, что ни один из нуклеотидов не является мутированным таким образом, чтобы приводить в результате к реверсии генотипу Asibi (который может быть представлен последовательностью РНК под SEQ ID NO. 6). Другими словами, если нуклеотид в SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 или SEQ ID NO. 5 отличается от нуклеотида в том же положении в геноме Asibi (в SEQ ID NO. 6), то этот нуклеотид в последовательности РНК живого аттенуированного штамма YFV в соответствии с настоящим изобретением не является мутированным таким образом, чтобы стать нуклеотидом в том же положении в геноме Asibi (в SEQ ID NO. 6). Нуклеотиды из SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 или SEQ ID NO. 5, которые отличаются от нуклеотидов в тех же положениях в геноме Asibi, могут быть легко идентифицированы с помощью выравнивания последовательности (Needleman and Wunsch, (1970)) между SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 или SEQ ID NO. 5 и последовательностью Asibi (SEQ ID NO. 6).

В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный штамм YFV в соответствии с настоящим изобретением содержит последовательность РНК, содержащую SEQ ID NO. 2, где по меньшей мере один или несколько нуклеотидов в положении 2411, 3701, 6496 и необязательно 1408 является/являются мутированным(-и), при условии, что нуклеотиды в следующих положениях в SEQ ID NO. 2 не являются мутированными таким образом, чтобы приводить в результате к реверсии к генотипу Asibi (SEQ ID NO. 6): 304, 370, 854, 883, 1127, 1140, 1431, 1482, 1491, 1572, 1750, 1819, 1870, 1887, 1946, 1965, 2112, 2193, 2219, 2356, 2687, 3371, 3613, 3817, 3860, 3925, 4007, 4013, 4022, 4054, 4056, 4289, 4387, 4505, 4507, 4612, 4864, 4873, 5153, 5194, 5362, 5431, 5473, 5926, 6023, 6448, 6876, 7171, 7496, 7571, 7580, 7642, 7701, 7945, 8008, 8629, 10142, 10285, 10312, 10338, 10367, 10418, 10550 и 10800.

Таблица 1. Отличия нуклеотидов между SEQ ID NO. 2 и последовательностью РНК генома Asibi (SEQ ID NO. 6)

Положение нуклеотида в SEQ ID NO. 2	Положение нуклеотида в Asibi KF769016	Нуклеотид в SEQ ID NO. 2	Положение аминокислоты в белке	Аминокислота в Asibi KF769016	Аминокислота в SEQ ID NO. 2
304	G	A	C-62	T	T
370	U	C	C-84	V	V
854	C	U	M-36	L	F
883	A	G	M-45	T	T
1127	G	A	E-52	G	R
1140	C	U	E-56	A	V
1431	A	C	E-153	N	T
1482	C	U	E-170	A	V
1491	C	U	E-173	T	I
1572	A	C	E-200	L	T
1750	C	U	E-258	T	T
1819	C	U	E-281	S	S
1870	G	A	E-299	M	I
1887	C	U	E-305	S	F
1946	C	U	E-325	P	S
1965	A	G	E-331	K	R
2112	C	G	E-380	T	R
2193	C	U	E-407	A	V
2219	G	A	E-416	A	T
2356	C	U	E-460	L	L
2687	C	U	NS1-79	L	F
3371	A	G	NS1-307	I	V
3613	G	A	NS2a-35	V	V
3817	A	G	NS2a-103	V	V
3860	A	G	NS2a-118	R	V
3925	A	U	NS2a-139	V	V
4007	A	G	NS2a-167	T	A
4013	C	U	NS2a-169	P	F
4022	A	G	NS2a-172	T	A
4054	C	U	NS2a-182	N	N
4056	C	U	NS2a-183	S	F
4289	A	C	NS2b-37	I	L
4387	A	G	NS2b-69	G	G
4505	A	C	NS2b-108	I	L
4507	U	C
4612	U	C	NS3-14	I	I
4864	A	G	NS3-98	Q	Q
4873	U	G	NS3-101	A	A
5153	A	G	NS3-195	I	V
5194	U	C	NS3-208	F	F
5362	C	U	NS3-264	A	A
5431	C	U	NS3-287	I	I
5473	C	U	NS3-301	A	A
5926	C	U	NS3-452	R	R
6023	G	A	NS3-485	D	N
6448	G	U	NS4a-3	A	A
6876	U	C	P2k-20	V	A
7171	A	G	NS4b-95	I	M
7496	U	C	NS4b-204	L	L
7571	C	A	NS4b-229	R	R
7580	U	C	NS4b-232	Y	H
7642	U	C	NS5-2	S	S
7701	A	G	NS5-22	Q	R
7945	C	U	NS5-103	F	F
8008	U	C	NS5-124	I	I
8629	C	U	NS5-331	Y	Y
10142	G	A	NS5-836	E	K
10285	U	C	NS5-883	Y	Y
10312	A	G	NS5-892	R	R
10338	C	U	NS5-901	P	L
10367	U	C	3'UTR	-	-
10418	U	C	3'UTR	-	-
10550	U	C	3'UTR	-	-
10800	G	A	3'UTR	-	-

В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный штамм YFV в соответствии с настоящим изобретением содержит последовательность РНК под SEQ ID NO. 7. Предпочтительно, живой аттенуированный штамм YFV в соответствии с настоящим изобретением содержит последовательность РНК, которая отличается ограниченным количеством мутаций, например не более 5, не более 4, не более 3 или не более 2 из SEQ ID NO. 7. Предпочтительно, живой аттенуированный штамм YFV в соответствии с настоящим изобретением содержит последовательность РНК, которая отличается ограниченным количеством мутаций, например не более 5, не более 4, не более 3 или не более 2 из SEQ ID NO. 7, при условии, что ни один из нуклеотидов не является мутированным таким образом, чтобы приводить в результате к реверсии к генотипу Asibi. В иллюстративном варианте осуществления последовательность геномной РНК живого аттенуированного штамма YFV в соответствии с настоящим изобретением может состоять из нуклеотидной последовательности под SEQ ID NO. 7.

В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный штамм YFV в соответствии с настоящим изобретением содержит последовательность РНК под SEQ ID NO. 8. Предпочтительно, живой аттенуированный штамм YFV в соответствии с настоящим изобретением содержит последовательность РНК, которая отличается ограниченным количеством мутаций, например не более 5, не более 4, не более 3 или не более 2 из SEQ ID NO. 8. Предпочтительно, живой аттенуированный штамм YFV в соответствии с настоящим изобретением содержит последовательность РНК, которая отличается ограниченным количеством мутаций, например не более 5, не более 4, не более 3 или не более 2 из SEQ ID NO. 8, при условии, что ни один из нуклеотидов не является мутированным таким образом, чтобы приводить в результате к реверсии к генотипу Asibi. В иллюстративном варианте осуществления последовательность геномной РНК живого аттенуированного штамма YFV в соответствии с настоящим изобретением может состоять из нуклеотидной последовательности под SEQ ID NO. 8.

Как упоминалось выше, нуклеиновая кислота YFV кодирует 11 белков, как представлено ниже:

- капсидный белок (белок С), длина предшественника которого составляет 121 а.к., а длина зрелого белка составляет 101 а.к.,

- премембранный белок (белок prM) длиной 164 а.к., который представляет собой предшественник мембранного белка (белок М), длина которого составляет 75 а.к.,

- оболочечный белок (белок Е), длина которого составляет 493 а.к.,

- неструктурный белок 1 (NS1), длина которого составляет 352 а.к.,

- неструктурный белок 2а (NS2a), длина которого составляет 224 а.к.,

- неструктурный белок 2b (NS2b), длина которого составляет 130 а.к.,

- неструктурный белок 3 (NS3), длина которого составляет 623 а.к.,

- неструктурный белок 4а (NS4a), длина которого составляет 126 а.к.,

- неструктурный пептид P2k, длина которого составляет 23 а.к.,

- неструктурный белок 4b (NS4b), длина которого составляет 250 а.к.,

- неструктурный белок 5 (NS5), длина которого составляет 905 а.к.

В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный штамм вируса желтой лихорадки содержит нуклеиновую кислоту, содержащую мутацию в кодоне аминокислоты в положении 480 оболочечного белка (E), мутацию в кодоне аминокислоты в положении 65 неструктурного белка 2A (NS2a), мутацию в кодоне аминокислоты в положении 19 неструктурного белка 4A (NS4a) и/или мутацию в кодоне аминокислоты в положении 145 оболочечного белка (Е).

В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный штамм вируса желтой лихорадки содержит нуклеиновую кислоту, содержащую мутацию в кодоне аминокислоты в положении 480 оболочечного белка (E), мутацию в кодоне аминокислоты в положении 65 неструктурного белка 2A (NS2a) и мутацию в кодоне аминокислоты в положении 19 неструктурного белка 4A (NS4a).

В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный штамм вируса желтой лихорадки содержит нуклеиновую кислоту, содержащую мутацию в кодоне аминокислоты в положении 480 оболочечного белка (E), мутацию в кодоне аминокислоты в положении 65 неструктурного белка 2A (NS2a), мутацию в кодоне аминокислоты в положении 19 неструктурного белка 4A (NS4a) и мутацию в кодоне аминокислоты в положении 145 оболочечного белка (Е).

В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный штамм вируса желтой лихорадки содержит нуклеиновую кислоту, содержащую:

В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный штамм вируса желтой лихорадки в соответствии с настоящим изобретением содержит нуклеиновую кислоту, содержащую:

i) мутацию в кодоне аминокислоты в положении 480 оболочечного белка (E), которая приводит в результате к замене аминокислоты валина на лейцин, и

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота дополнительно содержит мутацию в кодоне аминокислоты в положении 19 неструктурного белка 4A (NS4a), которая приводит в результате к замене кодона AAA на AAG.

В некоторых вариантах осуществления мутация в кодоне аминокислоты в положении 480 оболочечного белка (E) приводит в результате к замене кодона с GUA на UUA, UUG, CUU, CUC, CUA или CUG. В варианте осуществления происходит замена кодона с GUA на UUA.

В некоторых вариантах осуществления мутация в кодоне аминокислоты в положении 65 неструктурного белка 2A (NS2a) приводит в результате к замене кодона с AUG на GUG, GUU, GUC или GUA. В варианте осуществления происходит замена кодона с AUG на GUG.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота дополнительно содержит мутацию в кодоне аминокислоты в положении 145 оболочечного белка (E), которая приводит в результате к замене кодона GUA на GUU.

i) мутацию в кодоне аминокислоты в положении 480 оболочечного белка (E), которая приводит в результате к замене аминокислоты валина на лейцин;

ii) мутацию в кодоне аминокислоты в положении 65 неструктурного белка 2A (NS2a), которая приводит в результате к замене аминокислоты метионина на валин; и

iii) мутацию в кодоне аминокислоты в положении 19 неструктурного белка 4A (NS4a), которая приводит в результате к замене кодона с AAA на to AAG.

ii) мутацию в кодоне аминокислоты в положении 65 неструктурного белка 2A (NS2a), которая приводит в результате к замене аминокислоты метионина на валин;

iii) мутацию в кодоне аминокислоты в положении 19 неструктурного белка 4A (NS4a), которая приводит в результате к замене кодона AAA на AAG; и

iv) мутацию в кодоне аминокислоты в положении 145 оболочечного белка (Е), которая приводит в результате к замене кодона GUA на GUU.

В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный штамм вируса желтой лихорадки содержит оболочечный белок, содержащий мутацию в положении 480. В частности, живой аттенуированный штамм вируса желтой лихорадки в соответствии с настоящим изобретением содержит оболочечный белок, содержащий мутацию в положении 480, которая приводит в результате к замене аминокислоты валина на лейцин.

В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный штамм вируса желтой лихорадки содержит оболочечный белок, содержащий остаток лейцина в положении в белке, которое соответствует положению 480 в SEQ ID NO. 15. В частности, указанный оболочечный белок содержит последовательность, на по меньшей мере 90%, 95%, 98% или 100% идентичную последовательности под SEQ ID NO. 15.

В частности, в нуклеиновой кислоте живого аттенуированного штамма вируса желтой лихорадки по настоящему изобретению ни один нуклеотид не мутирован таким образом, чтобы приводить в результате к реверсии генотипа Asibi (SEQ ID NO. 6). Например, нуклеиновая кислота живого аттенуированного штамма вируса желтой лихорадки не содержит мутаций нуклеотидов в следующих положениях в SEQ ID NO. 2 таким образом, чтобы приводить в результате к реверсии к генотипу Asibi (SEQ ID NO. 6): 304, 370, 854, 883, 1127, 1140, 1431, 1482, 1491, 1572, 1750, 1819, 1870, 1887, 1946, 1965, 2112, 2193, 2219, 2356, 2687, 3371, 3613, 3817, 3860, 3925, 4007, 4013, 4022, 4054, 4056, 4289, 4387, 4505, 4507, 4612, 4864, 4873, 5153, 5194, 5362, 5431, 5473, 5926, 6023, 6448, 6876, 7171, 7496, 7571, 7580, 7642, 7701, 7945, 8008, 8629, 10142, 10285, 10312, 10338, 10367, 10418, 10550 и 10800.

В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный штамм вируса желтой лихорадки содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую:

(i) оболочечный белок, содержащий мутацию в положении 480, и

(ii) белок NS2a, содержащий мутацию в положении 65.

В частности, молекула нуклеиновой кислоты живого аттенуированного штамма вируса желтой лихорадки дополнительно содержит мутацию в кодоне аминокислоты в положении 19 неструктурного белка 4A (NS4a) и/или мутацию в кодоне аминокислоты в положении 145 оболочечного белка (E).

В некоторых вариантах осуществления живой аттенуированный штамм вируса желтой лихорадки в соответствии с настоящим изобретением содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую:

В частности, нуклеиновая кислота дополнительно содержит мутацию в кодоне аминокислоты в положении 19 неструктурного белка 4A (NS4a), которая приводит в результате к замене кодона AAA на AAG, и/или мутацию в кодоне аминокислоты в положении 145 оболочечного белка (E), которая приводит в результате к замене кодона GUA на GUU.

В частности, указанный оболочечный белок содержит последовательность, на по меньшей мере 90%, 95%, 98% или 100% идентичную последовательности под SEQ ID NO. 15, и указанный белок NS2a содержит последовательность, на по меньшей мере 90%, 95%, 98% или 100% идентичную последовательности под SEQ ID NO. 16.

Нуклеиновая кислота живого аттенуированного штамма вируса желтой лихорадки по настоящему изобретению может дополнительно содержать нуклеотид G в положении в нуклеиновой кислоте, кодирующей неструктурный белок 4A (NS4a), которое соответствует положению 57 в SEQ ID NO. 17, и/или нуклеотид U в положении в нуклеиновой кислоте, кодирующей оболочечный белок (E), который соответствует положению 435 в SEQ ID NO. 18. В частности, живой аттенуированный штамм вируса желтой лихорадки по настоящему изобретению может содержать молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую неструктурный белок 4A (NS4a), который содержит последовательность, на по меньшей мере 90%, 95%, 98% или 100% идентичную последовательности под SEQ ID NO. 17, и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую оболочечный белок (E), который содержит последовательность, на по меньшей мере 90%, 95%, 98% или 100% идентичную последовательности под SEQ ID NO. 18.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит последовательность РНК субштамма 17D, содержащего мутации в соответствии с настоящим изобретением, как описано выше.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит последовательность РНК субштамма 17D-204, содержащего мутации в соответствии с настоящим изобретением, как описано выше.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит последовательность РНК под SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 или SEQ ID NO.5, содержащую мутации в соответствии с настоящим изобретением, как описано выше.

В иллюстративном варианте осуществления нуклеиновая кислота содержит последовательность РНК под SEQ ID NO. 2, содержащую мутации в соответствии с настоящим изобретением, как описано выше.

Как будет видно из приведенного в данном документе ниже раздела примеров, вышеопределенные мутации позволяют получать штаммы YFV, адаптированные к росту в клетках VERO и обладающие аттенуированной вирулентностью, такой как аттенуированная нейровирулентность, по сравнению с исходным штаммом YFV, и вирулентность которых является совместимой с использованием этих штаммов в качестве вакцин или в вакцинных композициях. В варианте осуществления вышеопределенные мутации позволяют получать штаммы YFV, адаптированные к росту в клетках VERO, которые являются менее нейровирулентными по сравнению с исходным штаммом YFV и по меньшей мере такими же аттенуированными по висцеротропизму, как и исходный штамм YFV. В варианте осуществления вышеопределенные мутации позволяют получать штаммы YFV, адаптированные к росту в клетках VERO, которые являются менее нейровирулентными по сравнению с исходным штаммом YFV, по меньшей мере такими же аттенуированными по висцеротропизму, как и исходный штамм YFV, и по меньшей мере такими же иммуногенными, как и исходный штамм YFV.

• Иммуногенные, вакцинные и фармацевтические композиции

В другом аспекте настоящее изобретение также относится к иммуногенной композиции, содержащей живой аттенуированный штамм YFV в соответствии с настоящим изобретением.

В объеме настоящего изобретения термин "иммуногенный" относится к способности композиции стимулировать антитело-опосредованный и/или клеточно-опосредованный иммунитет и/или иммунологическую память.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция может применяться для образования нейтрализующих антител против вируса желтой лихорадки.

В другом аспекте настоящее изобретение дополнительно относится к иммуногенной композиции, содержащей живой аттенуированный штамм вируса желтой лихорадки в соответствии с настоящим изобретением и фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к вакцинной композиции, содержащей живой аттенуированный штамм вируса в соответствии с настоящим изобретением и/или вакцинную композицию, содержащую иммуногенную композицию в соответствии с настоящим изобретением.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция может не содержать какого-либо вспомогательного средства.

В объеме настоящего изобретения "вспомогательное средство" относится к любому веществу, предназначенному для усиления соответствующего иммунного ответа и последующей клинической эффективности вакцины.

