Способ микроклонального размножения картофеля in vitro сорта хозяюшка

Авторы патента:

Гаджимурадова Айсарат Махмудовна (KZ)

A01H4/00 - Разведение растений из тканевых культур

Владельцы патента RU 2789460:

Общество с ограниченной ответственностью "Элита" (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к технологии ускоренного размножения пробирочных растений картофеля в условиях in vitro. Изобретение представляет собой способ микроклонального размножения картофеля, включающий размножение пробирочных растений картофеля in vitro при использовании питательной среды Мурасиге и Скуга, содержащей макросоли, микросоли, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту и сахарозу, глюкозу, агар. При этом осуществляют предварительное оздоровление исходных растений картофеля от вирусной инфекции стерилизацией апикальных меристем (0,2-0,5 мм) в 0,3%-ном растворе диацида в течение 3-5 минут с последующей трехкратной промывкой стерильной дистиллированной H₂O. Для культивирования оздоровленных растений (эксплантов) картофеля в питательную среду вносят феруловую кислоту 0,5 мг/л, кинетин 1мг/л, РРТ 0,01 мг/л при следующем соотношении компонентов: макросоли 50 мг/л, микросоли 1 мг/л, Fe₂SO₄·7H₂O - 5,0 мг/л, CaCl₂·2H₂O - 440 мг/л, мезо-инозит - 100 мг/л, тиамин - 1,0 мг/л, пиридоксин - 1,0 мг/л, сахароза - 20 000 мг/л, агар - 7000 мг/л, рН 5,7-5,8. Культивирование растений (эксплантов) осуществляют в культуральной комнате при освещенности 5000 люкс, фотопериоде - 16 часов, температуре 25°С и влажности воздуха 70-80%. Способ позволяет повысить эффективность размножения пробирочных растений картофеля свободных от вирусных и бактериальных инфекций в условиях in vitro, прост в использовании и может быть использован на предприятиях для получения стерильного семенного картофеля. 1 табл.

Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно, к технологии ускоренного размножения пробирочных растений картофеля в условиях in vitro. Изобретение может быть использовано для оздоровления пробирочных растений при производстве семенного посадочного материала свободного от вирусных и бактериальных инфекций из меристемных линий.

Картофель (Solanum tuberosum L.) является наиболее важным продуктом питания населения, выращивается в России повсеместно, практически во всех климатических зонах. Россия занимает одно из последних мест по урожайности культуры картофеля. Зараженность вирусными и бактериальными инфекциями семенного материала является одной из основных причин низкой урожайности картофеля. Картофель поражается бактериальными и вирусными инфекциями на всех этапах жизненного цикла: до появления всходов, во время вегетации, в период хранения. Возбудители инфекций способны накапливаться и длительно сохраняться в почве.

По данным ЗАО «Тепличный» г. Омска (2019 г), отечественный семенной картофель в промышленном картофелеводстве региона, практически на 100% поражен мозаичными вирусами (X, Y, S, L, М) и бактериальными инфекциями, приводящими к большим потерям урожая (до 50 %) и снижению качества. Сибирский сорт картофеля «Хозяюшка» высокоурожайный, крупноплодный, среднеспелый сорт картофеля столового назначения, отличается высокой товарностью и устойчивостью к температурным стрессам, однако сорт «Хозяюшка» находится на грани полного исчезновения за счет вырождения вирусами и вследствие этого в настоящее время в промышленном картофелеводстве Западной Сибири не используется. Сорт «Хозяюшка» рекомендован к выращиванию в двух регионах: Западно-Сибирском (Республика Алтай и Алтайский край, Кемеровская, Новосибирская, Омская, Томская, Тюменская области) и Восточно-Сибирском (Республики Бурятия, Якутия, Тыва, Хакасия, Иркутская область, Красноярский и Забайкальский края).

Перспективным направлением для производства картофеля, свободного от вирусных и бактериальных инфекции, является микроклональное размножение картофеля из меристемных линий. Картофельные вирусные заболевания чаще всего передаются через семенной материал. В процессе длительного культивирования оздоровленных от вирусных и бактериальных инфекций растений из меристемных линий в условиях in vitro, часто происходит контаминация материала бактериальной и грибной микрофлорой за счет инфицирования эксплантов, компонентов питательной среды, за счет внутрилабораторной передачи инфекции из воздуха, от персонала и от одной культуры к другим.

