Сонодинамическая терапия

Изобретение относится к способам сонодинамической терапии, включающим совместное введение комплекса микропузырек-химиотерапевтический агент вместе с комплексом микропузырек-соносенсибилизатор, при этом указанный химиотерапевтический агент представляет собой 5-фторурацил, доксорубицин, гемцитабин, доцетаксел или паклитаксел, а указанный соносенсибилизатор представляет собой бенгальский розовый краситель. Также предложены фармацевтические композиции, содержащие указанные комплексы, и их применение в способах сонодинамической терапии при лечении рака, например, такого как рак поджелудочной железы. Совместное применение комплекса микропузырек-химиотерапевтический агент с комплексом микропузырек-соносенсибилизатор в способе сонодинамической терапии приводит к улучшению эффективности лечения глубоко расположенных опухолей. 9 н. и 24 з.п. ф-лы, 19 ил., 1 табл., 17 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение относится к усовершенствованиям и относится к методам сонодинамической терапии и, в частности, к лечению заболеваний, характеризующихся гиперпролиферативными клетками и/или идиопластами. Более конкретно, изобретение относится к целенаправленной обработке глубоко расположенных опухолей с применением комбинированной сонодинамической и противораковой терапии.

Изобретение также относится к некоторым новым сенсибилизаторам, к способам их получения и к их применению в качестве сенсибилизаторов в методах фотодинамической терапии (PDT) и/или сонодинамической терапии (SDT). Оно также относится к применению некоторых из указанных агентов в качестве средств для визуализации в области ближнего ИК спектра (NIR) и их применению в методах диагностической визуализации PDT.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Традиционно принятое лечение глубоко расположенных опухолей обычно связано с обширным хирургическим вмешательством, химиотерапией, лучевой терапией или комбинацией всех указанных факторов. Все три вмешательства могут привести к различным осложнениям, включая сепсис. Таким образом, поиск более целенаправленных и менее инвазивных терапевтических подходов с улучшенной эффективностью лечения таких пациентов пользуется большим спросом. Рак поджелудочной железы является одним из примеров глубоко расположенной опухоли. Он остается одним из наиболее смертоносных видов рака, среди которых менее 20% диагностированных пациентов имеют право на лечебное хирургическое лечение. На его долю приходится около 2% всех видов рака с пятилетней выживаемостью на 15-21% у пациентов с хирургической резекцией, сопровождаемой системной химиотерапией.

Методы, известные для использования при лечении рака, включают фотодинамическую терапию (PDT). PDT включает применение фоточувствительных агентов к пораженному участку с последующим воздействием фотоактивирующего света для преобразования их в цитотоксическую форму. Это приводит к разрушению клеток и окружающей сосудистой сети в ткани-мишени. Фотосенсибилизаторы, которые в настоящее время одобрены для использования в PDT, поглощают свет в видимой области (ниже 700 нм). Однако свет этой длины волны имеет ограниченную способность проникать в кожу; он проникает на глубину всего лишь несколько мм от поверхности. В то время как PDT может использоваться для лечения более глубоких клеток-мишеней, обычно это связано с использованием устройства, такого как волоконно-оптическая система с катетером, для активации фотосенсибилизатора. Это не только сложная процедура, но и исключает доступ к определенным областям тела. Это также ставит под угрозу неинвазивный характер лечения. Таким образом, хотя и подходит для лечения поверхностных опухолей, использование PDT при лечении глубоко расположенных клеток, таких как массы опухолей и анатомически менее доступные очаги, ограничено.

Сонодинамическая терапия (SDT) является более новой концепцией и включает комбинацию ультразвука и соночувствительного препарата (также называемого в данном документе «соносенсибилизатором»). Подобно PDT активация соносенсибилизатора акустической энергией приводит к образованию реакционноспособных видов кислорода (ROS), таких как синглетный кислород, в интересующем целевом сайте. Такие виды являются цитотоксичными, тем самым убивая клетки-мишени или по меньшей мере уменьшая их пролиферативный потенциал. Многие известные фотосенсибилизирующие агенты могут быть активированы с помощью акустической энергии и, таким образом, пригодны для использования в SDT. Поскольку ультразвук легко распространяется через несколько см ткани, SDT обеспечивает способ, с помощью которого можно лечить опухоли, которые расположены глубоко внутри тканей. Как и в случае со светом, энергия ультразвука также может быть сфокусирована на массе опухоли, чтобы активировать соносенсибилизатор, тем самым ограничивая его воздействие на целевой участок.

SDT предлагает некоторые существенные преимущества перед PDT: ультразвук широко признан как экономически эффективный и безопасный клинический метод внутривидения и, в отличие от света, может быть сильно сфокусирован с проникновением в мягкие ткани до нескольких десятков сантиметров в зависимости от частоты ультразвука.

В WO 2012/143739 соночувствительные вещества конъюгированы с заполненным газом микропузырьком (MB), чтобы обеспечить комплекс микропузырек-соносенсибилизатор для использования в SDT. Данные комплексы обеспечивают эффективную доставку активного соносенсибилизатора специфическим для сайта способом путем контролируемого разрушения пузырька с использованием ультразвука. Последующая или одновременная соно-активация целевого соносенсибилизатора приводит к разрушению клеток на целевом сайте и регрессии опухолевых тканей. Применение микропузырьков также приводит к уменьшению токсических побочных эффектов из-за экранирования соносенсибилизатора от потенциальной активации светом до достижения желаемого целевого сайта.

В последнее время изобретатели продемонстрировали эффективность SDT с использованием комплекса микропузырек-соночувствительные средства для лечения рака поджелудочной железы в доклинической модели (McEwan et al. J Control Release. 2015; 203, 51-6). Данные исследования показали, что инъекция микропузырьков, чувствительных к ультразвуку (MB), заполненных газообразным кислородом и несущих сенсибилизатор бенгальского розового, обеспечивает статистически значимое опосредованное SDT снижение роста опухоли у мышей, несущих ксенотрансплантат ВхРС-3 опухоли человека, по сравнению с опухолями, обработанными аналогичным МВ-конъюгатом, содержащим SF₆ в качестве газа сердцевины. Обоснованием включения кислорода в сердцевину MB было увеличение количества ROS, генерируемого в микроокружении опухоли во время сонодинамического события, поскольку кислород является субстратом для продукции ROS в SDT. Известно, что опухоли поджелудочной железы являются высоко гипоксичными, и это дополнительно отрицательно влияет на эффективность подходов, таких как PDT/SDT, которые зависят от применения кислорода для генерации цитотоксической ROS.

Было также продемонстрировано, что сочетание стандартной терапии на основе 5-фторурацила (5-FUU) и гемцитабина для лечения рака поджелудочной железы с антимитаболитами с дополнительными химиотерапиями, такими как иринотекан и оксалиплатин, может улучшить среднюю выживаемость больных раком поджелудочной железы (Lee et al., Chemotherapy. 2013; 59, 273-9). Однако данная комбинация, известная как FOLFIRINOX, приводит к значительным побочным эффектам и назначается только для пациентов, которые в противном случае подходят и здоровы.

Таким образом, существует потребность в альтернативных методах лечения глубоко расположенных, недоступных опухолей, таких как рак поджелудочной железы, в частности неинвазивных или минимально инвазивных методах и которые не имеют неблагоприятных побочных эффектов. Такие методы будут иметь очевидные социально-экономические преимущества, например, с точки зрения уменьшения травмирования пациента, сокращения расходов на лечение и снижения затрат, связанных с пребыванием в больнице. Данное изобретение решает данную потребность.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Поскольку антиметаболитическая терапия и SDT оказывают свои цитотоксические эффекты путем различных механизмов (первая с помощью ингибирования тимидилатсинтазы, а вторая - путем окисления клеточных субстратов), изобретатели теперь предлагают, что их комбинация в одном терапевтическом режиме может обеспечить значительную пользу для пациентов.

В частности, авторы изобретения теперь обнаружили, что применение микропузырьков для доставки как соносенсибилизатора, так и антиметаболита придает ряд преимуществ при применении в методах сонодинамической терапии. В частности, то, что у них найдено, состоит в том, что доставка как соносенсибилизатора, так и антиметаболита в виде комплекса (или комплексов) с микропузырьком позволяет эффективно доставлять оба агента в сайт-специфический способ (например, к внутренней опухоли) путем контролируемого разрушения пузырьков с помощью ультразвука. Соно-активация целевого соносенсибилизатора приводит к генерации ROS, которые разрушают опухолевые клетки на целевом сайте. Это действие дополняется действием антиметаболита, который оказывает свой цитотоксический эффект непосредственно на предполагаемом целевом сайте. Используя микропузырек в качестве носителя для обоих агентов, их неспецифическое поглощение нецелевыми тканями уменьшается, что дает значительное преимущество перед системной доставкой. Ожидается, что данная терапия уменьшит побочные эффекты и, в свою очередь, обеспечит значительную пользу для пациентов.

Кроме того, используя загруженную кислородом платформу МП в сочетании с ультразвуком, полученным извне, для доставки не только кислорода, но также антиметаболита и сенсибилизатора в микроокружение опухоли, изобретатели предлагают реализовать высокоточную терапию, в частности, как результат увеличения терапевтических показателей сенсибилизатора и антиметаболита химиотерапевтического препарата. Ожидается, что способность микропузырька доставлять кислород в опухоль еще больше усиливает такие методы лечения, которые зависят от кислорода, чтобы опосредовать их терапевтические эффекты.

В данном документе описано получение наполненных кислородом липид-стабилизированных MB (О₂МВ) с прикрепленным к их поверхности либо бенгальским розовым (О₂МВ-RB) либо 5-FU (O₂MB-5FU). Полученные конъюгаты характеризуются с точки зрения стабильности МП и опосредованного ультразвуком выделения кислорода и демонстрируют опосредованную ультразвуком цитотоксичность комбинированного лечения антиметаболитом/SDT в панели клеточной линии рака поджелудочной железы in vitro. Терапевтическая эффективность комбинированного подхода продемонстрирована с использованием доклинической модели ксенотрансплантата эктопированной опухоли поджелудочной железы человека у мышей и по сравнению с традиционно принятыми терапевтическими подходами, использующими только 5-FU или лечение гемцитабином. Имеются также данные, свидетельствующие о том, что SDT оказывает значительное влияние на процессы передачи сигналов, которые опосредуют иммунный ответ и клеточную пролиферацию.

Представленные в данном документе результаты иллюстрируют не только потенциал комбинированной терапии SDT/антиметаболит как самостоятельного варианта лечения рака поджелудочной железы, но также способность MB, наполненных О₂, доставлять О₂ в микроокружение опухоли, чтобы повысить эффективность терапий, которые основаны на применении О₂ для опосредования их терапевтического эффекта, применение MB для облегчения доставки О₂, а также сенсибилизатора/антиметаболита в сочетании с возможностью активации сенсибилизатора с применением ультразвукового воздействия снаружи, обеспечивает более целенаправленный подход с улучшенной эффективностью и уменьшенными побочными эффектами по сравнению с традиционно принятыми системными способами введения только антиметаболитических препаратов..

Данный новый подход к лечению рака поджелудочной железы распространяется на лечение других заболеваний и патологических состояний, характеризующихся гиперпролиферативными и/или аномальными клетками, в частности на лечение других глубоко расположенных опухолей. Как будет описано в данном документе, такой подход, таким образом, имеет более широкое применение, которое распространяется на лечение других таких заболеваний и патологических состояний с применением других химиотерапевтических препаратов.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В своем самом широком аспекте изобретение обеспечивает комплекс микропузырек-химиотерапевтический агент для применения в методе сонодинамической терапии. В контексте данного документа термин «сонодинамическая терапия» предназначен для обозначения метода, включающего комбинацию ультразвука и соносенсибилизатора (также называемого в данном документе, как «соночувствительный препарат»), при котором активация соносенсибилизатора акустической энергией приводит к генерации активных форм кислорода, таких как синглетный кислород.

Комплекс микропузырек-химиотерапевтический агент содержит микропузырек, прикрепленный или иным образом связанный по меньшей мере с одним химиотерапевтическим агентом. Там, где микропузырек прикреплен к более чем одному химиотерапевтическому агенту, указанные агенты он могут быть одинаковыми или разными. Однако, как правило, химиотерапевтические агенты, прикрепленные к определенному микропузырьку, будут идентичны. В той степени, в которой такой комплекс предназначен для применения в методах SDT, он будет чувствителен к ультразвуку. В частности, предполагается, что микропузырьковый компонент комплекса может быть разрушен путем применения ультразвука, тем самым высвобождая химиотерапевтическое средство на желаемом участке мишени.

Химиотерапевтический агент (или агенты) может быть связан с микропузырьком ковалентным или нековалентным способом, например, путем электростатического взаимодействия, сил Ван-дер-Ваальса и/или водородную связь. В одном варианте осуществления микропузырек электростатически связан с химиотерапевтическим агентом. В другом варианте осуществления он может быть ковалентно связан, то есть химиотерапевтический агент будет прикреплен к микропузырьку одной или большим количеством ковалентных связей.

Предпочтительно взаимодействие между химиотерапевтическим агентом (или агентами) и микропузырьком будет включать сильное нековалентное связывание, такое как взаимодействие биотина с авидином. В данном варианте осуществления один компонент пары связывания (например, химиотерапевтический агент) функционализирован биотином, а другой (например, микропузырек) - авидином. Поскольку авидин содержит множественные сайты связывания для биотина, он, как правило, также будет связан с микропузырьком через взаимодействие биотин-авидин. Например, микропузырек может быть функционализирован биотином с образованием биотинилированного микропузырька, который затем инкубируется с авидином. Когда авидин связан с пузырьком, это позволяет связывать любые другие биотинилированные фрагменты, такие как химиотерапевтический агент. Таким образом, полученная связь между микропузырьком и химиотерапевтическим агентом может принимать форму взаимодействия «биотин-авидин-биотин».

В контексте данного документа, термин «химиотерапевтический агент» предназначен для широкого охвата любого химического или биологического соединения, пригодного для лечения рака. Он включает ингибирующие рост агенты и другие цитотоксические агенты. Термин «ингибирующий рост агент» относится к соединению, которое ингибирует рост клетки, особенно раковой клетки, либокак in vitro, так и in vivo.

Для применения по данному изобретению подходящие классы химиотерапевтических агентов и примеры в этих классах включают следующее: антифолаты (например, метотрексат); 5-фторпиримидины (например, 5-фторурацил или 5-FU); цитидиновые аналоги (например, гемцитабин); пуриновые антиметаболиты (например, меркаптопурин); алкилирующие агенты (например, циклофосфамид); неклассические алкилирующие агенты (например, дакарбазин); платиновые аналоги (например, цисплатин); противоопухолевые антибиотики (например, актиномицин D, блеомицин, митомицин С); биоредуктивные лекарственные средства (например, митомицин С, баноксантрон (AQ4N)); антрациклины (например, доксорубицин, митоксантрон); ингибиторы топоизомеразы I (например, иринотекан); ингибиторы топоизомазы II (например, этопозид); антимикротубулиновые агенты, такие как алкалоиды барвинка (например, винкристин), таксолы (например, паклитаксел) и эпотилоны (например, иксабепилон); антиэстрогены (например, тамоксифен); антиандрогены (например, биклутамид, ципротерон ацетат); ингибиторы ароматазы (например, анастразол, форместан); антиангиогенные средства или гипоксии, нацеливающие лекарственные средства (естественного происхождения, например, эндостатин или синтетические, например, гефитиниб, леналидомид); антиваскулярные агенты (например, камбрестатин); ингибиторы тирозинкиназы (например, гефитиниб, эрлотиниб, вандетаним, сунитиниб); агенты, нацеливающие онкогенный или сигнальный путь (например, типифарниб, лонафарниб, налтриндол, рапамицин); агенты, нацеленные на белки стрессов (например, гелданамицин и их аналоги); агенты, нацеливающие аутофагию (например, хлорохин); агенты, нацеливающие на протеасомы (например, бортезомиб); ингибиторы теломеразы (нацеленные олигонуклеотиды или нуклеотиды); ингибиторы гистондезацетилазы (например, трихостатин А, вальпроевая кислота); ингибиторы метилтрансферазы ДНК (например, децитабин); алкилсульфонаты (например, бусульфан, импросульфан и пипосульфан); азиридины (например, бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа); этиленимины и метиламеламины (например, алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилолмеламин); азотые иприты (например, хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид мехлорэтамин оксида, мелфалан, новэмбихин, фенэстерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый иприт); нитрозомочевины (например, кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин); пуриновые аналоги (например, флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин); пиримидиновые аналоги (например, анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флуксуридин); андрогены (например, калустерон, пропионат дромостанолона, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон); и анти-адреналовые агенты (например, аминоглютетимид, митотан, трилостан). Также могут быть применены фармацевтически приемлемые соли, производные или аналоги любого из указанных соединений.

Примеры ингибирующих рост агентов для применения по данному изобретению включают агенты, которые блокируют прогрессию клеточного цикла (в месте, отличном от фазы S), такие как агенты, которые индуцируют остановку G1 и остановку М-фазы. Классические блокаторы М-фазы включают алкалоиды барвинка (винкристин и винбластин); члены семейства таксанов, включая паклитаксел, доцетаксел и их аналоги; ингибиторы топоизомеразы, такие как иринотекан, топотекан, камптотецин, ламелларин D, доксорубицин, эпирубицин, даунорубицин, этопозид и блеомицин. Агенты, останавливающие G1, включают, например, ДНК-алкилирующие агенты, такие как тамоксифен, преднизон, дакарбазин, мехлорэтамин, цисплатин, метотрексат, 5-FU и ara-С.

Выбор химиотерапевтического агента будет зависеть от различных факторов, включая характер опухоли, пациента, подлежащего лечению, и т.д., но он может быть легко выбран специалистами в данной области техники.

В одном конкретном варианте осуществления химиотерапевтический агент представляет собой антиметаболит. Антиметаболиты, которые особенно пригодны для применения в данном изобретении, включают анти-фолаты, пуриновые и пиримидиновые антиметаболиты и антибиотики. Одним из примеров антиметаболита, который может быть применен при лечении рака поджелудочной железы, является 5-фторурацил (5-FU).

