Аптамеры для применения при ингибировании и/или подавлении активации tlr9

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к аптамерам, и может быть использовано в медицине для применения в терапии субъекта для ингибирования или подавления активации TLR9. Применяемый аптамер состоит из последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID No. 1 (GGT TGG TGT GGT TGG). Изобретение обеспечивает ингибирование активации TLR9 в клетке субъекта путем специфического взаимодействия аптамера с TLR9-рецептором. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 5 ил., 3 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к новым молекулам аптамеров для применения при терапии субъекта путем ингибирования или подавления активации TLR9 в клетке, способу ингибирования или подавления активации TLR9 в клетке с использованием таких молекул аптамеров, фармацевтической композиции и набору, содержащему такие молекулы аптамеров, а также применению молекул аптамеров для ингибирования или подавления активации TLR9.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Толл-подобные рецепторы (TLR) присутствуют на многих клетках иммунной системы и продемонстрировали себя вовлеченными во врожденный иммунный ответ (Hornung, V. et al., (2002) J. Immunol. 168:4531-4537). У позвоночных или млекопитающих это семейство состоит из белков, называемых TLR1-TLR10, которые известны для распознавания патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (PAMP) в бактериях, грибках, паразитах и вирусах (Poltorak, a. et al. (1998) Science 282:2085-2088; Underhill, D.M., et al. (1999) Nature 401:811-815; Hayashi, F. et. al (2001) Nature 410:1099-1103; Zhang, D. et al. (2004) Science 303:1522-1526; Meier, A. et al. (2003) Cell. Microbial. 5:561 570; Campos, M.A. et al. (2001) J. Immunol. 167: 416-423; Hoebe, K. et al. (2003) Nature 424: 743-748; Lund, J. (2003) J. Exp. Med. 198:513-520; Heil, F. et al. (2004) Science 303:1526-1529; Diebold, S.S., et al. (2004) Science 303:1529-1531; Hornung, V. et al. (2004) J. Immunol. 173:5935-5943).

TLR являются ключевыми средствами, благодаря которым млекопитающие распознают и вызывают иммунный ответ на чужеродные молекулы, а также обеспечивают средство, благодаря которому связаны врожденные и адаптивные иммунные ответы (Akira, S. et al. (2001) Nature Immunol. 2:675-680; Medzhitov, R. (2001) Nature Rev. Immunol. 1:135-145). Также было показано, что TLR играют роль в патогенезе многих заболеваний, в том числе аутоиммунности, инфекционного заболевания и воспаления (Cook, D.N. et al. (2004) Nature Immunol. 5:975-979), а регуляция TLR-опосредованной активации с использованием подходящих агентов может предоставить средство для помощи при заболевании. Кроме того, активация TLR9 в предшественниках плазмоцитоидных дендритных клеток (PDC) и B-клетках посредством собственных нуклеиновых кислот играет существенную роль в патогенезе системной красной волчанки (SLE).

Будучи частью защиты от вне- и внутриклеточных патогенов, TLR находятся на поверхности клетки, но также и внутри клетки. Тогда как TLR2, 4, 5 и 6 являются рецепторами, находящимися на поверхности клетки, которые защищают клетку от внеклеточных патогенов, TLR3, 7, 8 и 9 в целом находятся внутри клетки для поддержания защиты от внутриклеточных патогенов (Dowling and Dellacasagrande, 2016) Dowling, J.K. and Dellacasagrande, J. (2016) Methods Mol. Biol. Clifton NJ 1390, 3-27), (Diebold, S.S. et al. (2004) Science 303:1529-1531; Liew, F. et al. (2005) Nature 5:446-458; Hemmi H et al. (2002) Nat Immunol 3:196-200; Jurk M et al., (2002) Nat Immunol 3:499; Lee Jet al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:6646-6651); (Alexopoulou, L. (2001) Nature 413:732-738).

Было показано, что некоторые неметилированные CpG-мотивы, присутствующие в бактериальной и синтетической ДНК, активируют иммунную систему и индуцируют противоопухолевую активность через TLR9 (Tokunaga T et al., J. Natl. Cancer Inst. (1984) 72:955-962; Shimada S, et al., Jpn. H cancer Res, 1986, 77, 808-816; amamoto S, et al., Jpn. J. Cancer Res., 1986, 79, 866-73). В отличие от этого, ДНК млекопитающего в целом не имеет иммуностимулирующей активности очевидно ввиду низкой частоты CG-последовательностей и ввиду того, что большинство CG- последовательностей имеют метилированный цитозин. Таким образом, создается впечатление, что клетки иммунной системы млекопитающего различают бактериальную ДНК от собственной ДНК через TLR9-рецептор.

Другие исследования с использованием антисмысловых олигонуклеотидов, содержащих CpG-динуклеотиды, показывают стимулирование иммунных ответов (Zhao Q, et al. (1996) Biochem.Pharmacol. 26:173-182). Последующие исследования продемонстрировали, что TLR9 распознает неметилированные CpG-мотивы, присутствующие в бактериальной и синтетической ДНК (Hemmi, H. et al. (2000) Nature 408:740-745).

Другие модификации CpG-содержащих тиофосфатных олигонуклеотидов также могут воздействовать на их способность действовать в качестве модуляторов иммунного ответа через TLR9 (см., например, Zhao et al., Biochem. Pharmacol. (1996) 51:173-182; Zhao et al. (1996) Biochem Pharmacol. 52:1537-1544; Zhao et al. (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7:495-502; Zhao et al (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:3453-3458; Zhao et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:1051-1054; Yu, D. et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:2585-2588; Yu, D. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. Lett. 11:2263-2267; и Kandimalla, E. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813).

В дополнение, исследования связи структура-активность обеспечили идентификацию синтетических мотивов и новые соединения на основе ДНК, которые индуцируют специфические профили иммунного ответа, которые отличаются от тех, которые исходят от неметилированных CpG-динуклеотидов (Kandimalla, E. et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. US A 102:6925-6930. Kandimalla, E. et al. (2003) Proc. Nat. Acad. Sci. US A 100:14303-14308; Cong, Y. et al. (2003) Biochem Biophys Res. Commun. 310: 1133-1139; Kandimalla, E. et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 306:948-953; Kandimalla, E. et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2393-2400; Yu, D. et al. (2003) Bioorg. Med. Chem.11 :459-464; Bhagat, L. et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun.300:853-861; Yu, D. et al. (2002) Nucleic Acids Res.30:4460-4469; Yu, D. et al. (2002) J. Med. Chem.45:4540-4548. Yu, D. et al. (2002) Biochem. Biophys. Res. Commun.297:83-90; Kandimalla. E. et al. (2002) Bioconjug. Chem.13:966-974; Yu, D. et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30:1613-1619; Yu, D. et al. (2001) Bioorg. Med. Chern. 9:2803-2808; Yu, D. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. Lett. 11:2263-2267; Kandimalla, E. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813; Yu, D. et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:2585-2588; Putta, M. et al. (2006) Nucleic Acids Res. 34:3231-3238).

Тогда как активация TLR вовлечена в формирование иммунного ответа, неконтролируемая стимуляция иммунной системы через TLR может усугубить некоторые заболевания, например, у субъектов с ослабленным иммунитетом. Таким образом, в случаях в целом или специфично увеличенного иммунного ответа, вызванного активацией TLR9, может быть желательным применение TLR9- антагонистов.

За последние годы несколько групп показали использование синтетических олигодезоксиолигонуклеотидов (ODN), действующих в качестве ингибиторов воспалительных цитокинов (Lenert, P. et al. (2003) DNA Cell Biol. 22(10):621-631).

Используя некоторые синтетические ODN, Lenert et al. сообщили о способности получения ингибирующих ODN (Lenert, P. et al. (2003) DNA Cell Biol. 22(10):621-631). Эти ингибирующие ODN требуют две триплетные последовательности, проксимальный «CCT»-триплет и дистальный «GGG»-триплет. В дополнение к этим триплет-содержащим ингибирующим ODN несколько групп сообщили о других специфичных ДНК последовательностях, который могут ингибировать TLR9-опосредованную активацию посредством CpG-содержащих ODN. Эти «ингибирующие» или «подавляющие» мотивы богаты поли-«G»- (например, «GGGG») или «CG»-последовательности, имеют тенденцию быть метилированными и присутствуют в ДНК млекопитающих и некоторых вирусов (см., например, Chen, Y., et al., Gene Ther. 8: 1024-1032 (2001); Stunz, L.L., Eur. J. Immunol. 32: 1212-1222 (2002).

Duramad, O., et al., J. Immunol., 174: 5193-5200 (2005) и заявка на выдачу патента США US 2005/0239733 описывают структуру ингибирующих ДНК- олигонуклеотидов, содержащих GGGG-мотив в пределах последовательностей. Patole et al. демонстрируют, что GGGG, содержащий ODN, будет подавлять системную волчанку (Patole, P. et al. (2005) J. Am. Soc. Nephrol. 16:3273-3280). Дополнительно, Gursel, I., et al., J. Immunol., 171: 1393-1400 (2003) описывают повторяющиеся TTAGGG-элементы, которые присутствуют с высокой частотой в теломерах млекопитающих и даун-регулируют CpG-индуцированную иммунную активацию. Shirota, H., et al., J. Immunol., 173: 5002-5007 (2004) демонстрируют, что синтетические олигонуклеотиды, содержащие TTAGGG-элемент, имитируют эту активность и могут быть эффективными в профилактике/лечении некоторых Th1-зависимых аутоиммунных заболеваний.

В заявке на выдачу патента США US 11/549,048 раскрыт новый класс TLR- антагонистов, которые не требуют поли-G-последовательности. Kandimalla et al. также описывает применение этих новых композиций для лечения и профилактики различных заболеваний и расстройств (11/549,048; 11/743,876; 12/140,334; 12/140,338; 12/244,199).

Однако остается проблема, заключающаяся в разработке дополнительных TLR-антагонистов, которые не требуют поли-G-последовательности. Количество TLR9-антагонистов все еще достаточно ограничено, а их эффективность и безвредность для применения на людях и животных по-прежнему требует подтверждения. Поэтому желательно располагать дополнительными TLR9-антагонистами, которые показывают преимущественные профили ингибирования.

Такие новые специально разработанные соединения и композиции найдут применения во многих клинически релевантных сферах применения, в том числе лечении и профилактике, например, заболеваний и расстройств со стимулирующим иммунитет компонентом, а также боли и воспалении. Такие соединения и композиции в настоящее время испытывают на эффективность при астме и аллергических ринитах или других аллергических состояниях (Basith S, Manavalan B, Lee G, Kim SG, Choi S. «Toll-like receptor modulators: a patent review (2006-2010).» Expert Opin Ther Pat. Jun 2011: 927-944.).