Известен способ микроклонального размножения картофеля, включающий стерилизацию питательной среды, культивирование растений картофеля in vitro путем микрочеренкования исходных растений. Используют питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту и сахарозу, аскорбиновую кислоту. Метод, отличается тем, что предварительное оздоровление исходных растений картофеля от вирусной инфекции проводят стерилизацией в 0,3%-ном растворе диацида в течение 3-5 минут, с последующей трехкратной промывкой стерильной дистиллированной H₂O. Причем для культивирования оздоровленных растений и получения микроклубней картофеля используют питательную среду, содержащую дополнительно аденин 1-1,5 мг/л, кинетин 1-2 мг/л, индолилуксусную кислоту (ИУК) 0,5-1,5 мг/л, а тиамин, аскорбиновая кислота, Fe-хелат и сахароза берутся в следующей концентрации: 1-1,2 мг/л; 2,1-4 мг/л; 374-390 мг/л и 81000-85000 мг/л, получение микроклубней картофеля осуществляют при температуре 19-20°C при условии светового дня 8 часов (5000 лк) и полной темноты 16 часов и относительной влажности воздуха 70-80% [Патент РФ на изобретение №2637361, МПК А 01 Н 4/00, опубликован 04.12.2017 г.].

Недостатком этого способа микроклонального размножения картофеля применительно к генотипу сорта «Хозяюшка» является отсутствие компонента питательной среды для снижения контаминации вирусной и бактериальной микрофлоры в процессе длительного культивирования стерильных растений картофеля из меристемных линий в условиях in vitro.

Наиболее близким по технической сущности к заявленному изобретению является способ микроклонального размножения картофеля, включающий размножение пробирочных растений картофеля in vitro при использовании безгормональной питательной среды с рН 5,7-5,8, содержащей микросоли и макросоли по Мурасиге и Скуга, Fe₂SO₄, CaCl₂, мезо-инозит, тиамин, пиридоксин, никотиновую кислоту, сахарозу, глюкозу, агар, отличающийся тем, что дополнительно в питательную среду вводят биологически активные вещества мицелиального гриба Trichoderma lixii при следующем соотношении компонентов: макросоли - 50 мг/л, микросоли - 1 мг/л, Fe₂SO₄ 7H₂O - 5,0 мг/л, CaCl₂ H₂O - 440 мг/л, мезо-инозит - 100 мг/л, тиамин 1,0 мг/л, пиридоксин - 1,0 мг/л, никотиновая кислота - 0,5 мг/л, сахароза - 25 г/л, глюкоза - 25 г/л, агар - 6 г/л, биологически активные вещества - мицелиального гриба Trichoderma lixii - 0,5 мг/л [Патент РФ на изобретение №2702765, МПК А 01 Н 4/00, опубликован 11.10.2019 г.].

Недостатками этого способа микроклонального размножения картофеля применительно к генотипу сорта «Хозяюшка» является ограничение использования тетрациклина для производства оздоровленных пробирочных растений ввиду того, что антибиотик активен в отношении лишь некоторых грамотрицательных бактерий. К антибиотику тетрациклину не устойчивы микроорганизмы большинства грибов, которые чаще всего вызывают контаминацию питательной среды при длительном культивировании стерильных растений в условиях in vitro. Недостаточно высокая скорость роста эксплантов и растений-регенерантов in vitro на безгормональной питательной среде.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является повышение эффективности размножения оздоровленных пробирочных растений картофеля сорта «Хозяюшка», полученных из меристемных линий, в условиях in vitro.

Техническим результатом заявленного изобретения является получение в короткие сроки оздоровленных растений сибирского сорта картофеля «Хозяюшка», повышение коэффициента микроклонального размножения растений-регенерантов, ускорение роста эксплантов, снижение вирусной и бактериальной нагрузки при длительном культивировании стерильных растений in vitro.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе микроклонального размножения картофеля, включающем размножение пробирочных растений картофеля in vitro при использовании питательной среды Мурасиге и Скуга, содержащей макросоли, микросоли, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту и сахарозу, глюкозу, агар, рН 5,7-5,8. Согласно заявленному изобретению осуществляют предварительное оздоровление исходных растений картофеля от вирусной инфекции стерилизацией в 0,3%-ном растворе диацида в течение 3-5 минут с последующей трехкратной промывкой стерильной дистиллированной H₂O, причем для культивирования оздоровленных растений и эксплантов картофеля используют питательную среду с дополнительным внесением феруловой кислоты 0,5 мг/л, кинетина 1мг/л, PPT - 0,01 мг/л, при следующем соотношении компонентов: макросоли 50 мг/л, микросоли 1 мг/л, Fe₂SO₄·7H₂O - 5,0 мг/л, CaCl₂·2H₂O - 440 мг/л, мезо-инозит - 100 мг/л, тиамин - 1,0 мг/л, пиридоксин - 1,0 мг/л, сахароза - 20 000 мг/л, агар - 7000 мг/л, рН 5,7-5,8.