В качестве альтернативы вакцинная композиция может дополнительно содержать одно или несколько вспомогательных средств.

В некоторых вариантах осуществления вспомогательное средство может содержать минеральную соль, эмульсию, природное или синтетическое производное, происходящее из микроорганизмов, комбинированный вспомогательное средство, вспомогательное средство, полученное из цитокинов, или вспомогательное средство, полученное из дополнительных молекул, состав в виде частиц и т.п. Получение и использование вспомогательных средств хорошо известно из уровня техники.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрена иммуногенная композиция, содержащая живой аттенуированный штамм YFV, описанный в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая живой аттенуированный штамм YFV, описанный в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

В контексте настоящего изобретения выражение "фармацевтически приемлемый носитель" относится к носителю, который является физиологически приемлемым для введения человеку, при этом сохраняется физиологическая активность иммуногенной композиции в соответствии с настоящим изобретением, т.е. ее способность индуцировать иммунный ответ. Одним иллюстративным примером фармацевтически приемлемого носителя является физиологический солевой буфер. Другие физиологически приемлемые носители известны специалистам в данной области и описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences (18^th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Истон, Пенсильвания, США. Иммуногенная композиция, описанная в данном документе, может необязательно содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для приближения к физиологическим условиям, такие как pH-регулирующие и буферные средства, средства, регулирующие тоничность, увлажняющие средства и т.п. Кроме того, вакцинная композиция может необязательно содержать фармацевтически приемлемые добавки, в том числе, например, разбавители, связующие вещества, стабилизаторы и консерванты.

В различных вариантах осуществления pH иммуногенной композиции составляет от 5,5 до 8, например от 6,5 до 7,5 (например, приблизительно 7). Стабильный pH можно поддерживать с помощью буфера. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит буфер. Иммуногенные композиции могут быть изотоническими по отношению к организму человека. Иммуногенная композиция также может содержать одну или несколько дополнительных солей, таких как NaCl. Получение и использование фармацевтически приемлемых носителей хорошо известно из уровня техники.

На практике, иммуногенная композиция, и/или вакцинная композиция, и/или фармацевтическая композиция, содержащие живой аттенуированный штамм YFV по настоящему изобретению, могут быть получены с помощью общепринятых и передовых практик в данной области.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция, вакцинная композиция и/или фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением могут содержать один или несколько подходящих разбавителей и/или наполнителей.

В различных вариантах осуществления фармацевтические композиции, иммуногенные композиции и вакцинные композиции можно стерилизовать с помощью обычных методик стерилизации или можно стерилизовать фильтрованием. Полученные водные растворы можно упаковывать и хранить в жидкой форме или лиофилизировать, при этом лиофилизированный препарат перед введением восстанавливают с помощью стерильного водного носителя. В иллюстративном варианте осуществления фармацевтические композиции, иммуногенные композиции и вакцинные композиции упаковывают и хранят в виде микропеллет посредством процесса приллирования, описанного в WO 2009/109550. В варианте осуществления фармацевтические композиции, иммуногенные композиции и/или вакцинные композиции являются лиофилизированными или высушенными с помощью распылительной сублимационной сушки.

Способ получения живого аттенуированного штамма YFV

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения живого аттенуированного штамма вируса желтой лихорадки, адаптированного к росту в клетках Vero, предусматривающему стадии:

В некоторых вариантах осуществления стадию d) представленного выше способа по настоящему изобретению осуществляют 2, 3, 4, 5, 6 или больше раз. В некоторых вариантах осуществления клонирование на стадии е) представленного выше способа по настоящему изобретению осуществляют с помощью 2, 3, 4, 5, 6 или больше последовательных клонирований методом бляшкообразования с использованием клеток Vero. В некоторых вариантах осуществления стадию f) представленного выше способа по настоящему изобретению осуществляют 2, 3, 4, 5, 6 или больше раз.

- g) отбора из указанного множества штаммов вируса желтой лихорадки, выделенных на стадии f), одного или нескольких штаммов вируса желтой лихорадки, содержащих нуклеиновую кислоту, которая содержит:

ii) мутацию в кодоне аминокислоты в положении 65 неструктурного белка 2A (NS2a), которая приводит в результате к замене аминокислоты метионина на валин. Такой отбор легко осуществить с помощью способов секвенирования, хорошо известных из уровня техники.

В некоторых вариантах осуществления стадия g) может предусматривать отбор одного или нескольких живых аттенуированных штаммов вируса желтой лихорадки, содержащих нуклеиновую кислоту, которая содержит:

В некоторых вариантах осуществления стадия g) может предусматривать отбор одного или нескольких живых аттенуированных вышеописанных штаммов вируса желтой лихорадки, содержащих нуклеиновую кислоту, дополнительно содержащую мутацию в кодоне аминокислоты в положении 19 неструктурного белка 4A (NS4a), которая приводит в результате к изменению кодона AAA на AAG.

В некоторых вариантах осуществления стадия g) может предусматривать отбор одного или нескольких живых аттенуированных вышеописанных штаммов вируса желтой лихорадки, содержащих нуклеиновую кислоту, дополнительно содержащую мутацию в кодоне аминокислоты в положении 145 оболочечного белка (Е), которая приводит в результате к изменению кодона GUA на GUU.

i) мутацию в кодоне аминокислоты в положении 480 оболочечного белка (E), которая приводит в результате к замене аминокислоты валина на лейцин,

ii) мутацию в кодоне аминокислоты в положении 65 неструктурного белка 2A (NS2a), которая приводит в результате к замене аминокислоты метионина на валин,

iii) мутацию в кодоне аминокислоты в положении 19 неструктурного белка 4A (NS4a), которая приводит в результате к замене кодона с AAA на to AAG, и/или

В одном варианте осуществления исходный живой аттенуированный штамм вируса желтой лихорадки из стадии а) представляет собой субштамм вируса желтой лихорадки 17D, такой как субштамм вируса желтой лихорадки 17D-204.

На практике клетки Vero доступны в коллекциях клеток, таких как ATCC. Способы, подходящие для роста клеток Vero в культуре клеток in vitro, в том числе способы с использованием бессывороточной среды, хорошо известны специалисту в данной области (Kolell K. et al., 2007). В одном варианте осуществления клетки Vero адаптированы для роста на бессывороточной среде перед любым культивированием вирусов.

В некоторых вариантах осуществления культуральная среда, используемая для выращивания клеток Vero, является бессывороточной и необязательно не содержит какого-либо вещества человеческого или животного происхождения.

В объеме настоящего изобретения выражение "вещество человеческого или животного происхождения" относится к веществу, такому как белок, липид, гликопротеин, липопротеин, гликолипид, моносахарид или полисахарид, происходящему из организма человека или отличного от человека животного, например, фактору роста, гормону, который получают, например экстрагируют, из организма человека или животного организма, отличного от человеческого. Рекомбинантные молекулы не считаются веществом человеческого или животного происхождения. Такие бессывороточные среды и/или среды, не содержащие какого-либо вещества человеческого или животного происхождения, легкодоступны в каталогах поставщиков (например, в каталоге THERMOFISHER SCIENTIFIC®).

В некоторых вариантах осуществления культуральная среда, используемая для выращивания клеток Vero, также не содержит антибиотиков.

В некоторых вариантах осуществления культуральная среда, используемая для выращивания клеток Vero, может содержать один или несколько экстрактов, происходящих из бактерий, дрожжей и/или растений.

В некоторых вариантах осуществления геном исходного живого аттенуированного штамма вируса желтой лихорадки, не адаптированного к росту в клетках Vero, может находиться в форме кДНК, кодирующей геномную РНК.

В определенных вариантах осуществления кДНК переносится подходящим вектором, таким как, например, плазмида.

В некоторых других аспектах настоящее изобретение относится к вектору, содержащему нуклеиновую кислоту, который содержит последовательность РНК под SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 или SEQ ID NO. 5, в которой присутствует/присутствуют мутация(-и), описанная(-ые) в данном документе.

В некоторых других аспектах настоящее изобретение относится к вектору, содержащему нуклеиновую кислоту, которая содержит последовательность кДНК, соответствующую последовательности под SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 или SEQ ID NO. 5, в которой присутствует/присутствуют мутации, соответствующая(-ие) мутации(-ям), описанной(-ым) в данном документе.

В дополнительном аспекте живой аттенуированный штамм вируса желтой лихорадки в соответствии с настоящим изобретением получают путем мутирования геномной последовательности вируса желтой лихорадки с тем, чтобы ввести в указанную геномную последовательность мутации, описанные в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления геномная последовательность субштамма вируса желтой лихорадки 17D может быть мутирована с тем, чтобы ввести в указанную геномную последовательность мутации, описанные в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, содержащая последовательность РНК под SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 или SEQ ID NO. 5 или соответствующую последовательность кДНК, может быть мутирована с тем, чтобы ввести мутации, описанные в настоящем изобретении. Мутации могут быть введены в геномную последовательность путем сайт-направленного мутагенеза с помощью способов, хорошо известных специалисту в данной области, включая использование любой подходящей технологии редактирования генома. Геномная последовательность, в которую вводят мутации, описанные в настоящем изобретении, может представлять собой кДНК, кодирующую геномную РНК вируса желтой лихорадки, например, кДНК, кодирующую геномную РНК субштамма вируса желтой лихорадки 17D, например, кДНК, кодирующую SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 или SEQ ID NO. 5. В некоторых вариантах осуществления кДНК переносится подходящей плазмидой. Мутации, описанные в настоящем изобретении, которые могут быть введены в геномную последовательность вируса желтой лихорадки, выбраны из мутации нуклеотида в положении 2411, положении 3701, или положении 6496 геномной последовательности; или любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления эти мутации могут содержать замену нуклеотида G (гуанозина) в положении 2411 геномной последовательности на нуклеотид U (уридин), при этом нуклеотид A (аденозин) в положении 3701 геномной последовательности заменяют нуклеотидом G (гуанозин); или нуклеотид A (аденозин) в положении 6496 геномной последовательности заменяют нуклеотидом G (гуанозин) или любой их комбинацией. В некоторых вариантах осуществления вводят дополнительную мутацию, расположенную в положении 1408 геномной последовательности. В некоторых вариантах осуществления эта дополнительная мутация представляет собой замену нуклеотида A (аденин) в положении 1408 геномной последовательности на нуклеотид U (уридин). В некоторых вариантах осуществления в геномную последовательность вируса желтой лихорадки могут быть введены другие мутации, при условии, что ни один нуклеотид не мутирован таким образом, который приводит в результате к реверсии к генотипу Asibi. В другом аспекте мутации, описанные в настоящем изобретении, которые могут быть введены в геномную последовательность вируса желтой лихорадки, выбраны из мутации в кодоне аминокислоты в положении 480 оболочечного белка (E), которая приводит в результате к изменению аминокислоты валина на лейцин, мутации в кодоне аминокислоты в положении 65 неструктурного белка 2A (NS2a), которая приводит в результате к замене аминокислоты метионина на валин, или мутации в кодоне аминокислоты в положении 19 неструктурного белка 4A (NS4a), которая приводит в результате к замене кодона AAA на AAG, или любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления вводят дополнительную мутацию в кодоне аминокислоты в положении 145 оболочечного белка (Е), которая приводит в результате к замене кодона GUA на GUU. В некоторых вариантах осуществления в геномную последовательность вируса желтой лихорадки могут быть введены другие мутации, при условии, что ни один нуклеотид не мутирован таким образом, который приводит в результате к реверсии к генотипу Asibi. В частности, мутации, описанные в настоящем изобретении, которые могут быть введены в геномную последовательность вируса желтой лихорадки, представляют собой мутацию в кодоне аминокислоты в положении 480 оболочечного белка (E), которая приводит в результате к изменению аминокислоты валина на лейцин, и мутацию в кодоне аминокислоты в положении 65 неструктурного белка 2A (NS2a), которая приводит в результате к замене аминокислоты метионина на валин.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение также относится к живому аттенуированному штамму вируса желтой лихорадки, получаемому посредством способа в соответствии с настоящим изобретением.

В данном документе также раскрыт живой аттенуированный штамм вируса желтой лихорадки, полученный в соответствии с настоящим изобретением.

Другие способы и пути применения

Настоящее изобретение также относится к способу иммунизации индивидуума, нуждающегося в этом, против инфекции YFV, предусматривающему введение указанному индивидууму вакцинной композиции в соответствии с настоящим изобретением.

В объеме настоящего изобретения выражение "индивидуум, нуждающийся в этом" предназначено для обозначения индивидуума, подверженного риску инфицирования YFV.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение также относится к использованию живого аттенуированного штамма YFV в соответствии с настоящим изобретением для получения вакцины. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к использованию живого ослабленного штамма YFV в соответствии с настоящим изобретением в виде pMSL, в виде MSL или в виде WSL. В частности, настоящее изобретение также относится к использованию живого ослабленного штамма YFV в соответствии с настоящим изобретением в виде pMSL, в виде MSL или в виде WSL в ходе получения вакцины.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к живому аттенуированному штамму YFV в соответствии с настоящим изобретением для применения в получении вакцины.

В еще одном дополнительном аспекте настоящее изобретение также относится к вакцинной композиции в соответствии с настоящим изобретением для применения в предупреждении инфекции YFV.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу предупреждения инфекции YFV у индивидуума, предусматривающему введение указанному индивидууму эффективного количества живого аттенуированного YFV, иммуногенной композиции, фармацевтической композиции или вакцинной композиции в соответствии с настоящим изобретением.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу образования нейтрализующих антител против вируса желтой лихорадки у индивидуума, предусматривающему введение указанному индивидууму эффективного количества живого аттенуированного YFV, иммуногенной композиции, фармацевтической композиции или вакцинной композиции в соответствии с настоящим изобретением.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к применению живого аттенуированного вируса в соответствии с настоящим изобретением для получения лекарственного препарата для предупреждения инфекции YFV.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к живому аттенуированному вирусу в соответствии с настоящим изобретением для применения в предупреждении инфекции YFV.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к применению иммуногенной композиции в соответствии с настоящим изобретением для получения лекарственного препарата для предупреждения инфекции YFV.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к применению иммуногенной композиции в соответствии с настоящим изобретением для получения вакцинной композиции для предупреждения инфекции YFV.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к иммуногенной композиции в соответствии с настоящим изобретением для применения в предупреждении инфекции YFV.

Вакцинная композиция и иммуногенная композиция в соответствии с настоящим изобретением могут быть введены индивидууму, нуждающемуся в этом, с помощью любого подходящего пути введения.

Иммуногенная композиция или вакцина в соответствии с настоящим изобретением могут быть введены посредством любого подходящего пути, как например, с помощью мукозального введения (например, интраназального или сублингвального), парентерального введения (например, внутримышечного, подкожного, чрескожного или внутрикожного пути) или перорального введения. Как будет понятно специалисту в данной области, вакцина по настоящему изобретению составлена подходящим образом, чтобы быть совместимой с предполагаемым путем введения. В иллюстративных вариантах осуществления композицию по настоящему изобретению вводят внутримышечно или подкожно.

Вакцину по настоящему изобретению можно вводить в нескольких дозах. Например, вакцину по настоящему изобретению можно вводить в одной, двух или трех дозах. В варианте осуществления вакцину в соответствии с настоящим изобретением вводят в однократной дозе.

Вакцину в соответствии с настоящим изобретением можно вводить в количествах, которые могут легко определить специалисты средней квалификации в данной области. В некоторых вариантах осуществления доза вакцины составляет от 4 до 6 log₁₀ CCID₅₀.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1. Получение живых аттенуированных штаммов YFV путем адаптации на клетках Vero (доматочные посевные серии (pMSL))

1.1. Выбор способа - принципы

Общая стратегия для доматочных посевных серий (pMSL) показана на фигуре 1.

Вакцины YF-VAX® и Stamaril® разрабатывали из препаратов неклонированного штамма YF17D-204, и они содержали гетерологичные популяции вируса, как визуализировано по фенотипу размера бляшек. Кроме того, обе вакцины получали в яйцах.

Для создания гомогенных, четко определенных штаммов вирусов, адаптированных к росту в клетках Vero, а также для обеспечения стерильности и отсутствия занесенных агентов в конечных pMSL:

- (1) вирусную геномную РНК вирусов YF-VAX® и Stamaril® очищали;

- (2) а затем трансфицировали в клетки Vero для выделения вирусов желтой лихорадки, которые затем дважды амплифицировали на клетках Vero для адаптации вирусов для роста на этом клеточном субстрате;

- (3) затем вирусы клонировали с помощью двух циклов очистки от бляшек. Для этого вирусный препарат разбавляли для инфицирования клеток Vero и выращивали под полутвердым слоем с получением хорошо разделенных вирусных бляшек. Для каждой трансфекции 2 отдельные бляшки, каждая из которых соответствовала отдельной вирусной популяции, отбирали через верхний слой, разбавляли и использовали для второго цикла очистки бляшек, приводящего к образованию вирусных клонов;

- (4) затем эти клоны амплифицировали с получением достаточного запаса вируса для получения pMSL.

Все среды и растворы, используемые для получения pMSL, не содержали компонентов животного и человеческого происхождения.

1.2. Способы

1.2.1. Транскрипция in vitro из геномной кДНК YF-VAX®

Транскрипцию in vitro геномной кДНК YFV из YF-VAX® (плазмида pJSY2374.5, раскрытая в WO 2014/016360) осуществляют с помощью набора mMessage mMachine™ SP6 (AMBION®, ссылка AM1340) в соответствии с рекомендациями поставщика. Одновременно из плазмиды pJSY2374.5 2 осуществляли транскрипции in vitro.