Намного больше заболеваний было ассоциировано с нежелательной или неестественной активацией TLR9 у пациентов. Также было известно, что сердечные фибробласты переносят TLR9-рецептор и что активация сердечного фибробласта TLR9-рецепторов, по всей видимости, вовлечена в патологические состояния сердца, такие как миокардиты, поддерживая патологическое состояние (Ohm IK, Alfsnes K, Belland Olsen M, Ranheim T, Sandanger ∅, Dahl TB, Aukrust P, Finsen AV, Yndestad A, Vinge LE. «Toll-like receptor 9 mediated responses in cardiac fibroblasts» PLoS One. No date: e104398.).

Блокада, подавление или ингибирование активации TLR9 в таких случаях может показать терапевтический эффект, что уже наблюдается с IRS 954 от Dynavax при экспериментальной волчанке (Pawar RD1, Ramanjaneyulu A, Kulkarni OP, Lech M, Segerer S, Anders HJ. «Inhibition of Toll-like receptor-7 (TLR-7) or TLR-7 plus TLR-9 attenuates glomerulonephritis and lung injury in experimental lupus.» J Am Soc Nephrol. Jun 2007: 1721-1731.).

В настоящее время доступно лишь очень ограниченное количество аптамеров, которые могут быть использованы для регуляции активации TLR9, например, при аутоиммунных заболеваниях, и их эффективность и безвредность для применения на пациентах-людях по-прежнему требует подтверждения. Поэтому желательно располагать дополнительными олигонуклеотидными последовательностями, которые ингибируют или подавляют активацию TLR9.

Следовательно, задача настоящего изобретения заключается в предоставлении новых антагонистов для применения при терапии субъекта путем ингибирования или подавления активации TLR9 в клетке.

Кроме того, другая задача настоящего изобретения заключается в предоставлении способа ингибирования или подавления активации TLR9 с использованием новых TLR9-антагонистов.

Также, задача настоящего изобретения заключается в предоставлении фармацевтической композиции и набора, содержащих новые TLR9-антагонисты.

Еще одна задача настоящего изобретения заключается в предоставлении применения новых TLR9-антагонистов для ингибирования или подавления активации TLR9.

РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данная задача решается аспектами настоящего изобретения, как раскрыто далее в настоящем документе.

В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения, представлен аптамер для применения в терапии субъекта путем ингибирования или подавления активации TLR9 в клетке.

В предпочтительном варианте реализации первого аспекта изобретения субъектом является млекопитающее, предпочтительно, субъектом является человек.

В другом предпочтительном варианте реализации первого аспекта изобретения клетка, подлежащая контакту, или субъект, подлежащий лечению, демонстрирует сверхэкспрессию TLR9 и/или сверхактивность TLR9-опосредованного сигналинга.

Еще в одном другом предпочтительном варианте реализации первого аспекта изобретения клетку и/или субъекта, подлежащего лечению, тестируют на сверхэкспрессию TLR9 и/или сверхактивность TLR9-опосредованного сигналинга перед ингибированием активации TLR9 в клетке и/или субъекте.

В предпочтительном варианте реализации первого аспекта изобретения клетка представляет собой глиальную клетку, микроглиальную клетку, астроцит, макрофаг, B-клетку и/или дендритную клетку, предпочтительно, плазмацитоидную дендритную клетку.

В другом предпочтительном варианте реализации первого аспекта изобретения субъект страдает от расстройства, выбранного из аутоиммунного расстройства, воспалительного расстройства, аутоиммунной болезни соединительной ткани (ACTD) и/или нейродегенеративного расстройства, предпочтительно, расстройство выбрано, но без ограничения, из псориаза, ревматоидного артрита, универсальной алопеции, острого рассеянного энцефаломиелита, болезни Аддисона, аллергии, анкилозирующего спондилита, синдрома антифосфолипидных антител, артериосклероза, атеросклероза, аутоиммунной гемолитической анемии, аутоиммунного гепатита, буллезного пемфигоида, болезни Шагаса, хронической обструктивной болезни легких, глютеновой болезни, кожной красной волчанки (CLE), дерматомиозита, сахарного диабета, дилатационной кардиомиопатии (DCM), эндометриоза, синдрома Гудпасчера, болезни Грейвса, синдрома Гийена-Барре, болезни Хашимото, гнойного гидраденита, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, воспалительного заболевания кишечника, интерстициального цистита, локализованной склеродермии, множественного склероза (MS), миастении гравис, миокардита, нарколепсии, нейромиотонии, пемфигуса, злокачественной анемии, полимиозита, первичного билиарного цирроза, ревматоидного артрита (RA), шизофрении, синдрома Шегрена, системной красной волчанки (SLE), системного склероза, темпорального артериита, васкулита, витилиго, вульводинии, гранулематоза Вегенера, травматической боли, нейропатической боли и токсичности от ацетаминофена.

В педпочтительном варианте реализации первого аспекта изобретения субъект страдает от опухоли/рака, предпочтительно, опухоль/рак выбран из группы, состоящей из рака молочной железы, сквамозно-клеточной карциномы шейки матки, карциномы желудка, глиомы, гепатоклеточной карциномы, рака легких, меланомы, рака простаты, рекуррентной глиобластомы, рекуррентной неходжкинской лимфомы, рака толстой и прямой кишки.

В одном предпочтительном варианте реализации первого аспекта изобретения аптамер содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID No. 1 (GGT TGG TGT GGT TGG) и/или последовательность нуклеиновой кислоты, являющуюся по меньшей мере на 80% идентичной SEQ ID No. 1.

В соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения представлен способ ингибирования или подавления активации TLR9 в клетке, включающий приведение клетки, экспрессирующей TLR9, в контакт с аптамером.

В предпочтительном варианте реализации второго аспекта изобретения способ выполняют in vitro/ex vivo.

В другом предпочтительном варианте реализации второго аспекта изобретения способ дополнительно включает предшествующий этап тестирования клетки на сверхэкспрессию TLR9 и/или сверхактивность TLR9-опосредованного сигналинга.

В предпочтительном варианте реализации второго аспекта изобретения клетка представляет собой клетку млекопитающего, предпочтительно, клетка представляет собой клетку человека.

В одном предпочтительном варианте реализации второго аспекта изобретения аптамер содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID No. 1 (GGT TGG TGT GGT TGG) и/или последовательность нуклеиновой кислоты, являющуюся по меньшей мере на 80% идентичной SEQ ID No. 1.

В соответствии с третьим аспектом настоящего изобретения представлена фармацевтическая композиция, содержащая аптамер для применения в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.

В соответствии с четвертым аспектом настоящего изобретения представлен набор, содержащий по меньшей мере один аптамер для применения в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения и контейнер.

В соответствии с пятым аспектом настоящего изобретения представлено применение аптамера, определенного в настоящем документе, для ингибирования или подавления активации TLR9.

В предпочтительном варианте реализации пятого аспекта изобретения аптамер применяют in vitro/ex vivo.

ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фигуре 1 показано ингибирование активации TLR9 в ODN 2006 (TLR9- агонист)-стимулированных HEK-Blue™ hTLR9-клетках путем добавления повышающихся концентраций (в мкМ) аптамера SEQ ID No. 1 (серые столбцы). Потенциальные свойственные эффекты от повышающихся концентраций аптамера SEQ ID No. 1 на активацию TLR9 при отсутствии стимуляции TLR9-агонистом ODN 2006 (SEQ ID No. 2) были исследованы и показаны в виде черных полос. Изменения оптической плотности вызваны TLR9-активированной экспрессией щелочной фосфатазы.

На фигуре 2 показаны эффекты от повышающихся концентраций аптамера SEQ ID No. 1 (в мкМ) на HEK-Blue™ TNF-α клетки, стимулированные 100 нг TNF-α (серые столбцы), и при отсутствии стимуляции TNF-α (черные столбцы). Изменения оптической плотности вызваны TNF-α-активированной экспрессией щелочной фосфатазы.

На фигуре 3 показано ингибирование активации TLR9 в ODN 2006 (TLR9- агонист)-стимулированных HEK-Blue™ hTLR9-клетках путем добавления повышающихся концентраций (в мкМ) аптамера SEQ ID No. 3 (серые столбцы). Потенциальные свойственные эффекты от повышающихся концентраций аптамера SEQ ID No. 3 на активацию TLR9 при отсутствии стимуляции TLR9-агонистом ODN 2006 (SEQ ID No. 2) были исследованы и показаны в виде черных полос. Изменения оптической плотности вызваны TLR9-активированной экспрессией щелочной фосфатазы.

На фигуре 4 показаны эффекты от повышающихся концентраций аптамера SEQ ID No. 3 (в мкМ) на HEK-Blue™ TNF-α клетки, стимулированные 100 нг TNF-α (серые столбцы), и при отсутствии стимуляции TNF-α (черные столбцы). Изменения оптической плотности вызваны TNF-α-активированной экспрессией щелочной фосфатазы.

На фигуре 5 показано ингибирование активации TLR9 в ODN 2006 (TLR9- агонист)-стимулированных HEK-Blue™ hTLR9-клетках путем добавления повышающихся концентраций (в нг) TLR9-антагониста CpG ODN TTAGGG (SEQ ID No. 4; изображены в виде серых столбцов). Потенциальные свойственные эффекты от повышающихся концентраций CpG ODN TTAGGG (SEQ ID No. 4) на активацию TLR9 при отсутствии стимуляции TLR9-агонистом ODN 2006 (SEQ ID No. 2) были исследованы и показаны в виде черных полос. Изменения оптической плотности вызваны TLR9-активированной экспрессией щелочной фосфатазы.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано на идентификации новых олигонуклеотидов неожиданной структуры и нуклеотидной композиции, которые способны взаимодействовать с, а также ингибировать и подавлять активацию TLR9-рецептора в эукариотических клетках.

До настоящего момента из уровня техники было известно только очень ограниченное количество аптамеров, которые, как казалось, обладают антагонистическим действием с TLR9-рецептором. Некоторые общие структурные мотивы лежат в основе ранее известных антагонистических олигонуклеотидов. Однако в некоторых случаях эти общие структуры могут вносит вклад в сниженную биодоступность и/или другие трудности ввиду строгих требований в отношении фармацевтического применения аптамеров при терапии, например, пациентов-людей. Для этой цели было очень желательным обеспечить дополнительные, структурно отличающиеся аптамеры для применения в нацеленной модуляции активации TLR9.