Отличительным признаком заявляемого способа является введение в состав питательной среды для размножения пробирочных растений картофеля PPT (фосфинотрицин, Баста) в концентрации 0,1 мг/л, который обеспечивает деконтаминацию от нежелательной вирусной и бактериальной микрофлоры культивируемого растительного материала и обогащение, введение биологически активного вещества - феруловой кислоты в концентрации 0,5 мг/л и фитогормона - кинетина в концентрации 1мг/л ускоряют ростовые факторы.

Комплексное использование в питательной среде феруловой кислоты, кинетина и взаимовлияние их друг на друга способствует более интенсивному стимулированию ростовых процессов, ризогенезу, морфогенезу и приживаемости эксплантов. Учитывая, что соотношение биологически активных веществ - феруловой кислоты и кинетина, является ключевым фактором деления клеток и дифференцировки тканей растения картофеля, экспериментальным путем установлено оптимальное соотношение и концентрации внесения в питательную среду. Введенная в состав питательной среды феруловая кислота обладает активным действием на ростовые процессы, выступая в качестве активатора ИУК-оксидазы, участвуя в ее биосинтезе. Феруловая кислота экономичнее, чем гетерауксины, что снижает себестоимость получения оздоровленных растений.

Доказано, что использование PPT (фосфинотрицин) в концентрации 0,01 мг/л для неустойчивых растений и выше 0,5 мг/л для устойчивых растений, снижает уровень контаминации в процессе культивирования in vitro, данный гербицид в низких концентрациях в питательной среде обладает бактерицидным и фунгицидным действием.

Опыты проводились в условиях лаборатории «Клеточная биотехнология» ООО «Элита» с оздоровленным сортом картофеля «Хозяюшка».

Способ микроклонального размножения картофеля осуществляют следующим образом.

Отбирают экспланты растений картофеля, регенерированные из апикальных меристем размером 0,1-0,5 мм с одним примордиальным листом, стерильные от вирусной и бактериальной инфекций. Растения картофеля должны иметь 8-10 междоузлий.

Для пересадки эксплантов растений картофеля готовят твердую питательную среду по прописи Мурасиге и Скуга, содержащую макросоли 50 мг/л, микросоли 1 мг/л, феруловой кислоты 0,5 мг/л, кинетина 1мг/л, РРТ 0,01 мг/л, Fe2SO4·7H2O - 5,0 мг/л, CaCl2·2H2O - 440 мг/л, мезо-инозит - 100 мг/л, тиамин - 1,0 мг/л, пиридоксин - 1,0 мг/л, сахароза - 20 000 мг/л, агар - 7000 мг/л. Уровень рН питательной среды перед автоклавированием - 5,8. Питательную среду автоклавируют в автоклаве под давлением 1,0 атм, температуре 110°С в течение 10 минут. РРТ в концентрации 0,01 мг/л вносят в стерильных условиях ламинар-бокса в питательную среду, остывшую до 55-60°С после автоклавирования, затем питательную среду разливают в пробирки и закрывают ватно-марлевыми пробками.

Затем в условиях ламинар-бокса растения картофеля, регенерированные из апикальных меристем, извлекают из пробирки пинцетом и кладут на стерильную крафт-бумагу (100*100 мм). Стерильными инструментами растения извлекают из пробирок и скальпелем разрезают на черенки, которые содержат кусочек стебля с листочком и пазушной почкой. Длина микрочеренка составляет 10-15 мм, 2 мм над глазком, остальные под глазком. Затем черенки с помощью пинцета переносят в пробирки с твердой питательной средой по прописи Мурасиге и Скуга, содержащую макросоли 50 мг/л, микросоли 1 мг/л, феруловой кислоты 0,5 мг/л, кинетина 1мг/л, РРТ 0,01 мг/л. Культивирование растений (эксплантов) осуществляют в культуральной комнате при освещенности 5000 люкс, фотопериоде - 16 часов, температуре 25°С и влажности воздуха 70-80%. В процессе роста (интервал 14 суток) проводят оценку морфометрических показателей и наличие контаминантов в выросших растениях с 5-6 черенками. В таблице 1 представлены результаты исследований по размножению оздоровленных пробирочных растений картофеля сорта «Хозяюшка», полученных из меристемных линий, в условиях in vitro.

