Способ прогнозирования неблагоприятного исхода локального и местно-распространенного рака ободочной кишки и ректосигмоидного соединения

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для прогнозирования неблагоприятного исхода локального и местно-распространенного рака ободочной кишки и ректосигмоидного соединения. До проведения операции в периферической крови определяют уровень IL-6 и процент СD16dim56bright субпопуляции натуральных киллеров. При уровне IL-6 равном или выше 18,13 пг/мл, а СD16dim56bright клеток равном или выше 6,01% от общего количества натуральных киллеров прогнозируют высокий риск неблагоприятного исхода в первые пять лет после операции. Способ обеспечивает эффективное прогнозирование неблагоприятного исхода локального и местно-распространенного рака ободочной кишки и ректосигмоидного соединения за счет определения уровня IL-6 и процента СD16dim56bright субпопуляции натуральных киллеров в периферической крови у пациента до проведения операции. 3 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно, к онкологии и может быть использовано для прогнозирования исхода заболевания при лечении рака ободочной кишки и ректосигмоидного отдела.

Известны способы прогнозирования течения колоректального рака (КРР), в частности, рака ободочной кишки и ректосигмоидного отдела, основанные на исследовании не только клинико-патологических, но и некоторых дополнительных лабораторных характеристик опухоли, а также локальных и системных иммунологических показателей. Поскольку известно, что гиперэкспрессия KRAS ассоциирована с низкой общей выживаемостью (ОВ) при КРР (см. Julien Taieb, Karine Le Malicot, Qian Shi, Frédérique Penault-Llorca, Olivier Bouché, Josep Tabernero, Enrico Mini, Richard M. Goldberg, Gunnar Folprecht, Jean Luc Van Laethem, Daniel J. Sargent, Steven R. Alberts, Jean Francois Emile, Pierre Laurent Puig, Frank A. Sinicrope Prognostic Value of BRAF and KRAS Mutations in MSI and MSS Stage III Colon Cancer // JNCI: Journal of the National Cancer Institute, Volume 109, Issue 5, May 2017, djw272, https://doi.org/10.1093/jnci/djw272), описаны способы прогнозирования течения этого заболевания, основанные на определении экспрессии данного гена и дополнительно включающие определение циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК), например, способ прогнозирования метастазирования при раке ободочной кишки, заключающийся в том, что до операции определяют наличие мутации гена KRAS в опухоли, выполняют исследование ЦОК в крови и при отсутствии мутации гена KRAS и содержании ЦОК более 10 в 7,5 мл крови прогнозируют метастазирование в 100% случаев, а при наличии мутации гена KRAS и содержании циркулирующих опухолевых клеток более 5 в 7,5 мл крови прогнозируют метастазирование также в 100% случаев (см. Патент RU 2613142 С1, опубл. 15.03.2017 г., Бюл. № 8. - 8 с.).

Известно, что высокий уровень ЦОК вне зависимости от стадии заболевания связан с более выраженными иммунологическими нарушениями, чем у больных с отсутствием ЦОК (см. Е.Ю. Златник, А.О. Ситковская, И.А. Новикова, Е.С. Бондаренко, А.Б. Сагакянц Показатели клеточного иммунитета у больных КРР разных стадий при наличии и отсутствии циркулирующих опухолевых клеток // Сибирский онкологический журнал. 2020.Т.19, №4. С.94-98), поэтому представляется обоснованным использование показателей иммунного статуса в качестве прогностических для риска неблагоприятного исхода КРР у больных, у которых первым этапом лечения был хирургический.

Наиболее близким к заявляемому способу является известный «Способ прогнозирования метастазирования местнораспространенного рака толстой кишки» (см. Патент RU 2619340, опубл. 15.05.2017 г., Бюл. № 14), заключающийся в определении процента CD4+, CD8+, CD19+ клеток в крови и CD19+ клеток в опухоли и на основе полученных данных вычислении вероятности (риска) метастазирования Рм, при значении которой 0,5 и выше прогнозировали высокий риск появления метастазов местнораспространенного рака толстой кишки в течение 2-х лет после операции.

