Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к новым сахаридам, и может быть применимо в медицинской практике. Изобретение раскрывает модифицированный О-полисахарид, способный стимулировать у млекопитающего иммунный ответ в отношении патогенных серотипов E. coli. 5 н. и 20 з.п. ф-лы, 25 ил., 21 табл., 23 пр.

Перекрестная ссылка на родственные заявки

В настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США рег. № 62/722370, поданной 24 августа 2018 г., предварительной заявки на патент США рег. № 62/784940, поданной 26 декабря 2018 г., и предварительной заявки на патент США рег. № 62/881361, поданной 31 июля 2019 г., каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям Escherichia coli и к способам их применения.

Предпосылки создания изобретения

Клеточная стенка грамотрицательных бактерий включает внешнюю мембрану и слой пептидогликана на внутренней стороне внешней мембраны. Внешняя мембрана включает фосфолипиды, липополисахариды (ЛПС), липопротеины и мембранные белки. Липополисахарид находится во внешнем слое мембраны, а фосфолипид - в ее внутреннем слое.

ЛПС включает мембранный «якорь», содержащий липид А, который связывает олигосахарид сердцевины с полимером O-полисахаридов, содержащих повторяющиеся мономерные сахаридные звенья, которые образуют короткие, длинные или очень длинные O-цепи. Олигосахарид сердцевины является наиболее консервативным в бактериях отдельных видов, а О-полисахарид может варьироваться среди серотипов.

Escherichia coli (E. coli) представляет собой грамотрицательную бактерию, которая, как известно, вызывает опасный для жизни бактериальный сепсис. Капсулярные (K) и липополисахаридные (ЛПС) O-антигены являются важными факторами вирулентности.

В настоящее время значительно возрос интерес к использованию О-полисахаридов в качестве основы для вакцин против E. coli. Однако предыдущие попытки разработать вакцины на основе гликоконъюгата E. coli с применением обычных способов химического конъюгирования или биоконъюгирования не привели к вырабатыванию устойчивых функциональных иммунных ответов для всех серотипов. В соответствии с этим, все еще существует потребность в иммуногенных композициях против E. coli, которые вырабатывали бы устойчивые функциональные иммунные ответы.

Сущность изобретения

Для удовлетворения этих и других потребностей было разработано настоящее изобретение, которое относится к композициям и к способам их применения для вырабатывания иммунных ответов против серотипов E. coli.

В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к сахаридам, конъюгатам и содержащим их композициям, полученным из штаммов E. coli, которые были сконструированы для экспрессии более длинных липополисахаридов О-антигена (ЛПС) с улучшенными свойствами для запуска биопроцессов и с более высокой плотностью иммуногенных эпитопов. Так, например, в одном варианте осуществления изобретения, штамм E. coli был сконструирован для экспрессии гена fepE Salmonella enterica из высококопийной плазмиды, что позволяет получить длинноцепочечный ЛПС в штаммах E. coli различных серотипов О-антигена.

Первоначальная разработка штамма была сосредоточена на О-антигене серотипа O25b, который ассоциируется с трудно поддающимся лечением заболеваний, вызываемых этим серотипом, и приводит к появлению изолятов, резистентных к множеству лекарственных средств. Ген wzzB был удален из клинического штамма O25b E. coli. После трансформации плазмидой fepE Salmonella, сконструированный штамм O25b E. coli продуцировал исключительно длинноцепочечный ЛПС. После химической экстракции уксусной кислотой для высвобождения О-антигена с бактериальной поверхности, полученный длинноцепочечный полисахарид O25b может быть подвергнут очистке и конъюгированию стандартными методами. В отличие от О-антигенов, продуцируемых посредством биоконъюгирования, эти О-антигены с более длинной цепью сохраняют внутренние и внешние олигосахариды сердцевины, которые независимо друг от друга способны вырабатывать функциональные антитела, которые одновременно являются бактерицидными и могут блокировать развитие сепсиса. Было неожиданно обнаружено, что репрезентативные гликоконъюгаты О25b являются значительно более иммуногенными у млекопитающих, чем неконъюгированный полисахарид.

В соответствии с этим, в одном своем аспекте, настоящее изобретение относится к сахариду, включающему по меньшей мере на 5 повторяющхеся звенье больше, чем число звеньев в соответствующем O-полисахариде E. coli дикого типа.

В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает структуру, выбранную из Формулы O1, Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4, Формулы O5, Формулы O6, Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18, Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23, Формулы O24, Формулы O25, Формулы O25b, Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45, Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы 62D₁, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73, Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144, Формулы O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186 и Формулы O187, где n равно целому числу от 1 до 1000. См. Таблицу 1 и фиг. 9A-C и Фиг. 10A-B.

Используемый здесь термин, «где n равно», если это не оговорено особо, означает «n» в формуле(ах), выбранной(ых) из группы формул. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает структуру, выбранную из Формулы O1 (например, Формулы O1A, Формулы O1B и Формулы O1С), Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4 (например, Формулы O4:K52 и Формулы O4:K6), Формулы O5 (например, Формулы O5ab и Формулы O5aс (штамма 180/C3)), Формулы O6 (например, Формулы O6:K2; K13; K15 и Формулы O6:K54), Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18 (например, Формулы O18A, Формулы O18aс, Формулы O18A1, Формулы O18B и Формулы O18B1), Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23 (например, Формулы O23A), Формулы O24, Формулы O25 (например, Формулы O25a и Формулы O25b), Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45 (например, Формулы O45 и Формулы O45rel), Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59,, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62 Формулы 62D₁, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73 (например, Формулы O73 (штамма 73-1)), Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144, Формулы O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186 и Формулы O187, где n равно целому числу от 1 до 1000. См. Таблицу 1 и Фиг. 9A-C и Фиг. 10A-B.

В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает структуру, выбранную из Формулы O1 (например, Формулы O1A, Формулы O1B и Формулы O1C), Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4 (например, Формулы O4:K52 и Формулы O4:K6), Формулы O5 (например, Формулы O5ab и Формулы O5aс (штамма 180/C3)), Формулы O6 (например, Формулы O6:K2; K13; K15 и Формулы O6:K54), Формулы O7, Формулы O10, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18 (например, Формулы O18A, Формулы O18aс, Формулы O18A1, Формулы O18B и Формулы O18B1), Формулы O21, Формулы O23 (например, Формулы O23A), Формулы O24, Формулы O25 (например, Формулы O25a и Формулы O25b), Формулы O26, Формулы O28, Формулы O44, Формулы O45 (например, Формулы O45 и Формулы O45rel), Формулы O55, Формулы O56, Формулы O58, Формулы O64, Формулы O69, Формулы O73 (например, Формулы O73 (штамма 73-1)), Формулы O75, формулы O77, формулы O78, формулы O86, Формулы O88, Формулы O90, Формулы O98, Формулы O104, Формулы 0111, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O119, Формулы O121, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O136, Формулы O138, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O147, Формулы O149, Формулы O152, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O164, Формулы O173, Формулы 62D₁, Формулы O22, Формулы O35, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O83, Формулы O91, Формулы O105, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O139, Формулы O153, формулы O167 и формулы O172, где n равно целому числу от 1 до 1000. См. Таблицу 1 и Фиг. 9A-C и Фиг.10A.

В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает структуру, выбранную из Формулы O1 (например, Формулы O1A, Формулы O1B и Формулы O1C), Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4 (например, Формулы O4:K52 и Формулы O4:K6), Формулы O5 (например, Формулы O5ab и Формулы O5aс (штамма 180/C3)), Формулы O6 (например, Формулы O6: K2;K13; K15 и Формулы O6:K54), Формулы O7, Формулы O10, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18 (например, Формулы O18A, Формулы O18aс, Формулы O18A1, Формулы O18B и Формулы O18B1), Формулы O21, Формулы O23 (например, Формулы O23A), Формулы O24, Формулы O25 (например, Формулы O25a и Формулы O25b), Формулы O26, Формулы O28, Формулы O44, Формулы O45 (например, Формулы O45 и Формулы O45rel), Формулы O55, Формулы O56, Формулы O58, Формулы O64, Формулы O69, Формулы O73 (например, Формулы O73 (штамма 73-1)), Формулы O75, формулы O77, формулы O78, формулы O86, Формулы O88, Формулы O90, Формулы O98, Формулы O104, Формулы 0111, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O119, Формулы O121, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O136, Формулы O138, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O147, Формулы O149, Формулы O152, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O164, Формулы O173 и Формулы 62D₁, где n равно целому числу от 1 до 1000. См. Таблицу 1 и Фиг. 9A-C.

В одном варианте осуществления изобретения, композиция не включает структуру, выбранную из формулы O8, формулы O9a, формулы O9, формулы O20ab, формулы O20ac, формулы O52, формулы O97 и формулы O101. В другом варианте осуществления изобретения, композиция включает структуру, выбранную из Формулы O8, Формулы O9a, Формулы O9, Формулы O20ab, Формулы O20ac, Формулы O52, Формулы O97 и Формулы O101, где n равно целому числу от 1 до 10. См. Таблицу 1 и фиг. 10B.

В одном варианте осуществления изобретения, E. coli представляет собой любой серотип E. coli, выбранный из O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18, O19, O20, O21, O22, O23, O24, O25, O25b, O26, O27, O28, O29, O30, O32, O33, O34, O35, O36, O37, O38, O39, O40, O41, O42, O43, O44, O45, O46, O48, O49, O50, O51, O52, O53, O54, O55, O56, O57, O58, O59, O60, O61, O62, 62D₁, O63, O64, O65, O66, O68, O69, O70, O71, O73, O74, O75, O76, O77, O78, O79, O80, O81, O82, O83, O84, O85, O86, O87, O88, O89, O90, O91, O92, O93, O95, O96, O97, O98, O99, O100, O101, O102, O103, O104, O105, O106, O107, O108, O109, O110, 0111, O112, O113, O114, O115, O116, O117, O118, O119, O120, O121, O123, O124, O125, O126, O127, O128, O129, O130, O131, O132, O133, O134, O135, O136, O137, O138, O139, O140, O141, O142, O143, O144, O145, O146, O147, O148, O149, O150, O151, O152, O153, O154, O155, O156, O157, O158, O159, O160, O161, O162, O163, O164, O165, O167, O168, O169, O170, O171, O172, O173, O174, O175, O176, O177, O178, O179, O180, O181, O182, O183, O184, O185, O186 и O187.

В одном варианте осуществления изобретения, E. coli представляет собой серотип E. coli, выбранный из группы, состоящей из O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18, O19, O20, O21, O22, O23, O24, O25, O25b, O26, O27, O28, O29, O30, O32, O33, O34, O35, O36, O37, O38, O39, O40, O41, O42, O43, O44, O45, O46, O48, O49, O50, O51, O52, O53, O54, O55, O56, O57, O58, O59, O60, O61, O62, 62D₁, O63, O64, O65, O66, O68, O69, O70, O71, O73, O74, O75, O76, O77, O78, O79, O80, O81, O82, O83, O84, O85, O86, O87, O88, O89, O90, O91, O92, O93, O95, O96, O97, O98, O99, O100, O101, O102, O103, O104, O105, O106, O107, O108, O109, O110, 0111, O112, O113, O114, O115, O116, O117, O118, O119, O120, O121, O123, O124, O125, O126, O127, O128, O129, O130, O131, O132, O133, O134, O135, O136, O137, O138, O139, O140, O141, O142, O143, O144, O145, O146, O147, O148, O149, O150, O151, O152, O153, O154, O155, O156, O157, O158, O159, O160, O161, O162, O163, O164, O165, O166, O167, O168, O169, O170, O171, O172, O173, O174, O175, O176, O177, O178, O179, O180, O181, O182, O183, O184, O185, O186 и O187.

В одном варианте осуществления изобретения, сахарид получают посредством экспрессии белка семейства wzz в грамотрицательной бактерии с образованием указанного сахарида. В одном варианте осуществления изобретения, сахарид получают путем увеличения числа повторяющихся звеньев О-полисахаридов, продуцируемых грамотрицательной бактерией в культуре, посредством экспрессии (сверхэкспрессии, но необязательно) белков семейства wzz в грамотрицательной бактерии с образованием указанного сахарида. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, любой белок семейства wzz выбран из wzzB, wzz, wzz_SF, wzz_ST, fepE, wzz_fepE, wzz1 и wzz2. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, экспрессируемый (не обязательно сверхэкспрессируемый) белок семейства wzz выбран из группы, состоящей из wzzB, wzz, wzz_SF, wzz_ST, fepE, wzz_fepE, wzz1 и wzz2. В альтернативном варианте изобретения, сахарид является синтезированным. В одном варианте осуществления изобретения, сахарид ковалентно связан (конъюгирован) с белком-носителем. Предпочтительно, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

В одном своем аспекте, настоящее изобретение относится к композиции, которая включает сахарид и/или его конъюгаты и фармацевтически приемлемый разбавитель.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу индуцирования иммунного ответа у индивидуума, включающеиу введение индивидууму эффективного количества композиции. В одном варианте осуществления изобретения, иммунный ответ включает индуцирование антитела против O-специфического полисахарида E. coli.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1A-B - На фиг. 1А изображен репликон pUC, 500-700 копий на клетку; регулятор длины цепи (фиг. 1А) и репликон Р15а - 10-12 копий на клетку; плазмиды оперона О-антигена (фиг. 1В).

Фиг. 2 - Выравнивание аминокислотных последовательностей WzzB, где показаны K12\W3110\WzzB (SEQ ID NO: 23); O25a\ETEC\ATCC\WzzB (SEQ ID NO: 22); O25a:K5:H1\WzzB (SEQ ID NO: 21); O25b\2401\WzzB (SEQ ID NO: 20); и O25b\2401\WzzB (SEQ ID NO: 20).

Фиг. 3A-B: Модуляция длины цепи O-антигена в штаммах серотипа O25a и O25b посредством плазмидной экспрессии гетерологичных регуляторов длины цепи wzzB и fepE. Показана генетическая комплементация экспрессии ЛПС в плазмидных трансформантах штаммов с нокаутом wzzB O25K5H1 (O25a) и GAR2401 (O25b). Слева на фиг. 3A показаны профили ЛПС плазмидных трансформантов O25a O25K5HΔwzzB; а справа - аналогичные профили трансформантов O25b GAR 2401ΔwzzB. Иммуноблоттинг геля-репликатора, зондированного O25-специфической сывороткой (Statens Serum Institut), показан на фиг. 3B. Фон O25a ΔwххB (с нокаутом) показан на дорожках 1-7; фон O25b 2401 ΔwzzB (с нокаутом) показан на дорожках 8-15.

Фиг. 4 - Экспрессия длинноцепочечного О-антигена, обеспечиваемая плазмидами E. coli и fepE Salmonella в хозяине O25K5H1ΔwzzB.

Фиг. 5 - Выравнивание аминокислотных последовательностей FepE. Аминокислотная последовательность O157 FepE представляет собой SEQ ID NO: 18; аминокислотная последовательность O25a ETEC ATCC FepE представляет собой SEQ ID NO: 17; аминокислотная последовательность O25a:K5:H1 FepE представляет собой SEQ ID NO: 16; аминокислотная последовательность O25b 2401 FepE представляет собой SEQ ID NO: 15; аминокислотная последовательность LT2 FepE Salmonella представляет собой SEQ ID NO: 19.

Фиг. 6 - Экспрессия fepE Salmonella способствует продуцированию ЛПС длинного O-антигена в различных клинических изолятах.

Фиг. 7A-B - Опосредованная плазмидой и индуцируемая арабинозой экспрессия ЛПС длинного O-антигена O25b в штамме-хозяине с нокаутом O-антигена O25b. Результаты электрофореза в ДСН-ПААГ показаны на фиг. 7A, а результаты иммуноблоттинга O25 показаны на фиг. 7B, где дорожка 1 относится к клону 1 без арабинозы; дорожка 2 относится к клону 1 с 0,2% арабинозой; дорожка 3 относится к клону 9 без арабинозы; дорожка 4 относится к клону 9 с 0,2% арабинозой; дорожка 5 относится к стандартному ЛПС E. coli O55; а дорожка 6 относится к стандартному ЛПС E.coli O111, как показано на фиг. 7A и на фиг. 7В.

Фиг. 8 - Опосредованная плазмидой и индуцируемая арабинозой экспрессия ЛПС длинного O-антигена в обычном штамме-хозяине.

Фиг. 9A-C - Структуры О-антигенов, синтезируемых по независимому от полимеразы пути с четырьмя или менее остатками в остове.

Фиг. 10A-B - На фиг. 10А представлены структуры О-антигенов, синтезируемых по зависимому от полимеразы пути с пятью или шестью остатками в остове; на Фиг. 10B представлены О-антигены, которые, как предполагается, синтезируются по пути, зависимому от переносчика ABC.

Фиг. 11 - Экспрессия ЛПС O-антигена O25 в штаммах для исследования биопроцессов.

Фиг. 12A-B - ЭХ-профили и свойства коротких (фиг. 12A, штамм 1 O25b дикого типа 2831) и длинных O-антигенов O25b (фиг. 12B, штамм 2 O25b 2401 AwzzB/LT2 FepE), очищенных из штаммов GAR2831 и '2401ΔwzzB/fepE.

Фиг. 13A-B - (фиг. 13A) - Информация о схеме вакцинации для исследования 1 на кроликах VAC-2017-PRL-EC-0723; (Фиг. 13B) - Схема вакцинации для исследования 2 на кроликах VAC-2018-PRL-EC-077.

Фиг. 14A-C - IgG-ответы на гликоконъюгат O25b, где -•- представляет результаты до забора крови; - - забор крови 1 (6 недель) - -; забор крови 2 (8 недель); -♦- забор крови 3 (12 недель). На фиг. 14A показаны результаты для кролика 1-3 (умеренная активация); на фиг. 14B показаны результаты для кролика 2-3 (низкая активация); на фиг. 14C показаны результаты для кролика 3-1 (высокая активация).

Фиг. 15A-F - IgG-ответы на гликоконъюгат длинного O-антигена O25b, то есть, конъюгат O25b-CRM₁₉₇с низкой активацией (фиг. 15D-F, где -•- означает результаты до забора крови у кролика 2-1, - - неделя 12, антисыворотка от кролика 2-1) по сравнению с неконъюгированным полисахаридом, то есть, свободным полисахаридом O25b (фиг. A-C, где -•- означает результаты до забора крови у кролика A-1, - - неделя 6, антисыворотка от кролика A-1, - - неделя 8, антисыворотка от кролика A-1). Следует отметить, что MFI отложены на графике по логарифмической шкале для выявления различий между неиммунными и иммунными антителами в интервале <1000 MFI. На фиг. 15A представлены результаты для кролика A-1 (неконъюгированный полисахарид); на фиг. 15В представлены результаты для кролика A-3 (неконъюгированный полисахарид); на фиг. 15С представлены результаты для кролика А-4 (неконъюгированный полисахарид); на фиг. 15D представлены результаты для кролика 2-1 (низкая активация); на фиг. 15E представлены результаты для кролика 2-2 (низкая активация); и на фиг. 15F представлены результаты для кролика 2-3 (низкая активация).

Фиг. 16A-C - Поверхностная экспрессия нативного и длинного O-антигена O25b, детектированная с использованием антисыворотки против O25b. На фиг. 16A представлены результаты, где -•- представляет результаты для O25b 2831 по сравнению с антисывороткой против PD3; - - результаты для O25b 2831 дикого типа по сравнению с результатами до забора крови; - - результаты для O25b 2831/fepE по сравнению с результатами с антисывороткой против PD3; - - результаты для O25b 2831/fepE по сравнению с результатами до забора крови. На фиг. 16B представлены результаты, где -•- представляет результаты для O25b 2401 по сравнению с антисывороткой против PD3; - - результаты для O25b 2401 дикого типа по сравнению с результатами до забора крови; - - результаты для O25b 2401/fepE по сравнению с результатами с антисывороткой против PD3; - - результаты для O25b 2401/fepE по сравнению с результатами до забора крови. На фиг. 16C показаны результаты, где -•- представляет результаты для K12 E. coli по сравнению с результатами для антисыворотки против PD3; - - результаты для K12 E. coli по сравнению с результатами до забора крови.

Фиг. 17 - Обобщенные структуры углеводного остова внешних олигосахаридов сердцевины пяти известных хемотипов. Все глюкозы находятся в α-аномерной конфигурации, если это не оговорено особо. Гены, продукты которых катализируют образование каждой связи, показаны пунктирными стрелками. Звездочкой обозначен остаток олигосахарида сердцевины, к которому присоединен О-антиген.

Фиг. 18 - Неконъюгированный свободный полисахарид O25b не является иммуногенным (dLIA), где -•- представляет результаты, полученные на неделе 18 (1 неделя=PD4), антисыворотка от 4-1; - - неделя 18 (1 неделя=PD4), антисыворотка от 4-2; - - неделя 18 (1 неделя=PD4), антисыворотка от 5-1; - - Неделя 18 (1 неделя=PD4), антисыворотка от 5-2; - - неделя 18 (1 неделя=PD4), антисыворотка от 6-1; - - неделя 18 (1 неделя=PD4), антисыворотка от 6-2.

Фиг. 19A-C - Графики, иллюстрирующие специфичность OPA-титров иммунной сыворотки с конъюгатом O25b у кроликов BRC RAC. На фиг. 19A показаны OPA-титры в неиммунной сыворотке кролика 2-3 -•- и в постиммунной сыворотке через 13 недель - -. На фиг. 19B показаны OPA-титры в неиммунной сыворотке у кролика 1-2 -•- и в постиммунной сыворотке через 19 недель - -. На фиг. 19C показана специфичность OPA-титра у кролика 1-2 на неделе 19, где активность OPA иммунной сыворотки кролика 1-2 блокировали посредством предварительного инкубирования со 100 мкг/мл очищенного полисахарида длинного O-антигена неконъюгированного O25b, где - - означает результаты для иммунной сыворотки кролика 1-2 не неделе 19; и - - означает результаты для кролика 1-2 на неделе 19 с длинным OAg w/R1.

Фиг. 20A-C - На фиг. 20A проиллюстрирована репрезентативная схема введения. На фиг. 20B и фиг. 20C показаны графики, иллюстрирующие уровни IgG в ответ на O-антиген O25b, вырабатываемый полисахаридом длинного O-антигена неконъюгированного O25b (фиг. 20B, свободный полисахарид O25b (2 мкг) и производное гликоконъюгата длинного O-антигена O25b с RAC/ДМСО (фиг. 20C, длинный O25b-CRM₁₉₇ RAC (2 мкг)), где -...- (пунктирная линия) означает уровень IgG в ответ на O25b «необученных» CD1.

Фиг. 21 A-B - Графики, иллюстрирующие иммуногенность OPA RAC, длинных гликоконъюгатов eTEC O25b и гликоконъюгатов по одному концу после введения дозы 2 (фиг. 21A) и после введения дозы 3 (фиг. 21B), где -○- означает результаты для 2 мкг короткого полисахарида, присоединенного по одному концу; -•- означает результаты для 2 мкг длинного полисахарида, присоединенного по одному концу; - - означает результаты для 2 мкг длинного полисахарида с RAC/ДМСО; - - означает результаты для 2 мкг длинного полисахарида с eTEC; * фоновый контроль (n=20). † Ответы респондентов означают % мышей с титрами > 2× от невакцинированного базового уровня.

Фиг. 22 - График, иллюстрирующий OPA-иммуногенность уровней химической молекулы eTEC и модифицированных уровней активации полисахаридов. † Ответы респондентов означают % мышей с титрами > 2× от невакцинированного базового уровня.

Фиг. 23A-B - На фиг. 23A проиллюстрирована репрезентативная схема введения, а на фиг. 23В показан график, иллюстрирующий защиту мышей, иммунизированных дозами конъюгатов eTEC E. coli, от летального заражения изолятом O25b, где - - означает 17% активацию длинноцепочечного eTEC; - - означает 10% активацию длинноцепочечного eTEC; - - означает 4% активацию длинноцепочечного eTEC; - - означает полисахарид O25b; - - означает невакцинированные контроли.

Фиг. 24 - Схематическое изображение, иллюстрирующее репрезентативное получение конъюгатов по одному концу, где способ конъюгирования включает селективную активацию 2-кето-3-дезоксиоктановой кислоты (KDO) дисульфидным аминовым линкером после удаления маскирующей функциональной тиоловой группы. Затем KDO конъюгируют с белком CRM₁₉₇,активированным бромом, как показано на фиг. 24 (Получение конъюгатов по одному концу).

На фиг. 25A-B показана репрезентативная блок-схема способов активации (фиг. 25A) и конъюгирования (фиг. 25B), применяемых при получении гликоконъюгата E. coli с CRM₁₉₇.

Идентификаторы последовательностей

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность праймера для LT2wzzB_S, описанную в Таблице 4.

SEQ ID NO: 2 представляет последовательность праймера для LT2wzzB_AS, описанную в Таблице 4.

SEQ ID NO: 3 представляет последовательность праймера для O25bFepE_S, описанную в Таблице 4.

SEQ ID NO: 4 представляет последовательность праймера для O25bFepE_A, описанную в Таблице 4.

SEQ ID NO: 5 представляет последовательность праймера для wzzB P1_S, описанную в Таблице 4.

SEQ ID NO: 6 представляет последовательность праймера для wzzB P2_AS, описанную в Таблице 4.

SEQ ID NO: 7 представляет последовательность праймера для wzzB P3_S, описанную в Таблице 4.

SEQ ID NO: 8 представляет последовательность праймера для wzzB P4_AS, описанную в Таблице 4.

SEQ ID NO: 9 представляет последовательность праймера для O157 FepE_S, описанную в Таблице 4.

SEQ ID NO: 10 представляет последовательность праймера для O157 FepE_AS, описанную в Таблице 4.

SEQ ID NO: 11 представляет последовательность праймера для pBAD33_adaptor_S, описанную в Таблице 4.

SEQ ID NO: 12 представляет последовательность праймера для pBAD33_adaptor_AS, описанную в Таблице 4.