Вкратце, после размораживания при комнатной температуре 10 мкг плазмиды линеаризировали путем переваривания в течение 2 часов при 37 ± 2°C рестрикционным ферментом NruI (30 Ед./10 мкг). Затем фермент инактивировали с помощью инкубации при 65°C в течение 20 минут. Линеаризацию плазмиды подтверждали с помощью электрофореза в 0,5% агарозном геле. Получали 40 мкл реакционной смеси, содержащей реакционный буфер набора, рибонуклеотиды (АТФ, CTP, UTP и смесь GTP и 7-метил-GTP), фермент и 1 мкг плазмиды. Полученную смесь инкубировали в течение 2 часов при 37 ± 2°C.

1.2.2. Очистка РНК

a) Из рабочей посевной серии вакцины Stamaril®

Одновременно осуществляли две очистки вирусной РНК.

Четыре флакона рабочей посевной серии вакцины Stamaril® (серия № FA238667, инфекционный титр 6,38 log₁₀ БОЕ/флакон) суспендировали в 200 мкл лизирующего буфера из набора RNeasy® (QIAGEN®), а затем объединяли. Затем РНК очищали с помощью двух серий экстракции смесью фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (125:24:1; pH 4,5).

Пробирки Phase Lock Gel Heavy объемом 2 мл (5PRIME®) центрифугировали в течение 30 секунд при 11000 × g. В каждую пробирку вводили по 750 мкл смеси РНК/буфер для лизиса. Затем в каждую пробирку добавляли равный объем (750 мкл) раствора фенол/хлороформ/IAA. После энергичного перемешивания органической и водной фаз с образованием гомогенной временной суспензии пробирки центрифугировали при 11000 × g в течение 5 минут для разделения фаз. Затем извлекали верхнюю фазу (водную фазу). Операцию возобновляли в новых пробирках Phase Lock Gel объемом 2 мл. Затем операцию осуществляли снова со смесью хлороформа и изоамилового спирта (24:1) для удаления всех примесей фенола. Затем РНК концентрировали и очищали от любых примесей органического растворителя путем очистки на колонке с диоксидом кремния с помощью набора RNeasy® (QIAGEN®) в соответствии с рекомендациями поставщика. Затем очищенную РНК элюировали водой, не содержащей нуклеаз.

b) Из геномной кДНК YF-VAX®, полученной в результате транскрипции in vitro

Плазмидную ДНК, контаминирующую РНК, полученную путем транскрипции in vitro (см. выше), удаляли с помощью 4 Ед. ДНКазы в течение 15 минут при 37 ± 2°C. Затем полимеразу SP6 инактивировали с помощью инкубации в течение 10 минут при 70°C.

РНК, полученную с помощью транскрипции in vitro, смешивали с 60 мкл воды, не содержащей РНКазы, и 350 мкл буфера для лизиса из набора RNeasy® (QIAGEN®). Затем РНК очищали с помощью двух серий экстракции смесью фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (125:24:1; pH 4,5). Для этого пробирки Phase Lock Gel Heavy объемом 1,5 мл центрифугировали в течение 30 секунд при 11000 × g. В каждую пробирку вводили 750 мкл смеси РНК/буфер для лизиса. Затем в каждую пробирку добавляли равный объем (750 мкл) раствора фенол/хлороформ/изоамиловый спирт. После энергичного перемешивания органической и водной фаз с образованием гомогенной временной суспензии пробирки центрифугировали при 11000 × g в течение 5 минут для разделения фаз. Затем извлекали верхнюю фазу (водную фазу). Операцию возобновляли в новых пробирках Phase Lock Gel объемом 1,5 мл. Затем операцию осуществляли снова со смесью хлороформа и изоамилового спирта (24: 1) для удаления всех примесей фенола. Затем РНК очищали на колонке с диоксидом кремния с помощью набора RNeasy® (QIAGEN®) в соответствии с рекомендациями поставщика. Затем очищенную РНК элюировали водой, не содержащей нуклеаз.

1.2.3. Трансфекция

Для каждой очистки РНК одновременно осуществляли две трансфекции.

a) Получение смеси РНК/Lipofectamine™

Смешивали 10 или 15 мкл Lipofectamine™ 2000 CD (LIFE TECHNOLOGIES®) с 1 мл среды OptiPro SFM (LIFE TECHNOLOGIES®) и инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре. Затем добавляли приблизительно 10 log₁₀ Гэкв. (титр, эквивалентный геному, определенный с помощью qRT-PCR YF-NS5, как описано в Mantel et al. (2008)) очищенной РНК. Эти смеси инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре.

b) Подготовка клеток Vero

Перед трансфекцией бессывороточные клетки Vero из банка GMP Sanofi Pasteur, предварительно высеянные в 6-луночных планшетах (9,10⁵ клеток в 3 мл VP-SFM (THERMOFISHER SCIENTIFIC) на лунку), промывали с помощью среды OptiPro SFM по 2 мл на лунку.

c) Реакция трансфекции

В 6-луночном планшете после удаления промывочной среды из клеток смеси для трансфекции, содержащие РНК, депонировали в две лунки (1 мл/лунка) для каждого препарата. Лунку приводили в контакт со средой OptiPro SFM/Lipofectamine™, не содержащей РНК, и последнюю лунку оставляли в качестве клеточного контроля только в среде OptiPro SFM. Два планшета получали одновременно: один со смесями, содержащими 10 мкл Lipofectamine™, и один со смесями, содержащими 15 мкл Lipofectamine™. Смесь, содержащую Lipofectamine™ и РНК, оставляли в контакте с клетками Vero в течение 4 часов при 37 ± 2°C, при 5 ± 2% CO₂, а затем в каждую лунку добавляли по 2 мл предварительно нагретой среды VP-SFM. 6-луночные планшеты инкубировали при 37 ± 2°C; 5 ± 2% CO₂, в течение 16 часов. Затем среду обновляли и планшеты повторно инкубировали при 37 ± 2°C, 5 ± 2% CO₂. Супернатанты после трансфекции собирали, когда был заметен цитопатический эффект (лизис клеток), и когда геномный титр, определенный с помощью qRT-PCR YF-NS5 из супернатанта культуры (как описано в Mantel et al. (2008)), составлял более 8,0 log₁₀ Гэкв./мл. Замену культуральной среды свежей средой осуществляли в D5 и D8, если время культивирования, необходимое для сбора материала, было больше, чем это время. Собранные супернатанты разделяли на аликвоты.

1.2.4. Амплификация вируса

a) Амплификация № 1 (пассаж вируса № 2)

За два дня до амплификации вируса №1 высевали 2,10⁵ клеток Vero в колбы объемом 25 см², содержащие 5 мл среды VP-SFM. Затем вирусные суспензии, полученные в результате трансфекции, разбавляли в среде VP-SFM, чтобы получить множественность генома (m.o.g), равную 2 (т.е. 2 Гэкв. на клетку, рассчитанную на основе концентрации РНК, полученной с помощью qRT-PCR). Культуральную среду из ранее засеянных клеток Vero удаляли и клетки приводили в контакт с 1 мл разбавленной вирусной суспензии или 1 мл только среды VP-SFM (клеточный контроль). Колбы инкубировали в течение 2 ч. при 37 ± 2°C; 5 ± 2% CO₂. Затем вирусный инокулят удаляли и заменяли 10 мл среды VP-SFM, а клетки инкубировали при 37 ± 2°C; 5 ± 2% CO₂ в течение 2 дней. Затем культуральную среду обновляли новой средой VP-SFM, предварительно нагретой до 37 ± 2°C, и колбы повторно инкубировали при 37 ± 2°C; 5 ± 2% CO₂ в течение 2-3 дней. Через 4-5 дней инкубации выделяли супернатант культуры, содержащий вирус. Вирусную суспензию осветляли путем центрифугирования в течение 10 минут при 1200 об/мин. при 4°C, а затем распределяли по аликвотам. 140 мкл этой вирусной суспензии использовали для экстракции общей РНК с помощью мини-набора QiaAmp для вирусов (QIAGEN®; в соответствии с протоколом поставщика) и для количественного определения вирусной РНК с помощью qRT-PCR YF-NS5 (как описано в Mantel et al. (2008)).

Одну или несколько аликвот, в зависимости от титра вирусной РНК, хранили для проведения второй стадии амплификации, если ее осуществляли в тот же день, остальные замораживали при ≤ -70°C в присутствии 10% конечного раствора сорбита.

b) Амплификация № 2 (пассаж вируса № 3)

За два дня до амплификации вируса № 2 высевали 5⋅10⁵ клеток Vero в колбы объемом 75 см², содержащие 20 мл среды VP-SFM. Затем вирусную суспензию, полученную в первой амплификации, разбавляли в среде VP-SFM, чтобы инфицировать клетки Vero из расчета m.o.g., составляющей 2 (т.е. Гэкв. на клетку, рассчитанную на основе концентрации РНК, полученной с помощью qRT-PCR).

Другие стадии амплификации № 2 осуществляли, как подробно описано для амплификации №1 (см. раздел а) выше).

c) Клонирование вируса - очистка на планшете (пассажи вируса 4 и 5)

Для каждой вирусной суспензии, полученной после трансфекции и амплификации, требовалось два 6-луночных планшета.

Аликвоту вирусной суспензии, полученной после амплификации № 2, разбавляли так, чтобы получить суспензию с концентрацией приблизительно 2,0 log₁₀ БОЕ/мл и суспензию с концентрацией 1,7 log₁₀ БОЕ/мл. За клетками Vero, предварительно засеянными в 6-луночные планшеты (9,10⁵ клеток в 3 мл VP-SFM на лунку), наблюдали для проверки целостности клеток и отсутствия контаминации, затем культуральную среду удаляли. Для каждого разбавления 5 лунок планшета инфицировали 500 мкл разбавленного вируса в каждой лунке (разбавления 2,0 log₁₀ БОЕ/мл или 1,7 log₁₀ БОЕ/мл), а лунка клеточного контроля содержала только 500 мкл VP-SFM. Планшеты инкубировали в течение 2 часов при 37 ± 2°C; 5 ± 2% CO₂. Затем инокулят удаляли и заменяли 4 мл смеси для верхнего слоя, т.е. раствором VP-SFM 2X, предварительно нагретым до 42°C, и смешивали экстемпорально в отношении объема к объему с 2% раствором агарозы. После затвердевания смеси для верхнего слоя планшеты инкубировали в обратном положении (крышкой вниз) в течение 3-6 дней при 37 ± 2°C; 5 ± 2% CO₂. За планшетами наблюдали каждый день. Как только проявлялся цитопатический эффект, в каждую лунку (2 мл) добавляли вторую смесь для верхнего слоя, которая была идентична первой, но дополнительно содержала 0,008% нейтрального красного, и планшеты инкубировали в обратном положении в течение 1-2 дней при 37 ± 2°С; 5 ± 2% CO₂.

Инфицирование клетки вирусной частицей (клоном) оставалось в этих условиях ограниченным непосредственно окружающими клетками и вызывало локальный лизис, создавая белое пятно (бляшку лизиса), богатое вирусами, над клеточным монослоем, иным образом окрашенным в красный цвет. Для каждого амплифицированного вирусного разбавления два клона выделяли через покровную среду с помощью микропипетки и конуса на 1000 мкл. Полученный таким образом вирусный клон суспендировали в 1 мл среды VP-SFM, а затем энергично перемешивали.

Каждую из этих суспензий разбавляли в каскадных стадиях от 1:2 до 1:200000 для осуществления второй серии очистки на планшете. В конце этого второго цикла клонирования снова собирали два клона на планшет. Получали максимум шестнадцать клонов на линию дифференцировки, т.е. 16 клонов из исходного штамма Stamaril® и 16 клонов из исходного штамма YF-VAX®.

d) Амплификация №3 (пассаж вируса № 6)

Для каждого клона (до 32 включительно) вирусную суспензию, полученную путем ресуспендирования вирусного материала, содержащегося в агарозе, разбавляли в соотношении 1/4 или 1/2 (в зависимости от размера собранной бляшки) в VP-SFM.

Амплификацию № 3 осуществляли в соответствии с тем же протоколом, что и амплификацию №1 (см. раздел а) выше). Амплифицированный вирус собирали, когда был заметен цитопатический эффект и геномный титр в qRT-PCR составлял более 8,0 log₁₀ Гэкв./мл.

Через 4-5 дней инкубации супернатант культуры, содержащий вирус, выделяли и разделяли на аликвоты. 140 мкл этой вирусной суспензии использовали для экстракции общей РНК с помощью мини-набора QiaAmp для вирусов (QIAGEN®) в соответствии с протоколом поставщика и для количественного определения РНК с помощью qRT-PCR YF-NS5 (как описано в Mantel et al. (2008)). Одну или несколько аликвот, в зависимости от титра вирусной РНК, хранили для выполнения следующей стадии амплификации, остальные замораживали при ≤ -70°C в присутствии 10% конечного раствора сорбита.

e) Амплификация № 4 (пассаж вируса № 7)

Вирусную суспензию, полученную в результате амплификации №3 (см. раздел d) выше), разбавляли в среде VP-SFM так, чтобы инфицировать клетки Vero, ранее засеянные из расчета m.o.g., составляющего 2, и далее обрабатывали в соответствии с тем же протоколом, что и при амплификации № 2 (см. раздел b) выше).

Амплифицированный вирус собирали, когда был заметен цитопатический эффект и геномный титр в qRT-PCR составлял более 8,0 log₁₀ Гэкв./мл. В общей сложности через 4-5 дней инкубации супернатант собирали, вирусную суспензию осветляли путем центрифугирования в течение 10 минут при 1200 об/мин. при 4°C, а затем разделяли на замороженные аликвоты при ≤ -70°C в присутствии 10% конечного раствора сорбита.

Полученную таким образом вирусную суспензию использовали для выполнения инфекционного титрования и секвенирования вирусного генома.

На основании этих данных три штамма из каждой линии дифференцировки (т. е. три штамма TV2212, TV2232 и TV2241 из исходного штамма Stamaril® и три штамма TV3111, TV3112 и TV4221 из исходного штамма YF-VAX®) отбирали в соответствии со следующими критериями: инфекционный титр ≥ 6 log₁₀ CCID₅₀/мл и геномная последовательность, не демонстрирующая реверсии к последовательности исходного штамма Asibi.

Инфекционное титрование вирусной суспензии осуществляли способом CCID₅₀ на клетках Vero. Вкратце, вирусные суспензии серийно 4-кратно разбавляли в 96-луночном планшете в IMDM (THERMOFISHER SCIENTIFIC) + 4% FCS, начиная с -4,6 log10 до -8 log10. Контрольный вирус (вирус Stamaril®, амплифицированный один раз на клетках Vero, партия MLE-JPO-000089) включали в каждый тест в качестве положительного эталона. Сто микролитров каждого вирусного разбавления добавляли в 10 лунок, содержащих клетки Vero, засеянные в 96-луночные планшеты с плоским дном, за три дня до анализа (8000 клеток/лунка). Через 4 дня после инкубации при +37°C, 5% CO₂, супернатанты удаляли, и клетки фиксировали в течение 15 минут при -20 ± 3°C с помощью 150 мкл 85% ацетона, затем насыщали 2,5% молочным буферным раствором PBS-Tween перед иммуноокрашиванием мышиным моноклональным антителом 4G2, специфическим ко всем флавивирусам Е (RD BIOTECH®, серия №130726-4G2), в концентрации 2 мкг/мл (разбавление 1/2000). Инфицированные очаги, окрашенные антителом 4G2, затем обнаруживали после инкубации с антителом козы против IgG мыши, конъюгированным со щелочной фосфатазой (CLINISCIENCES® SA, ссылка № 1030-04, серия № A7013-Z145), разбавленным до 1/1000, а затем с субстратом щелочной фосфатазы (BCIP/NBT, SIGMA-ALDRICH®, ссылка № B5655, серия № SLBN0689V, и левамизол, SIGMA-ALDRICH®, ссылка № L9756, серия № 091M1227V).

Подсчитывали положительные лунки, т.е. лунки, содержащие по меньшей мере одну бляшку, окрашенную в черный цвет, и рассчитывали окончательный титр с использованием способа регрессии наименьших квадратов.

f) Амплификация № 5 (пассаж вируса № 8) - кандидат для доматочной посевной серии (pMSL)

Вирусную суспензию из каждого из 6 штаммов, выбранных после амплификации № 4 (см. раздел е) выше), разбавляли в среде VP-SFM так, чтобы инфицировать клетки Vero при m.o.i., составляющем 0,01.

За два дня до амплификации вируса № 5 высевали 12,10⁶ клеток Vero в колбы объемом 175 см², содержащие 30 мл среды VP-SFM. Как осуществляли ранее, культуральную среду удаляли и заменяли 12 мл разбавленной вирусной суспензии или только VP-SFM (контрольные клетки). Колбы инкубировали в течение 2 ч. при 37 ± 2°C; 5 ± 2% CO₂. Затем вирусный инокулят удаляли и заменяли 50 мл среды VP-SFM. Колбы инкубировали в течение 2 дней при 37 ± 2°C; 5 ± 2% CO₂. Затем культуральную среду обновляли свежей средой VP-SFM, предварительно нагретой до 37 ± 2°C, и колбы повторно инкубировали при 37 ± 2°C; 5 ± 2% CO₂ в течение 1-3 дней. Амплифицированный вирус собирали, когда был заметен цитопатический эффект и геномный титр в qRT-PCR составлял более 8,0 log₁₀ Гэкв./мл.

После в общей сложности 3-5 дней инкубации супернатант собирали, вирусную суспензию осветляли путем центрифугирования в течение 10 минут при 1200 об/мин. при 4°C, затем разделяли на аликвоты, которые замораживали при ≤ -70°C в присутствии 10% конечного раствора сорбита. Амплифицированные вирусы, полученные из 6 отобранных штаммов, составляли 6 кандидатов для pMSL.

ПРИМЕР 2. Нейровирулентность кандидатов в мышиной модели

2.1. Нейровирулентность кандидатов для pMSL в мышиной модели

Нейровирулентность кандидатов vYF (адаптированного к клеткам Vero вируса желтой лихорадки) доматочной посевной серии (pMSL) оценивали посредством определения летальной дозы 50% у мыши (MLD₅₀), как описано в WHO TRS 872, приложение 2 (1998).

