Функционализированная гиалуроновая кислота или ее производное для лечения воспалительных состояний
Группа изобретений относится к функционализированной гиалуроновой кислоте. Раскрыта функционализированная гиалуроновая кислота или ее производное формулы (I)
(I), где R1, R2, R3, R4 независимо представляют собой H, SO3-, ацильную группу карбоновой кислоты алифатического, ароматического, арилалифатического, циклоалифатического или гетероциклического ряда, -CO-(CH2)2-COOY, где Y представляет собой отрицательный заряд или H, и R представляет собой Z(1) или Z(2), а R5 представляет собой -CO-CH3, H, SO3-, ацильную группу карбоновой кислоты алифатического, ароматического, арилалифатического, циклоалифатического или гетероциклического ряда, ацильную группу гиалуроновой кислоты. Также раскрыты способ получения функционализированной гиалуроновой кислоты или ее производного и фармацевтическая композиция. Группа изобретений обеспечивает лечение патологий, обусловленных изменением экспрессии галектинов. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 29 пр.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к функционализированной гиалуроновой кислоте или ее производному, а также к способу ее получения и ее применению в качестве биоматериала и в качестве ингредиента фармацевтических композиций.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Галектины представляют собой семейство белков, характеризующихся специфичным связыванием с β-галактозидными сахарами, такими как N-ацетил-лактозамин, которые могут связываться с белками посредством N-гликозилирования или О-гликозилирования. У млекопитающих известно 15 галектинов, которые кодируются генами LGALS и пронумерованы последовательно, в то время как у людей выявлены лишь галектины -1, -2, -3, -4, -7, -8, -9, -10, -12 и -13.
Они бывают внутриклеточными или внеклеточными. Последние вступают в бивалентные или мультивалентные взаимодействия с гликанами на поверхности клеток и вызывают различные клеточные ответы, включая выработку цитокинов и других медиаторов воспаления, клеточную адгезию, миграцию и апоптоз. Кроме того, они могут образовывать пространственные структуры с гликопротеиновыми рецепторами мембран и модулировать свойства указанных рецепторов. Внутриклеточные галектины могут участвовать в передаче сигнала и изменять биологические ответы, включая апоптоз, дифференцировку клеток и клеточную подвижность. По имеющимся в настоящее время данным, галектины играют важную роль в остром и хроническом воспалительных ответах, а также в ряде других патологических процессов.
Недавние исследования показали, что некоторые галектины участвуют в воспалительном ответе при некоторых скелетно-мышечных расстройствах, таких как ревматоидный артрит и остеоартрит (D. Weinmann et al. Scientific Reports DOI: 10.1038/srep39112; Toegel S. et al Histochem Cell Biol 2014, 142, 373; Toegel S. The Journal of Immunology 2016, 1910; Li S. et al. J. Clin. Cell Immunol 2013, 4(5), 1000164). Поскольку многие воспалительные патологии сопровождаются избыточной экспрессией галектинов, ингибирование металлопротеиназной активности может, соответственно, приводить к заметному снижению активности процессов в воспалительном каскаде.
Кроме того, известно, что галектины играют активную роль в развитии и прогрессировании опухолей. Поэтому в настоящее время проводятся исследования галектинов, направленные на улучшение как диагностики, так и лечения новообразований (Ebrahim AH, et al. Galectins in cancer: carcinogenesis, diagnosis and therapy. Ann Transl Med 2014;2(9):88. doi: 10.3978/j.issn.2305-5839.2014.09.12).
Соответственно, задачей настоящего изобретения является обеспечение продукта, регулирующего экспрессию указанных рецепторов, для оказания терапевтического воздействия на патологии, обусловленные изменением экспрессии галектинов, обладающего при этом подходящими медицинскими и фармацевтическими характеристиками.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данная задача была решена с помощью функционализированной гиалуроновой кислоты или ее производного по п. 1 формулы изобретения.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу получения функционализированной гиалуроновой кислоты или ее производного.
Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к применению указанной функционализированной гиалуроновой кислоты или ее производного для лечения патологий, обусловленных изменением экспрессии галектинов. Неограничивающими примерами патологий, обусловленных избыточной или недостаточной регуляцией указанных рецепторов, являются неалкогольный стеатогепатит, бляшечный псориаз, ревматоидный артрит, остеоартрит, неоплазия и фиброзные процессы в легких, почках и сердечно-сосудистой системе.
Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к применению указанной функционализированной гиалуроновой кислоты или ее производного в качестве биоматериала или каркаса для роста клеток при лечении ортопедических заболеваний.
Согласно следующему аспекту настоящее изобретение относится к применению указанной функционализированной гиалуроновой кислоты или ее производного в качестве биоматериала или каркаса для роста клеток, в пластической/косметической хирургии, гемодиализе, кардиологии, ангиологии, офтальмологии, отоларингологии, одонтологии, гинекологии, урологии, дерматологии, онкологии и восстановлении тканей.
Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одну функционализированную гиалуроновую кислоту или ее производное и по меньшей мере одно фармакологически активное вещество и/или по меньшей мере одно биологически активное вещество.
Согласно следующему аспекту настоящее изобретение относится к применению указанной фармацевтической композиции для лечения патологий, обусловленных изменением экспрессии галектинов. Неограничивающими примерами патологий, обусловленных избыточной или недостаточной регуляцией указанных рецепторов, являются неалкогольный стеатогепатит, бляшечный псориаз, ревматоидный артрит, остеоартрит, неоплазия и фиброзные процессы в легких, почках и сердечно-сосудистой системе.
Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к применению указанной фармацевтической композиции в пластической/косметической хирургии, гемодиализе, кардиологии, ангиологии, офтальмологии, отоларингологии, одонтологии, гинекологии, урологии, дерматологии, онкологии и восстановлении тканей.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Характеристики и преимущества настоящего изобретения станут очевидны из нижеследующего подробного описания, вариантов реализации, приведенных с помощью неограничивающих примеров, и прилагаемых графических материалов, где:
- На ФИГУРЕ 1 приведено сравнение ИК-спектров лактозы, деацетилированной гиалуроновой кислоты и производного гиалуроновой кислоты, где R5 представляет собой Z(3), а Z3 представляет собой галактозный фрагмент.
- На ФИГУРЕ 2 приведено сравнение ИК-спектров гиалуроновой кислоты, аминопроизводного восстанавливающего сахара, полученного путем восстановительного аминирования, и производного гиалуроновой кислоты, где R представляет собой Z(1), а Z3 представляет собой галактозный фрагмент.
- На ФИГУРЕ 3 приведены 1H-ЯМР спектры (400 МГц, D2O, 343 K): 1) гиалуроната натрия; 2) гиалуроната натрия, полученного согласно Примеру 6; 3) аминопроизводных частично деацетилированной гиалуроновой кислоты (восстановительное аминирование с применением восстанавливающих сахаров), полученных согласно Примеру 13, и
- На ФИГУРЕ 4 приведены 1H-ЯМР спектры (400 МГц, D2O, 298 K): 1) гиалуроната натрия; 2) аминопроизводного восстанавливающего сахара, полученного согласно Примеру 3; 3) амидопроизводного частично деацетилированной гиалуроновой кислоты (амидирование с применением аминопроизводных восстанавливающих сахаров), полученного согласно Примеру 13.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Соответственно, настоящее изобретение относится к функционализированной гиалуроновой кислоте или ее производному, имеющим формулу (I):
(I)
где
R1, R2, R3, R4 независимо представляют собой H, SO3-, ацильную группу карбоновой кислоты алифатического, ароматического, арилалифатического, циклоалифатического или гетероциклического ряда, -CO-(CH2)2-COOY, где Y представляет собой отрицательный заряд или H,
и
R представляет собой Z(1) или Z(2), а R5 представляет собой -CO-CH3, H, SO3-, ацильную группу карбоновой кислоты алифатического, ароматического, арилалифатического, циклоалифатического или гетероциклического ряда, ацильную группу гиалуроновой кислоты,
где Z(1) представляет собой фрагмент формулы (1):
(1)
где Z1 представляет собой -NR6CH2-, а R6 представляет собой H или замещенную или незамещенную алифатическую, ароматическую, арилалифатическую, циклоалифатическую или гетероциклическую группу,
Z2 представляет собой -OH или -NHCOCH3,
Z3 представляет собой H, моносахарид, дисахарид или олигосахарид,
или Z(2) представляет собой фрагмент формулы (2):
(2)
где Z4 представляет собой -NR6CH-, а R6 представляет собой H или замещенную или незамещенную алифатическую, ароматическую, арилалифатическую, циклоалифатическую или гетероциклическую группу,
Z5 и Z6 независимо представляют собой H, моносахарид, дисахарид или олигосахарид,
или
R5 представляет собой Z(3) или Z(4), и R представляет собой NR6R7, или спиртовую группу алифатического, ароматического, арилалифатического, циклоалифатического или гетероциклического ряда, OH, O-, спиртовую группу гиалуроновой кислоты, аминогруппу гиалуроновой кислоты, и R6, R7 независимо представляют собой H или замещенную или незамещенную алифатическую, ароматическую, арилалифатическую, циклоалифатическую или гетероциклическую группу,
где Z(3) представляет собой фрагмент формулы (3):
(3)
где Z1 представляет собой -CH2- или -CO-,
Z2 представляет собой -OH или -NHCOCH3,
Z3 представляет собой H, моносахарид, дисахарид или олигосахарид,
или Z(4) представляет собой фрагмент формулы (4):
(4)
где Z4 представляет собой -CH-,
Z5 и Z6 независимо представляют собой H, моносахарид, дисахарид или олигосахарид,
или
R представляет собой Z(1) или Z(2), а R5 представляет собой Z(3) или Z(4).
