Новый штамм-продуцент хлорэремомицина kibdelosporangium aridum

Группа изобретений относится к микробиологии и биотехнологии. Штамм Kibdelosporangium aridum VKPM Ac-2184 продуцент хлорэремомицина. Применение указанного штамма для получения хлорэремомицина. Способ получения хлорэремомицина осуществляют следующим образом. Культивируют указанный штамм и выделяют антибиотик хлорэремомицин из культуральной жидкости с последующей очисткой. Группа изобретений обеспечивает увеличение продуктивности штамма-продуцента хлорэремомицина, сокращение времени культивирования, снижение количества примесей в субстанции антибиотика хлорэремомицина, высокую биохимическую активность и повышенную устойчивость нового штамма к неблагоприятным факторам, в том числе при хранении и культивировании. 3 н.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 6 пр.

 

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, и касается нового штамма-продуцента антибиотика хлорэремомицина.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ.

Хлорэремомицин - гликопептидный антибиотик класса ванкомицинов, имеет в составе своей структуры три сахара, одну D-глюкозу и два L-4-эпи-ванкозамина, присоединенные к сшитому гептапептидному остову тремя гликозилтрансферазами, GtfA, -B и –C (Lu W, et al. Characterization of a regiospecific epivancosaminyl transferase GtfA and enzymatic reconstitution of the antibiotic chloroeremomycin// Proc Natl Acad Sci U S A.- 2004 Mar 30.-101(13):4390-5. Epub 2004 Mar 18).

Хлорэремомицин является предшественником полусинтетического антибиотика оритаванцина (Wang, W.-Y. et al. Enhancement of A82846B yield and proportion by overexpressing the halogenase gene in Amycolatopsis orientalis SIPI18099, Appl. Microbiol. Biotech.- 2018.- P.5635-5643).

Большинство используемых в медицине антимикробных препаратов разработаны на основе природных метаболитов бактерий и грибов. Актиномицеты, грамположительные мицелиальные бактерии порядка Actinomycetales являются продуцентами таких классов антибиотиков, как макролиды, антрациклины, полиэфирные антибиотики, циклополилактоны, аминогликозиды, стрептотрицины, актиномицины, хиноксалиновые пептиды, гликопептиды и др. Для поиска актиномицетов — продуцентов биологически активных соединений разрабатываются различные методы селективной изоляции новых штаммов (Синёва О.Н. Выделение актиномицетов редких родов — продуцентов антибиотиков из почв с применением сока Aloe arborescens// Антибиотики и Химиотерапия.- 2021.- 66(9-10):4-11).

Известен штамм-продуцент Кibdelosporangium aridum JH100-32B16B промежуточного продукта синтеза оритаванцина, депонированный в Общем центре сбора микробиологических культур Китая (CGMCC) под номером CGMCC №17931 (CN113493748, опубл. 12.10.2021).

Известен рекомбинантный штамм Kibdelosporangium aridum, продуцирующий антибиотик A82846B, который является важным предшественником полусинтетического гликопептидного антибиотика оритаванцина (Тian et al., Enhancing A82846B production by artificial attB-assisted overexpression of orf10-orf11 genes in Kibdelosporangium aridum SIPI-3927. AMB Express. - 2020 Mar 16. - 10(1):52). Указанный штамм рассматривался авторами настоящего изобретения в качестве близкого аналога.

Цель настоящего изобретения - получение нового штамма микроорганизма, превосходящего по уровню накопления хлорэремомицина известные ранее штаммы.

Техническим результатом заявленного изобретения является увеличение продуктивности нового штамма Kibdelosporangium aridum VKPM Ac-2184, сокращение времени культивирования, снижение количества примесей в субстанции антибиотика хлорэремомицин, высокая биохимическая активность и повышенная устойчивость нового штамма по настоящему изобретению к неблагоприятным факторам, в том числе, при хранении и культивировании.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ.

Из образца дерново–подзолистой почвы (Мордовия) был выделен штамм дикого типа, продуцирующий антибиотик хлорэремомицин.