SEQ ID NO: 13 представляет последовательность праймера для JUMPSTART_r, описанные в Таблице 4.

SEQ ID NO: 14 представляет последовательность праймера для gnd_f, описанную в Таблице 4.

SEQ ID NO: 15 представляет аминокислотную последовательность O25b 2401 FepE, показанную на фиг. 5.

SEQ ID NO: 16 представляет аминокислотную последовательность O25a:K5:H1 FepE, показанную на фиг. 5.

SEQ ID NO: 17 представляет аминокислотную последовательность O25a ETEC ATCC FepE, показанную на фиг. 5.

SEQ ID NO: 18 представляет аминокислотную последовательность O157 FepE, показанную на фиг. 5.

SEQ ID NO: 19 представляет аминокислотную последовательность Salmonella LT2 FepE, показанную на фиг. 5.

SEQ ID NO: 20 представляет собой аминокислотную последовательность O25b 2401 WzzB, показанную на фиг. 2.

SEQ ID NO: 21 представляет аминокислотную последовательность O25a:K5:H1 WzzB, показанную на фиг. 2.

SEQ ID NO: 22 представляет собой аминокислотную последовательность O25a ETEC ATCC WzzB, показанную на фиг. 2.

SEQ ID NO: 23 представляет аминокислотную последовательность K12 W3110 WzzB, показанную на фиг. 2.

SEQ ID NO: 24 представляет собой аминокислотную последовательность Salmonella LT2 WzzB, показанную на фиг. 2.

Подробное описание изобретения

Авторами настоящего изобретения были неожиданно обнаружены антигены E. coli, полученные в результате конструирования различных белков Wzz (например, WzzB), включая неожиданное открытие иммуногенных конъюгатов и способов их применения. Кроме того, авторами настоящего изобретения были неожиданно обнаружены гликоконъюгаты, содержащие сахариды, ковалентно конъюгированные с белком-носителем, например, посредством двухвалентного гетеробифункционального линкера, называемого здесь (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбаматным (eTEC) спейсером. Авторы настоящего изобретения также неожиданно обнаружили гликоконъюгаты, содержащие сахариды, конъюгированные с белком-носителем, например, посредством восстановительного аминирования (RAC). В частности, RAC осуществляют в апротонном растворителе, а предпочтительно, в ДМСО (RAC/ДМСО) или в водном растворе. Настоящее изобретение также относится к иммуногенным композициям, содержащим такие гликоконъюгаты, и к способам применения таких гликоконъюгатов и иммуногенных композиций. Кроме того, авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что в некоторых вариантах осуществления изобретения, гликоконъюгат, содержащий высокомолекулярный сахарид, имеющий О-антиген с промежуточной или длинной цепью, может быть более иммуногенным по сравнению с гликоконъюгатами, имеющими относительно короткие цепи О-антигена. Более того, авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что в некоторых вариантах осуществления изобретения, гликоконъюгаты, полученные путем многосторонней активации сахарида перед конъюгированием с белком-носителем, например, с применением методов, включающих RAC или одностороннее конъюгирование или eTEC, могут быть более иммуногенными, чем гликоконъюгаты, полученные путем односторонней активации сахарида перед конъюгированием с белком-носителем.

В одном варианте осуществления изобретения, сахарид получают путем экспрессии (необязательно сверхэкспрессии) различных белков Wzz (например, WzzB) для регуляции размера сахарида.

Используемый здесь термин «сахарид» означает одну сахарную группу или моносахаридное звено, а также комбинации двух или более одиночных сахарных групп или моносахаридных звеньев, ковалентно связанных с образованием дисахаридов, олигосахаридов и полисахаридов. Сахарид может быть прямым или разветвленным.

В одном варианте осуществления изобретения, сахарид продуцируется рекомбинантной грамотрицательной бактерией. В одном варианте осуществления изобретения, сахарид продуцируется в клетке рекомбинантной E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, сахарид продуцируется в клетке рекомбинантной Salmonella. Примеры бактерий включают E. coli O25K5H1, E. coli BD559, E. coli GAR2831, E. coli GAR865, E. coli GAR868, E. coli GAR869, E. coli GAR872, E. coli GAR878, E. coli GAR896, E. coli GAR1902, E. coli O25a ETC NR-5, E. coli O157:H7:K-, штамм Salmonella enterica серотипа Typhimurium LT2, E. coli GAR2401, штамм Salmonella enterica серотипа Enteritidis CVD 1943, штамм Salmonella enterica серотипа Typhimurium CVD 1925, штамм Salmonella enterica серотипа Paratyphi A CVD 1902 и штамм Shigella flexneri CVD 1208S. В одном варианте осуществления изобретения, бактерия не является E. coli GAR2401. Такой генетический подход позволяет получать сахариды, подходящие для эффективного продуцирования молекул О-полисахаридов и О-антигена в качестве вакцинных компонентов.

Используемый здесь термин «белок wzz» означает полипептид с определенной длиной цепи, такой как, например, wzzB, wzz, wzz_SF, WZZ_ST, fepE, wzz_fepE, wzzl и wzz2. Репрезентативные последовательности гена wzz имеются в GenBank под номерами доступа: AF011910 для E4991/76; AF011911 для F186; AF011912 для M70/1-1; AF01 1913 для 79/311; AF011914 для Bi7509-41; AF011915 для C664-1992; AF011916 для C258-94; AF011917 для C722-89 и AF011919 для EDL933. Номерами доступа GenBank для последовательностей генов wzz G7 и Bi316-41 являются U39305 и U39306, соответственно. Дополнительными номерами доступа в GenBank для репрезентативных последовательностей гена wzz являются NP_459581 для Salmonella enterica подвида enterica серотипа Typhimurium str. LT2 FepE; AIG66859 для штамма E. coli O157:H7 EDL933 FepE; NP_461024 для Salmonella enterica подвида enterica серотипа Typhimurium str. LT2 WzzB. NP_416531 для штамма E. coli подтипа K-12 MG1655 WzzB; NP_415119 для штамма E. coli подтипа K-12 MG1655 FepE. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, белок семейства wzz представляет собой любой из белков wzzB, wzz, wzz_SF, wzz_ST, fepE, wzz_fepE, wzzl и wzz2, наиболее предпочтительно wzzB, а более предпочтительно fepE.

Репрезентативные последовательности wzzB включают:

> O25b 2401 WzzB

MRVENNNVSGQNHDPEQIDLIDLLVQLWRGKMTIIISVIVAIALAIGYLAVAKEKWTSTAIITQPDVGQIAGYNNAMNVIYGQAAPKVSDLQETLIGRFSSAFSALAETLDNQEEPEKLTIEPSVKNQQLPLTVSYVGQTAEGAQMKLAQYIQQVDDKVNQELEKDLKDNIALGRKNLQDSLRTQEVVAQEQKDLRIRQIQEALQYANQEQVTKPQVQQTEDVTQDTLFLLGSEALESMIKHEATRPLVFSSNYYQTRQNLLDIESLKVDDLDIHAYRYVMKPTLPIRRDSPKKAITLILAVLLGGMVGAGIVLGRNALRNYNAK

(SEQ ID NO: 20)

> O25a:K5:H1 WzzB

MRVENNNVSGQNNDPEQIDLIDLLVQLWRGKMTIIISVIVAIALAIGYLAVAKEKWTSTAIITQPDVGQIAGYNNAMNVIYGQAAPKVSDLQETLIGRFSSAFSALAETLDNQDEPEKLTIEPSVKNQQLPLTVSYVGQTAEGAQMKLAQYIQQVDDKVNQELEKDLKDNIALGRKNLQDSLRTQEVVAQEQKDLRIRQIEEALQYANQAQVTKPQIQQTGEDITQDTLFLLGSEALESMIKHEATRPLVFSPNYYQTRQNLLDIESLKVDDLDIHAYRYVMKPTLPIRRDSPKKAITLILAVLLGGMVGAGIVLGRNALRNYNAK

(SEQ ID NO: 21)

> O25a ETEC ATCC WzzB

MRVENNNVSGQNHDPEQIDLIDLLVQLWRGKMTIIISVVVAIALAIGYLAVAKEKWTSTAIITQPDVGQIAGYNNAMNVIYGQAAPKVSDLQETLIGRFSFAFSALAETLDNQKEPEKLTIEPSVKNQQLPLTVSYVGQTAEDAQMKLAQYIQQVDDKVNQELEKDLKDNLALGRKNLQDSLRTQEVVAQEQKDLRIRQIQEALQYANQAQVTKPQIQQTGEDITQDTLFLLGSEALESMIKHEATRPLVFSPNYYQTRQNLLDIENLKVDDLDIHAYRYVMKPTLPIRRDSPKKAITLILAVLLGGMVGAGIVLGRNALRNYNSК (SEQ ID NO: 22)

> K12 W3110 WzzB

MRVENNNVSGQNHDPEQIDLIDLLVQLWRGKMTIIISVIVAIALAIGYLAVAKEKWTSTAIITQPDVGQIAGYNNAMNVIYGQAAPKVSDLQETLIGRFSSAFSALAETLDNQEEREKLTIEPSVKNQQLPLTVSYVGQTAEGAQMKLAQYIQQVDDKVNQELEKDLKDNIALGRKNLQDSLRTQEVVAQEQKDLRIRQIQEALQYANQAQVTKPQIQQTGEDITQDTLFLLGSEALESMIKHEATRPLVFSPNYYQTRQNLLDIESLKVDDLDIHAYRYVMKPMLPIRRDSPKKAITLILAVLLGGMVGAGIVLGRNALRNYNAK(SEQ ID NO: 23)

> LT2 WzzB Salmonella

MTVDSNTSSGRGNDPEQIDLIELLLQLWRGKMTIIVAVIIAILLAVGYLMIAKEKWTSTAIITQPDAAQVATYTNALNVLYGGNAPKISEVQANFISRFSSAFSALSEVLDNQKEREKLTIEQSVKGQALPLSVSYVSTTAEGAQRRLAEYIQQVDEEVAKELEVDLKDNITLQTKTLQESLETQEVVAQEQKDLRIKQIEEALRYADEAKITQPQIQQTQDVTQDTMFLLGSDALKSMIQNEATRPLVFSPAYYQTKQTLLDIKNLKVTADTVHVYRYVMKPTLPVRRDSPKTAITLVLAVLLGGMIGAGIVLGRNALRSYKPKAL

(SEQ ID NO: 24)

Репрезентативные последовательности FepE включают:

> O25b GAR2401 FepE

MSSLNIKQGSDAHFPDYPLASPSNNEIDLLNLISVLWRAKKTVMAVVFAFACAGLLISFILPQKWTSAAVVTPPEPVQWQELEKSFTKLRVLDLDIKIDRTEAFNLFIKKFQSVSLLEEYLRSSPYVMDQLKEAKIDELDLHRAIVALSEKMKAVDDNASKKKDEPSLYTSWTLSFTAPTSEEAQTVLSGYIDYISTLVVKESLENVRNKLEIKTQFEKEKLAQDRIKTKNQLDANIQRLNYSLDIANAAGIKKPVYSNGQAVKDDPDFSISLGADGIERKLEIEKAVTDVAELNGELRNRQYLVEQLTKAHVNDVNFTPFKYQLSPSLPVKKDGPGKAIIVILSALIGGMVACGGVLLRYAMASRKQDAMMADHLV (SEQ ID NO: 15)

> O25a:K5:H1 FepE

MSSLNIKQGSEAHFPEYPLASPSNNEIDLLNLIEVLWRAKKTVMAVVFAFACAGLLISFILPQKWTSAAVVTPPEPVQWQELEKTFTKLRVLDLDIKIDRTEAFNLFIKKFQSVSLLEEYLRSSPYVMDQLKEAKIDPLDLHRAIVALSEKMKAVDDNASKKKDESALYTSWTLSFTAPTSEEAQKVLAGYIDYISALVVKESIENVRNKLEIKTQFEKEKLAQDRIKTKNQLDANIQRLNYSLDIANAAGIKKPVYSNGQAVKDDPDFSISLGADGIERKLEIEKAVTDVAELNGELRNRQYLVEQLTKTNINDVNFTPFKYQLRPSLPVKKDGQGKAIIVILSALVGGMVACGGVLLRHAMASRKQDAMMADHLV (SEQ ID NO: 16)

> O25a ETEC ATCC FepE

> O157 FepE

MSSLNIKQGSDAHFPDYPLASPSNNEIDLLNLISVLWRAKKTVMAVVFAFACAGLLISFILPQKWTSAAVVTPPEPVQWQELEKTFTKLRVLDLDIKIDRTEAFNLFIKKFQSVSLLEEYLRSSPYVMDQLKEAKIDELDLHRAIVALSEKMKAVDDNASKKKDEPSLYTSWTLSFTAPTSEEAQTVLSGYIDYISALVVKESIENVRNKLEIKTQFEKEKLAQDRIKMKNQLDANIQRLNYSLDIANAAGIKKPVYSNGQAVKDDPDFSISLGADGIERKLEIEKAVTDVAELNGELRNRQYLVEQLTKANINDVNFTPFKYQLSPS LPVKKDGPGKAIIVILSALIGGMVACGSVLLRYAMASRKQDAMMADHLV (SEQ ID NO: 18)

> LT2 FepE Salmonella

MPSLNVKQEKNQSFAGYSLPPANSHEIDLFSLIEVLWQAKRRILATVFAFACVGLLLSFLLPQKWTSQAIVTPAESVQWQGLERTLTALRVLDMEVSVDRGSVFNLFIKKFSSPSLLEEYLRSSPYVMDQLKGAQIDEQDLHRAIVLLSEKMKAVDSNVGKKNETSLFTSWTLSFTAPTREEAQKVLAGYIQYISDIVVKETLENIRNQLEIKTRYEQEKLAMDRVRLKNQLDANIQRLHYSLEIANAAGIKRPVYSNGQAVKDDPDFSISLGADGISRKLEIEKGVTDVAEIDGDLRNRQYHVEQLAAMNVSDVKFTPFKYQLSPSLPVKKDGPGKAIIIILAALIGGMMACGGVLLRHAMVSRKMENALAIDERLV (SEQ ID NO: 19).

В некоторых вариантах осуществления изобретения, модифицированный сахарид (модифицированный по сравнению с соответствующим сахаридом дикого типа) может быть получен путем экспрессии (сверхэкспрессии, но необязательно) белка семейства wzz (например, fepE) из грамотрицательной бактерии и/или путем «отключения» экспрессии (то есть, репрессии, делетирования, удаления) второго гена wzz (например, wzzB) с получением высокомолекулярных сахаридов, таких как липополисахариды, содержащие промежуточные или длинные цепи О-антигена. Так, например, модифицированные сахариды могут быть получены путем экспрессии (сверхэкспрессии, но необязательно) wzz2 и «отключения» экспрессии wzzl. Или альтернативно, модифицированные сахариды могут быть получены путем экспрессии (сверхэкспрессии, но необязательно) wzzfepE и «отключения» экспрессии wzzB. В другом варианте осуществления изобретения, модифицированные сахариды могут быть получены путем экспрессии (сверхэкспрессии, но необязательно) wzzB, но «отключения» экспрессии wzzfepE. В другом варианте осуществления изобретения, модифицированные сахариды могут быть получены путем экспрессии fepE. Предпочтительно, белок семейства wzz происходит от штамма, который является гетерологичным по отношению к клетке-хозяину.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, сахарид получают путем экспрессии белка семейства wzz, имеющего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 30%, 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентична любой из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19. В одном варианте осуществления изобретения, белок семейства wzz включает любую последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19. Предпочтительно, чтобы белок семейства wzz имел последовательность, которая по меньшей мере на 30%, 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18 и SEQ ID NO:19. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сахарид получают путем экспрессии белка, имеющего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 30%, 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности белка fepE.

В одном своем аспекте, настоящее изобретение относится к сахаридам, полученным путем экспрессии белка семейства wzz, предпочтительно fepE, в грамотрицательной бактерии с образованием высокомолекулярных сахаридов, содержащих промежуточные или длинные цепи О-антигена, имеющие длину, которая по меньшей мере на 1, 2, 3, 4 или 5 повторяющихся звеньев превышает длину соответствующего O-полисахарида дикого типа. В одном своем аспекте, настоящее изобретение относится к сахаридам, продуцируемым грамотрицательной бактерией в культуре, которая экспрессирует (сверхэкспрессирует, но необязательно) белок семейства wzz (например, wzzB) из грамотрицательной бактерии с образованием высокомолекулярных сахаридов, содержащих промежуточные или длинные цепи О-антигена, имеющие длину, которая по меньшей мере на 1, 2, 3, 4 или 5 повторяющихся звеньев превышает длину соответствующего O-антигена дикого типа. См. Описание О-полисахаридов и О-антигенов, приведенное ниже для дополнительных репрезентативных сахаридов, имеющих повышенное количество повторяющихся звеньев по сравнению с соответствующими сахаридами дикого типа. Желаемой длиной цепи является такая длина, которая обеспечивает улучшенную или максимальную иммуногенность для данной конструкции вакцины.

В другом варианте осуществления изобретения, сахарид имеет любую Формулу, выбранную из Формул Таблицы 1, в которой число повторяющихся звеньев n в сахариде на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 или более превышает число повторяющихся звеньев в соответствующем О-полисахариде дикого типа. Предпочтительно, сахарид имеет число повторяющихся звеньев, которое по меньшей мере на 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 повторяющихся звеньев превышает число звеньев соответствующего О-полисахарида дикого типа. См., например, Таблицу 21. Способы определения длины сахаридов известны специалистам в данной области. Такие способы включают ядерный магнитный резонанс, масс-спектроскопию и эксклюзионную хроматографию, как описано в Примере 5.

В своем предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к сахариду, продуцируемому в клетке-хозяине рекомбинантной E. coli, где ген эндогенного регулятора длины О-антигена wzz (например, wzzB) был делетирован и заменен (вторым) геном wzz грамотрицательной бактерии, гетерологичной рекомбинантной клетке-хозяину E. coli (например, Salmonella fepE), с образованием высокомолекулярных сахаридов, таких как липополисахариды, содержащие промежуточные или длинные цепи О-антигена. В некоторых вариантах осуществления изобретения, рекомбинантная клетка-хозяин E. coli включает ген wzz Salmonella, а предпочтительно Salmonella enterica.

В одном варианте осуществления изобретения, клетка-хозяин включает гетерологичный ген для белка семейства wzz в качестве стабильно поддерживаемого плазмидного вектора. В другом варианте осуществления изобретения, клетка-хозяин включает гетерологичный ген для белка семейства wzz в качестве гена, интегрированного в хромосомную ДНК клетки-хозяина. Способы стабильной экспрессии плазмидного вектора в клетке-хозяине E. coli и способы интеграции гетерологичного гена в хромосому клетки-хозяина E. coli известны специалистам в данной области. В одном варианте осуществления изобретения, клетка-хозяин включает гетерологичные гены О-антигена в качестве стабильно поддерживаемого плазмидного вектора. В другом варианте осуществления изобретения, клетка-хозяин включает гетерологичные гены O-антигена в качестве гена, интегрированного в хромосомную ДНК клетки-хозяина. Способы стабильной экспрессии плазмидного вектора в клетке-хозяине E.coli и в клетке-хозяине Salmonella известны специалистам в данной области. Способы интеграции гетерологичного гена в хромосому клетки-хозяина E. coli и клетки-хозяина Salmonella известны специалистам.

В одном аспекте изобретения, рекомбинантную клетку-хозяина культивируют в среде, содержащей источник углерода. Источники углерода для культивирования E. coli известны специалистам в данной области. Примеры источников углерода включают спирты ряда сахаров, полиолы, альдолы ряда сахаров или кетосахара, включая, но не ограничиваясь ими, арабинозу, целлобиозу, фруктозу, глюкозу, глицерин, инозит, лактозу, мальтозу, маннит, маннозу, рамнозу, раффинозу, сорбит, сорбозу, сахарозу, трегалозу, пируват, сукцинат и метиламин. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, среда включает глюкозу. В некоторых среда включает полиол или альдол ряда сахаров, например маннит, инозит, сорбозу, глицерин, сорбит, лактозу и арабинозу в качестве источника углерода. Все источники углерода могут быть добавлены в среду перед началом культивирования, либо они могут добавляться постадийно или непрерывно во время культивирования.

Репрезентативная культуральная среда для рекомбинантной клетки-хозяина включает любой элемент, выбранный из KH₂PO₄, K₂HPO₄, (NH₄)₂SO₄, цитрата натрия, Na₂SO₄, аспарагиновой кислоты, глюкозы, MgSO₄, FeSO₄-7H₂O, Na₂MoO₄-2H₂O, H₃BO₃, CoCl₂-6H₂O, CuCl₂-2H₂O, MnCl₂-4H₂O, ZnCl₂ и CaCl₂-2H₂O. Предпочтительно, среда включает KH₂PO₄, K₂HPO₄, (NH₄)₂SO₄, цитрат натрия, Na₂SO₄, аспарагиновую кислоту, глюкозу, MgSO₄, FeSO₄-7H₂O, Na₂MoO₄-2H₂O, H₃BO₃, CoCl₂-6H₂O, CuCl₂-2H₂O, MnCl₂-4H₂O, ZnCl₂ и CaCl₂-2H₂O.

Используемая здесь среда может быть твердой или жидкой, синтетической (то есть, искусственной) или натуральной и может включать достаточное количество питательных веществ для культивирования рекомбинантной клетки-хозяина. Предпочтительно, среда является жидкой.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, среда может дополнительно включать подходящие неорганические соли. В некоторых вариантах осуществления изобретения, среда может дополнительно включать микроэлементы. В некоторых вариантах осуществления изобретения, среда может дополнительно включать факторы роста. В некоторых вариантах осуществления изобретения, среда может дополнительно включать дополнительный источник углерода. В некоторых вариантах осуществления изобретения, среда может дополнительно включать подходящие неорганические соли, микроэлементы, факторы роста и дополнительный источник углерода. Неорганические соли, микроэлементы, факторы роста и дополнительные источники углерода, подходящие для культивирования E. coli, известны специалистам в данной области.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, среда может включать дополнительные компоненты, если это необходимо, такие как пептон, N-Z-амин, ферментативный гидрозилат сои, дополнительный дрожжевой экстракт, солодовый экстракт, дополнительные источники углерода и различные витамины. В некоторых вариантах осуществления изобретения, среда не включает такие дополнительные компоненты, как пептон, NZ-амин, ферментативный гидрозилат сои, дополнительный дрожжевой экстракт, солодовый экстракт, дополнительные источники углерода и различные витамины.

Иллюстративные примеры подходящих дополнительных источников углерода включают, но не ограничиваются ими, другие углеводы, такие как глюкоза, фруктоза, маннит, крахмал или гидролизат крахмала, гидролизат целлюлозы и мелассы; органические кислоты, такие как уксусная кислота, пропионовая кислота, молочная кислота, муравьиная кислота, яблочная кислота, лимонная кислота и фумаровая кислота; и спирты, такие как глицерин, инозит, маннит и сорбит.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, среда дополнительно включает источник азота. Источники азота, подходящие для культивирования E. coli, известны специалистам в данной области. Иллюстративные примеры подходящих источников азота включают, но не ограничиваются ими, аммиак, включая газообразный аммиак и водный раствор аммиака; аммониевые соли неорганических или органических кислот, такие как хлорид аммония, нитрат аммония, фосфат аммония, сульфат аммония и ацетат аммония; мочевину; нитратные или нитритные соли и другие азотсодержащие вещества, включая аминокислоты в виде чистых или неочищенных препаратов, мясной экстракт, пептон, рыбную муку, рыбий гидролизат, кукурузный сироп, гидролизат казеина, гидролизат соевого жмыха, дрожжевой экстракт, сухие дрожжи, дистиллят из этанола-дрожжей, соевую муку, хлопковую муку и т.п.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, среда включает неорганическую соль. Иллюстративные примеры подходящих неорганических солей включают, но не ограничиваются ими, соли калия, кальция, натрия, магния, марганца, железа, кобальта, цинка, меди, молибдена, вольфрама и других микроэлементов, а также фосфорную кислоту.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, среда включает соответствующие факторы роста. Иллюстративные примеры соответствующих микроэлементов, факторов роста и т.п. включают, но не ограничиваются ими, кофермент А, пантотеновую кислоту, пиридоксин-HCl, биотин, тиамин, рибофлавин, флавин-мононуклеотид, флавин-адениндинуклеотид, DL-6,8-тиоктовую кислоту, фолиевую кислоту, витамин B₁₂, другие витамины, аминокислоты, такие как цистеин и гидроксипролин, основания, такие как аденин, урацил, гуанин, тимин и цитозин, тиосульфат натрия, p- или r-аминобензойную кислоту, ниацинамид, нитрилоацетат и т.п., либо в виде чистых или частично очищенных химических соединений, либо в виде соединений, присутствующих в природных продуктах. Количество может быть определено эмпирически специалистом в данной области с применением методов и способов, известны специалистам в данной области.

В другом варианте осуществления изобретения, модифицированный сахарид (по сравнению с соответствующим сахаридом дикого типа), описанный в настоящей заявке, получают путем синтеза, например, in vitro. Синтетическое производство или синтез сахаридов позволяет избежать проведения дорогостоящих и длительных производственных процессов. В одном варианте осуществления изобретения, сахарид получают путем синтеза, например, с применением стратегии последовательного гликозилирования или комбинации стратегий последовательного гликозилирования и [3+2]-блочного синтеза из соответствующим образом защищенных промежуточных соединений моносахаридов. Так, например, тиогликозиды и производные гликозилтрихлорацетимидата могут быть использованы в качестве доноров гликозила при гликозилировании. В одном варианте осуществления изобретения, сахарид, который получают путем синтеза in vitro, имеет структуру, идентичную структуре сахарида, полученного рекомбинантными способами, такими как модификация описанного выше белка семейства wzz.