Однако в литературных источниках не описан уровень субпопуляции натуральных киллеров СD16dim56bright в качестве фактора прогноза при КРР или раке ободочной кишки и ректосигмоидного соединения. Тем не менее, свойства этих клеток, описанные в литературе, предполагают возможность их негативной роли в течение онкологических заболеваний.

На основании результатов экспериментальных и клинических исследований сформулировано представление о незрелости этих клеток (см. Chiara Romagnani, Kerstin Juelke, Michela Falco, Barbara Morandi, Antonella D'Agostino, Roberta Costa, Giovanni Ratto, Giuseppe Forte, Paolo Carrega, Gabrielle Lui, Romana Conte, Till Strowig, Alessandro Moretta, Christian Münz, Andreas Thiel, Lorenzo Moretta, Guido Ferlazzo CD56brightCD16- killer Ig-like receptor- NK cells display longer telomeres and acquire features of CD56dim NK cells upon activation // J Immunol. 2007 Apr 15;178(8):4947-55. doi: 10.4049/jimmunol.178.8.4947; Helena Stabile, Cinzia Fionda, Angela Gismondi and Angela Santoni Role of Distinct Natural Killer Cell Subsets in Anticancer Response Front. Immunol., 16 March 2017 // https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.00293; см. Elisabetta Vulpis, Helena Stabile, Alessandra Soriani, Cinzia Fionda, Maria Teresa Petrucci, Elena Mariggio, Maria Rosaria Ricciardi, Marco Cippitelli, Angela Gismondi, Angela Santoni and Alessandra Zingoni Key Role of the CD56^lowCD16^low Natural Killer Cell Subset in the Recognition and Killing of Multiple Myeloma Cells // Cancers 2018, 10(12), 473; https://doi.org/10.3390/cancers10120473), о низком содержании в них транскрипционных факторов STAT5A и STAT5В, гиперпродукции TGFβ1, стимулирующего выработку VEGF (Michele De Palma, Daniela Biziato, Tatiana V Petrova Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis // Nat Rev Cancer 2017 Aug;17(8):457-474. doi: 10.1038/nrc.2017.51), что вместе взятое говорит о том, что данная субпопуляция натуральных киллеров обладает проонкогенным действием, а не цитотоксическим, в отличие от значительно преобладающей в норме субпопуляции СD16+56dim.

Известно, что для больных II-IV стадий КРР при наличии ЦОК характерен более высокий уровень СD16dim56bright NK-клеток, чем при отсутствии ЦОК, что свидетельствует о снижении антитело-зависимой и перфорин/гранзим-зависимой цитотоксичности натуральных киллеров в условиях такого неблагоприятного фактора, как циркуляция опухолевых клеток (см. А.О. Ситковская. Иммунологические и иммуногистохимическиеаспекты циркуляции опухолевых клеток при колоректальном раке. Дисс. канд. биол. наук, 2021, г. Ростов-на-Дону).

Известно прогностически неблагоприятное значение высокого уровня IL-6 при различных опухолях, в частности, при КРР, суммированное в метаанализе (см. Jinming Xu, Yao Ye, Honghe Zhang, Maciej Szmitkowski, MJ Mäkinen, Peiwei Li, Dajing Xia, Jun Yang, Yihua Wu, and Han Wu Diagnostic and Prognostic Value of Serum Interleukin-6 in Colorectal Cancer // Medicine (Baltimore). 2016 Jan; 95(2): e2502. Published online 2016 Jan 15. doi: 10.1097/MD.0000000000002502). Поскольку этот цитокин участвует в таких механизмах выживания опухолевых клеток, как аутофагия и химиорезистентность (см. Fuqing Hu, Da Song, Yumeng Yan, Changsheng Huang, Chentao Shen, Jingqin Lan, Yaqi Chen, Anyi Liu, Qi Wu, Li Sun, Feng Xu, Fayong Hu, Lisheng Chen, Xuelai Luo, Yongdong Feng, Shengyou Huang, Junbo Hu& Guihua Wang IL-6 regulates autophagy and chemotherapy resistance by promoting BECN1 phosphorylation // Nature Communications volume 12, Article number: 3651 (2021) https://doi.org/10.1038/s41467-021-23923-1Published: 15 June 2021), его высокий исходный уровень может неблагоприятно влиять на эффект адъювантной химиотерапии, следующей за этапом хирургического лечения.

