Средство, обладающее противовирусным действием в отношении коронавируса sars-cov-2
Владельцы патента RU 2788762:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук (RU)
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)
Изобретение относится к медицине и вирусологии, а именно к применению полифенольного комплекса древесины маакии амурской (ПФК), активной субстации препарата Максар®, в качестве средства, обладающего противовирусным действием в отношении коронавируса SARS-CoV-2. Применение полифенольного комплекса древесины маакии амурской, активной субстации препарата Максар®, в качестве средства, обладающего противовирусным действием в отношении коронавируса SARS-CoV-2. Применяемое средство обладает низкой цитотоксической активностью по отношению к клеткам Vero E6 и проявляет вирусингибирующую дозозависимую активность против SARS-CoV-2 в тестах на клеточной культуре Vero E6, наиболее эффективно ингибирует репликацию SARS-CoV-2 при непосредственном воздействии на вирус (вирулицидное действие). 2 ил., 3 табл.
Изобретение относится к медицине и вирусологии, и касается средства, обладающего противовирусным действием в отношении коронавируса SARS-CoV-2.
В 2019 году люди познакомилось с вирусом SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 2) (Nidovirales: Coronoviridae, Betacoronavirus, подрод Sarbecovirus), который вызвал первую в истории человечества документированную пандемию, этиологически связанную с коронавирусом [World Health Organization. Coronavirus disease 2019 (COVID-19). Situation Report 51 (11 March 2020). URL: https: //www.who.int/docs/de fault-source/coronaviruse/situation-reports/20200311-sitrep-51-covid 19.pdf?sfvrsn=1ba62e57_10 (date of request: 07.01.2021).]. Вызываемое SARS-CoV-2 заболевание - COVID-19 (Coronavirus disease 2019), которое в большинстве случаев протекает как острая респираторная вирусная инфекция, связывают с частым развитием тяжелых респираторных осложнений (вирусная пневмония, дыхательная недостаточность, острый респираторный дистресс-синдром) и отсроченных поражений легких [Никифоров В.В. и др. Новая коронавирусная инфекция (COVID-19): клинико-эпидемиологические аспекты. Архивъ внутренней медицины. 2020;10(2):87-93.]. Всемирная организация здравоохранения оценила общее число смертей в 2020 и 2021 годах, прямо или косвенно связанных с пандемией COVID-19, примерно в 15 миллионов человек [David Adam. 15 million people have died in the pandemic, WHO says. The World Health Organization’s long-awaited estimate of excess COVID deaths is in line with other studies. Nature (05 May 2022).]. В этой связи во всем мире ведется интенсивный поиск противовирусных лекарственных средств для лечения COVID-19.
Одним из практических подходов в качестве меры быстрого реагирования на возникшую пандемию стало перепрофилирование существующих терапевтических агентов, ранее предназначенных для других вирусных инфекций, наиболее известными из которых явились нуклеозидные аналоги или их предшественники, блокирующие репликацию вирусной РНК. Например, нуклеозидный аналог - фавипиравир, раннее применявшийся для лечения гриппа, в России стал одним из первых фармпрепаратов для лечения COVID-19 [RU 2764444 C1, 17.01.2022].
Помимо направленного поиска и скрининга синтетических соединений, обладающих противовирусной активностью, представляется перспективным поиск эффективных в противовирусном плане веществ природного происхождения. Особое место среди них занимают растительные полифенолы, оказывающие разнообразное биологическое действие, основанное на их прямой антиоксидантной активности и влиянии на модуляцию внутриклеточной передачи сигналов [Tarbeeva D.V. et al. Biologically active polyphenolic compounds from Lespedeza bicolor. Fitoterapia. 2022. Т. 157. С. 105121.].