Полученный (рекомбинантным или синтетическим способом) сахарид включает структуру, происходящую от любого серотипа E. coli, включая, например, любой из следующих серотипов E. coli: O1 (например, O1A, O1B, и O1C), O2, O3, O4 (например, O4:K52 и O4:K6), O5 (например, O5ab и O5ac (штамма 180/C3)), O6 (например, O6:K2; K13; K15 и O6:K54), O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18 (например, O18A, O18ac, O18A1, O18B и O18B1), O19, O20, O21, O22, O23 (например, O23A), O24, O25 (например, O25a и O25b), O26, O27, O28, O29, O30, O32, O33, O34, O35, O36, O37, O38, O39, O40, O41, O42, O43, O44, O45 (например, O45 и O45rel), O46, O48, O49, O50, O51, O52, O53, O54, O55, O56, O57, O58, O59, O60, O61, O62, 62D₁, O63, O64, O65, O66, O68, O69, O70, O71, O73 (например, O73 (штамма 73-1)), O74, O75, O76, O77, O78, O79, O80, O81, O82, O83, O84, O85, O86, O87, O88, O89, O90, O91, O92, O93, O95, O96, O97, O98, O99, O100, O101, O102, O103, O104, O105, O106, O107, O108, O109, O110, 0111, O112, O113, O114, O115, O116, O117, O118, O119, O120, O121, O123, O124, O125, O126, O127, O128, O129, O130, O131, O132, O133, O134, O135, O136, O137, O138, O139, O140, O141, O142, O143, O144, O145, O146, O147, O148, O149, O150, O151, O152, O153, O154, O155, O156, O157, O158, O159, O160, O161, O162, O163, O164, O165, O166, O167, O168, O169, O170, O171, O172, O173, O174, O175, O176, O177, O178, O179, O180, O181, O182, O183, O184, O185, O186 и O187.

Отдельные полисахариды обычно очищают (обогащают по количеству конъюгата полисахарид-белок) с применением методов, известных специалистам в данной области, таких как, например, диализ, концентрирование, диафильтрация, фильтрация в тангенциальном потоке, осаждение, элюирование, центрифугирование, преципитация, ультрафильтрация, глубинная фильтрация и/или колоночная хроматография (ионообменная хроматография, мультимодальная ионообменная хроматография, DEAE и гидрофобная хроматография). Предпочтительно, полисахариды очищают способом, который включает фильтрацию в тангенциальном потоке.

Очищенные полисахариды могут быть активированы (например, химически активированы) так, чтобы они были реакционноспособными (например, могли реагировать непосредственно с белком-носителем, либо посредством линкера, такого как спейсер eTEC), а затем они могут быть включены в гликоконъюгаты согласно изобретению, как дополнительно описано в настоящей заявке.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения, сахарид согласно изобретению происходит от серотипа E. coli, где серотипом является O25a. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, серотипом является O25b. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, серотипом является O1A. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, серотипом является O2. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, серотипом является O6. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, серотипом является O17. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, серотипом является O15. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, серотипом является O18A. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, серотипом является O75. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, серотипом является O4. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, серотипом является O16. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, серотипом является O13. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, серотипом является O7. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, серотипом является O8. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, серотипом является O9.

Используемый здесь термин «серотип», если он относится к любому из перечисленных выше серотипов, охватывает структуру повторяющихся звеньев (О-звеньев, как описано ниже), известных специалистам в данной области техники, и являющихся уникальными для соответствующего серотипа. Так, например, термин серотип «O25a» (также известен специалистам в данной области как серотип «O25») означает серотип, который включает формулу O25, представленную в Таблице 1. В качестве другого примера, термин серотип «O25b» означает серотип, который включает формулу O25b, представленную в Таблице 1.

Используемый здесь серотипы упоминаются здесь в общем смысле, если это не оговорено особо, например, термин формула «O18» является общим термином и включает Формулу O18A, формулу O18ac, Формулу 18A1, Формулу O18B и Формулу O18B1.

Используемый здесь термин «O1» является общим термином и включает и охватывает виды формулы, которые включают общий термин «O1» в названии формулы в соответствии с Таблицей 1, например, любую из Формул, таких как Формула O1A, Формула O1A1, Формула O1B и Формула O1C, каждая из которых показана в Таблице 1. Соответственно, «серотип O1» в целом относится к серотипу, который включает любую из Формул, таких как Формула O1A, Формула O1A1, Формула O1B и Формула O1C.

Используемый здесь термин «O6» в целом относится к видам формул, которые включают общий термин «O6» в названии формулы в Таблице 1, такой как любая из Формул O6:K2; K13; K15; и O6:K54, каждая из которых показана в Таблице 1. Соответственно, «серотип O6» в целом относится к серотипу, который включает любую из формул O6:K2; K13; K15; и O6:K54.

Другими примерами терминов, которые, в общих чертах, относятся к видам формулы, которые включают общий термин в названии формулы в Таблице 1, являются: «O4», «O5», «O18» и «O45».

Используемый здесь термин «O2» относится к формуле O2, показанной в Таблице 1. Термин «O-антиген O2» означает сахарид, который имеет Формулу O2, показанную в Таблице 1.

В настоящей заявке, ссылка на O-антиген серотипа, указанного выше, относится к сахариду, который имеет формулу, помеченную соответствующим названием серотипа. Так, например, термин «O-антиген O25B» означает сахарид, который имеет Формулу O25B, показанную в Таблице 1.

В качестве другого примера, термин «O-антиген О1» в целом относится к сахариду, который охватывает формулу, включающую формулу, обозначаемую термином «O1», такую как Формула O1A, Формула O1A1, Формула O1B и Формула O1C, каждая из которых показана в Таблице 1.

В качестве другого примера, термин «O-антиген О6» в целом относится к сахариду, который охватывает формулу, включающую формулу, обозначаемую термином «O6», такую как Формула O6:K2; Формула O6:K13; Формула O6:K15 и Формула O6:K54, каждая из которых показана в Таблице 1.

О-полисахарид

Используемый здесь термин «О-полисахарид» относится к любой структуре, которая включает О-антиген, при условии, что эта структура не включает целую клетку или липид А. Так, например, в одном варианте осуществления изобретения, О-полисахарид включает липополисахарид, где липид А не является связанным. Стадия удаления липида А известна специалистам в данной области и включает, например, тепловую обработку с добавлением кислоты. Репрезентативный способ включает обработку 1% уксусной кислотой при 100°С в течение 90 минут. Этот спосбоб объединяют со способом выделения липида А после удаления. Репрезентативный способ выделения липида A включает ультрацентрифугирование.

В одном варианте осуществления изобретения, O-полисахарид имеет структуру, которая состоит из O-антигена, и в этом случае, O-полисахарид является синонимом термина «O-антиген». В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения, O-полисахарид имеет структуру, которая включает повторяющиеся звенья O-антигена без сахарида сердцевины. Соответственно, в одном варианте осуществления изобретения, О-полисахарид не включает фрагмент сердцевины R1 E. coli. В другом варианте осуществления изобретения, O-полисахарид не включает фрагмент сердцевины R2 E. coli. В другом варианте осуществления изобретения, O-полисахарид не включает фрагмент сердцевины R3 E. coli. В другом варианте осуществления изобретения, O-полисахарид не включает фрагмент сердцевины R4 E. coli. В другом варианте осуществления изобретения, O-полисахарид не включает фрагмент сердцевины K12 E. coli. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, О-полисахарид имеет структуру, которая включает О-антиген и сахарид сердцевины. В другом варианте осуществления изобретения, O-полисахарид имеет структуру, которая включает О-антиген, сахарид сердцевины и группу KDO.

Способы очистки O-полисахарида, который включает олигосахарид сердцевины, из ЛПС известны специалистам в данной области. Так, например, после очистки ЛПС, очищенный ЛПС может быть гидролизован путем нагревания в 1% (об./об.) уксусной кислоте в течение 90 минут при 100 градусах Цельсия с последующим ультрацентрифугированием при 142000×g в течение 5 часов при 4°C. Супернатант, содержащий О-полисахарид, сушат вымораживанием и хранят при 4°C. В некоторых вариантах осуществления изобретения описана делеция генов синтеза капсулы для обеспечения простой очистки O-полисахарида.

О-полисахарид может быть выделен способами, включая, но не ограничиваясь ими, слабый кислотный гидролиз для удаления липида А из ЛПС. Другие варианты осуществления изобретения могут включать использование гидразина в качестве агента для получения О-полисахарида. Приготовление ЛПС может быть осуществлено известными методами.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, О-полисахариды, очищенные из штаммов дикого типа, модифицированных или аттенюированных штаммов грамотрицательных бактерий, которые экспрессируют (сверхэкспрессируют, но необязательно) белок Wzz (например, wzzB), предназначены для их использования в конъюгированных вакцинах. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, O-полисахаридную цепь очищают из штамма грамотрицательной бактерии, экспрессирующей (сверхэкспрессирующей, но необязательно) белок wzz, для использования в качестве вакцинного антигена, в виде конъюгированной или в виде комплексной вакцины.

В одном из вариантов осуществления изобретения, O-полисахарид имеет молекулярную массу, которая приблизительно в 1 раз, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 11 раз, 12 раз, 13 раз, 14 раз, 15 раз, 16 раз, 17 раз, 18 раз, 19 раз, 20 раз, 21 раз, 22 раза, 23 раза, 24 раза, 25 раз, 26 раз, 27 раз, 28 раз, 29 раз, 30 раз, 31 раз, 32 раза, 33 раза, 34 раза, 35 раз, 36 раз, 37 раз, 38 раз, 39 раз, 40 раз, 41 раз, 42 раза, 43 раза, 44 раза, 45 раз, 46 раз, 47 раз, 48 раз, 49 раз, 50 раз, 51 раз, 52 раза, 53 раза, 54 раза, 55 раз, 56 раз, 57 раз, 58 раз, 59 раз, 60 раз, 61 раз, 62 раза, 63 раза, 64 раза, 65 раз, 66 раз, 67 раз, 68 раз, 69 раз, 70 раз, 71 раз, 72 раза, 73 раза, 74 раза, 75 раз, 76 раз, 77 раз, 78 раз, 79 раз, 80 раз, 81 раз, 82 раза, 83 раза, 84 раза, 85 раз, 86 раз, 87 раз, 88 раз, 89 раз, 90 раз, 91 раз, 92 раза, 93 раза, 94 раза, 95 раз, 96 раз, 97 раз, 98 раз, 99 раз, 100 раз или более превышает молекулярную массу соответствующего O-полисахарида дикого типа. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, O-полисахарид имеет молекулярную массу, которая по меньшей мере не превышает и максимум в 5 раз превышает молекулярную массу соответствующего O-полисахарида дикого типа. В другом варианте осуществления изобретения, O-полисахарид имеет молекулярную массу, которая по меньшей мере в 2 раза и максимум в 4 раза превышает молекулярную массу соответствующего O-полисахарида дикого типа. Увеличение молекулярной массы О-полисахарида по сравнению с соответствующим О-полисахаридом дикого типа предпочтительно связано с увеличением числа повторяющихся звеньев О-антигена. В одном варианте осуществления изобретения, увеличение молекулярной массы О-полисахарида обусловлено белком семейства wzz.

В одном варианте осуществления изобретения, O-полисахарид имеет молекулярную массу, которая приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 кДа или более превышает молекулярную массу соответствующего О-полисахарида дикого типа. В одном варианте осуществления изобретения, O-полисахарид согласно изобретению имеет молекулярную массу, которая по меньшей мере на 1 и максимум на 200 кДа превышает молекулярную массу соответствующего O-полисахарида дикого типа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 5 и максимум на 200 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 10 и максимум на 200 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 12 и максимум на 200 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 15 и максимум на 200 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 18 и максимум на 200 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 20 и максимум на 200 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 21 и максимум на 200 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 22 и максимум на 200 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 30 и максимум на 200 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 1 и максимум на 100 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 5 и максимум на 100 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 10 и максимум на 100 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 12 и максимум на 100 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 15 и максимум на 100 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 20 и максимум на 100 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 1 и максимум на 75 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 5 и максимум на 75 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 10 и максимум на 75 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 12 и максимум на 75 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 15 и максимум на 75 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 18 и максимум на 75 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 20 и максимум на 75 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 30 и максимум на 75 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 10 и максимум на 90 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 12 и максимум на 85 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 10 и максимум на 75 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 10 и максимум на 70 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 10 и максимум на 60 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 10 и максимум на 50 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 10 и максимум на 49 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 10 и максимум на 48 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 10 и максимум на 47 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 10 и максимум на 46 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 20 и максимум на 45 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 20 и максимум на 44 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 20 и максимум на 43 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 20 и максимум на 42 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, молекулярная масса увеличивается по меньшей мере на 20 и максимум на 41 кДа. Такое увеличение молекулярной массы О-полисахарида по сравнению с молекулярной массой соответствующего О-полисахарида дикого типа предпочтительно ассоциируется с увеличением числа повторяющихся звеньев О-антигена. В одном варианте осуществления изобретения, увеличение молекулярной массы О-полисахарида происходит за счет белка семейства wzz. См., например, Таблицу 21.

В другом варианте осуществления изобретения, O-полисахарид имеет любую формулу, выбранную из Таблицы 1, где количество повторяющихся звеньев n в O-полисахариде превышает количество повторяющихся звеньев в соответствующем O-полисахариде дикого типа на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 или более повторяющихся звеньев. Предпочтительно сахарид имеет число звеньев, которое по меньшей мере на 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 повторяющихся звеньев превышает число звеньев соответствующего О-полисахарида дикого типа. См., например, Таблицу 21.

О-Антиген

О-антиген является частью липополисахарида (ЛПС) внешней мембраны грамотрицательных бактерий. О-антиген находится на поверхности клетки и является вариабельным компонентом клетки. Вариабельность О-антигена служит основой для серотипирования грамотрицательных бактерий. Представленная здесь схема серотипирования E. coli включает О-полисахариды от 1 до 181.

О-антиген включает олигосахаридные повторяющиеся звенья (О-звенья), структура дикого типа которых обычно содержит от двух до восьми остатков сахаров широкого диапазона. О-звенья типичных О-антигенов E. coli показаны в Таблице 1, см. также фиг. 9A-C и фиг. 10А-B.

В одном варианте осуществления изобретения, сахарид согласно изобретению может представлять собой одно олигосахаридное звено. В одном варианте осуществления изобретения, сахарид согласно изобретению представляет собой одно повторяющееся олигосахаридное звено соответствующего серотипа. В таких вариантах осуществления изобретения, сахарид может иметь любую структуру, выбранную из Формулы O8, Формулы O9a, Формулы O9, Формулы O20ab, Формулы O20ac, Формулы O52, Формулы O97 и Формулы O101.

В одном варианте осуществления изобретения, сахарид согласно изобретению может представлять собой олигосахариды. Олигосахариды имеют небольшое количество повторяющихся звеньев (обычно 5-15 повторяющихся звеньев) и обычно их получают путем синтеза или путем гидролиза полисахаридов. В таких вариантах осуществления изобретения, сахарид может иметь любую структуру, выбранную из Формулы O8, Формулы O9a, Формулы O9, Формулы O20ab, Формулы O20ac, Формулы O52, Формулы O97 и Формулы O101.

Предпочтительно, чтобы все сахариды согласно изобретению и сахариды в иммуногенных композициях согласно изобретению были полисахаридами. Высокомолекулярные полисахариды могут вызывать определенные гуморальные иммунные ответы из-за эпитопов, присутствующих на антигенной поверхности. Выделение и очистку высокомолекулярных полисахаридов предпочтительно проводят для их использования в конъюгатах, композициях и способах согласно изобретению.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, количество повторяющихся О-звеньев в каждом отдельном полимере О-антигена (и следовательно, длина и молекулярная масса полимерной цепи) зависит от регулятора длины цепи wzz, то есть белка внутренней мембраны. Различные белки wzz имеют модальные длины в различных диапазонах (от 4 до >100 повторяющихся звеньев). Термин «модальная длина» относится к количеству повторяющихся О-звеньев. Грамотрицательные бактерии часто имеют два различных белка Wzz, которые дают две различные цепи OAg модальной длины, одну длинную и одну короткую цепь. Экспрессия (сверхэкспрессия, но необязательно) белков семейства wzz (например, wzzB) в грамотрицательных бактериях позволяет манипулировать длиной O-антигена, то есть сдвигать или смещать продуцирование бактериями O-антигенов с определенной длиной и увеличивать продуцирование высокомолекулярных липополисахаридов с высоким выходом. В одном варианте осуществления изобретения, используемый здесь термин «короткая» модальная цепь означает небольшое число повторяющихся О-звеньев, например, 1-20. В одном варианте осуществления изобретения, используемый здесь термин «длинная» модальная цепь означает число повторяющихся О-звеньев, более чем 20 и максимум до 40. В одном варианте осуществления изобретения, «очень длинная» модальная цепь означает более чем 40 повторяющихся О-звеньев.

В одном варианте осуществления изобретения, полученный сахарид имеет длину, которая по меньшей мере на 10 повторяющихся звеньев, 15 повторяющихся звеньев, 20 повторяющихся звеньев, 25 повторяющихся звеньев, 30 повторяющихся звеньев, 35 повторяющихся звеньев, 40 повторяющихся звеньев, 45 повторяющихся звеньев, 50 повторяющихся звеньев, 55 повторяющихся звеньев, 60 повторяющихся звеньев, 65 повторяющихся звеньев, 70 повторяющихся звеньев, 75 повторяющихся звеньев, 80 повторяющихся звеньев, 85 повторяющихся звеньев, 90 повторяющихся звеньев, 95 повторяющихся звеньев или 100 повторяющихся звеньев превышает длину соответствующего O-полисахарида дикого типа.

В другом варианте осуществления изобретения, сахарид согласно изобретению имеет число повторяющихся звеньев, которое на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 или более превышает число повторяющихся звеньев соответствующего O-полисахарида дикого типа. Предпочтительно, сахарид имеет число повторяющихся звеньев, которое по меньшей мере на 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 или более превышает число повторяющихся звеньев соответствующего O-полисахарида дикого типа. См., например, Таблицу 21. Способы определения длины сахаридов известны специалистам в данной области. Такие способы включают ядерный магнитный резонанс, масс-спектроскопию и эксклюзионную хроматографию, как описано в Примере 5.

Способы определения числа повторяющихся звеньев в сахариде также известны специалистам в данной области. Так, например, число повторяющихся звеньев (или «n» в формуле) можно вычислить путем деления молекулярной массы полисахарида (без молекулярной массы сахарида сердцевины или остатка KDO) на молекулярную массу повторяющегося звена (то есть, молекулярную массу структуры в соответствующей формуле, показанной, например, в Таблице 1, которая может быть теоретически рассчитана как сумма молекулярной массы каждого моносахарида в формуле). Молекулярная масса каждого моносахарида в составе данной формулы известна специалистам в данной области. Молекулярная масса повторяющегося звена формулы O25b, например, составляет приблизительно 862 Да. Молекулярная масса повторяющегося звена формулы O1a, например, составляет приблизительно 845 Да. Молекулярная масса повторяющегося звена формулы O2, например, составляет приблизительно 829 Да. Молекулярная масса повторяющегося звена формулы O6, например, составляет приблизительно 893 Да. При определении числа повторяющихся звеньев в конъюгате в расчет принимается молекулярная масса белка-носителя и отношение белок:полисахарид. Как определено в настоящей заявке, «n» означает число повторяющихся звеньев (представленных в скобках в Таблице 1) в молекуле полисахарида. Как известно специалистам в данной области, в биологических макромолекулах, повторяющиеся структуры могут чередоваться с областями неполных повторов, таких как, например, повторы без ветвления. Кроме того, специалистам известно, что полисахариды, выделенные и очищенные из природных источников, таких как бактерии, могут иметь различные размеры и ветвления. В таком случае, n может означать среднее или медианное значение n для молекул в данной популяции.

В одном варианте осуществления изобретения, O-полисахарид имеет по меньшей мере на одно повторяющееся звено O-антигена больше, чем соответствующий O-полисахарид дикого типа. Повторяющиеся звенья O-антигенов показаны в Таблице 1. В одном варианте осуществления изобретения, O-полисахарид имеет всего 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 или более повторяющихся звеньев. Предпочтительно, сахарид имеет всего по меньшей мере от 3 до максимум 80 повторяющихся звеньев. В другом варианте осуществления изобретения, O-полисахарид имеет число повторяющихся звеньев, которое на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 или более превышает число повторяющихся звеньев соответствующего O-полисахарида дикого типа.

В одном варианте осуществления изобретения, сахарид включает О-антиген, где n в любой из формул О-антигена (таких как, например, формулы, показанные в Таблице 1 (см. также фиг. 9A-C и фиг. 10A-B)) означает целое число по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 и максимум 200, 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51 или 50. Любое минимальное значение и любое максимальное значение могут быть объединены для определения интервала. Репрезентативные интервалы включают, например, по меньшей мере от 1 до максимум 1000; по меньшей мере от 10 до максимум 500; и по меньшей мере от 20 до максимум 80, а предпочтительно максимум 90. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения, n составляет по меньшей мере от 31 до максимум 90. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, n составляет от 40 до 90, а более предпочтительно от 60 до 85.

В одном варианте осуществления изобретения, сахарид включает О-антиген, где n в любой из Формул О-антигена равно по меньшей мере 1 и максимум 200. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 5 и максимум 200. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 10 и максимум 200. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 25 и максимум 200. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 50 и максимум 200. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 75 и максимум 200. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 100 и максимум 200. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 125 и максимум 200. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 150 и максимум 200. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 175 и максимум 200. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 1 и максимум 100. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 5 и максимум 100. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 10 и максимум 100. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 25 и максимум 100. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 50 и максимум 100. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 75 и максимум 100. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 1 и максимум 75. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 5 и максимум 75. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 10 и максимум 75. Формул О-антигена составляет по меньшей мере 20 и максимум 75. Формул О-антигена составляет по меньшей мере 30 и максимум 75. Формул О-антигена составляет по меньшей мере 40 и максимум 75. Формул О-антигена составляет по меньшей мере 50 и максимум 75. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 30 и максимум 90. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 35 и максимум 85. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 35 и максимум 75. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 35 и максимум 70. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 35 и максимум 60. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 35 и максимум 50. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 35 и максимум 49. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 35 и максимум 48. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 35 и максимум 47. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 35 и максимум 46. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 36 и максимум 45. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 37 и максимум 44. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 38 и максимум 43. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 39 и максимум 42. В одном варианте осуществления изобретения, n в любой из Формул О-антигена составляет по меньшей мере 39 и максимум 41.

Так, например, в одном варианте осуществления изобретения, n в сахариде составляет 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 или 90, а наиболее предпочтительно 40. В другом варианте осуществления изобретения, n равно по меньшей мере от 35 до максимум 60. Так, например, в одном варианте осуществления изобретения, n равно любому числу из 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 и 60, а предпочтительно 50. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, n равно по меньшей мере от 55 до максимум 75. Так, например, в одном варианте осуществления изобретения, n равно 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 или 69, а наиболее предпочтительно 60.

Структура сахарида может быть определена с применением способов и устройств, известных специалистам в данной области, таких как, например, ЯМР, включая 1D, 1H и/или 13C, 2D-TOCSY, DQF-COSY, NOESY и/или HMQC.

В некоторых варианте осуществления изобретения, очищенный полисахарид перед конъюгированием имеет молекулярную массу от 5 кДа до 400 кДа. В других таких вариантах осуществления изобретения, сахарид имеет молекулярную массу от 10 кДа до 400 кДа; от 5 кДа до 400 кДа; от 5 кДа до 300 кДа; от 5 кДа до 200 кДа; от 5 кДа до 150 кДа; от 10 кДа до 100 кДа; от 10 кДа до 75 кДа; от 10 кДа до 60 кДа; от 10 кДа до 40 кДа; от 10 кДа до 100 кДа; 10 кДа и 200 кДа; от 15 до 150 кДа; от 12 кДа до 120 кДа; от 12 кДа до 75 кДа; от 12 кДа до 50 кДа; от 12 до 60 кДа; от 35 кДа до 75 кДа; от 40 кДа до 60 кДа; от 35 кДа до 60 кДа; от 20 кДа до 60 кДа; от 12 кДа до 20 кДа; или от 20 кДа до 50 кДа. В дополнительных вариантах осуществления изобретения, полисахарид имеет молекулярную массу от 7 кДа до 15 кДа; от 8 кДа до 16 кДа; от 9 кДа до 25 кДа; от 10 кДа до 100; от 10 кДа до 60 кДа; от 10 кДа до 70 кДа; от 10 кДа до 160 кДа; от 15 кДа до 600 кДа; от 20 кДа до 1000 кДа; от 20 кДа до 600 кДа; от 20 кДа до 400 кДа; от 30 кДа до 1000 кДа; от 30 кДа до 60 кДа; от 30 кДа до 50 кДа или от 5 кДа до 60 кДа. Любое целое число в любом из вышеуказанных интервалов рассматривается как вариант раскрытия изобретения.

Используемый здесь термин «молекулярная масса» полисахарида или конъюгата «белок-носитель-полисахарид» означает молекулярную массу, вычисленную с помощью эксклюзионной хромотографии (ЭХ), в комбинации с детектированием на многоугловом лазерном детекторе светового рассеяния (MALLS).

Размер полисахарида может быть немного уменьшен во время обычных процедур очистки. Кроме того, как описано в настоящей заявке, размер полисахарида может быть определен перед конъюгироваием. При этом может быть применена механическая или химическая калибровка. Химический гидролиз может быть проведен с использованием уксусной кислоты. Механическая калибровка может быть проведена посредством сдвиговой гомогенизации под высоким давлением. Вышеупомянутые интервлы молекулярных масс относятся к полисахаридам, очищенным перед конъюгированием (например, перед активацией).