Для повышения секреции хлорэремомицина штамм дикого типа подвергался процессу индуцированного мутагенеза путем воздействия на него ультрафиолета при низких температурах.

Далее полученный высокопродуктивный штамм, который получил внутреннее наименование CLE 20-36, был идентифицирован по макро- и микроморфологическим признакам, а родовая принадлежность была подтверждена секвенированием гена 16S рРНК.

По результатам анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, тестируемый штамм CLE 20-36 оказался наиболее близок к виду Kibdelosporangium aridum.

Полученный новый штамм Kibdelosporangium aridum депонирован в Национальный Биоресурсный Центр Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» под номером VKPM Ac-2184.

Таким образом, одним из вариантов настоящего изобретения является штамм продуцент хлорэремомицина Kibdelosporangium aridum VKPM Ac-2184. Другим вариантом настоящего изобретения является применение штамма Kibdelosporangium aridum VKPM Ac-2184 для получения антибиотика хлорэремомицина. Еще одним из вариантов настоящего изобретения является способ получения антибиотика хлорэремомицина, который заключается в том, что осуществляют культивирование штамма Kibdelosporangium aridum VKPM Ac-2184 и выделение хлорэремомицина из культуральной жидкости с последующей очисткой (Фиг.1).

ТЕРМИНЫ и ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Ниже приведены термины, которые могут использоваться при описании настоящего изобретения. Если не указано иное, все технические и специальные термины, использованные в описании, имеют общепринятое в данной области техники значение.

Термин «антибиотик» включает в себя любую молекулу, которая может ингибировать рост, разрушать или приводит к гибели микроорганизмов, но не является смертельным для пациента в интервалах концентрации и дозировании, предполагаемых для введения. Согласно настоящему изобретению указанные антибиотики могут быть классифицированы как бактерицидные (т.е., непосредственно приводящие к гибели микроорганизма) или бактериостатические (т.е. предотвращающие деление и/или размножение микроорганизма). В контексте настоящего изобретения антибиотик не является токсичным для пациента, в интервалах вводимых концентраций и дозирования.

Использование термина «антибиотический» в контексте настоящего изобретения означает эффект или тип воздействия в лечении или профилактике инфекций, вызванных грамотрицательными и/или грамположительными бактериями.

Термин «биомасса» в контексте настоящего изобретения относится к совокупной массе клеток Kibdelosporangium aridum VKPM Ac-2184, отделенных в процессе центрифугирования от супернатанта культуральной жидкости, полученной в результате культивирования, в том числе, в качалочных колбах или биореакторах (например, при культивировании батарейным способом).

Термин «культуральная жидкость» в контексте настоящего изобретения означает газожидкостную питательную (или ферментационную) среду, в которую в процессе глубинного культивирования микроорганизмы выделяют продукты метаболизма (в т.ч. вторичные метаболиты). Термин «биореактор» в контексте настоящего изобретения относится к сосуду или устройству, в котором осуществляются процесс глубинного культивирования микроорганизмов для наработки целевого продукта (в рамках настоящего изобретения, антибиотика хлорэремомицина).

Термин «продуктивность штамма» в контексте настоящего изобретения относится к количеству полученного антибиотика хлорэремомицина, рассчитанному на единицу объема культуральной жидкости, при глубинном культивировании штамма Kibdelosporangium aridum VKPM Ac-2184 в условиях биореактора, выраженному в граммах хлорэремомицина на литр культуральной жидкости.

При использовании в описании термина «примерно», «приблизительно», «около» следует считать, что он характеризует плюс минус десять процентов от указанной величины.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано посредством Фиг. 1.

На Фиг. 1 изображены основные этапы скрининга штамма Kibdelosporangium aridum VKPM Ac-2184 и наработки хлорэремомицина из его культуральной жидкости, полученной после глубинного культивирования.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно настоящему изобретению предложен новый штамм продуцент хлорэремомицина - штамм Kibdelosporangium aridum депонирован в Национальный Биоресурсный Центр Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» под номером VKPM Ac-2184.