Авторами изобретения сейчас впервые были обнаружены заявленные аптамеры в качестве антагонистов TLR9, которые отличаются от структурных мотивов олигонуклеотидов, широко известных своим антагонистическим действием на TLR9- рецептор. Таким образом, теперь стало возможным обеспечение структурно новых олигонуклеотидов в качестве антагонистов TLR9.

В соответствии с одним предпочтительным вариантом реализации настоящего изобретения субъектом, у которого активация TLR9 подлежит ингибированию или подавлению, является позвоночное, более предпочтительно, субъектом является млекопитающее. Согласно смыслу настоящего изобретения, группа млекопитающих включает, но без ограничения, крыс, мышей, кроликов, кошек, собак, лошадей, крупный рогатый скот, коров, свиней, овец, приматов, не являющихся людьми, и людей. Более предпочтительно, субъектом является человек.

В контексте настоящего изобретения следует понимать, что любое раскрытие, в котором сделана ссылка только на «субъекта», дополнительно может трактоваться как такое же раскрытие, ссылающееся на «клетку», и наоборот, если только специалист в данной области техники не расценит, что такое раскрытие не несет какого-либо технического смысла.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна клетка, подлежащая контакту с аптамерами изобретения, демонстрирует сверхэкспрессию TLR9. Таким образом, субъект, подлежащий лечению аптамерами, в соответствии с изобретением, демонстрирует сверхэкспрессию TLR9 по меньшей мере в некоторых клетках этого субъекта. Более предпочтительно, субъект, подлежащий лечению, страдает от расстройства и/или симптомов, вызванных сверхэкспрессией TLR9 по меньшей мере в некоторых клетках указанного субъекта.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна клетка, подлежащая контакту с аптамерами изобретения, проявляет сверхактивность TLR9-опосредованного сигналинга. Это может означать, что субъект, подлежащий лечению аптамерами изобретения, демонстрирует сверхактивность TLR9-опосредованного сигналинга по меньшей мере в некоторых клетках этого субъекта. Более предпочтительно, субъект, подлежащий лечению, страдает от расстройства и/или симптомов, вызванных сверхактивностью TLR9-опосредованного сигналинга по меньшей мере в некоторых клетках указанного субъекта.

В соответствии с одним предпочтительным вариантом реализации настоящего изобретения клетку и/или субъекта, подлежащего лечению, тестируют на сверхэкспрессию TLR9 и/или сверхактивность TLR9-опосредованного сигналинга перед ингибированием активации TLR9 в клетке и/или субъекте. Таким образом, в соответствии с другим предпочтительным вариантом реализации настоящего изобретения клетки и/или субъекты, подлежащие лечению, были охарактеризованы как демонстрирующие сверхэкспрессию TLR9 и/или сверхактивность TLR9- опосредованного сигналинга перед вхождением в контакт с аптамерами изобретения, или лечением ими.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом реализации настоящего изобретения субъект, подлежащий лечению, имеет положительный результат теста на сверхэкспрессию TLR9 и/или сверхактивность TLR9-опосредованного сигналинга.

В спектр возможностей специалиста в данной области техники входит достоверное тестирование и определение того, демонстрирует ли клетка или субъект сверхэкспрессию TLR9 и/или сверхактивность TLR9-опосредованного сигналинга. В данном контексте, в качестве примера, ссылка делается на раскрытие Deering and Orange, Clin Vaccine Immunol. 2006 Jan;13(1):68-76. В нем представлены способы оценки экспрессии TLR9 и/или активности TLR9-опосредованного сигналинга. Дополнительные свидетельства касательно оценки экспрессии/активности TLR9, образующие часть уровня техники, могут быть взяты из разработки «TLR9 Test Strip 2216» от Invivogen, Сан Диего, Калифорния, Соединенные Штаты Америки.

В соответствии с одним предпочтительным вариантом реализации настоящего изобретения предполагается сверхэкспрессия TLR9 и/или сверхактивность TLR9- опосредованного сигналинга, если TLR9-опосредованная продукция TNFα увеличена выше эталонного значения для здоровых субъектов. В соответствии с предпочтительным вариантом реализации значение для субъекта, подлежащего лечению, определяется следующим образом:

Определение сверхэкспрессии TLR9 и/или сверхактивности TLR9- опосредованного сигналинга посредством применения TLR9-опосредованной продукции TNFα в качестве суррогатного параметра.

Выделение TLR9-переносящих мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC)

Для оценки состояния TLR9 у пациента, PBMC пациентов, которые переносят рецептор TLR9-рецептор, выделяют из образца гепаринизированной крови с помощью разделения по градиенту плотности Ficoll-Paque Plus (Amersham Biosciences, Уппсала, Швеция). Выделенные PBMC ресуспендируются в RPMI (GIBCO/BRL, Гранд-Айленд, Нью-Йорк), содержащем 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS; HyClone, Логан, Юта), 0,1 мкмоль заменимых аминокислот, 10 мМ HEPES, 1 мМ пирувата натрия, 50 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл сульфата стрептомицина и 2 мМ L-глутамина (GIBCO/BRL), которые совместно называются R10-FBS.

Все среды фильтруются через одноразовый фильтр 0,2 мкм (Millipore, Биллерика, Массачусетс) после приготовления. PBMC могут быть криоконсервированы путем ресуспендирования клеток в стерилизованной через фильтр 0,2 мкм FBS, содержащей 10% диметил сульфоксида (DMSO; Fisher Scientific, Фьер-Лоун, Нью-Джерси), в 1-мл полипропиленовом флаконе, содержащем неопреновую прокладку (Corning, Корнинг, Нью-Йорк). Температуру флаконов постепенно понижают на приблизительно 1°C/мин с помощью метанол-содержащего немеханического прибора для криоконсервации (Nalgene, Рочестер, Нью-Йорк) в морозильной камере при -80°C. Перед быстрым размораживанием для использования в эксперименте клетки хранятся в жидком азоте.

После размораживания определяют жизнеспособность клетки с помощью вытеснения трипанового синего (GIBCO/BRL) и любой образец с жизнеспособностью <95% исключают.

Провоцирование агонист(лиганд)-опосредованного TLR9-ответа на PBMC

Активность TLR9 может быть оценена при инкубации TLR9-рецептор- содержащих PBMC со специфическим агонистом/лигандом ODN 2216. Для провоцирования TLR9-ответа, 2×10⁵ PBMC в 100 мкл R10-FBS добавляют в каждую из двойных лиганд-содержащих (40 мкг ODN 2216/мл, 100 мкл/лунку) или содержащих контрольную среду лунок и инкубируют при 37°C в течение 24 ч с 5% CO2. Свободную от лиганда среду используют для определения базовой линии продукции TNFα.

Оценка количества образованных TNFα посредством иммунноферментного анализа (ELISA)

Количество TNFα, образованных PBMC, провоцированными ODN 2216, в крови пациентов или контрольных субъектов оценивалось TNFα-специфичной технологией ELISA.

Для этой цели микротитрационные планшеты Immulon (ThermoLabSystems, Франклин, Массачусетс) инкубировали в течение ночи при 4°C со 100 мкл моноклонального иммобилизованного антитела человека против TNFα человека (BD Biosciences) в покрывающем буфере (0,1 М карбоната натрия, pH 9,5). После удаления супернатанта планшеты трижды промывали фосфатно-буферным раствором (PBS) с 0,05% Tween 20 (PBST), pH 7,4, а затем блокировали посредством PBS, содержащим 10% альбумина бычьей сыворотки, pH 7,0, в течение 1 ч при комнатной температуре.

Супернатанты из индивидуальных лунок TLR9 лиганд-стимулированных PBMC переносят в индивидуальные покрытые антителом лунки.

Предпочтительно разводить супернатанты двукратно непосредственно в покрытых антителом лунках, так что количество измеренных TNFα в любом случае попадает в пределы диапазона стандартной кривой TNFα. Стандартный препарат TNFα с серийным разведением служит в качестве стандартной кривой (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота).

После загрузки образца и стандартной кривой, планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч с последующими пятью промываниями с помощью PBST. Для обнаружения захваченного TNFα, в каждую лунку должно быть добавлено 100 мкл биотинилированного моноклонального сэндвич-антитела против TNFα человека (BD Biosciences) вместе с конъюгатом пероксидазы авидина-хрена (BD Biosciences) и планшеты должны быть инкубированы в течение 1 ч при комнатной температуре.

После промывания пять раз PBST и инкубации с 100 мкл тетраметилбензидина плюс субстратный раствор перекиси водорода в течение 30 мин при комнатной температуре колориметрическую реакцию останавливают путем добавления 50 мкл 1 М серной кислоты. Поглощаемость считывают при 450 нм с помощью спектрофотометра микротитрационного планшета (Biotek, Уинуски, Вермонт).

В соответствии с одним конкретным вариантом реализации настоящего изобретения значение TNFα, определенное в соответствии со способом, описанным выше в настоящем документе для субъекта, подлежащего лечению, составляет по меньшей мере 50 пг/мл, предпочтительно, по меньшей мере 60 пг/мл, более предпочтительно, по меньшей мере 75 пг/мл, еще более предпочтительно, по меньшей мере 90 пг/мл, еще более предпочтительно, по меньшей мере 100 пг/мл, еще более предпочтительно, по меньшей мере 110 пг/мл, еще более предпочтительно, по меньшей мере 125 пг/мл, еще более предпочтительно, по меньшей мере 150 пг/мл, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 175 пг/мл.

В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения клетка, подлежащая контакту с аптамерами изобретения, представляет собой глиальную клетку, микроглиальную клетку, астроцит, макрофаг, B-клетку и/или дендритную клетку, более предпочтительно, плазмацитоидную дендритную клетку. В соответствии с другим более предпочтительным вариантом реализации клетка, подлежащая контакту, представляет собой глиальную клетку в центральной нервной системе.

В одном предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения субъект имеет расстройство, выбранное из аутоиммунного расстройства, воспалительного расстройства, аутоиммунной болезни соединительной ткани (ACTD) и/или нейродегенеративного расстройства, более предпочтительно, расстройство выбрано, но без ограничения, из псориаза, ревматоидного артрита, универсальной алопеции, острого рассеянного энцефаломиелита, болезни Аддисона, аллергии, анкилозирующего спондилита, синдрома антифосфолипидных антител, артериосклероза, атеросклероза, аутоиммунной гемолитической анемии, аутоиммунного гепатита, буллезного пемфигоида, болезни Шагаса, хронической обструктивной болезни легких, глютеновой болезни, кожной красной волчанки (CLE), дерматомиозита, сахарного диабета, дилатационной кардиомиопатии (DCM), эндометриоза, синдрома Гудпасчера, болезни Грейвса, синдрома Гийена-Барре, болезни Хашимото, гнойного гидраденита, идиопатическй тромбоцитопенической пурпуры, воспалительного заболевания кишечника, интерстициального цистита, локализованной склеродермии, множественного склероза (MS), миастении гравис, миокардита, нарколепсии, нейромиотонии, пемфигуса, злокачественной анемии, полимиозита, первичного билиарного цирроза, ревматоидного артрита (RA), шизофрении, синдрома Шегрена, системной красной волчанки (SLE), системного склероза, темпорального артериита, васкулита, витилиго, вульводинии, гранулематоза Вегенера, травматической боли, нейропатической боли и токсичности от ацетаминофена.