Термин «алифатический, ароматический, арилалифатический, циклоалифатический, гетероциклический» предпочтительно означает линейный, разветвленный или циклический фрагмент - насыщенный или ненасыщенный, алифатический или ароматический, выбранный из: C1-C10 алкила, замещенного C1-C10 алкила, C2-C10 алкенила, замещенного C2-C10 алкенила, C4-C10 диенила, замещенного C4-C10 диенила, C2-C10 алкинила, замещенного C2-C10 алкинила, фенила, замещенного фенила, арила, замещенного арила, гетероарила, замещенного гетероарила, C1-C10 алкилтио, замещенного C1-C10 алкилтио, фенилтио, замещенного фенилтио, арилтио, замещенного арилтио, карбонила, замещенного C1-C6 карбонила, карбоксила, замещенного C1-C6 карбоксила, амино, замещенного C1-C6 амино, амида, замещенного C1-C6 амида, сульфонила, замещенного C1-C6 сульфонила, сульфокислоты, фосфонила, замещенного C1-C6 фосфонила, полиарила, замещенного полиарила, C3-C20 циклоалкила, замещенного C3-C20 циклоалкила, C3-C20 гетероциклоалкила, замещенного C3-C20 гетероциклоалкила, C2-C10 циклоалкенила, замещенного C2-C10 циклоалкенила, C4-C10 циклодиенила, замещенного C4-C10 циклодиенила или аминокислоты. Термин «замещенный» означает «связанный с по меньшей мере одним галогеном, гидроксилом, C1-C4 алкилом, карбоксилом или их комбинациями».
Предпочтительно Z3, Z5 и Z6 независимо представляют собой H, глюкозный, галактозный, арабинозный, ксилозный, маннозный, лактозный, трегалозный, гентиобиозный, целлобиозный, целлотриозный, мальтозный, мальтотриозный, хитобиозный, хитотриозный, маннобиозный, мелибиозный, фруктозный, N-ацетилглюкозаминный, N-ацетилгалактозаминный фрагмент или их комбинацию.
Более предпочтительно Z3 представляет собой H, глюкозный, галактозный, маннозный, N-ацетилглюкозаминный, N-ацетилгалактозаминный фрагмент или их комбинацию.
Согласно особенно предпочтительным вариантам реализации Z представляет собой лактозный или галактозный фрагмент, где Z представляет собой любой из Z(1), Z(2), Z(3) и Z(4).
Как видно из приведенных выше структурных формул, гиалуроновая кислота или ее производное функционализированы посредством конъюгирования с фрагментом формулы Z - Z(1), Z(2), Z(3) или Z(4) - за счет:
1) амидной связи между карбоксильной группой гиалуроновой кислоты, или ее производного, и амином, посредством восстановительного аминирования прекурсора Z первичными аминами или источниками аммиака,
2) аминной связи между аминогруппой гиалуроновой кислоты или ее производного, предварительно деацетилированных, и фрагментом Z, посредством восстановительного аминирования,
3) амидной связи между аминогруппой гиалуроновой кислоты или ее производного, предварительно деацетилированных, и карбоксильной группой прекурсора фрагмента Z.
Соответственно, согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу получения функционализированной гиалуроновой кислоты или ее производного, включающему следующие стадии:
i) обеспечения гиалуроновой кислоты или ее частично или полностью деацетилированного производного;
ii) обеспечения аминопроизводного моносахарида, дисахарида или олигосахарида с помощью реакции восстановительного аминирования;
iii) взаимодействия:
а) указанной гиалуроновой кислоты со стадии i) с аминопроизводным со стадии ii) в присутствии карбодиимидов и/или активаторов карбоксильной группы,
или
b) указанного частично или полностью деацетилированного производного со стадии i) с моносахаридом, дисахаридом или олигосахаридом в присутствии аминоборана;
или
с) частично или полностью деацетилированного производного со стадии i) с карбокси-производным моносахарида, дисахарида или олигосахарида в присутствии карбодиимидов и/или активаторов карбоксильной группы;
или
d) указанного производного со стадии iii-b) с аминопроизводным со стадии ii) в присутствии карбодиимидов и/или активаторов карбоксильной группы;
или
е) указанного производного со стадии iii-с) с аминопроизводным со стадии ii) в присутствии карбодиимидов и/или активаторов карбоксильной группы;
и
iv) осаждение образовавшейся функционализированной гиалуроновой кислоты или ее производного органическим растворителем.
Неожиданно было обнаружено, что указанные аминобораны проявляют значительную селективность при восстановлении иминогруппы по сравнению с карбонильной группой и совместимы с водной средой, обеспечивая тем самым эффективное аминное восстановление восстанавливающих сахаров в присутствии первичных аминов, источников аммиака и аминных фрагментов полисахаридов. В то же время присутствие карбодиимидов и/или активаторов карбоксильной группы эффективно способствует образованию амидопроизводных гиалуроновой кислоты с превосходной селективностью по отношению к образованию сложноэфирных производных. Таким образом, указанный способ в целом обеспечивает преимущество в виде возможности объединения моносахаридов, дисахаридов и олигосахаридов с основной цепью гиалуроновой кислоты без необходимости введения химических спейсеров.
Производными гиалуроновой кислоты, которые можно использовать для получения функционализированных производных согласно настоящему изобретению, предпочтительно являются:
- соли гиалуроновой кислоты, такие как гиалуронат натрия, гиалуронат калия, гиалуронат кальция, гиалуронат магния, гиалуронат цинка, гиалуронат кобальта, гиалуронат аммония, гиалуронат тетрабутиламмония и их смеси,
- сложные эфиры гиалуроновой кислоты, в которых часть карбоксильных групп или все карбоксильные группы этерифицированы алифатическими, ароматическими, арилалифатическими, циклоалифатическими или гетероциклическими спиртами, как описано также в EP 0216453 B1,
- самосшитые сложные эфиры гиалуроновой кислоты, в которых часть карбоксильных групп или все карбоксильные группы этерифицированы спиртовыми группами из той же самой полисахаридной цепи или других цепей, как описано также в EP 0341745 B1,
- поперечно-сшитые соединения гиалуроновой кислоты, в которых часть карбоксильных групп или все карбоксильные группы этерифицированы алифатическими, ароматическими, арилалифатическими, циклоалифатическими или гетероциклическими полиспиртами, где поперечная сшивка образована спейсерными цепями, как описано также в EP 0265116 B1,
- полуэфир янтарной кислоты или соли тяжелых металлов янтарной кислоты с гиалуроновой кислотой или с частичными или полными эфирами гиалуроновой кислоты, как описано также в WO 96/357207,
- О-сульфопроизводные, как описано также в WO 95/25751, или N-сульфопроизводные, как описано также в WO 1998/045335.