Таблица 1: Серогруппы/серотипы E. coli и фрагменты О-звеньев

Серогруппа/ серотипe	Структура фрагмента (O-звена)	Структура фрагмента, названная здесь как:
O1A, O1A1	[→3)-α-l-Rha-(1→3)-α-l-Rha-(1→3)-β-l-Rha-(1→4)-β-d-GlcNAc-(1→ \| β-d-ManNAc-(1→2)]_n	Формула O1A
O1B	[→3)-α-l-Rha-(1→2)-α-l-Rha-(1→2)-α-d-Gal-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→\|β-d-ManNAc-(1→2)]_n	Формула O1B
O1C	[→3)-α-l-Rha-(1→2)-α-l-Rha-(1→3)-α-d-Gal-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→\|β-d-ManNAc-(1→2)]_n	Формула O1C
O2	[→3)-α-l-Rha-(1→2)-α-l-Rha-(1→3)-β-l-Rha-(1→4)-β-d-GlcNAc-(1→ \| α-d-Fuc3NAc-(1→2)]_n	Формула O2
O3	[β-l-RhaNAc(1→4)α-d-Glc-(1→4)\|\|→3)-β-d-GlcNAc-(1→3)-α-d-Gal-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→]_n	Формула O3
O4:K52	[→2)-α-l-Rha-(1→6)-α-d-Glc-(1→3)-α-l-FucNAc-(1→3)-β-d-GlcNAc(1→]_n	Формула O4:K52
O4:K6	[α-d-Glc-(1→3) \| →2)-α-l-Rha-(1→6)-α-d-Glc-(1→3)-α-l-FucNAc-(1→3)-β-d-GlcNAc(1→]_n	Формула O4:K6
O5ab	[→4)-β-d-Qui3NAc-(1→3)-β-d-Ribf-(1→4)-β-d-Gal-(1→3)-α-d-GalNAc(1→]_n	Формула O5ab
O5ac (штамм 180/C3)	[→2)-β-d-Qui3NAc-(1→3)-β-d-Ribf-(1→4)-β-d-Gal-(1→3)-α-d-GalNAc(1→]_n	Формула O5ac (штамм 180/C3)
O6:K2; K13; K15	[→4)-α-d-GalNAc-(1→3)-β-d-Man-(1→4)-β-d-Man-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→ \| β-d-Glc-(1→2)]_n	Формула O6:K2; K13; K15
O6:K54	[→4)-α-d-GalNAc-(1→3)-β-d-Man-(1→4)-β-d-Man-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→\|β-d-GlcNAc-(1→2)]_n	Формула O6:K54
O7	[α-l-Rha-(1→3) \| →3)-β-d-Qui4NAc-(1→2)-α-d-Man-(1→4)-β-d-Gal-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→]_n	Формула O7
O10	[→3)-α-l-Rha-(1→3)-α-l-Rha-(1→3)-α-d-Gal-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→ \| α-d-Fuc4N-ацил-(1→2) Ацил=ацетил (60%) или (R)-3-гидроксибутирил (40%)]_n	Формула O10
O16	[→2)-β-d-Galf-(1→6)-α-d-Glc-(1→3)-α-l-Rha2Ac-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→]_n	Формула O16
O17	[α-d-Glc-(1→6) \| →6)-α-d-Man-(1→2)-α-d-Man-(1→2)-β-d-Man-(1→3)-α-d-GlcNAc(1→]_n	Формула O17
O18A, O18ac	[→2)-α-l-Rha-(1→6)-α-d-Glc-(1→4)-α-d-Gal-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→ \| β-d-GlcNAc-(1→3)]_n	Формула O18A, Формула O18ac
O18A1	[α-d-Glc-(1→6) \| →2)-α-l-Rha-(1→6)-α-d-Glc-(1→4)-α-d-Gal-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→ \| β-d-GlcNAc-(1→3)]_n	Формула O18A1
O18B	[→3)-α-l-Rha-(1→6)-α-d-Glc-(1→4)-α-d-Gal-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→ \| β-d-Glc-(1→3)]_n	Формула O18B
O18B1	[α-d-Glc-(1→4) \| →3)-α-l-Rha-(1→6)-α-d-Glc-(1→4)-α-d-Gal-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→ \| β-d-Glc-(1→3)]_n	Формула O18B1
O21	[β-d-Gal-(1→4) \| →3)-β-d-Gal-(1→4)-β-d-Glc-(1→3)-β-d-GalNAc-(1→ \| β-d-GlcNAc-(1→2)]_n	Формула O21
O23A	[α-d-Glc-(1→6) \| →6)-α-d-Glc-(1→4)-β-d-Gal-(1→3)-α-d-GalNAc-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→ \| β-d-GlcNAc(1→3)]_n	Формула O23A
O24	[→7)-α-Neu5Ac-(2→3)-β-d-Glc-(1→3)-β-d-GalNAc-(1→ \| α-d-Glc-(1→2)]_n	Формула O24
O25/O25a	[β-d-Glc-(1→6) \| →4)-α-d-Glc-(1→3)-α-l-FucNAc-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→ \| α-l-Rha-(1→3)]_n	Формула O25a
O25b	β-Glcp- → [α-Rhap-(1→3)-α-Glcp-(1→3)-α-Rhap2OAc-(1→3)-β- GlcpNAc-]_n	Формула O25b
O26	[→3)-α-l-Rha-(1→4)-α-l-FucNAc-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→]_n	Формула O26
O28	[→2)-(R)-Gro-1-P→4)-β-d-GlcNAc-(1→3)-β-d-Galf2Ac-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→]_n	Формула O28
O36	[α-L-Rhap-(1→2)-α-L-Fucp 1 ↓ 3 →4)-α-D-Manp-(1→3)-α-L-Fucp-(1→3)-β-D-GlcpNAc-(1→]n	Формула O36
O44	[α-d-Glc-(1→4) \| →6)-α-d-Man-(1→2)-α-d-Man-(1→2)-β-d-Man-(1→3)-α-d-GlcNAc(1→]_n	Формула O44
O45	[→2)-β-d-Glc-(1→3)-α-l-6dTal2Ac-(1→3)-α-d-FucNAc-(1→]_n	Формула O45
O45rel	[→2)-β-d-Glc-(1→3)-α-l-6dTal2Ac-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→]_n	Формула O45rel
O54	[→4)-α-d-GalpA-(1 → 2)-α-l-Rhap-(1 →2)-β-d-Ribf-(1 → 4)-β-d-Galp-(1 → 3)-β-d-GlcpNAc-(1→]n	Формула O54
O55	[→6)-β-d-GlcNAc-(1→3)-α-d-Gal-(1→3)-β-d-GalNAc-(1→ \| α-Col-(1→2)-β-d-Gal-(1→3)]_n	Формула O55
O56	[→7)-α-Neu5Ac-(2→3)-β-d-Glc-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→ \| α-d-Gal-(1→2)]_n	Формула O56
O57	[→3)-α-D-Galp-(1→3)-α-L-FucpNAc-(1→3)-α-D-GlcpNAc-(1→]n	Формула O57
O58	[ 3-O-[(R)-1-карбоксиэтил]-α-l-Rha -(1→3) \| →4)-α-d-Man-(1→4)-α-d-Man2Ac-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→]_n	Формула O58
O64	[β-d-Gal-(1→6) \| →3)-α-d-ManNAc-(1→3)-β-d-GlcA-(1→3)-β-d-Gal-(1→3)-β-d-GlcNAc(1→]_n	Формула O64
O68	→6)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-β-D-Manp-(1→3)-α-D-GlcpNAC-(1→]n	Формула O68
O69	[→2)-α-l-Rha-(1→2)-α-l-Rha-(1→2)-α-d-Gal-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→ ]_n	Формула O69
O73 (Штамм 73-1)	[α-d-Glc-(1→3) \| →4)-α-d-Man-(1→2)-α-d-Man-(1→2)-β-d-Man-(1→3)-α-d-GalNAc(1→]_n	Формула O73 (штамм 73-1)
O74	→6)-α-D-GlcpNAc-(1→4)-β-D-GalpA-(1→3)-β-D-GlcpNAc-(1→]n ⎮ [β-D-Fucp3NAc-(1→3)	Формула O74
O75	[β-d-Man-(1→4) \| →3)-α-d-Gal-(1→4)-α-l-Rha-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→]_n	Формула O75
O76	[→4)-β-d-GlcpA-(1→4)-β-d-GalpNAc3Ac-(1→4)-α-d-GalpNAc-(1→3)-β-d-GalpNAc-(1→]n	Формула O76
O77	[→6)-α-d-Man-(1→2)-α-d-Man-(1→2)-β-d-Man-(1→3)-α-d-GlcNAc(1→]_n	Формула O77
O78	[→4)-β-d-GlcNAc-(1→4)-β-d-Man-(1→4)-α-d-Man-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→]_n	Формула O78
O86	[α-d-Gal-(1→3) \| →4)-α-l-Fuc-(1→2)-β-d-Gal-(1→3)-α-d-GalNAc-(1→3)-β-d-GalNAc-(1→]_n	Формула O86
O88	[α-l-6dTal-(1→3) \| →4)-α-d-Man-(1→3)-α-d-Man-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→]_n	Формула O88
O90	[→4)-α-l-Fuc2/3Ac-(1→2)-β-d-Gal-(1→3)-α-d-GalNAc-(1→3)-β-d-GalNAc-(1→]_n	Формула O90
O98	[→3)-α-l-QuiNAc-(1→4)-α-d-GalNAcA-(1→3)-α-l-QuiNAc-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→ ]_n	Формула O98
O104	[→4)-α-d-Gal-(1→4)-α-Neu5,7,9Ac₃-(2→3)-β-d-Gal-(1→3)-β-d-GalNAc-(1→]_n	Формула O104
O111	[α-Col-(1→6) \| →4)-α-d-Glc-(1→4)-α-d-Gal-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→ \| α-Col-(1→3)]_n	Формула O111
O113	[→4)-α-d-GalNAc-(1→4)-α-d-GalA-(1→3)-α-d-Gal-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→ \| β-d-Gal-(1→3)]_n	Формула O113
O114	[→4)-β-d-Qui3N(N-ацетил-l-серил)-(1→3)-β-d-Ribf-(1→4)-β-d-Gal-(1→3)-α-d-GlcNAc(1→ ]_n	Формула O114
O119	[ β-d-RhaNAc3NFo-(1→3) \| →2)-β-d-Man-(1→3)-α-d-Gal-(1→4)-α-l-Rha-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→]_n	Формула O119
O121	[→3)-β-d-Qui4N(N-ацетил-глицил)-(1→4)-α-d-GalNAc3AcA6N-(1→4)-α-d-GalNAcA-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→]_n	Формула O121
O124	[4-O-[(R)-1-карбоксиэтил]-β-d-Glc-(1→6)-α-d-Glc(1→4) \|→3)-α-d-Gal-(1→6)-β-d-Galf-(1→3)-β-d-GalNAc-(1→]_n	Формула O124
O125	[α-d-Glc-(1→3) \| →4)-β-d-GalNAc-(1→2)-α-d-Man-(1→3)-α-l-Fuc-(1→3)-α-d-GalNAc-(1→ \| β-d-Gal-(1→3)]_n	Формула O125
O126	[→2)-β-d-Man-(1→3)-β-d-Gal-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→ \| α-l-Fuc-(1→2)]_n	Формула O126
O127	[→2)-α-l-Fuc-(1→2)-β-d-Gal-(1→3)-α-d-GalNAc-(1→3)-α-d-GalNAc-(1→]_n	Формула O127
O128	[α-l-Fuc-(1→2) \| →6)-β-d-Gal-(1→3)-β-d-GalNAc-(1→4)-α-d-Gal-(1→3)-β-d-GalNAc-(1→]_n	Формула O128
O136	[→4)-β-Pse5Ac7Ac-(2→4)-β-d-Gal-(1→4)-β-d-GlcNAc-(1→β-Pse5Ac7Ac=5,7-диацетамидо-3,5,7,9-тетрадозокси-l-глицеро-β-l-манно-нонулозоновая кислота]_n	Формула O136
O138	[→2)-α-l-Rha-(1→3)-α-l-Rha-(1→4)-α-d-GalNAcA-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→]_n	Формула O138
O140	[α-D-Galf-(1→2)-α-L-Rhap 1 ↓ 4 →3)-β-D-Galp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-β-D-GlcpA-(1→3)-β-D-GalpNAc-(1→]n	Формула O140
O141	[α-l-Rha-(1→3) \|→4)-α-d-Man-(1→3)-α-d-Man6Ac-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→ \| β-d-GlcA-(1→2)]_n	Формула O141
O142	[→2)-α-l-Rha-(1→6)-α-d-GalNAc-(1→4)-α-d-GalNAc-(1→3)-α-d-GalNAc-(1→ \| β-d-GlcNAc-(1→3)]_n	Формула O142
O143	[→2)-β-d-GalA6R3,4Ac-(1→3)-α-d-GalNAc-(1→4)-β-d-GlcA-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→ R=1,3-дигидрокси-2-пропиламино]_n	Формула O143
O147	[→2)-α-l-Rha-(1→2)-α-l-Rha-(1→4)-β-d-GalA-(1→3)-β-d-GalNAc-(1→]_n	Формула O147
O149	[→3)-β-d-GlcNAc-(S)-4,6Py-(1→3)-β-l-Rha-(1→4)-β-d-GlcNAc-(1→ (S)-4,6Py=4,6-O-[(S)-1-карбоксиэтилиден]-]_n	Формула O149
O152	[β-l-Rha-(1→4) \| →3)-α-d-GlcNAc-(1-P→6)-α-d-Glc-(1→2)-β-d-Glc-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→ ]_n	Формула O152
O157	[→2)-α-d-Rha4NAc-(1→3)-α-l-Fuc-(1→4)-β-d-Glc-(1→3)-α-d-GalNAc-(1→]_n	Формула O157
O158	[ α-d-Glc-(1→6) \| →4)-α-d-Glc-(1→3)-α-d-GalNAc-(1→3)-β-d-GalNAc-(1→ \| α-l-Rha-(1→3)]_n	Формула O158
O159	[α-l-Fuc-(1→4) \| →3)-β-d-GlcNAc-(1→4)-α-d-GalA-(1→3)-α-l-Fuc-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→]_n	Формула O159
O164	[β-d-Glc-(1→6)-α-d-Glc(1→4) \| →3)-β-d-Gal-(1→6)-β-d-Galf-(1→3)-β-d-GalNAc-(1→]_n	Формула O164
O173	[α-l-Fuc-(1→4) \| →3)-α-d-Glc-(1-P→6)-α-d-Glc-(1→2)-β-d-Glc-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→]_n	Формула O173
62D₁ Предположительно как Erwinia herbicola	[α-d-Gal(1→6) \| →2)-β-d-Qui3NAc-(1→3)-α-l-Rha-(1→3)-β-d-Gal-(1→3)-α-d-FucNAc-(1→]_n	Формула 62D₁
O22	[→6)-α-d-Glc-(1→4)-β-d-GlcA-(1→4)-β-d-GalNAc3Ac-(1→3)-α-d-Gal-(1→3)-β-d-GalNAc-(1→]_n	Формула O22
O35	[→3)-α-l-Rha-(1→2)-α-l-Rha-(1→3)-α-l-Rha-(1→2)-α-l-Rha-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→ \|α-d-GalNAcA6N-(1→2)]_n	Формула O35
O65	[→2)-β-d-Qui3NAc-(1→4)-α-d-GalA6N-(1→4)-α-d-GalNAc-(1→4)-β-d-GalA-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→]_n	Формула O65
O66	[→2)-β-d-Man-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→2)-β-d-Glc3Ac-(1→3)-α-l-6dTal-(1→3)-α-d-GlcNAc(1→]_n	Формула O66
O83	[→6)-α-d-Glc-(1→4)-β-d-GlcA-(1→6)-β-d-Gal-(1→4)-β-d-Gal-(1→4)-β-d-GlcNAc-(1→]_n	Формула O83
O91	[→4)-α-d-Qui3NAcyl-(1→4)-β-d-Gal-(1→4)-β-d-GlcNAc-(1→4)-β-d-GlcA6NGly-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→ ацил=(R)-3-гидроксибутирил]_n	Формула O91
O105	[β-d-Ribf-(1→3) \|→4)-α-d-GlcA2Ac3Ac-(1→2)-α-l-Rha4Ac-(1→3)-β-l-Rha-(1→4)-β-l-Rha-(1→3)-β-d-GlcNAc6Ac-(1→]_n	Формула O105
O116	[→2)-β-d-Qui4NAc-(1→6)-α-d-GlcNAc-(1→4)-α-d-GalNAc-(1→4)-α-d-GalA-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→]_n	Формула O116
O117	[→4)-β-d-GalNAc-(1→3)-α-l-Rha-(1→4)-α-d-Glc-(1→4)-β-d-Gal-(1→3)-α-d-GalNAc-(1→]_n	Формула O117
O139	[β-d-Glc-(1→3) \| →3)-α-l-Rha-(1→4)-α-d-GalA-(1→2)-α-l-Rha-(1→3)-α-l-Rha-(1→2)-α-l-Rha-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→]_n	Формула O139
O153	[→2)-β-d-Ribf-(1→4)-β-d-Gal-(1→4)-α-d-GlcNAc-(1→4)-β-d-Gal-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→]_n	Формула O153
O167	[α-d-Galf-(1→4) \| →2)-β-d-GalA6N(l)Ala-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→2)-β-d-Galf-(1→5)-β-d-Galf-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→]_n	Формула O167
O172	[→3)-α-l-FucNAc-(1→4)-α-d-Glc6Ac-(1-P→4)-α-d-Glc-(1→3)-α-l-FucNAc-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→]_n	Формула O172
O8	[→2)-α-d-Man-(1→2)-α-d-Man-(1→3)-β-d-Man-(1→]_n	Формула O8
O9a	[→2)-α-d-Man-(1→2)-α-d-Man-(1→3)-α-d-Man-(1→3)-α-d-Man-(1→]_n	Формула O9a
O9	[→2)-[α-d-Man-(1→2)]₂-α-d-Man-(1→3)-α-d-Man-(1→3)-α-d-Man-(1→]_n	Формула O9
O20ab	[→2)-β-d-Ribf-(1→4)-α-d-Gal-(1→]_n	Формула O20ab
O20ac	[α-d-Gal-(1→3) \| →2)-β-d-Ribf-(1→4)-α-d-Gal-(1→]_n	Формула O20ac
O52	[→3)-β-d-Fucf-(1→3)-β-d-6dmanHep2Ac-(1→]_n	Формула O52
O97	[→3)-α-l-Rha-(1→3)-β-l-Rha-(1→ \|\| β-d-Xulf-(2→2)β-d-Xulf-(2→2)]_n	Формула O97

† β-d-6dmanHep2Ac представляет собой 2-O-ацетил-6-дезокси-β-

d-манно-гептопиранозил.

‡ β-d-Xulf представляет собой β-d-трео-пентофуранозил.

Олигосахарид сердцевины

Олигосахарид сердцевины расположен между липидом А и внешней областью О-антигена в ЛПС E. coli дикого типа. Более конкретно, олигосахарид сердцевины является частью полисахарида, которая включает связь между О-антигеном и липидом А в E. coli дикого типа. Эта связь включает кетозидную связь между полукетальной функциональной группой самого внутреннего остатка 3-дезокси-d-манно-окт-2-улозоновой кислоты (KDO)) и гидроксильной группой остатка GlcNAc липида A. Область олигосахарида сердцевины показывает высокую степень сходства среди штаммов E. coli дикого типа. Обычно он включает ограниченное количество сахаров. Олигосахарид сердцевины включает внутреннюю область сердцевины и внешнюю область сердцевины.

Более конкретно, внутренняя сердцевина состоит, в основном, из остатков L-глицеро-D-манно-гептозы (гептозы) и KDO. Внутренняя сердцевина является в высокой степени консервативной. Остаток KDO включает следующую формулу KDO:

Внешняя область олигосахарида сердцевины является более вариабольной, чем внутренняя облвсть сердцевины, и различия в этой области наблюдаются у пяти хемотипов E. coli: R1, R2, R3, R4 и K-12. См. Фиг. 17, где проиллюстрированы обобщенные структуры углеводного остова внешних олигосахаридов сердцевины пяти известных хемотипов. HepII представляет собой последний остаток внутреннего олигосахарида сердцевины. Все внешние олигосахариды сердцевины имеют общую структуру, то есть, углеводный остов с (гексозой)₃ и два остатка боковой цепи, а порядок расположения гексоз в остове, а также природа, положение и связь остатков боковой цепи могут варьироваться. Структуры внешних олигосахаридов сердцевины R1 и R4 очень похожи и отличаются только одним β-связанным остатком.

Олигосахариды сердцевины E. coli дикого типа были классифицированы специалистами в данной области исходя из структур дистального олигосахарида на пять различных хемотипов: R1 E. coli, R2 E. coli, R3 E. coli, R4 E. coli и K12 E. coli.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, описанные здесь композиции включают гликоконъюгаты, в которых О-полисахарид включает олигосахарид сердцевины, связанный с О-антигеном. В одном варианте осуществления изобретения, композиция индуцирует иммунный ответ по меньшей мере против одного из основных хемотипов E. coli: R1 E. coli, R2 E. coli, R3 E. coli, R4 E. coli и K12 E. coli. В другом варианте осуществления изобретения, композиция индуцирует иммунный ответ против по меньшей мере двух основных хемотипов E. coli. В другом варианте осуществления изобретения, композиция индуцирует иммунный ответ против по меньшей мере трех основных хемотипов E. coli. В другом варианте осуществления изобретения, композиция индуцирует иммунный ответ по меньшей мере против четырех основных хемотипов E. coli. В другом варианте осуществления изобретения, композиция индуцирует иммунный ответ против всех пяти основных хемотипов E. coli.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, описанные здесь композиции включают гликоконъюгаты, в которых О-полисахарид не включает олигосахарид сердцевины, связанный С О-антигеном. В одном варианте осуществления изобретения, такая композиция индуцирует иммунный ответ против по меньшей мере одного из основных хемотипов E. coli: R1 E. coli, R2 E. coli, R3 E. coli, R4 E. coli и K12 E. coli, несмотря на то, что гликоконъюгат содержит О-полисахарид, который не включает олигосахарид сердцевины.

Серотипы E. coli могут быть охарактеризованы по одному из пяти хемотипов. В Таблице 2 перечислены типичные серотипы, охарактеризованные в соответствии с хемотипом. Серотипы, выделенные жирным шрифтом, представляют собой серотипы, которые наиболее часто ассоцируются с указанным основным хемотипом. В соответствии с этим, в предпочтительном варианте осуществления изобретения, композиция индуцирует иммунный ответ против по меньшей мере одного из основных хемотипов E. coli: R1 E. coli, R2 E. coli, R3 E. coli, R4 E. coli и K12 E. coli, который включает иммунный ответ против любого из соответствующих серотипов E. coli.

Таблица 2: Основной хемотип и ассоциированный с ним серотип E. coli

Основной хемотип	Серотип
R1	O25a, O6, O2, O1, O75, O4, O16, O8, O18, O9, O13, O20, O21, O91 и O163.
R2	O21, O44, O11, O89, O162, O9
R3	O25b, O15, O153, O21, O17, O11, O159, O22 O86, O93
R4	O2, O1, O86, O7, O102, O160, O166
K-12	O25b, O16

В некоторых вариантах осуществления изобретения, композиция включает сахарид, который имеет структуру, происходящую от серотипа, имеющего хемотип R1, например, выбранного из сахарида, имеющего Формулу O25a, Формулу O6, Формулу O2, Формулу O1, Формулу O75, Формулу O4, Формулу O16, Формулу O8, Формулу O18, Формулу O9, Формулу O13, Формулу O20, Формулу O21, Формулу O91 и Формулу O163, где n равно от 1 до 100. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сахарид в указанной композиции дополнительно включает фрагмент сердцевины R1 E. coli, например, как показано на фиг. 17.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, композиция включает сахарид, который имеет структуру, происходящую от серотипа, имеющего хемотип R1, например, выбранного из сахарида, имеющего Формулу O25a, Формулу O6, Формулу O2, Формулу O1, Формулу O75, Формулу O4, Формулу O16, Формулу O18, Формулу O13, Формулу O20, Формулу O21, Формулу O91 и Формулу O163, где n равно от 1 до 100, предпочтительно, от 31 до 100, более предпочтительно от 35 до 90, а наиболее предпочтительно от 35 до 65. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сахарид в указанной композиции дополнительно включает фрагмент сердцевины R1 E. coli в сахариде.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, композиция включает сахарид, который имеет структуру, происходящую от серотипа, имеющего хемотип R2, например, выбранного из сахарида, имеющего Формулу O21, Формулу O44, Формулу O11, Формулу O89, Формулу O162 и Формулу O9, где n равно от 1 до 100, предпочтительно, от 31 до 100, более предпочтительно от 35 до 90, а наиболее предпочтительно от 35 до 65. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сахарид в указанной композиции дополнительно включает фрагмент сердцевины R1 E. coli, например, как показано на фиг. 17.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, композиция включает сахарид, который имеет структуру, происходящую от серотипа, имеющего хемотип R3, например, выбранного из сахарида, имеющего Формулу O25b, Формулу O15, Формулу O153, Формулу O21, Формулу O17, Формулу О11, Формулу О159, Формулу О22, Формулу О86, и Формулу O93, где n равно от 1 до 100, предпочтительно, от 31 до 100, более предпочтительно от 35 до 90, а наиболее предпочтительно от 35 до 65. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сахарид в указанной композиции дополнительно включает фрагмент сердцевины R3 E. coli, например, как показано на фиг. 17.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, композиция включает сахарид, который имеет структуру, происходящую от серотипа, имеющего хемотип R4, например, выбранного из сахарида, имеющего Формулу O2, Формулу O1, Формулу O86, Формулу O7, Формулу O102, Формулу О160 и Формулу O166, где n равно от 1 до 100, предпочтительно, от 31 до 100, более предпочтительно от 35 до 90, а наиболее предпочтительно от 35 до 65. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сахарид в указанной композиции дополнительно включает фрагмент сердцевины R4 E. coli, например, как показано на фиг. 17.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, композиция включает сахарид, который имеет структуру, происходящую от серотипа, имеющего хемотип K-12 (например, выбранного из сахарида, имеющего формулу O25b, и сахарида, имеющего формулу O16), где n равно от 1 до 1000, предпочтительно от 31 до 100, более предпочтительно от 35 до 90, а наиболее предпочтительно от 35 до 65. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сахарид в указанной композиции дополнительно включает фрагмент сердцевины К-12 E. coli, например, как показано на фиг. 17.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, сахарид включает сахарид сердцевины. В соответствии с этим, в одном варианте осуществления изобретения, О-полисахарид дополнительно включает фрагмент сердцевины R1 E. coli. В другом варианте осуществления изобретения, О-полисахарид дополнительно включает фрагмент сердцевины R2 E. coli. В другом варианте осуществления изобретения, О-полисахарид дополнительно включает фрагмент сердцевины R3 E. coli. В другом варианте осуществления изобретения, О-полисахарид дополнительно включает фрагмент сердцевины R4 E. coli. В другом варианте осуществления изобретения, О-полисахарид дополнительно включает фрагмент сердцевины K12 E. coli.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, сахарид не включает сахарид сердцевины. В соответствии с этим, в одном варианте осуществления изобретения, О-полисахарид не включает фрагмент сердцевины R1 E. coli. В другом варианте осуществления изобретения, О-полисахарид не включает фрагмент сердцевины R2 E. coli. В другом варианте осуществления изобретения, О-полисахарид не включает фрагмент сердцевины R3 E. coli. В другом варианте осуществления изобретения, О-полисахарид не включает фрагмент сердцевины R4 E. coli. В другом варианте осуществления изобретения, О-полисахарид не включает фрагмент сердцевины К12 E. coli.