В более предпочтительном варианте реализации субъект страдает от аутоиммунного расстройства, выбранного из группы, включающей системную красную волчанку, множественный склероз, артериосклероз, воспалительное заболевание кишечника, сахарный диабет, аллергию и рак, в частности, аутоиммунный диабет.

В другом более предпочтительном варианте реализации субъект страдает от аутоиммуного расстройства, которое ассоциировано с присутствием GPCR- аутоантител, еще более предпочтительно, аутоиммунное расстройство выбрано из группы, содержащей кардиомиопатию, дилатационную кардиомиопатию (DCM), ишемическую кардиомиопатию (iCM), перипартальную кардиомиопатию (PPCM), идиопатическую кардиомиопатию, кардиомиопатию Шагаса, кардиомиопатию, индуцированную химиотерапией, мегаколон Шагаса, мегаэзофагус Шагаса, нейропатию Шагаса, доброкачественную гиперплазию предстательной железы, склеродерму, синдром Рейно, окклюзионную болезнь периферийных артерий (PAOD), пре-экламзию, отторжение аллотрансплантата почки, миокардит, глаукому, гипертензию, легочную гипертензию, злокачественную гипертензию, метаболический синдром, алопецию, очаговую алопецию, мигрень, болезнь Паркинсона, эпилепсию, кластерную головную боль, множественный склероз, депрессию, региональный болевой синдром, нестабильную стенокардию, системную красную волчанку (SLE), шизофрению, синдром Шегрена, периодонтит, атриальную фибрилляцию, витилиго, гемолитический уремический синдром, синдром мышечной скованности, врожденную блокаду сердца, сахарный диабет I типа, псориаз, болезнь Альцгеймера, патологическую усталость, нейродерматит, ренальную болезнь почек, амиотрофический латеральный склероз (ALS), атрофию зрительного нерва Лебера (синдром LHON), аллергическую астму, аритмию, рефрактерную гипертензию, сахарный диабет II типа, сосудистую деменцию, мегаколон, не являющийся таковым Шагаса, и/или ортостатическую гипертензию.

В другом более предпочтительном варианте реализации субъект страдает от патологического состояния сердца, в частности, от дилатационной кардиомиопатии и/или миокардита.

В другом более предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения субъект страдает от нейропатической боли, являющейся результатом воздействия сахарного диабета или лекарственных препаратов для химиотерапии на нервы, травмы, хирургических процедур, артрита, СПИДа, травм от ожогов, заболевания церебрального или поясничного отдела позвоночника, фибромиалгии, постишемической боли, опухолей, вирусной невралгии, синдрома симпатической рефлекторной дистрофии, фантомной боли и боли после ампутации, постгерпетической невралгии, комплексного регионарного болевого синдрома или центрального болевого синдрома.

В другом более предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения субъект страдает от воспалительного расстройства, такого как ревматоидный артрит, спондилоартропатии, подагрический артрит, остеоартрит, системная красная волчанка или ювенильный артрит. В другом более предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения субъект страдает от воспаления, ассоциированного с астмой, аллергическим ринитом, заболеваниями носовых пазух, бронхитом, туберкулезом, острым панкреатитом, сепсисом, инфекционными заболеваниями, менструальными спазмами, преждевременными родами, тендинитом, бурситом, связанными с кожей состояниями, такими как псориаз, экзема, атопический дерматит, уртикария, дерматит, контактный дерматит и ожоги, или от послеоперационного воспаления, в том числе от офтальмологической хирургической операции, такой как хирургическая операция на катаракте и рефракционная хирургическая операция, сосудистых заболеваний, мигреневых головных болей, узелкового периартериита, тиреоидита, апластической анемии, болезни Ходжкина, склеродомы, ревматической лихорадки, сахарного диабета I типа, болезни нейромышечного соединения, в том числе миастении гравис, заболевания белого вещества, в том числе множественного склероза, саркоидоза, нефротического синдрома, синдрома Бехчета, полимиозита, гингивита, нефрита, гиперчувствительности, припухлости, появившейся после травмы, ишемии миокарда, аллергического ринита, респираторный дистресс-синдром, синдрома системной воспалительной реакции (SIRS), воспаления, связанного с раком, снижения опухоль- ассоциированного ангиогенеза, синдрома эндотоксического шока, атеросклероза, офтальмологического заболевания, такого как ретинит, ретинопатии, увеит, глазная фотофобия или острая травма ткани глаза, воспаления легких, такого как ассоциированного с вирусными инфекциями или кистозным фиброзом, хронической обструктивной болезни легких или острым респираторным дистресс-синдромом, отторжения ткани, расстройств «трансплантат против хозяина», гиперчувствительности задержанного типа, а также иммуноопосредованных и воспалительных элементов заболеваний ЦНС, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, множественный склероз.

В другом предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения субъект страдает от опухоли/рака, предпочтительно, опухоль/рак выбран из группы, состоящей из рака молочной железы, сквамозно-клеточной карциномы шейки матки, карциномы желудка, глиомы, гепатоклеточной карциномы, рака легких, меланомы, рака простаты, рекуррентной глиобластомы, рекуррентной неходжкинской лимфомы, рака толстой и прямой кишки.

В другом более предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения субъект страдает от острого лимфобластного лейкоза, острого миелоцитарного лейкоза, адренокортикальной карциномы, рака, связанного со СПИДом, лимфомы, связанной со СПИДом, рака анального канала, рака аппендикса, астроцитомы (детской церебеллярной или церебральной), базальноклеточной карциномы, рака желчного протока, рака мочевого пузыря, рака костей, глиомы ствола головного мозга, опухолей головного мозга (церебеллярной астроцитомы, церебральной астроцитомы/злокачественной глиомы, эпендимомы, медуллобластомы, супратенториальных примитивных нейроэктодермальных опухолей, глиомы зрительного пути и гипоталамической глиомы), рака молочной железы, бронхиальных аденом/карциноидов, лимфомы Беркитта, карциноидных опухолей (детских, желудочно-кишечных), карциномы неизвестной первичной локализации, лимфомы центральной нервной системы (первичной), церебеллярной астроцитомы, церебральной астроцитомы/злокачественной глиомы, рака шейки матки, детского рака, хронического лимфоцитарного лейкоза, хронического миелолейкоза, хронических миелопролиферативных нарушений, рака толстой кишки, кожной Т-клеточной лимфомы, десмопластической мелкокруглоклеточной опухоли, рака эндометрия, эпендимомы, рака пищевода, саркомы Юинга из семейства опухолей Юинга, экстракраниальной герминогенной опухоли (детской), внегонадной герминогенной опухоли, рака внепеченочного желчного протнгока, глазного рака (интраокулярной меланомы, ретинобластомы), рака желчного пузыря, желудочного рака (желудка), карциноидальной опухоли желудочно-кишечного тракта, стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта, герминогенных опухолей (детских экстракраниальных, внегонадных, овариальных), гестационной трофобластической опухоли, глиом (взрослых, ствола головного мозга у детей, детской церебральной астроцитомы, зрительного пути и гипоталамических у детей), карциноида желудка, волосяноклеточного лейкоза, рака головы и шеи, печеночноклеточного рака (печени), лимфомы Ходжкина, гипофарингиального рака, гипоталамической глиомы и глиомы зрительных путей (у детей), интраокулярной меланомы, карциномы островковых клеток, саркомы Капоши, рака почек (почечно-клеточного рака), рака гортани, лейкозов (острого лимфобластического, острого миелоидного, хронического лимфотического, хронического миелогенного, волосяноклеточного), рака губы и ротовой полости, рака печени (первичного), рака легких (немелкоклеточного, мелкоклеточного), лимфом (связанных со СПИДом, Беркета, кожных Т-клеточных, Ходжкина, неходжкинских, первичных в центральной нервной системе), макроглобулинемии (Вальденстрема), злокачественной фиброзной гистиоцитомы кости/остеосаркомы, медуллобластомы (у детской), меланомы, интраокулярной меланомы, карциномы клеток Меркеля, мезотелиом (взрослых злокачественных, детских), метастатического сквамозного рака шеи со скрытой первичной локализацией, рака ротовой полости, синдрома множественной эндокринной неоплазии (детского), множественной миеломы/плазмоклеточной неоплазии, фунгоидного микоза, миелодиспластических синдромов, миелодиспластических/миелопролиферативных заболеваний, миелогенного лейкоза (хронического), миелоидных лейкозов (взрослых острых, детских острых), множественной миеломы, миелопролиферативных нарушений (хронических), рака носовой полости и околоносовых пазух, назофарингеальной карциномы, нейробластомы, неходжкинской лимфомы, немелкоклеточного рака легких, рака ротовой полости, рака ротоглотки, остеосаркомы/злокачественной фиброзной гистиоцитомы кости, рака яичников, эпителиального рака яичников (поверхностной эпителиально-стромальной опухоли), эмбрионально-клеточной опухоли яичников, пограничной опухоли яичников, рака поджелудочной железы, рака поджелудочной железы (островковых клеток), рака околоносовых пазух и носовой полости, рака паращитовидных желез, рака полового члена, фарингеального рака, феохромоцитомы, пинеальной астроцитомы, пинеальной герминомы, пинеобластомы и супратенториальных примитивных нейроэктодермальных опухолей (детских), аденомы гипофиза, неоплазии плазматических клеток, плевролегочной бластомы, первичной лимфомы центральной нервной системы, рака простаты, рака прямой кишки, почечно-клеточной карциномы (рака почек), рака почечной лоханки и переходных клеток мочеточника, ретинобластомы, рабдомиосаркомы (детской), рака слюнных желез, саркомы (из семейства опухолей Юинга, Капоши, мягких тканей, матки), синдрома Сезари, рака кожи (немеланомного, меланомного), карциномы кожи (клеток Меркеля), мелкоклеточного рака легких, рака тонкой кишки, саркомы мягких тканей, карциномы сквамозных клеток, сквамозного рака шеи со скрытой первичной локализацией (метастатического), рака желудка, супратенториальной примитивной нейроэктодермальной опухоли (детской), Т-клеточной лимфомы (кожной), рака яичка, рака горла, тимомы (детской), тимомы и рака вилочковой железы, рака щитовидной железы, рака щитовидной железы (детского), рака переходных клеток почечной лоханки и мочеточника, трофобластической опухоли (гестационной), неизвестной первичной локализации (взрослой, детской), рака переходных клеток мочеточника и почечной лоханки, рака уретры, рака матки (внутриматочного), саркомы матки, рака влагалища, глиомы зрительного пути и гипоталамической глиомы (детской), рака вульвы, макроглобулинемии Вальденстрема и опухоли Вильмса (детской).