Известно противовирусное средство на основе лектина семян Maackia amurensis [патент W02022086916 А1, 28.04.2022]. Этот лектин воздействует на рецептор ACE2, снижает экспрессию и гликозилирование ACE2, подавляет связывание шиповидного белка SARS-CoV-2 и снижает экспрессию медиаторов воспаления эпителиальными клетками полости рта, которые вызывают синдром респираторного расстройства (ОРДС) - смертельно опасного заболевания, при котором легкие не могут нормально работать у пациентов с COVID-19.
Наиболее близкими аналогом по назначению (прототипом) является ингибитор коронавируса SARS-CoV-2, содержащий водный экстракт биологически активных веществ из базидиального гриба Inonotus obliquus [RU 2741714 C1, 28.01.2021]. Однако недостатком этого ингибитора коронавируса SARS-CoV-2 является отсутствие данных о токсических свойствах этого препарата в отношении клеток и живых организмов и его стандартизации.
Расширение арсенала эффективных и малотоксичных средств для профилактики и лечения коронавируса SARS-CoV-2 является в настоящее время актуальной задачей.
Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в использовании полифенольного комплекса древесины маакии амурской, активной субстации препарата Максар®, в качестве средства, обладающего противовирусным действием в отношении коронавируса SARS-CoV-2.
Предлагаемое средство обладает низкой цитотоксической активностью по отношению к клеткам Vero E6 и проявляет вирусингибирующую дозозависимую активность против SARS-CoV-2 в тестах на клеточной культуре Vero E6. Средство эффективно ингибирует репликацию SARS-CoV-2 при непосредственном воздействии на вирус (вирулицидное действие). Наиболее эффективное снижение содержания РНК вируса SARS-CoV-2 обнаружено при предварительной обработке вируса максимально нецитотоксической концентрацией полифенольного комплекса древесины маакии амурской (200 мкг/мл).
Высокая противовирусная активность заявляемого средства была зарегистрирована при одновременном воздействии на клетки Vero E6 коронавируса и полифенольного комплекса древесины маакии амурской (IC50 = 28,7±3,7 мкг/мл; SI = 42,2±5,5).
Маакия амурская (Maackia amurensis Ruper et Max.) - растение семейства бобовых характеризуется высоким содержанием полифенольных соединений с выраженными антиоксидантными свойствами и низкой токсичностью. При детальном химическом исследовании спиртовых экстрактов ядровой древесины маакии амурской было показано, что основными ее компонентами являются растительные полифенолы, составляющие полифенольный комплекс (ПФК), на основе которого был создан гепатопротективный препарат Максар® (регистрационный номер P N003294/01). В состав ПФК ядровой древесины маакии амурской, из которого получают активную субстанцию препарата Максар® входят свыше 20 полифенолов, основными из которых являются изофлавоны, птерокарпаны, флаваноны, изофлаваны, изофлаваноны, халконы, лигнаны, мономерные и димерные стильбены. Показано, что Максар® усиливает антиоксидантную защиту организма и снижает уровень перекисного окисления липидов. Этот препарат эффективен при лечении жировой дистрофии печени и снижает общее содержание липидов в крови, обладает антиагрегантными и противоопухолевыми свойствами [Федореев С.А. и др. Препарат максар из дальневосточного растения маакии амурской. Хим. - фарм. журн. 2004; 38 (11): 22-26.].
Однако противовирусные свойства полифенолов маакии амурской на сегодняшний день мало изучены. Известно только об антигерпетической активности резвератрола, который обнаружен в составе ПФК [Annunziata G.M. et al. Resveratrol as a Novel Anti-Herpes Simplex Virus Nutraceutical Agent: An Overview. Viruses 2018, 10, 473.]. При лечении препаратом Максар® больных с хроническими вирусными гепатитами разной этиологии была показана его терапевтическая эффективность [Путилова Е.А. и др. Клинико-иммунологическая эффективность максара при хронических вирусных гепатитах. Фундаментальные исследования. - 2011. - № 9-3. - С. 484.].