Для исследования нейровирулентности кандидатов для pMSL группам из 8 самок мышей OF1 (в возрасте 4 недель на момент инокуляции) интрацеребрально вводили 30 мкл от 5 до 7 вирусных разбавлений в 0,4% NaCl 2,5% буфере человеческого сывороточного альбумина (HSA). Четыре кандидата для vYF pMSL TV2212, TV3111, TV3112 и TV4221 оценивали в отношении их нейровирулентности и сравнивали с эталонными вакцинами Stamaril® и YF-VAX®. За мышами наблюдали в течение 21 дня и в день 21 регистрировали количество выживших мышей. Осуществляли три независимых эксперимента со случайным распределением образцов. Для каждого эксперимента введенные количества проверяли путем обратного титрования методом CCID₅₀ в день инокуляции.

Клинический контроль осуществляли ежедневно для ежедневной регистрации выживаемости. MLD₅₀ рассчитывали как дозу, приводящую к выживанию 50% мышей, с помощью метода регрессии наименьших квадратов и выражали в log₁₀ MLD₅₀/мл. MLD₅₀ каждого штамма определяли как взвешенное среднее из 3 определений и 95% доверительных интервалов, за исключением TV3111 и TV3112, для которых нельзя было рассчитать MLD₅₀, поскольку 100% выживание мышей регистрировали для групп, которым вводили штаммы TV3111 и TV3112 даже с самой высокой дозой (30 мкл 0,7 log₁₀ разбавления).

Результаты представлены в таблице 2 ниже.

Таблица 2. Характеристика штаммов vYF на стадии pMSL в тесте нейровирулентности у мыши (тест MLD₅₀)

Штамм YFV	log₁₀ CCID₅₀/мл	log₁₀ MLD₅₀/мл
Stamaril®	6,3	6,0
TV2212	6,8	6,7
YF-VAX®	7,5	4,7
TV3111	7,2	< 2,2
TV3112	7,2	< 2,2
TV4221	7,9	4,8

Что касается штамма vYF TV2212, полученного из линии дифференцировки Stamaril®, то он проявлял аналогичную нейровирулентность по сравнению с эталонной вакциной Stamaril®.

Штамм vYF TV4221, полученный из линии дифференцировки YF-VAX®, проявлял аналогичную нейровирулентность по сравнению с эталонной вакциной YF-VAX®. Наконец, оба штамма vYF TV3111 и TV3112, полученные из линии дифференцировки YF-VAX®, не проявляли нейровирулентного эффекта по сравнению с эталонной вакциной YF-VAX®. Для этих 2 штаммов vYF невозможно рассчитать титр MLD₅₀ (по меньшей мере <2,2 log₁₀ MLD₅₀/мл).

В результате 2 штамма vYF TV2212 и TV4221 демонстрировали сходные профиль нейровирулентности и титры MLD₅₀, как и их соответствующие исходные эталонные штаммы Stamaril® и YF-VAX®. Два других штамма vYF, как TV3111, так и TV3112, полученные из линии дифференцировки YF-VAX®, демонстрировали заметную аттенуацию нейровирулентности по сравнению с их исходным штаммом YF-VAX®, и при этом нельзя было оценить их титры MLD₅₀.

2.2. Нейровирулентность MSL и WSL штамма TV3112 в мышиной модели

2.2.1. MSL и WSL штамма TV3112

Все среды и растворы, используемые для получения MSL и WSL, не содержали компонентов животного и человеческого происхождения.

После амплификации клеток Vero в статических условиях клетки высевали в биореактор. Через 3 дня роста клеток в биореакторе среду меняли со среды для роста клеток на среду для получения вирусов. Вирус инокулировали путем добавления в биореактор посевной серии (pMSL TV3112 с получением MSL TV3112 или MSL TV3112 с получением WSL TV3112). Через 2 дня размножения вируса среду с получением вируса удаляли и заменяли таким же объемом свежей среды с получением вирусов. Через 4 дня после инокуляции вируса содержимое биореактора собирали, осветляли, стабилизировали, заполняли и хранили замороженным.

2.2.2. Нейровирулентность MSL и WSL штамма TV3112

Применяли тот же самый протокол, описанный в примере 2, подраздел 2.1, выше.

Таблица 3. Характеристика штамма TV3112 на стадиях MSL и WSL в тесте вирулентности у мыши (тест MLD₅₀)

Штамм YFV	log₁₀ CCID₅₀/мл	log₁₀ MLD₅₀/мл
MSL TV3112	7,0	< 2,2
WSL TV3112	8,1	< 2,2

Что касается pMSL TV3112, то MSL TV3112 и WSL TV3112 не проявляли какого-либо эффекта нейровирулентности. Для MSL TV3112 и WSL TV3112 невозможно рассчитать титр MLD₅₀ (по меньшей мере <2,2 log₁₀ MLD₅₀/мл).

MSL TV3112 и WSL TV3112 демонстрировали заметную аттенуацию нейровирулентности по сравнению с их исходным штаммом YF-VAX®, и нельзя было оценить их титры MLD₅₀.

ПРИМЕР 3. Висцеротропизм и нейротропизм кандидатов штамма vYF в мышиной модели

Висцеротропизм и нейротропизм 6 кандидатов доматочной посевной серии (pMSL) vYF (адаптированного к клеткам Vero вируса желтой лихорадки) оценивали в анализах, основанных на инокуляции мышей с недостаточностью рецепторов IFN типа I, которые разрабатывали для обеспечения дифференцировки патогенных и аттенуированных вакцинных штаммов (Meier et al., 2009; Erickson and Pfeiffer, 2015). Описано, что мыши с иммунодефицитом A129 с КО рецепторов IFN типа I имитировали инфекцию вируса YF дикого типа у приматов и людей (Meier et al., 2009). Таким образом, по-видимому, такая мышиная модель является подходящей для изучения висцеротропного заболевания, вызываемого неаттенуированными вирусами желтой лихорадки.

3.1. Способы

3.1.1. Определение групп

Пятнадцати группам (группы от A до O) из шести самок мышей A129 в возрасте 4-8 недель вводили 4 log₁₀ CCID_CCID50/доза каждого из 6 кандидатов для pMSL или эталонной вакцины Stamaril®, как описано в таблице 4 ниже (без вспомогательного средства; подкожный путь введения; 200 мкл в D0).

Таблица 4. Определение групп

Группа	Количество мышей на группу	Тестируемый продукт
Группа	Количество мышей на группу	Действующее вещество
Название	Доза
A	6	PBS 1X	-
B	6	Stamaril®	4 log БОЕ
C	6	Stamaril®	4 log БОЕ
D	6	TV2212	4 log₁₀ CCID₅₀
E	6	TV2212	4 log₁₀ CCID₅₀
F	6	TV2232	4 log₁₀ CCID₅₀
G	6	TV2232	4 log₁₀ CCID₅₀
H	6	TV2241	4 log₁₀ CCID₅₀
I	6	TV2241	4 log₁₀ CCID₅₀
J	6	TV3111	4 log₁₀ CCID₅₀
K	6	TV3111	4 log₁₀ CCID₅₀
L	6	TV3112	4 log₁₀ CCID₅₀
M	6	TV3112	4 log₁₀ CCID₅₀
N	6	TV4221	4 log₁₀ CCID₅₀
O	6	TV4221	4 log₁₀ CCID₅₀

3.1.2. Схема исследования

Схема исследования описана на фигуре 2.

Умерщвляли 6 мышей из групп C, E, G, I, K, M, O и образцы их органов отбирали в D6, и умерщвляли 6 мышей из групп B, D, F, H, J, L, N и образцы их органов отбирали в D11. Промежуточный забор образцов крови осуществляли в группах A, B, D, F, H, J, L и N в D4. Для контроля PBS включали только 6 мышей и образцы отбирали в D11 (группа A).

3.1.3. Клинические наблюдения и оценка мышей

За животными наблюдали ежедневно в течение 11 дней после инокуляции в соответствии с оценочной сеткой, описанной в таблице 5 ниже. Температуру тела контролировали и регистрировали каждый день с D3 до конца эксперимента в D11.

Таблица 5. Оценочная таблица

Параметры	Описание	Балл
Общий аспект (GA)	Нормальные	0
	Шерсть/взъерошенная	1
	Выгнутая спина	2
Дрожь	3
Неврологические признаки (NS)	Нормальные	0
	На цыпочках	1
	Осложнение движений	2
Судорога	3
Реакция на раздражители (RS)	Нормальные	0
	Неизменная	1
	Сниженная	2
	Избыточная/прострация	3
Отсутствие реакции	4
Дыхание (B)	Нормальные	0
Дыхание (B)	Быстрое или беспорядочное	1
Респираторный дистресс-синдром	2

В ходе эксперимента животных умерщвляли при наступлении любого из следующих событий:

- признаки страдания (кахексия, ослабление, сложность передвижения или питания);

- смешанная токсичность (сутулость, судороги);

- оценка общих аспектов=3+реакция на раздражители=3;

- потеря веса тела >20%.

Любое животное, найденное мертвым, вскрывали.

3.1.4. Отбор биологических образцов

a) в D4 под анестезией отбирали промежуточные образцы крови из поднижнечелюстной вены. Приблизительно 200 мкл крови собирали во флаконы, содержащие активатор свертывания и отделитель сыворотки (BD Microtainer SST).

b) в день 6 и D11 у всех животных под анестезией отбирали образцы крови после кровопускания через надрез сонной артерии. Около 1 мл крови собирали во флаконы, содержащие активатор свертывания и отделитель сыворотки (BD Vacutainer SST).

с) Сборы органов осуществляли в стерильных условиях. Инструменты, применяемые для вскрытия животных, предварительно промывали дезактивационным раствором RNaseZap™. Все органы, перечисленные ниже, отбирали у всех мышей как можно быстрее после кровопускания с последующей эвтаназией животного путем смещения шейных позвонков под анестезией: мозг, печень и селезенку.

Что касается печени, то две иглы для биопсии диаметром 7 мм, предназначенные для выявления вирусной нагрузки, помещали во флаконы, содержащие 1 мл раствора RNAlater™.

Для головного мозга и селезенки 2 половинных среза, предназначенных для выявления вирусной нагрузки, помещали во флаконы, содержащие 1 мл раствора RNAlater™.

3.1.7. Аналитические тесты

a) Виремия

Полную геномную РНК экстрагировали из 140 мкл каждого отдельного образца сыворотки с помощью набора для вирусов Macherey Nagel NucleoSpin®96 на автоматизированной рабочей станции для экстракции РНК Tecan Evoware в соответствии с инструкциями производителя и элюировали в две стадии до конечного объема 140 мкл воды, не содержащей нуклеаз.

Сразу после экстракции количественное определение РНК осуществляли с помощью qRT-PCR YF-NS5 (как описано в Mantel et al. (2008)). QRT-PCR нацелена на консервативную область гена NS5 YF для выявления присутствия вирусного генома YF.

b) Вирусная нагрузка в органах

Иглы для биопсии замораживали при -80°C в растворе RNA later™. При размораживании каждый образец органа взвешивали.

Общую РНК экстрагировали из игл для биопсии органов с помощью комбинированного способа Trizol™ (Invitrogen®)/RNeasy™ (Qiagen®) в соответствии с рекомендациями поставщика.

Затем присутствие вирусной РНК в очищенных образцах РНК определяли количественно с помощью анализа qRT-PCR YF-NS5, описанного в Mantel et al. (2008). qRT-PCR нацелена на консервативную область гена NS5 YF для выявления присутствия вирусного генома YF.

Каждый цикл qRT-PCR включал два нематричных контроля (отрицательные контроли qRT-PCR) и два положительных контроля на основе вирусной суспензии CYD-3.

Для подтверждения цикла все отрицательные контроли должны быть ниже предела выявления (LOD), а положительные контроли должны быть включены в контрольные диаграммы.

Из-за коэффициентов разбавления и для образца, составляющего 100 мг органа, предел выявления рассчитывали на уровне 1 Гэкв./мг органа.

3.2. Результаты

3.2.1. Клинические признаки

За всеми животными наблюдали ежедневно после инокуляции в соответствии с оценочной сеткой, описанной в таблице 5 выше: всех мышей из групп от A до O оценивали ежедневно от дня 3 до дня 6, и всех мышей из групп A, B, D, F, H, J, L и N дополнительно оценивали ежедневно до 11 дня включительно.

Средние баллы рассчитывали для каждого критерия, т. е. общего аспекта (GA), реакции на раздражители (RS), неврологических признаков (NS) и дыхания (B), от дня 3 до дня 11 для каждой группы в каждый момент времени. Как и ожидалось, для всех мышей A129, которым вводили контрольный физиологический раствор (PBS, группа A), не было зарегистрировано каких-либо конкретных клинических показателей для какого-либо животного в течение всего периода контроля.

Для всех групп A129, которым вводили либо эталонную вакцину Stamaril®, либо один из кандидатов pMSL vYF, клинические признаки были слабыми со средним баллом по каждому критерию ниже 1,5 независимо от времени и критерия (GA <1,5; RS, NS и B <1).

Какой-либо конкретной клинической оценки не регистрировали в течение дней 3, 4 и 5; затем некоторые оценки 1/0/0/0 или 2/0/0/0 (GA/RS/NS/B) регистрировали для нескольких мышей в дни 6 и 7. В день 10 и 11 все мыши A129, которым вводили эталонную вакцину Stamaril® или один из кандидатов для pMSL vYF, проявляли низкие баллы (некоторые мыши с баллами GA=1 или 2 и RS, NS, а также баллами B=1) за исключением одной мыши, которой вводили TV2232 (группа F), у которой в день 10 проявлялся дрожащий фенотип, сложность передвижения, прострация и респираторный дистресс (оценка 3/2/3/2), и которую умерщвляли по этическим причинам.

3.2.2. Контроль веса

Всех мышей (группы от А до О) взвешивали в дни 0, 3, 4, 5 и 6; в дни 7, 10 и 11 взвешивали всех мышей из оставшихся групп (A, B, D, F, H, J, L и N). Проценты потери веса по сравнению с днем 0 рассчитывали для каждой отдельной мыши в каждый момент времени.

После иммунизации эталонной вакциной Stamaril® в течение контрольного периода 11 дней наблюдали незначительную потерю веса (в среднем менее 5% потери веса в D11).

После иммунизации кандидатами для pMSL vYF, происходящими из линии дифференцировки Stamaril®, как и для контроля Stamaril не наблюдали резкой потери веса, за исключением одной мыши, иммунизированной клоном TV2232 в день 10, которая потеряла более 20% своего веса. Эту мышь пришлось умертвить по этическим причинам (см. 3.2.1 выше).

После иммунизации кандидатами для pMSL vYF, происходящими из линии дифференцировки YFVAX®, TV3111, TV3112 и TV4221 наблюдали стабильный вес и его регистрировали до дней 5-6, а незначительное увеличение веса наблюдали до конца периода контроля (среднее значение меньше прибавки в весе 5% в D11).

3.2.3. Вирусная нагрузка в сыворотке и органах

a) В сыворотке - фигура 3

Индивидуальная виремия, а также геометрические средние титры (GMT) и стандартные отклонения, рассчитанные для каждой группы и временных точек, показаны на фигуре 3.

Как и ожидалось, виремию не выявляли в день 4 у мышей A129, которым в день 0 вводили PBS (<LOD 3 log₁₀ Гэкв./мл), тогда как средние геометрические титры виремии между 4 и 5 log₁₀ Гэкв./мл в дни 4 и 6 выявляли у мышей A129, которым вводили эталонную вакцину Stamaril®.

После иммунизации кандидатами для pMSL vYF не наблюдали значительного превышения виремии по сравнению с виремией, индуцированной после иммунизации контрольным штаммом Stamaril® (все р-значения > 0,2 для TV2212, TV2232, TV2241, TV3111 и TV3112 в любой момент времени), за исключением TV4221, происходящего из линии дифференцировки YF-VAX®, который индуцировал значительно более высокую виремию, чем контроль Stamaril®, в день 4 после инъекции (р-значение=0,001).

b) В печени - фигура 4

Результаты выражены в log₁₀ Гэкв./мг органа. Индивидуальная вирусная нагрузка, а также геометрические средние и стандартные отклонения, рассчитанные для каждой группы и временных точек, показаны на фигуре 4.

Как и ожидалось, вирусную нагрузку в печени не выявляли в день 11 у мышей A129, которым в день 0 вводили PBS (<LOD 1 log₁₀ Гэкв./мг). Аналогичным образом не выявляли или выявляли низкие вирусные нагрузки у мышей A129, которым вводили эталонную вакцину Stamaril® (GMT=0,8 в день 6, <LOD в день 11).

После иммунизации кандидатами для pMSL vYF не наблюдали значительного превышения вирусной нагрузки печени по сравнению с вирусной нагрузкой печени, индуцированной после иммунизации контрольным штаммом Stamaril® (все р-значения >0,1 для TV2212, TV2232, TV2241, TV3111, TV3112 и TV4221 в день 6, статистический анализ не осуществляли в день 11 из-за большого количества не ответивших на обработку <LOD).

c) В головном мозге - фигура 5

Результаты выражены в log₁₀ Гэкв./мг органа. Индивидуальная вирусная нагрузка, а также геометрические средние титры и стандартные отклонения, рассчитанные для каждой группы и временных точек, показаны на фигуре 5.

Как и ожидалось, вирусную нагрузку в головном мозге не выявляли в день 11 у мышей A129, которым в день 0 вводили PBS (<LOD 1 log₁₀ Гэкв./мг), в то время как выявляли вирусные нагрузки в головном мозге у мышей A129, которым вводили эталонную вакцину Stamaril® (GMT=0,6 в день 6, 3,7 в день 11).