В одном предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения последовательности аптамера, определенные в настоящем документе, которые оказывают антагонистический эффект на TLR9-рецептор, не содержат цитозиновый нуклеотид. Очевидно, что последовательности, которые содержат последовательность, обладающую антагонистическим эффектом на TLR9, могут содержать дополнительные последовательности нуклеотидов, в том числе цитозиновые нуклеотиды.

В более предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения аптамер по настоящему изобретению, описанный и раскрытый в настоящем документе, содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID No. 1 (GGT TGG TGT GGT TGG) и/или последовательность нуклеиновой кислоты, являющуюся по меньшей мере на 80% идентичной SEQ ID No. 1. В другом более предпочтительном варианте реализации аптамер содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID No. 1 (GGT TGG TGT GGT TGG), в частности, аптамер состоит из последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID No. 1 (GGT TGG TGT GGT TGG).

В одном предпочтительном варианте реализации аптамер по настоящему изобретению, как раскрыто и описано в настоящем документе, содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID No. 5 (GGT TGG TGT GGT TG), предпочтительно, аптамер состоит из последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID No. 5 (GGT TGG TGT GGT TG).

Определение процента идентичности между двумя последовательностями осуществляется, согласно настоящему изобретению, путем использования математического алгоритма Карлина-Альтшуля (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90:5873-5877). Такой алгоритм положен в основу программ BLASTN и BLASTP в Altschul et al. (J. Mol. Biol. (1990) 215: 403-410). Поиски BLAST нуклеотида выполняются с помощью программы BLASTN. Для получения выравниваний с пробелами для целей сравнения используется BLAST с пробелами, как описано в Altschul et al. (Nucleic Acids Res. (1997) 25: 3389-3402). При использовании программ BLAST и BLAST с пробелами используются параметры соответствующих программ по умолчанию.

В соответствии с предпочтительным вариантом реализации настоящего изобретения последовательности аптамера образуют часть изобретения, которая состоит из или содержит последовательность нуклеиновой кислоты, являющуюся по меньшей мере на 85% идентичной индивидуализированным последовательностям аптамера, которые раскрыты в настоящем документе, более предпочтительно, по меньшей мере на 90% идентичной, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 95% идентичной.

Для цели настоящего изобретения термин «аптамер» относится к олигонуклеотиду, который специфически и с высокой аффинностью связывается с молекулой-мишенью. В определенных условиях аптамеры могут складываться в специфическую трехмерную структуру. В одном предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения заявленные аптамеры специфически и с высокой аффинностью взаимодействуют с рецептором-мишенью, более предпочтительно, с TLR9-рецептором.

В соответствии с предпочтительным вариантом реализации изобретенный аптамер не образует часть наноструктуры, составленной минимум из двух компонентов, причем минимум два компонента представляют собой множество олигонуклеотидов и множество образующих G-квадруплекс нуклеиновых кислот, связанных со множеством олигонуклеотидов, более предпочтительно, изобретенный аптамер не образует часть наноструктуры, составленной минимум из двух компонентов. В данном предпочтительном варианте реализации два компонента, предпочтительно, структурно отличаются. Кроме того, в данном предпочтительном варианте реализации связь между множеством олигонуклеотидов и множеством образующих G-квадруплекс нуклеиновых кислот, связанных со множеством олигонуклеотидов в наноструктуре, не заявленной в данном варианте реализации, представляет собой ковалентную связь или нековалентную связь, причем нековалентная связь, более предпочтительно, основана на одном или более из электростатических взаимодействий, Ван-дер-Ваальсовых сил, π-эффектов или гидрофобных эффектов.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом реализации изобретенный аптамер не образует часть стабильной самособираемой наноструктуры из нуклеиновых кислот, содержащей множество олигонуклеотидов, причем каждая межнуклеотидная связь олигонуклеотида не является фосфоротиоатной связью, множество образующих G-квадруплекс нуклеиновых кислот, связанных со множеством олигонуклеотидов, причем образующие G-квадруплекс нуклеиновые кислоты не являются TAGGGTT, и множество стабилизирующих G-квадруплекс доменов, связанных с образующими G-квадруплекс нуклеиновыми кислотами, причем олигонуклеотиды, образующие G-квадруплекс нуклеиновые кислоты и стабилизирующие G-квадруплекс домены образуют множество G-квад структур.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом реализации изобретенный аптамер не образует часть стабильной самособирающейся наноструктуры из нуклеиновых кислот, содержащей множество олигонуклеотидов, множество образующих G-квадруплекс нуклеиновых кислот, связанных со множеством олигонуклеотидов, причем образующие G-квадруплекс нуклеиновые кислоты не являются TAGGGTT, и множество стабилизирующих G-квадруплекс доменов, связанных с образующими G-квадруплекс нуклеиновыми кислотами, причем когда по меньшей мере одна из образующих G-квадруплекс нуклеиновых кислот содержит GG, GGG или GGGG, а олигонуклеотид представляет собой CpG олигонуклеотид, липид не является диациллипидом, причем олигонуклеотиды, образующие G-квадруплекс нуклеиновые кислоты и стабилизирующие G-квадруплекс домены образуют множество G-квад структур.

В соответствии с еще одним другим предпочтительным вариантом реализации изобретенный аптамер не образует часть наноструктуры из нуклеиновых кислот, содержащей стабилизирующие G-квадруплекс домены, связанные с изобретенным аптамером.

Аптамер изобретения содержит или состоит из последовательности молекул нуклеиновой кислоты, нуклеотиды. В соответствии с предпочтительным вариантом реализации, аптамер изобретения состоит из нуклеотидной последовательности, как определено в настоящем документе.

Аптамер изобретения предпочтительно содержит немодифицированные и/или модифицированные D- и/или L-нуклеотиды. В соответствии с общим однобуквенным кодом оснований нуклеиновой кислоты «C» означает цитозин, «A» означает аденин, «G» означает гуанин, а «T» означает или тимин, если нуклеотидная последовательность представляет собой последовательность ДНК, или «T» означает урациловый нуклеотид, если нуклеотидная последовательность представляет собой последовательность РНК. Если ниже не указано иное, термин «нуклеотид» относится к рибонуклеотидам и дезоксирибонуклеотидам.

Аптамер изобретения может содержать или состоять из нуклеотидной последовательности ДНК или РНК и, следовательно, может называться ДНК-аптамером или РНК-аптамером соответственно. Следует понимать, что если аптамер изобретения содержит нуклеотидную последовательность РНК в мотивах последовательности, конкретно указанных в настоящем изобретении, «T» означает урацил.

Для обеспечения краткости в настоящем изобретении ссылка делается только на явно выраженные нуклеотидные последовательности ДНК. Однако следует понимать, что соответствующие нуклеотидные последовательности РНК также входят в объем настоящего изобретения.

В соответствии с одним вариантом реализации предпочтительным является использование ДНК-аптамеров. ДНК-аптамеры, как правило, более стабильны в плазме, чем РНК-аптамеры. Однако в соответствии с альтернативным вариантом реализации предпочтительными являются РНК-аптамеры. В соответствии с другим вариантом реализации предпочтительными являются однонитевые нуклеотидные последовательности. В соответствии с другим альтернативным вариантом реализации предпочтительными являются двунитевые нуклеотидные последовательности.

Аптамеры изобретения могут содержать нуклеотидную последовательность, содержащую 2'-модифицированные нуклеотиды, например, 2'-фтор-, 2'-метокси-, 2'- метоксиэтил- и/или 2'-амино-модифицированные нуклеотиды. Аптамер изобретения также может содержать смесь дезоксирибонуклеотидов, модифицированных дезоксирибонуклеотидов, рибонуклеотидов и/или модифицированных рибонуклеотидов. Соответственно, термины «2'-фтор-модифицированный нуклеотид», «2'-метокси-модифицированный нуклеотид», «2'-метоксиэтил-модифицированный нуклеотид» и/или «2-амино-модифицированный нуклеотид» относятся к модифицированным рибонуклеотидам и модифицированным дезоксирибонуклеотидам.

Аптамер изобретения может содержать модификации. Такие модификации охватывают, например, алкилирование, т.е. метилирование, арилирование или ацетилирование по меньшей мере одного нуклеотида, включение энантиомеров и/или слияние аптамеров с одним или более другими нуклеотидами или последовательностями нуклеиновой кислоты. Такие модификации могут содержать, например, 5'- и/или 3'-PEG- или 5'- и/или 3'-CAP-модификации. В качестве альтернативы или в дополнение, аптамер изобретения может содержать модифицированные нуклеотиды, предпочтительно, выбранные из закрытых нуклеиновых кислот, 2'-фтор-, 2'-метокси- и/или 2'-амино-модифицированных нуклеотидов.

Закрытые нуклеиновые кислоты (LNA) представляют собой аналоги соответствующих нуклеотидов РНК, причем конформация была зафиксирована.

Олигонуклеотиды закрытых нуклеиновых кислот содержат один или более бициклических рибонуклеозидов, причем 2'-OH группа соединена с C₄-атомом углерода через метиленовую группу. Закрытые нуклеиновые кислоты проявляют улучшенную стабильность против нуклеаз по сравнению с соответствующими немодифицированными РНК-аптамерами. Также улучшены свойства гибридизации, что обеспечивает возможность усиления аффинности и специфичности аптамера.

Другой предпочтительной модификацией является присоединение так называемой 3'-CAP-, 5'-CAP-структуры и/или модифицированного гуанозин-нуклеотида (например, 7-метил-гуанозина) к 3'- и/или 5'-концу аптамера. Такая модификация 3'-и/или 5'-конца обладает эффектом, заключающимся в том, что аптамер защищен от быстрого деградации от нуклеаз.