Указание на использование ПФК древесины маакии амурской, активной субстанции препарата Максар®, в качестве противовирусного средства в отношении SARS-CoV-2 в доступной патентной и другой научно-технической литературе не найдено и обнаружено авторами впервые. Новая функция ПФК активной субстанции препарата Максар® не вытекает с очевидностью из его известных свойств и состава.
Противовирусная активность ПФК древесины маакии амурской в отношении SARS-CoV-2 была определена экспериментальным путем.
Изобретение иллюстрируется фигурами и экспериментами.
На фиг. 1 представлено влияние соединений на жизнеспособность клеток Vero Е6 (по результатам трех экспериментов). ПФК - полифенольный комплексдревесины маакии амурской, РВ - Рибавирин®. * - статистически значимые различия между показателями ПФК и РВ (p≤0,05).
- На фиг. 2 представлены относительные изменения уровня вирусной нагрузки SARS-CoV-2, рассчитанные по формуле 2-ΔCt, при различных схемах применения соединений. * - статистически значимые различия между показателями уровня вирусной нагрузки при воздействии соединений (ПФК и РВ) и контроля (p≤0,05); ** - статистически значимые различия между показателями уровня вирусной нагрузки при воздействии ПФК и РВ (p≤0,05). Пунктирная линия установлена в качестве отрицательного контроля (0,000002), и показатели уровня вирусной нагрузки в серой области ниже пунктирной линии считаются отрицательными по SARS-CoV-2.
В экспериментах использовали полифенольный комплекс древесины маакии амурской.
Способ его получения заключается в следующем: измельченную ядровую древесину маакии амурской экстрагируют 95% этиловым спиртом при 50-55°С в соотношении сырье : экстрагент 1:5 в батарее перкаляторов, затем спиртовые извлечения упаривают и сушат в вакууме [RU 2104027 C1, 10.02.1998].
Культура клеток
В работе использовали перевиваемую культуру эпителиальных клеток почки африканской зеленой мартышки Vero Е6, полученной из коллекции культур клеток ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. В качестве среды роста клеток использовали питательную среду ДМЕМ (ООО «БиолоТ», Россия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ООО «БиолоТ», Россия), 100 Ед/мл гентамицина при 37°С в атмосфере 5% СО2. При культивировании клеток с вирусом в качестве поддерживающей среды использовали питательную среду ДМЕМ с гентамицином, но с добавлением 1% сыворотки. Концентрация клеток в ходе всех экспериментов составляла 1×104 кл/мл.
Вирус SARS-CoV-2 штамм SARS-CoV-2/human/RUS/4460/2020 был получен из коллекции ФГБНУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова» Роспотребнадзора. Штамм был выделен из назофарингеального смыва пациента с клинически и лабораторно подтвержденным диагнозом COVID-19. Штамм SARS-CoV-2/human/RUS/4460/2020 был выделен путем последовательного пассирования на культуре клеток Vero Ε6. Вирусный материал, полученный на разных пассажных уровнях, анализировали на наличие РНК SARS-CoV-2 с помощью набора реагентов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ- SARS-CoV-2) (ООО «НПФ Синтол», Россия). Титр вируса определяли по цитопатогенному действию (ЦПД) на культуру клеток Vero E6, рассчитывали по методу Рида и Менча [Ramakrishnan M.A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World J. Virol. 2016; 5 (2): 85-6.] и выражали в десятичных логарифмах 50%-х тканевых цитопатических доз в мл (lg ТЦД50/мл). После 5-го пассажа титр вируса составлял 6,2 lg ТЦД50/мл. Идентификация штамма коронавируса SARS-CoV-2/human/RUS/4460/2020 была проведена с помощью секвенирования полноразмерного генома (GenBank ID: MZ544367.1).
Исследуемые соединения:
Полифенольный комплекс древесины маакии амурской - активная субстанция препарата Максар® (производство ТИБОХ ДВО РАН, Россия).
Референсный препарат Рибавирин® (Sigma-Aldrich, USA).