После иммунизации кандидатами для pMSL vYF не наблюдали значительного превышения вирусной нагрузки в головном мозге по сравнению с вирусной нагрузкой в головном мозге, индуцированной после иммунизации контрольным штаммом Stamaril® (р-значения > 0,06 для TV2212 и TV2232). Кроме того, TV2241, TV3111, TV3112 и TV4221 индуцировали значительно более низкую вирусную нагрузку в головном мозге в день 11, чем контроль Stamaril® (значения p ≤0,003).

d) В селезенке - фигура 6

Как и ожидалось, вирусную нагрузку в селезенке не выявляли в день 11 у мышей A129, которым в день 0 вводили PBS (<LOD 1 log₁₀ Гэкв./мг), в то время как выявляли вирусные нагрузки в селезенке у мышей A129, которым вводили эталонную вакцину Stamaril® (GMT=4,1 в день 6, 2 в день 11).

После иммунизации кандидатами для pMSL vYF не наблюдали значительного превышения вирусной нагрузки в селезенке по сравнению с вирусной нагрузкой в селезенке, индуцированной после иммунизации контрольным штаммом Stamaril® (все р-значения > 0,09 для TV2212, TV2232, TV2241, TV3111, TV3112 и TV4221 вне зависимости от временной точки).

3.2.4. Выживаемость

Для расчета выживаемости для каждой группы (для групп A, B, D, F, H, J, L и N) количество выживших мышей регистрировали ежедневно в течение 11 дней после подкожной иммунизации 4 log₁₀ CCID₅₀/доза Stamaril® или одного из 6 кандидатов для pMSL vYF.

Как показано на кривых Каплана-Мейера (фигура 7), 100% (6 мышей из 6) мышей выживали на протяжении всего хода исследования при введении либо буфера PBS, Stamaril®, либо одного из пяти штаммов vYF TV2212, TV2241, TV3111, TV3112 и TV4221.

Напротив, только 80% мышей выживали в группе F, которым вводили штамм TV2232, происходящий из линии дифференцировки Stamaril®, поскольку в день 10 одну мышь умерщвляли по этическим причинам (см. 3.2.1 выше).

ПРИМЕР 4. Иммуногенность кандидатов для штамма vYF в модели у хомяков

Иммуногенность 6 кандидатов для pMSL vYF в модели у хомяков оценивали и сравнивали с эталонной вакциной Stamaril®.

4.1. Способы

4.1.1. Определение групп

Пятнадцать самок золотистых сирийских хомяков в возрасте 5-6 недель включали в каждую группу и для каждого из 6 кандидатов для pMSL вводили 2 дозы, т. е. низкую субоптимальную дозу 2,5 log₁₀ CCID₅₀/доза и высокую дозу 5,5 log₁₀ CCID₅₀/доза.

Для эталонного штамма Stamaril® включали только 10 хомяков на группу для 2 вышеописанных тестируемых доз.

В общей сложности 200 самок золотых сирийских хомяков случайным образом распределяли в одну из 14 следующих групп (группы от A до N), описанных в таблице 6 ниже (без вспомогательного средства; подкожный путь введения; 200 мкл в D0 и D26).

Таблица 6. Определение групп

Группа	Количество хомяков на группу	Тестируемый продукт
Группа	Количество хомяков на группу	Действующее вещество
Название	Доза
A	10	Stamaril®	2,5 log БОЕ
B	10	5,5 log БОЕ
C	15	TV2212	2,5 log₁₀ CCID₅₀
D	15	5,5 log₁₀ CCID₅₀
E	15	TV2232	2,5 log₁₀ CCID₅₀
F	15	5,5 log₁₀ CCID₅₀
G	15	TV2241	2,5 log₁₀ CCID₅₀
H	15	5,5 log₁₀ CCID₅₀
I	15	TV3111	2,5 log₁₀ CCID₅₀
J	15	5,5 log₁₀ CCID₅₀
K	15	TV3112	2,5 log₁₀ CCID₅₀
L	15	5,5 log₁₀ CCID₅₀
M	15	TV4221	2,5 log₁₀ CCID₅₀
N	15	5,5 log₁₀ CCID₅₀

4.1.2. Схема исследования

Схема исследования обобщена на фигуре 8.

Планирование процедур и подробности процедур описаны в таблице 7 ниже.

Таблица 7. Схема исследования

День	Группа Количество	Количество Животные	Процедуры	Конкретные характеристики
D0	От A до N	200	Забор образцов крови Иммунизация (первая инъекция)	Химическая анестезия (IP путь) Промежуточный забор образцов крови SC путь иммунизации
D26	От A до N	200	Забор образцов крови Иммунизация (вторая инъекция)	Химическая анестезия (IP путь) Промежуточный забор образцов крови SC путь иммунизации
D41	От A до N	200	Забор образцов крови	Химическая анестезия (IP путь) Промежуточный забор образцов крови
D55	От A до N	200	Забор образцов крови	Химическая анестезия (IP путь) Конечный забор образцов крови Эвтаназия

4.1.3. Забор биологических образцов и анализы серонейтрализации

a) Забор биологических образцов

Промежуточные образцы крови брали под анестезией из ретроорбитального синуса (ROS) в D0, D26 и D41 от всех животных. Последний забор крови брали под анестезией посредством внутрисердечной пункции. Анестезию осуществляли с использованием Imalgène (150 мг/кг) и Rompun (10 мг/кг), вводимых в объеме 200 мкл внутрибрюшинным путем.

Кровь собирали во флаконы, содержащие активатор свертывания и отделитель сыворотки (BD Microtainer SST). После ночи при +4°C или 2 ч при 37°C кровь центрифугировали при 2000×g в течение 10 минут, а сыворотку собирали и хранили при -20°C до анализа.

b) Анализы серонейтрализации

Функциональные нейтрализующие антитела, присутствующие в сыворотке иммунизированных животных, титровали в D0, D26 и D41 после первой инъекции.

Вкратце, инактивированные нагреванием сыворотки серийно 2-кратно разбавляли в IMDM+4% фетальной телячьей сыворотке (FCS), начиная с 1:5. Вирус Stamaril® YF-17D, выращенный на клетках Vero, разбавляли с получением 4000 мкБОЕ/мл в IMDM и инкубировали 90 минут с 2-кратно разбавленными образцами сыворотки (об./об.). Затем смесь вирус/сыворотка добавляли к клеткам Vero в 96-луночных планшетах и инкубировали в течение 45 +/- 2 часов. После инкубации перед иммуноокрашиванием клетки фиксировали 85% ацетоном. Планшеты блокировали PBS+0,05% Tween 20+2,5% обезжиренное молоко и инкубировали сначала с моноклональным антителом 4G2 против флавивируса, а затем с конъюгатом HRP антитела козы против IgG мыши. Наконец, планшеты окрашивали хромогеном Trueblue™. Бляшки подсчитывали с помощью ридера Viruscope от Microvision™.

Конечный титр серонейтрализующих антител рассчитывали с использованием способа наименьших квадратов, и он соответствовал обратному разбавлению, демонстрирующему нейтрализацию 50% вирусных бляшек. LOD анализа составляла 10, что соответствовало первому обратному разбавлению в конечном объеме.

Для расчета средних значений на группу назначали произвольный титр 5 (половина LOD) для всех титров ниже 10.

4.2. Результаты - серонейтрализация

Нейтрализующую активность против штамма вакцины против вируса желтой лихорадки 17D на клетках Vero контролировали с помощью анализов серонейтрализации в индивидуальных образцах сыворотки крови, собранных у всех животных на исходном уровне (D0), через четыре недели после одной иммунизации (D26) и через две недели после двух иммунизаций (D41). Геометрические средние титры (GMT), а также индивидуальные нейтрализующие титры и 95% доверительный интервал (CI), показаны на фигуре 9 и фигуре 10.

Как и ожидалось, у не подвергаемых обработке хомяков на исходном уровне (D0) в группе с GMT ≤12, независимо от использования кандидатов для pMSL vYF или эталонного штамма Stamaril®, не выявляли или выявляли низкие титры нейтрализующих антител (≤40). Порог ответивших на обработку определяли на уровне 20,87 (1,32 log₁₀) путем статистического анализа всех индивидуальных данных, полученных в D0 (повышенный толерантный интервал с долей 0,99 и риском альфа 5%).

Что касается кинетики ответа, то через один месяц после 1 иммунизации (D26; фигура 9) наблюдали заметный повышенный нейтрализующий ответ для всех иммунизированных групп по меньшей мере с 10-850-кратным увеличением нейтрализующего GMT по сравнению с исходным уровнем в D0. Через две недели после второй иммунизации (D41; фигура 10) нейтрализующие GMT дополнительно увеличивались для всех групп с 0,8-7,5-кратным увеличением нейтрализующего GMT по сравнению с D26.

Реакция нейтрализующих антител, индуцированная эталонным штаммом Stamaril®, была значительно ниже (р-значения=0,007 и 0,023 в D26 и D41, соответственно) для дозы 2,5 log₁₀ CCID₅₀ (GMT 281 и 544 в D26 и D41, соответственно), чем для 5,5 log₁₀ CCID₅₀ (GMT 5061 и 11714 в D26 и D41, соответственно). Следует отметить, что 100% хомяков из группы, которым вводили дозу 5,5 log₁₀ CCID₅₀, определяли как ответивших на обработку (>20,87 порога) сразу после первой иммунизации (в D26), в то время как только 60% и 70% хомяков из группы, которым вводили дозу 2,5 log₁₀ CCID₅₀, обнаруживали ответившими на обработку в D26 и D41, соответственно.

Для кандидатов для pMSL vYF из линии дифференцировки Stamaril® TV2212, TV2232 и TV2241 не наблюдали значимой разницы между двумя тестируемыми дозами (все p-значения > 0,07 независимо от кандидатов для pMSL vYF и момента времени), при этом GMT находился в диапазоне от 144 до 505 в D26 и от 115 до 1159 в D41 для дозы 2,5 log₁₀ CCID₅₀ по сравнению с GMT в диапазоне от 115 до 373 в D26 и от 465 до 955 в D41 для 5,5 log₁₀ CCID₅₀. Ни один из кандидатов для pMSL vYF из линии дифференцировки Stamaril® не был способен индуцировать устойчивый ответ со стороны нейтрализующих антител у всех иммунизированных животных, независимо от тестируемой дозы и независимо от схемы иммунизации (после 1 или 2 иммунизации). Было обнаружено, что процент хомяков, ответивших на обработку, колебался от 53% до 93% после одной иммунизации и от 43% до 93% после двух иммунизаций TV2212, TV2232 и TV2241, независимо от дозы.

Для кандидатов для pMSL vYF из линии дифференцировки YF-VAX® TV3111, TV3112 и TV4221 не наблюдали значимой разницы между двумя тестируемыми дозами (все p-значения > 0,06 независимо от штаммов vYF и момента времени), за исключением TV3111, для которого доза 2,5 log₁₀ CCID₅₀ индуцировала значимо более высокие титры нейтрализующих антител, чем 5,5 log₁₀ CCID₅₀ (р-значение=0,04 и 0,003 в D26 и D41, соответственно). Для дозы 2,5 log₁₀ CCID₅₀ индуцированные GMT были высокими и варьировали от 3939 до 8898 в D26 и от 3771 до 13674 в D41, в то время как для дозы 5,5 log₁₀ CCID₅₀ GMT варьировали от 2071 до 5145 в D26 и от 1821 до 6421 в D41. Кандидаты для pMSL vYF из линии дифференцировки YF-VAX® были способны индуцировать устойчивый ответ со стороны нейтрализующих антител у большинства иммунизированных животных после 1 иммунизации (93% ответивших на обработку для дозы 2,5 log₁₀ CCID₅₀ TV3111 и 100% ответивших на обработку для всех остальных кандидатов для pMSL vYF из линии дифференцировки YF-VAX®, независимо от тестируемой дозы). После двух иммунизаций все кандидаты для pMSL vYF из линии дифференцировки YF-VAX® были способны индуцировать устойчивый ответ со стороны нейтрализующих антител у 100% иммунизированных хомяков, независимо от дозы.

Что касается сравнения каждого из кандидатов для pMSL vYF с эталонным штаммом Stamaril®, то нейтрализующие ответы, индуцированные дозой 2,5 log₁₀ CCID₅₀ кандидатов для pMSL vYF, полученных из линии дифференцировки YF-VAX®, TV3111, TV3112 и TV4221, значимо не уступали полученным с помощью эталонной вакцины Stamaril® (р-значения p ≤ 0,010 и ≤ 0,047 в D26 и D41, соответственно). Не было продемонстрировано значимого отсутствия меньшей эффективности ни для штаммов vYF, полученных из линии дифференцировки Stamaril® (все р-значения ≥ 0,25, независимо от дозы и временной точки), ни для штаммов vYF, полученных из линии дифференцировки YF-VAX®, вводимых при 5,5 log₁₀ CCID₅₀ (p-значения ≥0,49, в любой временной точке).

ПРИМЕР 5. Токсичность и иммуногенность штамма TV3112 vYF в модели у обезьян

Предварительное исследование токсичности и исследование иммуногенности осуществляли у отличных от человека приматов (NHP). Отличные от человека приматы, и в частности макаки резус или яванские макаки, обычно используются для оценки безопасности и инфекционности, измеряемой виремией, а также иммуногенности вакцин-кандидатов против флавивирусов (денге, желтой лихорадки...). В контексте желтой лихорадки обезьяны являются естественными хозяевами; вирус был впервые выделен у обезьян, и именно в этой модели оценивали аттенуацию вакцинных штаммов. С 2000-х годов были описаны модели "мелких животных", которые можно использовать для оценки определенных свойств вакцин-кандидатов, как это осуществляли для отбора кандидатов для pMSL vYF. Однако эти модели (хомяк, мышь A129) имеют ограничения, и макак до настоящего времени остается наиболее прогнозируемой моделью золотого стандарта по сравнению с людьми и широко описан в литературе, например, в Julander (2016), Mason et al. (1973), Monath et al. (2010) и Moulin et al. (2013). Кроме того, эта модель рекомендована нормативными документами.

5.1. Способы

5.1.1. Определение групп и цели

Три группы из девяти 2-летних самцов яванских макак (Macaca fascicularis), импортированных с Маврикия, иммунизировали подкожно 500 мкл Stamaril® (одна доза для человека соответствовала 4,2 log₁₀ CCID₅₀/доза), одной дозой YF-VAX® (6,2 log₁₀ CCID₅₀) или 4,2 log₁₀ CCID₅₀ кандидата для WSL vYF TV3112.

В качестве первичных показателей вакцину-кандидата сравнивали с каждой из эталонных вакцин для оценки i) безопасности вакцины, ii) ее способности вызывать специфическую виремию YF и вирусную нагрузку в органах: печени, селезенке, почке, лимфатическом узле и головном мозге (оценивали с помощью количественного анализа вирусной РНК с помощью qRT-PCR YF-NS5, как описано в Mantel et al. (2008)), и iii) индукции специфических к вирусу желтой лихорадки серонейтрализующих антител (оцениваемых с помощью анализа микроPRNT₅₀), определяемых как коррелят защиты.

В качестве вторичных показателей для определения других потенциальных биомаркеров эффективности вакцины контролировали другие параметры. Эти анализы касались: i) устойчивости ответа со стороны антител и ii) B- и T-клеточного иммунного ответа, в том числе ответов памяти.

5.1.2. Анестезия

Для иммунизации и в определенных случаях (например, забор образцов крови в сочетании с другими манипуляциями во время периода акклиматизации или если обезьяны препятствовали забору образцов крови без анестезии), осуществляли легкую анестезию. Кетамин (Imalgene 1000, MERIAL®) в дозе 10 мг/кг вводили внутримышечно в область бедра.

5.1.3. Контроль

Всех животных взвешивали в D-29 и D0, ежедневно наблюдали за клиническими признаками до D7 и их индивидуальную температуру тела (транспондерная система) регистрировали в D-17 и во время ожидаемого периода виремии в D0, D3, D4, D5, D6 и D7. Общий анализ крови, биохимический анализ крови и виремии крови оценивали у всех обезьян в D1, D3 и D7. Затем трех обезьян из каждой группы подвергали эвтаназии и их органы извлекали в D7 для оценок гистопатологии и вирусной нагрузки в органах. Дополнительно взвешивали 6 оставшихся обезьян в каждой группе в D27, D60, D90, D122, D153 и D181, и их индивидуальную температуру тела дополнительно регистрировали в течение ожидаемого периода виремии в D10 и D14. У 6 оставшихся обезьян в каждой группе также ежедневно наблюдали за клиническими признаками до D221 включительно. Образцы крови для серонейтрализации, анализов Т-клеток и В-клеток памяти собирали у 6 оставшихся обезьян в каждой группе в D27, D60, D90, D122, D153, D181 и D221.

5.1.4. Способы исследований

YF-специфические серонейтрализующие антитела титровали с использованием способа микроPRNT50 на клетках VERO. Вкратце, инактивированные нагреванием сыворотки серийно 2-кратно разбавляли в IMDM (THERMOFISHER SCIENTIFIC) + 4% FCS, начиная с 1:5. Вирус Stamaril® YF-17D, выращенный на клетках Vero, разбавляли с получением 4000 мкБОЕ/мл в IMDM и инкубировали 90 минут с 2-кратно разбавленными образцами сыворотки (об./об.). Затем смесь вирус/сыворотка добавляли к клеткам Vero в 96-луночных планшетах и инкубировали в течение 45 +/- 2 часов. После инкубации перед иммуноокрашиванием клетки фиксировали 85% ацетоном. Планшеты блокировали PBS+0,05% Tween 20+2,5% обезжиренное молоко и инкубировали сначала с моноклональным антителом 4G2 против флавивируса, а затем с конъюгатом HRP антитела козы против IgG мыши. Наконец, планшеты окрашивали хромогеном Trueblue™. Бляшки подсчитывали с помощью ридера Viruscope от Microvision™. Конечный титр рассчитывали с использованием способа наименьших квадратов, и он соответствовал обратному разбавлению, демонстрирующему нейтрализацию 50% бляшек.