В качестве альтернативы или в дополнение, аптамер изобретения может проявлять пегилированный 3' или 5'-конец. 3'- или 5'-PEG модификация содержит присоединение по меньшей мере одной единицы полиэтиленгликоля (PEG), предпочтительно, PEG-группа содержит от 1 до 900 этиленовых групп, более предпочтительно, от 1 до 450 этиленовых групп. В предпочтительном варианте реализации аптамер содержит линейные PEG-единицы с HO-(CH₂CH₂O)_n-H, причем n представляет собой целое число от 1 до 900, предпочтительно, n представляет собой целое число от 1 до 450.

Аптамер изобретения может быть полностью или частично сконфигурирован в виде пептидной нуклеиновой кислоты (PNA). Аптамеры в соответствии с настоящим изобретением могут быть дополнительно модифицированы, как описано в Keefe AD et al., Nat Rev Drug Discov. 2010 Jul;9(7):537-50 или в Mayer G, Angew Chem Int Ed Engl. 2009;48(15):2672-89 или в Mayer, G. и Famulok M.,Pharmazie in unserer Zeit 2007; 36: 432-436.

Термин «олигонуклеотид» в целом относится к полинуклеозиду, содержащему множество связанных единиц нуклеозида. Такие олигонуклеотиды могут быть получены из существующих источников нуклеиновой кислоты, в том числе геномной или кДНК, но, предпочтительно, их получают методами синтеза. В предпочтительных вариантах реализации каждая единица нуклеозида может охватывать различные химические модификации и замены по сравнению с олигонуклеотидами дикого типа, в том числе, но без ограничения, модифицированное основание нуклеозида и/или модифицированную единицу сахара.

Примеры химических модификаций известны специалисту в данной области техники и описаны, например, в Uhlmann, E. et al. (1990) Chem. Rev. 90:543; «Protocols for Oligonucleotides and Analogs» Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, USA 1993; и Hunziker, J. et al. (1995) Mod. Syn. Methods 7:331-417; и Crooke, S. et al. (1996) Ann. Rev. Pharm. Tox. 36:107-129.

Остатки нуклеозида могут быть соединены друг с другом любой из многочисленных известных межнуклеозидных связей, среди прочего, для улучшения стабильности олигонуклетидов против ферментативной деградации, например, нуклеазами. Такие межнуклеозидные связи включают, без ограничения, фосфодиэфир, фосфоротиоат, фосфородитиоат, алкилфосфонат, алкилфосфоротиоат, фосфотриэфир, фосфорамидат, силоксан, карбонат, карбоалкокси, ацетамидат, карбамат, морфолино, боран, тиоэфир, мостиковую фосфорамидат, мостиковую метилен фосфонат, мостиковую фосфоротиоат и сульфоновую межнуклеозидные связи.

Термин «олигонуклеотид» также охватывает полинуклеозиды, имеющие одну или более стереоспецифических межнуклеозидных связей (например, (Rr)- или (Sr)- фосфоротиоатную, алкилфосфонатную или фосфотриэфирную связи). Предполагается, что используемые в настоящем документе термины «олигонуклеотид» и «динуклеотид» явно включают полинуклеозиды и динуклеозиды, имеющие любую такую межнуклеозидную связь вне зависимости от того, содержит ли связь фосфатную группу или нет. В некоторых предпочтительных вариантах реализации эти межнуклеозидные связи могут представлять собой фосфодиэфирные, фосфоротиоатные или фосфородитиоатные связи или их комбинации, более предпочтительно, межнуклеозидные связи представляют собой фосфоротиоат.

Кроме того, аптамеры могут быть инкапсулированы в подходящие носители для защиты их структурной целостности, а также для способствования их доставки внутрь клеток. Предпочтительные носители включают липосомы, липидные везикулы, микрочастицы и тому подобное.

Липидные везикулы подобны плазматическим мембранам и они могут быть выполнены для слияния с клеточными мембранами. Большинство липосом и многоламеллярных везикул не являются явным образом фузогенными в основном по той причине, что сохраненная энергия радиуса кривизны везикулы является минимальной. Предпочтительные липидные везикулы включают малые моноламеллярные везикулы. Малые моноламеллярные везикулы, предполагаемые для инкапсулирования аптамеров настоящего изобретения, являются очень фузогенными, поскольку они имеют очень маленький радиус кривизны. Средний диаметр малой моноламеллярной везикулы составляет от 5 нм до 500 нм; предпочтительно, от 10 нм до 100 нм, более предпочтительно, от 20 нм до 60 нм, в том числе 40 нм. Этот размер позволяет везикулам проходить через промежутки между эндотелиальными клетками, тем самым обеспечивая возможность системной доставки аптамер-содержащих везикул после внутривенного введения. Размер полезных везикул может существенно варьироваться и они могут быть выбраны в соответствии с конкретным применением с аптамером.

Малые моноламеллярные везикулы могут быть легко получены in vitro с помощью процедур, доступных из уровня техники (как, например, раскрыто в WO 2005/037323 A2). Композиции, из которых образуются везикулы, содержат фосфолипид, который представляет собой образователь стабильной везикулы, предпочтительно, вместе с другим полярным липидом, и необязательно с одним или более дополнительными полярными липидами и/или образователями рафта. Предпочтительные фосфолипиды, которые являются образователями стабильной везикулы, включают 1-пальмитоил-2- докозагексаноил-sn-глицеро-3-фосфохолин и 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин. Предпочтительные полярные липиды включают: 1- пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3- фосфат, 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-этилфосфохолин, 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин, 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-[фосфо-l-серин], типичный сфингомиелин, 1,2-димиристоил-sn-глицерин и 1-пальмитоил-2-гидрокси-sn-глицеро-3-фосфохолин.

Другие предпочтительные полярные липиды включают фосфатидилсерин, фосфатидилглицерин, фосфатидилхолин со смешанной цепью, фосфатидилэтанол и фосфолипиды, содержащие декозагексаеновые кислоты. Одним примером предпочтительного образователя рафта является холестерин.

Одно преимущество модификации аптамера изобретения одним из способов, упомянутых выше, заключается в том, что аптамер может быть стабилизирован против вредоносных воздействий, таких как, например, нуклеаз, присутствующих в среде, где используется аптамер. Указанные модификации также подходят для адаптации фармакологических свойств аптамера. Предпочтительно, модификации не изменяют аффинность или специфичность аптамера.

Аптамер изобретения также может быть конъюгирован с молекулой-носителем и/или репортерной молекулой. Молекулы-носители содержат такие молекулы, которые при конъюгировании с аптамером пролонгируют период полужизни в плазме конъюгированного аптамера в плазме человека, например, путем усиления стабильности и/или путем воздействия на скорость экскреции. Одним примером подходящей молекулы-носителя является PEG.

Репортерные молекулы содержат молекулы, которые обеспечивают возможность обнаружения конъюгированного аптамера. Примерами таких репортерных молекул являются GFP, биотин, холестерин, красители, такие как, например, флуоресцентные красители, электрохимически активные репортерные молекулы и/или соединения, содержащие радиоактивные остатки, в частности, радионуклиды, подходящие для обнаружения с помощью PET (позитронно- эмиссионной томографии), такие как, например, ¹⁸F, ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O, ⁸²Rb или ⁶⁸Ga. Специалисту в данной области техники хорошо известны подходящие молекулы- носители и репортерные молекулы, а также способы их конъюгации с аптамером изобретения.

Аптамеры настоящего изобретения полезны для лечения некоторых заболеваний путем ингибирования или подавления активации TLR9 в клетке. В контексте настоящего изобретения предполагается, что аптамеры являются полезными для субъектов-людей, а также для субъектов-животных. В соответствии с одним вариантом реализации аптамеры предназначены для применения на субъектах-людях. В соответствии с другим вариантом реализации аптамеры предназначены для применения на субъектах-животных.

Заболевания, при которых может быть полезным ингибирование или подавление активации TLR9, являются такими, при которых активация TLR9 вызывает нежелательные симптомы или последствия у субъекта, проявляющего такую активацию TLR9. В соответствии с предпочтительным вариантом реализации расстройство и/или заболевание вызвано активацией TLR9 у субъекта, подлежащего лечению. В соответствии с особенно предпочтительным вариантом реализации расстройство и/или заболевание вызвано активацией TLR9 у субъекта, проходящего лечение от аутоантител, направленных на связанные с G-белком рецепторы.

В литературе уже было сообщено или известно несколько заболеваний, связанных с активацией TLR9. Авторами настоящего изобретения было проведено дополнительное исследование ввиду такой связи и было обнаружено, что с такой активацией TLR9 или сверхактивацией TLR9 может быть связано больше заболеваний, чем было сообщено ранее (данные не показаны).

Ввиду аффинности заявленных аптамеров к TLR9 и их антагонистических эффектов на него, имеются основания, что любое заболевание, которое связано с активацией или сверхактивацией TLR9, эффективно поддается лечению с помощью представленных и заявленных в настоящем документе аптамеров. Таким образом, в принципе, все заболевания, которые были признаны связанными с (сверх)активацией TLR9 являются перспективными целевыми заболеваниями, подлежащими лечению с помощью аптамеров в соответствии с настоящим изобретением.

Аптамеры настоящего изобретения способны оказывать воздействие на TLR9- рецептор, предпочтительно, антагонистический эффект на него. Таким образом, в предпочтительном варианте реализации, заявленные аптамеры действуют как TLR9- антагонисты. Предпочтительно, заявленные аптамеры способны к ингибированию или подавлению активации TLR9. В соответствии с одним предпочтительным вариантом реализации аптамеры настоящего изобретения не оказывают воздействие на TLR7- рецептор, более предпочтительно, они не оказывают воздействие на любую другую молекулу TLR-рецептора. В соответствии с другим предпочтительным вариантом реализации аптамеры настоящего изобретения также оказывают воздействие на TLR7-рецептор.

Путем ингибирования патологической или нежелательной активации или сверхактивации TLR9-рецептора потенциально отрицательные эффекты активации TLR9 нейтрализуются и ослабляются, а перманентная или временная активация TLR9 может быть устранена или снижена до нормальных уровней. Как следствие, степень и серьезность заболевания, вызванного или связанного с активацией TLR9, может быть существенно снижена. Таким образом, в настоящем изобретении обеспечены аптамеры, которые пригодны для применения при лечении заболеваний, связанных с активацией или сверхактивацией TLR9.

В соответствии с другим вариантом реализации настоящего изобретения представлен способ ингибирования или подавления активации TLR9 в клетке, включающий контактирование клетки, экспрессирующей TLR9, с аптамером.

В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения способ выполняют in vitro/ex vivo. Более предпочтительно, клетка, подлежащая контакту с аптамером в соответствии со способом настоящего изобретения, не образует часть целого живого организма. В одном варианте реализации клетка, подлежащая контакту, может быть культивирована в клеточной структуре. Такие культуры индивидуальных или групп клеток могут осуществляться так, как обычно выполняется в области техники.