Конъюгированные О-антигены

Химическое связывание О-антигенов или предпочтительно О-полисахаридов с белками-носителями может улучшать иммуногенность О-антигенов или О-полисахаридов. Однако, вариабельность размера полимера представляет проблему при его получении на практике. При коммерческом использовании, размер сахарида может влиять на совместимость с различными стратегиями синтеза путем конъюгирования, на однородность продукта и иммуногенность конъюгата. Регуляция экспрессии регулятора длины цепи белка семейства Wzz посредством модификации пути синтеза О-антигена позволяет получить желаемую длину цепей О-антигена в различных штаммах грамотрицательных бактерий, включая E. coli.

В одном варианте осуществления изобретения, очищенные сахариды подвергают химической активации для получения активированных сахаридов, способных реагировать с белком-носителем. После активации, каждый сахарид отдельно конъюгируют с белком-носителем с образованием конъюгата, а именно гликоконъюгата. Используемый здесь термин «гликоконъюгат» означает сахарид, ковалентно связанный с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, сахарид непосредственно связан с белком-носителем. В другом варианте осуществления изобретения, сахарид связан с белком посредством спейсера/линкера.

Конъюгаты могут быть получены по схемам, которые связывают носитель с O-антигеном в одном или нескольких сайтах вдоль O-антигена, или по схемам, которые активируют по меньшей мере один остаток олигосахарида сердцевины.

В одном варианте осуществления изобретения, каждый сахарид конъюгирован с одним и тем же белком-носителем.

Если в 2-х или более сахаридах в композиции присутствует один и тот же белок-носитель, то сахариды могут быть конъюгированы с одной и той же молекулой белка-носителя (например, молекулами носителя, имеющими 2 или более конъюгированных с нею различных сахаридов).

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, каждый отдельный сахарид конъюгирован с различными молекулами белка-носителя (каждая молекула белка-носителя имеет конъюгированный с ней сахарид только одного типа). В указанном варианте осуществления изобретения, это означает, что сахариды отдельно конъюгированы с белком-носителем.

Химическая активация сахаридов и последующее конъюгирование с белком-носителем могут быть достигнуты с применением описанных здесь способов активации и конъюгирования. После конъюгирования полисахарида с белком-носителем, гликоконъюгаты очищают (обогащают по количеству конъюгата полисахарид-белок) с применением различных методов. Эти методы включают процедуры концентрирования/диафильтрации, осаждения/элюирования, колоночную хроматографию и глубинную фильтрацию. После очистки отдельных гликоконъюгатов, их смешивают с получением иммуногенной композиции согласно изобретению.

Активация. Настоящее изобретение также относится к активированным полисахаридам, полученным согласно любому из описанных здесь вариантов, где полисахарид активируют химическим реагентом с получением реакционноспособных групп для конъюгирования с линкером или белком-носителем. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сахарид согласно изобретению активируют перед конъюгированием с белком-носителем. В некоторых вариантах осуществления изобретения, степень активации не приводит к значительному снижению молекулярной массы полисахарида. Так, например, в некоторых вариантах осуществления изобретения, степень активации не расщепляет остов полисахарида. В некоторых вариантах осуществления изобретения, степень активации не оказывает значительного влияния на степень конъюгирования, как может быть определено по количеству лизиновых остатков, модифицированных в белке-носителе, таком как CRM₁₉₇ (как было определено с помощью аминокислотного анализа). Так, например, в некоторых вариантах осуществления изобретения, степень активации не приводит к значительному, то есть к 3-кратному, увеличению количества модифицированных лизиновых остатков (как было определено с помощью аминокислотного анализа) в белке-носителе по сравнению с количеством лизиновых остатков, модифицированных в белке-носителе конъюгата с эталонным полисахаридом с той же степенью активации. В некоторых вариантах осуществления изобретения, степень активации не повышает уровень неконъюгированного свободного сахарида. В некоторых вариантах осуществления изобретения, степень активации не снижает оптимальное соотношение сахарид/белок.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, активированный сахарид имеет процент активации, где количество молей тиола на повторяющееся сахаридное звено активированного сахарида составляет 1-100%, например, 2-80%, 2-50%, 3-30% и 4-25%. Степень активации составляет по меньшей мере 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, ≥20%, ≥30%, ≥40%, ≥50%, ≥60%, ≥70%, ≥80% или ≥90%, или приблизительно 100%. Предпочтительно, степень активации составляет максимум 50%, а более предпочтительно максимум 25%. В одном варианте осуществления изобретения, степень активации составляет максимум 20%. Любое минимальное значение и любое максимальное значение могут быть объединены для определения интервала.

В одном варианте осуществления изобретения, полисахарид активируют тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламинопиридиния (CDAP) с образованием сложного эфира цианистоводородной кислоты. Затем активированный полисахарид непосредственно или посредством спейсерной (линкерной) группы присоединяют к аминогруппе белка-носителя (предпочтительно CRM₁₉₇ или столбнячного токсоида).

Так, например, спейсер может представлять собой цистамин или цистеамин, используемый для получения тиолированного полисахарида, который может быть связан с носителем посредством тиоэфирной связи, образуемой после реакции взаимодействия с активированным малеимидом белком-носителем (например, с использованием N-[Y-малеимидобутирилокси]сукцинимидоэфира (GMBS) или галогенацетилированного белка-носителя (например, с использованием иодацетимида, N-сукцинимидилбромацетата (SBA; SIB), N-сукцинимидил(4-иодацетил)аминобензоата (SIAB), сульфосукцинимидил(4-иодацетил)аминобензоата (сульфо-SIAB), N-сукцинимидилиодацетат (SIA) или сукцинимидил-3-[бромацетамидо] пропионата (SBAP)). В одном варианте осуществления изобретения, сложный эфир цианистоводородной кислоты (необязательно полученный с помощью химической реакции CDAP) подвергают реакции сочетания с гександиамином или дигидразидом адипиновой кислоты (ADH), а амино-дериватизированный сахарид конъюгируют с белком-носителем (например, с CRM₁₉₇) с применением карбодиимидного химического метода (например, посредством EDAC или EDC) через карбоксильную группу на белке-носителе.

В других подходящих методах конъюгирования используют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, п-нитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU. Конъюгирование может включать использование карбонильного линкера, который может быть образован в результате реакции взаимодействия свободной гидроксильной группы сахарида с CDI с последующей реакцией с белком с образованием карбаматной связи. Эта реакция может включать восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, необязательно, защиту/снятие защиты с первичной гидроксильной группы, реакцию взаимодействия первичной гидроксильной группы с CDI с образованием промежуточного карбамата CDI и связывание промежуточного карбамата CDI с аминогруппой на белке (с применением химического метода CDI).

Молекулярная масса. В некоторых вариантах осуществления изобретения, гликоконъюгат содержит сахарид, имеющий молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа. В других вариантах осуществления изобретения, сахарид имеет молекулярную массу от 50 до 1000 кДа. В других вариантах осуществления изобретения, сахарид имеет молекулярную массу от 70 кДа до 900 кДа. В других вариантах осуществления изобретения, сахарид имеет молекулярную массу от 100 до 800 кДа. В других вариантах осуществления изобретения, сахарид имеет молекулярную массу от 200 до 600 кДа. В других вариантах осуществления изобретения, сахарид имеет молекулярную массу от 100 до 1000 кДа; от 100 кДа до 900 кДа; от 100 кДа до 800 кДа; от 100 кДа до 700 кДа; от 100 кДа до 600 кДа; от 100 кДа до 500 кДа; от 100 кДа до 400 кДа; от 100 кДа до 300 кДа; от 150 кДа до 1000 кДа; от 150 кДа до 900 кДа; от 150 кДа до 800 кДа; от 150 кДа до 700 кДа; от 150 кДа до 600 кДа; от 150 кДа до 500 кДа; от 150 кДа до 400 кДа; от 150 кДа до 300 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 200 кДа до 900 кДа; от 200 кДа до 800 кДа; от 200 кДа до 700 кДа; от 200 кДа до 600 кДа; от 200 кДа до 500 кДа; от 200 кДа до 400 кДа; от 200 кДа до 300; от 250 кДа до 1000 кДа; от 250 кДа до 900 кДа; от 250 кДа до 800 кДа; от 250 кДа до 700 кДа; от 250 кДа до 600 кДа; от 250 кДа до 500 кДа; от 250 кДа до 400 кДа; от 250 кДа до 350 кДа; от 300 кДа до 1000 кДа; от 300 кДа до 900 кДа; от 300 кДа до 800 кДа; от 300 кДа до 700 кДа; от 300 кДа до 600 кДа; от 300 кДа до 500 кДа; от 300 кДа до 400 кДа; от 400 кДа до 1000 кДа; от 400 кДа до 900 кДа; от 400 кДа до 800 кДа; от 400 кДа до 700 кДа; от 400 кДа до 600 кДа; от 500 кДа до 600 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, гликоконъюгат, имеющий такую молекулярную массу, получают посредством конъюгирования по одному концу. В другом варианте осуществления изобретения, гликоконъюгат, имеющий такую молекулярную массу, получают посредством химической реакции восстановительного аминирования (RAC), проводимой в водном буфере. Любое целое число в любом из вышеуказанных интервалов рассматривается как вариант осуществления настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, гликоконъюгат согласно изобретению имеет молекулярную массу от 400 до 15000 кДа; от 500 кДа до 10000 кДа; от 2000 кДа до 10000 кДа; от 3000 до 8000 кДа; или от 3000 до 5000 кДа. В других вариантах осуществления изобретения, гликоконъюгат имеет молекулярную массу от 500 кДа до 10000 кДа. В других вариантах осуществления изобретения, гликоконъюгат имеет молекулярную массу от 1000 до 8000 кДа. В других вариантах осуществления изобретения, гликоконъюгат имеет молекулярную массу от 2000 кДа до 8000 кДа или от 3000 до 7000 кДа. В дополнительных вариантах осуществления изобретения, гликоконъюгат согласно изобретению имеет молекулярную массу от 200 кДа до 20000 кДа; от 200 кДа до 15000 кДа; от 200 кДа до 10000 кДа; от 200 кДа до 7500 кДа; от 200 кДа до 5000 кДа; от 200 кДа до 3000 кДа; от 200 кДа до 1000 кДа; от 500 кДа до 20000 кДа; от 500 кДа до 15000 кДа; от 500 кДа до 12500 кДа; от 500 кДа до 10000 кДа; от 500 кДа до 7500 кДа; от 500 кДа до 6000 кДа; от 500 кДа до 5000 кДа; от 500 кДа до 4000 кДа; от 500 кДа до 3000 кДа; от 500 кДа до 2000 кДа; от 500 кДа до 1500 кДа; от 500 кДа до 1000 кДа; от 750 кДа до 20000 кДа; от 750 кДа до 15000 кДа; от 750 кДа до 12500 кДа; от 750 кДа до 10000 кДа; от 750 кДа до 7500 кДа; от 750 кДа до 6000 кДа; от 750 кДа до 5000 кДа; от 750 кДа до 4000 кДа; от 750 кДа до 3000 кДа; от 750 кДа до 2000 кДа; от 750 кДа до 1500 кДа; от 1000 до 15000 кДа; от 1000 до 12500 кДа; от 1000 до 10000 кДа; от 1000 до 7500 кДа; от 1000 до 6000 кДа; от 1000 до 5000 кДа; от 1000 до 4000 кДа; от 1000 до 2500 кДа; от 2000 кДа до 15000 кДа; от 2000 кДа до 12500 кДа; от 2000 кДа до 10000 кДа; от 2000 кДа до 7500 кДа; от 2000 кДа до 6000 кДа; от 2000 кДа до 5000 кДа; от 2000 кДа до 4000 кДа; или от 2000 кДа до 3000 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, гликоконъюгат, имеющий такую молекулярную массу, получают посредством описанного здесь конъюгирования eTEC. В другом варианте осуществления изобретения, гликоконъюгат, имеющий такую молекулярную массу, получают посредством химической реакции восстановительного аминирования (RAC). В другом варианте осуществления изобретения, гликоконъюгат, имеющий такую молекулярную массу, получают посредством химической реакции восстановительного аминирования (RAC), проводимой в ДМСО.

В дополнительных вариантах осуществления изобретения, гликоконъюгат согласно изобретению имеет молекулярную массу от 1000 до 20000 кДа; от 1000 до 15000 кДа; от 2000 кДа до 10000 кДа; от 2000 кДа до 7500 кДа; от 2000 кДа до 5000 кДа; от 3000 до 20000 кДа; от 3000 до 15000 кДа; от 3000 до 12500 кДа; от 4000 кДа до 10000 кДа; от 4000 до 7500 кДа; от 4000 кДа до 6000 кДа; или от 5000 до 7000 кДа. В одном варианте осуществления изобретения, гликоконъюгат, имеющий такую молекулярную массу, получают посредством химической реакции восстановительного аминирования (RAC). В другом варианте осуществления изобретения, гликоконъюгат, имеющий такую молекулярную массу, получают посредством химической реакции восстановительного аминирования (RAC), проводимой в ДМСО. В другом варианте осуществления изобретения, гликоконъюгат, имеющий такую молекулярную массу, получают посредством описанного здесь конъюгирования eTEC.

В дополнительных вариантах осуществления изобретения, гликоконъюгат согласно изобретению имеет молекулярную массу от 5000 до 20000 кДа; от 5000 до 15000 кДа; от 5000 до 10000 кДа; от 5000 до 7500 кДа; от 6000 кДа до 20000 кДа; от 6000 кДа до 15000 кДа; от 6000 кДа до 12500 кДа; от 6000 кДа до 10000 кДа или от 6000 кДа до 7500 кДа.

Молекулярная масса гликоконъюгата может быть измерена с помощью SEC-MALLS. Любое целое число в любом из вышеуказанных интервалов рассматривается как вариант осуществления изобретения. Гликоконъюгаты согласно изобретению могут быть также охарактеризованы соотношением (масс./масс.) сахарида к белку-носителю. В некоторых вариантах осуществления изобретения, отношение полисахарида к белку-носителю в гликоконъюгате (масс./масс.) составляет от 0,5 до 3 (например, приблизительно 0,5, приблизительно 0,6, приблизительно 0,7, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9, приблизительно 1,0, приблизительно 1,1, приблизительно 1,2, приблизительно 1,3, приблизительно 1,4, приблизительно 1,5, приблизительно 1,6, приблизительно 1,7, приблизительно 1,8, приблизительно 1,9, приблизительно 2,0, приблизительно 2,1, приблизительно 2,2, приблизительно 2,3, приблизительно 2,4, приблизительно 2,5, приблизительно 2,6, приблизительно 2,7, приблизительно 2,8, приблизительно 2,9 или приблизительно 3,0). В других вариантах осуществления изобретения, отношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,5 до 2,0, от 0,5 до 1,5, от 0,8 до 1,2, от 0,5 до 1,0, от 1,0 до 1,5 или от 1,0 до 2,0. В дополнительных вариантах осуществления изобретения, отношение сахарида к белку-носителю (масс./масс.) составляет от 0,8 до 1,2. В предпочтительном варианте изобретения, отношение полисахарида к белку-носителю в конъюгате составляет от 0,9 до 1,1. В некоторых таких вариантах осуществления изобретения, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

Гликоконъюгаты могут быть также охарактеризованы по распределению их молекулярных размеров (K_d). Среда для эксклюзионной хроматографии (CL-4B) может быть использована для определения относительного распределения размеров молекул конъюгата. Эксклюзионную хроматографию (ЭХ) проводят на колонках с подачей самотеком для определения профиля распределения молекулярных размеров конъюгатов. Большие молекулы, выходящие из пор в среде, элюируются быстрее, чем небольшие молекулы. Для сбора элюата с колонки используют устройства для сбора фракций. Фракции тестируют колориметрически с помощью сахаридного анализа. Для определения K_d, колонки калибруют для определения фракции, при которой молекулы полностью вытесняются (V₀), (K_d= 0), и фракции, соответствующей максимальному удерживанию (V), (K_d=1). Фракция, при которой достигается желаемый признак выборки (V_e), связана с Kd и вычисляется по формуле K_d = (V_e - V_o)/(V_i - V₀).

Свободный сахарид. Гликоконъюгаты и иммуногенные композиции согласно изобретению могут включать свободный сахарид, который не является ковалентно конъюгированным с белком-носителем, но тем не менее, присутствует в композиции гликоконъюгата. Свободный сахарид может быть нековалентно связан с гликоконъюгатом (то есть, нековалентно связан с ним, адсорбирован на нем или захватываться им). В предпочтительном варианте осуществления изобретения, гликоконъюгат содержит максимум 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% или 15% свободного полисахарида от общего количества полисахарида. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, гликоконъюгат содержит приблизительно менее, чем 25% свободного полисахарида от общего количества полисахарида. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, гликоконъюгат содержит приблизительно максимум 20% свободного полисахарида от общего количества полисахарида. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, гликоконъюгат содержит приблизительно максимум 15% свободного полисахарида от общего количества полисахарида. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, гликоконъюгат содержит приблизительно максимум 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% свободного полисахарида от общего количества полисахарида. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, гликоконъюгат содержит приблизительно менее, чем 8% свободного полисахарида от общего количества полисахарида. В предпочтительном варианте осуществления гликоконъюгат содержит приблизительно максимум 6% свободного полисахарида от общего количества полисахарида. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, гликоконъюгат содержит приблизительно максимум 5% свободного полисахарида от общего количества полисахарида. См., например, Таблицу 12, Таблицу 13, Таблицу 14, Таблицу 15, Таблицу 16, Таблицу 17 и Таблицу 18.

Ковалентная связь. В других вариантах осуществления изобретения, конъюгат содержит по меньшей мере одну ковалентную связь между белком-носителем и сахаридом на каждые 5-10 повторяющихся сахаридных звеньев; каждые 2-7 повторяющихся сахаридных звеньев; каждые 3-8 повторяющихся сахаридных звеньев; каждые 4-9 повторяющихся сахаридных звеньев; каждые 6-11 повторяющихся сахаридных звеньев; каждые 7-12 повторяющихся сахаридных звеньев; каждые 8-13 повторяющихся сахаридных звеньев; каждые 9-14 повторяющихся сахаридных звеньев; каждые 10-15 повторяющихся сахаридных звеньев; каждые 2-6 повторяющихся сахаридных звеньев, каждые 3-7 повторяющихся сахаридных звеньев; каждые 4-8 повторяющихся сахаридных звеньев; каждые 6-10 повторяющихся сахаридных звеньев; каждые 7-11 повторяющихся сахаридных звеньев; каждые 8-12 повторяющихся сахаридных звеньев; каждые 9-13 повторяющихся сахаридных звеньев; каждые 10-14 повторяющихся сахаридных звеньев; каждые 10-20 повторяющихся сахаридных звеньев; каждые 4-25 повторяющихся сахаридных звеньев или каждые 2-25 повторяющихся сахаридных звеньев. Во многих вариантах осуществления изобретения, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В другом варианте осуществления изобретения, по меньшей мере одна связь между белком-носителем и сахаридом присутствует на каждые 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 повторяющихся сахаридных звеньев полисахарида. В одном варианте осуществления изобретения, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. Любое целое число в любом из вышеуказанных интервалов рассматривается как вариант осуществления настоящего изобретения.

Лизиновые остатки. Другим способом характеризации гликоконъюгатов согласно изобретению является определение количества лизиновых остатков в белке-носителе (например, CRM₁₉₇), которые становятся конъюгированными с сахаридом, который можно охарактеризовать как ряд конъюгированных лизинов (степень конъюгирования). Подтверждение модификации белка-носителя лизином за счет ковалентных связей с полисахаридами может быть получено путем аминокислотного анализа с применением рутинных методов, известных специалистам в данной области. Конъюгирование приводит к уменьшению количества имеющихся лизиновых остатков по сравнению с исходным белком-носителем, используемым для получения продуктов-конъюгатов. В предпочтительном осуществления изобретения, степень конъюгирования гликоконъюгата согласно изобретению составляет от 2 до 15, от 2 до 13, от 2 до 10, от 2 до 8, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4, от 3 до 15, от 3 до 13, от 3 до 10, от 3 до 8, от 3 до 6, от 3 до 5, от 3 до 4, от 5 до 15, от 5 до 10, от 8 до 15, от 8 до 12, от 10 до 15 или от 10 до 12. В одном из вариантов осуществления изобретения, степень конъюгирования гликоконъюгата согласно изобретению составляет приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14 или приблизительно 15. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, степень конъюгирования гликоконъюгата согласно изобретению составляет от 4 до 7. В некоторых таких вариантах, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

Еще одним параметром для характеризации гликоконъюгатов согласно изобретению является частота присоединения сахаридной цепи к лизину на белке-носителе. Так, например, в некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере одна ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом присутствует на каждые 4 повторяющихся сахаридных звена полисахарида. В другом варианте осуществления изобретения, ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом присутствует по меньшей мере один раз на каждые 10 повторяющихся сахаридных звеньев полисахарида. В другом варианте осуществления изобретения, ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом присутствует по меньшей мере один раз из каждые 15 повторяющихся сахаридных звеньев полисахарида. В другом варианте осуществления изобретения, ковалентная связь между белком-носителем и полисахаридом присутствует по меньшей мере один раз из каждые 25 повторяющихся сахаридных звеньев полисахарида.

О-ацетилирование. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сахариды согласно изобретению являются O-ацетилированными. В некоторых вариантах осуществления изобретения, гликоконъюгат содержит сахарид, который имеет степень O-ацетилирования 10-100%, 20-100%, 30-100%, 40-100%, 50-100%, 60%-100%, 70-100%, 75-100%, 80-100%, 90-100%, 50-90%, 60-90%, 70-90% или 80-90%. В других вариантах осуществления изобретения, степень O-ацетилирования составляет ≥10%, ≥20%, ≥30%, ≥40%, ≥50%, ≥60%, ≥70%, ≥80%, или ≥90% или приблизительно 100%. Под % O-ацетилирования подразумевается процентное содержание данного сахарида по отношению к общему содержанию (где каждое повторяющееся звено полностью ацетилировано по отношению ко всей ацетилированной структуры).

В некоторых вариантах осуществления изобретения, гликоконъюгат получают посредством восстановительного аминирования. В некоторых вариантах осуществления изобретения, гликоконъюгат представляет собой конъюгированный сахарид, связанный с одним концом, где сахарид ковалентно связан непосредственно с белком-носителем. В некоторых вариантах осуществления изобретения, гликоконъюгат ковалентно связан с белком-носителем посредством (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбаматного (eTEC) спейсера.

Восстановительное аминирование. В одном варианте осуществления изобретения, сахарид конъюгируют с белком-носителем путем восстановительного аминирования (как описано в публикациях заявок на патент США №№ 2006/0228380, 2007/0231340, 2007/0184071 и 2007/0184072, WO 2006/110381, WO 2008/079653 и WO 2008/143709).

Восстановительное аминирование включает (1) окисление сахарида, (2) восстановление активированного сахарида и белка-носителя с образованием конъюгата. Перед окислением, сахарид гидролизуют, но необязательно. Может быть проведен механический или химический гидролиз. Химический гидролиз может быть проведен с использованием уксусной кислоты.

Стадия окисления может включать реакцию взаимодействия с периодатом. Используемый здесь термин «периодат» означает периодат и периодную кислоту. Этот термин также включает метапериодат (IO₄^-) и ортопериодат (IO₆^5-) и различные соли периодата (например, периодат натрия и периодат калия). В одном варианте осуществления изобретения, полисахарид окисляется в присутствии метапериодата, предпочтительно в присутствии периодата натрия (NaIO₄). В другом варианте осуществления изобретения, полисахарид окисляется в присутствии ортопериодата, а предпочтительно в присутствии периодной кислоты.