Указанные моносахариды, дисахариды или олигосахариды отвечают определению, приведенному выше для фрагмента Z.
Указанный аминоборан предпочтительно представляет собой 2-метил-пиридинборан, 5-этил-2-метил-пиридинборан, пиридинборан, триметиламинборан, триэтиламинборан, диметиламинборан, трет-бутиламинборан или их смесь. Более предпочтительно указанный аминоборан представляет собой 2-метил-пиридинборан, 5-этил-2-метил-пиридинборан или их смесь.
Аминобораны можно использовать без предварительной обработки, или их можно предварительно солюбилизировать или диспергировать в смешивающихся с водой органических растворителях, таких как спирты. Среди таких спиртов наиболее предпочтительными являются метанол, этанол, 2-пропанол или их смесь.
Термин «органический растворитель» означает смешивающийся с водой органический растворитель, способный понижать диэлектрическую проницаемость водного реакционного раствора. Подходящие органические растворители представляют собой ацетон, метанол, этанол, 2-пропанол или их смесь, и предпочтительно указанный органический растворитель представляет собой этанол или 2-пропанол, или их смесь.
Термин «активатор карбоксильной группы» означает реагенты, модифицирующие гидрокси-группу указанной группы и способствующие тем самым ее отщеплению в реакциях замещения. Активаторы карбоксильной группы включают гидроксибензотриазол, 1,1''-карбодиимидазол, п-нитрофенол, натриевую соль N-гидроксисульфосукцинимида, N-гидроксисукцинимид и их смеси.
Подходящие карбодиимиды включают дициклогексилкарбодиимид, 1-этил-3-(3-диметиламино-пропил)карбодиимида гидрохлорид, 1-этил-3-(3-диметиламино-пропил)карбодиимид, N,N''-ди-изо-пропил-карбодиимид и их смеси.
Необязательно, осадок, выделяемый на стадии iv), промывают смесями воды и органического растворителя, где содержание воды составляет до 30%, более предпочтительно до 10%.
Предпочтительно на стадии iii) молярное отношение моносахарида, дисахарида или олигосахарида к гиалуроновой кислоте или ее производному составляет от 0,5 до 30, более предпочтительно от 1 до 20, еще более предпочтительно от 1 до 10.
Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к применению указанной функционализированной гиалуроновой кислоты или ее производного для лечения патологий, обусловленных изменением экспрессии галектинов. Неограничивающими примерами патологий, обусловленных избыточной или недостаточной регуляцией указанных рецепторов, являются неалкогольный стеатогепатит, бляшечный псориаз, ревматоидный артрит, остеоартрит, неоплазия и фиброзные процессы в легких, почках и сердечно-сосудистой системе.
Примеры неоплазии и фиброзных процессов включают острый лимфобластный лейкоз, идиопатический фиброз легких, фиброз печени, фиброз сердца, фиброз почек, а также опухоли яичников, предстательной железы, легких, желудка, кожи, щитовидной железы и поджелудочной железы.
Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к применению указанной функционализированной гиалуроновой кислоты или ее производного в качестве биоматериала или каркаса для роста клеток при лечении ортопедических заболеваний.
Согласно следующему аспекту настоящее изобретение относится к применению указанной функционализированной гиалуроновой кислоты или ее производного в качестве биоматериала или каркаса для роста клеток, в пластической/косметической хирургии, гемодиализе, кардиологии, ангиологии, офтальмологии, отоларингологии, одонтологии, гинекологии, урологии, дерматологии, онкологии и восстановлении тканей.
Функционализированную гиалуроновую кислоту или ее производное можно также применять в качестве биоматериала для нанесения покрытий на объекты, применяемые в области медицины и других областях промышленности, с приданием поверхности такого объекта, применяемого в качестве среды, новых биологических характеристик.
Объекты, на которые может быть нанесено покрытие, включают, например, катетеры, трубки, зонды, сердечные клапаны, протезы мягких тканей, протезы животного происхождения, искусственные сухожилия, костные и сердечно-сосудистые протезы, контактные линзы, оксигенаторы крови, искусственные почки, сердце, поджелудочная железа, печень, пакеты для переливания крови, шприцы, хирургические инструменты, системы фильтрации, лабораторные инструменты, контейнеры для хранения культур и для восстановления клеток и тканей, среды для пептидов, белков и антител.
Функционализированную гиалуроновую кислоту или ее производное можно также применять в косметологии и дерматологии.
Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одну функционализированную гиалуроновую кислоту или ее производное и по меньшей мере одно фармакологически активное вещество и/или по меньшей мере одно биологически активное вещество.
Подходящие фармакологически активные вещества включают антибиотики, противоинфекционные, противомикробные, противовирусные, цитостатические, цитотоксические, противоопухолевые и противовоспалительные лекарственные средства, ранозаживляющие средства, анестетики, анальгетики, сосудосуживающие средства, холинергические или андренергические агонисты и антагонисты, противотромботические средства, антикоагулянты, кровоостанавливающие, фибринолитические или тромболитические средства, белки и их фрагменты, пептиды, полинуклеотиды, факторы роста, ферменты, вакцины или их комбинации.
Предпочтительно указанное биологически активное вещество выбрано из коллагена, фибриногена, фибрина, альгиновой кислоты, альгината натрия, альгината калия, альгината магния, целлюлозы, хондроитинсульфата, дерматансульфата, кератансульфата, гепарина, гепарансульфата, ламинина, фибронектина, эластина, полимолочной кислоты, полигликолевой кислоты, сополимера полимолочной и полигликолевой кислот, поликапролактона, желатина, альбумина, сополимера полигликолида и поликапролактона, сополимера полигликолида и политриметиленкарбоната, гидроксиапатита, трикальцийфосфата, дикальцийфосфата, деминерализованного костного матрикса и их смесей.
Предпочтительно указанная по меньшей мере одна функционализированная гиалуроновая кислота или ее производное и указанное по меньшей мере одно биологически активное вещество содержатся в массовом соотношении от 100:1 до 1:150.
Согласно следующему аспекту настоящее изобретение относится к применению указанной фармацевтической композиции для лечения патологий, обусловленных изменением экспрессии галектинов. Неограничивающими примерами патологий, обусловленных избыточной или недостаточной регуляцией указанных рецепторов, являются неалкогольный стеатогепатит, бляшечный псориаз, ревматоидный артрит, остеоартрит, неоплазия и фиброзные процессы в легких, почках и сердечно-сосудистой системе.
Согласно следующему аспекту настоящее изобретение относится к применению указанной фармацевтической композиции в пластической/косметической хирургии, гемодиализе, кардиологии, ангиологии, офтальмологии, отоларингологии, одонтологии, гинекологии, урологии, онкологии, дерматологии и восстановлении тканей.
Предпочтительно, фармацевтическая композиция согласно изобретению содержит до 10% масс. включительно указанной по меньшей мере одной функционализированной гиалуроновой кислоты или ее производного, в расчете на массу фармацевтической композиции, и более предпочтительно, до 5% масс. включительно указанной по меньшей мере одной функционализированной гиалуроновой кислоты или ее производного. Наиболее предпочтительными являются фармацевтические композиции, в которых количество указанной по меньшей мере одной функционализированной гиалуроновой кислоты или ее производного составляет от 0,5 до 5% масс. в расчете на массу указанной фармацевтической композиции.
Согласно особенно предпочтительным вариантам реализации настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одну функционализированную гиалуроновую кислоту или ее производное, как описано выше, и гидроксиапатит, трикальцийфосфат или их смеси. Указанные композиции с успехом находят применение в области ортопедии применительно к скелетной системе.
Фармацевтическую композицию согласно изобретению можно вводить перорально, внутримышечно, внутривенно, внутрисуставно, трансдермально, подкожно или местно - наружно или внутрь, например с помощью хирургических средств.
Предпочтительно указанную фармацевтическую композицию вводят внутрисуставно, трансдермально или местно вовнутрь.