В другом предпочтительном варианте реализации способа настоящего изобретения способ может выполняться in vivo и/или на клетках, которые образуют часть целого живого организма. В соответствии с данным вариантом реализации способ, предпочтительно, включает дополнительный предшествующий этап тестирования клетки(ок), подлежащей(их) контакту, на активацию TLR9, более предпочтительно, клетку(и) тестируют на сверхэкспрессию TLR9 и/или сверхактивность TLR9-опосредованного сигналинга.

В предпочтительном варианте реализации второго аспекта изобретения клетка представляет собой клетку млекопитающего, предпочтительно, клетка представляет собой клетку человека.

Настоящее изобретение также направлено на фармацевтическую композицию, содержащую по меньшей мере один аптамер изобретения и, необязательно, по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. Изобретение также направлено на фармацевтическую композицию, содержащую аптамер изобретения или смесь различных аптамеров изобретения и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, такое как, например, подходящий носитель или разбавитель.

Предпочтительно, аптамер изобретения составляет активный ингредиент фармацевтической композиции и/или присутствует в эффективном количестве. Термин «эффективное количество» подразумевает количество аптамера изобретения, оказывающее профилактически, диагностически или терапевтически релевантный эффект на заболевание или патологическое состояние. Профилактический эффект предотвращает вспышку заболевания. Терапевтически релевантный эффект ослабляет до некоторой степени один или более симптомов заболевания или частично или полностью нормализует один или более физиологических или биохимических параметров, связанных с заболеванием или патологическими состояниями или являющихся их причиной.

Соответствующее количество для введения аптамера изобретения является достаточной высоким для достижения желаемого профилактического, диагностического или терапевтического эффекта. Специалисту в данной области техники будет ясно, что конкретный уровень дозы, частота и период введения любому конкретному млекопитающему будет зависеть от широкого ряда факторов, в том числе от активности конкретных используемых компонентов, возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола, питания, времени введения, пути введения, комбинации лекарственных препаратов и степени тяжести конкретного лечения. Используя общеизвестные средства и способы, специалист в данной области техники может определить точное количество путем рутинных экспериментов.

В соответствии с одним вариантом реализации фармацевтической композиции изобретения по меньшей мере 20% от общего содержания аптамера составляет аптамер изобретения, предпочтительно, по меньшей мере 50%, более предпочтительно, по меньшей мере 75%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 95%.

При использовании для лечения фармацевтическая композиция в целом будет вводиться в виде состава в ассоциации с одним или более фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами. Термин «вспомогательное вещество» используется в настоящем документе для описания любого ингредиента, отличного от аптамера изобретения. Выбор вспомогательного вещества в большой степени будет зависеть от конкретного режима введения. Вспомогательные вещества могут представлять собой подходящие носители и/или разбавители.

Фармацевтическая композиция изобретения может вводиться перорально. Пероральное введение может включать глотание, так что композиция попадает в желудочно-кишечный тракт, или может быть использовано трансбуккальное или сублингвальное введение, благодаря которому композиция попадает в кровоток непосредственно из ротовой полости.

Составы, подходящие для перорального введения, включают: твердые составы, такие как таблетки; покрытые таблетки, капсулы, содержащие частицы, жидкости или порошки; таблетки для рассасывания (в том числе заполненные жидкостью); и жевательные конфеты; мульти- и наночастицы; гели; твердые растворы; липосомы; пленки, суппозитории, спреи и жидкие составы.

Жидкие составы включают суспензии, растворы, сиропы и эликсиры. Такие составы могут быть использованы в качестве наполнителей в мягких или твердых капсулах и, как правило, они содержат носитель, например, воду, этанол, полиэтиленгликоль, пропиленгликоль, метилцеллюлозу или подходящее масло, а также один или более эмульгирующих агентов и/или суспендирующих агентов. Жидкие составы также могут быть получены путем разведения твердого вещества, например, из пакета-саше.

Для лекарственной формы в виде таблетки, в зависимости от дозы, аптамер изобретения может составлять от 0,1 мас. % до 80 мас. % лекарственной формы, более конкретно, от 5 мас. % до 60 мас. % лекарственной формы. Помимо аптамера изобретения таблетки в целом содержат разрыхлитель.

Примеры разрыхлителей включают крахмалгликолят натрия, карбоксиметилцеллюлозу натрия, карбоксиметилцеллюлозу кальция, кроскармеллозу натрия, кросповидон, поливинилпирролидон, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, замещенную нижним алкилом, крахмал, прежелатинизированный крахмал и альгинат натрия.

В целом, разрыхлитель будет составлять от 1 мас. % до 25 мас. %, предпочтительно, от 5 мас. % до 20 мас. % лекарственной формы.

Таблетки могут содержать дополнительные вспомогательные вещества, такие как, например, связующие вещества, поверхностно-активные агенты, смазывающие вещества и/или другие возможные ингредиенты, такие как, например, антиоксиданты, красители, вкусоароматические агенты, консерванты и/или маскирующие вкус агенты.

Смеси для таблеток могут быть прессованы прямым образом или посредством ролика для формования таблеток. В качестве альтернативы, смеси для таблеток или порции смесей могут быть получены с применением влажного, сухого гранулирования или гранулирования из расплава, отверждения расплава или экструзии перед таблетированием. Конечный состав может содержать один или более слоев и может быть покрыт или не покрыт; он даже может быть инкапсулирован.

Твердые составы для перорального введения могут быть составлены для немедленного и/или модифицированного высвобождения. Составы модифицированного высвобождения включают отсроченное, задержанное, прерывистое, контролируемое, направленное и запрограммированное высвобождение.

Фармацевтическая композиция изобретения также может вводиться непосредственно в кровоток, в мышцу или во внутренний орган. Подходящие средства для парентерального введения включают внутривенные, внутриартериальные, интраперитонеальные, интратекальные, интравентрикулярные, интрауретральные, интрастернальные, интракраниальные, внутримышечные и подкожные. Подходящие устройства для парентерального введения включают игольный (в том числе микроиглу) инъектор, безыгольные инъекторы и технические средства для инфузии.

Составы для парентерального введения, как правило, представляют собой водные растворы, которые могут содержать вспомогательные вещества, такие как соли, углеводы и буферные агенты (предпочтительно, до значения pH от 3 до 9), однако для некоторых вариантов применения они могут быть более подходящим образом составлены в виде стерильного безводного раствора или в виде сухой формы для использования совместно с подходящим носителем, таким как стерилизованная апирогенная вода.

Получение составов для парентерального введения в стерильных условиях, например, путем лиофилизации, легко может быть осуществлено с использованием стандартных фармацевтических технологий, широко известных специалистам в данной области техники.

Растворимость фармацевтической композиции изобретения, используемой при получении составов для парентерального введения, может быть повышена за счет использования подходящих технологий получения состава, таких как добавление усилителей растворимости.

Составы для парентерального введения могут быть составлены так, чтобы представлять собой составы немедленного и/или модифицированного высвобождения. Составы модифицированного высвобождения включают отсроченное, задержанное, прерывистое, контролируемое, направленное и запрограммированное высвобождение. Таким образом, соединения изобретения могут быть составлены в виде твердого вещества, полутвердого вещества или тиксотропной жидкости для введения в виде имплантируемого депо, обеспечивающего модифицированное высвобождение активного соединения. Примеры таких составов включают покрытые лекарственным средством стенты и микросферы с PGLAполи(dl-молочной-когликолевой)кислотой (PGLA).

Фармацевтическая композиция изобретения также может нанесена местно на кожу или слизистую оболочку, то есть дермально или трансдермально. Типичные составы для этой цели включают гели, гидрогели, лосьоны, растворы, кремы, мази, присыпки, повязки, пены, пленки, кожные пластыри, облатки, имплантаты, губки, волокна, перевязки и микроэмульсии.

Также могут быть использованы липосомы. Типичные носители включают спирт, воду, минеральное масло, жидкий вазелин, белый вазелин, глицерин, полиэтиленгликоль и пропиленгликоль. Могут быть добавлены усилители проникновения. Другие средства для местного применения включают доставку путем электропорации, ионтофореза, фонофореза, сонофореза и микроигольную или безыгольную (например, Powderject(TM), Bioject(TM) и т.д.) инъекцию. Составы для местного применения могут быть составлены так, чтобы представлять собой составы немедленного и/или модифицированного высвобождения. Составы модифицированного высвобождения включают отсроченное, задержанное, прерывистое, контролируемое, направленное и запрограммированное высвобождение.

Для введения пациентам-людям общая суточная доза аптамера изобретения и/или фармацевтической композиции изобретения, как правило, находится в диапазоне от 0,001 мг до 5000 мг, безусловно, в зависимости от режима введения. Например, необходимая суточная доза для внутривенного введения может составлять лишь от 0,001 мг до 40 мг. Общая суточная доза может вводиться в виде единой или разделенной доз и на усмотрение врача может выходить за пределы типичного диапазона, определенного в настоящем документе.

Эти дозы основаны на среднестатистическом субъекте-человеке с массой приблизительно от 75 кг до 80 кг. Врач легко сможет определить дозы для субъектов, масса которых выходит за пределы этого диапазона, таких как новорожденные или пожилые люди.

В контексте настоящего изобретения аптамер, предпочтительно, может вводиться в комбинации с одной или более вакцинами, антигенами, антителами, цитотоксическими агентами, аллергенами, антибиотиками, антисмысловыми олигонуклеотидами, антагонистом TLR, пептидами, белками, генотерапевтическими векторами, ДНК-вакцинами, адъювантами или ингибиторами киназы.

Настоящее изобретение также охватывает набор, содержащий аптамер изобретения, контейнер и, необязательно, письменные инструкции по применению и/или со средствами для введения.

Для лечения и/или диагностики заболевания, вне зависимости от пути введения, аптамер изобретения вводят при суточной дозе на цикл лечения, составляющей не более чем 20 мг/кг массы тела, предпочтительно, не более чем 10 мг/кг массы тела, более предпочтительно, выбранной из диапазона от 1 мкг/кг до 20 мг/кг массы тела, наиболее предпочтительно, выбранной из диапазона от 0,01 до 10 мг/кг массы тела.

В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения аптамер может быть использован in vitro/ex vivo. В альтернативном варианте реализации аптамер может быть использован in vivo.

Производство или массовое получение аптамеров изобретения широко известно из уровня техники и представляет собой лишь рутинные действия.

Все варианты реализации настоящего изобретения, описанные в настоящем документе, считаются обладающими возможность комбинирования в любой комбинации, если только специалист в данной области техники не сочтет, что такая комбинация не несет в себе никакого технического смысла.