Однако, будучи провоспалительным цитокином, IL-6 может быть повышен, в том числе, транзиторно, при широком спектре сопутствующих заболеваний и состояний. Кроме того, его уровни, как и других цитокинов, имеют широкую индивидуальную вариабельность у различных больных, что затрудняет их четкую стратификацию.

Задачей предлагаемого нами изобретения является повышение точности и информативности способа прогнозирования с оценкой риска развития летального исхода у больных локальным и местнораспространенным раком ободочной кишки и ректосигмоидного отдела.

Техническим результатом является разработка способа прогнозирования неблагоприятного исхода локального и местнораспространенного рака ободочной кишки и ректосигмоидного соединения.

Технический результат достигается тем, что до проведения операции в периферической крови определяют уровень IL-6 и процент СD16dim56bright субпопуляции натуральных киллеров, при уровне IL-6 равно или выше 18,13 пг/мл, а СD16dim56bright клеток равно или выше 6,01% от общего количества натуральных киллеров прогнозируют высокий риск неблагоприятного исхода в первые пять лет после операции.

Изобретение «Способ прогнозирования неблагоприятного исхода локального и местнораспространенного рака ободочной кишки и ректосигмоидного соединения» является новым, так как оно неизвестно в области медицины при прогнозировании течения этого вида рака.

Новизна изобретения заключается в том, что в периферической крови больных локальным и местнораспространенным раком ободочной кишки и ректосигмоидного отдела, у которых первым этапом лечения является хирургический, методом иммуноферментного анализа определяют уровень IL-6 и методом проточной цитометрии - процент СD16dim56bright клеток от натуральных киллеров и при уровне IL-6 равно и выше 18,13 пг/мл, а СD16dim56bright клеток равно и выше 6,01% от общего количества натуральных киллеров прогнозируют высокий риск неблагоприятного исхода в первые пять лет после операции, что является основанием для выбора тактики дальнейшего лечения и его индивидуализации с целью улучшения его результатов.

При исследовании возможных факторов прогноза риска неблагоприятного исхода рака ободочной кишки и ректосигмоидного соединения нами на материале 300 больных до начала их лечения был получен широкий спектр различных клеточных и цитокиновых показателей, характеризующих системный и локальный иммунитет больных, и проведен их анализ в связи с клиническими характеристиками больных, в частности, с развитием у них летального исхода, связанного с заболеванием, который был зарегистрирован у 138 больных.

Был проведен регрессионный анализ Кокса, в результате которого из 40 исследованных факторов, характеризующих иммунный и цитокиновый статус, были выявлены всего 2, статистически значимо прогнозирующие риск неблагоприятного исхода в течение пяти лет после операции: уровни в крови IL-6 и СD16dim56bright субпопуляции натуральных киллеров. Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета STATISTICA 13 (StatSoftInc., США) (см. таблица 1). Проверку на нормальность распределения осуществляли с помощью критерия Шапиро-Уилка. С учетом отсутствия нормального распределения, результаты представляли в виде центральной тенденции медианы (Me) и интерквартильного размаха - 25 и 75 процентили (Ме [LQ; UQ]). Достоверность различий между выборками оценивали с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни, различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Таблица 1 Результаты регрессионного анализа Кокса по оценке риска неблагоприятного исхода у больных раком ободочной кишки и ректосигмоидного соединения на основании оценки системных иммунологических показателей крови
Показатель	β-станд. коэффициент регрессии	Станд. ошибка β	Критерий Вальда	p	Отношение шансов
СD16dim56 bright (от NK)	0,185	0,036	5,53	0,019	1,82
IL-6	0,114	0,006	5,41	0,023	1,64

Как видно из таблицы 1, риск летального исхода больных усиливался при повышении содержания в крови СD16dim56bright (р=0,019) и концентрации цитокина IL-6 (р=0,023), независимо друг от друга. На данное обстоятельство указывало положительное значение β-стандартизированного коэффициента регрессии для двух показателей.