Для применения в SDT, комплекс микропузырек-химиотерапевтический агент применяют в комбинации по меньшей мере с одним соносенсибилизатором (например, с множеством соносенсибилизаторов), который также связан с микропузырьком (в данном документе "комплекс микропузырек-соносенсибилизатор"). Соносенсибилизатор может быть связан с тем же микропузырьком, что и химиотерапевтический агент, или, альтернативно, он может быть связан с отдельным микропузырьком. Как правило, два агента будут связаны с отдельными микропузырьками.

Комплекс микропузырек-соносенсибилизатор содержит микропузырек, прикрепленный или иным образом связанный по меньшей мере с одним соносенсибилизатором, предпочтительно с множеством соносенсибилизаторов. Там, где микропузырьки прикреплены более, чем к одному соносенсибилизатору, они могут быть одинаковыми или разными. Однако, как правило, соносенсибилизаторы будут одинаковыми. В той степени, в которой такой комплекс предназначен для применения в методах SDT, он будет чувствителен к ультразвуку. В частности, предполагается, что микропузырьковый компонент комплекса может быть разрушен путем применения ультразвука, тем самым высвобождая соносенсибилизатор на желаемом целевом участке. Как описано в данном документе, активация соносенсибилизатора акустической энергией также приводит к образованию активных форм кислорода, таких как синглетный кислород, которые являются цитотоксичными.

Соносенсибилизатор (или соносенсибилизаторы) может быть связан с микропузырьком через ковалентно или нековалентно, например, через электростатическое взаимодействие, силы Ван-дер-Ваальса и/или водородную связь. В одном варианте осуществления микропузырек электростатически связан с соносенсибилизатором. В другом варианте осуществления он может быть ковалентно связан, то есть соносенсибилизатор будет прикреплен к микропузырьку одной или большим количеством ковалентных связей. Предпочтительно, однако, взаимодействие будет связано с сильным нековалентным связыванием, таким как взаимодействие биотина с авидином, как описано выше.

В случае, когда взаимодействие биотина с авидином применяют для связывания соносенсибилизатора (или соносенсибилизаторов) с микропузырьком, один компонент пары связывания (например, соносенсибилизатор) функционализирован биотином, а другой (например, микропузырек) с авидином. Как правило, молекула авидина также связана с микропузырьком через взаимодействие биотин-авидин. Например, микропузырек может функционализироваться биотином с образованием биотинилированного микропузырька, который затем инкубируется с авидином. Как только авидин связан с пузырьком, это позволяет связывать любые другие биотинилированные фрагменты, такие как соносенсибилизатор. Полученная связь между микропузырьком и соносенсибилизатором может, таким образом, иметь форму взаимодействия «биотин-авидин-биотин».

В контексте данного документа, термин «микропузырек» предназначен для обозначения микросферы, содержащей оболочку, имеющую приблизительно сферическую форму и которая окружает внутреннюю пустоту, содержащую газ или смесь газов. «Оболочка» относится к мембране, которая окружает внутреннюю пустоту микропузырька.

Микропузырьки хорошо известны в данной области техники, например, в качестве ультразвуковых контрастных агентов. Таким образом, их состав и способы их получения хорошо известны специалистам в данной области техники. Примеры способов получения микропузырьков описаны, например, в, Christiansen et al., Ultrasound Med. Biol., 29: 1759-1767, 2003; Farook et al, J. R. Soc. Interface, 6: 271-277, 2009; и Stride & Edirisinghe, Med. Biol. Eng. Comput., 47: 883-892, 2009, содержание которых настоящим включено в данный документ посредством ссылки.

Микропузырьки содержат оболочку, которая окружает внутреннюю пустоту, содержащую газ. Как правило, они имеют приблизительно сферическую форму, хотя форма микропузырька не является существенной при осуществлении изобретения и поэтому не считается ограничивающей. Размер микропузырька должен быть таким, чтобы обеспечить его прохождение через легочную систему после введения, например, путем внутривенного введения. Микропузырьки обычно имеют диаметр менее чем около 200 мкм, предпочтительно в диапазоне от около 0,5 до около 100 мкм. Особенно пригодными для применения в данном изобретении являются микропузырьки, имеющие диаметр менее чем около 10 мкм, более предпочтительно от 1 до 8 мкм, особенно предпочтительно до 5 мкм, например, около 2 мкм. Оболочка микропузырьков будет варьироваться по толщине и обычно будет составлять от около 10 до около 200 нм. Точная толщина не является существенной, если оболочка выполняет желаемую функцию удержания газовой сердцевины.

Материалы, которые могут быть применены для образования микропузырьков, должны быть биосовместимыми, а подходящие материалы хорошо известны в данной области техники. Как правило, оболочка микропузырька будет содержать поверхностно-активное вещество или полимер. Поверхностно-активные вещества, которые могут быть использованы, включают любой материал, который способен образовывать и поддерживать микропузырьк, образуя слой на границе раздела между газом внутри сердцевины и внешней средой, например, водный раствор, который содержит микропузырь. Может использоваться поверхностно-активное вещество или комбинация поверхностно-активных веществ. К подходящим относятся липиды, в частности фосфолипиды. Липиды, которые могут быть использованы, включают лецитины (т.е. фосфатидилхолин), например, натуральные лецитины, такие как лецитин яичного желтка или лецитин соевых бобов и синтетические лецитины, такие как димиристоилфосфатидилхолин, дипальмитоилфосфатидилхолин или дистеароилфосфатидилхолин; фосфатидные кислоты; фосфатидилэтаноламины; фосфатидилсерины; фосфатидилглицерины; фосфатидилинозитолы; и их смеси. Использование фосфолипидов, имеющих общий результирующий заряд (например, отрицательный заряд), таких как, например, те, которые получены из соевых бобов или яичного желтка; фосфатидилсерины; фосфатидилглицерины; фосфатидилинозитолы; и фосфатидные кислоты, является преимущественным для связывания микропузырька с соносенсибилизатором посредством ионной связи. В одном варианте осуществления длинноцепочечный липид, такой как дибегеноилфосфатидилхолин (DBPC), можно использовать для образования оболочки микропузырьков.

Подходящие липиды могут быть выбраны на основе их способности повышать стабильность микропузырьков в отношении удерживания кислорода. Подходящим для использования в этом отношении является дибегеноилфосфатидилхолин (DBPC).

Полимерные материалы, которые пригодны для использования при формировании оболочки микропузырьков, включают белки, в частности альбумин, в частности человеческий сывороточный альбумин. Другие биосовместимые полимеры, которые могут быть использованы, включают поливиниловый спирт (PVA), поли (D,L-лактид-со-гликолид) (PLGA), цианоакрилат, полоксамеры (Pluronics) или их комбинации.

Микропузырьковые оболочки могут содержать один или большее количество слоев из тех же или разных материалов. Несколько слоев могут, например, образовываться в тех случаях, когда основной материал оболочки (например, липид) несет один или большее количество полимеров или полисахаридов. Примеры таких полимеров включают полиэтиленгликоль и поливинилпирролидон.

Микропузырьковая оболочка также может быть покрыта полимерами, такими как поли-L-лизин и PLGA, и/или полисахариды, такие как альгинат, декстран, гидрохлорид диэтиламиноэтилдекстрана (DEAE) или хитозан. Способы прикрепления этих покрывающих материалов могут включать электростатическое или ковалентное взаимодействие. Для улучшения свойств микропузырьков могут быть использованы различные материалы для покрытия (полимеры, полисахариды, белки и т.д.), например, путем повышения жесткости, стабильности в циркуляции и/или способности проникать в ткани реагентов на основе микропузырьков, манипулируя результирующим поверхностным зарядом микропузырька и, возможно, самое главное, путем увеличения его полезной нагрузки. Одним из способов достижения увеличения полезной нагрузки является применение поэтапного способа сборки (LBL). Это включает в себя прикрепление нескольких слоев соносенсибилизатора к предварительно сформированным микропузырькам для увеличения емкости соносенсибилизатора. Способ LBL описан Borden et al. в DNA and polylysine adsorption and multilayer construction onto cationic lipid-coated microbubbles DNA и, Langmuir 23(18): 9401-8, 2007.

Кроме того, покрытие микропузырьков может повысить стабильность полезной нагрузки, особенно когда материал покрытия служит в качестве матрицы иммобилизации для соносенсибилизатора или химиотерапевтического агента (например, путем сшивания).

Также могут быть использованы липиды, образующие монослойную, двухслойную или многослойную структуру. Примерами таких липидов являются однослойные или многоламмелярные липосомы и мицеллы.

Любая из описанных в данном документе микропузырьковых оболочек может содержать дополнительные компоненты, которые способствуют доставке пузырька в целевой участок. Например, они могут функционализироваться таким образом, чтобы они включали или связывали с ним лиганд или нацеливающий агент, который способен связываться с клеткой-мишенью или тканью. Примеры подходящих нацеливающих агентов включают антитела и фрагменты антител, молекулы адгезии клеток и их рецепторы, цитокины, факторы роста и рецепторные лиганды. Такие агенты могут быть присоединены к микропузырькам с использованием способов, известных в данной области техники, например, путем ковалентного сочетания, используя молекулярные спейсеры (например, ПЭГ) и/или способа образования комплекса авидин-биотин. Например, включение конъюгата липид-ПЭГ-биотин в микропузырьки на основе липидов с последующим добавлением авидина позволяет функционализировать поверхность микропузырьков биотинилированным нацеливающим лигандом. Герцептин является примером антитела, которое может быть конъюгировано с оболочкой микропузырьков с целью нацеливания.

Газ в сердцевине микропузырьков должен быть биосовместимым. Термин «газ» охватывает не только вещества, которые являются газообразными при комнатной температуре и давлении, но также и те, которые находятся в жидкой форме при данных условиях. Когда «газ» является жидким при температуре окружающей среды, он обычно подвергается фазовому переходу в газ при температуре 30°C или выше, более предпочтительно 35°C или выше. Для любого газа, который является жидкостью при температуре окружающей среды, обычно предпочтительно, чтобы данное соединение подверглось фазовому переходу в газ при температуре между около 30 и 37°C, предпочтительно при нормальной температуре тела. Таким образом, любая ссылка на «газ» должна рассматриваться как охватывающая не только газы и жидкости, но также жидкие пары и любую их комбинацию, например, смесь жидкого пара в газе.

Газы, которые пригодны для включения в микропузырьки для применения по данному изобретению, включают воздух, азот, кислород, диоксид углерода, водород; инертные газы, такие как гелий, аргон, ксенон или криптон; фториды серы, такие как гексафторид серы, декафторид дисеры; низкомолекулярные углеводороды, такие как алканы (например, метан, этан, пропан, бутан), циклоалканы (например, циклопропан, циклобутан, циклопентан), алкены (например, этилен, пропен); и алкины (например, ацетилен или пропин); простые эфиры; сложные эфиры; галогенированные низкомолекулярные углеводороды; и их смеси.

Примерами подходящих галогенированных углеводородов являются такие, которые содержат один или большее количество атомов фтора и включают, например, бромхлордифторметан, хлордифторметан, дихлордифторметан, бромтрифторметан, хлортрифторметан, хлорпентафторэтан, дихлортетрафторэтан, хлортрифторэтилен, фторэтилен, этилфторид, 1,1-дифторэтан и перфторуглероды.

Примеры подходящих фторуглеродных соединений включают перфторуглероды. Перфторуглероды включают перфторалканы, такие как перфторметан, перфторэтан, перфторпропаны, перфторбутаны, перфторпентаны, перфторгексаны и перфторгептаны; перфторалкены, такие как перфторпропен, перфторбутены; и перфторциклоалканы, такие как перфторциклобутан.

Микропузырьки, содержащие перфторированные газы, в частности, перфторуглероды, такие как перфторпропаны, перфторбутаны, перфторпентаны и перфторгексаны, пригодны для применения в данном изобретении из-за их стабильности в кровотоке.

В данном изобретении могут применяться микропузырьки, содержащие перфторуглерод, в частности перфторалкан, и оболочку, содержащую фосфолипид, и описаны, например, Nomikou & McHale, Cancer Lett., 296: 133-143, 2010. Одним из примеров такого микропузырька является Sonidel SDM202 (доступный от Sonidel Ltd.). Перфторуглерод может либо присутствовать в виде газа, либо в жидкой форме. Те пузырьки, которые содержат жидкое ядро, могут быть получены из наноэмульсий, которые затем могут быть превращены в газовый микропузырек после воздействия ультразвука, например, как описано в Rapoport et al., Bubble Sci. Eng. Technol. 1: 31-39, 2009.

Особенно предпочтительными для применения в данном изобретении являются микропузырьки, которые переносят кислород. Поскольку кислород является ключевым субстратом для SDT, и многие виды рака являются гипоксическими, заполнение ядра пузыря кислородным газом усиливает сонодинамический эффект и количество произведенного синглетного кислорода.

Когда микропузырек загружен как химиотерапевтическим агентом, так и соносенсибилизатором, он предпочтительно будет содержать кислород (например, он будет содержать газ кислород). В случае применения различных микропузырьков в комбинированной терапии, описанной в данном документе, предпочтительно, чтобы по меньшей мере один тип микропузырьков включал кислород. Например, микропузырек, конъюгированный с соносенсибилизатором, может включать кислород и/или микропузырек, несущий химиотерапевтическое средство, может включать кислород. В предпочтительном варианте осуществления все применяемые микропузырьки будут содержать кислород (например, газ О₂), т.е. указанные пузырьки будут "наполненными O₂".

Соносенсибилизаторы, которые могут быть применены в данном изобретении, включают соединения, которые делают клетки-мишени или ткани гиперчувствительными к ультразвуку. В некоторых случаях соносенсибилизатор может быть способен преобразовывать акустическую энергию (например, ультразвук) в ROS, что приводит к токсичности для клеток. Другие могут обусловливать гиперчувствительность клетки-мишени или тканей к ультразвуку, нарушая целостность клеточной мембраны. Хорошо известно, что многие известные соносенсибилизаторы могут облегчить фотодинамическую активацию и могут также применяться для визуализации клеток или тканей, чувствительных к свету.

В одном варианте осуществления данного изобретения соносенсибилизатор может одновременно функционировать как средство визуализации, например, в качестве агента NIR. Такие сенсибилизаторы предлагают преимущества с точки зрения их потенциала визуализации, позволяющего отслеживать конъюгаты in vivo.

Примеры соединений, подходящих для применения в качестве соносенсибилизаторов в данном изобретении, включают фенотиазиновые красители (например, метиленовый синий, толуидиновый синий), бенгальский розовый, порфирины (например, Photofrin®), хлорины, бензохлорины, фталоцианины, нафталоцианины, порфицены, цианины (например, Мероцианин 540 и индоцианиновый зеленый), азодипирометины (например, BODIPY и их галогенированные производные), акридиновые красители, пурпурины, феофорбиды, вердины, псоралены, гематопорфирины, протопорфирины и куркумины. Могут также применяться любые известные аналоги или производные указанных агентов. Подходящие производные включают фармацевтически приемлемые соли.

Предпочтительными для применения в качестве соносенсибилизаторов в данном изобретении являются метиленовый синий, бенгальский розовый, индоцианиновый зеленый (ICG, также известный как Cardio Green) и любые аналоги и его производные. ICG имеет следующую структуру:

Известные аналоги любого из соносенсибилизаторов, описанных в данном документе, также могут быть применены в данном изобретении. Особенно подходящими являются структурные аналоги красителей на основе цианина, например, структурных аналогов ICG и их фармацевтически приемлемых солей. Примеры таких соединений включают цианиновые красители IR820 и IR783, оба из которых являются коммерчески доступными:

Флуоресцентный краситель, абсорбирующий в ближней области ИК спектра (NIR), одобренный FDA, предназначен для использования в медицинской визуализации. Он сильно поглощает в области NIR (750-900 нм) и имеет то преимущество, что его можно активировать светом на большей глубине в ткани человека (проникновение света при 800 нм в четыре раза больше, чем при 600 нм). Однако эффективность образования синглетного кислорода (SOG) цианиновыми красителями, такими как ICG, IR820 и IR783, относительно невелика по сравнению с другими известными сенсибилизаторами, такими как бенгальский розовый. Это можно преодолеть, концентрируя больше молекул цианина на микропузырьке.

Были предприняты другие попытки улучшить способность генерации ROS цианиновыми красителями путем включения атомов галогена (например, иода и брома) в их структуру. Например, в US 2013/0231604 (полное содержание которого включено в данный документ посредством ссылки) предлагается, чтобы красители на основе цианина и аналоги таких красителей можно было модифицировать путем включения трех атомов йода в бензольную или нафталиновую часть каждого бензазола или нафтазола. Любой из полиметиновых красителей (в частности, цианинов), описанных в данном документе, может быть использован в качестве соносенсибилизатора по данному изобретению ROS.

При разработке работы, задокументированной в US 2013/0231604, авторы данного изобретения получили структурные аналоги некоторых цианиновых красителей (например, IR783), несущих либо один, либо два атома галогена (например, иод или бром, предпочтительно иод) на каждом из бензазольных колец, и обладают повышенной способностью генерировать ROS и, таким образом, являются более цитотоксичными по отношению к раковым клеткам (например, раковым клеткам поджелудочной железы) при активации ультразвуком по сравнению с ICG. Не желая связывать себя теорией, мы считаем, что присутствие атомов галогена увеличивает интеркомбинационную конверсию (ISC) от возбужденного синглета до возбужденного триплетного состояния, что известно как «эффект тяжелых атомов». Возбужденное триплетное состояние затем может взаимодействовать с молекулярным кислородом или другими субстратами для генерации ROS. То, что такой уровень повышенной способности генерировать ROS может быть достигнут путем замены меньшего количества (то есть всего 2 или 4) атомов водорода в IR783 с атомами галогена (например, иода), не может быть предсказано в свете этого факта US 2013/0231604.

Кроме того, как будет рассмотрено более подробно ниже, авторы неожиданно обнаруживают, что когда IR783 замещен в общей сложности двумя атомами галогена (т.е. только одним атомом галогена, например иодом, на каждом из бензазольных колец), соединение остается высоко флуоресцентным и, таким образом, может также использоваться в качестве агента визуализации NIR. Поскольку любое увеличение ISC обычно уменьшает способность соединения излучать флуоресценцию, данное открытие является неожиданным. При объединении потенциал визуализации NIR и потенциал сенсибилизатора указанных конкретных аналогов IR783 означает, что данные соединения обладают «лечебно-диагностическим» потенциалом, то есть способностью функционировать как терапевтический и диагностический агент.