LOD анализа микроPRNT50 составляла приблизительно 20 микроPRNT50 при первом разбавлении тестируемой сыворотки 1:10. Для расчета среднего значения на группу произвольное значение половины LOD присваивали всем образцам ниже LOD, т.е. 10 микроPRNT50.

Ответы со стороны клеток памяти измеряли с помощью ELISPOT. Флуоресцентный иммуноферментный спот-анализ (FLUOROSPOT) применяли для выявления и подсчета индивидуальных В-клеток памяти, секретирующих антитела, независимо от специфичности антигена (общий IgM или общий IgG).

В D0 замороженные PBMC размораживали в среде RPMI (THERMOFISHER SCIENTIFIC®) с добавлением 10% FBS и 100 мкг/мл ДНКазы и инкубировали в течение 1 часа при 37°C; 5% CO₂. Через 1 час клетки разбавляли до 1 миллиона клеток/мл и стимулировали с помощью инкубации в течение 4 дней при 37°C; 5% CO₂, в RPMI 10% FBS с добавлением rIL2 (10 мкг/мл).

В D3 мембрану 96-луночных микропланшетов FluoroSpot, оснащенных низкофлуоресцентной мембраной из PVDF (MERCK Millipore®), предварительно смачивали в течение 1 минуты с помощью 35 мкл 35% этанола. Каждую лунку дважды промывали 200 мкл PBS 1X. Затем микропланшеты покрывали лизатом клеток Vero, инфицированных YF-17D (SANOFI PASTEUR®) при разбавлении 1:80, или смесью моноклональных антител, специфичных к IgG и IgM обезьян, при разбавлении 15 мкг/мл, и инкубировали в течение ночи при 4°C.

В D4 планшеты промывали PBS, а затем блокировали в течение по меньшей мере 2 ч. при 37°C с помощью RPMI 10% FBS. После промывания планшетов 2 × 10⁵ или 4 × 10⁵ стимулированных РВМС добавляли в лунки, покрытые лизатом клеток Vero, инфицированных YF-17D. В лунки, покрытые антителами к IgG и антителами к IgM, добавляли диапазон разбавления стимулированных клеток (от 5 × 10³ до 6,2 × 10²).

Через 5 часов планшеты промывали 3 раза с помощью PBS 1X и хранили при 4°C в течение ночи.

В D7 планшеты промывали 6 раз с помощью PBS 1X-BSA 0,5% (150 мкл/лунка). После стадии промывания добавляли 100 мкл/лунка соответственно антител к IgM-FITC и IgG-CY3 обезьян при разбавлении 1/500 в PBS1X-BSA 0,5% в течение 2 часов при комнатной температуре в темноте. Планшеты повторно 6 раз промывали с помощью PBS 1X-BSA 0,5% (150 мкл/лунка). Планшеты хранили при 5°C ± 3°C в темноте до считывания показателей.

Каждое пятно, соответствующее клетке, секретирующей антитела, подсчитывали с помощью автоматического планшет-ридера FLUOROSPOT (Microvision™). Результаты выражали в виде количества секретирующих ACS клеток на 10⁶ клеток.

Т-клеточные ответы определяли с помощью набора для определения ответов IFN-γ IL-2 Dual FluoroSpot (набор FS-2122-10 Monkey IFN-γ/IL-2 FluoroSpot от Mabtech®) у выделенных PBMC.

Вкратце, микропланшеты, оснащенные мембраной из PVDF FluoroSpot, предварительно обрабатывали 35% этанолом, промывали и покрывали в течение ночи с помощью инкубации с моноклональными антителами против IFN-γ обезьяны (клон GZ-4, Mabtech®) и против IL-2 обезьяны (клоны IL2M-I/249, Mabtech®) в концентрации 15 мкг/мл в стерильном фосфатно-солевом буфере (PBS) при 4°C. Планшеты промывали 3 раза с помощью PBS, а затем блокировали с помощью инкубации в течение 2 часов при 37°C со средой RPMI 1640 (Gibco®) с добавлением 10% FCS. Добавляли PBMC (4 × 10⁵) в каждую лунку с 0,1 мкг/мл моноклонального антитела CD28-A (Mabtech®). Пулы пептидов YF-Env и YF-NS3 (15-мерные перекрывающиеся пептиды, охватывающие аминокислотные последовательности YF-Env и YF-NS3) добавляли до конечной концентрации каждого пептида в культуральной среде, составляющей 1 мкг/мл. Использовали mAb к CD3 (Mabtech®) в качестве положительного контроля в концентрации 2,5 мкг/мл. Планшеты инкубировали в течение 24 часов при 37°C в атмосфере, содержащей 5% CO₂. После инкубации планшеты 6 раз промывали с помощью PBS. Антитело FITC к IFN-γ (клон 7-B6-1-FS-FITC, Mabtech®) и биотинилированное антитело к IL-2 (IL2-биотин MT8G10, Mabtech®) добавляли в концентрации соответственно 1:200 и 1 мкг/мл, в 0,5% BSA в PBS; планшеты инкубировали в течение 2 часов при 37°C. После 3 промываний с помощью PBS инкубацию осуществляли с антителом к FITC-490 (1:200, Mabtech®) и антителом к стрептавидину SA-550 (1:200, Mabtech®), разбавленными в 0,5% BSA в PBS, в течение 1 часа при комнатной температуре и промывали 6 раз с помощью PBS. Планшеты хранили при 5°C ± 3°C в темноте до считывания показателей. Флуоресцентные пятна, соответствующие клеткам, секретирующим IFN-γ или IL-2 (IFN-γ SC или IL5 SC), а также полифункциональным Т-клеткам, секретирующим цитокины IFN-γ и IL-2, подсчитывали с помощью автоматического планшет-ридера FLUOROSPOT (Microvision™). Результаты выражали в виде количества клеток, секретирующих IFN-γ или IL-2, на 10⁶ PBMC.

Виремию вакцины против YF и вирусную нагрузку в органах контролировали с помощью qRT-PCR YF-NS5 (как описано в Mantel et al. (2008)).

5.2. Результаты

Коррелят защиты для живых аттенуированных вакцин против желтой лихорадки определен в WHO TRS 978, приложение 5, в виде индукции измеримых нейтрализующих антител у ранее серонегативного индивидуума, например, в виде титра PRNT > предела выявления. Нейтрализующие антитела, намного превышающие предварительно установленный защитный порог (LOD=20), выявляли у всех обезьян уже в D14 и в течение по меньшей мере 9 месяцев (см. фигуру 11). Титры нейтрализующих антител значимо не отличались от титров, выявленных после иммунизации существующими вакцинами.

Этот длительный ответ со стороны нейтрализующих антител также поддерживался устойчивой частотой B-клеток памяти, контролируемой в периферической крови от дня 14 до дня 221 после вакцинации против vYF TV3112 (см. фигуру 12 и фигуру 13). Эти данные показывают, что как IgM (фигура 12), так и IgG (фигура 13) В-клетки памяти развивались уже в день 14 после вакцинации и сохранялись во время периода исследования в течение по меньшей мере 221 дня. Что касается vYF TV3112, то кинетика и процент индуцированных В-клеток памяти были аналогичны профилю В-клеток памяти, индуцированных обеими эталонными вакцинами Stamaril® и YF-VAX®.

Более того, специфический клеточный ответ Th1 (клетки, секретирующие IFN-γ и IL-2) к YF-ENV и YF-NS3 индуцировали после вакцинации vYF TV3112 и он был аналогичным клеточному ответу, наблюдаемому после вакцинации с помощью Stamaril® или YF-VAX® (см. фигуру 14).

Это исследование также продемонстрировало сохраненный профиль безопасности vYF TV3112 по сравнению с контрольными вакцинами: отсутствие клинических признаков, отсутствие потери веса тела, отсутствие изменений температуры, отсутствие гематологических (лейкоциты и эритроциты; нейтрофилы; лимфоциты; моноциты; эозинофилы; базофилы; ретикулоциты; тромбоциты; гемоглобин; гематокрит; средний эритроцитарный объем; средний гемоглобин эритроцитов) или биохимических (щелочная фосфатаза; аланинтрансфераза; аспартаттрансфераза; гамма-глутамилтрансфераза; С-реактивный белок; желчные кислоты; общий билирубин; альбумин; содержание азота мочевины в крови; креатинин) нарушений (отсутствие статистических различий по сравнению с Stamaril® и YF-VAX® по данным статистического анализа PLS-DA), отсутствие или очень низкую виремию (<4 log₁₀ Гэкв./мл у 1 из 9 обезьян), отсутствие или очень низкий уровень вирусной РНК, выявленной в органах-мишенях при желтой лихорадке (в 100-10000 раз ниже, чем вирусная нагрузка, наблюдаемая после инфекции штаммом Asibi дикого типа) (см. фигуру 15), отсутствие гистопатологических данных, связанных с вакциной, в органах-мишенях при желтой лихорадке.

ПРИМЕР 6. Защита, индуцированная штаммом vYV TV3112, против летального инфицирования в модели у макак

Цель заключалась в оценке защиты от инфицирования вирусом желтой лихорадки у макак, иммунизированных вакциной-кандидатом vYF TV3112.

6.1. Способы

6.1.1. Животные

Через девять месяцев после иммунизации вакцинами-кандидатами Stamaril®, YF-VAX® или vYF TV3112 6 обезьян, оставшихся в D221 из каждой из трех групп животных, которых исследовали в примере 5 выше, инфицировали вирулентным штаммом вируса желтой лихорадкой Asibi для оценки эффективности вакцины. Другую группу из 6 не подвергаемых обработке контрольных обезьян также подвергали инфицированию.

6.1.2. YFV и буферы

Инфицирование осуществляли с использованием штамма вируса желтой лихорадки Asibi (YFV) из Медицинского отделения Техасского университета (UTMB). YFV (серия 19455, инфекционный титр 7,7 Log₁₀ CCID₅₀/мл на клетках VERO) разбавляли в буфере NaCl+HSA (NaCl 0,4% + сывороточный альбумин человека (HSA) 2,5%). Каждому животному вводили подкожно в верхний правый задний участок 10³ CCID₅₀ YFV в 1 мл буфера NaCl+HSA.

6.1.3. Контроль

За животными наблюдали в течение 28 дней после инфицирования штаммом Asibi. За животными ежедневно наблюдали в отношении потребления пищи и поведения. Ректальную температуру и вес тела регистрировали в каждой временной точке забора образцов. Забор образцов крови осуществляли, как описано в таблице 8 ниже.

Таблица 8. Временной график

Дни после инфицирования	-8	0	2	3	4	5	7	10	14	28
Контрольное инфицирование		X
Эвтаназия										X
Наблюдения¹	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X
Локальное оценивание	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X
Кровь для общего анализа крови²	X		X	X	X	X	X	X	X	X
Кровь для анализа плазмы крови	X		X	X	X	X	X	X	X	X
Сыворотка для определения нейтрализующих антител³ и связывания антител	X						X		X	X
Сыворотка для биохимического анализа⁴	X		X	X	X	X	X	X	X	X

¹ Клиническое наблюдение, вес тела, ректальная температура. ² Лейкоциты и эритроциты; нейтрофилы; лимфоциты; моноциты; эозинофилы; базофилы; ретикулоциты; тромбоциты; гемоглобин; гематокрит; средний эритроцитарный объем; средний гемоглобин эритроцитов.³ Анализ нейтрализации. ^4. Щелочная фосфатаза; аланинтрансфераза; аспартаттрансфераза; гамма-глутамилтрансфераза; С-реактивный белок; желчные кислоты; общий билирубин; альбумин; содержание азота мочевины в крови; креатинин.

6.1.4. Прижизненные наблюдения

За животными наблюдали 7 дней в неделю. Во время каждого забора крови осуществляли клиническое обследование, как описано в таблице 9 ниже.

Таблица 9. Карта наблюдений за животными

Смертность	Ежедневно
Явные признаки заболевания, такие как диарея, потеря аппетита и летаргия	Ежедневно
Вес тела	В день забора образца¹
Температура тела (ректальная)	В день забора образца¹
Потребление пищи и воды	Ежедневная оценка

¹ См. таблицу 8.

6.2. Результаты

Все вакцинированные обезьяны были защищены от эффектов инфицирования: виремии (только низкая виремия, т. е. <3,6 log₁₀ Гэкв./мл у 2/6 обезьян только в течение одного дня, измеренная с помощью qRT-PCR YF-NS5, как описано в Mantel et al. (2008)), гематологических нарушений, биохимических нарушений и смерти.

В данном исследовании 3 из 6 NHP в невакцинированной контрольной группе выжили после инфицирования, однако все 6 контрольных NHP продемонстрировали виремию (>8 log₁₀ Гэкв./мл), лимфопению, тромбоцитопению и нарушение биохимического анализа крови с высоким увеличением уровня трансаминаз, CRP, билирубина и желчных кислот.

Соответственно, вакцина-кандидат vYF TV3112 была способна защитить яванских макак, одну из наиболее эффективных животных моделей для прогнозирования вакцин против желтой лихорадки, от инфицирования штаммом Asibi дикого типа, как и доступные в настоящее время вакцины Stamaril® и YF-VAX®.

ПРИМЕР 7. Анализ последовательностей

РНК-вирусы в природе обладают высокими уровнями генетической изменчивости, которые ответственны за квазивидовую внутреннюю природу этих вирусов. Даже если частота ошибок полимеразы вируса желтой лихорадки описывается как низкая для РНК-вируса, - эта частота ошибок полимеразы составляет около 10^-6 замен на геном за инфекционный цикл.

Четко определенный процесс получения налажен так, чтобы ограничить это явление до строгого минимума путем постоянного поддержания одних и тех же условий роста вируса. Однако статистически квазивиды вируса непрерывно образуются каждый раз, когда вирус реплицируется в клетке, и всякий раз, когда вариант приносит вирусу преимущество роста, он будет сохраняться и амплифицироваться в долгосрочной перспективе, постепенно заменяя исходную популяцию.

Кроме того, по мере того как новая система роста вируса будет перемещаться от яйца к культуре клеток Vero, вероятно, произойдет некоторая адаптационная мутация. В частности, несколько мутаций в NS4B были описаны в различных моделях флавивирусов в качестве позитивной адаптации вируса к росту в клетках Vero (Blaney et al., 2003; Tang et al., 2005; Beasley et al., 2013).

Кроме того, настоящая затравка никогда не клонировалась, поэтому в существующих вакцинных штаммах сосуществует смесь квазивидов. Эталонные последовательности сначала будут установлены путем высокопроизводительного секвенирования геномов вакцин YF-VAX® и Stamaril®, а затем новые геномы-кандидаты для pMSL будут сравниваться с ними.

Поскольку новые кандидаты для pMSL получают после 2 стадий клонирования, они представляют собой гомогенные вирусные популяции.

7.3. Способы

7.3.1. Принципы

Секвенирование вируса желтой лихорадки осуществляют после выделения и очистки вирусной РНК.

Затем РНК обратно транскрибируют в комплементарную ДНК, а после этого геном полностью амплифицируют с помощью ПЦР с использованием конкретных праймеров. Затем продукты ПЦР используют для образования библиотеки благодаря набору для подготовки образцов ДНК Nextera® XT (Illumina, Inc.). Образование библиотеки происходит в несколько стадий. Сначала эквимолярным способом собирают ампликоны. Затем их фрагментируют с помощью транспосом (тагментазы). Транспосомы разрезают ДНК и добавляют адаптеры. Затем выполняли стадию амплификации с помощью ПЦР с использованием праймеров, комплементарных адаптерам. Эта стадия давала возможность добавлять с обеих сторон фрагментов индексы (используемые для маркировки образца) и прикреплять фрагменты к подложке для секвенирования. Наконец, библиотеку очищали с использованием гранул Agencourt® (AMPure® XP, Beckman Coultern Genomics, Inc.) и секвенировали с использованием секвенатора MiSeq (Illumina®, Inc.).

После получения последовательностей выполняли анализ с помощью модуля анализа "Выявление вариантов на основе качества (прежняя версия)" программного обеспечения CLC Genomics Workbench (QIAGEN®).

7.3.2. Экстракция РНК

Вирусную РНК экстрагировали из 140 мкл вирусной суспензии при минимальной концентрации 10⁸ Гэкв./мл (количественная оценка с помощью qRT-PCR YF-NS5) с использованием набора Qiamp Viral (QIAGEN®) в соответствии с рекомендациями поставщика. Очищенную вирусную РНК элюировали в 140 мкл воды, не содержащей нуклеаз.

7.3.3. RT-PCR

Сначала выполняли специфическую стадию обратной транскрипции (RT) РНК в кДНК с использованием трех антисмысловых праймеров, предназначенных для перекрытия генома вируса желтой лихорадки. Затем осуществляли ПЦР-амплификацию с использованием трех пар праймеров, описанных в таблице 10.

Таблица 10. Последовательности праймеров (MWG®)

SEQ ID NO.	Последовательность (5' - > 3')	Н. о. из нукл.	Размер ампликона	Положение в геноме
9	GCTAGGCAATAAACACATTTGGA	23	4146	49-4195
10	TTCACTGGGATACTCCTTCGC	21
11	ATCAAATACCATCTTGCCCCTC	22	4009	3940-7949
12	AGTAAATCCTTTGACCCCACT	21
13	GGCTTACCGCAATGCACT	18	4235	6553-10788
14	CAGAGAACCACTCCGGTC	18

Получали три смеси, содержащие один из трех антисмысловых праймеров (SEQ ID NO. 10; SEQ ID NO. 12 или SEQ ID NO. 14) (см. таблицу 11 ниже).

Таблица 11. Смесь для одного образца

Смесь обратных праймеров (10 мкM)	1 мкл
dNTP (10 мM)	1 мкл
Вода, не содержащая нуклеаз	5 мкл
Экстрагированная РНК	5 мкл

Образцы нагревали в термоциклере в течение 5 минут при +65°C и сразу же выполняли тепловой шок путем инкубирования пробирки в течение 3 минут на льду.