На следующем этапе для установления конкретных значений обоих показателей, которые позволят прогнозировать неблагоприятный исход у данного контингента больных, проведено разделение больных на две группы: без развития летального исхода в течение первых пяти лет после операции (группа 1) и с развитием летального исхода, связанного с основным заболеванием, в тот же срок (группа 2).

Результаты сравнения показателей этих групп по критерию Манна-Уитни, представлены в таблице 2.

Таблица 2 Уровни IL-6 и СD16dim56bright клеток в крови больных сравниваемых групп, Me (LQ UQ)
Группы больных	Показатели
IL-6, пг/мл	СD16dim56bright от NK, %
1-я группа (n=162)	7,79 (5,83; 11,7)	3,6 (3,0; 4,7)
2-я группа (n=138)	31,52 (18,13; 53,67)	9,8 (6,01; 21,3)
Р 1-2	0,023566	0,017659

Как видно из таблицы 2, отмечены статистически значимые различия между показателями больных с различным клиническим исходом, при этом уровни как IL-6, так и СD16dim56bright были выше в группе больных, у которых наблюдался летальный исход, что позволяет считать эти параметры факторами негативного прогноза у таких больных.

С помощью ROC анализа были определены разделительные уровни IL-6 и СD16dim56bright для формирования заключения о риске смерти пациентов в первые пять лет после операции. У пациентов при повышении IL-6 выше 18,13 пг/мл включительно риск смерти в первые пять лет после операции возрастал в 1,9 раза (р=0,001) с диагностической чувствительностью 81% и специфичностью 77% (площадь под ROC кривой AUC=0,794±0,013). У больных при превышении СD16dim56bright уровня 6,01% от общего количества натуральных киллеров включительно в первые пять лет после операции риск генерализации процесса с последующей смертью больных составлял 2,01 (p<0,001) с диагностической чувствительностью 84% и специфичностью 82% (площадь под ROC кривой AUC=0,803±0,016). При одновременном превышении как IL-6, так и СD16dim56bright соответствующих разделительных уровней прогностическая информативность возрастала: диагностическая чувствительность соответствовала 93%, специфичность 91% (площадь под ROC кривой AUC=0,901±0,027).

Таким образом, была определена совокупность параметров и их конкретные значения, которые дополнительно к стадии рака ободочной кишки и ректосигмоидного отдела позволяют получить информацию о вероятности наступления неблагоприятного исхода в течение пяти лет после операции.

Способ осуществляется следующим образом.

До проведения операции выполняется забор периферической крови натощак с 8 до 10 часов утра. В качестве антикоагулянта используют ЭДТА. Клетки инкубируют при комнатной температуре в темноте 20 минут с 5 мкл панелью моноклональных антител CD16/CD3 + CD19/CD56PE/CD45 (Becton Dickinson, USA). Характеристика использованных антител представлена в таблице 3.

Таблица 3 Характеристика моноклональных антител
наименование	флюорохром	клон	№ по каталогу
CD16	PE	3G8	555407
CD3	PerCP-Cy5.5	SK7	560835
CD19	PerCP-Cy5.5	SJ25C1	332780
CD56	PE-Cy7	NCAM16.2	335826
CD45	APC-Cy7	2D1	557748

Подготовку проб осуществляют по методике окрашивание-лизис-отмывка. Лизирование и отмывку проводят с использованием прибора Lyse-Wash assistant. Анализ антигенной экспрессии проводят на проточном цитометре FACSCantoII (Becton Dickinson, USA), исследуют не менее 30 тыс. событий. Мониторинг стабильности работы прибора осуществляют с помощью калибровочной сиситемы 7-color Setup Beads (BD, USA). Долю клеток, с иммунофенотипом СD16dim56bright вычисляют в процентах от СD16/56+ (NK).