Галогенированные (например, йодированные) аналоги IR783, которые раскрыты здесь, являются новыми химическими объектами и представляют собой дополнительный аспект изобретения. В соответствии с дополнительным аспектом в изобретении, таким образом, предложено соединение формулы I или формулы II или его фармацевтически приемлемая соль:

(где в формуле I и формуле II каждый X независимо выбран из атома брома и иода, где, предпочтительно, каждый X представляет собой иод).

Подходящие соли таких соединений и способы их получения могут быть легко выбраны специалистами в данной области техники. Соединения могут, например, превращаться в подходящую их фармацевтически приемлемую соль с неорганическим или органическим основанием. Основания, которые могут быть пригодны для данной цели, включают гидроксиды щелочных и щелочно-земельных металлов, например, гидроксид натрия, гидроксид калия или гидроксид цезия, аммиак и органические амины, такие как диэтиламин, триэтиламин, этаноламин, диэтаноламин, циклогексиламин и дициклогексциламин. Методы солеобразования являются общепринятыми в данной области техники.

Предпочтительные соединения формулы I и II включают следующие и их фармацевтически приемлемые соли:

Фармацевтические композиции, содержащие любое из соединений формулы I, II, Ia или IIa, или его фармацевтически приемлемую соль вместе с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентом представляют собой дополнительный аспект изобретения.

Указанные новые соединения могут быть получены способами, известными специалистам в данной области техники и проиллюстрированы с помощью приведенных в данном документе примеров. Способы получения таких соединений также являются частью данного изобретения.

В соответствии с дополнительным аспектом изобретение, таким образом, в изобретении предложен способ получения соединения формулы I или II, включающий следующие стадии:

(а) введение в реакцию соединения формулы III:

с соединением формулы IV или V:

(где, в формуле IV, X представляет собой атом брома или иода, и в формуле V каждый X независимо выбран из атома брома и иода); а также

(b) необязательное превращение полученного соединения в его фармацевтически приемлемую соль.

Изобретение также предусматривает применение любого из соединений формулы I, II, Ia и IIa и их фармацевтически приемлемых солей в качестве лекарственного средства, например, в качестве терапевтического, диагностического или терапевтического агента (то есть, имеющего как терапевтическую, так и диагностическую функциональность). В частности, они могут быть применены в методе PDT и/или SDT или в методе визуализации in vivo (например, визуализации NIR), особенно в таких способах для лечения и/или диагностической визуализации глубоко расположенных клеток, таких как опухолевые массы. При применении в способах PDT можно использовать активирующий свет, имеющий длину волны в ближней области ИК спектра, например, от 700 до 900 нм, более конкретно от 750 до 850 нм. При активации светом NIR или ультразвуковой активации указанные соединения обладают повышенной способностью генерировать ROS и более токсичны для раковых клеток (например, поджелудочной железы и цервикальных раковых клеток), чем ICG.

Применение соединений формулы I или Ia или их фармацевтически приемлемых солей в качестве агентов визуализации NIR, предпочтительно в виде комбинированных сенсибилизаторов и агентов визуализации NIR в PDT и/или SDT, представляет собой предпочтительный вариант осуществления изобретения.

Микропузырьки, несущие любой из галогенированных сенсибилизаторов, описанных в данном документе, в частности соединения формулы I, II, Ia, IIa и их фармацевтически приемлемые соли, и способы получения таких микропузырьков также являются частью изобретения. Такие комплексы микропузырьковых сенсибилизаторов могут быть получены с использованием любого из способов, описанных в данном документе в отношении прикрепления соносенсибилизатора к микропузырьку. Предпочтительно, такие способы будут включать стадию биотинилирования галогенированного сенсибилизатора и связывания этого с микропузырьком функционализированным биотин-авидином.

Способы образования микропузырьков известны в данной области техники. Такие способы включают образование суспензии газа в водной среде в присутствии выбранного материала оболочки. Способы, используемые для образования микропузырьков, включают обработку ультразвуком, высокоскоростное перемешивание (механическое перемешивание), коаксиальное электрогидродинамическое распыление и микрожидкостную обработку с использованием Т-перехода (см., например, Stride & Edirisinghe, Med. Biol. Eng. Comput., 47: 883-892, 2009). Ультразвуковая обработка широко используется и в целом предпочтительна. Данный способ может быть выполнен с использованием ультразвукового излучающего преобразователя. Более конкретно, водную суспензию компонентов микропузырьковой оболочки обрабатывают ультразвуком в присутствии соответствующего газообразного микропузырькового компонента, например, кислорода.

Другие способы, которые могут быть использованы для образования микропузырьков, включают испарение ядра нанокапель в наноэмульсии (см., например, Rapoport et al., supra). Ядро таких нанокапель, как правило, образуется органическим перфторсодержащим соединением, которое покрывается стенками биодеградируемого амфифильного блок-сополимера, такого как поли(этиленоксид)-сополи(L-лактид) или поли(этиленоксид)-со-капролактон. Альтернативно, наноэмульсии могут быть получены путем экструзии через проклеивающие мембраны, например, с использованием альбумина в качестве материала оболочки. Переход от капли к пузырьку может быть вызван физическими и/или механическими средствами, которые включают тепло, ультразвук и инъекцию через иглу тонкой калибровки. Такие микропузырьки могут быть сформированы в момент введения пациенту (например, во время стадии введения с использованием иглу тонкой калибровки) или in vivo в целевых клетках или тканях мишени (например, подвергая наноэмульсию действию ультразвука).

Введение наноэмульсии, способной образовывать желаемый комплекс (или комплексы) микропузырьков, определенных в данном документе, либо на стадии введения пациенту, либо после введения (т.е. in vivo), входит в объем данного изобретения. Когда желательно, чтобы полученный микропузырек содержал газообразный кислород, это может быть обеспечено в растворенной форме в жидкой сердцевине из перфторуглерода наноэмульсии со сдвигом фазы.

Предлагаемые в данном документе комплексы микропузырьков могут быть получены с использованием способов и методик, известных в данной области техники. Способы, которые могут быть использованы для ковалентного прикрепления химиотерапевтического агента и/или соносенсибилизатора к микропузырьку, включают известные методы образования химической связи. Конкретно использованный метод будет зависеть от точной природы микропузырьков, химиотерапевтического агента и соносенсибилизатора, в частности от природы любых боковых функциональных групп. В случае необходимости один или оба компонента комплекса (например, микропузырьковый и/или соночувствительный или микропузырьковый и/или химиотерапевтический агент) могут быть функционализированы, например, для включения реакционноспособных функциональных групп, которые могут быть использованы для соединения молекул. Подходящие реакционноспособные группы включают кислотную группу, гидрокси, карбонил, галоидангидрид, тиол и/или первичный амин. Способы введения таких функциональных групп хорошо известны в данной области техники.

Примеры способов, которые могут быть использованы для ковалентного связывания микропузырьков с одним или большим количеством химиотерапевтических агентов и/или соносенсибилизаторов, включают, но не ограничиваются ими, следующие: а) способы связывания на основе карбодиимида. Они могут быть использованы для связывания микропузырьков, содержащих функциональные амино-группу или карбоксильную группу, с фрагментом, имеющим либо карбоксильную функциональную группу, либо функциональную амино-группу. Такие способы приводят к образованию сложноэфирных или амидных связей; б) реакция «CLICK» (т.е. реакция 1,3-диполярного циклоприсоединения). Эта реакция может быть использована для взаимодействия с азид- или ацетилен-функционализированными микропузырьками с фрагментом, имеющим либо ацетиленовую, либо азидную функциональную группу; с) образование основания Шиффа (то есть образование имино-связи). Данная реакция может быть использована для связывания функционализированных альдегидом или амином микропузырьков с фрагментом, содержащим амино- или альдегидную функциональную группу; и d) реакция присоединения Михаэля.

Связывание микропузырька с одним или большим количеством химиотерапевтических агентов и/или соносенсибилизаторов черезь связь биотин-авидин может быть осуществлено способами, известными специалистам в данной области техники. В таких способах обе части обычно будут биотинилированы, а авидин затем применяют для образования связи между ними. Пример способа получения конъюгата микропузырек-химиотерапевтический агент, связанного взаимодействием биотина с авидином, представлен на Схеме 1 в Примере 2.

В качестве альтернативы сочетанию химиотерапевтического агента и/или соносенсибилизатора с предварительно сформированным микропузырьком данные фрагменты альтернативно могут быть связаны с липидом (например, с применением любого из способов, описанных выше) и что липид впоследствии может быть включен в липидную оболочку микропузырька во время его получения.

Заряженные соносенсибилизаторы и/или химиотерапевтические агенты могут быть электростатически связаны с заряженным микропузырьком. Например, анионный пузырь может быть связан с катионным соносенсибилизатором или катионным химиотерапевтическим агентом и наоборот. Одним из примеров заряженного соносенсибилизатора является метиленовый синий, который может быть электростатически присоединен к анионному микропузырьку.

Примеры способов получения комплекса микропузырек-соносенсибилизатор описаны в WO 2012/143739, полное содержание которых включено в данный документ посредством ссылки. В качестве примера на Фиг. 2 изображена (а) схематическая иллюстрация получения производного бенгальского розового (обозначено как «RB1») и (б) схематическая иллюстрация ковалентной связи RB1 с микропузырьком. Любой из способов, описанных в WO 2012/143739, может применяться аналогично способу получения комплекса микропузырек-химиотерапевтический агент, описанного в данном документе.

Комплексы микропузырек-химиотерапевтический агент, описанные в данном документе, сами по себе являются новыми и образуют дополнительный аспект изобретения. В одном варианте осуществления данные комплексы также могут быть связаны с одним или большим количеством соносенсибилизаторами, описанных в данном документе. Способы получения комплексов микропузырек-химиотерапевтический агент, включающие этап связывания по меньшей мере одного химиотерапевтического агента с микропузырьком, например, с применением любого из описанных в данном документе способов, образуют еще один аспект изобретения.

Описанные в данном документе комплексы микропузырьков обладают свойствами, которые делают их пригодными в методах сонодинамической терапии.

Комплексы пригодны для лечения расстройств или аномалий клеток или тканей в организме, которые реагируют на сонодинамическую терапию. К ним относятся злокачественные и предраковые состояния, такие как раковые опухоли или опухоли, и их метастазы; опухоли, такие как саркомы и карциномы, в частности солидные опухоли. Изобретение особенно пригодно для лечения опухолей, особенно тех, которые расположены ниже поверхности кожи.

Примерами опухолей, которые можно лечить с применением данного изобретения, являются саркомы, включая остеогенные и саркомы мягких тканей; карциномы, например, молочной железы, легких, мозгового, мочевого пузыря, щитовидной железы, предстательной железы, толстой кишки, прямой кишки, поджелудочной железы, желудка, печени, матки, печени, почек, предстательной железы, цервикальную и яичниковую карциномы; лимфомы, в том числе лимфому Ходжкина и неходжкиновскую лимфому; нейробластому, меланому, миелому, опухоль Вильмса; лейкозы, включая острый лимфобластный лейкоз и острый миелобластный лейкоз; астроцитомы, глиомы и ретинобластомы. Лечение рака поджелудочной железы является предпочтительным аспектом данного изобретения.

В одном аспекте описанные в данном документе комплексы могут применяться в методе сонодинамической терапии и одновременно в способе визуализации in vivo (например, методе диагностической визуализации). В таких методах визуализация может применяться для мониторинга осаждения полезной нагрузки и/или накопления комплекса (или комплексов) на интересующем объекте. Как описано выше, данный аспект изобретения может быть реализован путем выбора сенсибилизатора, который обладает потенциалом визуализации, например, сенсибилизатор, который одновременно функционирует как визуализирующий агент NIR. Альтернативно, известный агент визуализации, такой как агент визуализации NIR, также может быть конъюгирован по меньшей мере с одним из микропузырьков, предлагаемых для применения в данном изобретении. Там, где используется один микропузырек, он может, таким образом, переносить химиотерапевтический агент, сенсибилизатор и агент визуализации NIR. Когда различные микропузырьки используются для переноса химиотерапевтического агента и сенсибилизатор, средство визуализации NIR может быть конъюгировано (например, с помощью нековалентной связи, такой как взаимодействие биотин-авидин) с одним или обоими типами микропузырьков. Каждый из указанных типов микропузырьков является новым, и они образуют дополнительные аспекты изобретения.

В дополнение к предоставлению средств для нацеливания химиотерапевтического агента и соносенсибилизатора на конкретный сайт in vivo, описанные в данном документе способы могут быть дополнительно применены ex vivo. Например, при аутологичной трансплантации костного мозга при лечении лейкоза костный мозг пациента можно лечить ex vivo путем молекулярного нацеливания комплекса микропузырьков (или комплексов) на раковые клетки. Данные смеси затем могут быть обработаны ультразвуком для уничтожения раковых клеток, и обработанный костный мозг затем может быть применен для восстановления кроветворения у пациента после лучевой терапии. Альтернативно, способы по данному изобретению могут быть осуществлены ех vivo для удаления нежелательных тканей из органов, собранных для обычной трансплантации. Хирургически удаленные ткани могут быть нацелены и поражения разрушены до повторной трансплантации обработанной ткани.

Для применения в любом из описанных в данном документе способов комплексы микропузырьков обычно будут предлагаться в фармацевтической композиции вместе по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентом. Такие композиции образуют дополнительный аспект данного изобретения.

Фармацевтические композиции для применения по данному изобретению могут быть составлены с применением методов, хорошо известных в данной области. Путь введения будет зависеть от предполагаемого применения. Как правило, они будут вводиться системно и, таким образом, могут быть предоставлены в форме, подходящей для парентерального введения, например, интрадермальной, подкожной, внутрибрюшинной или внутривенной инъекцией. Подходящие фармацевтические формы включают суспензии и растворы, которые содержат активные комплексы микропузырьков вместе с одним или большим количеством инертных носителей или эксципиентов. Подходящие носители включают физиологический раствор, стерильную воду, забуференный фосфатом физиологический раствор и их смеси.

Композиции могут дополнительно включать другие агенты, такие как эмульгаторы, суспендирующие агенты, диспергирующие агенты, солюбилизаторы, стабилизаторы, буферные агенты, консерванты и т.д. Композиции можно стерилизовать обычными методами стерилизации.

Растворы, содержащие комплексы, могут быть стабилизированы, например, путем добавления агентов, таких как модификаторы вязкости, эмульгаторы, солюбилизирующие агенты и т.д.

Предпочтительно композиции для применения по данному изобретению будут применяться в форме водной суспензии комплекса (или комплексов) в воде или физиологическом растворе, например, забуференный фосфатом физиологический раствор. Комплексы могут быть поданы в виде лиофилизированного порошка для повторного растворения в месте применения, например, для повторного растворения в воде, солевом растворе или ФСБ.

Способы, описанные в данном документе, включают введение терапевтически эффективного количества композиции, которая содержит загруженные микропузырьки. Затем комплексы микропузырьков могут распределяться до желаемой части или целевой области тела до активации. После введения в организм целевую область подвергают действию ультразвука с частотой и интенсивностью для достижения желаемого терапевтического эффекта. В отношении микропузырька, загруженного сенсибилизатором типичная процедура активации схематически изображена на прилагаемой Фиг. 1. На данной фигуре изображен двухстадийный процесс, в котором микропузырьки (MB) сначала разрушаются сфокусированным ультразвуком, тем самым высвобождая соносенсибилизатор (SS), который затем способен проникать в желаемую ткань-мишень (например, опухоль). Последующая соноактивация соносенсибилизатора в клетках-мишенях приводит к получению синглетного кислорода, который может окислять различные клеточные компоненты, такие как белки, липиды, аминокислоты и нуклеотиды, тем самым разрушая клетки-мишени. Хотя предполагается, что активация соносенсибилизатора обычно происходит после его доставки (т.е. после разрушения микропузырьков для высвобождения соносенсибилизатора), доставка комплекса и активация соносенсибилизатора может, тем не менее, быть одновременной.

Эффективная доза описанных в данном документе композиций будет зависеть от характера комплекса, способа введения, патологического состояния, подлежащего лечению, пациента и т.д. И может быть соответствующим образом скорректирована.

Частота и интенсивность ультразвука, который может быть использован, могут быть выбраны на основе необходимости достижения избирательного разрушения микропузырьков в целевом участке и могут, например, соответствовать резонансной частоте микропузырьков. Ультразвуковые частоты обычно находятся в диапазоне от 20 кГц до 10 МГц, предпочтительно от 0,1 до 2 МГц. Ультразвук может быть доставлен как в виде одной частоты, так и комбинации разных частот. Интенсивность (т.е. плотность мощности) ультразвука может составлять от около 0,1 Вт/см² до около 1 кВт/см², предпочтительно от около 1 до около 50 W/cm². Время обработки обычно находится в диапазоне от 1 мс до 20 минут, и это будет зависеть от выбранной интенсивности, т.е. при низкой интенсивности ультразвука время обработки будет увеличено, а для более высокой интенсивности ультразвука время лечения будет ниже. Ультразвук может применяться в непрерывном или импульсном режиме и может быть либо сфокусирован, либо доставлен в виде столбчатого пучка.

Любой источник излучения, способный производить акустическую энергию (например, ультразвук), может быть использован в описанных в данном документе методах. Источник должен быть способен направлять энергию на целевой участок и может включать, например, преобразователь или устройство, способное направлять энергию в ткань-мишень с поверхности тела.

В тех случаях, когда частоты и/или интенсивности ультразвука, необходимые для достижения кавитации (или уничтожения микропузырьков), и те, которые необходимы для активации активации соносенсибилизатора, различны, данные разные наборы параметров ультразвука (частота/интенсивность) могут применяться одновременно или в двух (или несколько) этапной методике.

Еще один аспект данного изобретения относится к способу сонодинамической терапии клеток или тканей пациента, который включает:

(a) введение в пораженные клетки или ткани эффективного количества композиции, описанной в данном документе; а также

(b) подвергая указанные клетки или ткани действию ультразвука.

В случае, когда применяют соносенсибилизатор, который также реагирует на свет, ультразвуковая активация может сопровождаться активацией света. Также может быть применена фототермическая активация, например, при применении красителя NIR в качестве соносенсибилизатора.

В тех случаях, когда различные микропузырьки применяют для переноса химиотерапевтического агента и соносенсибилизатора, предполагается, что они, как правило, будут совместно введены в одном фармацевтическом препарате, например, водном раствором. Однако в другом варианте осуществления их можно вводить отдельно (например, одновременно или последовательно) в отдельных препаратах.