Затем получали смесь, как описано в таблице 12 ниже.

Таблица 12. Смесь для одного образца вирусной РНК (4 реакции с RT)

Буфер с RT	16 мкл
DTT (0,1 M)	4 мкл
РНКаза OUT (LIFE TECHNOLOGIES®)	2 мкл
Superscript III (LIFE TECHNOLOGIES®)	2 мкл
Вода, не содержащая нуклеаз	8 мкл

В каждую из трех пробирок с РНК/праймерами добавляли по 12 мкл этой смеси и осуществляли цикл обратной транскрипции, как описано в таблице 13 ниже.

Таблица 13. Программа RT

Стадия	Время (мин.)	Температура (°C)
Стадия обратной транскрипции	60 мин	+50°C
Инактивация фермента	5 мин	85°C
Хранение	-	10°C

В каждую из пробирок добавляли по 1 мкл РНКазы H и пробирки инкубировали в течение 20 минут при 37°C в термоциклере.

Из полученной кДНК амплификацию осуществляли на трех ампликонах с помощью ПЦР.

Получали три смеси ПЦР, как описано в таблице 14 ниже, содержащие одну из трех пар праймеров (SEQ ID NO. 9 и SEQ ID NO. 10; SEQ ID NO. 11 и SEQ ID NO. 12; SEQ ID NO. 13 и SEQ ID NO. 14).

Таблица 14. ПЦР-смесь для одного образца

Буфер 5X Phusion HF (BioLabs®)	5 мкл
dNTP 10 мM	1 мкл
Прямой праймер 10 мкM	1 мкл
Обратный праймер 10 мкM	1 мкл
Вода, не содержащая нуклеаз	12,5 мкл
ДНК-полимераза Phusion HF (BioLabs®)	0. 5 мкл

По 20 мкл каждой смеси добавляли к 5 мкл соответствующей кДНК.

Программа ПЦР описана в таблице 15 ниже.

Таблица 15. Программа ПЦР

Стадия	Время (с или мин)	Температура (°C)
Исходная денатурация	30 с	+98°C
35 циклов - Денатурация - Гибридизация праймеров - Элонгация
	10 с	+98°C
	20 с	+58°C
4 мин	+72°C
Конечная элонгация	5 мин	+72°C
Хранение	-	+10°C

7.3.5. Анализ и очистка ампликонов

Все ампликоны анализировали в 1,2% агарозном геле для проверки качества амплификации. Ампликоны очищали вручную с помощью набора для очистки QIAQuick® PCR (QIAGEN®) в соответствии с рекомендациями поставщика.

7.3.6. Образование библиотеки с помощью набора Nextera® XT (Illumina, Inc.)

Очищенные ампликоны количественно определяли с помощью флуориметра Qubit® 2.0 (LIFE TECHNOLOGIES®) с использованием набора для анализа dsDNA HS Qubit® в соответствии с рекомендациями поставщика.

После анализа ампликоны серийно разбавляли в воде, не содержащей нуклеаз, с получением конечной концентрации 0,2 нг/мкл. Затем для каждого образца смешивали три ампликона с получением одного концентрированного пула ПЦР при 0,6 нг/мкл.

Программа ПЦР описана в таблице 16 ниже.

Таблица 16. Программа ПЦР

Стадия	Время (с или мин.)	Температура (°C)
Активация ДНК-полимеразы	3 мин	+72°C
Исходная денатурация	30 с	+95°C
12 циклов - Денатурация - Гибридизация праймеров - Элонгация
	10 с	+95°C
	30 с	+55°C
30 с	+72°C
Конечная элонгация	5 мин	+72°C
Хранение	-	+10°C

Ампликоны очищали и калибровали с помощью набора Agencourt® AMPure® XP (BECKMAN COULTER®) в соответствии с рекомендациями поставщика. Библиотека была стабильной при -20°C в течение недели.

7.3.7. Анализ библиотеки

Количественное определение библиотеки осуществляли с помощью флуориметра Qubit® 2.0 (LIFE TECHNOLOGIES®) с использованием набора для анализа dsDNA HS Qubit® в соответствии с рекомендациями поставщика.

7.3.8. Секвенирование библиотеки

Секвенирование библиотеки осуществляли с помощью системы MiSeq (ILLUMINA®) в соответствии с рекомендациями поставщика. Последовательности анализировали с помощью программы для просмотра анализа секвенирования ILLUMINA® Sequencing Analysis Viewer (Illumina, Inc.) в соответствии с рекомендациями поставщика.

Анализ образованных последовательностей осуществляли с помощью программного обеспечения CLC Genomics Workbenck 7.5.2 (QIAGEN®) в соответствии с рекомендациями поставщика.

7.4. Результаты

7.4.1. Эталонные последовательности для вакцин YF-VAX® и Stamaril®

Эталонная последовательность вакцины YF-VAX® была представлена в виде SEQ ID NO. 2. Эталонная последовательность вакцины Stamaril® была обнаружена в виде SEQ ID NO. 3.

7.4.1.1. pMSL, полученные из Stamaril®

Геномы кандидатов для pMSL (пассаж № 8) секвенировали и сравнивали с геномом их исходного штамма. В таблице 17 ниже представлены результаты высокопроизводительного секвенирования для трех штаммов из линии дифференцировки Stamaril®.

Таблица 17. Результаты секвенирования из линии дифференцировки Stamaril®

Штамм	№ нукл.¹	Эталон. нукл. (Stamaril®)²	Нукл. послед.³	Эталон. кодон (Stamaril®)	Посл. кодона	Частота (%)	Аннотация⁴	Замена а.к.
TV2212	2524	C	U	GAC	GAU	100%	NS1-24	-
TV2232	5590	U	G	GUU	GUG	100%	NS3-340	-
	5695	C	U	GUC	GUU	100%	NS3-375	-
	7766	U	C	UUG	CUG	100%	NS5-47	-
	8404	C	U	GAC	GAU	100%	NS5-256	-
6379	A	G	GAA	GAG	99%	NS3-603	-
TV2241	2524	C	U	GAC	GAU	100%	NS1-24	-

¹ Положение нуклеотида от 5'-конца первого нуклеотида. ² Нуклеотид генома эталонного штамма Stamaril®.³ Мутированный нуклеотид по сравнению с соответствующим нуклеотидом из генома эталонного штамма Stamaril®. ⁴ Соответствующий белок YFV и соответствующее положение аминокислоты в белке.

TV2241 и TV2212 представляют одну мутацию по сравнению с исходным штаммом Stamaril®, применяемым в качестве эталона (нуклеотид 2524, расположенный в кодирующей области NS1, молчащий на аминокислотном уровне). TV2232 демонстрирует другой профиль, имеющий пять мутаций в NS3 и NS5, все молчащие.

7.4.1.2. pMSL, полученные из YF-VAX®

В таблице 18 ниже представлены результаты высокопроизводительного секвенирования для трех кандидатов для pMSL (пассаж № 8) из линии дифференцировки YF-VAX®.

Таблица 18. Результаты секвенирования штаммов, полученных из YF-VAX®

Штамм	№ нукл.¹	Эталон. нукл. (YF-VAX®)²	Нукл. послед.³	Эталон. кодон (YF-VAX®)	Посл. кодона	Частота (%)	Аннотация⁴	Замена а.к.⁵
TV3111	2411	G	U	GUA	UUA	100%	E-480	Val480Leu
TV3111	3701	A	G	AUG	GUG	100%	NS2a-65	Met65Val
6496	A	G	AAA	AAG	100%	NS4a-19	-
TV3112	3701	A	G	ATG	GUG	100%	NS2a-65	Met65Val
	2411	G	U	GUA	UUA	100%	E-480	Val480Leu
	6496	A	G	AAA	AAG	100%	NS4a-19	-
1408	A	U	GUA	GUU	100%	E-145	-
TV4221			Вариантов не выявлено.

¹ Положение нуклеотида от 5'-конца первого нуклеотида. ² Нуклеотид генома эталонного штамма YF-VAX®.³ Мутированный нуклеотид по сравнению с соответствующим нуклеотидом из генома эталонного штамма YF-VAX®. ⁴ Соответствующий белок YFV и соответствующее положение аминокислоты в белке. ⁵ Мутированная аминокислота и положение в белке по сравнению с соответствующей аминокислотой из эталонного штамма YF-VAX®.

TV4221 является идентичной эталонной последовательности вакцинного штамма YF-VAX®.

TV3111 имеет 3 мутации в положении 2411 (E-480, от Val до Leu), 3701 (NS2a-65, от Met до Val) и 6496 (NS4a-19, молчащая).

TV3112 имеет те же мутации, что и TV3111, наряду с одной дополнительной мутацией в положении 1408 (E-145, молчащая).

Штаммы TV3112 и TV3111 содержат оболочечный белок, представленный SEQ ID NO 15 (с остатком лейцина в положении 480). SEQ ID NO 16 (с остатком лейцина в положении 65) представляет собой последовательность белка NS2a из штаммов TV3112 и TV3111. SEQ ID NO 17 (с нуклеотидом G в положении 57) представляет собой последовательность РНК, кодирующую белок NS4a из штамма TV3112. SEQ ID NO 18 (с нуклеотидом U в положении 435) представляет собой последовательность РНК, кодирующую оболочечный белок из штамма TV3112.

Специалисту в данной области хорошо известно, что роль генома состоит в поддержании информации, и что белки благодаря своей функции играют роль в фенотипе вируса. Молчащие мутации не оказывают влияния на функцию белков. Соответственно, штаммы TV3112 и TV3111 можно описать как живые аттенуированные штаммы вируса желтой лихорадки, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую:

(ii) белок NS2a, содержащий мутацию в положении 65, которая приводит в результате к замене аминокислоты метионина на валин. Или штаммы TV3112 и TV3111 можно описать как живые аттенуированные штаммы вируса желтой лихорадки, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую:

(i) оболочечный белок, который содержит остаток лейцина в положении в белке, которое соответствует положению 480 в SEQ ID NO. 15; и

7.4.2. Штамм TV3112, полученный из YF-VAX®, на стадиях MSL и WSL

Консенсусная последовательность TV3112 MSL оставалась идентичной последовательности ее исходной pMSL (pMSL TV3112). Консенсусная последовательность WSL TV3112 осталась идентичной ее исходной MSL (MSL TV3112). Штамм TV3112 является генетически стабильным и сохраняет в своей консенсусной последовательности мутации в положениях нуклеотидов 1408, 2411, 3701 и 6496 от стадии pMSL до стадии WSL.

ССЫЛКИ НА ЛИТЕРАТУРУ

Ссылки, не относящиеся к патентам

- Barrett ADT. Yellow fever live attenuated vaccine: A very successful live attenuated vaccine but still we have problems controlling the disease. Vaccine. 2017 Oct 20; 35(44):5951-5955.

- Beasley DW, Morin M, Lamb AR, Hayman E, Watts DM, Lee CK, Trent DW, Monath TP. Adaptation of yellow fever virus 17D to Vero cells is associated with mutations in structural and non-structural protein genes. Virus Res. 2013 Sep; 176(1-2):280-4.

- Blaney JE Jr, Manipon GG, Firestone CY, Johnson DH, Hanson CT, Murphy BR, Whitehead SS. Mutations which enhance the replication of dengue virus type 4 and an antigenic chimeric dengue virus type 2/4 vaccine candidate in Vero cells. Vaccine. 2003 Oct 1; 21(27-30):4317-27.

- dos Santos CN, Post PR, Carvalho R, Ferreira II, Rice CM, Galler R. Complete nucleotide sequence of yellow fever virus vaccine strains 17DD and 17D-213. Virus Res. 1995 Jan; 35(1):35-41.

- Dupuy A, Despres P, Cahour A, Girard M, Bouloy M. Nucleotide sequence comparison of the genome of two 17D-204 yellow fever vaccines. Nucleic Acids Res. 1989 May 25; 17(10):3989.

- Erickson AK, Pfeiffer JK. Spectrum of disease outcomes in mice infected with YFV-17D. J Gen Virol. 2015 Jun; 96:1328-1339.

- Hayes EB. Is it time for a new yellow fever vaccine? Vaccine. 2010 Nov 29; 28(51):8073-6.

- Julander JG. Animal models of yellow fever and their application in clinical research. Curr Opin Virol. 2016 Jun; 18:64-9.

- Kolell K. et al. Virus Production in Vero Cells Using a Serum-free Medium. In: Smith R. (eds) Cell Technology for Cell Products (2007). Springer.

- Mantel N, Aguirre M, Gulia S, Girerd-Chambaz Y, Colombani S, Moste C, Barban V. Standardized quantitative RT-PCR assays for quantitation of yellow fever and chimeric yellow fever-dengue vaccines. J Virol Methods. 2008 Jul; 151(1):40-6.

- Mason RA, Tauraso NM, Spertzel RO, Ginn RK. Yellow fever vaccine: direct challenge of monkeys given graded doses of 17D vaccine. Appl Microbiol. 1973 Apr; 25(4):539-44.

- Meier KC, Gardner CL, Khoretonenko MV, Klimstra WB, Ryman KD. A mouse model for studying viscerotropic disease caused by yellow fever virus infection. PLoS Pathog. 2009 Oct; 5(10).

- Monath TP. Yellow fever vaccine. Expert Rev Vaccines. 2005 Aug; 4(4):553-74.

- Monath TP, Lee CK, Julander JG, Brown A, Beasley DW, Watts DM, Hayman E, Guertin P, Makowiecki J, Crowell J, Levesque P, Bowick GC, Morin M, Fowler E, Trent DW. Inactivated yellow fever 17D vaccine: development and nonclinical safety, immunogenicity and protective activity. Vaccine. 2010 May 14; 28(22):3827-40.

- Moulin JC, Silvano J, Barban V, Riou P, Allain C. Yellow fever vaccine: comparison of the neurovirulence of new 17D-204 Stamaril™ seed lots and RK 168-73 strain. Biologicals. 2013 Jul; 41(4):238-46.

- Needleman SB, Wunsch CD. A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. J Mol Biol. 1970 Mar; 48(3):443-53.

- Pereira RC, Silva AN, Souza MC, Silva MV, Neves PP, Silva AA, Matos DD, Herrera MA, Yamamura AM, Freire MS, Gaspar LP, Caride E. An inactivated yellow fever 17DD vaccine cultivated in Vero cell cultures. Vaccine. 2015 Aug 20; 33(35):4261-8.

- Remington's Pharmaceutical Sciences (18^th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, Pa.

- Rice CM, Lenches EM, Eddy SR, Shin SJ, Sheets RL, Strauss JH. Nucleotide sequence of yellow fever virus: implications for flavivirus gene expression and evolution. Science. 1985 Aug 23; 229(4715):726-33.

- Tang WF, Eshita Y, Tadano M, Morita K, Makino Y. Molecular basis for adaptation of a chimeric dengue type-4/Japanese encephalitis virus to Vero cells. Microbiol Immunol. 2005;49(3):285-94.

- World Health Organization. Requirements for yellow fever vaccine. WHO Technical report series, 1998, No. 872, Annex 2, 30-68.

- World Health Organization. Recommendations to assure the quality, safety and efficacy of live attenuated yellow fever vaccines. WHO Technical report series, 2010, No. 978, Annex 5, 241-314.