Указанная фармацевтическая композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемые наполнители.
Подходящие фармацевтически приемлемые наполнители включают, например, регуляторы рН, регуляторы изотоничности, растворители, стабилизаторы, хелатирующие агенты, разбавители, связующие, дезинтегранты, лубриканты, вещества, способствующие скольжению, красители, суспендирующие агенты, поверхностно-активные вещества, криопротекторы, консерванты и антиоксиданты.
Настоящее изобретение также относится к биоматериалу, содержащему указанную функционализированную гиалуроновую кислоту или ее производное, как описано выше, отдельно или в комбинации с по меньшей мере одним из фармакологически активных и/или биологически активных веществ, описанных выше. Указанный биоматериал может быть представлен в форме микросфер, наносфер, мембран, губки, проволоки, пленки, иглы, направляющих, тампонов, гелей, гидрогелей, тканей, нетканых материалов, канюль или их комбинации.
При этом следует понимать, что все аспекты, обозначенные как предпочтительные и преимущественные применительно к указанной гиалуроновой кислоте или ее производному, следует рассматривать как в равной степени предпочтительные и преимущественные и применительно к способу, композициям, биоматериалам и применениям, описанным выше.
Следует также понимать, что все возможные комбинации предпочтительных аспектов функционализированной гиалуроновой кислоты или ее производного, способа получения, композиций, биоматериала и применений, изложенных выше, являются в равной степени предпочтительными.
Ниже в иллюстративных целях приведены примеры реализации настоящего изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Синтез первично-аминных производных восстанавливающих сахаров
(Гидрохлорид 4-O-β-D-галактопиранозил-1-амино-1-дезокси-D-глюцитола)
Раствор лактозы (6,25% масс./об.) и ацетата аммония (56% масс./об.) в метаноле обрабатывали при комнатной температуре при перемешивании количеством комплекса 5-этил-2-метилпиридинборана, эквимолярным количеству лактозы. Полученную смесь выдерживали в этих же условиях в течение 16 часов, после чего сырой продукт реакции смешивали с равным объемом изопропанола, а затем подкисляли до рН 2-3 6N соляной кислотой, в результате чего выпадал осадок хлористоводородной соли аминного производного лактозы. Затем указанный осадок выделяли и промывали смесью этанол:вода (9:1, 3x) и этанол:6N гидроксид натрия (95:5) до рН 9, а затем снова смесью этанол:вода (9:1, 2x) и, наконец, этанолом (1х). Полученное таким образом твердое вещество сушили при пониженном давлении и использовали на следующих стадиях синтеза без дополнительной очистки. Указанное производное анализировали методом ИК-спектроскопии. Выход реакции: 90%.
Пример 2. Синтез бензиламинных производных восстанавливающих сахаров
Раствор лактозы (3% масс./об.), бензиламина (5% масс./об.) и 5-этил-2-метилпиридинборана (6% масс./об.) в воде и метаноле (3:1) перемешивали при температуре 55°C и оставляли для протекания реакции на 20 часов. Затем указанную смесь охлаждали, экстрагировали дихлорметаном и, наконец, выпаривали водную фазу при низком давлении с получением белого кристаллического твердого вещества, которое затем промывали диэтиловым эфиром, после чего выделяли декантацией и сушили при пониженном давлении. Продукт анализировали методом ИК- и 1H-ЯМР-спектроскопии. Выход реакции: 90%.
Пример 3. Синтез первично-аминных производных восстанавливающих сахаров
Раствор производного, полученного согласно Примеру 2 (4% масс./об.), в метаноле и воде (1:1) перемешивали с помощью магнитной мешалки при комнатной температуре. Затем добавляли Pd на угле (0,4% масс./об.), и в полученной таким образом системе создавали избыточное давление водородом. Через 48 часов давление в системе сбрасывали и добавляли к системе равный объем воды, и декантированное твердое вещество и раствор фильтровали через целит. Полученный таким образом раствор затем сушили при пониженном давлении с получением твердого вещества белого цвета. Полученный продукт анализировали методом ИК- и 1H-ЯМР-спектроскопии. Выход реакции: 96%.
Пример 4. Синтез ацилирующего раствора на основе имидазоламида лактобионовой кислоты
Раствор лактобионовой кислоты (10% масс./об.) в диметилсульфоксиде смешивали с 1,1-карбонилдиимидазолом (1 экв.) и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Полученный раствор использовали далее без дополнительной очистки.
Пример 5. Синтез частично деацетилированного гиалуроната натрия (48 ч)
Раствор сульфата гидразина (1% масс./об.) в моногидрате гидразина смешивали с гиалуронатом натрия (2% масс./об.), и полученную таким образом систему нагревали до 55°C и оставляли при перемешивании для протекания реакции на 48 часов. Затем сырой продукт реакции охлаждали, осаждали этанолом, выделяли и промывали этанолом, а затем сушили в течение 24 часов при пониженном давлении. После этого полученный продукт (5% масс./об.) растворяли в водном растворе уксусной кислоты (5% об./об.), охлаждали раствор до 4°C, и добавляли по каплям водный раствор HIO3 (0.5 M, 60% об./об.). Смесь выдерживали в этих же условиях в течение 1 ч для протекания реакции, а затем добавляли раствор йодистоводородной кислоты (57% масс./об., 11% об./об. по отношению к раствору), и систему оставляли еще на 15 минут для протекания реакции. Затем раствор экстрагировали этиловым эфиром до полного обесцвечивания, доводили рН водной фазы до 7-7,5 с помощью NaOH (1N, 0,1N) и, наконец, осаждали продукт этанолом, промывали этанолом и сушили. Продукт анализировали методом 1H-ЯМР- и ИК-спектроскопии. Выход реакции: 83%, степень деацетилирования: 11%.
Пример 6. Синтез частично деацетилированного гиалуроната натрия (72 ч)
Раствор гиалуроната натрия (2% масс./об.) и сульфата гидразина (1% масс./об.) в гидрате гидразина перемешивали магнитной мешалкой при температуре 55°C в течение 72 часов. По истечении времени реакции добавляли этанол для осаждения полимера, и полученное твердое вещество промывали дополнительным количеством этанола и сушили под током азота. Полученный продукт растворяли в водном растворе уксусной кислоты (6% масс./об., 5% уксусная кислота), термостатировали при 0-5°C и смешивали с 0,8 экв. по объему раствора йодноватой кислоты в воде (7,5% масс./об.). Полученную систему выдерживали при перемешивании в течение 1 часа, затем смешивали с 0,11 экв. по объему водной йодистоводородной кислоты (57%) и оставляли еще на 15 минут для протекания реакции. Затем рН доводили до 9 с помощью 1М водного раствора NaOH и экстрагировали раствор этиловым эфиром до полного обесцвечивания. После этого продукт осаждали этанолом, промывали этанолом, сушили при пониженном давлении и анализировали методом ИК- и 1H-ЯМР-спектроскопии. Выход реакции: 86%, степень деацетилирования: 20%.
Пример 7. Синтез частично деацетилированного гиалуроната натрия (96 ч)
Раствор сульфата гидразина (1% масс./об.) в моногидрате гидразина смешивали с гиалуронатом натрия (2% масс./об.), и полученную таким образом систему нагревали до 55°C и оставляли при перемешивании для протекания реакции на 96 часов. Затем сырой продукт реакции охлаждали, осаждали этанолом, выделяли и промывали этанолом, а затем сушили в течение 24 часов при пониженном давлении. После этого полученный продукт (5% масс./об.) растворяли в водном растворе уксусной кислоты (5% об./об.), охлаждали раствор до 4°C, и добавляли по каплям водный раствор HIO3 (0.5 M, 60% об./об.). Смесь выдерживали в этих же условиях в течение 1 ч для протекания реакции, а затем добавляли раствор йодистоводородной кислоты (57% масс./об., 11% об./об. по отношению к раствору), и систему оставляли еще на 15 минут для протекания реакции. Затем раствор экстрагировали этиловым эфиром до полного обесцвечивания, доводили рН водной фазы до 7-7,5 с помощью NaOH (1N, 0,1N) и, наконец, осаждали продукт этанолом, промывали этанолом и сушили. Продукт анализировали методом 1H-ЯМР- и ИК-спектроскопии. Выход реакции: 86%, степень деацетилирования: 21%.