В следующем аспекте изобретение, таким образом, предложен продукт, содержащий комплекс микропузырек-химиотерапевтический агент, описанный в данном документе, и комплекс микропузырек-соносенсибилизатор, описанный в данном документе для одновременного или последовательного применения в методе сонодинамической терапии и/или диагностической визуализации.

В еще одном аспекте изобретение предложен набор, содержащий: (i) комплекс микропузырек-химиотерапевтический агент, описанный в данном документе; и отдельно (ii) комплекс микропузырек-соносенсибилизатор, описанный в данном документе; необязательно вместе с инструкциями по применению (i) и (ii) в методе сонодинамической терапии и/или диагностической визуализации. При применении активные компоненты набора (то есть (i) и (ii)) могут вводиться одновременно, отдельно или последовательно. В одном варианте осуществления набора компонент (i) и/или (ii) может быть предложен в сухой форме, например, в виде лиофилизированных порошков. В этом случае набор может также содержать контейнер, содержащий стерильную физиологически приемлемую жидкость для повторного растворения порошкообразных форм активных веществ, например, солевой раствор или ФСБ.

Хотя разнообразные способы и способы применения по данному изобретению в основном описаны в данном документе в контексте введения «готового к применению» комплекса микропузырек-соносенсибилизатор, в альтернативном варианте осуществления может быть введен прекурсор комплекса. Используемый в данном документе термин «прекурсор» предназначен для обозначения прекурсора комплекса микропузырек-соносенсибилизатор, который преобразуется in vivo в него и, таким образом, по существу эквивалентен ему. Так, например, термин «прекурсор» охватывает препараты наноэмульсий или нанокапель, которые способны превращаться в желаемый комплекс микропузырек-соносенсибилизатор либо in vivo, либо во время введения. В одном варианте осуществления такие прекурсоры способны превращаться в желаемый комплекс при накоплении в ткани-мишени (например, опухолевой ткани). Последующее распределение к ткани или клеткам-мишеням, переход от капли к пузырьку может быть вызван методами, которые включают ультразвук. Альтернативно, стадия введения прекурсора комплекса может сама вызывать формирование комплекса микропузырек-соносенсибилизатор по данному изобретению. Например, когда прекурсор принимает форму наноэмульсии, переход от капли к пузырьку может быть вызван путем инъекции через иглу тонкой калибровки. Прямое введение подходящих наноэмульсий в клетки-мишени или ткани, например, в опухоли, является предпочтительным аспектом данного изобретения.

Как будет понятно, в любой из композиций способы или применения, описанные в данном документе, любая ссылка на комплекс микропузырек-соносенсибилизатор по данному изобретению может быть заменена подходящим «прекурсором», в соответствии с определением в данном документе.

Препараты наноэмульсий или нанокапель для применения в качестве предшественников микропузырькового соносенсибилизатора по данному изобретению могут быть получены путем соответствующей модификации способов и методик, известных в данной области техники, например, описанных в Rapoport et al. (supra). В таких препаратах сердцевины наноэмульсионных капель, которые могут быть образованы жидким перфторуглеродом (например, перфторалканом), покрыты стенками подходящих полимерных, белковых или липидных образующих оболочки материалов (например, любой из описанных в данном документе полимеров в отношении комплекса микропузырек-соносенсибилизаторы). Связывание оболочек нанокапель с соносенсибилизатором может быть достигнуто с применением традиционно принятых методов и включает любой из описанных выше метод прикрепления соносенсибилизатора к предварительно сформированному микропузырьку. Точный метод будет зависеть от точной природы материала оболочки и соносенсибилизатора, в частности от природы любых боковых функциональных групп. При необходимости функционализированной может как оболочка так и/или соносенсибилизатор, например, включать реакционноспособные функциональные группы, которые могут быть применены для связывания фрагментов. Подходящие реакционноспособные группы включают кислоту, гидрокси, карбонил, галогенангидрид, тиол и/или первичный амин. В одном варианте осуществления оболочка может функционализирована биотином и затем связываться с авидином, чтобы впоследствии облегчить связывание биотинилированного соносенсибилизатора. Когда желательно, чтобы образовавшийся микропузырек содержал газ кислород, перфторуглерод мог действовать как носитель для кислорода в жидкой форме. После образования комплекса перфторуглеродная жидкость насыщается кислородом, который затем испаряется с образованием газообразного кислорода.

Подобным образом, как описано выше в отношении комплексов микропузырек-соносенсибилизатор, в данном изобретении также могут быть применены прекурсоры комплекса микропузырек-химиотерапевтический агент. Подобным образом, они могут находиться в форме наноэмульсии, которая способна образовывать желаемый комплекс либо во время введения, либо в предполагаемом целевом участке.

Далее изобретение будет описано дополнительно со ссылкой на следующие неограничивающие примеры и сопровождающие графические материалы, на которых:

Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение активированного ультразвуком соночувствительного комплекса микропузырек-соносенсибилизатор.

На Фиг. 2 изображена (а) схематическая иллюстрация получения производного бенгальского розового (обозначен как «RB1») и (б) схематическое изображение ковалентной связи RB1 с микропузырьком.

На Фиг. 3 изображены микрофотографии, взятые с объективом с 40 × увеличением О₂МВ после разбавления (1:10) в ФСБ. Масштаб шкалы составляет 20 мкм; (б) распределение по размерам О₂МВ после центрифугирования, полученного при анализе 30 изображений с оптическим микроскопом (незаполненные боксы в левой части графика представляют MB, которые были обнаружены программным обеспечением для анализа изображения, но менее 450 нм, оптическое разрешение системы).

На Фиг. 4 изображен график зависимости % MB, оставшихся после инкубации дисперсий MB в ФСБ, полученных из DBPC или DSPC при 37°C. Величины ошибок представляют собой ± стандартную ошибку, где n=4. *р<0,05 и **р<0,01

На Фиг. 5 изображен график зависимости % увеличения растворенного кислорода для дегазированных растворов ФСБ, содержащих либо О₂МВ, либо PFBMB. Стрелка указывает время применения ультразвука.

На Фиг. 6 изображен график жизнеспособности клеток для клеток(а) ВхРс-3, (b) MIA РаСа-2 и (с) PANC-1, обработанных (слева направо) (i) без обработки (ii) гемцитабином (iii) 5-FU (iv) O₂MB-5FU+US (v) O₂MB-RB+US (vi) смесью O₂MB-RB / O₂MB-5FU - US и (vii) смесью O₂MB-RB / O₂MB-5FU+US. [RB], [5-FU] и [гемцитабином] поддерживали постоянными при 5 мкМ, 100 мкМ и 100 мкМ соответственно. Обработку ультразвуком осуществляли в течение 30 сек при частоте 1 МГц, плотности мощности ультразвука равной 3,0 Вт⋅см^-2 и цикле работы равном 50%, частоте пульса =100 Гц. Величины ошибок представляют собой ± стандартную ошибку, где n=4. *р<0,05, **р<0,01 и ***р<0,001.

На Фиг. 7 изображен график жизнеспособности клеток для ВхРс-3 (черный), MIA РаСа-2 (серый) и PANC-1 (белый) клеток, обработанных смесью PFBMB-RB / PFBMB-5FU+US (слева) или (ii) смесью О₂МВ-RB / O₂MB-5FU+US (справа). Концентрации и параметры США, как на Фиг. 6. Величины ошибок представляют собой ± стандартную ошибку, где n=4 **р<0,01

На Фиг. 8 изображен график изменения (а) % объема опухоли и (b) средней массы тела для мышей, обработанных (i) без обработки (пустые алмазы) (ii) только ультразвуком (закрашенные алмазы) (iii) гемцитабином (пустые треугольники)(b) (iv) смесью O₂MB-RB / O₂MB-5FU - US (пустые круги) (v) O₂MB-RB+US (закрашенные квадраты) (vi) смесью O₂MB-RB / O₂MB-5FU+US (закрашенные квадраты). Не показаны для простоты иллюстрации обработка только 5-FU, O₂MB-RB - US, O₂MB-5FU+US, O₂MB-5FU - US. Концентрации RB, 5-FU и гемцитабинаподдерживали постоянными при 0,184 мг/кг (90,8 мкМ), 0,115 мг/кг (440 мкМ) и 0,264 мг/кг (440 мкМ) соответственно, обработку ультразвуком осуществляли в течение 30 сек при частоте равной 1 МГц, плотности мощности ультразвука равной 3,0 Вт⋅см^-2 и цикле работы равном 50%, частота пульса =100 Гц. Величины ошибок представляют собой ± стандартную ошибку, где n=4. *р<0,05, **р<0,01 и ***р<0,001 для (vi) по сравнению с (i) и ^Δр<0,05, ^ΔΔр<0,01 и ^ΔΔΔр<0,001 для (vi) по сравнению с (v).

На Фиг. 9 изображен график изменения % объема опухоли у мышей, получавших IP гемцитабин (закрашенные алмазы). Величины ошибок представляют собой ± стандартную ошибку, где n=4.

На Фиг, 10 изображена (а) экспрессия белка Bcl3 и Bcl2 с использованием иммуногистохимии. Внутреннее изображение представляет собой всю секцию, а основное изображение представляет собой выбранную область с увеличением ×20. (b) Оценка гистологии для экспрессии Bcl3 и Bcl2.

На Фиг. 11 изображена (а) количественная экспрессия RT-PCR мРНК Bcl3. (b) Участок профилей экспрессии гена Bcl3 для (i) без обработки (черный), (ii) O₂MB-5FU+US (серый) и (iii) смеси O₂MB-RB / O₂MB-5FU+US (белый). Величины ошибок представляют собой ± стандартную ошибку, где n=3. ***р<0,001.

На Фиг. 12 изображены (а) типичные флуоресцентные изображения голых мышей, несущих эктопические опухоли ВхРС-3, до (t=0), через 5 мин после (t=5) и через 30 мин после (t=30) внутривенное введение конъюгата МВ-9 с с (+US) или без (-US) ультразвука, применяемого к опухоли во время инъекции IV. (b) Участок % увеличения флуоресценции опухоли регистрировался через 5 и 30 мин после внутривенного введения МВ-9 конъюгатов с (США) или без (контрольного) ультразвука, примененного к опухоли во время инъекции IV. Увеличение интенсивности, измеренное относительно опухолей перед обработкой. Величины ошибок представляют собой ± SEM, где n=3. (с) Данные денситометрии (по сравнению с контролем загрузки GAPDH), изображающие экспрессию опухолевого белка Hif1α для мышей, получавших суспензию IV O₂MB или PFBMB. Вставка представляет собой типовое изображение Вестерн-блоттинга экспрессии белка HIF1α в опухолях, обработанных суспензией IV O₂MB или РРВМВ. Величины ошибок представляют собой ± SEM, где n=3. *р<0,05, **р<0,01 и ***р<0,001.

На Фиг. 13 изображен график зависимости роста опухоли от времени для мышей, несущих эктопические опухоли ВхРС3 поджелудочной железы человека, обработанные (i) только несущей средой (открытые круги) или (ii) внутриопухолевой инъекцией I₂-IR783 (100 мкл, 1 мг/кг) в несущей среде ФСБ : ДМСО (98:2) при облучении светом 780 нм в течение 3×3 мин с 1-минутной задержкой между обработками (открытые квадраты). Мыши в группе лечения получили второй курс обработки на 8-й день, который включал 100 мкл O₂MBs (1×10⁸ МП/мл).

На Фиг. 14 изображено (а) спектры УФ видимой части спектра и (b) Спектры флуоресценции ICG (……), I2-IRCYDYE (сплошная линия) и I4-IRCYDYE (-----).

На Фиг. 15 изображен график увеличения интенсивности SOSG при 410 нм для ICG, I2-IRCYDYE и I4-IRCYDYE. Повышенная интенсивность SOSG указывает на образование синглетного кислорода.

На Фиг. 16 изображен график жизнеспособности клеток для клеток Mia Раса (верхние графики) и для клеток BxPC3 (нижние графики), обработанных (a) ICG, (b) I2-IRCYDYE и (с) I4-IRCYDYE с (белые полоски) и без (черные полоски) 780 нм (200 мВт) света за 1 мин.

На Фиг. 17 изображена обработка клеток MiaPaCa2 с применением способа на основе бенгальского розового1 (RB), 5-фторурацила (5FU) и комбинированной терапии RB/5FU ± ультразвук, чтобы определить, существует ли какая-либо синергия при сочетании лечения SDT и 5-FU. Клетки инкубировали с 3 мкМ RB и 50 мкМ 5FU (или обоими) в течение 3 ч, поскольку они представляют собой сублетальные дозы и позволяют идентифицировать синергию, если она очевидна. Ультразвуковое воздействие составляло 30 сек, 3 Ват/см², 1 МГц, 50% цикл работы; частота повторения импульсов равна 100 МГц. Жизнеспособность клеток определяли через 24 ч после обработки, используя МТТ-тест.

На Фиг. 18 изображено схематическое изображение наполненных кислородом микропузырьков с доксорубицином (Dox-О₂МВ) и бенгальским розовым (RBO₂MB), прикрепленным к поверхности.

На Фиг. 19 изображен график изменения % объема опухоли во времени для ксенотрансплантата MDA-MB-231 опухолей молочной железы человека, обработанных (i) только несущей средой (ii) DoxO₂MB+US (iii) RBO₂MB+US или (iv) смешанными DoxO₂MB / RBO₂MB+US. Внутриутробную инъекцию 100 мкл вводили на 0 и 14 дни, отражающую дозу MB, содержащую 300 мкМ и 475 мкМ RB и DOX соответственно для групп (ii) и (iii) и 150 мкМ и 237,5 мкМ RB и DOX соответственно для группы (iv). Ультразвуковое воздействие было равно 3,5 мин, 3 Ват/см², 1 МГц, 50% цикл работы; частота повторения импульсов 100 МГц.

ПРИМЕРЫ

Реагенты и оборудование:

Натриевая соль бенгальского розового, 2-бромэтиламин, NHS-биотин, МТТ, авидин, FITC-авидин, хлоруксусная кислота, 4-диметиламинопиридин (DMAP), гидроксибензотриазол (HOBt), N,N'-дициклогексилкарбодиимид (DCC), безводный диметилформамид (ДМФА) и этанол были приобретены у Sigma Aldrich (Великобритания) самой высокой степени очитки. Биотин, 5-фторурацил, ди-(N-сукцинимидил)карбонат и 2-аминоэтанол были приобретены у Tokyo Chemical Industry UK Ltd. 1,2-дибегеноил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DSPC), дибегеноилфосфатидилхолин (DBPC), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[амино(полиэтиленгликоль)-2000 (DSPE-PEG (2000)) и DSPE-PEG(2000)-biotin были приобретены у Avanti Polar Lipids (Alabaster, Алабама, США). Доксорубицин был приобретен у ХАВС (Китай). Газообразный кислород был куплен у ВОС Industrial Gases Соединенное Королевство, тогда как газообразный перфторбутан (PFB) был куплен у Apollo Scientific Ltd. Фосфатно-солевой буфер (ФСБ) был куплен у Gibco, Life Technologies, Соединенное Королевство.

ЯМР-спектры записывали на спектрометре Varian 500 МГцМГц. ЭСИ-МС характеризация была достигнута с использованием масс-спектрометра с квадрупольной ионной ловушкой LCQTM (Finnigan МАТ, Сан-Хосе, Калифорния, США) применяя электроспрей ионизацию (ЭСИ). Оптические изображения получали с помощью оптического микроскопа оптического микроскопа (оптический микроскоп Leica DM500). Растворенный кислород измеряли, используя настольный измеритель растворенного кислорода Thermo Scientific Orion Star A216. Ошибка была выражена в виде ± SEM (среднее квадратическое отклонение среднего) в то время как статистические сопоставления проводились с использованием непарные данные t-критерия Стьюдента.

Пример 1 - Получение микропузырьков загруженных O₂ (O₂MBs)

DSPC MB получили, как описано в McEwan et al. (J Control Release. 2015; 203, 51-6). Однако для улучшения как физической стабильности MB, так и их устойчивости по отношению к удерживанию O₂, использовали длинноцепочечный липид дибегеноилфосфатидилхолин (DBPC) вместо дистеароилфосфатидилхолина (DSPC) как это было показано в предыдущей работе для уменьшения диффузионности поверхности MB и, следовательно, улучшения стабильности.

Для получения MB DBPC, DBPC (4,0 мг, 4,43 мкмоль), DSPE-PEG (2000) (1,35 мг, 0,481 мкмоль) и DSPE-PEG (2000)-биотин (1,45 мг, 0,481 мкмоль) в молярном соотношении 82:9:9 растворили в хлороформе и поместили в стеклянную пробирку. Раствор нагревали до 40°C пока весь хлороформ не испарился. Прибавили ФСБ (рН 7,4±0,1) (5 мл) к высушенной липидной пленке, и содержимое нагревали выше температуры фазового перехода липида (>70°C) при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в течение 30 минут. Затем суспензию обрабатывали ультразвуком с помощью ультразвукового разрушающего устройства Microson в течение 1,5 мин (100 Watts, 22,5 кГц при настройке мощности 4), свободное пространство заполнили перфторбутановым (PFB) газом и поверхность газ/ жидкость обрабатывали ультразвуком (мощность 19) в течение20 с образованием PFBMB. Суспензию МП охлаждали на ледяной бане в течение около 10 минут. Затем к охлажденной суспензии MB прибавили водный раствор авидина (50 мкл, 10 мг/мл) и перемешивали в течение дополнительных 10 минут. Затем суспензию центрифугировали (300 об./мин, 10 мин) и полученную "лепешку" MB концентрировали в 1 мл ФСБ (рН 7,4±0,1). Указанный раствор был разделен на два пробирки для лиофильной сушки. Для PFBMB пробирки затем были обжаты (запечатаны металлической крышкой). Для создания заполненных кислородом MB свободное пространство пробирки и суспензию MB продували под положительным давлением газообразного кислорода в течение 2 мин, после чего пробирку обжимали. После получения, как описано выше, образцы MB были визуализированы с помощью обычной оптической микроскопии для определения их распределения и концентрации по размеру. 10 мкл образцов удаляли из каждой суспензии и разбавляли в 90 мкл ФСБ (рН 7,4±0,1) с последующим обследованием на гемоцитометре (Bright-Line, Hausser Scientific, Хоршем, Пенсильвания, США). Изображения были получены с линзами объектива 40х на оптическом микроскопе Leica DM500. Распределение MB по размеру и концентрацию затем получили с использованием специального программного обеспечения для анализа изображений Matlab (2010В, The MathWorks, Натик, Массачусетс, США).