В одном варианте осуществления изобретения, окислитель представляет собой стабильное нитроксильное соединение или нитроксидный радикал, такой как пиперидин-N-окси- или пирролидин-N-окси-соединения, и в присутствии такого окислителя происходит селективное окисление первичных гидроксилов. В указанной реакции, фактическим окислителем в каталитическом цикле является соль N-оксоаммония. В одном аспекте изобретения, указанное стабильное нитроксильное соединение или нитроксидный радикал представляют собой пиперидин-N-окси- или пирролидин-N-окси-соединения. В одном аспекте изобретения, указанное стабильное нитроксильное соединение или нитроксидный радикал содержат группу ТЕМРО (2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилокси) или PROXYL (2,2,5,5-тетраметил-1-пирролидинилокси). В одном аспекте изобретения, указанный стабильный нитроксильный радикал представляет собой TEMPO или его производное. В одном аспекте изобретения, указанный окислитель представляет собой молекулу, несущую N-галогеногруппу. В одном аспекте изобретения, указанный окислитель выбран из N-хлорсукцинимида, N-бромсукцинимида, N-иодсукцинимида, дихлоризоциануровой кислоты, 1,3,5-трихлор-1,3,5-триазинан-2,4,6-триона, дибромизоциануровой кислоты, 1,3,5-трибром-1,3,5-триазинан-2,4,6-триона, дииодизоциануровой кислоты и 1,3,5-трииод-1,3,5-триазинан-2,4,6-триона. Предпочтительно, указанный окислитель представляет собой N-хлорсукцинимид.

Обычно, после стадии окисления сахарида, такой сахарид становится активированным и упоминается ниже как «активированный». Активированный сахарид и белок-носитель может быть лиофилизован (осушен путем вымораживания), либо независимо (путем дискретной лиофилизации), либо в комбинации (путем совместной лиофилизации). В одном варианте осуществления изобретения, активированный сахарид и белок-носитель являются совместно лиофилизованными. В другом варианте осуществления изобретения, активированный полисахарид и белок-носитель лиофилизуют независимо.

В одном варианте осуществления изобретения, лиофилизация происходит в присутствии невосстанавливающего сахара, где возможными невосстанавливающими сахарами являются сахароза, трегалоза, раффиноза, стахиоза, мелезитоза, декстран, маннит, лактит и палатинит.

Следующей стадией процесса конъюгирования является восстановление активированного сахарида и белка-носителя с образованием конъюгата (так называемое восстановительное аминирование) с использованием восстановителя. Подходящими восстановителями являются цианоборгидриды, такие как цианоборгидрид натрия, триацетоксиборгидрид натрия или боргидрид натрия или цинка в присутствии кислот Бренстеда или Льюиса, аминобораны, такие как пиридинборан, 2-пиколинборан, 2,6-диборан-метанол, диметиламинборан, t-BuMe'PrN-BH3, бензиламин-BH3 или 5-этил-2-метилпиридинборан (PEMB), боран-пиридин или боргидридная обменная смола. В одном варианте осуществления изобретения, восстановитель представляет собой цианоборгидрид натрия.

В одном варианте осуществления изобретения, реакцию восстановления проводят в водном растворителе (например, выбранном из PBS, MES, HEPES, бис-Триса, ADA, PIPES, MOPSO, BES, MOPS, DIPSO, MOBS, HEPPSO, POPSO, TEA, EPPS, бицина или HEPB, при pH от 6,0 до 8,5, от 7,0 до 8,0 или от 7,0 до 7,5). В другом варианте осуществления изобретения, реакцию проводят в апротонном растворителе. В одном из вариантов осуществления изобретения, реакцию восстановления проводят в растворителе, а именно, в ДМСО (диметилсульфоксиде) или в ДМФ (диметилформамиде). Растворитель ДМСО или ДМФ могут быть использованы для восстановления активированного полисахарида и белка-носителя, которые были лиофилизованы.

По окончании реакции восстановления, в конъюгатах могут оставаться непрореагировавшие альдегидные группы, которые могут быть блокированы с помощью подходящего блокирующего агента. В одном варианте осуществления изобретения, этот блокирующий агент представляет собой борогидрид натрия (NaBH₄). После конъюгирования (реакции восстановления и, необязательно, блокирования), гликоконъюгаты могут быть очищены (обогащены по количеству конъюгата полисахарид-белок) различными методами, известными специалистам в данной области. Эти методы включают диализ, концентрирование/диафильтрацию, фильтрацию в тангенциальном потоке, осаждение/элюирование, колоночную хроматографию (DEAE или гидрофобную хроматографию) и глубинную фильтрацию. Гликоконъюгаты могут быть очищены путем диафильтрации и/или ионообменной хроматографии и/или эксклюзионной хроматографии. В одном из вариантов осуществления изобретения, гликоконъюгаты очищают путем диафильтрации, ионообменной хроматографии или эксклюзионной хроматографии. В одном варианте осуществления изобретения, гликоконъюгаты подвергают стерильной фильтрации.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, гликоконъюгат серотипа E. coli выбран из O25B, O1, O2 и O6, полученных путем восстановительного аминирования. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, гликоконъюгаты серотипов E. coli O25B, O1, O2 и O6 получают путем восстановительного аминирования.

В одном своем аспекте, настоящее изобретение относится к конъюгату, который включает белок-носитель, например, CRM₁₉₇, связанный с сахаридом формулы O25B, представленной

где n представляет собой любое целое число, которое больше или равно 1. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, n представляет собой целое число, равное по меньшей мере 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 и максимум 200, 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51 или 50. Любое минимальное значение и любое максимальное значение могут быть объединены для определения интервала. Репрезентативные интервалы включают, например, по меньшей мере от 1 до максимум 1000; по меньшей мере от 10 до максимум 500; и по меньшей мере от 20 до максимум 80. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения, n составляет от по меньшей мере от 31 до максимум 90, более предпочтительно, от 40 до 90, а наиболее предпочтительно от 60 до 85.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к конъюгату, который включает белок-носитель, например CRM₁₉₇, связанный с сахаридом, имеющим любую из нижеследующих структур, показанных в Таблице 1 (см. также фиг. 9A-C и фиг. 10A-B), где n представляет собой целое число, которое больше или равно 1.

Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией или механизмом, авторы лишь отмечают, что в некоторых вариантах осуществления изобретения, стабильный конъюгат, как предполагается, требует такого уровня модификации сахаридного антигена, который сохранял бы структурную целостность важных иммуногенных эпитопов антигена.

Активация и образование альдегида. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сахарид согласно изобретению активируют с образованием альдегида. В таких вариантах осуществления изобретения, в которых сахарид является активированным, процент (%) активации (или степень окисления (DO)) относится к молям повторяющихся сахаридных звеньев на моль альдегида активированного полисахарида. Так, например, в некоторых вариантах осуществления изобретения, сахарид активируют посредством окисления периодатом соседних диолов на повторяющихся звеньях полисахарида, что приводит к образованию альдегида. Изменение молярных эквивалентов (мол.экв.) периодата натрия по отношению к повторяющимся сахаридным звеньям и изменение температуры во время окисления приводит к изменению уровней степени окисления (DO).

Концентрации сахарида и альдегида обычно определяют с помощью колориметрических анализов. Альтернативным реагентом является комбинация TEMPO (2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксильный радикал)-N-хлорсукцинимид (NCS), которая способствует образованию альдегидов из первичных спиртовых групп.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, активированный сахарид имеет степень окисления, при которой количество молей повторяющихся сахаридных звеньев на моль альдегида активированного сахарида составляет от 1 до 100, например, 2-80, 2-50, 3-30 и 4-25. Степень активации составляет по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,≥20,≥30,≥40,≥50,≥60,≥70,≥80 или≥90 или приблизительно 100. Предпочтительно, степень окисления (DO) составляет по меньшей мере 5 и максимум 50, более предпочтительно, по меньшей мере 10 и максимум 25. В одном варианте осуществления изобретения, степень активации составляет по меньшей мере 10 и максимум 25. Любое минимальное значение и любое максимальное значение могут быть объединены для определения интервала. Степень окисления может быть представлена как процент (%) активации. Так, например, в одном варианте осуществления изобретения, значение DO, равное 10, относится к одному активированному повторяющемуся сахаридному звену от общего количества 10 повторяющихся сахаридных звеньев в активированном сахариде, и в этом случае, значение DO, равное 10, может быть представлено как 10% активация.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, конъюгат, полученный посредством химической реакции восстановительного аминирования, включает белок-носитель и сахарид, где сахарид имеет любую структуру, выбранную из Формулы O1 (например, Формулы O1A, Формулы O1B и Формулы O1C), Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4 (например, Формулы O4:K52 и Формулы O4:K6), Формулы O5 (например, Формулы O5ab и Формулы O5ac (штамма 180/C3)), Формулы O6 (например, Формулы O6:K2; K13; K15 и Формулы O6: K54), Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18 (например, Формулы O18A, Формулы O18ac, Формулы O18A1, Формулы O18B и Формулы O18B1), Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23 (например, Формулы O23A), Формулы O24, Формулы O25 (например, Формулы O25a и Формулы O25b), Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45 (например, Формулы O45 и Формулы O45rel), Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы 62D₁, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73 (например, Формулы O73 (штамма 73-1)), Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78 Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144, Формулы O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O169, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186 и Формулы O187. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сахарид в конъюгате имеет формулу, в которой n представляет собой целое число от 1 до 1000, от 5 до 1000, предпочтительно от 31 до 100, более предпочтительно, от 35 до 90, а наиболее предпочтительно, от 35 до 65.

Конъюгаты, связанные у одного конца. В некоторых вариантах осуществления изобретения, конъюгат представляет собой конъюгированный сахарид, связанный у одного конца, где сахарид ковалентно связан у одного конца сахарида с белком-носителем. В некоторых вариантах осуществления изобретения, конъюгированный полисахарид, связанный у одного конца, имеет концевой сахарид. Так, например, конъюгат связан у одного конца, если один из концов (концевой сахаридный остаток) полисахарида ковалентно связан с белком-носителем. В некоторых вариантах осуществления изобретения, конъюгат связан у одного конца, если концевой сахаридный остаток полисахарида ковалентно связан с белком-носителем посредством линкера. Такие линкеры могут включать, например, цистаминовый линкер (A1), линкер на основе 3,3'-дитио-бис(дигидразид пропановой кислоты) (A4) и линкер на основе 2,2'-дитио-N, N'-бис(этан-2,1-диил)бис(2-(аминоокси)ацетамида) (А6).

В некоторых вариантах осуществления изобретения, сахарид конъюгирован с белком-носителем посредством остатка 3-дезокси-d-манно-окт-2-улозоновой кислоты (KDO) с образованием конъюгата, связанного у одного конца. См., папример, Пример 18, Пример 19, Пример 20 и фиг. 24.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, конъюгат предпочтительно не является биоконъюгатом. Термин «биоконъюгат» означает конъюгат белка (например, белка-носителя) и антигена, например, O-антигена (например, O25B), полученного в исходной клетке-хозяине, где аппарат клетки-хозяина связывает антиген с белком (например, посредством N-связи). Гликоконъюгаты включают биоконъюгаты, а также конъюгаты «сахарный антиген (например, олиго- и полисахариды)-белок», полученные способами, которые не требуют получения конъюгата в клетке-хозяине, например, путем конъюгирования посредством химического связывания белка и сахарида.

Сахариды, активированные тиолом. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сахарид согласно изобретению активирован тиолом. В таких вариантах осуществления изобретения, где сахарид активирован тиолом, процент (%) активации относится к молям тиола на повторяющееся сахаридное звено активированного полисахарида. Концентрации сахарида и тиола обычно определяют с помощью анализа Эллмана для количественного определения сульфгидрилов. Так, например, в некоторых вариантах осуществления изобретения, сахарид включает 2-кето-3-дезоксиоктановую кислоту (KDO), активированную дисульфидным аминовым линкером. См., например, Пример 18 и фиг. 24. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сахарид ковалентно связан с белком-носителем посредством двухвалентного гетеробифункционального линкера (также называемого здесь «спейсером»). Линкер предпочтительно обеспечивает тиоэфирную связь между сахаридом и белком-носителем, в результате чего образуется гликоконъюгат, называемый здесь «тиоэфирным гликоконъюгатом». В некоторых вариантах осуществления изобретения, линкер дополнительно обеспечивает карбаматные и амидные связи, такие как, например, (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбамат (eTEC). см., например, Пример 13.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, конъюгат, связанный у одного конца, включает белок-носитель и сахарид, где сахарид имеет любую структуру, выбранную из Формулы O1 (например, Формулы O1A, Формулы O1B, и Формулы O1C), Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4 (например, Формулы O4:K52 и Формулы O4:K6), Формулы O5 (например, Формулы O5ab и Формулы O5ac (штамма 180/C3)), Формулы O6 (например, Формулы O6:K2; K13; K15 и Формулы O6:K54), Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18 (например, Формулы O18A, Формулы O18ac, Формулы O18A1, Формулы O18B, и Формулы O18B1), Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23 (например, Формулы O23A), Формулы O24, Формулы O25 (например, Формулы O25a и Формулы O25b), Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45 (например, Формулы O45 и Формулы O45rel), Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы 62D₁, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73 (например, Формулы O73 (штамма 73-1)), Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144, Формулы O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186, и Формулы O187. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сахарид в конъюгате имеет формулу, в которой n представляет собой целое число от 1 до 1000, от 5 до 1000, предпочтительно от 31 до 100, более предпочтительно от 35 до 90, а наиболее предпочтительно от 35 до 65.

Так, например, в одном варианте осуществления изобретения, конъюгат, связанный у одного конца, включает белок-носитель и сахарид, имеющий структуру, выбранную из Формулы O8, Формулы O9a, Формулы O9, Формулы O20ab, Формулы O20ac, Формулы O52, Формулы 097 и Формулы O101, где n представляет собой целое число от 1 до 10.

Конъюгаты eTEC

В одном своем аспекте, настоящее изобретение в целом относится к гликоконъюгатам, содержащим сахарид, полученный из описанной выше E. coli и ковалентно конъюгированный с белком-носителем посредством (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбаматного (eTEC) спейсера (как описано, например, в патенте США 9517274 и публикации Международной патентной заявки WO2014027302, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки), включая иммуногенные композиции, содержащие такие гликоконъюгаты, и к способам получения и применения таких гликоконъюгатов и иммуногенных композиций. Указанные гликоконъюгаты содержат сахарид, ковалентно конъюгированный с белком-носителем посредством одного или более спейсеров eTEC, где сахарид ковалентно конъюгирован со спейсером eTEC посредством карбаматной связи, и где белок-носитель ковалентно конъюгирован со спейсером eTEC посредством амидной связи. Спейсер eTEC включает семь линейных атомов (то есть, -C(O)NH(CH₂)₂SCH₂C(О)-) и обеспечивает стабильные тиоэфирные и амидные связи между сахаридом и белком-носителем.

Гликоконъюгаты, связанные с eTEC, согласно изобретению могут быть представлены общей формулой (I):

где атомы, составляющие спейсер eTEC, указаны в центральной рамке.

В указанных гликоконъюгатах согласно изобретению, сахарид может быть полисахаридом или олигосахаридом.

Белки-носители, включенные в гликоконъюгаты согласно изобретению, выбраны из группы белков-носителей, обычно подходящих для таких целей, как дополнительно описано в настоящей заявке или известно специалистам в данной области. В конкретных вариантах осуществления изобретения, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу получения гликоконъюгата, содержащего описанный здесь сахарид, конъюгированный с белком-носителем посредством спейсера eTEC, где указанный способ включает стадии: а) реакции взаимодействия сахарида с производным угольной кислоты в органическом растворителе с образованием активированного сахарида; b) взаимодействия активированного сахарида с цистамином или цистеамином или их солью с образованием тиолированного сахарида; c) взаимодействия тиолированного сахарида с восстановителем с образованием активированного тиолированного сахарида, содержащего один или более свободных сульфгидрильных остатков; d) взаимодействия активированного тиолированного сахарида с активированным белком-носителем, содержащим одну или более α-галогенацетамидных групп, с образованием конъюгата «тиолированный сахарид-белок-носитель»; и e) реакции взаимодействия конъюгата «тиолированный сахарид - белок-носитель» (i) с первым блокирующим реагентом, способным к блокированию неконъюгированных α-галогенацетамидных групп активированного белка-носителя; и/или (ii) со вторым блокирующим реагентом, способным блокировать неконъюгированные свободные сульфгидрильные остатки активированного тиолированного сахарида; в результате чего продуцируется гликоконъюгат, связанный с eTEC.

Во многих вариантах осуществления изобретения, производное угольной кислоты представляет собой 1,1'-карбонил-ди-(1,2,4-триазол) (CDT) или 1,1'-карбонилдиимидазол (CDI). Предпочтительно, производное угольной кислоты представляет собой CDT, а органический растворитель представляет собой полярный апротонный растворитель, такой как диметилсульфоксид (ДМСО). В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, тиолированный сахарид получают посредством реакции взаимодействия активированного сахарида с бифункциональным симметричным тиоалкиламиновым реагентом, цистамином или его солью. Альтернативно, тиолированный сахарид может быть образован посредством реакции взаимодействия активированного сахарида с цистеамином или его солью. Связанные с eTEC гликоконъюгаты, полученные способами согласно изобретению, могут быть представлены общей формулой (I).

Во многих вариантах осуществления изобретения, первый блокирующий реагент представляет собой N-ацетил-L-цистеин, который реагирует с неконъюгированными α-галогенацетамидными группами на лизиновых остатках белка-носителя с образованием остатка S-карбоксиметилцистеина (CMC), ковалентно связанного с активированным лизиновым остатком посредством тиоэфирной связи.

В других вариантах осуществления изобретения, второй блокирующий реагент представляет собой иодацетамид (IAA), который реагирует с неконъюгированными свободными сульфгидрильными группами активированного тиолированного сахарида с образованием блокированного тиоацетамида. В большинстве случаев, стадия е) включает блокирование первым блокирующим реагентом и вторым блокирующим реагентом. В некоторых вариантах осуществления изобретения, стадия e) включает блокирование N-ацетил-L-цистеином, используемым в качестве первого блокирующего реагента и IAA, используемым в качестве второго блокирующего реагента.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, стадия блокирования е) дополнительно включает реакцию взаимодействия с восстанавителем, например, DTT, TCEP или меркаптоэтанолом, после реакции взаимодействия с первым и/или вторым блокирующим реагентом.

Связанные с eTEC гликоконъюгаты и иммуногенные композиции согласно изобретению могут включать свободные сульфгидрильные остатки. В некоторых случаях, активированные тиолированные сахариды, полученные описанными здесь способами, будут включать множество свободных сульфгидрильных остатков, некоторые из которых могут не подвергаться ковалентному конъюгированию с белком-носителем на стадии конъюгирования. Такие свободные сульфгидрильные остатки блокируют посредством реакции взаимодействия с блокирующим реагентом, реагирующим с тиолом, например, с иодацетамидом (IAA) для блокирования потенциально реакционноспособных функциональных групп. Также рассматриваются и другие реагирующие с тиолом блокирующие реагенты, например, реагенты, содержащие малеимид и т.п.

Кроме того, гликоконъюгаты, связанные с eTEC, и иммуногенные композиции согласно изобретению могут включать остаточный неконъюгированный белок-носитель, который может включать активированный белок-носитель, который подвергался модификации на стадиях реакции блокирования.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, стадия d) дополнительно включает получение активированного белка-носителя, содержащего одну или бодее α-галогенацетамидных групп, перед проведением реакции взаимодействия активированного тиолированного сахарида с активированным белком-носителем. Во многих вариантах осуществления изобретения, активированный белок-носитель содержит одну или более α-бромацетамидных групп.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к гликоконъюгату, связанному с eTEC и содержащему описанный здесь сахарид, конъюгированный с белком-носителем посредством спейсера eTEC, полученного в соответствии с любым из способов, описанных в настоящей заявке.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, белок-носитель представляет собой CRM_197, а ковалентная связь посредством спейсера eTEC, расположенного между CRM₁₉₇ и полисахаридом, присутствует по меньшей мере один раз на каждые 4, 10, 15 или 25 повторяющихся сахаридных звеньев полисахарида.

В каждом из аспектов изобретения, в конкретных вариантах описанных здесь способов и композиций, гликоконъюгат, связанный с eTEC, включает описанный здесь сахарид, такой как сахарид, происходящий от E. coli.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу профилактики, лечения или ослабления бактериальной инфекции, заболевания или состояния у индивидуума, где указанный способ включает введение индивидууму иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции согласно изобретению, где указанная иммуногенная композиция содержит гликоконъюгат, связанный с eTEC и содержащий описанный здесь сахарид. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сахарид происходит от E. coli.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, гликоконъюгат, связанный с eTEC, содержит белок-носитель и сахарид, где указанный сахарид имеет любую структуру, выбранную из Формулы O1 (например, Формулы O1A, Формулы O1B, and Формулы O1C), Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4 (например, Формулы O4:K52 и Формулы O4:K6), Формулы O5 (например, Формулы O5ab и Формулы O5ac (штамма 180/C3)), Формулы O6 (например, Формулы O6:K2; K13; K15 и Формулы O6:K54), Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18 (например, Формулы O18A, Формулы O18ac, Формулы O18A1, Формулы O18B, и Формулы O18B1), Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23 (например, Формулы O23A), Формулы O24, Формулы O25 (например, Формулы O25a и Формулы O25b), Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45 (например, Формулы O45 и Формулы O45rel), Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы 62D₁, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73 (например, Формулы O73 (штамма 73-1)), Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144, Формулы O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186, и Формулы O187. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сахарид в конъюгате имеет формулу, где n представляет собой целое число от 1 до 1000, от 5 до 1000, предпочтительно от 31 до 100, более предпочтительно от 35 до 90, а наиболее предпочтительно от 35 до 65.

Количество лизиновых остатков в белке-носителе, которые становятся конъюгированными с сахаридом, можно охарактеризовать как интервал конъюгированных лизинов. Так, например, в некоторых вариантах иммуногенных композиций, CRM₁₉₇ может содержать от 4 до 16 лизиновых остатков из 39 остатков, которые были ковалентно связаны с сахаридом. Другими словами можно сказать, что приблизительно от 10% до приблизительно 41% лизинов CRM₁₉₇ ковалентно связаны с сахаридом. В других вариантах осуществления изобретения, CRM₁₉₇ может содержать от 2 до 20 лизиновых остатков из 39 остатков, которые были ковалентно связаны с сахаридом. Другими словами можно сказать, что приблизительно от 5% до приблизительно 50% лизинов CRM₁₉₇ ковалентно связаны с сахаридом.

В большинстве вариантов осуществления изобретения, белок-носитель представляет собой CRM_197, а ковалентная связь посредством спейсера eTEC, расположенного между CRM₁₉₇ и полисахаридом, присутствует по меньшей мере один раз на каждые 4, 10, 15 или 25 сахаридных повторяющихся звеньев полисахарида.

В других вариантах осуществления изобретения, конъюгат содержит по меньшей мере одну ковалентную связь между белком-носителем и сахаридом на каждые 5-10 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 2-7 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 3-8 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 4-9 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 6-11 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 7-12 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 8-13 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 9-14 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 10-15 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 2-6 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 3-7 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 4-8 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 6-10 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 7-11 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 8-12 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 9-13 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 10-14 повторяющихся сахаридных звеньев; на каждые 10-20 повторяющихся сахаридных звеньев; или на каждые 4-25 повторяющихся сахаридных звеньев.

В другом варианте осуществления изобретения, по меньшей мере одна связь между белком-носителем и сахаридом присутствует на каждые 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 повторяющихся сахаридных звеньев полисахарида.

Белки-носители

Компонент гликоконъюгата согласно изобретению представляет собой белок-носитель, с которым конъюгирован сахарид. Термины «белок-носитель», «носитель белок» или «носитель» могут быть использованы здесь как синонимы. Белки-носители должны быть подвергнуты стандартным процедурам конъюгирования.

Одним из компонентов конъюгата является белок-носитель, с которым конъюгирован O-полисахарид. В одном варианте осуществления изобретения, конъюгат включает белок-носитель, конъюгированный с олигосахаридом O-полисахарида сердцевины (см. Фиг. 17). В одном варианте осуществления изобретения, конъюгат включает белок-носитель, конъюгированный с O-антигеном O-полисахарида.

Термины «белок-носитель», «носитель белок» или «носитель» могут быть использованы здесь как синонимы. Белки-носители должны быть подвергнуты стандартным процедурам конъюгирования.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, белок-носитель конъюгатов независимо выбран из TT, DT, мутантов DT (таких как CRM₁₉₇), белка D H.influenzae, PhtX, PhtD, гибридных соединений PhtDE (особенно тех, которые описаны в WO 01/98334 и WO 03/54007), детоксифицированного пневмолизина, PorB, белка N19, PspA, OMPC, токсина A или B C. Difficile и PsaA. В одном из вариантов осуществления изобретения, белок-носитель конъюгатов согласно изобретению представляет собой DT (дифтерийный токсоид). В другом варианте осуществления изобретения, белок-носитель конъюгатов согласно изобретению представляет собой ТТ (столбнячный токсоид). В другом варианте осуществления изобретения, белок-носитель конъюгатов согласно изобретению представляет собой PD (белок D Haemophilus influenzae - см., например, ЕР 0594610B).

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, сахариды конъюгированы с белком CRM₁₉₇. Белок CRM₁₉₇ является нетоксичной формой дифтерийного токсина, но иммунологически он не отличается от дифтерийного токсина. CRM₁₉₇ продуцируется бактерией C. diphtheriae, инфицированной нетоксигенным фагом p197tox, созданным посредством нитрозогуанидинового мутагенеза токсигенного коринефага бета. Белок CRM₁₉₇ имеет такую же молекулярную массу, как и дифтерийный токсин, но отличается от него заменой одного основания (гуанина на аденин) в структурном гене. Эта замена одного основания приводит к замене глутаминовой кислоты на глицин в зрелом белке и к элиминации токсических свойств дифтерийного токсина. Белок CRM₁₉₇ является безопасным и эффективным Т-клеточно-зависимым носителем для сахаридов.