Для оценки сывороточного уровня IL-6 используют метод ИФА с тест-системой производства «Вектор-Бест» (Новосибирск), определение проводят по инструкции к тест-системе, результаты выражают в пг/мл.

При уровне IL-6 равно и выше 18,13 пг/мл, а СD16dim56bright клеток равно и выше 6,01% от общего количества натуральных киллеров прогнозируют высокий риск неблагоприятного исхода в течение пяти лет после операции.

Приводим клинические примеры, подтверждающие применимость и эффективность данного способа.

Клинический пример 1

Больной Р., 1966 г.р., поступил в отделение абдоминальной онкологии ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России с диагнозом рак слепой кишки с жалобами на боли в животе, похудание, слабость. При поступлении больному выполнена фиброколоноскопия с биопсией, по данным которой выявлен рак слепой кишки. По результатам гистологического исследования биопсийного материала выявлена низкодифференцированная аденокарцинома. Установлен диагноз: Рак слепой кишки, Т3N0M0, ст. II, гр. 2.

До оперативного вмешательства больному проведено иммунологическое исследование периферической крови, по результатам которого выявлено содержание IL-6 равное 10,8 пг/мл и СD16dim56bright - 4,6%.

После предоперационной подготовки выполнена правосторонняя гемиколэктомия. Проведено гистологическое исследование операционного материала, по данным которого определена низкодифференцированная аденокарцинома с прорастанием всех слоев стенки и распространением в жировую клетчатку, наличием лимфоваскулярной инвазии, отсутствием метастатического поражения лимфатических узлов.

В послеоперационном периоде больному проведено 6 курсов адъювантной ХТ по схеме FOLFOX.

Больной наблюдается в течение 72 мес. от начала проведения оперативного вмешательства без признаков прогрессирования основного заболевания.

Клинический пример 2

Больной У., 53 г., поступил в отделение абдоминальной онкологии ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России с жалобами на боли в животе, запоры, похудание, слабость. При фиброколоноскопии выявлена опухоль нисходящей ободочной кишки на 50 см от ануса. По результатам гистологического исследования биопсийного материала выявлена умереннодифференцированная аденокарцинома. Установлен диагноз: Рак нисходящего отдела ободочной кишки, Т3N0M0, ст. II, гр. 2.

До оперативного вмешательства больному проведено иммунологическое исследование периферической крови, по результатам которого по результатам которого выявлено содержание IL-6 равное 26,4 пг/мл и СD16dim56bright - 7,4%.

После предоперационной подготовки выполнена операция гемиколэктомия слева. Проведено гистологическое исследование операционного материала, по данным которого определена умеренно дифференцированная аденокарцинома с инвазией всех слоев стенки кишки, наличием лимфоваскулярной и периневральной инвазии, отсутствием метастатического поражения лимфатических узлов.

В послеоперационном периоде больному проведено 6 курсов адъювантной ХТ по схеме FOLFOX.

Летальный исход от прогрессирования основного заболевания зафиксирован через 46,4 мес. от начала проведения оперативного вмешательства.

Технико-экономическая эффективность способа заключатся в том, что применение способа позволяет повысить точность и информативность прогноза развития летального исхода у больных локальным и местнораспространенным раком ободочной кишки и ректосигмоидного отдела.

Способ прогнозирования неблагоприятного исхода локального и местно-распространенного рака ободочной кишки и ректосигмоидного соединения, заключающийся в том, что до проведения операции в периферической крови определяют уровень IL-6 и процент СD16dim56bright субпопуляции натуральных киллеров, при уровне IL-6 равном или выше 18,13 пг/мл, а СD16dim56bright клеток равном или выше 6,01% от общего количества натуральных киллеров прогнозируют высокий риск неблагоприятного исхода в первые пять лет после операции.