Пример 8. Синтез частично деацетилированного гиалуроната натрия (120 ч)
Раствор сульфата гидразина (1% масс./об.) в моногидрате гидразина смешивали с гиалуронатом натрия (2% масс./об.), и полученную таким образом систему нагревали до 55°C и оставляли при перемешивании для протекания реакции на 120 часов. Затем сырой продукт реакции охлаждали, осаждали этанолом, выделяли и промывали этанолом, а затем сушили в течение 24 часов при пониженном давлении. После этого полученный продукт (5% масс./об.) растворяли в водном растворе уксусной кислоты (5% об./об.), охлаждали раствор до 4°C, и добавляли по каплям водный раствор HIO3 (0.5 M, 60% об./об.). Смесь выдерживали в этих же условиях в течение 1 ч для протекания реакции, а затем добавляли раствор йодистоводородной кислоты (57% масс./об., 11% об./об. по отношению к раствору), и систему оставляли еще на 15 минут для протекания реакции. Затем раствор экстрагировали этиловым эфиром до полного обесцвечивания, доводили рН водной фазы до 7-7,5 с помощью NaOH (1N, 0,1N) и, наконец, осаждали продукт этанолом, промывали этанолом и сушили. Продукт анализировали методом 1H-ЯМР- и ИК-спектроскопии. Выход реакции: 89%, степень деацетилирования: 26%.
Пример 9. Синтез частично деацетилированного гиалуроната натрия (24 ч)
Раствор гиалуроната натрия (2% масс./об.) и йодида аммония (0.7% масс./об.) в гидрате гидразина перемешивали магнитной мешалкой при температуре 60°C в течение 24 часов. По истечении времени реакции добавляли этанол для осаждения полимера, и полученное твердое вещество промывали этанолом и сушили под током азота. Полученный продукт растворяли в водном растворе уксусной кислоты (6% масс./об., 5% уксусная кислота), термостатировали при 0-5°C и смешивали с 0,8 экв. по объему раствора йодноватой кислоты в воде (7,5% масс./об.). Полученную систему выдерживали при перемешивании в течение 1 часа, затем смешивали с 0,11 экв. по объему водной йодистоводородной кислоты (57%) и оставляли еще на 15 минут для протекания реакции. Затем рН доводили до 9 с помощью 1М водного раствора NaOH и экстрагировали раствор этиловым эфиром до полного обесцвечивания. После этого продукт осаждали этанолом, промывали этанолом и сушили при пониженном давлении. Полученное таким образом твердое вещество анализировали методом ИК- и 1H-ЯМР-спектроскопии. Выход реакции: 88%, степень деацетилирования: 15%.
Пример 10. Получение тетрабутиламмониевой соли гиалуроновой кислоты
Водный раствор гиалуроната натрия (1,6% масс./об.) пропускали через колонку, заполненную сульфосмолой в виде тетрабутиламмониевой соли (50% об./об. по отношению к раствору), предварительно активированной раствором тетрабутиламмония (40% масс./об.). Элюированный раствор затем лиофилизировали.
Пример 11. Получение частично деацетилированной тетрабутиламмониевой соли гиалуроновой кислоты
Водный раствор частично деацетилированного гиалуроната натрия (1,6% масс./об.) пропускали через колонку, заполненную сульфосмолой в виде тетрабутиламмониевой соли (50% об./об. по отношению к раствору), предварительно активированной раствором тетрабутиламмония (40% масс./об.). Элюированный раствор затем лиофилизировали.
Пример 12. Амидопроизводные гиалуроновой кислоты (амидирование с применением аминопроизводных восстанавливающих сахаров)
Раствор гиалуроната натрия (0,25% масс./об.) в воде смешивали с аминопроизводным, полученным в Примере 1 (30 экв.), и доводили рН полученного раствора до 6,8 с помощью подходящего количества гидроксида натрия (1N, 0,1N) или соляной кислоты (1N, 0,1N). Затем добавляли по каплям раствор гидрохлорида (3-диметиламинопропил)-N“-этилкарбодиимида (5 экв., 11% масс./об.) и гидроксибензотриазола (3,5 экв., 6% масс./об.), предварительно солюбилизированного в смеси вода:диметилсульфоксид (1,1:1). Доводили рН полученного раствора до 6,8 с помощью подходящего количества гидроксида натрия (1N, 0,1N), и полученный сырой продукт оставляли при комнатной температуре для протекания реакции на 16 часов. Затем доводили рН до 7 с помощью гидроксида натрия/соляной кислоты (0,1N), и полученный раствор многократно подвергали диализу с применением воды (значения отсечки: 12-14000). После этого к раствору добавляли хлорид натрия до достижения титра 5% масс./об., и целевой продукт осаждали этанолом, сушили и анализировали методом ИК и 1H-ЯМР-спектроскопии. Выход реакции: 88%, амидирование с применением аминопроизводного восстанавливающего сахара: 88%.
Пример 13. Амидопроизводные гиалуроновой кислоты (амидирование с применением аминопроизводных восстанавливающих сахаров)
Водный раствор, содержащий гиалуронат натрия (3% масс./об.), гидроксибензотриазол (0,4% масс./об.), гидрохлорид N-этил-N-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (0,6% масс./об.) и аминопроизводное лактозы, полученное согласно Примеру 3 (2% масс./об.), выдерживали при перемешивании в течение 22 часов, поддерживая рН равным 6,8 путем добавления водных растворов 0,1 M NaOH или 0.1 M HCl. Затем добавляли NaCl (5 г/100 мл) и осаждали продукт метанолом. Полученное таким образом твердое вещество выделяли декантацией, промывали метанолом и водой (4:1), чистым метанолом и, наконец, сушили при пониженном давлении. Продукт анализировали методом ИК- и 1H-ЯМР-спектроскопии. Выход реакции: 86%, амидирование с применением аминопроизводного восстанавливающего сахара: 27%.
Пример 14. Амидопроизводные гиалуроновой кислоты (амидирование с применением аминопроизводных восстанавливающих сахаров)
Раствор воды и диоксана (1:1), содержащий гиалуронат натрия (0,5% масс./об.), N-гидроксисукцинимид (1,3% масс./об.), гидрохлорид N-этил-N-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (1,0% масс./об.) и аминопроизводное лактозы, полученное согласно Примеру 3 (2,1% масс./об.), перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. По истечении времени реакции добавляли гидрокарбонат натрия, доводили рН до примерно 9-10 и оставляли раствор при перемешивании еще на 3 часа. рН полученной смеси доводили до 7 путем добавления уксусной кислоты (50%, об./об.), затем добавляли хлорид натрия (5 г/100 мл) и осаждали продукт этанолом, промывали этанолом и, наконец, сушили при пониженном давлении. Продукт анализировали методом ИК- и 1H-ЯМР-спектроскопии. Выход реакции: 85%, амидирование с применением аминопроизводного восстанавливающего сахара: 21%.
Пример 15. Амидопроизводные гиалуроновой кислоты (амидирование с применением аминопроизводных восстанавливающих сахаров) в органической среде
Раствор тетрабутиламмониевой соли гиалуроновой кислоты (2% масс./об.) в диметилсульфоксиде обрабатывали водной соляной кислотой для доведения рН до 3, а затем добавляли 1,1-карбонилдиимидазол (1,5 экв.) и выдерживали для протекания реакции в течение 12 часов. Затем раствор фильтровали через тигель Гуча для удаления твердых частиц, добавляли аминопроизводное, полученное в Примере 1 (2 экв.), и оставляли полученную смесь для протекания реакции на 48 часов. После этого добавляли насыщенный раствор хлорида натрия в количестве, достаточном для получения конечного титра в 5% масс./об. по хлориду натрия. Смесь перемешивали в течение 1 часа и, наконец, осаждали продукт путем добавления ацетона. Полученное твердое вещество выделяли и сушили. Продукт анализировали методом ИК- и 1H-ЯМР-спектроскопии. Выход реакции: 80%, амидирование с применением аминопроизводного восстанавливающего сахара: 10%.