Культурально-морфологические признаки: аэроб; окраска по Граму – положительная, при культивировании на плотной среде нижеуказанного состава типичные колонии имеют цвет от светло-бежевого до серо-бежевого, коническую форму, диаметр 3-5 мм, приподняты над агаром, поверхность неровная.

Физиолого-биохимические характеристики: Хорошо утилизирует сахарозу, крахмал, фруктозу, арабинозу, инозит, галактозу, манит, глюкозу; умеренно лактозу, рамнозу, ксилозу, не утилизирует рафинозу. Обладает протеолитической активностью. Восстанавливает нитраты до нитритов.

Для хранения и приготовления посевного материала используется среда следующего состава, г/л: растворимый крахмал –15.0-19.0; глюкоза – 8.0-10.0; дрожжевой экстракт – 3.0-4.0; ферментативный гидролизат казеина – 4.0-4.5; гидрофосфат калия – 0.3 - 0.5; агар-агар - 18.0-21.0; вода очищенная; рН среды 6.7±0.3.

Условия культивирования для выделения единичных колоний- 10-12 суток, при температуре 27-32°С.

ПРИМЕРЫ

Изобретение поясняется следующими иллюстративными примерами, которые не ограничивают заявленный объем охраны.

Пример 1. Способ селективного выделения из штамма - продуцента хлорэремомицина из образца почвы.

Объектами исследования были образцы дерново-подзолистой почвы. Образцы почвы были отобраны в Республике Мордовия в летний период из верхних горизонтов почвы.

Для выделения штамма дикого типа - продуцента хлорэремомицина из образцов почв использовали метод посева на твердые питательные среды. Гомогенизированный образец почвы массой 1 г помещали в колбу со 100 мл стерильной водопроводной воды, далее готовили разведение 1:300 и проводили посев на чашки с питательной средой Гаузе 1. В питательную среду добавляли антибиотики широкого спектра для ограничения роста и активности нежелательных микроорганизмов.

Посевы инкубировали при температурах 20 - 30°С до появления видимых колоний. Чистую культуру выводили путем последовательных пересевов до единичной колонии. Контроль чистоты культуры проводили микроскопически.

Пример 2. Получение высокопродуктивного штамма-продуцента хлорэремомицина.

Путем многоступенчатой селекции с применением мутагенных факторов и направленных методов отбора модификантов родительского дикого штамма был получен новый высокопродуктивный штамм - продуцент хлорэремомицина CLE 20-36.

Для этого осуществляли воздействие УФ с длиной волны 250 нм (лампа Mineralight) водной суспензии спор и клеток родительского штамма, размещенного на расстоянии 55 см от лампы в течение 20 минут при температуре 0oC. Полученному штамму был присвоен внутренний номер CLE 20-36.

Пример 3. Идентификация штамма CLE 20-36 до вида с помощью анализа 16s РНК.

Выделение ДНК штамма CLE 20-36 для ПЦР проводили по стандартной методике (PCR Protocols. A Guide to methods and applications. Innis M, Gelfand D., Sninsky J.p.14-15).

Для секвенирования использовали консервативные праймеры для наработки 16S rDNA:

8f - AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG

926r - CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT

Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе АЕ3000 с режимами реакции:

1. 95оС - 3мин.

2. 35 циклов

95оС - 30 сек.

57оС - 30 сек.

72оС - 1 мин. 30 сек.

3. 72оС - 5 мин.

Для анализа секвенированных последовательностей использовали специализированные филогенетические компьютерные программы. Для стабильности воспроизведения результатов проводили не менее трех повторов ПЦР-реакций.

Далее проводили электрофорез ПЦР исследуемых образцов в 1,0% агарозном геле, при напряженности электрического поля 5 В/см.

Первичный скрининг по базе данных GenBank показал, что исследуемый штамм принадлежит к следующим систематическим группам: Bacteria; Actinobacteria; Pseudonocardiales; Pseudonocardiaceae; Kibdelosporangium.

Последовательности были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий, доступными из базы данных GenBank.

Обработку секвенированных последовательностей проводились при помощи биоинформатического программного обеспечения в открытом доступе - программы Blast (Basic Local Alignment Search Tool), предназначенной в т.ч. для определения степени филогенетической близости живых организмов.