Тестируемые соединения растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО, ООО «БиолоТ», Россия) и стоковые растворы (10 мг/мл) хранили при -20°C. Рабочие растворы готовили из стоковых растворов путем разведения средой ДМЕМ до конечной концентрации ДМСО 0,5%.
Определение цитотоксичности исследуемых соединений по отношению к клеткам Vero E6
Цитотоксичность соединений оценивали по жизнеспособности клеток Vero Е6 с использованием МТТ (метилтиазолилтетразолий бромид) теста [Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods. 1983. Vol. 65. P. 55.]. Монослой клеток (1×104 клеток/лунку), выращенных в 96-луночных планшетах, обрабатывали различными концентрациями (от 5 до 2000 мкг/мл) тестируемых соединений, контролем служили клетки, обработанные ДМСО. Клетки культивировали при 37°C в CO2-инкубаторе в течение 5 сут. После инкубации к монослою клеток добавляли по 20 мкл/лунку 5 мг/мл раствора МТТ (Sigma-Aldrich, USA), оставляли на 2 ч при 37°C. Далее раствор МТТ удаляли и добавляли изопропиловый спирт, подкисленный 0,4 М соляной кислотой. Оптическую плотность (ОП) измеряли на планшетном ридере (Labsystems Multiskan RC, Finland) при длине волны 540 нм. Жизнеспособность клеток рассчитывали как (ОПо)/(ОПк)×100%, где ОПо - оптическая плотность клеток, обработанных тестируемыми соединениями, ОПк - оптическая плотность контрольных клеток. Значение 50% цитотоксической концентрации (СС50) определяли с помощью регрессионного анализа как концентрацию соединения, которая уменьшала количество жизнеспособных клеток на 50% по сравнению с контролем клеток.
Определение противовирусной активности исследуемых соединений в отношении вируса SARS-CoV-2 с помощью МТТ-теста и методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ)
А) МТТ-тест
Анти-коронавирусную активность соединений оценивали по ингибированию цитопатогенного действия (ЦПД) вируса с помощью МТТ-теста. Монослой клеток Vero E6, выращенный в 96-луночных планшетах (1×104 клеток/лунку), инфицировали 100 ТЦД50/мл, а тестируемые соединения добавляли в концентрациях от 1 до 500 мкг/мл по нескольким схемам, каждая из которых выполнена в трех независимых повторах с использованием триплетов различных концентраций соединений. Результаты представлены в таблице 1.
| Таблица 1 Схемы применения исследуемых соединений для оценки их анти-SARS-CoV-2 действия |
||
| Схема | Порядок обработки | Описание |
| 1 | Предварительная обработка вируса соединениями (вирулицидное действие) | Вирусную суспензию инкубировали с соединениями (1:1, v/v) в течение 1 ч при 37°C, затем этой смесью инфицировали монослой клеток 1 ч при 37°C. Затем клетки промывали и инкубировали в течение 5 сут при 37°C в атмосфере 5% СО2 до появления ЦПД. |
| 2 | Предварительная обработка клеток соединениями (профилактическое действие) | Монослой клеток обрабатывали соединениями 1 ч при 37°C, затем инфицировали вирусом в течение 1 ч. Клетки промывали от неадсорбированного вируса и инкубировали в течение 5 сут при 37°C в атмосфере 5% СО2 до появления ЦПД. |
| 3 | Одновременная обработка клеток вирусом и соединениями | Монослой клеток инфицировали вирусом и одновременно вносили соединения (1:1, v/v) в течение 1 ч при 37°C. Клетки промывали и инкубировали в течение 5 сут при 37°C в атмосфере 5% СО2 до появления ЦПД. |
| 4 | Обработка инфицированных клеток соединениями (вирусингибирующее действие) | Монослой клеток инкубировали с вирусом 1 ч при 37°C, удаляли неадсорбированный вирус и вносили питательную среду, содержавшую разные концентрации исследуемых соединений, и инкубировали в течение 5 сут при 37°C в атмосфере 5% СО2 до появления ЦПД. |
Оценка противовирусной активности осуществлялась с учетом степени подавления (IR) цитопатогенного действия вирусов соединением, а также по 50% ингибирующей концентрации (IC50) и селективному индексу (SI). IR рассчитывали по формуле: IR = (ОПtv - ОПcv) / (ОПcd - ОПcv)×100%, где ОПtv соответствует оптической плотности инфицированных клеток, обработанных соединением; ОПcv - оптической плотности контрольных инфицированных клеток, ОПcd - оптической плотности контрольных (неинфицированных) клеток. IC50, снижающую на 50% вирус-индуцированное ЦПД, рассчитывали с помощью регрессионного анализа кривых доза-эффект, SI вычисляли как отношение CC50 к IC50 [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств, часть первая. - М.: Гриф и К, 2013. 942 с.].