В соответствии с этим, в некоторых вариантах осуществления изобретения, конъюгаты согласно изобретению включают CRM₁₉₇ в качестве белка-носителя, где сахарид ковалентно связан с CRM₁₉₇.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, белок-носитель гликоконъюгатов выбран из группы, состоящей из DT (дифтерийного токсина), TT (столбнячного токсоида) или фрагмента C TT, CRM197 (нетоксичного, но антигенно идентичного варианта дифтерийного токсина), других мутантов DT (таких как CRM176, CRM228, CRM45 (Uchida et al. J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973), CRM9, CRM45, CRM102, CRM103 или CRM107; и других мутаций, описанных Nicholls и Youle в Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; делеции или замены Glu-148 на Asp, Gin или Ser и/или Ala 158 на Gly и других мутаций, раскрытых в патенте США 4709017 или 4950740; мутации по меньшей мере одного или более остатков Lys 516, Lys 526, Phe 530 и/или Lys 534 и других мутаций, раскрытых в патенте США 5917017 или 6455673; или фрагмента, описанного в патенте США 5843711, пневмококкового пневмолизина (Kuo et al. (1995) Infect Immun 63; 2706-13), включая белок PLY, детоксифицированный соответствующим образом, например, dPLY-GMBS (WO 04081515, PCT/EP2005/010258) или dPLY-формола, PhtX, включая PhtA, PhtB, PhtD, PhtE (последовательности PhtA, PhtB, PhtD или PhtE раскрыты в WO 00/37105 или WO 00/39299) и гибридных белков Pht, например, гибридов PhtDE, гибридов PhtBE, Pht A-E (WO 01/98334, WO 03/54007, WO2009/000826), OMPC (менингококкового внешнего мембранного белка, обычно экстрагированного из N. meningitidis серологической группы B - EP0372501), PorB (от N. meningitidis), PD (белка D Haemophilus influenzae - см., например, EP 0594610 B), или их иммунологически функциональных эквивалентов, синтетических пептидов (EP0378881, EP0427347), белков теплового шока (WO 93/17712, WO 94/03208), белков коклюшного токсина (WO 98/58668, EP0471 177), цитокинов, лимфокинов, факторов роста или гормонов (WO 91/01146), искусственных белков, содержащих множество человеческих CD4⁺-Т-клеточных эпитопов различных антигенов, происходящих от патогенов (Falugi et al (2001) Eur. J. Immunol 31; 3816-3824) таких как белок N19 (Baraldoi et al (2004) Infect lmmun 72; 4884-7), пневмококкового поверхностного белка PspA (WO 02/091998), белков, поглощающих железо (WO 01/72337), токсина A или B C. difficile (WO 00/61761), белков, связывающихся с трансферином, пневмококкового адгезивного белка (PsaA), рекомбинантного экзотоксина А Pseudomonas aeruginosa (в частности, его нетоксических мутантов (таких как экзотоксин A, имеющий замену в положении глутаминовой кислоты 553 (Uchida Cameron DM, RJ Collier. 1987. J. Bacteriol. 169:4967-4971)). В качестве белков-носителей могут быть также использованы и другие белки, такие как овальбумин, гемоцианин лимфы улитки (KLH), альбумин бычьей сыворотки (BSA) или очищенное производное белка туберкулина (PPD). Другие подходящие белки-носители включают инактивированные бактериальные токсины, такие как холерный токсоид (например, описанный в Международной заявке на патент № WO 2004/083251), LT E. coli, ST E. coli и экзотоксин A от Pseudomonas aeruginosa.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, белок-носитель выбран, например, из CRM₁₉₇, фрагмента B дифтерийного токсина (DTFB), DTFB C8, дифтерийного токсоида (DT), столбнячного токсоида (TT), фрагмента C TT, коклюшного токсоида, холерного токсоида или экзотоксина A от Pseudomonas aeruginosa; детоксифицированного экзотоксина A P. aeruginosa (EPA), белка, связывающегося с мальтозой (MBP), флагеллина, детоксифицированного гемолизина A S. aureus, фактора свертывания крови A, фактора свертывания крови B, субъединицы В холерного токсина (CTB), пневмолизина Streptococcus pneumoniae и их детоксифицированных вариантов, AcrA C. jejuni и природных гликопротеинов C. jejuni. В одном варианте осуществления изобретения, белок-носитель представляет собой детоксифицированный экзотоксин Pseudomonas (EPA). В другом варианте осуществления изобретения, белок-носитель не является детоксифицированным экзотоксином Pseudomonas (EPA). В одном варианте осуществления изобретения, белок-носитель представляет собой флагеллин. В другом варианте осуществления изобретения, белок-носитель не является флагеллином.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, белок-носитель гликоконъюгатов независимо выбран из группы, состоящей из TT, DT, мутантов DT (таких как CRM₁₉₇), белка D H. influenzae, PhtX, PhtD, гибридных соединений PhtDE (в частности, описанных в WO 01/98334 и WO 03/54007), детоксифицированного пневмолизина, PorB, белка N19, PspA, OMPC, токсина A или B от C. Difficile и PsaA. В одном из вариантов осуществления изобретения, белок-носитель гликоконъюгатов согласно изобретению представляет собой DT (дифтерийный токсоид). В другом варианте осуществления изобретения, белок-носитель гликоконъюгатов согласно изобретению представляет собой ТТ (столбнячный токсоид). В другом варианте осуществления изобретения, белок-носитель гликоконъюгатов согласно изобретению представляет собой PD (белок D Haemophilus influenzae, см., например, ЕР 0594610 B).

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, капсулярные сахариды согласно изобретению конъюгированы с белком CRM₁₉₇. Белок CRM₁₉₇ представляет собой нетоксичную форму дифтерийного токсина, но иммунологически он не отличается от дифтерийного токсина. CRM₁₉₇ продуцируется бактерией C. diphtheriae, инфицированной нетоксигенным фагом p197tox, созданным посредством нитрозогуанидинового мутагенеза токсигенного коринефага бета (Uchida, T. et al. 1971, Nature New Biology 233: 8-11). Белок CRM₁₉₇ имеет такую же молекулярную массу, как и дифтерийный токсин, но отличается от него заменой одного основания (гуанина на аденин) в структурном гене. Эта замена одного основания приводит к замене глутаминовой кислоты на глицин в зрелом белке и к элиминации токсических свойств дифтерийного токсина. Белок CRM₁₉₇ белок является безопасным и эффективным Т-клеточно-зависимым носителем для сахаридов. Дополнительную информацию о CRM₁₉₇ и его получении можно найти, например, в патенте США 5614382.

В соответствии с этим, в большинстве вариантов осуществления изобретения, гликоконъюгаты согласно изобретению содержат CRM₁₉₇ в качестве белка-носителя, где капсулярный полисахарид ковалентно связан с CRM₁₉₇.

Композиция и вакцина

Кроме того, авторами настоящего изобретения были также получены композиции, включающие по меньшей мере один описанный выше сахарид, и композиции, содержащие по меньшей мере один описанный выше конъюгат. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, композиция представляет собой иммуногенную композицию. В другом варианте осуществления изобретения, композиция представляет собой вакцину.

В одном аспекте изобретения, иммуногенная композиция включает любой из описанных здесь сахаридов. В предпочтительном аспекте изобретения, иммуногенная композиция включает любой из описанных здесь конъюгатов.

В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция включает по меньшей мере один гликоконъюгат E. coli серотипа O25, а предпочтительно серотипа O25b. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция включает по меньшей мере один гликоконъюгат E. coli серотипа O1, а предпочтительно серотипа O1a. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция включает по меньшей мере один гликоконъюгат E. coli серотипа O2. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция включает по меньшей мере один гликоконъюгат E. coli серотипа O6.

В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция включает по меньшей мере один гликоконъюгат, выбранный из следующих серотипов E. coli: O25, O1, O2 и O6, а предпочтительно O25b, O1a, O2 и O6. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция включает по меньшей мере два гликоконъюгата, выбранных из следующих серотипов E. coli: O25, O1, O2 и O6, а предпочтительно O25b, O1a, O2 и O6. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция включает по меньшей мере три гликоконъюгата, выбранных из следующих серотипов E. coli: O25, O1, O2 и O6, а предпочтительно O25b, O1a, O2 и O6. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция включает гликоконъюгат от каждого из следующих серотипов E. coli: O25, O1, O2 и O6, а предпочтительно O25b, O1a, O2 и O6.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, гликоконъюгат любой из вышеуказанных иммуногенных композиций отдельно конъюгирован с CRM₁₉₇.

Соответственно, композиция включает О-антиген по меньшей мере одного серотипа E. coli. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от более, чем 1 серотипа E. coli. Так, например, композиция может включать О-антиген от двух различных серотипов E. coli (или «v», валентности) до 12 различных серотипов (12v). В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 3 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 4 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 5 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 6 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 7 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 8 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 9 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 10 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 11 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 12 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 13 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 14 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 15 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 16 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 17 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 18 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 19 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 20 различных серотипов E. coli.

Предпочтительно, количество сахаридов E. coli может варьироваться в пределах от 1 серотипа (или с валентностью «v»,) до 26 различных серотипов (26v). В одном варианте осуществления изобретения имеется один серотип. В одном варианте осуществления изобретения имеются 2 различных серотипа. В одном варианте осуществления изобретения имеются 3 различных серотипа. В одном варианте осуществления изобретения имеются 4 различных серотипа. В одном варианте осуществления изобретения, имеются 5 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения имеются 6 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения имеются 7 различных серотипа. В одном варианте осуществления изобретения имеются 8 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения имеются 9 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения имеются 10 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения имеются 11 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения имеются 12 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения имеются 13 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения имеются 14 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения имеются 15 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения имеются 16 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения имеются 17 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения имеются 18 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения имеются 19 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения, имеются 20 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения имеются 21 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения имеются 22 различных серотипа. В одном варианте осуществления изобретения имеются 23 различных серотипа. В одном варианте осуществления изобретения имеются 24 различных серотипа. В одном варианте осуществления изобретения имеются 25 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения имеются 26 различных серотипов. Сахариды конъюгируют с белком-носителем с образованием гликоконъюгатов, описанных в настоящей заявке.

В одном аспекте изобретения, композиция включает гликоконъюгат, который содержит О-антиген по меньшей мере от одной серогруппы E. coli, где О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от более, чем 1 серотипа E. coli, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 3 различных серотипов E. coli, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 4 различных серотипов E. coli, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 5 различных серотипов E. coli, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 6 различных серотипов E. coli, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 7 различных серотипов E. coli, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 8 различных серотипов E. coli, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 9 различных серотипов E. coli, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 10 различных серотипов E. coli, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 11 различных серотипов E. coli, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 12 различных серотипов, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 13 различных серотипов, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 14 различных серотипов, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 15 различных серотипов, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 16 различных серотипов, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 17 различных серотипов, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 18 различных серотипов, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 19 различных серотипов, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 20 различных серотипов, где каждый О-антиген конъюгирован с белком-носителем.

В другом аспекте изобретения, композиция включает O-полисахарид по меньшей мере от одного серотипа E. coli. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от более чем 1 серотипа E. coli. Так, например, композиция может включать О-полисахарид от двух различных серотипов E. coli до 12 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 3 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 4 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 5 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 6 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 7 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 8 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 9 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 10 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 11 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 12 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 13 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 14 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 15 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 16 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 17 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 18 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 19 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 20 различных серотипов.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид по меньшей мере от одного серотипа E. coli, где O-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид из более, чем 1 серотипа E. coli, где каждый O-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. Так, например, композиция может включать О-полисахарид от двух различных серотипов E. coli до 12 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 3 различных серотипов E. coli, где каждый O-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 4 различных серотипов E. coli, где каждый O-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 5 различных серотипов E. coli, где каждый O-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 6 различных серотипов E. coli, где каждый O-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 7 различных серотипов E. coli, где каждый O-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 8 различных серотипов E. coli, где каждый O-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 9 различных серотипов E. coli, где каждый O-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 10 различных серотипов E. coli, где каждый O-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 11 различных серотипов E. coli, где каждый O-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 12 различных серотипов, где каждый O-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 13 различных серотипов, где каждый O-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 14 различных серотипов, где каждый O-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 15 различных серотипов, где каждый O-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 16 различных серотипов, где каждый O-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 17 различных серотипов, где каждый O-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 18 различных серотипов, где каждый O-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 19 различных серотипов, где каждый O-полисахарид конъюгирован с белком-носителем. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 20 различных серотипов, где каждый O-полисахарид конъюгирован с белком-носителем.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид по меньшей мере от одного серотипа E. coli, где О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и сахарид сердцевины. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от более чем 1 серотипа E.coli, где каждый O-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где O-полисахарид включает O-антиген и сахарид сердцевины. Так, например, композиция может включать О-полисахарид от двух различных серотипов E. coli до 12 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 3 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 4 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 5 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 6 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 7 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 8 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 9 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 10 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 11 различных серотипов E. coli, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 11 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 12 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 13 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 14 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 15 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 16 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 17 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 18 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 19 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-полисахарид от 20 различных серотипов, где каждый О-полисахарид конъюгирован с белком-носителем, и где О-полисахарид включает О-антиген и сахарид сердцевины. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид, конъюгированный с CRM₁₉₇, где O-полисахарид имеет формулу O25a, где n равно по меньшей мере 40, и сахарид сердцевины. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, композиция также включает O-полисахарид, конъюгированный с CRM₁₉₇, где O-полисахарид имеет формулу O25b, где n равно по меньшей мере 40, и сахарид сердцевины. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, композиция также включает O-полисахарид, конъюгированный с CRM₁₉₇, где O-полисахарид имеет формулу O1а, где n равно по меньшей мере 40, и сахарид сердцевины. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, композиция также включает O-полисахарид, конъюгированный с CRM₁₉₇, где O-полисахарид имеет формулу O2, где n равно по меньшей мере 40, и сахарид сердцевины. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, композиция также включает O-полисахарид, конъюгированный с CRM₁₉₇, где O-полисахарид имеет формулу O6, где n равно по меньшей мере 40, и сахарид сердцевины.

В другом варианте осуществления изобретения, композиция дополнительно включает O-полисахарид, конъюгированный с CRM₁₉₇, где O-полисахарид имеет формулу O17, где n равно по меньшей мере 40, и сахарид сердцевины. В другом варианте осуществления изобретения, композиция дополнительно включает O-полисахарид, конъюгированный с CRM₁₉₇, где O-полисахарид имеет формулу O15, где n равно по меньшей мере 40, и сахарид сердцевины. В другом варианте осуществления изобретения, композиция дополнительно включает O-полисахарид, конъюгированный с CRM₁₉₇, где O-полисахарид имеет формулу O18А, где n равно по меньшей мере 40, и сахарид сердцевины. В другом варианте осуществления изобретения, композиция дополнительно включает O-полисахарид, конъюгированный с CRM₁₉₇, где O-полисахарид имеет формулу O75, где n равно по меньшей мере 40, и сахарид сердцевины. В другом варианте осуществления изобретения, композиция дополнительно включает O-полисахарид, конъюгированный с CRM₁₉₇, где O-полисахарид имеет формулу O4, где n равно по меньшей мере 40, и сахарид сердцевины. В другом варианте осуществления изобретения, композиция дополнительно включает O-полисахарид, конъюгированный с CRM₁₉₇, где O-полисахарид имеет формулу O16, где n равно по меньшей мере 40, и сахарид сердцевины. В другом варианте осуществления изобретения, композиция дополнительно включает O-полисахарид, конъюгированный с CRM₁₉₇, где O-полисахарид имеет формулу O13, где n равно по меньшей мере 40, и сахарид сердцевины. В другом варианте осуществления изобретения, композиция дополнительно включает O-полисахарид, конъюгированный с CRM₁₉₇, где O-полисахарид имеет формулу O7, где n равно по меньшей мере 40, и сахарид сердцевины.

В другом варианте осуществления изобретения, композиция дополнительно включает О-полисахарид, конъюгированный с CRM_197, где О-полисахарид имеет формулу О8, где n равно по меньшей мере 40, и сахарид сердцевины. В другом варианте осуществления изобретения, O-полисахарид имеет формулу O8, где n равно 1-20, предпочтительно 2-5, а более предпочтительно 3. Формула O8 показана, например, на фиг. 10B. В другом варианте осуществления изобретения, композиция дополнительно включает О-полисахарид, конъюгированный с CRM_197, где O-полисахарид имеет формулу O9, где n равно по меньшей мере 40, и сахарид сердцевины. В другом варианте осуществления изобретения, O-полисахарид имеет формулу O9, где n равно 1-20, предпочтительно 4-8, более предпочтительно 5. Формула O9 показана, например, на фиг. 10B. В другом варианте осуществления изобретения, O-полисахарид имеет формулу O9a, где n равно 1-20, предпочтительно 4-8, более предпочтительно 5. Формула O9a показана, например, на фиг. 10B.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, O-полисахарид имеет любую формулу, выбранную из Формулы O20ab, Формулы O20ac, Формулы O52, Формулы O97 и Формулы O101, где n равно 1-20, предпочтительно 4-8, а более предпочтительно 5. См., например, Фиг. 10B.

Как описано выше, композиция может включать любую комбинацию конъюгированных О-полисахаридов (антигенов). В одном репрезентативном варианте осуществления изобретения, композиция включает полисахарид, который имеет формулу O25b, полисахарид, который имеет формулу O1A, полисахарид, который имеет формулу O2, и полисахарид, который имеет формулу O6. Более конкретно, такая композиция включает: (i) O-полисахарид, конъюгированный с CRM_197, где O-полисахарид имеет формулу O25b, где n равно по меньшей мере 40, и сахарид сердцевины; (ii) O-полисахарид, конъюгированный с CRM_197, где O-полисахарид имеет Формулу O1a, где n равно по меньшей мере 40, и сахарид сердцевины; (iii) O-полисахарид, конъюгированный с CRM_197, где O-полисахарид имеет Формулу O2, где n равно по крайней мере 40, и сахарид сердцевины; и (iv) O-полисахарид, конъюгированный с CRM_197, где O-полисахарид имеет Формулу O6, где n равно по крайней мере 40, и сахарид сердцевины.

В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает по меньшей мере один O-полисахарид, происходящий от любого серотипа E. coli, где серотип не является O25a. Так, например, в одном варианте осуществления изобретения, композиция не включает сахарид, который имеет Формулу O25a. Такая композиция может включать, например, O-полисахарид, который имеет Формулу O25b, O-полисахарид, который имеет Формулу O1A, O-полисахарид, который имеет Формулу O2, и O-полисахарид, который имеет Формулу O6.

В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 2 различных серотипов E. coli, где каждый O-полисахарид конъюгирован с CRM_197, и где O-полисахарид включает O-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 3 различных серотипов E. coli, где каждый O-полисахарид конъюгирован с CRM_197, и где O-полисахарид включает O-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 4 различных серотипов E. coli, где каждый O-полисахарид конъюгирован с CRM_197, и где O-полисахарид включает O-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 5 различных серотипов E. coli, где каждый O-полисахарид конъюгирован с CRM_197, и где O-полисахарид включает O-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 6 различных серотипов E. coli, где каждый O-полисахарид конъюгирован с CRM_197, и где O-полисахарид включает O-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 7 различных серотипов E. coli, где каждый O-полисахарид конъюгирован с CRM_197, и где O-полисахарид включает O-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 8 различных серотипов E. coli, где каждый O-полисахарид конъюгирован с CRM_197, и где O-полисахарид включает O-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 9 различных серотипов E. coli, где каждый O-полисахарид конъюгирован с CRM_197, и где O-полисахарид включает O-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 10 различных серотипов E. coli, где каждый O-полисахарид конъюгирован с CRM_197, и где O-полисахарид включает O-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 11 различных серотипов E. coli, где каждый O-полисахарид конъюгирован с CRM_197, и где O-полисахарид включает O-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 12 различных серотипов, где каждый O-полисахарид конъюгирован с CRM_197, и где O-полисахарид включает O-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 13 различных серотипов, где каждый O-полисахарид конъюгирован с CRM_197, и где O-полисахарид включает O-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 14 различных серотипов, где каждый O-полисахарид конъюгирован с CRM_197, и где O-полисахарид включает O-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 15 различных серотипов, где каждый O-полисахарид конъюгирован с CRM_197, и где O-полисахарид включает O-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 16 различных серотипов, где каждый O-полисахарид конъюгирован с CRM_197, и где O-полисахарид включает O-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 17 различных серотипов, где каждый O-полисахарид конъюгирован с CRM_197, и где O-полисахарид включает O-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 18 различных серотипов, где каждый O-полисахарид конъюгирован с CRM_197, и где O-полисахарид включает O-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 19 различных серотипов, где каждый O-полисахарид конъюгирован с CRM_197, и где O-полисахарид включает O-антиген и сахарид сердцевины. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает O-полисахарид от 20 различных серотипов, где каждый O-полисахарид конъюгирован с CRM_197, и где O-полисахарид включает O-антиген и сахарид сердцевины.

В одном своем аспекте, настоящее изобретение относится к композиции, которая включает конъюгат, содержащий сахарид, ковелентно связанный с белком-носителем, где сахарид имеет Формулу О25b, где n равно 15±2. В одном своем аспекте, настоящее изобретение относится к композиции, которая включает конъюгат, содержащий сахарид, ковелентно связанный с белком-носителем, где сахарид имеет Формулу О25b, где n равно 17±2. В одном своем аспекте, настоящее изобретение относится к композиции, которая включает конъюгат, содержащий сахарид, ковелентно связанный с белком-носителем, где сахарид имеет Формулу О25b, где n равно 55±2. В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к композиции, которая включает конъюгат, содержащий сахарид, ковелентно связанный с белком-носителем, где сахарид имеет Формулу О25b, где n равно 51±2. В одном из вариантов осуществления изобретения, сахарид дополнительно включает фрагмент сахарида сердцевины R1 E. coli. В другом варианте осуществления изобретения, сахарид дополнительно включает фрагмент сахарида сердцевины K12 E. coli. В другом варианте осуществления изобретения, сахарид дополнительно включает фрагмент KDO. Предпочтительно, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления изобретения, конъюгат получают путем конъюгирования с присоединением у одного конца. В одном варианте осуществления изобретения, конъюгат получают посредством химической реакции восстановительного аминирования, предпочтительно в буфере ДМСО. В одном варианте осуществления изобретения, сахарид конъюгирован с белком-носителем посредством (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбаматного (eTEC) спейсера. Предпочтительно, композиция дополнительно включает фармацевтически приемлемый разбавитель.

В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция продуцирует антитела IgG у человека, где указанные антитела способны связываться с полисахаридом серотипа O25B E. coli в концентрации по меньшей мере 0,2 пг/мл, 0,3 пг/мл, 0,35 пг/мл, 0,4 пг/мл или 0,5 пг/мл, как было определено с помощью ELISA-анализа. Следовательно, может быть проведено сравнение OPA-активности сыворотки до и после иммунизации иммуногенной композицией согласно изобретению и сравнение их ответа на серотип O25B для оценки потенциального увеличения числа респондентов. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция продуцирует антитела IgG у человека, где указанные антитела способны уничтожать серотип O25B E. coli, как было определено с помощью опсонофагоцитарного анализа in vitro. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция продуцирует у человека функциональные антитела, где указанные антитела способны уничтожать E. coli серотипа O25B как было определено с помощью опсонофагоцитарного анализа in vitro. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция согласно изобретению повышает число респондентов, у которых вырабатывается ответ против E. coli серотипа O25B (то есть, индивидуумов с сывороткой, имеющей титр по меньшей мере 1:8, как было определено с помощью ОРА in vitro) по сравнению с группой до иммунизации. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция дает титр по меньшей мере 1:8 против E. coli серотипа O25B по меньшей мере у 50% индивидуумов, как было определено с помощью анализа на уничтожение опсонофагоцитов in vitro. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция согласно изобретению дает титр по меньшей мере 1:8 против E. coli серотипа O25B по меньшей мере у 60%, 70%, 80% или по меньшей мере 90% индивидуумов, как было определено с помощью анализа на уничтожение опсонофагоцитов in vitro. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция согласно изобретению способствует значительному увеличению числа респондентов, у которых вырабатывается ответ против E. coli серотипа O25B (то есть у индивидуума с сывороткой, имеющей титр по меньшей мере 1:8, как было определено с помощью ОРА in vitro) по сравнению с группой до иммунизации. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция согласно изобретению значительно увеличивает титры OPA у человека против E. coli серотипа O25B по сравнению с группой до иммунизации.

В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция продуцирует антитела IgG у человека, где указанные антитела способны связываться с полисахаридом серотипа O1А E. coli в концентрации по меньшей мере 0,2 пг/мл, 0,3 пг/мл, 0,35 пг/мл, 0,4 пг/мл или 0,5 пг/мл, как было определено с помощью ELISA-анализа. Следовательно, может быть проведено сравнение OPA-активности сыворотки до и после иммунизации иммуногенной композицией согласно изобретению и сравнение их ответа на серотип O1А для оценки потенциального увеличения числа респондентов. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция продуцирует антитела IgG у человека, где указанные антитела способны уничтожать серотип O1А E. coli, как было определено с помощью опсонофагоцитарного анализа in vitro. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция продуцирует у человека функциональные антитела, где указанные антитела способны уничтожать E. coli серотипа O1А как было определено с помощью опсонофагоцитарного анализа in vitro. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция согласно изобретению повышает число респондентов, у которых вырабатывается ответ против E. coli серотипа O1А (то есть, индивидуумов с сывороткой, имеющей титр по меньшей мере 1:8, как было определено с помощью ОРА in vitro) по сравнению с группой до иммунизации. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция дает титр по меньшей мере 1:8 против E. coli серотипа O1А по меньшей мере у 50% индивидуумов, как было определено с помощью анализа на уничтожение опсонофагоцитов in vitro. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция согласно изобретению дает титр по меньшей мере 1:8 против E. coli серотипа O1А по меньшей мере у 60%, 70%, 80% или по меньшей мере 90% индивидуумов, как было определено с помощью анализа на уничтожение опсонофагоцитов in vitro. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция согласно изобретению значительно увеличивает число респондентов, у которых вырабатывается ответ против E. coli серотипа O1А (то есть у индивидуума с сывороткой, имеющей титр по меньшей мере 1:8, как было определено с помощью ОРА in vitro) по сравнению с группой до иммунизации. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция согласно изобретению значительно увеличивает титры OPA у человека против E. coli серотипа O1А по сравнению с группой до иммунизации.