ПРИМЕРЫ

Функциональный анализ для оценки антагонистического эффекта аптамеров изобретения на TLR9-рецептор

Функциональный анализ, способный идентифицировать антагонистические эффекты олигонуклеотидов на TLR9-рецептор, был устанавлен для оценки способности к ингибированию или подавлению активации TLR9.

Этот функциональный анализ использует линию рекомбинантных клеток HEK-293 и установленный анализ TLR9-агониста/антагониста (HEK-Blue™ hTLR9 от InvivoGen, Сан Диего, Калифорния, США). Использованная линия клеток несет функционально сверхэкспрессированный TLR9-рецептор человека, связанный с репортерным геном, который представляет собой щелочную фосфатазу, секретированную после сигналинга NFkB-индуцибельным промотором. Сигнал активации TLR9 является повышенным значением оптической плотности (OD).

Рекомбинантные клетки HEK-293, которые переносят репортерный ген, но не TLR9-рецептор, служат в качестве контроля (HEK-Blue™ TNF-α клетки от InvivoGen, Сан Диего, Калифорния, США). Здесь репортерный ген активируется через TNFα. Используя эту контрольную клетку, можно различить специфичны ли эффекты для TLR9-рецептора или же они вызваны помехой в сигнальном каскаде.

Пример 1:

В данном примере исследован ингибирующий эффект SEQ ID No. 1 (GGT TGG TGT GGT TGG) на TLR9-рецептор. Клетки HEK-Blue™ hTLR9 были предварительно инкубированы с различными концентрациями аптамера SEQ ID No. 1 (0, 0,37, 1,1, 3,3, 10 и 20 мкМ аптамера) в течение 60 минут перед добавлением 300 нг/мл (38,86 нМ) широко известного TLR9-агониста ODN 2006 (SEQ ID No. 2: TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT), и клетки были инкубированы еще в течение 18 часов. Далее была определена оптическая плотность с помощью стандартного анализа щелочной фосфатазы. Результаты данного анализа показаны в виде серых столбцов на фигуре 1. Потенциально свойственный эффект SEQ ID No. 1 на сигнальный каскад, вовлекающий TLR9, также был протестирован в отсутствие агониста ODN 2006 и изображен в виде черных столбцов на фигуре 1.

В качестве контроля использовали ту же экспериментальную установку, использующую клетки HEK-Blue™ TNF-α в качестве, как описано выше. Эти чувствительные к TNF-α клетки были предварительно инкубирована с различными концентрациями аптамера SEQ ID No. 1 (0, 0,37, 1,1, 3,3, 10 и 20 мкМ аптамера) в течение 60 минут перед 100 нг/мл TNF-α (с молекулярной массой 17484 Дальтон; конечная концентрация TNF-α: 5,7 нМ), и клеток были инкубированы еще на 18 часов. Далее была определена оптическая плотность. Результаты данного анализа показаны в виде серых столбцов на фигуре 2. Потенциально свойственный эффект SEQ ID No. 1 на сигнальный каскад, вовлекающий TNF-α, также был протестирован в отсутствие стимулирующей молекулы TNF-α и изображен в виде черных столбцов на фигуре 2.

Из этих экспериментов и результатов, показанных на фигурах 1 и 2, можно увидеть, что аптамер SEQ ID No. 1 (GGT TGG TGT GGT TGG) не обладает никакими свойственными или неспецифическими эффектами на анализ агониста/антагониста или репортерную экспрессию, но вместо этого демонстрирует явное ингибирование и подавление активации TLR9.

Пример 2:

В качестве дополнительных контрольных экспериментов анализ, описанный выше и в примере 1, был использован для определения потенциальных ингибирующих эффектов другой олигонуклеотидной последовательности. С этой целью были выполнены те же эксперименты, включая контроли, которые описаны в примере 1, с использованием SEQ ID No. 3 (TGG AGG TGG A) вместо SEQ ID No. 1 для сравнения.

Результаты, полученные с SEQ ID No. 3 на ODN 2006-стимулированных клетках HEK-Blue™ hTLR9, показаны на фигуре 3, а на стимулированных TNF-α клетках HEK- Blue™ TNF-α показаны на фигуре 4 соответственно.

Из этого набора контрольных экспериментов можно увидеть, что протестированный 10-мер SEQ ID No. 3 не демонстрирует ингибирующих эффектов в отношении TLR9, а вместо этого проявляет независимый и аддитивный стимулирующий эффект на TLR9 в отсутствии (см. черные столбцы на фигуре 3) или присутствии агониста ODN 2006 (см. серые столбцы на фигуре 3). Вновь, с аптамером SEQ ID No. 3 (см. фигуру 4) не наблюдалось воздействия на сигнальный каскад.

Пример 3:

В качестве контроля для значения и валидности анализа, использованного в примерах 1 и 2 выше, был выполнен контрольный анализ с использованием установленного TLR9-антагониста CpG ODN TTAGGG (SEQ ID No. 4: TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG; молекулярная масса 7575 Да) при повышающихся концентрациях (0, 30, 100, 300, 1000 и 3000 нг TLR9-антагониста, соответствует 0, 3,96, 13,2, 39,6, 132 и 396 нМ соответственно) вместо аптамеров из примера 1 или 2, как описано выше.

Результаты, полученные с контрольным антагонистом на ODN 2006-стимулированных клетках HEK-Blue™ hTLR9, показаны на фигуре 5. Как и ожидалось, установленный TLR9-антагонист был способен к ингибированию и/или подавлению активации TLR9 (см. серые столбцы на фигуре 5) и не вызвал существенный свойственный эффект в отсутствие TLR9-агониста ODN 2006 (см. черные столбцы на фигуре 5).

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> БЕРЛИН КУРЕС ГМБХ

<120> Аптамеры для применения при ингибировании и/или подавлении

активации TLR9

<130> B 30246

<160> 4

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 15

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID No. 1

<400> 1

ggttggtgtg gttgg 15

<210> 2

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID No. 2

<400> 2

tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24

<210> 3

<211> 10

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID No. 3

<400> 3

tggaggtgga 10

<210> 4

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID No. 4

<400> 4

ttagggttag ggttagggtt aggg 24

<---

1. Применение способа, включающего введение субъекту-человеку эффективного количества аптамера, для терапии субъекта путем ингибирования или подавления активации TLR9 в клетке человека, где аптамер состоит из последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID No. 1 (GGT TGG TGT GGT TGG) и где аптамер специфически взаимодействует с TLR9-рецептором для ингибирования активации TLR9 в клетке субъекта.

2. Применение по п. 1, где субъект, подлежащий лечению, демонстрирует сверхэкспрессию TLR9 и/или сверхактивность TLR9-опосредованного сигналинга.

3. Применение по п. 1, где субъект, подлежащий лечению, имеет положительный результат теста на сверхэкспрессию TLR9 и/или сверхактивность TLR9-опосредованного сигналинга.

4. Применение по любому из пп. 2 или 3, где сверхэкспрессия TLR9 и/или сверхактивность TLR9-опосредованного сигналинга у субъекта установлена, если TLR9-опосредованная продукция TNFα увеличена выше эталонного значения для здоровых субъектов.

5. Применение по п. 4, где значение для субъекта, подлежащего лечению, определено способом, использующим TLR9-опосредованную продукцию TNFα в качестве суррогатного параметра и содержащим следующие стадии: выделение TLR9-переносящих мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), провоцирование агонист(лиганд)-опосредованного TLR9-ответа на PBMC и оценка количества образованных TNFα посредством иммунноферментного анализа (ELISA), где указанное значение составляет по меньшей мере 50 пг/мл, предпочтительно по меньшей мере 75 пг/мл, более предпочтительно по меньшей мере 100 пг/мл, наиболее предпочтительно по меньшей мере 125 пг/мл.

6. Применение по любому из пп. 1-4 или 5, где субъект страдает от расстройства, выбранного из аутоиммунного расстройства, воспалительного расстройства, аутоиммунной болезни соединительной ткани (ACTD) и/или нейродегенеративного расстройства, предпочтительно расстройство выбрано из псориаза, ревматоидного артрита, универсальной алопеции, острого рассеянного энцефаломиелита, болезни Аддисона, аллергии, анкилозирующего спондилита, синдрома антифосфолипидных антител, артериосклероза, атеросклероза, аутоиммунной гемолитической анемии, аутоиммунного гепатита, буллезного пемфигоида, болезни Шагаса, хронической обструктивной болезни легких, глютеновой болезни, кожной красной волчанки (CLE), дерматомиозита, сахарного диабета, дилатационной кардиомиопатии (DCM), эндометриоза, синдрома Гудпасчера, болезни Грейвса, синдрома Гийена-Барре, болезни Хашимото, гнойного гидраденита, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, воспалительного заболевания кишечника, интерстициального цистита, локализованной склеродермии, множественного склероза (MS), миастении гравис, миокардита, нарколепсии, нейромиотонии, пемфигуса, злокачественной анемии, полимиозита, первичного билиарного цирроза, ревматоидного артрита (RA), шизофрении, синдрома Шегрена, системной красной волчанки (SLE), системного склероза, темпорального артериита, васкулита, витилиго, вульводинии, гранулематоза Вегенера, травматической боли, нейропатической боли, токсичности от ацетаминофена и опухоли/рака, где предпочтительно опухоль/рак выбран из группы, состоящей из рака молочной железы, сквамозно-клеточной карциномы шейки матки, карциномы желудка, глиомы, гепатоклеточной карциномы, рака легких, меланомы, рака простаты, рекуррентной глиобластомы, рекуррентной неходжкинской лимфомы, рака толстой и прямой кишки.

7. Способ ингибирования или подавления активации TLR9 в клетке человека, включающий приведение клетки человека, экспрессирующей TLR9, в контакт с аптамером, где способ выполняют in vitro/ex vivo и где аптамер состоит из последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID No. 1 (GGT TGG TGT GGT TGG) и специфически взаимодействует с TLR9-рецептором для ингибирования активации TLR9 в клетке субъекта.

8. Способ по п. 7, где способ дополнительно включает предшествующий этап тестирования клетки на сверхэкспрессию TLR9 и/или сверхактивность TLR9-опосредованного сигналинга.

9. Применение способа, включающего приведение в контакт клетки человека, экспрессирующей TLR9, с эффективным количеством аптамера, состоящего из последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID No. 1 (GGT TGG TGT GGT TGG), для ингибирования или подавления активации TLR9 в клетке человека, где аптамер используется in vitro/ex vivo и где аптамер специфически взаимодействует с TLR9-рецептором для ингибирования активации TLR9 в клетке субъекта.