Данные MB имели средний диаметр равный 1-2 мкм с концентрацией около 1×109 МВ/мл как определено путем анализа изображений оптической микроскопии (Фиг. 3). Чтобы определить влияние включения DBPC на стабильность MB, мы инкубировали ФСБ-дисперсии MB, приготовленные с помощью DBPC или DSPC при 37°C и подсчитали количество жизнеспособных MB, оставшихся с различными временными интервалами. Результаты изображены на Фиг, 4 и указывают на значительное улучшение стабильности для MB, полученных из DBPC, по сравнению с препаратами, полученными с использованием DSPC. Действительно, после трехчасовой инкубации 80% DBPC MB остались, в то время как количество DSPC MB сократилось до 54%. Указанные результаты согласуются с результатами предыдущих исследований, которые показали, что увеличение длины ацильной цепи липида снижает как механическую гибкость микропузырьков, так и поверхностную диффузию.

Пример 2 - Получение биотинилированного бенгальского розового и биотинилированного 5-FU

Схема 1 (а) Синтетическая схема получения биотин-5-FU (5). (b) Схематическое представление структуры конъюгатов О₂МВ-PvB и O₂MB-5FU.

Биотин функционализированный бенгальский розовый (6) получали, как описано в McEwan et al. (J Control Release. 2015; 203, 51-6). Функционализированный биотином 5-FU (5) синтезировали в соответствии со схемой 1а в соответствии с методиками, изложенными ниже.

Получение N-(2-гидроксиэтил)-5-(2-оксогексагидро-1H-тиено[3,4-d]имидазол-4-ил)пентанамида (2):

К охлажденному на ледяной бане раствору биотин-N-гидроксисукцинимидного эфира (1) (полученного реакцией между биотином и ди(N-сукцинимидил) карбонатом) описанном в Kang et al., Jr. Rapid Commun Mass Spectrom. 2009, 23(11), 1719-1726) (3,75 g, 11 ммоль) в безводном ДМФА (40 мл), прибавили 2-аминоэтанол (1,0 мл, 16,4 ммоль) и смесь перемешивали при 25°C в течение 30 мин. Ход реакции контролировали с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) (Merck Silica 60, HF 254, 20:80 метанол-дихлорметан, об./об.). Биотин-N-гидроксисукцинимидный эфир (R_f=0,76) поглотился в течение 15 мин при сопутствующем образовании спиртового продукта (R_f=0,47). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток выпаривали совместно с ДМФА для удаления избыточных количеств 2-аминоэтанола. Белый остаток перекристаллизовывали из воды, чтобы получить 2 в виде светло-желтого твердого вещества (1,7 г, 38%). Аналитический образец был получен из второй перекристаллизации, Т.пл. 192-195°C. ¹НЯМР (500 МГц, D₂O) 4,49-4,47 (m, 1Н, -СН), 4,31-4,30 (m, 1Н, -СН), 3,53-3,51 (m, 2H, CH₂), 3,23-3,18 (m, 3Н, СН и СН₂), 2,85-2,64 (m, 2Н, СН₂), 2,15 (t, 2Н, -СН₂), 1,62-1,46 (m, 4Н, СН₂ X 2), 1,32-1,26 (m, 2Н, СН₂).

¹³СЯМР (125 МГц, D₂O) 177,09 (С=O), 61,98 (СН₂), 60,19 (СН), 59,91 (СН), 55,24 (СН), 41,29 (СН₂), 39,61 (СН₂), 35,42 (СН₂), 27,77 (СН₂), 27,56 (СН₂), 25,02 (СН₂).

ЭСИ-МС (М+Н⁺): найдено 288,70, рассчитано для C₁₂H₂₁N₃O₃S=287,13.

Получение 5-фторурацил-1-карбоновой кислоты (4):

Смесь 5-фторурацила (3) (5 г, 38,4 ммоль), гидроксида калия (9,07 г, 161,6 ммоль) и хлоруксусной кислоты (3,63 г, 38,4 ммоль) в 100 мл воды нагревали с обратным холодильником в течение 2 ч при 70°C. После охлаждения до комнатной температуры рН раствора доводили до 5,5 путем добавления концентрированной соляной кислоты. Затем реакционную смесь держали в холодильнике (5°C) в течение 18 ч и полученные белые кристаллы выделили путем фильтрования и промывали холодной водой для получения 4 с выходом 52,5%.

Т. пл.>200°C.

¹НЯМР (500 МГц, D₂O) 7,76 (d, 1Н, J=6 Hz, СН), 4,29 (s, 2H, CH₂).

¹³C ЯМР (D₂O): 173,58 (С=O), 159,97 (С=O), 150,80 (С=O), 141,20 (C), 131,74 (CH), 51,48 (CH₂).

ЭСИ-МС (M-H⁺): найдено 187,10, рассчитано для C₆H₅O₄N₂F=188,11.

Получение 2-(5-(2-оксогексагидро-1H-тиено[3,4-d]имидазол-4-ил)пентанамидо)этил-2-(5-фтор-2,4-диоксо-3,4-дигидропиримидин-1(2Н)-ил)ацетата (5):

N-(2-Гидроксиэтил)-5-(2-оксогексагидро-1H-тиено[3,4-d]имидазол-4-ил)пентанамид (2) (0,5 г, 1,7 ммоль), 5-фторурацил-1-карбоновую кислоту (4) (0,4 г, 2,1 ммоль), DMAP (0,023 g, 0,17 ммоль) и НОВТ (0,023 г, 0,17 ммоль) прибавили к 20 мл безводного ДМФА в 100 мл двухгорлой круглодонной колбе в атмосфере N₂. Смесь нагревали при 40°C и перемешивали до получения гомогенного раствора. Затем к реакционной смеси прибавили DCC (0,4 г, 1,9 ммоль) и оставили перемешиваться при комнатной температуре в течение 12 ч. ДМФА удалили при пониженном давлении, прибавили диэтиловый эфир (50 мл) и содержимое перемешивали в течение 20 мин. Полученный белый полутвердый продукт удалили фильтрованием и после удаления избытка диэтилового эфира при пониженном давлении сырой продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (колонка С-18) с использованием ацетонитрил/вода (80:20 по объему) в качестве подвижной фазы. Продукт 5 получили после лиофилизации желаемых фракций в виде белого полутвердого вещества (0,24 г, выход 30% Ч).

¹НЯМР (500 МГц, D₂O): 7,67 (d, 1H, J=6,0 Hz, СН), 4,50-4,47 (m, 1H, CH), 4,31-4,29 (m, 1H, CH), 4,19 (s, 2H, CH₂), 3,54 (t, 2H, CH₂), 3,22-3,19 (m, 2H, CH₂), 2,89-2,86 (m, 1H, CH), 2,67-2,64 (m, 2H, CH₂), 2,17-2,14 (m, 2H, CH₂), 1,61-1,47 (m, 4H, CH₂ X 2), 1,47-1,28 (m, 2H, CH₂).

¹³СЯМР 125 МГц, D₂O): 177,12 (С=O), 173,74 (С=O), 165,33 (С=O), 160,01 (С=O), 159,81 (С=O), 141,14 (C), 131,71 (CH), 62,00 (CH₂), 60,22 (CH), 59,94 (CH), 55,26 (CH), 51,53 (CH₂), 41,31 (CH₂), 39,64 (CH₂), 35,45 (CH₂), 27,79 (CH₂), 27,58 (CH₂), 25,14 (CH₂).

ЭСИ-МС (M - H⁺) найдено 456,20, рассчитано для C₁₈H₂₄FN₅O₆S=457,48.

Пример 3 - Получение конъюгатов O₂MB-Бенгальский розовый и O₂MB-5FU

Насыщенные растворы 5 (91,2 мМ) и 6 (0,61 мМ) получали в 0,5% растворе ДМСО в ФСБ (рН 7,4±0,1). Аликвоту 0,3 мл данных исходных растворов затем добавляли отдельно к 1 мкл двух суспензий авидина, функционализированного PFBMB (1×10⁹ МП/мл) и содержимое перемешивают, встряхивая в течение 15 минут. Затем суспензии центрифугировали (900 об/мин) в течение 5 мин, а конъюгаты MB выделяли в виде молочной суспензии, плавающей поверх раствора. Раствор удалили и заменяли еще 0,3 мл исходного раствора, содержащего либо 5 или 6, и повторили стадии смешивания/центрифугирования. Затем суспензии MB промывали ФСБ (5 мл), центрифугировали (900 об./мин) в течение 5 минут и переносили MB в чистую центрифужную пробирку. Данную процедуру промывки снова повторяли и PFBMB-RB и изолированные конъюгаты PFBMB-5FU помещали в стеклянный флакон. Затем конъюгаты PFBMB-RB и PFBMB-5FU затем барботировали газообразным кислородом в течение 2 мин, и в полученные конъюгаты O₂MB-RB и O₂MB-5FU смешивали вместе в соотношении 1:3,25 для получения конечной суспензии, содержащей 6,8×10⁷ МП/мл с 90,8 мкМ RB и 440 мкМ 5-FU.

Данную смесь O₂MB-RB / O₂MB-5FU применили непосредственно в экспериментах in vitro и in vivo, описанных в данном документе.

Пример 4 - Получение конъюгатов O₂MB-IR820

Схема 2 (а) Синтез биотин-функционализированного красителем, поглощающим в области NIR (9). (b) Схематическое изображение конъюгата МВ-9, используемого в экспериментах визуализации.

Синтез 2-((Е)-2-((Е)-2-((4-аминофенил)тио)-3-((Е)-2-(1,1-диметил-3-(4-сульфобутил)-1Н-бензо[е]индол-2(3H)-илиден)этилиден)циклогекс-1-ен-1-ил)винил)-1,1-диметил-3-(4-сульфобутил)-1Н-бензо[е]индол-3-ия (8):

Соединение 7 получили, используя следующую литературную методику (James et al., Evaluation of Polymethine Dyes as Potential Probes for Near Infrared Fluorescence Imaging of Tumors: Part - 1. Theranostics. 2013, 3(9), 692-702). 4-Аминотиофенол (0,63 г, 5 ммоль) растворили в безводном ДМФА (50 мл) в атмосфере N₂. К указанному раствору прибавили 7 (0,6 г, 0,7 ммоль) и смесь перемешивали в течение 18 ч при комнатной температуре. Ход течения реакции контролировали с помощью ТСХ (Merck Silica 60, HF 254, используя 25% МеОН/ДХМ в качестве подвижной фазы). ДМФА удалили при пониженном давлении и остаток повторно растворили в ДМФА (5 мл) и высадили в осадок с помощью Et₂O (15 мл). Твердый продукт отфильтровали, промыли Et₂O (30 мл) и очистили с помощью колоночной хроматографии (силикагель, 60-120 меш), используя МеОН-ДХМ (1:3) в качестве элюирующего агента. Продукт (230 мг, 4,8%) выделили в виде красновато-коричневый полутвердого вещества. Данное соединение не было стабильным и непосредственно использовалось на следующей стадии.

¹Н ЯМР (500 МГц, MeOH-d₄): 8,96-8,93 (m, 2Н, Ar-СН), 8,81-8,78 (m, 2Н, Ar-СН), 8,09-8,07 (m, 2Н, Ar-СН), 7,90-7,89 (m, 6Н, Ar-СН), 7,57-7,51 (m, 4Н, Ar-СН), 7,38 (brs, 2Н, NH₂), 7,38-7,28 (m, 2Н, Ar-СН), 6,34-6,31 (m, 2Н, СН X 2), 4,23 (brs, 4Н, СН X 2, СН₂), 2,87-2,80 (m, 8Н, СН₂ Х 4), 1,98-1,91 (m, 10Н, СН₂ X 5), 1,70 (s, 12Н, СН₃ X 4).

¹³С ЯМР (125 МГц, dmso-d₆): 173,4, 170,2, 150,1, 148,4, 143,7, 144,6, 142,7, 134,3, 133,9, 132,4, 128,0, 126,1, 126,2, 125,5, 125,7, 117,5, 115,4, 104,7, 61,8, 59,3, 49,4, 48,9, 46,8, 30,2, 28,6, 26,8, 26,9, 25,2, 21,0.

ЭСИ-МС рассчитано для C₅₂H₅₈N₃O₆S₃Na₂⁺ = 961,1, найдено 960,3.

Синтез 2-((Е)-2-((Е)-3-((Е)-2-(1,1-диметил-3-(4-сульфобутил)-1Н-бензо[е]индол-2(3H)-илиден)этилиден)-2-((4-(5-(2-оксогексагидро-1Н-тиено[3,4-d]имидазол-4-ил)пентанамидо)фенил)тио)циклогекс-1-ен-1-ил)винил)-1,1-диметил-3-(4-сульфобутил)-1Н-бензо[е]индол-3-ия (9):

Соединение 8 (100 мг, 0,1 ммоль) прибавили к перемешивающемуся раствору 1 (40,9 мг, 0,12 ммоль) в безводном ДМФА (50 мл), к которому прибавили каталитическое количество триэтиламина. Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 5 ч. Реакционную смесь прибавили к эфиру (100 мл) и содержимое перемешивали в течение 30 мин. Осадок собрали фильтрованием и очищали препаративной ТСХ с использованием МеОН : ДХМ (1:4) в качестве элюирующего агента и продукт выделили в виде зеленого порошка. Выход = 21 мг, 18,4%.

¹Н ЯМР (500 МГц, MeOH-d₄): 8,77 (d, J=7,8 Hz, 2H, Ar-СН), 8,2l (d, J=7,5 Hz, 2H, Ar-CH), 8,03-7,99 (m, 2H, Ar-CH), 7,73 (d, J=7,5 Hz, 2H, Ar-CH), 7,60-7,57 (m, 2H, Ar-CH), 7,47-7,44 (m, 2H, Ar-CH), 7,20-7,17 (m, 2H, Ar-CH), 7,16 (d, J=12 Hz, 1H, CH), 6,89-6,83 (m, 2H, Ar-CH), 6,58 (d, J=12 Hz, 1H, CH), 6,42 (brs, 1H, NH), 6,36 (brs, 2H, NH X 2), 4,29-4,27 (m, 6H, CH X 2, NCH₂), 4,10 (brs, 2H, -CH₂), 3,14-3,06 (m, 3H, CH, CH₂), 2,80-2,74 (m, 4H, CH₂ X 2), 2,57-2,48 (m, 4H, CH₂ X 2), 2,19-2,16 (m, 2H, CH₂), 1,88-1,59 (m, 2H, CH₂), 1,76 (s, 12H, CH₃ X 4), 1,59-1,57 (m, 2H, CH₂), 1,48-1,28 (m, 12H, CH₂ X 6).

¹³C ЯМР (125 МГц, dmso-d₆): 177,5, 174,3, 169,9, 166,2, 152,5, 150,2, 148,0, 145,3, 144,8, 140,7, 134,8, 132,6, 131,3, 130,0, 128,5, 126,3, 124,7, 120,1, 116,8, 114,8, 102,5, 64,0, 62,3, 60,1, 54,9, 50,1, 48,6, 48,1, 42,2, 36,7, 32,8, 30,2, 28,4, 28,3, 26,9, 26,0, 24,5, 22,8.

ЭСИ-МС рассчитано для C₆₂H₇₂N₅O₈S₄⁺ = 1142,4 (протонированная форма, М⁺), найдено 1143,4.

Получение конъюгатов O₂MB-IR820:

Функционализированный биотином IR-820 (9) был прикреплен к поверхности O₂MB, следуя методике описанной выше для 5-FU и бенгальского розового. [MB]=2,6×10⁸; [9]=280 мкМ.

Пример 5 - Опосредованное ультразвуком высвобождение O₂ из O₂MB

0,5 мл суспензии O₂MB (1×10⁸), полученного в Примере 1, прибавили к дегазированному ФСБ (рН 7,4±0,1) (4,5 мл). Уровень растворенного кислорода в данном растворе измеряли в течение периода 20 мин с 2 мин интервалами, используя измеритель растворенного кислорода. Ультразвук применяли через 4,5 мин в течение 1 мин, используя частоту 1 МГц, плотность мощности ультразвука 3,0 Вт⋅см^-2 и цикл работы 50% (частота импульса =100 Гц). Контрольные эксперименты с использованием PFBMB также выполняли по той же методике.

Если O₂MB должны быть успешным в качестве носителя для доставки кислорода in vivo, важно, чтобы газовый обмен между сердцевиной MB и кровью был минимизирован до тех пор, пока MB не подвергнется воздействию ультразвука на целевом участке. Время полужизни коммерчески доступных MB колеблется от 0,97 мин у мужчин до 1,23 мин у женщин. Поэтому важно, чтобы O₂MB могли сохранять свой кислород в течение по меньшей мере указанного периода времени в ситуациях, когда может существовать градиент диффузии кислорода. В попытке имитировать такой сценарий, O₂MB (0,5 мл, 1×10⁸) прибавили к 4,5 мл дегазированного ФСБ (рН 7,4±0,1) в стеклянном флаконе и содержимое периодически перемешивали при 37°C. Поскольку O₂MB плавали в верхней части раствора ФСБ, они находились в прямом контакте с воздухом в свободном пространстве открытого флакона. Количество растворенного O₂ в растворе ФСБ определяли, используя измеритель растворенного кислорода и измеряли в течение 4,5 мин до и 14,5 мин после обработки ультразвуком. В качестве контроля, также провели эксперименты с использованием PFBMB. Результаты изображены на Фиг. 5 и иллюстрируют, что O₂MB эффективно удерживают свой O₂ до разрушения при помощи внешнего ультразвука, при котором уровень растворенного кислорода увеличивается более чем на 40% через пять минут после облучения. Напротив, уровень растворенного кислорода в контрольном эксперименте PFBMB увеличился на около 20% через 1 мин после воздействия ультразвука, а затем уменьшился до 5% через пять минут после воздействия ультразвука. Мы считаем, что указанное первоначальное увеличение растворенного O₂ в контрольном препарате было вызвано опосредованным ультразвуком перемешиванием жидкости в измерительной камере. Тем не менее, результаты показывают, что O₂MB эффективно удерживают кислород и воздействие ультразвука приводит к увеличению растворенного кислорода, который поддерживается в течение относительно длительного периода времени в данной системе. Мы полагаем, что указанные временные рамки как удержания, так и высвобождения, опосредованного ультразвуком, позволили бы иметь достаточное время, чтобы обеспечить возможность нацеливания микропузырьков и их газовой нагрузки на конкретный анатомический участок и обеспечить увеличение концентрации растворенного кислорода в микроокружении ткани, которое было бы достаточным для поддержания повышенного уровня ROS во время SDT.