Ссылки на патентные документы

- WO 2009/109550

- WO 2014/016360.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> SANOFI PASTEUR

<120> ШТАММ ЖИВОГО АТТЕНУИРОВАННОГО ВИРУСА ЖЕЛТОЙ ЛИХОРАДКИ, АДАПТИРОВАННЫЙ

ДЛЯ РОСТА НА КЛЕТКАХ VERO, И ВАКЦИННАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ЕГО

<130> PM1801-WO-PCT

<160> 18

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 10862

<212> РНК

<213> Вирус желтой лихорадки

<220>

<223> Последовательность РНК штамма YFV 17D204

<400> 1

aguaaauccu gugugcuaau ugaggugcau uggucugcaa aucgaguugc uaggcaauaa 60

acacauuugg auuaauuuua aucguucguu gagcgauuag cagagaacug accagaacau 120

gucuggucgu aaagcucagg gaaaaacccu gggcgucaau augguacgac gaggaguucg 180

cuccuuguca aacaaaauaa aacaaaaaac aaaacaaauu ggaaacagac cuggaccuuc 240

aagagguguu caaggauuua ucuuuuucuu uuuguucaac auuuugacug gaaaaaagau 300

cacagcccac cuaaagaggu uguggaaaau gcuggaccca agacaaggcu uggcuguucu 360

aaggaaaguc aagagagugg uggccaguuu gaugagagga uuguccucaa ggaaacgccg 420

uucccaugau guucugacug ugcaauuccu aauuuuggga augcuguuga ugacgggugg 480

agugaccuug gugcggaaaa acagaugguu gcuccuaaau gugacaucug aggaccucgg 540

gaaaacauuc ucugugggca caggcaacug cacaacaaac auuuuggaag ccaaguacug 600

gugcccagac ucaauggaau acaacugucc caaucucagu ccaagagagg agccagauga 660

cauugauugc uggugcuaug ggguggaaaa cguuagaguc gcauauggua agugugacuc 720

agcaggcagg ucuaggaggu caagaagggc cauugacuug ccuacgcaug aaaaccaugg 780

uuugaagacc cggcaagaaa aauggaugac uggaagaaug ggugaaaggc aacuccaaaa 840

gauugagaga ugguucguga ggaaccccuu uuuugcagug acggcucuga ccauugccua 900

ccuuguggga agcaacauga cgcaacgagu cgugauugcc cuacuggucu uggcuguugg 960

uccggccuac ucagcucacu gcauuggaau uacugacagg gauuucauug agggggugca 1020

uggaggaacu uggguuucag cuacccugga gcaagacaag ugugucacug uuauggcccc 1080

ugacaagccu ucauuggaca ucucacuaga gacaguagcc auugauagac cugcugaggu 1140

gaggaaagug uguuacaaug caguucucac ucaugugaag auuaaugaca agugccccag 1200

cacuggagag gcccaccuag cugaagagaa cgaaggggac aaugcgugca agcgcacuua 1260

uucugauaga ggcuggggca auggcugugg ccuauuuggg aaagggagca uuguggcaug 1320

cgccaaauuc acuugugcca aauccaugag uuuguuugag guugaucaga ccaaaauuca 1380

guaugucauc agagcacaau ugcauguagg ggccaagcag gaaaauugga auaccgacau 1440

uaagacucuc aaguuugaug cccugucagg cucccaggaa gucgaguuca uuggguaugg 1500

aaaagcuaca cuggaaugcc aggugcaaac ugcgguggac uuugguaaca guuacaucgc 1560

ugagauggaa acagagagcu ggauagugga cagacagugg gcccaggacu ugacccugcc 1620

auggcagagu ggaaguggcg ggguguggag agagaugcau caucuugucg aauuugaacc 1680

uccgcaugcc gccacuauca gaguacuggc ccugggaaac caggaaggcu ccuugaaaac 1740

agcucuuacu ggcgcaauga ggguuacaaa ggacacaaau gacaacaacc uuuacaaacu 1800

acauggugga cauguuucuu gcagagugaa auugucagcu uugacacuca aggggacauc 1860

cuacaaaaua ugcacugaca aaauguuuuu ugucaagaac ccaacugaca cuggccaugg 1920

cacuguugug augcagguga aagugucaaa aggagccccc ugcaggauuc cagugauagu 1980

agcugaugau cuuacagcgg caaucaauaa aggcauuuug guuacaguua accccaucgc 2040

cucaaccaau gaugaugaag ugcugauuga ggugaaccca ccuuuuggag acagcuacau 2100

uaucguuggg agaggagauu cacgucucac uuaccagugg cacaaagagg gaagcucaau 2160

aggaaaguug uucacucaga ccaugaaagg cguggaacgc cuggccguca ugggagacac 2220

cgccugggau uucagcuccg cuggaggguu cuucacuucg guugggaaag gaauucauac 2280

gguguuuggc ucugccuuuc aggggcuauu uggcggcuug aacuggauaa caaaggucau 2340

caugggggcg guacuuauau ggguuggcau caacacaaga aacaugacaa uguccaugag 2400

caugaucuug guaggaguga ucaugauguu uuugucucua ggaguugggg cggaucaagg 2460

augcgccauc aacuuuggca agagagagcu caagugcgga gaugguaucu ucauauuuag 2520

agacucugau gacuggcuga acaaguacuc auacuaucca gaagauccug ugaagcuugc 2580

aucaauagug aaagccucuu uugaagaagg gaaguguggc cuaaauucag uugacucccu 2640

ugagcaugag auguggagaa gcagggcaga ugagaucaau gccauuuuug aggaaaacga 2700

gguggacauu ucuguugucg ugcaggaucc aaagaauguu uaccagagag gaacucaucc 2760

auuuuccaga auucgggaug gucugcagua ugguuggaag acuuggggua agaaccuugu 2820

guucucccca gggaggaaga auggaagcuu caucauagau ggaaagucca ggaaagaaug 2880

cccguuuuca aaccgggucu ggaauucuuu ccagauagag gaguuuggga cgggaguguu 2940

caccacacgc guguacaugg acgcagucuu ugaauacacc auagacugcg auggaucuau 3000

cuugggugca gcggugaacg gaaaaaagag ugcccauggc ucuccaacau uuuggauggg 3060

aagucaugaa guaaauggga cauggaugau ccacaccuug gaggcauuag auuacaagga 3120

gugugagugg ccacugacac auacgauugg aacaucaguu gaagagagug aaauguucau 3180

gccgagauca aucggaggcc caguuagcuc ucacaaucau aucccuggau acaagguuca 3240

gacgaacgga ccuuggaugc agguaccacu agaagugaag agagaagcuu gcccagggac 3300

uagcgugauc auugauggca acugugaugg acggggaaaa ucaaccagau ccaccacgga 3360

uagcgggaaa guuauuccug aaugguguug ccgcuccugc acaaugccgc cugugagcuu 3420

ccaugguagu gauggguguu gguaucccau ggaaauuagg ccaaggaaaa cgcaugaaag 3480

ccaucuggug cgcuccuggg uuacagcugg agaaauacau gcugucccuu uugguuuggu 3540

gagcaugaug auagcaaugg aagugguccu aaggaaaaga cagggaccaa agcaaauguu 3600

gguuggagga guagugcucu ugggagcaau gcuggucggg caaguaacuc uccuugauuu 3660

gcugaaacuc acaguggcug ugggauugca uuuccaugag augaacaaug gaggagacgc 3720

cauguauaug gcguugauug cugccuuuuc aaucagacca gggcugcuca ucggcuuugg 3780

gcucaggacc cuauggagcc cucgggaacg ccuugugcug acccuaggag cagccauggu 3840

ggagauugcc uuggguggcg ugaugggcgg ccuguggaag uaucuaaaug caguuucucu 3900

cugcauccug acaauaaaug cuguugcuuc uaggaaagca ucaaauacca ucuugccccu 3960

cauggcucug uugacaccug ucacuauggc ugaggugaga cuugccgcaa uguucuuuug 4020

ugccgugguu aucauagggg uccuucacca gaauuucaag gacaccucca ugcagaagac 4080

uauaccucug guggcccuca cacucacauc uuaccugggc uugacacaac cuuuuuuggg 4140

ccugugugca uuucuggcaa cccgcauauu ugggcgaagg aguaucccag ugaaugaggc 4200

acucgcagca gcuggucuag ugggagugcu ggcaggacug gcuuuucagg agauggagaa 4260

cuuccuuggu ccgauugcag uuggaggacu ccugaugaug cugguuagcg uggcugggag 4320

gguggauggg cuagagcuca agaagcuugg ugaaguuuca ugggaagagg aggcggagau 4380

cagcgggagu uccgcccgcu augauguggc acucagugaa caaggggagu ucaagcugcu 4440

uucugaagag aaagugccau gggaccaggu ugugaugacc ucgcuggccu ugguuggggc 4500

ugcccuccau ccauuugcuc uucugcuggu ccuugcuggg uggcuguuuc augucagggg 4560

agcuaggaga aguggggaug ucuuguggga uauucccacu ccuaagauca ucgaggaaug 4620

ugaacaucug gaggauggga uuuauggcau auuccaguca accuucuugg gggccuccca 4680

gcgaggagug ggaguggcac agggaggggu guuccacaca auguggcaug ucacaagagg 4740

agcuuuccuu gucaggaaug gcaagaaguu gauuccaucu ugggcuucag uaaaggaaga 4800

ccuugucgcc uaugguggcu cauggaaguu ggaaggcaga ugggauggag aggaagaggu 4860

ccaguugauc gcggcuguuc caggaaagaa cguggucaac guccagacaa aaccgagcuu 4920

guucaaagug aggaaugggg gagaaaucgg ggcugucgcu cuugacuauc cgaguggcac 4980

uucaggaucu ccuauuguua acaggaacgg agaggugauu gggcuguacg gcaauggcau 5040

ccuugucggu gacaacuccu ucguguccgc cauaucccag acugagguga aggaagaagg 5100

aaaggaggag cuccaagaga ucccgacaau gcuaaagaaa ggaaugacaa cuguccuuga 5160

uuuucauccu ggagcuggga agacaagacg uuuccuccca cagaucuugg ccgagugcgc 5220

acggagacgc uugcgcacuc uuguguuggc ccccaccagg guuguucuuu cugaaaugaa 5280

ggaggcuuuu cacggccugg acgugaaauu ccacacacag gcuuuuuccg cucacggcag 5340

cgggagagaa gucauugaug ccaugugcca ugccacccua acuuacagga uguuggaacc 5400

aacuaggguu guuaacuggg aagugaucau uauggaugaa gcccauuuuu uggauccagc 5460

uagcauagcc gcuagagguu gggcagcgca cagagcuagg gcaaaugaaa gugcaacaau 5520

cuugaugaca gccacaccgc cugggacuag ugaugaauuu ccacauucaa auggugaaau 5580

agaagauguu caaacggaca uacccaguga gcccuggaac acagggcaug acuggauccu 5640

agcugacaaa aggcccacgg caugguuccu uccauccauc agagcugcaa augucauggc 5700

ugccucuuug cguaaggcug gaaagagugu ggugguccug aacaggaaaa ccuuugagag 5760

agaauacccc acgauaaagc agaagaaacc ugacuuuaua uuggccacug acauagcuga 5820

aaugggagcc aaccuuugcg uggagcgagu gcuggauugc aggacggcuu uuaagccugu 5880

gcuuguggau gaagggagga agguggcaau aaaagggcca cuucguaucu ccgcauccuc 5940

ugcugcucaa aggagggggc gcauugggag aaaucccaac agagauggag acucauacua 6000

cuauucugag ccuacaagug aaaauaaugc ccaccacguc ugcugguugg aggccucaau 6060

gcucuuggac aacauggagg ugaggggugg aauggucgcc ccacucuaug gcguugaagg 6120

aacuaaaaca ccaguuuccc cuggugaaau gagacugagg gaugaccaga ggaaagucuu 6180

cagagaacua gugaggaauu gugaccugcc cguuuggcuu ucguggcaag uggccaaggc 6240

ugguuugaag acgaaugauc guaaguggug uuuugaaggc ccugaggaac augagaucuu 6300

gaaugacagc ggugaaacag ugaagugcag ggcuccugga ggagcaaaga agccucugcg 6360

cccaaggugg ugugaugaaa gggugucauc ugaccagagu gcgcugucug aauuuauuaa 6420

guuugcugaa gguaggaggg gagcugcuga agugcuaguu gugcugagug aacucccuga 6480

uuuccuggcu aaaaaaggug gagaggcaau ggauaccauc aguguguucc uccacucuga 6540

ggaaggcucu agggcuuacc gcaaugcacu aucaaugaug ccugaggcaa ugacaauagu 6600

caugcuguuu auacuggcug gacuacugac aucgggaaug gucaucuuuu ucaugucucc 6660

caaaggcauc aguagaaugu cuauggcgau gggcacaaug gccggcugug gauaucucau 6720

guuccuugga ggcgucaaac ccacucacau cuccuauguc augcucauau ucuuuguccu 6780

gauggugguu gugauccccg agccagggca acaaaggucc auccaagaca accaaguggc 6840

auaccucauu auuggcaucc ugacgcuggu uucagcggug gcagccaacg agcuaggcau 6900

gcuggagaaa accaaagagg accucuuugg gaagaagaac uuaauuccau cuagugcuuc 6960

acccuggagu uggccggauc uugaccugaa gccaggagcu gccuggacag uguacguugg 7020

cauuguuaca augcucucuc caauguugca ccacuggauc aaagucgaau auggcaaccu 7080

gucucugucu ggaauagccc agucagccuc aguccuuucu uucauggaca aggggauacc 7140

auucaugaag augaauaucu cggucauaau gcugcugguc aguggcugga auucaauaac 7200

agugaugccu cugcucugug gcauagggug cgccaugcuc cacuggucuc ucauuuuacc 7260

uggaaucaaa gcgcagcagu caaagcuugc acagagaagg guguuccaug gcguugccga 7320

gaacccugug guugauggga auccaacagu ugacauugag gaagcuccug aaaugccugc 7380

ccuuuaugag aagaaacugg cucuauaucu ccuucuugcu cucagccuag cuucuguugc 7440

caugugcaga acgcccuuuu cauuggcuga aggcauuguc cuagcaucag cugccuuagg 7500

gccgcucaua gagggaaaca ccagccuucu uuggaaugga cccauggcug ucuccaugac 7560

aggagucaug agggggaauc acuaugcuuu ugugggaguc auguacaauc uauggaagau 7620

gaaaacugga cgccggggga gcgcgaaugg aaaaacuuug ggugaagucu ggaagaggga 7680

acugaaucug uuggacaagc gacaguuuga guuguauaaa aggaccgaca uuguggaggu 7740

ggaucgugau acggcacgca ggcauuuggc cgaagggaag guggacaccg ggguggcggu 7800

cuccaggggg accgcaaagu uaaggugguu ccaugagcgu ggcuauguca agcuggaagg 7860

uagggugauu gaccuggggu guggccgcgg aggcuggugu uacuacgcug cugcgcaaaa 7920

ggaagugagu ggggucaaag gauuuacucu uggaagagac ggccaugaga aacccaugaa 7980

ugugcaaagu cugggaugga acaucaucac cuucaaggac aaaacugaua uccaccgccu 8040

agaaccagug aaaugugaca cccuuuugug ugacauugga gagucaucau cgucaucggu 8100

cacagagggg gaaaggaccg ugagaguucu ugauacugua gaaaaauggc uggcuugugg 8160

gguugacaac uucuguguga agguguuagc uccauacaug ccagauguuc ucgagaaacu 8220

ggaauugcuc caaaggaggu uuggcggaac agugaucagg aacccucucu ccaggaauuc 8280

cacucaugaa auguacuacg ugucuggagc ccgcagcaau gucacauuua cugugaacca 8340

aacaucccgc cuccugauga ggagaaugag gcguccaacu ggaaaaguga cccuggaggc 8400

ugacgucauc cucccaauug ggacacgcag uguugagaca gacaagggac cccuggacaa 8460

agaggccaua gaagaaaggg uugagaggau aaaaucugag uacaugaccu cuugguuuua 8520

ugacaaugac aaccccuaca ggaccuggca cuacuguggc uccuauguca caaaaaccuc 8580

aggaagugcg gcgagcaugg uaaauggugu uauuaaaauu cugacauauc caugggacag 8640

gauagaggag gucacaagaa uggcaaugac ugacacaacc ccuuuuggac agcaaagagu 8700

guuuaaagaa aaaguugaca ccagagcaaa ggauccacca gcgggaacua ggaagaucau 8760

gaaaguuguc aacagguggc uguuccgcca ccuggccaga gaaaagaacc ccagacugug 8820

cacaaaggaa gaauuuauug caaaaguccg aagucaugca gccauuggag cuuaccugga 8880

agaacaagaa caguggaaga cugccaauga ggcuguccaa gacccaaagu ucugggaacu 8940

gguggaugaa gaaaggaagc ugcaccaaca aggcaggugu cggacuugug uguacaacau 9000

gauggggaaa agagagaaga agcugucaga guuugggaaa gcaaagggaa gccgugccau 9060

augguauaug uggcugggag cgcgguaucu ugaguuugag gcccugggau uccugaauga 9120

ggaccauugg gcuuccaggg aaaacucagg aggaggagug gaaggcauug gcuuacaaua 9180

ccuaggauau gugaucagag accuggcugc aauggauggu gguggauucu acgcggauga 9240

caccgcugga ugggacacgc gcaucacaga ggcagaccuu gaugaugaac aggagaucuu 9300

gaacuacaug agcccacauc acaaaaaacu ggcacaagca gugauggaaa ugacauacaa 9360

gaacaaagug gugaaagugu ugagaccagc cccaggaggg aaagccuaca uggaugucau 9420

aagucgacga gaccagagag gauccgggca gguagugacu uaugcucuga acaccaucac 9480

caacuugaaa guccaauuga ucagaauggc agaagcagag auggugauac aucaccaaca 9540

uguucaagau ugugaugaau caguucugac caggcuggag gcauggcuca cugagcacgg 9600

augugacaga cugaagagga uggcggugag uggagacgac uguguggucc ggcccaucga 9660

ugacagguuc ggccuggccc ugucccaucu caacgccaug uccaagguua gaaaggacau 9720

aucugaaugg cagccaucaa aaggguggaa ugauugggag aaugugcccu ucuguuccca 9780

ccacuuccau gaacuacagc ugaaggaugg caggaggauu guggugccuu gccgagaaca 9840

ggacgagcuc auugggagag gaaggguguc uccaggaaac ggcuggauga ucaaggaaac 9900

agcuugccuc agcaaagccu augccaacau guggucacug auguauuuuc acaaaaggga 9960

caugaggcua cugucauugg cuguuuccuc agcuguuccc accucauggg uuccacaagg 10020

acgcacaaca uggucgauuc augggaaagg ggaguggaug accacggaag acaugcuuga 10080

gguguggaac agaguaugga uaaccaacaa cccacacaug caggacaaga caauggugaa 10140

aaaauggaga gaugucccuu aucuaaccaa gagacaagac aagcugugcg gaucacugau 10200

uggaaugacc aauagggcca ccugggccuc ccacauccau uuagucaucc aucguauccg 10260

aacgcugauu ggacaggaga aauacacuga cuaccuaaca gucauggaca gguauucugu 10320

ggaugcugac cugcaacugg gugagcuuau cugaaacacc aucuaacagg aauaaccggg 10380

auacaaacca cggguggaga accggacucc ccacaaccug aaaccgggau auaaaccacg 10440

gcuggagaac cgggcuccgc acuuaaaaug aaacagaaac cgggauaaaa acuacggaug 10500

gagaaccgga cuccacacau ugagacagaa gaaguuguca gcccagaacc ccacacgagu 10560

uuugccacug cuaagcugug aggcagugca ggcugggaca gccgaccucc agguugcgaa 10620

aaaccugguu ucugggaccu cccaccccag aguaaaaaga acggagccuc cgcuaccacc 10680

cucccacgug gugguagaaa gacggggucu agagguuaga ggagacccuc cagggaacaa 10740

auagugggac cauauugacg ccagggaaag accggagugg uucucugcuu uuccuccaga 10800

ggucugugag cacaguuugc ucaagaauaa gcagaccuuu ggaugacaaa cacaaaacca 10860

cu 10862

<210> 2

<211> 10862

<212> РНК

<213> Вирус желтой лихорадки

<220>

<223> Последовательность РНК штамма YFV YF-Vax®

<400> 2