Пример 16. Амидопроизводные гиалуроновой кислоты (амидирование с применением аминопроизводных восстанавливающих сахаров) в органической среде
Раствор гиалуроната натрия (2% масс./об.) в диметилформамиде смешивали с 1,1-карбонилдиимидазолом (1 экв.). Полученный раствор оставляли для протекания реакции на 6 часов, затем добавляли аминопроизводное, полученное в Примере 1 (5 экв.), и оставляли указанную систему для протекания реакции еще на 36 часов. После этого продукт осаждали ацетоном, выделяли, промывали ацетоном и сушили при пониженном давлении. Продукт анализировали методом ИК- и 1H-ЯМР-спектроскопии. Выход реакции: 80%, амидирование с применением аминопроизводного восстанавливающего сахара: 57%.
Пример 17. Аминопроизводные частично деацетилированной гиалуроновой кислоты (восстановительное аминирование с применением восстанавливающих сахаров)
К водному раствору частично деацетилированного гиалуроната натрия, полученного согласно Примеру 7 (1,5 масс./об.), добавляли лактозу (10 экв.) и доводили рН до примерно 5,5 с помощью уксусной кислоты (100%). Полученную таким образом систему нагревали до 60°C, добавляли раствор 2-метилпиридинборана (10 экв., 10% масс./об.) в метаноле и оставляли в этих же условиях на 2 часа для протекания реакции. Затем рН раствора доводили до примерно 2-3 с помощью водной соляной кислоты (4N) и выдерживали систему в этих условиях в течение 15 минут. Затем систему охлаждали, доводили рН до 7-7,5 с помощью NaOH (1N), и полученный раствор многократно подвергали диализу с применением воды (значения отсечки: 12-14000). Наконец, к раствору добавляли хлорид натрия до достижения титра 5% масс./об., и целевой продукт осаждали этанолом, сушили и анализировали методом ИК и 1H-ЯМР-спектроскопии. Выход реакции: 80%, аминирование восстанавливающим сахаром: 21%.
Пример 18. Аминопроизводные частично деацетилированной гиалуроновой кислоты (восстановительное аминирование с применением восстанавливающих сахаров)
К водному раствору частично деацетилированного гиалуроната натрия, полученного согласно Примеру 7 (1,5 масс./об.), добавляли лактозу (10 экв.) и доводили рН до примерно 5,5 с помощью уксусной кислоты (100%). Полученную таким образом систему нагревали до 60°C, добавляли раствор 2-метилпиридинборана (10 экв., 10% масс./об.) в метаноле и оставляли в этих же условиях на 2 часа для протекания реакции. Затем рН раствора доводили до примерно 2-3 с помощью водной соляной кислоты (4N) и выдерживали систему в этих условиях в течение 15 минут. После этого систему охлаждали, доводили рН до 7-7,5 с помощью NaOH (1N) и добавляли хлорид натрия до достижения титра 5% масс./об. Целевой продукт осаждали этанолом, сушили и анализировали методом ИК и 1H-ЯМР-спектроскопии. Выход реакции: 84%, аминирование восстанавливающим сахаром: 21%.
Пример 19. Аминопроизводные частично деацетилированной гиалуроновой кислоты (восстановительное аминирование с применением восстанавливающих сахаров)
К водному раствору частично деацетилированного гиалуроната натрия, полученного согласно Примеру 5 (1,5 масс./об.), добавляли лактозу (10 экв.) и доводили рН до примерно 5,5 с помощью уксусной кислоты (100%). Полученную таким образом систему нагревали до 60°C, добавляли раствор 2-метилпиридинборана (10 экв., 10% масс./об.) в метаноле и оставляли в этих же условиях на 2 часа для протекания реакции. Затем рН раствора доводили до примерно 2-3 с помощью водной соляной кислоты (4N) и выдерживали систему в этих условиях в течение 15 минут. Затем систему охлаждали, доводили рН до 7-7,5 с помощью NaOH (1N), и полученный раствор многократно подвергали диализу с применением воды (значения отсечки: 12-14000). Наконец, к раствору добавляли хлорид натрия до достижения титра 5% масс./об., и целевой продукт осаждали этанолом, сушили и анализировали методом ИК и 1H-ЯМР-спектроскопии. Выход реакции: 78%, аминирование восстанавливающим сахаром: 11%.
Пример 20. Аминопроизводные частично деацетилированной гиалуроновой кислоты (восстановительное аминирование с применением восстанавливающих сахаров)
К водному раствору частично деацетилированного гиалуроната натрия, полученного согласно Примеру 6 (2 масс./об.), добавляли лактозу (3 экв.) и доводили рН до примерно 5,5 с помощью уксусной кислоты (100%). Полученную таким образом систему нагревали до 60°C, добавляли раствор 2-метилпиридинборана (1 экв., 10% масс./об.) в изопропаноле и оставляли в этих же условиях на 3 часа для протекания реакции. Затем рН реакционной смеси доводили до примерно 2-3 с помощью водной соляной кислоты (4N) и выдерживали систему в этих условиях в течение 15 минут. Затем систему охлаждали и продукт осаждали путем добавления изопропанола, промывали смесью изопропанол:вода (80:20 и 90:10) и сушили при пониженном давлении. Продукт анализировали методом ИК- и 1H-ЯМР-спектроскопии. Выход реакции: 95%, аминирование восстанавливающим сахаром: 20%.
Пример 21. Аминопроизводные частично деацетилированной гиалуроновой кислоты (восстановительное аминирование с применением восстанавливающих сахаров)
К водному раствору частично деацетилированного гиалуроната натрия, полученного согласно Примеру 9 (2 масс./об.), добавляли лактозу (3 экв.) и доводили рН до примерно 5,5 с помощью уксусной кислоты (100%). Полученную таким образом систему нагревали до 60°C, добавляли раствор 2-метилпиридинборана (1 экв., 10% масс./об.) в изопропаноле и оставляли в этих же условиях на 3 часа для протекания реакции. Затем рН реакционной смеси доводили до примерно 2-3 с помощью водной соляной кислоты (4N) и выдерживали систему в этих условиях в течение 15 минут. Затем систему охлаждали и продукт осаждали путем добавления изопропанола, промывали смесью изопропанол:вода (80:20 и 90:10) и сушили при пониженном давлении. Продукт анализировали методом ИК- и 1H-ЯМР-спектроскопии. Выход реакции: 95%, аминирование восстанавливающим сахаром: 15%.
Пример 22. Амидопроизводные соединений, полученных согласно Примерам 17-21 (амидирование производных, полученных путем восстановительного аминирования гиалуроновой кислоты восстанавливающими сахарами)
Раствор аминопроизводного гиалуроновой кислоты, полученного согласно Примеру 17 (0,25% масс./об.), в воде смешивали с аминопроизводным, полученным в Примере 1 (30 экв.), и доводили рН полученного раствора до 6,8 с помощью подходящего количества гидроксида натрия (1N, 0,1N) или соляной кислоты (1N, 0,1N). Затем добавляли по каплям раствор гидрохлорида (3-диметиламинопропил)-N“-этилкарбодиимида (5 экв., 11% масс./об.) и гидроксибензотриазола (3,5 экв., 6% масс./об.), предварительно солюбилизированного в смеси вода:диметилсульфоксид (1,1:1). Доводили рН полученного раствора до 6,8 с помощью подходящего количества гидроксида натрия (1N, 0,1N), и полученный сырой продукт оставляли при комнатной температуре для протекания реакции на 16 часов. Затем доводили рН до 7 с помощью гидроксида натрия/соляной кислоты (0,1N), и полученный раствор многократно подвергали диализу с применением воды (значения отсечки: 12-14000). После этого к раствору добавляли хлорид натрия до достижения титра 5% масс./об., и целевой продукт осаждали этанолом, сушили и анализировали методом ИК и 1H-ЯМР-спектроскопии. Выход реакции: 90%, амидирование с применением аминопроизводного восстанавливающего сахара: 90%.