Б) ОТ-ПЦР-РВ-SARS-CoV-2
Противовирусную активность исследуемых соединений в отношении SARS-CoV-2 оценивали по подавлению репликации вируса методом ОТ-ПЦР-РВ. Монослой клеток Vero E6, выращенный в 96-луночных планшетах (1×104 клеток/лунку), инфицировали вирусом SARS-CoV-2 (100 ТЦД50/мл), добавляли исследуемые соединения (200 мкг/мл ДМСО использовали для положительного (инфицированные вирусом, необработанные соединением клетки) и отрицательного (неинфицированные, необработанные соединением клетки) контролей. После окончания инкубации (5 сут) из клеточных супернатантов экстрагировали вирусную РНК с помощью «Набора реагентов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 методом полимеразной цепной реакции в реальном времени» (ОТ-ПЦР-РВ-SARS-CoV-2) (ООО «НПФ Синтол», Россия) в соответствии с инструкцией производителя.
Наличие вирусной РНК оценивали путем измерения параметра Ct - количества циклов реакции амплификации (удвоения вирусной РНК), необходимого для достижения флуоресцентного сигнала; при этом значение Ct ≥ 37 указывало на отсутствие в образцах РНК вируса SARS-CoV-2. Для каждой схемы применения соединений, выполненной в трех повторностях, были определены значения Ct и рассчитаны ΔCt = Ctcv - Cttv, где Ctcv соответствует среднему значению Ct для инфекционного контроля и Cttv - среднее значение Ct для инфицированных образцов после обработки исследуемым соединением.
Анти-SARS-CoV-2 активность исследуемых соединений оценивали по изменению уровня вирусной нагрузки с помощью метода 2-ΔCt [Bovard D. et al. Iota-carrageenan extracted from red algae is a potent inhibitor of SARS-CoV-2 infection in reconstituted human airway epithelia. Biochemistry and Biophysics Reports 29 (2022) 101187], принимая за единицу уровень вирусной нагрузки в образцах инфекционного контроля и рассчитывая относительные изменения для образцов после обработки соединением.
Статистический анализ результатов
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программы «Statistica-10». Для всех данных были подсчитаны средние арифметические значения и их стандартные отклонения. Для определения значимости межгрупповых различий был использован односторонний анализ дисперсии (ANOVA). Уровень статистической значимости был установлен при p≥0,05.
Статистический анализ результатов исследований проводили методами непараметрической статистики, которые включали оценку различий между показателями в контрольной и опытной группах с использованием критерия Вилкоксона для связанных выборок.