Пример 6 - Эксперименты для определения цитотоксичности in vitro

Клеточные линии первичных панкреатических аденокарциномы человека MIA РаСа-2 и PANC-1 хранили в в среде Игла в модификации Дульбекко, тогда как клетки ВхРС-3 хранили в среде RPMI-1640, ко всем из которых были прибавлена добавка 10% (об./об.) фетальной бычьей сыворотки в увлажненной атмосфере 5% CO₂ при 37°C. Данные клеточные линии высевали в лунки 96-луночного планшета с концентрацией 5×10³ клеток на лунку и инкубировали в течение 21 h при 37°C в увлажненной 5% CO₂ атмосфере до того, как были перенесены в гипоксическую камеру при 37°C (O₂/CO₂/N₂, 0,1:5:94,9 об./об./об.) в течение 3 ч (это предназначено для имитации гипоксических состояний, обнаруженных в опухолевом участке). Затем среду удаляли из каждой лунки и заменяли на O₂MB-RB (50 мкл, 5 мкМ RB) и O₂MB-5FU (50 мкл, 100 мкМ 5FU) конъюгаты. Затем индивидуальные лунки обрабатывали ультразвуком, полученным с помощью сонопоратора Sonorel SP100 (30 сек, частота = 1 МГц, плотность мощности ультразвука = 3,0 Вт⋅см^-2, цикл работы = 50% с частотой повторения импульса = 100 Гц). Клетки выдерживали в гипоксической среде еще в течение 3 часов до того, как раствор для обработки удалили, клетки промыли ФСБ и прибавили свежую среду (200 мкл на лунку). Затем планшеты инкубировали в среде с нормальным содержанием кислорода (т.е. увлажненной атмосфере 5% CO₂ при 37°C) в течение дополнительных 21 часа до того, как жизнеспособность клеток определяли, используя МТТ-тест (McHale et al., Cancer Lett 1988; 41,315-21). Аналогичная процедура повторялась только для несущей среды, гемцитабина (препарат, одобренный для использования при лечении рака поджелудочной железы), 5-FU, O₂MB-5FU+US, O₂MB-RB+US и смеси O₂MB-RB / O₂MB-5FU - US. Bo всех экспериментах использовали количество RB, 5-FU и гемцитабина равное5 мкМ, 100 мкМ и 100 мкМ соответственно. Все группы также повторяли с использованием конъюгатов PFBMB с таким же количеством прикрепленного RB или 5-FU.

Результаты, изображенные на Фиг. 6, показывают, что статистически значимое снижение жизнеспособности наблюдалось во всех трех клеточных линиях для клеток, обработанных комбинированной терапией SDT/антиметаболит (т.е. O₂MB-RB / O₂MB-5FU смесь + US) по сравнению с клетками, обработанными либо терапией антиметаболита (т.е. 5-FU, либо гемцитабином). Действительно, статистически значимое снижение жизнеспособности наблюдалось также для клеток, обработанных комбинированной терапией, по сравнению с клетками, обработанными только SDT (т.е. O₂MB-RB+US). То, что эффект SDT, наблюдаемый в таких гипоксических условиях, значительно усиливается за счет применения O₂MBs было подтверждено путем сравнения разницы в цитотоксичности между смесью O₂MB-RB / O₂MB-5FU с ультразвуковой обработкой и в противном случае идентичной смесью конъюгатов PFBMB с ультразвуковой обработкой (Фиг. 7). Действительно, статистически значимое (р<0,01) снижение жизнеспособности клеток равное более 20% наблюдали для всех трех клеточных линий, обработанных конъюгатами О₂МВ по сравнению с конъюгатами PFBMB. В совокупности результаты, изображенные на Фиг. 6 и 7, четко показывают преимущества, получаемые при сочетании SDT с терапией антиметаболита, особенно в условиях гипоксической среды, когда O₂MBs может обеспечить дополнительный О₂ для улучшения эффекта SDT.

Пример 7 - Эксперименты для определения цитотоксичности in vivo

Клетки ВхРс-3 хранили в среде RPI-1640 с добавкой 10% фетального сывороточного альбумина, как указано выше. Клетки (1×10⁶) были повторно суспендировали в 100 мкл Matrigel^® и имплантировали сзади в спинку самок мышей Balb/c SCID (С.В-17/IcrHan®Hsd-Prkdcscid). Образование опухолей происходило через около 2 недели после имплантации, и измерения опухоли проводили через день с помощью циркулей. Как только опухоли достигли среднего объема 218 мм³, рассчитывали по геометрическому среднему диаметру с использованием уравнения объема опухоли = 4πR³/3, животные были случайным образом распределены на 10 групп (n=4). После введения анестезии (внутрибрюшинная инъекция Hypnorm/Hypnovel), 100 мкл смеси ФСБ, содержащей O₂MB-RB (MB=1,6×10⁷, [RB]=90,8 мкМ) и O₂MB-5FU (MB=5,2×10⁷, [5FU]=440 мкМ) вводили с помощью инъекции непосредственно в каждую опухоль. Внутриопухолевую инъекцию выбирали в качестве пути введения, чтобы исключить экспериментальные изменения, вызванные фармакокинетическим поведением платформы. При необходимости опухоли затем обрабатывали ультразвуком в течение 3,5 мин при частоте ультразвука 1 МГц, плотности мощности ультразвука равной 3,5 Вт⋅см^-2 (I_SATP; пространственный средний временной пик) и используя цикл работы 30% при повторении частоте повторения пульса равной 100 Гц. Дополнительные группы лечения включали (i) без лекарственного средства; (ii) только конъюгат O₂MB-RB ± обработку ультразвуком; и (iii) только конъюгат O₂MB-5FU ± обработку ультразвуком. Также выполняли обработку только гемцитабином (440 мкМ) и 5-FU (440 мкМ). После обработки животным разрешалось выходить из анестезии, а объем опухоли и массу тела регистрировали ежедневно в течение девяти дней. Увеличение % объема опухоли было рассчитано с использованием измерений предварительной обработки для каждой группы.

Объем опухоли измеряли ежедневно в течение 9 дней и % изменения объема опухоли для каждой группы в зависимости от времени. Для удобства интерпретации только результаты шести из десяти групп изображены на Фиг. 8а. Данные результаты свидетельствуют о резком снижении объема опухоли у мышей, получавших комбинированную терапию SDT/антиметаболит по сравнению с одной только терапией гемцитабином или 5-FU. Действительно, через 9 дней после обработки опухоли у мышей, получавших только гемцитабин или 5-FU, выросли на 125,1 и 123,3% соответственно, тогда как опухоли, обработанные смесью O₂MB-RB / O₂MB-5FU+US выросли всего на 29,1% по сравнению с первоначальным начальным объемом за тот же период времени. Кроме того, было также статистически значимое уменьшение объема опухоли для опухолей, обработанных комбинированной терапией SDT / 5-FU (т.е. смесью O₂MB-RB / O₂MB-5FU+US) по отношению к одной обработке SDT только (т.е. O₂MB-RB+US) с опухолями в среднем на 30,2% меньше, чем через 9 дней после обработки. Анализ средней массы тела (Фиг. 8b) для животных в каждой из групп не показал заметных уменьшений в течение эксперимента, предполагая, что обработка не вызывала каких-либо острых побочных эффектов.

В данных экспериментах гемцитабин вводили в виде внутриопухолевой инъекции при концентрации 0,264 мг/кг, чтобы обеспечить прямое молярное сравнение с использованным количеством 5-FU (440 мкМ). Несмотря на то, что это количество доставлялось непосредственно в опухоль, оно значительно меньше, чем нормальная системная доза гемцитабина (120 мг/кг) использованная для мышей.

Чтобы сравнить эффективность комбинированной терапии SDT/5-FU по сравнению с системной терапии гемцитабином, мы обработали мышей, несущих внематочные опухоли ВхРС-3, гемцитабином (120 мг/мг/кг), которым инъекцию вводили внутрибрюшинно (IP) на 0, 3 и 8 день. Объем опухоли измеряли ежедневно, как и раньше, и сравнивали с необработанным контролем животных. Данные результаты (Фиг. 9) показывают, что, хотя объем опухоли в контрольной группе увеличился на около 100%, объем опухоли увеличился на 38% в группе, обработанной гемцитабином, и ни при каких условиях терапия не уменьшила объем опухоли ниже исходного объема опухоли. Напротив, при единичной обработке для комбинированной терапии SDT/5FU (Фиг. 8) объем опухоли уменьшался ниже первоначального объема лечения и оставался таким образом до 6 дней после обработки, тогда как опухоли в группе гемцитабина демонстрировали увеличение объема опухоли на 20% на 6-й день. То, что такой драматический ответ может быть достигнут с применением относительно небольших количеств сенсибилизатора/5-FU и после единичной обработки является чрезвычайно перспективным и предполагает, что целенаправленная доставка таких агентов может обеспечить повышенное терапевтическое преимущество с уменьшенными побочными эффектами.

Пример 8 - Визуализации флуоресценции в области ближнего ИК спектра (NIR) in vivo конъюгатов О₂МВ-9 с последующим введением IV несущим опухоли мышам

Голым бестимусным мышам ввели анастезию (внутрибрюшинная инъекция Hypnorm/Hypnovel) и ввели конъюгат O₂MB-9 (100 мл) через инъекцию в хвостовую вену. В группе лечения ультразвук (условия, описанные выше в 2,10) были применены к опухолям во время и в течение 3 минут после инъекции, в то время как к опухолям контрольной группы ультразвук не применялось (n=3 в каждой группе). Последующее введение (при t=5 мин и t=10 мин), животных помещали в камеру системы визуализации способом флуоресценции Xenogen IVIS® Lumina, используя набор фильтров ICG (возбуждение: 705-780 нм; эмиссия: 810-885 нм). Данные собирали и проанализировали с использованием пакета программного обеспечения Living Image® версии 2,60. Количественные данные были получены путем рисования интересующей области вокруг опухоли и сравнения флуоресцентного сигнала (фотоны/сек) при t=5 и t=10 мин после введения О₂МВ-9 с флуоресцентным сигналом, полученным до введения.

Пример 9 - Иммуногистохимия и анализ qRT-PCR

Мы также были заинтересованы в изучении эффектов комбинированной терапии SDT/5-FU на молекулярном уровне по сравнению с 5-FU-терапией. Для этого опухоли в контрольной группе (то есть не получавшей лечения), группа O₂MB-5FU+US (т.е. 5-FU), и группа смесь O₂MB-RB / O₂MB-5FU смесь + US (т.е. комбинированное лечение) собирали в конце периода мониторинга и подвергали исследованию иммуногистохимии и анализа qRT-PCR.

Экспрессия HIF1α в опухоли после введения IV О₂МВ:

Голым бестимусным мышам ввели анастезию (внутрибрюшинная инъекция Hypnorm/Hypnovel) и как PFBMB так и О₂МВ (100 мкл) вводили через инъекцию в хвостовую вену (n=3 в каждой группе). Ультразвук (условия, как в 2,10 выше) применили к опухоли во время и в течение 3 минут после IV инъекции и опухоли вырезали через 30 минут. Для Вестерн-блоттингового анализа экспрессии белка HIF-1α общий белок экстрагировали с использованием мочевинного буфера. Первичные мышиные антитела, используемые в данных исследованиях, HIF1α (Millipore, 1:500) и anti-GAPDH (Sigma, 1:1000). Образцы белка подвергали электрофорезу на геле 4-12% TruPAGE^® и переносили на нитроцеллюлозные мембраны. Блокирование неспецифического связывания проводили в 5% (мас./об.) бычьем сывороточном альбумине, разведенном в 1х трис-буферном солевом растворе, содержащем 0,05% (об./об.) Твин 20. Мембраны затем инкубировали в соответствующем вторичном козьем антимышиным антителе IgG-HRP (1:10000 исходного раствора). Вторичные антитела были приобретены у Santa Cruz Biotechnology, Гейдельберг, Германия. Денситометрию проводили для количественной оценки экспрессии белка HIF1α, используя GAPDH в качестве стандарта.

Характеризация иммунного ответа:

Для характеристики иммунного ответа в тканях, подвергнутых терапии, экспрессию белка Bcl3 и Bcl2 исследовали с использованием иммуногистохимии в образцах тканей, собранных в конце периода мониторинга. Иммуногистохимическая (IHC) оценка белков Bcl2 и Bcl3 проводилась на парафиновых срезах. Образцы ткани, вложенные в парафин, были отрезаны до толщины 4 мкм с использованием микротома Leica RM2235 (Leica Biosystems Ltd., Ньюкасл) и исследовали на предметном стекле с покрытием. Анализ IHC для Bcl2 (клон: BCL-2/100/D5) и Bcl3 (клон: 1Е8) разбавили 1:200 и 1:150, соответственно. Оба антитела были мышиными антителами, полученными от Leica Biosystems. Иммуноокрашивание проводили с использованием автоматизированной системы Bond-Max (Leica Biosystems Ltd., Ньюкасл), используя адаптированное высокотемпературное демаскирование антигена со связывающим раствором для демаскировки антигена 2 (на основе ЭДТА рН 9,0) в течение 30 мин. Активность эндогенной пероксидазы блокировали с использованием 0,3% перекиси водорода в течение 5 мин. Гистологические образцы инкубировали с первичным антителом в течение 15 мин при комнатной температуре, а предметные стекла инкубировали с кроличьим антимышиным антителом в течение 8 мин при комнатной температуре. Затем предметные стекла инкубировали с козьим антикроличьим полимерным реагентом в течение 8 мин при комнатной температуре. Реакции были проявлены с использованием набора для определения связывания с очищенным полимером и с последующим проявлением цвета с 3,3'-диаминобензидин тетрагидрохлоридом в виде хромогена в течение 10 мин. Интенсивность иммуногистохимии и оценку показателей проводили в соответствии с Allred et al. (Prognostic и predictive factors in breast cancer by immunohistochemical analysis. 1998, 11 (2): 155-68). Для подтверждения иммуногистохимических исследований экспрессия Bcl3 также изучалась на уровне транскрипции, экспрессию мРНК Bcl3 измеряли с помощью геннспецифического qRT-PCR с использованием праймеров, перечисленных в Таблице 1:

qRT-PCR и анализ был выполнен по ранее опубликованным протоколам (Hamoudi et al., Leukemia, 2010, vol. 24, no. 8, pp. 1487-1497; и Bi et al., Haematologica, 2012, 97, 926-930). Вкратце, РНК была извлечена из микродиссекциированных слайдов с использованием RecoverAll Kit (Life Technologies, Пейсли, Великобритания). Синтез кДНК проводили с использованием Набор для синтеза кДНК Superscript III First Strand (Life Technologies, Пейсли, Великобритания), используя обратный праймер каждого из генов, включая два конститутивных гена; 18S рРНК и β-актин. qRT-PCR была проведена с использованием SYBR Green kit на инструменте CFX96 (BioRad, UK). Цикл qRT-PCR был следующим: 95°C в течение 3 мин, 95°C в течение 10 сек, 60°C в течение 45 сек в течение 40 циклов. Для анализа геометрическое среднее 18S рРНК и β-актина были взяты за единое конститутивное значение. Статистическое сравнение между группами проводилось с использованием двухстороннего ANOVA с ретроспективным анализом Бонферрони.

Результаты:

Результаты иммуногистохимии показали, что на уровне белка наблюдали дерегулирование Bcl3 и Bcl2 между обеими группами лечения и контрольной группой. На этом уровне анализа интенсивность и доля Bcl3 были выше в группах контроля и 5FU, но уменьшались в комбинированной группе лечения. Аналогично, экспрессия белка Bcl2 была самой высокой в контрольной группе, уменьшалась в группе 5FU и не определялась в группе, получавшей комбинированное лечения (Фиг. 10). На уровне мРНК аналогичная картина наблюдалась для Bcl3 (Фиг. 11а и 11b) с ΔΔCt, демонстрирующей значительное уменьшение на около 5 и 7 раз для 5FU и групп, получавших комбинированное лечение соответственно относительно контрольной группы (р<0,001). Bcl3 является ключевым элементом пути NF-κВ и участвует в регуляции многих клеточных путей, включая выживаемость, пролиферацию, воспаление и иммунный ответ. Экспрессия и активация Bcl3 были связаны с повышенной клеточной пролиферацией или выживаемостью, зависящей от ткани и типа стимулов. Было показано, что его функция транскрипционного репрессора участвует в регуляции иммунных реакций, а также в развитии и активации иммунных клеток (Wessells et al., J Biol Chem 2004; 279: 49995-50003, и Kuwata et al., Blood 2003; 102: 4123-4129). Тот факт, что экспрессия Bcl3 была дерегулирована, предполагает изменение иммунного ответа, а также сигнализацию выживания и пролиферации клеток. Это было подтверждено тем фактом, что Bcl2, который является важным антиапоптозным геном, был выше в контроле, но его экспрессия значительно уменьшилась после комбинированного лечения. Действительно, экспрессия Bcl2, как известно, регулируется в большинстве первичных опухолей поджелудочной железы (Campani et al., Pathol. 2001, 194(4), 444-450) и было показано, что использование Bcl2-специфической миРНК для снижения его экспрессии обладает антипролиферативным и проапоптотозным эффектом на рост опухоли поджелудочной железы in vitro и in vivo (Ocker et al., Gut, 2005, 54(9), 1298-1308). В последнее время было показано, что G-квадруплекссвязывающее соединение (ММ41), которое проявляет противоопухолевую активность с использованием модели ксенотрансплантата рака поджелудочной железы MIA РаСа-2, снижает уровни Bcl2 на 40% после анализа на уровне белка (Ohnmacht et al., Sci Rep. 2015, 16(5): 11385). В совокупности данные результаты указывают на заметное влияние на клеточные сигнальные пути в результате комбинированной терапии SDT/5-FU и предполагают, что SDT может обеспечить значительное терапевтическое преимущество для пациентов с раком поджелудочной железы при применении вместе с принятыми схемами лечения на основе химиотерапии.