Пример 23. Амидопроизводные частично деацетилированной гиалуроновой кислоты (ацилирование карбоксильными производными восстанавливающих сахаров)
К раствору деацетилированного гиалуроната натрия, полученного согласно Примеру 7 (0,30% масс./об.), в воде добавляли лактобионовую кислоту (30 экв.) и доводили рН полученного раствора до 6,8 с помощью подходящего количества гидроксида натрия (1N, 0,1N) или соляной кислоты (1N, 0,1N). Затем добавляли по каплям раствор гидрохлорида (3-диметиламинопропил)-N''-этилкарбодиимида (5 экв., 11% масс./об.) и гидроксибензотриазола (3,5 экв., 6% масс./об.), предварительно солюбилизированного в смеси вода:диметилсульфоксид (1,1:1). Доводили рН полученного раствора до 6,8 с помощью подходящего количества гидроксида натрия (1N, 0,1N), и полученный сырой продукт оставляли при комнатной температуре для протекания реакции на 16 часов. Затем доводили рН до 7 с помощью гидроксида натрия/соляной кислоты (0,1N), и полученный раствор многократно подвергали диализу с применением воды (значения отсечки: 12-14000). После этого к раствору добавляли хлорид натрия до достижения титра 5% масс./об., и целевой продукт осаждали этанолом, сушили и анализировали методом ИК и 1H-ЯМР-спектроскопии. Выход реакции: 79%, ацилирование лактобионовой кислотой: 5%.
Пример 24. Амидопроизводные частично деацетилированной гиалуроновой кислоты (ацилирование карбоксильными производными восстанавливающих сахаров)
К раствору деацетилированного гиалуроната натрия, полученного согласно Примеру 7 (0,5 экв., 0,30% масс./об.), в воде добавляли раствор лактобионовой кислоты, полученный согласно Примеру 4, и полученный сырой продукт оставляли при комнатной температуре на 16 часов для протекания реакции. Затем доводили рН до 7 с помощью гидроксида натрия/соляной кислоты (0,1N), и полученный раствор многократно подвергали диализу с применением воды (значения отсечки: 12-14000). После этого к раствору добавляли хлорид натрия до достижения титра 5% масс./об., и целевой продукт осаждали этанолом, сушили и анализировали методом ИК и 1H-ЯМР-спектроскопии. Выход реакции: 87%, ацилирование лактобионовой кислотой: 16%.
Пример 25. Амидопроизводные частично деацетилированной гиалуроновой кислоты (ацилирование карбоксильными производными восстанавливающих сахаров)
К раствору деацетилированного гиалуроната натрия, полученного согласно Примеру 7 (0,5 экв., 30% масс./об.), в воде добавляли раствор лактобионовой кислоты, полученный согласно Примеру 4, и полученный сырой продукт оставляли при комнатной температуре на 16 часов для протекания реакции. Затем добавляли насыщенный раствор хлорида натрия в количестве, достаточном для получения конечного титра в 5% масс./об. по хлориду натрия. Смесь перемешивали в течение 1 часа и, наконец, осаждали продукт путем добавления ацетона. Полученное твердое вещество выделяли и сушили. Продукт анализировали методом ИК- и 1H-ЯМР-спектроскопии. Выход реакции: 85%, ацилирование лактобионовой кислотой: 16%.
Пример 26. Амидопроизводные частично деацетилированной гиалуроновой кислоты (ацилирование карбоксильными производными восстанавливающих сахаров) в органической среде
К раствору деацетилированного гиалуроната тетрабутиламмония, полученного согласно Примеру 11 (0,5 экв., 2% масс./об.), в воде добавляли раствор лактобионовой кислоты, полученный согласно Примеру 4, и полученный сырой продукт оставляли при комнатной температуре на 16 часов для протекания реакции. Затем добавляли насыщенный раствор хлорида натрия в количестве, достаточном для получения конечного титра в 5% масс./об. по хлориду натрия. Смесь перемешивали в течение 1 часа и, наконец, осаждали продукт путем добавления ацетона. Полученное твердое вещество выделяли и сушили. Продукт анализировали методом ИК- и 1H-ЯМР-спектроскопии. Выход реакции: 80%, ацилирование лактобионовой кислотой: 10%.
Пример 27. Амидопроизводные частично деацетилированной гиалуроновой кислоты (ацилирование карбоксильными производными восстанавливающих сахаров) в органической среде
К раствору деацетилированного гиалуроната натрия, полученного согласно Примеру 7 (0,5 экв., 2% масс./об.), в диметилформамиде добавляли раствор лактобионовой кислоты, полученный согласно Примеру 4, и полученный сырой продукт оставляли при комнатной температуре на 16 часов для протекания реакции. Затем добавляли насыщенный раствор хлорида натрия в количестве, достаточном для получения конечного титра в 5% масс./об. по хлориду натрия. Смесь перемешивали в течение 1 часа и, наконец, осаждали продукт путем добавления ацетона. Полученное твердое вещество выделяли и сушили. Продукт анализировали методом ИК- и 1H-ЯМР-спектроскопии. Выход реакции: 88%, ацилирование лактобионовой кислотой: 19%.
Пример 28. Амидопроизводные соединений, полученных согласно Примерам 23-27 (амидирование производных, полученных путем ацилирования гиалуроновой кислоты аминопроизводными восстанавливающих сахаров)
Раствор амидопроизводного гиалуроновой кислоты, полученного согласно Примеру 24 (0,25% масс./об.), в воде смешивали с аминопроизводным, полученным в Примере 1 (30 экв.), и доводили рН полученного раствора до 6,8 с помощью подходящего количества гидроксида натрия (1N, 0,1N) или соляной кислоты (1N, 0,1N). Затем добавляли по каплям раствор гидрохлорида (3-диметиламинопропил)-N“-этилкарбодиимида (5 экв., 11% масс./об.) и гидроксибензотриазола (3,5 экв., 6% масс./об.), предварительно солюбилизированного в смеси вода:диметилсульфоксид (1,1:1). Доводили рН полученного раствора до 6,8 с помощью подходящего количества гидроксида натрия (1N, 0,1N), и полученный сырой продукт оставляли при комнатной температуре для протекания реакции на 16 часов. Затем доводили рН до 7 с помощью гидроксида натрия/соляной кислоты (0,1N), и полученный раствор многократно подвергали диализу с применением воды (значения отсечки: 12-14000). После этого к раствору добавляли хлорид натрия до достижения титра 5% масс./об., и целевой продукт осаждали этанолом, сушили и анализировали методом ИК и 1H-ЯМР-спектроскопии. Выход реакции: 84%, амидирование с применением аминопроизводного восстанавливающего сахара: 93%.
Пример 29. Снижение маркеров воспаления
Фибробласты мышей линии NIH-3T3 растили в среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко (DMEM) в присутствии 10% фетальной бычьей сыворотки ФБС, и обрабатывали ИЛ1β 1 нг/мл в течение 24 часов. Затем некоторые из указанных культур инкубировали с амидопроизводным гиалуроновой кислоты, полученным согласно Примеру 13, в концентрации 1,25 мг/мл. Выделяли клеточную РНК через 6, 12 и 24 часа после обработки для последующего анализа экспрессии провоспалительного цитокина TGF-β1 методом кПЦР. Данный анализ проводили с применением RotorGene серии Q, позволяющего проводить количественную оценку экспрессии генов в ходе реакции амплификации. Реакционная смесь для кПЦР содержала флюоресцентную молекулу, связывающуюся с малой бороздкой в молекуле двухцепочечной ДНК. Для каждой реакции вели отрицательный контрольный образец (реакционную смесь без кДНК). Эксперименты проводили в двух повторах, и проводили статистический анализ с применением двухстороннего t-критерия Стьюдента. При значении t-критерия Стьюдента <0.05 расхождения считались значительными. Значение, приведенное в таблице, соответствует 2^-ΔΔCt, полученному с помощью сравнительной количественной оценки согласно 2^-ΔΔCt методу Пфаффла (Pfaffl M.V. Nucleic Acid Research 2001, 29 (9): e45):
ΔCt = Ct гена «домашнего хозяйства» - Ct целевого гена
ΔΔCt = Δ∆Ct образца - ΔCt контроля
2^-ΔΔCt
| Время (часы) | Необработанный контроль | Контроль, обработанный ИЛ1β | Обработан ИЛ1β и амидопроизводным гиалуроновой кислоты |
| TGF-β1 | TGF-β1 | TGF-β1 | |
| 6 | 1,000 | 2,101 | 1,289 |
| 12 | 1,000 | 1,112 | 0,946 |
| 24 | 1,000 | 0,778 | 0,462 |
В Примере 29 наглядно показана способность регулировать патологические процессы, обусловленные галектинами, где производные гиалуроновой кислоты, полученные согласно настоящему изобретению, демонстрируют значительную способность снижать экспрессию TGF-β1 - цитокина, расположенного ниже по воспалительному каскаду в процессах, регулируемых галектином 3, таких как фиброз.