Цитотоксическая и противовирусная активность полифенольного комплекса древесины маакии амурской
Оценка цитотоксичности ПФК и РВ, как референсного препарата, проведенная при помощи МТТ-анализа, показала, что исследуемые соединения обладали низкой цитотоксической активностью по отношению к клеткам Vero E6. С помощью регрессионного анализа были рассчитаны 50%-цитотоксические концентрации соединений (CC50), которые снижали жизнеспособность обработанных клеток на 50% по сравнению с контрольными клетками, и определены максимально нецитотоксические концентрации соединений (MNTC), при которых 85 - 90% клеток Vero были жизнеспособны. Для ПФК значения CC50 и MNTC составили 1212±133 мкг/мл и 200±23 мкг/мл, для РВ эти значения были 730±88 и 150±18 мкг/мл соответственно (фиг.1).
В настоящем исследовании анти-SARS-CoV-2 активность полифенольного комплекса и Рибавирина® оценивалась по их способности подавлять размножение вируса при воздействии соединений на разные стадии жизненного цикла вируса в культуре клеток Vero E6.
При изучении противовирусной активности соединений с помощью МТТ-анализа было установлено, что ПФК наиболее эффективно ингибирует репликацию SARS-CoV-2 при непосредственном воздействии на вирус (вирулицидное действие): 50% ингибирующая концентрация (IC50) составила 10,7±1,3 мкг/мл и селективный индекс (SI), свидетельствующий об эффективности и безопасности соединения, был - 113,3±13,6. Рибавирин® не обладал вирулицидным действием.
Высокая противовирусная активность ПФК была зарегистрирована при одновременном воздействии на клетки Vero E6 коронавируса и полифенольного комплекса (IC50 = 28,7±3,7 мкг/мл; SI = 42,2±5,5). Эффективность Рибавирина® при таком способе применения была значимо ниже (IC50 = 207,0±25,0 мкг/мл; SI = 3,5±0,4). При применении ПФК после адсорбции и проникновения SARS-CoV-2 в клетки (через 1 ч после инфицирования) (вирусингибирующее действие) было обнаружено умеренное ингибирование репликации вируса (SI > 10), при этом активность Рибавирина® была низкой (SI > 4). Предварительная обработка клеток ПФК до инфицирования SARS-CoV-2 (профилактическое действие) была малоэффективной (IC50>160 мкг/мл, SI 7,3). Рибавирин® не защищал клетки от вируса при таком способе применения. Результаты представлены в таблице 2.
| Таблица 2 Анти-SARS-CoV-2 активность соединений при различных схемах применения, определенная в МТТ-тесте |
||||||||
| Соединения | Предварительная обработка вируса соединением | Предварительная обработка клеток соединением | Одновременная обработка клеток вирусом и соединением | Обработка инфицированных клеток соединением | ||||
| IC50 мкг/мл | SI | IC50 мкг/мл | SI | IC50 мкг/мл | SI | IC50 мкг/мл | SI | |
| ПФК | 10,7±1,3 | 113,3±13,6 | 165,0±18,2 | 7,3±0,9 | 28,7±3,7* | 42,2±5,5* | 120,4±13,2* | 10,1±1,2* |
| РВ | НА | НА | 207,0±25,0 | 3,5±0,4 | 158,1±17,4 | 4,6±0,6 |
Примечание: ПФК - полифенольный комплекс древесины маакии амурской; IC50 (мкг/мл) - 50%-вирусингибирующая активность соединения; SI - селективный индекс соединения (SI = CC50/IC50); НА - нет активности. *- статистически значимые различия между показателями ПФК и РВ (p≤0,05). В таблице суммированы данные трех экспериментов.
Результаты исследования противовирусной активности изучаемых соединений методом ОТ-ПЦР-РВ представлены в таблице 3 и на фигуре 2.