По результатам анализа последовательностей вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, тестируемый штамм CLE 20-36 оказался наиболее близок к виду Kibdelosporangium aridum.

Пример 4. Методика культивирования.

Проводили подготовку посевного материала путем посева культуры Kibdelosporangium aridum VKPM Ac-2184 в чашках Петри. Для этого агаризованную среду засевали исходной посевной культуры, и выдерживали в термостате от 5 до 12 суток, при температуре 25-34°С.

Далее проводили наработку культуры в колбах в жидкой среде в при 25-34°С в течение 24-48 часов на термостатируемой качалочной установке при 200-300 об/мин.

Далее проводили наработку посевной культуры в ферментере объемом 5/15/100 л, для этого проводили засев ферментера путем внесения посевной культуры в количестве 5-15% от объема среды в ферментере, при непрерывной подаче стерильного воздуха во время культивирования при перемешивании в течении 110-170 часов.

Контроль содержания антибиотика проводили методом ВЭЖХ. При максимальном накоплении антибиотика в среде процесс ферментации прекращали.

Пример 5. Определение содержания хлорэремомицина в культуральной жидкости методом ВЭЖХ.

Анализ содержания хлорэремомицина в культуральной жидкости методом ВЭЖХ проводили на колонке С18, 100 Å, 250*4,6 мм, 5 мкм; подвижная фаза А - 0,1 % ацетонитрила в 0,1 % водном растворе трифторуксусной кислоты. Подвижная фаза В: 0,1 % изопропилового спирта и 0,1 % подвижной фазы А в ацетонитриле скорость потока -1,1 мл/мин; длина волны детектирования – 254 нм.

Полученные данные представлены в таблице 1.

Таблица 1. Выход целевого продукта при глубинном культивировании

Штамм Продуктивность штаммов (г/л культуральной жидкости ±0,2 г/л)
в ферментере объемом 5 литров в ферментере объемом 15 литров в ферментере объемом 100 литров
Kibdelosporangium aridum VKPM
Ac-2184
5,5
5,7
6,4
6,8
7,0
7,4
15,1
15,8
16,2

Согласно литературным данным продуктивность известного штамма Kibdelosporangium aridum составляла 1,45 г/л (CN113493748, опубл. 12.10.2021). А продуктивность генетически модифицированного штамма Kibdelosporangium aridum достигала 2,52 г/л (Тian et al., Enhancing A82846B production by artificial attB-assisted overexpression of orf10-orf11 genes in Kibdelosporangium aridum SIPI-3927. AMB Express. - 2020 Mar.- 16;10(1):52).

Результаты исследований позволяют сделать вывод о том, что штамм микроорганизма по настоящему изобретению обладает высоким биотехнологическим потенциалом, значительно увеличенной продуктивностью и может применяться для промышленного производства антибиотика хлорэремомицина.

Пример 6. Методика выделения хлорэремомицина.

После культивирования микроорганизма Kibdelosporangium aridum VKPM Ac-2184 проводили отделение биомассы от культуральной жидкости центрифугированием. Очищенную от биомассы культуральную жидкость переносили на стадию очистки, а отработанную биомассу утилизировали.

Очищенную от биомассы культуральную жидкость наносили на колонку с гидрофобным сорбентом НР-20. Вытесненный с колонки раствор утилизировали. Колонку промывали очищенной водой. Элюат собирали и переносили порционно в колбу ротационного испарителя. Удаляли растворитель в вакууме при температуре не выше 40 °С. Полученный концентрат снова наносили на колонку с сорбентом НР-20. Колонку промывали очищенной водой. Затем колонку элюировали 50 % водным этанолом с добавлением уксусной кислоты. Контроль осуществляли методом ВЭЖХ/УФ. Элюат фракционировали, отдельные фракции анализировали методом ВЭЖХ. Фракции, содержащие хлорэремомицин с чистотой не менее 80 % объединяли. Менее чистые фракции утилизировали. Очищенный раствор хлорэремомицина депигментировали перемешиванием в течение 30 мин с 0.5 масс. % угля апирогенного. Уголь отделяли фильтрованием через слой силикагеля. Далее раствор хлорэремомицина концентрировали при помощи ротационного испарителя в вакууме до 1/3 от первоначального объема. Концентрат охлаждали, выпавший осадок отделяли фильтрованием.