Пример 10 - NIR визуализация

Чтобы быть пригодным для перехода к клиническому применению, суспензию МП необходимо вводить внутривенно и разрушать MB на участке опухоли с использованием соответствующих условий ультразвука. Такая стратегия должна усилить локализацию сенсибилизатора/химиотерапевтического агента и увеличить рО₂ опухоли на участке опухоли. Чтобы проверить осуществимость такого подхода, биотин-функционализированный цианиновый краситель, поглощающий вблизи инфракрасного спектра (9) применяли в качестве суррогата для RB и 5-FU (Схема 2) - см. Пример 4. Спектры УФ в видимой части спектра и флуоресцентные спектры 9 выявленной абсорбции (750 нм) и максимумы эмиссии (818 нм) в области NIR делают данное соединение идеальным для in vivo визуализации.

Как описано в Примере 4, краситель (9) загружали на поверхность MB после той же процедуры, что и для RB и 5-FU. Затем через хвостовую вену бестимусным голым мышам, несущим эктопированные опухоли Вх-PC3 внутривенно вводили конъюгат O₂MB-9 Ультразвук применяли непосредственно к опухоли во время и в течение 3 минут после введения IV. Контрольные эксперименты в отсутствие ультразвука были использованы для сравнительных целей.

Изображения на мышах получали до, через 5 и 30 минут после введения, используя систему визуализации всего тела IVIS. Репрезентативные изображения (Фиг. 12а) показывают сильную флуоресценцию опухоли через 30 мин после обработки мышей в группе, обработанной ультразвуком, тогда как мыши в контрольной группе показали незначительную флуоресценцию опухоли, причем большая часть излучения наблюдалась из области печени

Когда интенсивность флуоресценции опухоли измеряли относительно значения предварительной обработки (Фиг. 12b), статистически значимое 7-кратное усиление наблюдали для группы, обработанной ультразвуком, по сравнению с контрольной группой, через 30 мин после обработки (р<0,01). Кроме того, когда вводили О₂МВ или PFBMB опухоленесущим животным путем инъекции в хвостовую вену и впоследствии обработанных ультразвуком, белковые экстракты из хирургически вырезанных опухолей выявили значительное снижение Hif-1α в опухолях, обработанных О₂МВ (Фиг. 12с). Указанные результаты свидетельствуют о том, что применение ультразвука к опухоли в течение и сразу после введения конъюгата О₂МВ-9, способствует стимул-зависимому разрушению MB в сосудистой сети опухоли, что, в свою очередь, облегчает высвобождение как О₂ так и полезной нагрузки целевым образом. Конечным результатом является увеличение рО₂ опухоли о чем свидетельствует уменьшенная экспрессия белка Hif1α и более высокая концентрация лекарственного средства в опухоли, о чем свидетельствует усиленная флуоресценция (9).

Пример 11 - Синтез моноиодо ICG (I₂-IR783 или "I2-IRCYDYE")

Синтез (4-иодфенил)гидразина (1):

20 г (91,3 ммоль) 4-иоданилина перемешивали с раствором 15 мл концентрированной соляной кислоты и 15 мл воды. Смесь охладили до около -10°C и раствор 12,6 г (182,6 ммоль) NaNO₂ в 45 мл воды добавляли по каплям при непрерывном перемешивании. Суспензии давали перемешиваться еще 30 минут, а затем по каплям прибавили ледяной раствор SnCl₂,2H₂O (67,99 г, 301,3 ммоль в 40 мл концентрированной HCl) поддерживая температуру напри -10°C. Реакционную смесь перемешивали при данной температуре в течение 1,5 ч и при 5°C в течение ночи. Полученный светло-коричневый осадок отфильтровали и три раза промывали водой. Полученную таким образом твердую массу затем перемешивали с насыщенным раствором NaOH в воде (100 мл) и экстрагировали эфиром (200 мл). Эфирный слой промыли водным раствором NaOH, Na₂S₂O₃ и водой. После сушки с MgSO₄ (безводный), эфирный слой выпаривали досуха с получением 17,94 г (4-иодфенил)гидразина в виде коричневого порошка. Т.пл.=104-106°C.

¹Н ЯМР (CDCl₃): 7,48 (d, J=8,0 Hz, 2H, Ar-CH), 6,62 (d, J=8,0 Hz, 2H, Ar-CH), 5,18 (brs, 1H, NH), 3,55 (brs, 2H, NH₂).

ЭСИ-МС (M+H) найдено = 235,00, рассчитано для C₆H₇IN₂=234,04.

Синтез 5-иод-2,3,3-триметил-3Н-индол (2):

12,68 г (54,1 ммоль) (4-иодфенил)гидразин (1) и 8 г (92,8 ммоль) 3-метил-2-бутанона кипятили с обратным холодильником в 100 мл ледяной уксусной кислоты в течение 20 часов. Уксусную кислоту выпаривали и остаток растворили в эфире. Нерастворимый осадок отфильтровали и эфирный раствор промывали водным раствором NaOH с последующим промыванием Na₂S₂O₃ и водой. Органический слой сушили над безводным Na₂SO₄ и эфир удалили при пониженном давлении для получения 10,5 г 5-иод-2,3,3-триметил-3Н-индола (2) в виде клейкой красной жидкости.

¹Н ЯМР (CDCl₃): 7,60 (dd, J=4,5, 8,0 Hz, 2Н, Ar-CH), 7,28 (d, J=8,0 Hz, 1H, Ar-CH), 2,25 (s, 3H, CH₃), 1,20 (s, 6H, CH₃ X 2).

¹³C ЯМР (CDCl₃): 153,4 (C), 148,1 (C), 139,3 (C), 136,6 (CH), 130,6 (CH), 121,8 (CH), 89,9 (C), 54,0 (C), 23,0 (CH₃), 22,9 (CH₃), 15,3 (CH₃).

ЭСИ-МС (M+H) найдено = 286,1, рассчитано для C₁₁H₁₂IN=285,12.

Синтез 5-иод-2,353-триметил-1-(4-сульфобутил)-3Н-индол-1-ия (3):

Толуол (70 мл), 5-иод-2,3,3-триметил-3Н-индол (2) (12 ггг, 42,1 ммоль) и 1,4-бутансультон (8,6 г, 63,1 ммоль) нагревали с обратным холодильником в течение 18 часов. Реакционной смеси давали остыть до комнатной температуры. Полученные коричневые кристаллы фильтровали и промывали ацетоном (3 X 10 мл). Отфильтрованный продукт перекристаллизовывали из раствора МеОН и диэтилового эфира. Кристаллы собирали и сушили в вакууме, получая 8 г 5-иод-2,3,3-триметил-1-(4-сульфобутил)-3Н-индол-1-ия (3).

¹Н ЯМР (dmso-d₆): 8,27 (s, 1Н, Ar-CH), 7,95 (s, 1H, Ar-CH), 7,82 (s, 1H, Ar-CH), 4,42 (brs, 2H, CH₂), 2,79 (s, 3H, CH₃), 2,47 (brs, 2H, CH₂), 1,90 (brs, 2H, CH₂), 1,69 (brs, 2H, CH₂), 1,49 (s, 6H, CH₃ X 2).

¹³C ЯМР (DMSO-d₆): 176,2, 148,4, 139,9, 136,7, 132,5, 126,8, 96,8, 49,8, 46,8, 42,6, 26,8, 25,6, 10,5.

ЭСИ-МС (M+H) найдено = 422,10, рассчитано для C₁₅H₂₁INO₃S⁺=422,30.

Синтез 2-((Е)-2-((Е)-2-хлор-3-((Е)-2-(5-иод-3,3-диметил-1-(4-сульфобутил)индолин-2-илиден)этилиден)циклогекс-1-ен-1-ил)винил)-5-иод-3,3-диметил-1-(4-сульфобутил)-3Н-индол-1-ия (5):

Раствор 3 (0,2 г, 0,47 ммоль), 4 (полученный в соответствии со способом, описанным в Flanagan et al., Bioconjugate Chem, 1997, 8, 751-756) (0,153 г, 0,47 ммоль) и безводный ацетат натрия (0,077 г, 0,93 ммоль) в абсолютном EtOH (10 мл) в атмосфере N₂ нагревали с обратным холодильником в течение 4 часов. EtOH удалили при пониженном давлении и остаток очистили с помощью колоночной хроматографии (силикагель 60-120 меш), используя смесь 25% МеОН-CHCl₃ в качестве элюирующего агента. Продукт (0,152 г, выход 33%) выделили в виде зеленого порошка.

¹Н ЯМР (МеОН-d₄): 8,26 (d, J=7,8 Hz, 1Н, Ar-СН), 8,03-7,98 (m, 2H, Ar-CH), 7,68-7,63 (m, 2H, Ar-CH), 7,63-7,49 (m, 1H, Ar-CH), 6,39-6,36 (m, 2H, CH X 2), 4,34-4,33 (m, 2H, CH X 2), 3,33-3,34 (m, 4H, CH₂ X 2), 2,92-2,90 (m, 2H, CH₂), 2,89-2,80 (m, 2H, CH₂), 2,08-l,96 (m, 26H, CH₂ X 7, CH₃ X 4).

¹³С ЯМР (DMSO-d₆): 174,7, 173,9, 150,1, 149,6, 148,0, 146,7, 145,9, 130,8, 134,8, 132,6, 130,1, 129,8, 128,3, 126,4, 124,7, 120,7, 116,1, 114,9, 104,6, 102,8, 98,6, 62,1, 60,1, 50,4, 29,1, 48,7, 30,5, 28,4, 28,5, 26,3, 26,2, 24,6.

ЭСИ-МС (M-H⁺) найдено = 977,2, рассчитано для C₃₈H₄₆ClI₂N₂O₆S₂⁺=979,06.

Пример 12 - Синтез дииод-IR-820 (I₄-IR783 или "I4-IRCYDYE")

Синтез 3,5-дниоднитробензола (2):

К концентрированному раствору H₂SO₄ (96%, 15 мл), охлажденному до 0°C небольшими порциями прибавили 2,6-дииод-4-нитроанилин 1 (3,9 г, 10 ммоль). Данный раствор перемешивали 20 минут при указанной температуре и прибавили NaNO₂ (1,5 г, 22 ммоль). Перемешивание продолжали при 0°C в течение 2 ч. Затем вязкий раствор выливали на лед (100 г) и любой твердый материал отфильтровали. Желтый фильтрат осторожно вылили в кипящий раствор CuSO₄,5H₂O (160 мг, 1 ммоль) в EtOH (200 мл) и перемешивали в течение 2 ч для восстановления диазониевой соли. После охлаждения до комнатной температуры твердый 3,5-дииоднитробензол (2) отделили. Продукт отфильтровали и промывали водой до нейтральной среды. Продукт перекристаллизовали из EtOH с получением 2,48 г (выход 66%) тонких коричневых игл.

¹Н ЯМР (CDCl3) δ=8,43 (t, J=1,4 Hz, 2Н, Ar-CH Х2), 8,29 (s, 1Н, Ar-СН);

¹³С ЯМР (CDCl₃)δ=94,1, 131,7, 148,4, 151,0.

ЭСИ-МС[М+Н⁺]: рассчитано для C₆H₃I₂NO₂Na 397,8, найдено 398,9 m/z.

Синтез 3,5-дииоданилина (3):

К суспензии 2 (7,15 г, 19 ммоль) в безводном EtOH (75 мл) в атмосфере аргона прибавили SnCl₂,2H₂O (21,6 г, 96 ммоль). Данную смесь довели до кипения и по каплям прибавили раствор NaBH₄ (361 мг, 9,5 ммоль) в EtOH (40 мл). Реакционную смесь перемешивали при кипячении в течение 45 мин. После того как реакционную смесь охладили до 0°C, прибавили воду (60 мл) и смесь нейтрализовали NaOH (2,5 М в H₂O). Производное анилина экстрагировали диэтиловым эфиром, сушили над Na₂SO4 и выпарили при пониженном давлении с получением анилина 3 (5,86 г, выход сырого продукта 89%).

¹H ЯМР (CDCl3) δ=7,39 (s, 1Н, Ar-СН), 6,97 (s, 2Н, Ar-CH X 2), 3,66 (brs, 2Н, NH₂).

¹³С ЯМР (CDCl3)δ=148,5, 134,8, 122,9, 95,1.

ЭСИ-МС[М+Н⁺]: рассчитано для C₆H₅I₂N 344,8, найдено 345,5 m/z.

Синтез 3,5-дииодфенилгидразина (4):

Данное соединение синтезировали в соответствии с методикой, описанной в US 2013/0231604.

Синтез 4,6-дииод-2,3,3-триметил-3Н-индола (5):

Данное соединение синтезировали в соответствии с методикой, описанной в US 2013/0231604.

Синтез 4,6-дииод-2,3,3-триметил-1-(4-сульфобутил)-3Н-индол-1-ия

Толуол (10 мл), 4,6-дииод-2,3,3-триметил-3Н-индол (5) (2,1 г, 5,1 ммоль) и 1,4-бутансультон (3,5 г, 25,7 ммоль) нагревали при кипячении с обратным холодильником 18 ч. Реакционную смесь оставили охладиться до комнатной температуры. Полученные коричневые кристаллы отфильтровали и промыли ацетоном (3 X 10 мл). Отфильтрованный продукт перекристаллизовывали из раствора МеОН и диэтилового эфира. Кристаллы собрали и сушили в вакууме с получением 1,9 г 4,6-дииод-2,3,3-триметил-1-(4-сульфобутил)-3Н-индол-1-ия (6).

¹Н ЯМР (MeOH-d₄): 8,42 (s, 1Н, Ar-CH), 8,36 (s, 1H, Ar-CH), 4,51-4,48 (m, 2H, CH₂), 2,88-2,85 (m, 2H, CH₂), 2,09-2,00 (m, 2H, CH₂), 1,99-1,82 (m, 2H, CH₂), 1,73 (s, 6H, CH₃ X 2), 1,16 (s, 3H, CH₃).

ЭСИ-МС[М-Н⁺]: рассчитано для C₁₅H₂₀I₂NO₃S⁺ 547,9, найдено 546,1 m/z.

Синтез 2-((Е)-2-((Е)-2-хлор-3-((Е)-2-(4,6-дииод-3,3-диметил-1-(4-сульфобутил)индолин-2-илиден)этилиден)циклогекс-1-ен-1-ил)винил)-4,6-дииод-3,3-диметил-1-(4-сульфобутил)-3Н-индол-1-ия (8):

Раствор 8 (0,84 г, 1,5 ммоль), 7 (получали в соответствии со способом, описанным в Flanagan et al., Bioconjugate Chem, 1997, 8, 751-756) (0,25 г, 0,7 ммоль) и безводный ацетат натрия (0,13 г, 1,5 ммоль) в абсолютном EtOH (10 мл) в атмосфере N₂ нагревали с обратным холодильником в течение 4 часов. EtOH удалили при пониженном давлении и остаток очистили с помощью колоночной хроматографии (силикагель 60-120 меш), используя смесь 25% МеОН-CHCl₃ в качестве элюирующего агента. Продукт (0,153 г, выход 8%) выделили в виде коричневого порошка.

¹Н ЯМР (MeOH-d₄): 8,59 (s, 2Н, Ar-CH X 2), 8,29 (s, 2Н, Ar-СН X 2), 6,77-6,75 (m, 2Н, СН X 2), 5,30 (brs, 2Н, СН X 2), 4,82-4,72 (m, 4Н, СН₂ X 2), 3,39 (brs, 4Н, СН₂ X 2), 2,60-2,47 (m, 14Н, СН₂ X 7), 2,23 (s, 12Н, СН₃ X 4).

¹³С ЯМР (DMSO-d₆): 170,2, 169,9, 158,9, 150,1, 149,7, 148,6, 146,8, 144,9, 140,8, 139,3, 134,2, 132,1, 126,7, 124,3, 104,0, 100,4, 96,7, 96,2, 94,5, 64,1, 59,5, 50,5, 48,7, 48,1, 30,3, 28,7, 28,2, 26,3, 26,1, 24,3.

ЭСИ-МС[М-Н⁺]: рассчитано для C₃₈H₄₄CI₄N₂ O₆S₂Na⁺ 1253,85, найдено 1252,81 m/z.

Пример 13 - In vivo PDT эффект I₂-IR783 у мышей, несущих человеческие ксенотрансплантаты эктопических опухолей ВхРс-3 рака поджелудочной железы человека

Клетки ВхРс-3 хранили в среде RPMI-160 с добавкой 10% фетальной бычьей сыворотки. Клетки культивировали при 37°C в 5% CO2 в воздухе. Клетки ВхРс-3 (1×10⁶) были повторно суспендированы в 100 мкл матригеля и имплантировали в сзади в спинку самцов мышей SCID. Образование опухолей происходило через около 2 недели после имплантации, и измерения опухоли проводились каждый день с использованием циркуля. После того, как опухоли достигли среднего объема 267 мм³, рассчитанного по геометрическому среднему диаметру с использованием уравнения объема опухоли = 4πR³/3, животные были случайным образом распределены в 2 группы (n=2). После введения анестезии (внутрибрюшинная инъекция Hypnorm/Hypnovel), группа лечения получила аликвоту 100 мкл I₂-IR783 (1 мг/кг) в несущей среде OCB:DMSO (98:2) вводили непосредственно в каждую опухоль и облучали светом 780 нм (100 мВт) в течение 3×3 мин с 1 минутой задержки между обработками. Вторая группа (контроль) получила только несущую среду. После обработки животным разрешалось восстанавливаться после анестезии, и объем опухоли контролировали в указанные моменты времени. Увеличение % объема опухоли было рассчитано с использованием предварительных измерений для каждой группы. На 8-й день группа лечения получила вторую обработку, как описано выше, но также получила внутриопухолевую инъекцию 100 мкл О₂МВ (1×10⁸ МВ/мл) до облучения светом. Результаты приведены на Фиг. 13.

Пример 14 - Флуоресценция аналогов 12 и 14 IR783 ("I2-IRCYDYE" и "I4-IRCYDYE")

На Фиг. 14 изображены спектры (а) УФ видимой области спектра и (b) флуоресцентного излучения I2-IRCYDYE и I4-IRCYDYE по сравнению с Cardio green. Новые соединения ясно показывают профили поглощения сходные с Cardio Green. Однако, хотя флуоресцентное излучение I2-IRCYDYE остается аналогичным для Cardio green эмиссия I4-IRCYDYE значительно погашена. Это объясняется увеличением ISC из-за наличия дополнительных атомов иода.

Пример 15 - Образование синглетного кислорода и in vitro цитотоксичность аналогов I2 и I4 IR783 ("I2-IRCYDYE" и "I4-IRCYDYE")

На Фиг. 15 изображено, что оба I2-IRCYDYE и I4-IRCYDYE производят больше синглетного кислорода, чем Cardio Green при возбуждении при 780 нм.