| Таблица 3 Анти-SARS-CoV-2 активность исследуемых соединений при различных схемах применения, определенная методом ОТ-ПЦР-РВ по пороговому числу циклов (Ct) |
||||
| Соединения | Схемы применения соединений | Ct | -ΔCt | Изменение вирусной нагрузки (2-ΔCt), lg |
| ПФК (200 мкг/мл) | Предварительная обработка вируса соединением | 31,1±3,4 | -13±1,5 | 0,000122 (-3,91) |
| Одновременная обработка клеток вирусом и соединением | 25,6±3,0 | -7,5±0,9 | 0,00552 (-2,26) | |
| Обработка инфицированных клеток соединением | 23,0±2,6 | -4,9±0,5 | 0,033 (-1,48) | |
| Предварительная обработка клеток соединением | 19,2±2,5 | -1,1±0,2 | 0,466 (-0,33) | |
| РВ (150 мкг/мл) | Предварительная обработка вируса соединением | 18,8±2,3 | -0,7±0,1 | 0,325 (-0,49) |
| Одновременная обработка клеток вирусом и соединением | 20,7±2,5 | -2,6±0,3 | 0,165 (-0,78) | |
| Обработка инфицированных клеток соединением | 24,1±2,7 | -6,0±0,8 | 0,0156 (-1,81) | |
| Предварительная обработка клеток соединением | 18,2±2,5 | -0,1±0,02 | 0,933 (-0,03) | |
| Контроль вируса (ДМСО) | - | 18,1±2,2 | 0 | 1,0 (0) |
| Контроль клеток (ДМСО) | - | 37,0±4,1 | -18,9 | 0,000002 (-5,7) |
Примечание: ΔCt = Ctcv - Cttv, где Ctcv соответствует среднему значению Ct для инфекционного контроля и Cttv - среднее значение Ct для инфицированных образцов после обработки исследуемым соединением. Изменения уровня вирусной нагрузки SARS-CoV-2 относительно контроля рассчитаны с помощью метода 2-ΔCt.
Из представленных данных видно, что наиболее эффективное снижение содержания РНК вируса SARS-CoV-2 обнаружено при предварительной обработке вируса максимально нецитотоксической концентрацией ПФК (200 мкг/мл). При такой концентрации ПФК параметр Ct - количество циклов реакции амплификации (удвоения вирусной РНК), которое необходимо для достижения флуоресцентного сигнала, составляет 31,1 циклов удвоения. Значения Ct в контрольных образцах (инфицированные клетки необработанные соединением) составили 18,1. Это означает, что в образцах, обработанных ПФК, для достижения флуоресцентного сигнала, эквивалентного контролю, количество циклов амплификации снизилось в среднем на 13 циклов (ΔCt), и уровень вирусной нагрузки (по сравнению с контролем) значимо снизился на lg3,9 (p≤0,05). При этом применение Рибавирина в максимально нецитотоксической концентрации (150 мкг/мл) незначительно снижало содержание РНК SARS-CoV-2 на lg0,5 по сравнению с контролем (p>0,05). После одновременной обработки клеток SARS-CoV-2 и соединениями величина снижения репликации вируса при применении ПФК составила lg2,3 (p≤0,05), а под воздействием РВ - lg0,78 (p>0,05) относительно контроля.
Применение исследуемых соединений после адсорбции и проникновения SARS-CoV-2 в клетки (через 1 ч после инфицирования) выявило умеренное снижение вирусной нагрузки: на lg1,5(при воздействии ПФК) и на lg1,8 (при применении РВ) по сравнению с контролем (p≥0,05). Предварительная обработка клеток соединениями до инфицирования SARS-CoV-2 была малоэффективной, и снижение вирусной нагрузки было незначительно относительно контроля (p>0,05).
Таким образом, с помощью МТТ-анализа и ОТ-ПЦР-РВ была охарактеризована способность полифенольного комплекса древесины маакии амурской целенаправленно воздействовать на разные этапы жизненного цикла вируса SARS-CoV-2. Установлено, что механизмы, лежащие в основе противовирусного действия заявляемого средства, связаны с прямой инактивацией вирусных частиц и блокированием прикрепления вируса к клеткам.
Применение полифенольного комплекса древесины маакии амурской, активной субстации препарата Максар®, в качестве средства, обладающего противовирусным действием в отношении коронавируса SARS-CoV-2.