1. Штамм Kibdelosporangium aridum VKPM Ac-2184 продуцент хлорэремомицина.

2. Применение штамма по п.1 для получения хлорэремомицина.

3. Способ получения хлорэремомицина, включающий культивирование штамма по п.1 и выделение антибиотика хлорэремомицина из культуральной жидкости с последующей очисткой.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к получению 6-ундеканона, 6-ундеканола и лауриновой кислоты с использованием комбинированного биотехнологического и химического способа. Приводят этанол и/или ацетат в контакт с микроорганизмом, выбранным из Clostridium carboxidivorans и Clostridium kluyveri, способным осуществлять удлинение углеродной цепи с получением гексановой кислоты и/или ее сложного эфира из этанола и/или ацетата.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к микробиологическому синтезу L-треонина с использованием бактерии вида Escherichia coli. Предложен штамм бактерии Escherichia coli ВКПМ В-14270 с инактивированным геном yhjE, продуцирующий L-треонин.
Изобретение относится к биотехнологии и агроэкологии и предназначено для реабилитации почвогрунтов после аварийных разливов в районах добычи, транспортировки и переработки нефти, для рекультивации свалок ТБО и сельскохозяйственных земель, для утилизации отходов сельского хозяйства и отраслей промышленности по переработке растительного сырья, для очистки жидких отходов и сточных вод производств путем сорбции, фильтрации загрязненных вод и предотвращения миграции тяжелых металлов и нефтеуглеводородов с одновременным структурированием почвы и очисткой от загрязнений нефтью и нефтепродуктами.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению астаксантина, и может быть использовано в микробиологической промышленности. Предложен способ приготовления питательной среды для культивирования дрожжей Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma).

Изобретение относится к области биохимии, в частности к штаммам Pseudomonas putida 5G, ВКМ B-3636D и Rhodococcus erythropolis 62М/3, ВКМ Ac-2933D. Также раскрыт способ биоремедиации почв, загрязненных компонентами ракетного топлива.

Изобретение относится к применению Bifidobacterium longum NK49 с учетным номером KCCM12088P для предотвращения или лечения женского менопаузального расстройства. Предложены также фармацевтическая композиция для применения для предотвращения или лечения женского менопаузального расстройства, содержащая в эффективном количестве указанный штамм и фармацевтически приемлемый носитель, а также функциональный продукт питания для применения для предотвращения или облегчения женского менопаузального расстройства, содержащий указанный штамм.

Настоящее изобретение относится к микробиологии, в частности к штамму Thiopseudomonas alkaliphila, редкого и уникального микроорганизма, впервые выделенного на территории РФ. Штамм депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ-Оболенск) под регистрационным номером В-9992 и предназначен для уточнения строения и функции данного микроорганизма.
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен штамм Paenibacillus polymyxa ВСГУТУ-1 как продуцент экзополисахаридов, депонированный под регистрационным номером ВКПМ В-14267.

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии. Штамм Streptococcus pneumoniae 23 3-H-3 серотип 15F, предназначенный для получения полисахарида, используемого в качестве антигена, депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-9846.
Изобретение относится к области очистки нефтепродуктов, особенно дизельного топлива, от частиц размером более 4 мкм. Биосорбент содержит водную суспензию инактивированных микроорганизмов аскомицетов и/или аскомицетных дрожжей и консервант.

Изобретение относится к биотехнологии и сельскохозяйственной микробиологии, в частности к получению бактериальных штаммов, обладающих фунгицидными и ростстимулирующими свойствами. Предложен штамм бактерий Streptomyces hygroscopicus, депонированный в Национальном биоресурсном центре - Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов под номером Ас-2158 для получения биопрепарата против широкого спектра грибов и грибоподобных протистов - возбудителей грибных болезней сои.
Наверх