Таблица 1.
	Морфологические показатели регенерации
Корневая система, шт.	Листья, шт.	Высота растений, см.	Количество междоузлий, шт.
Кол-во дней	1	7	14	1	7	14	1	7	14	1	7	14
Предлагаемая питательная среда	0	4,1	11,2	1,0	9,3	11,5	2,1	5,7	12,1	1,0	5,1	8,2
Контрольная питательная среда (прототип)	0	3,6	7,1	1,0	7,1	9,1	2,2	5,1	10,2	1,0	4,1	7,1

Использование заявляемого способа микроклонального размножения картофеля in vitro позволяет получить безвирусные растения-регенеранты отечественного сорта картофеля «Хозяюшка», полученных из меристемных линий, с повышенной жизнеспособностью, приживаемостью, высокими морфометрическими показателями, отсутствием контаминации при культивировании вирусной и бактериальной инфекциями.

Предлагаемый способ прост в использовании, экологически безопасен и может быть использован на предприятиях для получения стерильного семенного картофеля.

Способ микроклонального размножения картофеля, включающий размножение пробирочных растений картофеля in vitro при использовании питательной среды Мурасиге и Скуга, содержащей макросоли, микросоли, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту и сахарозу, глюкозу, агар, рН 5,7-5,8, отличающийся тем, что осуществляют предварительное оздоровление исходных растений картофеля от вирусной инфекции стерилизацией апикальных меристем размером 0,2-0,5 мм в 0,3%-ном растворе диацида в течение 3-5 минут с последующей трехкратной промывкой стерильной дистиллированной Н₂О, оздоровленные растения и экспланты картофеля культивируют с использованием питательной среды Мурасиге и Скуга с дополнительным внесением феруловой кислоты 0,5 мг/л, кинетина 1 мг/л, РРТ 0,01 мг/л при следующем соотношении компонентов: макросоли 50 мг/л, микросоли 1 мг/л, Fe₂SO₄⋅7Н₂О - 5,0 мг/л, CaCl₂⋅2H₂O - 440 мг/л, мезоинозит - 100 мг/л, тиамин - 1,0 мг/л, пиридоксин - 1,0 мг/л, сахароза - 20 000 мг/л, агар - 7000 мг/л, рН 5,7-5,8.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к получению стандартных микрорастений картофеля. Представляет собой культивирование микрочеренков картофеля на питательной среде с подобранным составом: макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге и Скуг уменьшают в два раза, вводят агар-агар 6500 мг/л, кинетин 0,02 мг/л, ИУК 0,5 мг/л, сахарозу 15000 мг/л, пиридоксин 1 мг/л, тиамин 0,2 мг/л, аскорбиновую кислоту 0,2 мг/л, гидролизат казеина 40 мг/л.

Способ получения холодоустойчивого посадочного материала батата // 2787700

Изобретение представляет собой способ получения холодоустойчивого посадочного материала батата, относится к области сельского хозяйства и биотехнологии и может быть использовано для получения холодоустойчивого посадочного материала. В изобретении полученную из сегментов стебля и листовых пластинок микроклонов батата каллусную ткань культивируют in vitro в условиях действия пониженных положительных температур (+4-6°С) на питательной среде по прописи Мурасига и Скуга, содержащей препарат Мивал в концентрации 150 мг/л, и из живых, устойчивых к гипотермическому стрессу каллусных клеток получают растения - регенеранты.

Устройство для забора каллусной ткани // 2786914

Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно к растениеводству, и может быть использовано для стерильного забора каллусной ткани древесных и кустарниковых растений. Устройство для забора каллусной ткани выполнено в виде разборного инструмента, включающего полую трубку с рукоятью и мандрен с рукоятью.