1. Функционализированная гиалуроновая кислота или ее производное формулы (I)
(I),
где
R1, R2, R3, R4 независимо представляют собой H, SO3-, ацильную группу карбоновой кислоты алифатического, ароматического, арилалифатического, циклоалифатического или гетероциклического ряда, -CO-(CH2)2-COOY, где Y представляет собой отрицательный заряд или H,
и
R представляет собой Z(1) или Z(2), а R5 представляет собой -CO-CH3, H, SO3-, ацильную группу карбоновой кислоты алифатического, ароматического, арилалифатического, циклоалифатического или гетероциклического ряда, ацильную группу гиалуроновой кислоты,
где Z(1) представляет собой фрагмент формулы (1):
(1),
где Z1 представляет собой -NR6CH2-, а R6 представляет собой H или замещенную или незамещенную алифатическую, ароматическую, арилалифатическую, циклоалифатическую или гетероциклическую группу,
Z2 представляет собой -OH или -NHCOCH3,
Z3 представляет собой H, моносахарид, дисахарид или олигосахарид,
или Z(2) представляет собой фрагмент формулы (2):
(2),
где Z4 представляет собой -NR6CH-, и R6 представляет собой H или замещенную или незамещенную алифатическую, ароматическую, арилалифатическую, циклоалифатическую или гетероциклическую группу,
Z5 и Z6 независимо представляют собой H, моносахарид, дисахарид или олигосахарид,
или
R5 представляет собой Z(3) или Z(4), и R представляет собой NR6R7, или спиртовую группу алифатического, ароматического, арилалифатического, циклоалифатического или гетероциклического ряда, OH, O-, спиртовую группу гиалуроновой кислоты, аминогруппу гиалуроновой кислоты, и R6, R7 независимо представляют собой H или замещенную или незамещенную алифатическую, ароматическую, арилалифатическую, циклоалифатическую или гетероциклическую группу,
где Z(3) представляет собой фрагмент формулы (3):
(3),
где Z1 представляет собой -CH2- или -CO-,
Z2 представляет собой -OH или -NHCOCH3,
Z3 представляет собой H, моносахарид, дисахарид или олигосахарид,
или Z(4) представляет собой фрагмент формулы (4):
(4),
где Z4 представляет собой -CH-,
Z5 и Z6 независимо представляют собой H, моносахарид, дисахарид или олигосахарид,
или
R представляет собой Z(1) или Z(2), а R5 представляет собой Z(3) или Z(4).
2. Функционализированная гиалуроновая кислота или ее производное по п. 1, в которой Z3, Z5 и Z6 независимо представляют собой H, глюкозный, галактозный, арабинозный, ксилозный, маннозный, лактозный, трегалозный, гентиобиозный, целлобиозный, целлотриозный, мальтозный, мальтотриозный, хитобиозный, хитотриозный, маннобиозный, мелибиозный, фруктозный, N-ацетилглюкозаминный, N-ацетилгалактозаминный фрагмент или их комбинацию.
3. Функционализированная гиалуроновая кислота или ее производное по п. 1 или 2, в которой Z3 представляет собой H, глюкозный, галактозный, маннозный, N-ацетилглюкозаминный, N-ацетилгалактозаминный фрагмент или их комбинацию.
4. Функционализированная гиалуроновая кислота или ее производное по любому из пп. 1-3, в которой любой из Z(1), Z(2), Z(3) и Z(4) представляет собой лактозный или галактозный фрагмент.
5. Способ получения функционализированной гиалуроновой кислоты или ее производного по п. 1, включающий стадии:
i) обеспечения гиалуроновой кислоты или ее частично или полностью деацетилированного производного;
ii) взаимодействия:
а) указанной гиалуроновой кислоты со стадии (i) с аминопроизводным моносахарида, дисахарида или олигосахарида, полученным с помощью реакции восстановительного аминирования, в присутствии карбодиимидов и/или активаторов карбоксильной группы,
или
b) указанного частично или полностью деацетилированного производного со стадии (i) с моносахаридом, дисахаридом или олигосахаридом в присутствии аминоборана;
или
с) частично или полностью деацетилированного производного со стадии (i) с карбокси-производным моносахарида, дисахарида или олигосахарида в присутствии карбодиимидов и/или активаторов карбоксильной группы;
или
d) указанного производного со стадии (ii)-(b) с аминопроизводным моносахарида, дисахарида или олигосахарида, полученным с помощью реакции восстановительного аминирования, в присутствии карбодиимидов и/или активаторов карбоксильной группы;
или
е) указанного производного со стадии (ii)-(с) с аминопроизводным моносахарида, дисахарида или олигосахарида, полученным с помощью реакции восстановительного аминирования, в присутствии карбодиимидов и/или активаторов карбоксильной группы;
и
iii) осаждения образовавшейся функционализированной гиалуроновой кислоты или ее производного органическим растворителем.
6. Способ по п. 5, в котором молярное отношение моносахарида, дисахарида или олигосахарида со стадии (ii) к гиалуроновой кислоте или ее производному составляет от 0,5 до 30, предпочтительно от 1 до 20, более предпочтительно от 1 до 10.
7. Функционализированная гиалуроновая кислота или ее производное по п. 1 для применения для лечения патологий, обусловленных изменением экспрессии галектинов, где указанные патологии включают неалкогольный стеатогепатит, бляшечный псориаз, ревматоидный артрит, остеоартрит, неоплазию и фиброзные процессы в легких, почках и сердечно-сосудистой системе.
8. Функционализированная гиалуроновая кислота или ее производное по п. 1 для применения в качестве биоматериала или каркаса для роста клеток при лечении ортопедических патологий.
9. Фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере одну функционализированную гиалуроновую кислоту или ее производное по п. 1 и по меньшей мере одно фармакологически активное вещество и/или по меньшей мере одно биологически активное вещество, где:
- указанное фармакологически активное вещество выбрано из антибиотиков, противоинфекционных, противомикробных, противовирусных, цитостатических, цитотоксических, противоопухолевых или противовоспалительных агентов, ранозаживляющих агентов, анестетиков, анальгетиков, сосудосуживающих агентов, холинергических или андренергических агонистов и антагонистов, противотромботических агентов, антикоагулянтов, кровоостанавливающих, фибринолитических или тромболитических агентов, белков и их фрагментов, пептидов, полинуклеотидов, факторов роста, ферментов, вакцин и их комбинаций, и
- указанное биологически активное вещество выбрано из коллагена, фибриногена, фибрина, альгиновой кислоты, альгината натрия, альгината калия, альгината магния, целлюлозы, хондроитинсульфата, дерматансульфата, кератансульфата, гепарина, гепарансульфата, ламинина, фибронектина, эластина, полимолочной кислоты, полигликолевой кислоты, сополимера полимолочной и полигликолевой кислот, поликапролактона, желатина, альбумина, сополимера полигликолида и поликапролактона, сополимера полигликолида и политриметиленкарбоната, гидроксиапатита, трикальцийфосфата, дикальцийфосфата, деминерализованного костного матрикса и их смесей.
10. Фармацевтическая композиция по п. 9 для применения для лечения патологий, обусловленных изменением экспрессии галектинов, где указанные патологии включают неалкогольный стеатогепатит, бляшечный псориаз, ревматоидный артрит, остеоартрит, неоплазию и фиброзные процессы в легких, почках и сердечно-сосудистой системе.