На Фиг. 16 изображено, что оба I2-IRCYDYE и I4-IRCYDYE значительно более цитотоксичны к двум различным линиям рака поджелудочной железы (Mia Раса и ВхРС-3) чем Cardio Green при подвержении воздействию облучения 780 нм. Соединения также оказались более токсичными для линии клеток рака шейки матки (HeLa) чем Cardio Green при возбуждении 780 нм. In vivo эксперименты на мышах с использованием эктопических опухолей ВхРС-3 рака поджелудочной железы также демонстрируют, что I2-IRCYDYE локализуется в опухоли через 18 часов после введения в хвостовую вену.

Эти результаты свидетельствуют о том, что оба I2-IRCYDYE и I4-IRCYDYE являются эффективными сенсибилизаторами, активируемыми NIR, и что I2-IRCYDYE также имеет потенциал в качестве средства визуализации с учетом его высокой флуоресценции NIR. Это обеспечивает потенциал для изображения PDT и/или SDT твердых опухолей, например, опухоли поджелудочной железы.

Пример 16 - Комбинированная терапия Антиметаболит / Сонодинамическая терапия клеток рака поджелудочной железы человека MiaPaCa-2, используя бенгальский розовый и 5-FU.

Методика:

Клеточные линии первичной аденокарциномы рака поджелудочной железы человека MIA РаСа-2 хранили в среде Игла в модификации Дульбекко и с добавкой 10% (об./об.) фетальной бычьей сыворотки в увлажненной 5% CO₂ атмосфере при 37°C. Клетки высевали в лунки 96-луночного планшета при концентрации 4×10³ клеток на лунку и инкубировали в течение 21 ч при 37°C в увлажненной 5% CO₂ атмосфере. Затем среду удаляли и лунки обрабатывали либо бенгальским розовым, (3 мкМ), 5-фторурацилом (50 мкМ) либо комбинацией обоих RB (3 мкМ) и 5-FU (50 мкМ) в течение 3 ч. Растворы лекарственного средства затем удаляли, добавляли свежую среду и отобранные лунки, обработанные ультразвуком, доставляли с использованием сонопоратора Sonidel SP100 (30 сек, частота = 1 МГц, плотность мощности ультразвука = 3,0 Вт⋅см^-2, цикл работы = 50% с частотой повторения импульса = 100 Гц). Клетки затем инкубировали в течение 24 ч до определения жизнеспособности клеток с использованием МТТ-теста.

Результаты:

Результаты изображены на Фиг. 17. Результаты показывают, что лечение SDT (т.е. RB+US) снижает жизнеспособность клеток на 11,1% по сравнению с RB только (RB-US). Обработка 5FU + ультразвук снижала жизнеспособность клеток на 5,9% более чем 5FU. Обработка смешанными SDT/5FU + ультразвуком (combo + US) привела к снижению на 21,9% по сравнению с обработкой RB/5FU - ультразвук. Удивительно, но это различие больше, чем можно было бы ожидать, добавляя эффекты, вызванные обоими способами обработки (17%) и указывает на синергию при комбинации обоих способов. (n=6).

В данном эксперименте участвовали только активные агенты. Тем не менее, они представляли собой эффективно высвобождаемые молекулы при разрушении микропузырьков. Таким образом, ожидается, что результаты будут распространены на ситуацию, в которой активные агенты поставляются с применением описанной в данном документе технологии микропузырьков.

Пример 17 - Комбинированная терапия антрациклин / сонодинамическая терапия опухолей рака молочной железы человека MDA-MB-231, используя микрогранулы конъюгатов бенгальского розового и доксорубицина, наполненные кислородом.

Синтез Биотин-Бенгальский розовый и Биотин-Доксорубицин:

Синтез Биотин-Бенгальский розовый детально описан в Примере 2. Биотин-Доксорубицин (Biotin-Dox) получали согласно Схеме 3:

Схема 3: Схема синтеза для получения Biotin-Dox

К охлажденному на ледяной бане раствору сложного эфира биотин-N-гидроксисукцинимида (0,14 г, 0,41 ммоль) в ДМФА (10 мл) прибавили доксорубицин (0,3 г, 0,41 ммоль) в атмосфере азота. После перемешивания в течение 30 мин к указанной реакционной смеси добавляли триэтиламин (0,5 мл, 2 ммоль) и перемешивали еще 12 часов при комнатной температуре. Ход течения реакции контролировали с помощью ТСХ (Merck Silica 60, HF 254, 20: 80 метанол-дихлорметан, об./об.). После завершения реакции к реакционной смеси прибавили избыток диэтилового эфира (100 мл). Полученное таким образом красное твердое вещество отфильтровали и промывали три раза диэтиловым эфиром (50 мл X 3). Указанное красное твердое вещество затем подвергли очистке с помощью PTLC, используя метанол-дихлорметан (20:80, об./об.) в качестве элюента для получения 0,25 г (выход = 78%) биотинилированного доксорубицина. Аналитический образец был получен при перекристаллизации данного продукта из этанола.

¹Н ЯМР (МеОН-d₄) δ: 8,54 (brs, 1Н, NH), 7,82-7,76 (m, 2Н, aromatic), 7,47 (d, J=7,5 Hz, 1H, aromatic), 5,39 (brs, 1H, NH), 5,05 (brs, 2H, NH, OH), 4,71 (s, 2H, -CH₂-OH), 4,67 (brs, 2H, ОН X 2), 4,36-4,33 (m, 1H, CH), 4,25-4,22 (m, 1H, CH), 4,16-4,13 (m, 1H, CH), 3,99 (s, 3H, OCH₃), 3,60-3,58 (m, 1H, CH), 3,55 (brs, 2H, ОН X2), 3,30-2,5 (m, 4H, CH₂ X1, CH X 2), 2,18-2,14 (m, 3Н, CH₂ X 1, CH), 2,00-1,96 (m, 1H, CH), 1,63-1,50 (m, 4H, CH₂ X 2), 1,42-1,26 (m, 11 H, CH₃ X 1, CH₂X4).

ЭСИ-МС [M-H]: рассчитано для C₃₇H₄₃I₂N₃O₁₃S=769,25, найдено = 767,9 m/z.

Получение наполненных кислородом микропузырьков конъюгатов бенгальского розового (RBO₂MB) и доксорубицина (DoxO₂MB):

Растворы, содержащие Biotin-RB (2,5 мг/мл) и Biotin-Dox (2,5 мг/мл), получали в растворе 0,5% ДМСО в ФСБ (рН 7,4±0,1). Аликвоту 2 мл данных исходных растворов затем добавляли по отдельности к двум 2 мкл суспензии авидина, функционализированным PFBMB (1×10⁹ МВ/мл) и содержимое перемешивали встряхивая в течение 15 минут. Затем суспензии центрифугировали (900 об./мин) в течение 5 мин, а конъюгаты MB выделяли в виде молочной суспензии, плавающей поверх раствора. Раствор удалили и заменяли еще 2 мл исходного раствора, содержащего либо Biotin-RB или Biotin-Dox, и повторяли стадии смешивания/центрифугирования. Суспензии MB затем промыли ФСБ (5 мл), центрифугировали (900 об./мин) в течение 5 мин и переместили MB в чистые центрифужные пробирки. Данную процедуру промывки снова повторили и выделенные конъюгаты PFBMB-RB и PFBMB-Dox поместили в стеклянный флакон. Конъюгаты PFBMB-RB и PFBMB-Dox затем барботировали газообразным кислородом в течение 2 мин, и в результате RBO₂MB и DoxO₂MB (см. Фиг. 18) использовали непосредственно в экспериментах на животных.

Обработка ксенотрансплантата MDA-MB-231 человека с использованием опухолей рака молочной железы у мышей SCID:

Все животные, используемые в этом исследовании, обрабатывались гуманно и в соответствии с лицензированными процедурами в соответствии с UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986. Клетки MDA-MB-231 хранили в среде RPI-1640 с добавкой 10% фетального сывороточного альбумина, как указано выше. Клетки (1×10⁶) повторно суспендировали в 100 мкл Matrigel^® и имплантировали сзади в спинку самок мышей Balb/c SCID (C.B-17/IcrHan®Hsd-Prkdcscid). Образование опухолей происходило через около 2 недели после имплантации, и измерения опухоли проводили через день с помощью циркуля. Как только опухоли достигли среднего объема 100 мм³, рассчитанного по геометрическому среднему диаметру с использованием уравнения объема опухоли = 4πR³/3, животные были случайным образом распределены в 3 группы (n=3). После введения анестезии (внутрибрюшинная инъекция Hypnorm/Hypnovel), группа 1 получила 100 мкл RBO₂MB (300 мкМ RB); группа 2 получила 100 мкл DoxO₂MB (475 мкМ) и группа 3 получила 100 мкл, содержащих RBO₂MB (150 мкМ RB) и DoxO₂MB (237,5 мкМ). Внутриопухолевую инъекцию выбрали в качестве пути введения, чтобы исключить экспериментальные изменения, вызванные фармакокинетическим поведением платформы. Затем опухоли обрабатывали ультразвуком в течение 3,5 мин при частоте ультразвука 1 МГц, плотности мощности ультразвука равной 3,5 Вт⋅см^-2 (I_SATP; пространственный средний временный пик) и используя цикл работы равный 30% при частота повтора пульса равной 100 Гц. Обработки повторили на 14-й день. После обработки животным дали восстанавливаться после анестезии, а объем опухоли и массу тела регистрировали ежедневно в течение девяти дней. Увеличение % объема опухоли было рассчитано с использованием измерений предварительной обработки для каждой группы.

Результаты:

Результаты изображены на Фиг. 19. Результаты показывают, что смешанная обработка DoxO₂MB / RBO₂MB+US была более эффективной, чем RBO₂MB+US и такой же эффективной, как и DoxO₂MB+US используя половину концентрации доксорубицина и бенгальского розового. Результаты показывают, что платформа может применяться для лечения рака молочной железы.

1. Применение комплекса микропузырек-химиотерапевтический агент для производства лекарственного средства для лечения рака поджелудочной железы, молочной железы или предстательной железы посредством сонодинамической терапии, причем указанный способ сонодинамической терапии включает одновременное или последовательное применение комплекса микропузырек-соносенсибилизатора; при этом указанный химиотерапевтический агент представляет собой 5-фторурацил, доксорубицин, гемцитабин, доцетаксел или паклитаксел, а указанный соносенсибилизатор представляет собой бенгальский розовый краситель.

2. Применение комплекса микропузырек-химиотерапевтический агент в производстве лекарственного средства для лечения рака поджелудочной железы, молочной железы или предстательной железы посредством сонодинамической терапии, причем указанный комплекс прикреплен или ассоциирован с по меньшей мере одним соносенсибилизатором; при этом указанный химиотерапевтический агент и указанный соносенсибилизатор являются такими, как определено в п. 1.

3. Применение по п. 2, отличающееся тем, что указанный комплекс прикреплен или ассоциирован с по меньшей мере одним указанным соносенсибилизатором посредством взаимодействия биотин-авидин.

4. Применение по п. 1, отличающееся тем, что комплекс микропузырек- химиотерапевтический агент содержит микропузырек, прикрепленный или ассоциированный с по меньшей мере одним химиотерапевтическим агентом, который представляет собой 5-фторурацил, доксорубицин, гемцитабин, доцетаксел или паклитаксел.

5. Применение по п. 4, отличающееся тем, что комплекс микропузырек- химиотерапевтический агент содержит микропузырек, прикрепленный или ассоциированный с указанным по меньшей мере одним химиотерапевтическим агентом посредством взаимодействия биотин-авидин.

6. Применение по любому из пп. 1-5, отличающееся тем, что комплекс микропузырек-химиотерапевтический агент содержит микропузырек, имеющий оболочку, которая удерживает газ.

7. Применение по п. 6, отличающееся тем, что указанный газ представляет собой кислород.

8. Применение по любому из пп. 1 и 4-7, отличающееся тем, что комплекс микропузырек-соносенсибилизатор содержит микропузырек, имеющий оболочку, которая удерживает газ.

9. Применение по п. 8, отличающееся тем, что указанный газ представляет собой кислород.

10. Применение по любому из пп. 1-9, отличающееся тем, что указанный комплекс микропузырек-химиотерапевтический агент и/или указанный комплекс микропузырек-соносенсибилизатор содержит микропузырек, имеющий диаметр в диапазоне от 0,5 до 100 мкм.

11. Применение по любому из пп. 1-10, отличающееся тем, что указанный комплекс микропузырек-химиотерапевтический агент и/или указанный комплекс микропузырек-соносенсибилизатор содержит фосфолипидную монослойную оболочку со связанным с ней одним или большим количеством полимеров.

12. Фармацевтическая композиция для лечения рака поджелудочной железы, молочной железы или предстательной железы посредством сонодинамической терапии, при этом указанная композиция содержит комплекс микропузырек-химиотерапевтический агент, как он определен в п. 2 или 3, вместе с по меньшей мере одним фармацевтическим носителем или эксципиентом.

13. Фармацевтическая композиция для лечения рака поджелудочной железы, молочной железы или предстательной железы посредством сонодинамической терапии, при этом указанная композиция содержит комплекс микропузырек-химиотерапевтический агент, как он определен в любом из пп. 1, 4-7, 10 и 11, и комплекс микропузырек- соносенсибилизатор, как он определен в любом из пп. 1 и 8-11, вместе с по меньшей мере одним фармацевтическим носителем или эксципиентом.

14. Применение фармацевтической композиции по п. 12 или 13 в способе производства лекарственного средства для лечения рака поджелудочной железы, молочной железы или предстательной железы посредством сонодинамической терапии.

15. Применение по п. 14, отличающееся тем, что указанное лекарственное средство приводят в контакт с клетками или тканями пациента и, одновременно или последовательно, указанные клетки или ткани подвергают воздействию ультразвуком.

16. Применение по п. 14 или 15, отличающееся тем, что указанный рак представляет собой карциному молочной железы или предстательной железы.

17. Применение по п. 14 или 15, отличающееся тем, что указанный рак представляет собой рак поджелудочной железы.

18. Применение продукта, содержащего комплекс микропузырек- химиотерапевтический агент и комплекс микропузырек-соносенсибилизатор в производстве лекарственного средства для одновременного или последовательного применения в способе лечения рака поджелудочной железы, молочной железы или предстательной железы посредством сонодинамической терапии, при этом указанный химиотерапевтический агент представляет собой 5-фторурацил, доксорубицин, гемцитабин, доцетаксел или паклитаксел, а указанный соносенсибилизатор представляет собой бенгальский розовый краситель.

19. Микропузырек для использования при лечении рака поджелудочной железы, молочной железы или предстательной железы посредством сонодинамической терапии, при этом указанный микропузырек содержит связанный с ним по меньшей мере один химиотерапевтический агент и по меньшей мере один соносенсибилизатор, при этом указанный химиотерапевтический агент и указанный соносенсибилизатор являются такими, как определено в п. 1.

20. Микропузырек по п. 19, который содержит газообразный кислород.

21. Способ лечения рака поджелудочной железы, молочной железы или предстательной железы посредством сонодинамической терапии, который включает одновременное или последовательное введение в клетки или ткани пациента, нуждающегося в этом, комплекса микропузырек-соносенсибилизатор и комплекса микропузырек-химиотерапевтический агент, подвергая указанные клетки или ткани ультразвуковому воздействию для разрыва указанных микропузырьков и активации указанного соносенсибилизатора; при этом указанный химиотерапевтический агент представляет собой 5-фторурацил, доксорубицин, гемцитабин, доцетаксел или паклитаксел и указанный соносенсибилизатор представляет собой бенгальский розовый краситель.

22. Способ лечения рака поджелудочной железы, молочной железы или предстательной железы посредством сонодинамической терапии, который включает введение в клетки или ткани пациента, нуждающегося в этом, комплекса микропузырек- химиотерапевтический агент, при этом указанный комплекс прикреплен или ассоциирован с по меньшей мере одним соносенсибилизатором, и при этом указанный способ включает подвергание указанных клеток или тканей ультразвуковому воздействию для разрыва указанных микропузырьков и активации указанного соносенсибилизатора; и при этом указанный химиотерапевтический агент и указанный соносенсибилизатор являются такими, как определено в п. 21.

23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что указанный комплекс прикреплен или ассоциирован с по меньшей мере одним указанным соносенсибилизатором посредством взаимодействия биотин-авидин.

24. Способ по п. 21, отличающийся тем, что комплекс микропузырек- химиотерапевтический агент содержит микропузырек, прикрепленный или ассоциированный с по меньшей мере одним химиотерапевтическим агентом, который представляет собой 5-фторурацил, доксорубицин, гемцитабин, доцетаксел или паклитаксел.

25. Способ по п. 24, отличающийся тем, что комплекс микропузырек- химиотерапевтический агент содержит микропузырек, прикрепленный или ассоциированный с указанным по меньшей мере одним химиотерапевтическим агентом посредством взаимодействия биотин-авидин.

26. Способ по любому из пп. 21-25, отличающийся тем, что комплекс микропузырек- химиотерапевтический агент содержит микропузырек, имеющий оболочку, которая удерживает газ.

27. Способ по п. 26, отличающийся тем, что указанный газ представляет собой кислород.

28. Способ по любому из пп. 21 и 24-27, отличающийся тем, что комплекс микропузырек-соносенсибилизатор содержит микропузырек, имеющий оболочку, которая удерживает газ.

29. Способ по п. 28, отличающийся тем, что указанный газ представляет собой кислород.

30. Способ по любому одному из пп. 21-29, отличающийся тем, что указанный комплекс микропузырек-химиотерапевтический агент и/или указанный комплекс микропузырек-соносенсибилизатор содержит микропузырек, имеющий диаметр в диапазоне от 0,5 до 100 мкм.

31. Способ по любому одному из пп. 21-30, отличающийся тем, что указанный комплекс микропузырек-химиотерапевтический агент и/или указанный комплекс микропузырек-соносенсибилизатор содержит фосфолипидную монослойную оболочку, имеющую связанный с ней один или большее количество полимеров.

32. Способ по любому из пп. 21-31, отличающийся тем, что указанный рак представляет собой карциному молочной железы или предстательной железы.

33. Способ по любому из пп. 21-31, отличающийся тем, что указанный рак представляет собой рак поджелудочной железы.