Способ получения субстанции из каллусных культур зверобоя продырявленного (hypericum perforatum l.) // 2786911

Способ получения субстанции из каллусных культур зверобоя продырявленного (Hypéricum perforátum L.) относится к области биотехнологии. Способ осуществляют путем ступенчатой стерилизации семян зверобоя продырявленного, для чего первоначально обрабатывают растительные экспланты в мыльном растворе, затем отмывают дистиллированной водой, далее в ламинарном боксе помещают в 70% спирт на 1 минуту, а затем в основной стерилизующий раствор, которым выступает белизна 50% или 100% при воздействии в течение 10-20 минут, или перекись водорода 36% при воздействии в течение 15 минут, или сулема 0,1% при воздействии в течение не более 15 минут.

Способ сохранения растений in vitro // 2785761

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ сохранения растительного материала in vitro, где используют модификации разработанных ранее протоколов, заключающийся в асептическом культивировании растений при оптимальных условиях, в изолировании эксплантов для хранения и их переносе на специальные питательные среды в сосуды для хранения, в сохранении сосудов с образцами растительного материала в условиях ингибирования роста и состоящий из последовательно выполняемых этапов: культивирование in vitro растительного материала в оптимальных для роста условиях, сохранение образцов растительного материала на модифицированных питательных средах, дополненных 3-9 мМ глюконата кальция - С12H22СаО14 или нитрата кальция, 6-10% сахарозой, 4-6 г/л маннита, 0,2-0,5 мг/л 6-бензиламинопурина, 0,01-0,05 мг/л индолилмасляной кислоты, 0,2-1 мг/л паклобутразола [1-(4-хлорофенил)-4,4-диметил-2(1,2,4-триазол-1-ил)пентан-3-ол] и 10-12 г/л агар-агара при +1-20°С на свету (4-16 часовой день при освещенности 0,5-1,0 клк) или в темноте в присутствии или в отсутствие тиосульфата серебра в капсулах альгината кальция.

Способ адаптации in vitro земляники в двухслойном субстрате // 2785462

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ адаптации in vitro земляники в двухслойном субстрате, включающий посадку растений в субстрат, состоящий из смеси торфа и почвы, увлажненный раствором Мурасиге и Скуга, где растения высаживают в двухслойный субстрат, состоящий из верхнего слоя в виде обеззараженной муки природного цеолита фракциями 0,014-0,01 мм, нижний слой состоит из субстрата, выполненного в виде необеззараженной смеси торфа и почвы в соотношении 1:1, при этом обеззараженную муку природного цеолита получают путем прокаливания в сушильном шкафу при 1000°С в течение 8-10 минут, высота слоев торфа составляет 3 см, почвы 3 см, обеззараженной муки природного цеолита 5 см.

Способ получения подвойного материала л-2 в условиях in vitro // 2783895

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения оптимизированной питательной среды для подвойного материала (Л-2) в условиях in vitro, при котором сначала происходит черенкование пробирочных растений и высадка одноузловых черенков на агаризованную питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы и витамины на основе прописи питательной среды Мурасиге и Скуга.

Способ адаптации микроклонов ежевики // 2783512

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ адаптации микроклонов ежевики, включающий этап адаптации, где в качестве субстрата используют торфоперлитную смесь, перед высадкой в боксы корни растений освобождают от остатков питательной среды MS, промывают в дистиллированной воде, затем промывают в растворе перманганата калия, высаживают во влажный субстрат, доводят влажность субстрата до 85% дистиллированной водой и закрывают прозрачной крышкой, при этом поддерживают температуру воздуха 22-23°С днем и 18-20°С ночью, освещение 2000-2500 люкс при продолжительности светового дня 12 часов, на третьи сутки проводят вентиляцию для снижения влажности, затем постепенно каждый день увеличивают поступление более сухого воздуха из окружающей среды в адаптационный бокс и на 7-10 сутки полностью открывают адаптационный бокс.

Способ микроклонального размножения гречихи in vitro // 2783357

Изобретение относится к области биотехнологии. Предлагаемый способ микроклонального размножения гречихи in vitro включает культивирование микроклонов на питательной среде, содержащей макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, 20 г/л сахарозы и 6 г/л агар-агара.

Способ адаптации микроклонов стевии stevia rebaudiana bertoni к условиям ex vitro // 2783192

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ адаптации микроклонов стевии Stevia rebaudiana Bertoni к условиям ex vitro.