В одном своем аспекте, настоящее изобретение относится к композиции, которая включает конъюгат, содержащий сахарид, ковелентно связанный с белком-носителем, где сахарид имеет Формулу О2, где n равно 43±2. В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к композиции, которая включает конъюгат, содержащий сахарид, ковелентно связанный с белком-носителем, где сахарид имеет Формулу О2, где n равно 47±2. В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к композиции, которая включает конъюгат, содержащий сахарид, ковелентно связанный с белком-носителем, где сахарид имеет Формулу О2, где n равно 17±2. В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к композиции, которая включает конъюгат, содержащий сахарид, ковелентно связанный с белком-носителем, где сахарид имеет Формулу О2, где n равно 18±2. В одном из вариантов осуществления изобретения, сахарид дополнительно включает фрагмент сахарида сердцевины R1 E. coli. В другом варианте осуществления изобретения, сахарид дополнительно включает фрагмент сахарида сердцевины R4 E. coli. В другом варианте осуществления изобретения, сахарид дополнительно включает фрагмент KDO. Предпочтительно, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления изобретения, конъюгат получают путем конъюгирования с присоединением у одного конца. В одном варианте осуществления изобретения, конъюгат получают посредством химической реакции восстановительного аминирования, предпочтительно в буфере ДМСО. В одном варианте осуществления изобретения, сахарид конъюгирован с белком-носителем посредством (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбаматного (eTEC) спейсера. Предпочтительно, композиция дополнительно включает фармацевтически приемлемый разбавитель.

В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция продуцирует антитела IgG у человека, где указанные антитела способны связываться с полисахаридом серотипа O2 E. coli в концентрации по меньшей мере 0,2 пг/мл, 0,3 пг/мл, 0,35 пг/мл, 0,4 пг/мл или 0,5 пг/мл, как было определено с помощью ELISA-анализа. Следовательно, может быть проведено сравнение OPA-активности сыворотки до и после иммунизации иммуногенной композицией согласно изобретению и сравнение их ответа на серотип O2 для оценки потенциального увеличения числа респондентов. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция продуцирует антитела IgG у человека, где указанные антитела способны уничтожать серотип O2 E. coli, как было определено с помощью опсонофагоцитарного анализа in vitro. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция продуцирует у человека функциональные антитела, где указанные антитела способны уничтожать E. coli серотипа O2 как было определено с помощью опсонофагоцитарного анализа in vitro. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция согласно изобретению повышает число респондентов, у которых вырабатывается ответ против E. coli серотипа O2 (то есть, индивидуумов с сывороткой, имеющей титр по меньшей мере 1:8, как было определено с помощью ОРА in vitro) по сравнению с группой до иммунизации. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция дает титр по меньшей мере 1:8 против E. coli серотипа O2 по меньшей мере у 50% индивидуумов, как было определено с помощью анализа на уничтожение опсонофагоцитов in vitro. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция согласно изобретению дает титр по меньшей мере 1:8 против E. coli серотипа O2 по меньшей мере у 60%, 70%, 80% или по меньшей мере 90% индивидуумов, как было определено с помощью анализа на уничтожение опсонофагоцитов in vitro. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция согласно изобретению значительно увеличивает число респондентов, у которых вырабатывается ответ против E. coli серотипа O2 (то есть у индивидуума с сывороткой, имеющей титр по меньшей мере 1:8, как было определено с помощью ОРА in vitro) по сравнению с группой до иммунизации. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция согласно изобретению значительно увеличивает OPA-титры у человека против E. coli серотипа O2 по сравнению с группой до иммунизации.

В одном своем аспекте, настоящее изобретение относится к композиции, которая включает конъюгат, содержащий сахарид, ковелентно связанный с белком-носителем, где сахарид имеет Формулу О6, где n равно 42±2. В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к композиции, которая включает конъюгат, содержащий сахарид, ковелентно связанный с белком-носителем, где сахарид имеет Формулу О6, где n равно 50±2. В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к композиции, которая включает конъюгат, содержащий сахарид, ковелентно связанный с белком-носителем, где сахарид имеет Формулу О6, где n равно 17±2. В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к композиции, которая включает конъюгат, содержащий сахарид, ковелентно связанный с белком-носителем, где сахарид имеет Формулу О6, где n равно 18±2. В одном из вариантов осуществления изобретения, сахарид дополнительно включает фрагмент сахарида сердцевины R1 E. coli. В другом варианте осуществления изобретения, сахарид дополнительно включает фрагмент KDO. Предпочтительно, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления изобретения, конъюгат получают путем конъюгирования с присоединением у одного конца. В одном варианте осуществления изобретения, конъюгат получают посредством химической реакции восстановительного аминирования, предпочтительно в буфере ДМСО. В одном варианте осуществления изобретения, сахарид конъюгирован с белком-носителем посредством (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбаматного (eTEC) спейсера. Предпочтительно, композиция дополнительно включает фармацевтически приемлемый разбавитель.

В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция продуцирует антитела IgG у человека, где указанные антитела способны связываться с полисахаридом серотипа O6 E. coli в концентрации по меньшей мере 0,2 пг/мл, 0,3 пг/мл, 0,35 пг/мл, 0,4 пг/мл или 0,5 пг/мл, как было определено с помощью ELISA-анализа. Следовательно, может быть проведено сравнение OPA-активности сыворотки до и после иммунизации иммуногенной композицией согласно изобретению и сравнение их ответа на серотип O6 для оценки потенциального увеличения числа респондентов. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция продуцирует антитела IgG у человека, где указанные антитела способны уничтожать серотип O6 E. coli, как было определено с помощью опсонофагоцитарного анализа in vitro. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция продуцирует у человека функциональные антитела, где указанные антитела способны уничтожать E. coli серотипа O6 как было определено с помощью опсонофагоцитарного анализа in vitro. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция согласно изобретению повышает число респондентов, у которых вырабатывается ответ против E. coli серотипа O6 (то есть индивидуумов с сывороткой, имеющей титр по меньшей мере 1:8, как было определено с помощью ОРА in vitro) по сравнению с группой до иммунизации. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция дает титр по меньшей мере 1:8 против E. coli серотипа O6 по меньшей мере у 50% индивидуумов, как было определено с помощью анализа на уничтожение опсонофагоцитов in vitro. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция согласно изобретению дает титр по меньшей мере 1:8 против E. coli серотипа O6 по меньшей мере у 60%, 70%, 80% или по меньшей мере 90% индивидуумов, как было определено с помощью анализа на уничтожение опсонофагоцитов in vitro. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция согласно изобретению значительно увеличивает число респондентов, у которых вырабатывается ответ против E. coli серотипа O6 (то есть у индивидуума с сывороткой, имеющей титр по меньшей мере 1:8, как было определено с помощью ОРА in vitro) по сравнению с группой до иммунизации. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция согласно изобретению значительно увеличивает OPA-титры у человека против E. coli серотипа O6 по сравнению с группой до иммунизации.

В одном аспекте изобретения, композиция включает конъюгат, содержащий сахарид, ковалентно связанный с белком-носителем, где сахарид имеет любую структуру, выбранную из Формулы O1 (например, Формулы O1A, Формулы O1B, и Формулы O1C), Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4 (например, Формулы O4:K52 и Формулы O4:K6), Формулы O5 (например, Формулы O5ab и Формулы O5ac (штамма 180/C3)), Формулы O6 (например, Формулы O6:K2; K13; K15 и Формулы O6:K54), Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18 (например, Формулы O18A, Формулы O18ac, Формулы O18A1, Формулы O18B, и Формулы O18B1), Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23 (например, Формулы O23A), Формулы O24, Формулы O25 (например, Формулы O25a и Формулы O25b), Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45 (например, Формулы O45 и Формулы O45rel), Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы 62D₁, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73 (например, Формулы O73 (штамма 73-1)), Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144, Формулы O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186, и Формулы O187, где n представляет собой целое число от 1 до 100. В одном варианте осуществления изобретения, сахарид дополнительно включает фрагмент сахарида сердцевины R1 E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, сахарид дополнительно включает фрагмент сахарида сердцевины R2 E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, сахарид дополнительно включает фрагмент сахарида сердцевины R3 E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, сахарид дополнительно включает фрагмент сахарида сердцевины R4 E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, сахарид дополнительно включает фрагмент сахарида сердцевины K12 E. coli. В другом варианте сахарид дополнительно включает фрагмент KDO. Предпочтительно, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления изобретения, конъюгат получают путем конъюгирования с присоединением у одного конца. В одном варианте осуществления изобретения, конъюгат получают посредством химической реакции восстановительного аминирования, предпочтительно в буфере ДМСО. В одном варианте осуществления изобретения, сахарид конъюгирован с белком-носителем посредством (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбаматного (eTEC) спейсера. Предпочтительно, композиция дополнительно включает фармацевтически приемлемый разбавитель. В одном варианте осуществления изобретения, композиция дополнительно включает по меньшей мере от 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 дополнительных конъюгатов и максимум до 30 дополнительных конъюгатов, каждый из которых включает сахарид, ковалентно связанный с белком-носителем, где сахарид имеет любую структуру, выбранную из указанных Формул.

Дозы композиций

Количество гликоконъюгата(ов) в каждой дозе выбирают как количество, которое вызывает иммунопротективный ответ без значительных неблагоприятных побочных эффектов в типичных вакцинах. Такое количество будет варьироваться в зависимости от конкретно используемого иммуногена и от его формы.

Количество конкретного гликоконъюгата в иммуногенной композиции может быть вычислено исходя из общего количества полисахарида для этого конъюгата (конъюгированного и неконъюгированного). Так, например, гликоконъюгат с 20% свободным полисахаридом будет содержать приблизительно 80 г конъюгированного полисахарида и приблизительно 20 г неконъюгированного полисахарида в дозе полисахарида 100 г. Количество гликоконъюгата может варьироваться в зависимости от серотипа E. coli. Концентрация сахарида может быть определена с помощью анализа с использованием уроновой кислоты.

«Иммуногенное количество» различных полисахаридных компонентов в иммуногенной композиции может отличаться, и каждое из них может составлять приблизительно 1,0 г, приблизительно 2,0 г, приблизительно 3,0 г, приблизительно 4,0 г, приблизительно 5,0 г, приблизительно 6,0 г, приблизительно 7,0 г, приблизительно 8,0 г, приблизительно 9,0 г, приблизительно 10,0 г, приблизительно 15,0 г, приблизительно 20,0 г, приблизительно 30,0 г, приблизительно 40,0 пг, приблизительно 50,0 пг, приблизительно 60,0 пг, приблизительно 70,0 пг, приблизительно 80,0 пг, приблизительно 90,0 пг или приблизительно 100,0 г любого конкретного полисахаридного антигена. Обычно, каждая доза будет содержать от 0,1 г до 100 г полисахарида для данного серотипа, в частности от 0,5 г до 20 г, более конкретно от 1 г до 10 г, а еще более конкретно от 2 г до 5 г. Любое целое число в любом из вышеуказанных интервалов рассматривается как вариант осуществления настоящего изобретения. В одном варианте осуществления изобретения, каждая доза будет включать 1 г, 2 г, 3 г, 4 г, 5 г, 6 г, 7 г, 8 г, 9 г, 10 г, 15 г или 20 г полисахарида данного изотипа.

Количество белка-носителя. Обычно, каждая доза будет содержать от 5 до 150 г белка-носителя, в частности от 10 до 100 г белка-носителя, более конкретно от 15 до 100 г белка-носителя, более конкретно от 25 до 75 г белка-носителя, более конкретно от 30 г до 70 г белка-носителя, более конкретно от 30 до 60 г белка-носителя, более конкретно от 30 г до 50 г белка-носителя, а еще более конкретно от 40 до 60 г белка-носителя. В одном варианте осуществления изобретения, указанный белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В одном варианте осуществления изобретения, каждая доза будет включать приблизительно 25 г, приблизительно 26 г, приблизительно 27 г, приблизительно 28 г, приблизительно 29 г, приблизительно 30 г, приблизительно 31 г, приблизительно 32 г, приблизительно 33 г, приблизительно 34 г, приблизительно 35 г, приблизительно 36 г, приблизительно 37 г, приблизительно 38 г, приблизительно 39 г, приблизительно 40 г, приблизительно 41 г, приблизительно 42 г, приблизительно 43 г, приблизительно 44 г, приблизительно 45 г, приблизительно 46 г, приблизительно 47 г, приблизительно 48 г, приблизительно 49 г, приблизительно 50 г, приблизительно 51 г, приблизительно 52 г, приблизительно 53 г, приблизительно 54 г, приблизительно 55 г, приблизительно 56 г, приблизительно 57 г, приблизительно 58 г, приблизительно 59 г, приблизительно 60 г, приблизительно 61 г, приблизительно 62 г, приблизительно 63 г, приблизительно 64 г, приблизительно 65 г, приблизительно 66 г, приблизительно 67 г, приблизительно 68 г, приблизительно 69 г, приблизительно 70 г, приблизительно 71 г, приблизительно 72 г, приблизительно 73 г, приблизительно 74 г или приблизительно 75 г белка-носителя. В одном варианте осуществления изобретения, указанный белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

Адъювант

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанные здесь иммуногенные композиции могут дополнительно содержать по меньшей мере один, два или три адъюванта. Термин «адъювант» означает соединение или смеси, которые усиливают иммунный ответ на антиген. Антигены могут действовать, главным образом, как система доставки, а в первую очередь, как иммуномодулятор, или могут иметь явно выраженные признаки того и другого. Подходящие адъюванты включают адъюванты, которые могут быть использованы для млекопитающих, включая человека.

Примерами известных подходящих адъювантов типа систем доставки, которые могут быть использованы для человека, являются, но не ограничиваются ими, квасцы (например, фосфат алюминия, сульфат алюминия или гидроксид алюминия), фосфат кальция, липосомы, эмульсии типа «масло-в-воде», такие как MF59 (4,3% масс./об. сквалена, 0,5% масс./об. полисорбата 80 (Твина 80), 0,5% масс./об. триолеата сорбитана (Span 85)), эмульсии типа «вода-в-масле», такие как Montanide, и микрочастицы или наночастицы сополимера D, L-лактида и гликолида (PLG).

В одном из вариантов осуществления изобретения, описанные здесь иммуногенные композиции содержат в качестве адъюванта соли алюминия (квасцы) (например, фосфат алюминия, сульфат алюминия или гидроксид алюминия). В предпочтительном варианте осуществления изобретения, описанные здесь иммуногенные композиции содержат фосфат алюминия или гидроксид алюминия в качестве адъюванта. В одном из вариантов осуществления изобретения, описанные здесь иммуногенные композиции содержат от 0,1 мг/мл до 1 мг/мл или от 0,2 мг/мл до 0,3 мг/мл элементарного алюминия в форме фосфата алюминия. В одном из вариантов осуществления изобретения, описанные здесь иммуногенные композиции содержат приблизительно 0,25 мг/мл элементарного алюминия в форме фосфата алюминия. Примерами известных подходящих адъювантов иммуномодулирующего типа, которые могут быть использованы для человека, являются, но не ограничиваются ими, экстракты сапонинов из коры дерева Aquilla (QS21, Quil A), агонисты TLR4, такие как MPL (монофосфориллипид A), 3DMPL (3-O-деацилированный MPL) или GLA-AQ, мутанты LT/CT, цитокины, такие как различные интерлейкины (например, IL-2, IL-12) или GM-CSF, AS01 и т.п.

Примерами известных подходящих адъювантов иммуномодулирующего типа с функциями доставки и иммуномодуляции, которые могут быть использованы для человека, являются, но не ограничиваются ими, ISCOMS (см., например, Sjolander et al. (1998) J. Leukocyte Biol. 64:713; WO 90/03184, WO 96/11711, WO 00/48630, WO 98/36772, WO 00/41720, WO 2006/134423 и WO 2007/026190) или GLA-EM, который представляет собой комбинацию агониста TLR4 и эмульсии типа «масло-в-воде».

Для применения в ветеринарии, включая, но не ограничиваясь ими, эксперименты на животных, могут быть использованы полный адъювант Фрейнда (ПАФ), неполный адъювант Фрейнда (НАФ), эмульсиген, N-ацетил-мурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетил-нормурамил-L-аланил-D-изоглутамин (CGP 11637, обозначаемый здесь нор-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин (CGP 19835A, обозначаемый здесь MTP-PE) и RIBI, который содержит три компонента, экстрагированных из бактерий, а именно, монофосфориллипид A, димиколят трегалозы и каркас клеточной стенки (MPL+TDM+CWS) в 2% эмульсии сквалена/Твина 80.

Дополнительные репрезентативные адъюванты для повышения эффективности иммуногенных композиций, раскрытых в настоящей заявке, включают, но не ограничиваются ими: (1) составы эмульсий типа «масло-в-воде» (в присутствии или в отсутствии других специфических иммуностимулирующих агентов, таких как мурамилпептиды (см. ниже) или компоненты бактериальной клеточной стенки), такие как, например, (а) SAF, содержащий 10% сквалана, 0,4% Твина 80, 5% блокированного плюроником полимера L121 и thr-MDP, либо подвергнутые микрофлюидизации до образования субмикронной эмульсии, либо перемешанные в целях получения эмульсии частиц большего размера, и (b) адъювантная система RIBI™ (RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, Mont.), содержащая 2% сквалена, 0,2% Твина 80 и один или несколько компонентов бактериальной клеточной стенки, таких как монофосфорилипид A (MPL), димиколят трегалозы (TDM) и скелет клеточной стенки (CWS), а предпочтительно MPL+CWS (DETOX™); (2) сапониновые адъюванты, такие как QS21, STIMULON™ (Cambridge Bioscience, Worcester, Mass.), ABISCO® (Isconova, Sweden), или ISCOMATRIX® (Commonwealth Serum Laboratories, Australia), которые могут быть использованы, или полученные из них частицы, такие как ISCOM (иммуностимулирующие комплексы), где ISCOMS могут не содержать дополнительного детергента (например, WO 00/07621); (3) полный адъювант Фрейнда (ПАФ) и неполный адъювант Фрейнда (НАФ); (4) цитокины, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 (например, WO 99/44636)), интерфероны (например, гамма-интерферон), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), фактор некроза опухоли (TNF) и т.п.; (5) монофосфориллипид A (MPL) или 3-O-деацилированный MPL (3dMPL) (см., например, GB2220211, EP0689454) (см., например, WO 00/56358); (6) комбинации 3dMPL, например, с QS21 и/или с эмульсиями типа «масло-в-воде» (см., например, EP0835318, EP0735898, EP0761231); (7) полиоксиэтиленовый эфир или полиоксиэтиленовый сложный эфир (см., например, WO 99/52549); (8) поверхностно-активное вещество, а именно, сложный эфир полиоксиэтиленсорбитана в комбинации с октоксинолом (например, WO 01/21207) или поверхностно-активное вещество, а именно, полиоксиэтиленалкиловый эфир или сложный эфир в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным неионным поверхностно-активным веществом, таким как октоксинол (например, WO 01/21152); (9) сапонин и иммуностимулирующий олигонуклеотид (например, CpG-олигонуклеотид) (например, WO 00/62800); (10) иммуностимулятор и частицу соли металла (см., например, WO 00/23105); (11) сапонин и эмульсию типа «масло-в-воде» (например, WO 99/11241); (12) сапонин (например, QS21)+3dMPL+IM2 (необязательно, + стерол) (например, WO 98/57659); (13) другие вещества, которые действуют как иммуностимулирующие агенты для повышения эффективности композиции. Мурамиловые пептиды включают N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-25-ацетилнормурамил-L-аланил-D-изоглутамин (нор-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин (MTP-PE) и т.п.

В одном из вариантов настоящего изобретения, иммуногенные композиции, раскрытые в настоящей заявке, содержат CpG-олигонуклеотид в качестве адъюванта. Используемый здесь термин «CpG-олигонуклеотид» означает иммуностимулирующий CpG- олигодезоксинуклеотид (CpG ODN), и, соответственно, эти термины являются сининимами, если это не оговорено особо. Иммуностимулирующие CpG-олигодезоксинуклеотиды содержат один или более иммуностимулирующих мотивов CpG, которые представляют собой неметилированные динуклеотиды цитозин-гуанин, необязательно, с некоторыми предпочтительными основаниями. Статус метилирования иммуностимулирующего мотива CpG обычно определяется остатком цитозина в динуклеотиде. Иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере один неметилированный CpG-динуклеотид, представляет собой олигонуклеотид, который содержит 5'-неметилированный цитозин, связанный фосфатной связью с 3'-гуанином, и который активирует иммунную систему посредством связывания с ловушко-подобным рецептором 9 (TLR-9). В другом варианте осуществления изобретения, иммуностимулирующий олигонуклеотид может содержать один или более метилированных CpG-динуклеотидов, которые активируют иммунную систему посредством TLR9, но не так сильно, как если бы мотив(ы) CpG был(и) неметилирован(ы). Иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды могут включать один или более палиндромов, которые, в свою очередь, могут включать CpG-динуклеотид. CpG-олигонуклеотиды были описаны в ряде выданных патентов, в опубликованных патентных заявках и в других публикациях, включая патенты США No. 6194388; 6207646; 6214806; 6218371; 6239116; и 6339068.

В одном из вариантов осуществления изобретения, раскрытые здесь иммуногенные композиции содержат любой из CpG-олигонуклеотидов, описанных в WO 2010/125480, со страницы 3, строки 22 до страницы 12, строки 36.

Были идентифицированы различные классы иммуностимулирующих CpG-олигонуклеотидов. Они называются классами A, B, C и P и более подробно описаны в WO 2010/125480, со страницы 3, строки 22 до страницы 12, строки 36. Способы согласно изобретению включают использование этих различных классов иммуностимулирующих CpG-олигонуклеотидов.

Композиция

Иммуногенные композиции согласно изобретению могут быть приготовлены в жидкой форме (то есть, в виде растворов или суспензий) или в лиофилизованной форме. Жидкие композиции могут быть преимущественно введены непосредственно из их упакованной формы и, таким образом, они являются идеальными для инъекций без необходимости разведения в водной среде, как это необходимо для лиофилизованных композиций согласно изобретению.

Состав иммуногенной композиции согласно изобретению может быть получен с применением хорошо известных методов. Так, например, отдельные конъюгаты могут быть получены с использованием физиологически приемлемого носителя для приготовления композиций. Примеры таких носителей включают, но не ограничиваются ими, воду, забуференный физиологический раствор, полиолы (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль) и растворы декстрозы. Настоящее изобретение относится к иммуногенной композиции, содержащей любую комбинацию гликоконъюгатов, раскрытых в настоящей заявке, и фармацевтически приемлемый наполнитель, носитель или разбавитель.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, составы иммуногенных композиций включают фармацевтически приемлемый разбавитель, наполнитель или фармацевтически приемлемый носитель. В одном варианте осуществления изобретения, фармацевтически приемлемый разбавитель включает стерильную воду, воду для инъекций, стерильный изотонический физиологический раствор или биологический буфер. Конъюгаты полисахарид-белок и/или белковые иммуногены смешивают с такими разбавителями или носителями обычным способом. Используемый здесь термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает растворители, дисперсионные среды, агенты для покрытий, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты и агенты, замедляющие всасывание, и т.п., совместимые с введением человеку или другим позвоночным-хозяевам. Подходящие носители известны специалистам в данной области и в значительной степени зависят от способа введения.

Так, например, наполнители, которые могут присутствовать в составе иммуногенной композиции, включают консерванты, химические стабилизаторы и суспендирующие или диспергирующие агенты. Обычно, стабилизаторы, консерванты и т.п. оптимизируют для определения наилучшего состава с точки зрения эффективности для реципиента, которому их вводят (например, человеку). Примеры консервантов включают хлорбутанол, сорбат калия, сорбиновую кислоту, диоксид серы, пропилгаллат, парабены, этилванилин, глицерин, фенол и парахлорфенол. Примеры стабилизирующих ингредиентов включают казаминокислоты, сахарозу, желатин, феноловый красный, N-Z-амин, дифосфат одноосновного калия, лактозу, гидролизат лактальбумина и сухое молоко.

В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция согласно изобретению присутствует в жидкой форме, а предпочтительно, в водной жидкой форме.

Иммуногенные композиции согласно изобретению могут содержать один или более компонентов, таких как буфер, соль, двухвалентный катион, неионный детергент, криопротектор, такой как сахар, и антиоксидант, такой как акцептор свободных радикалов или хелатообразующий агент, или любое множество их комбинаций.

В одном из вариантов осуществления изобретения, иммуногенные композиции согласно изобретению содержат буфер. В одном варианте осуществления изобретения, указанный буфер имеет pKa приблизительно от 3,5 до приблизительно 7,5. В некоторых вариантах осуществления изобретения, буфер представляет собой фосфат, сукцинат, гистидин или цитрат. В некоторых вариантах осуществления изобретения, буфер представляет собой сукцинат в конечной концентрации от 1 мМ до 10 мМ. В одном конкретном варианте осуществления изобретения, конечная концентрация сукцинатного буфера составляет приблизительно 5 мМ.

В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенные композиции согласно изобретению содержат соль. В некоторых вариантах осуществления изобретения, соль выбрана из хлорида магния, хлорида калия, хлорида натрия и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления изобретения, соль выбрана из групп, состоящих из хлорида магния, хлорида калия, хлорида натрия и их комбинации. В одном конкретном варианте осуществления изобретения, соль представляет собой хлорид натрия. В одном конкретном варианте осуществления изобретения, иммуногенные композиции согласно изобретению содержат хлорид натрия в концентрации 150 мМ.

В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенные композиции согласно изобретению содержат поверхностно-активное вещество. В некоторых вариантах осуществления изобретения, композиция включает неионное поверхностно-активное вещество, включая, но не ограничиваясь ими, сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот. В одном из вариантов осуществления изобретения, поверхностно-активное вещество выбрано из полисорбата 20 (TWEEN™ 20), полисорбата 40 (TWEEN™ 40), полисорбата 60 (TWEEN™ 60), полисорбата 65 (TWEEN™ 65), полисорбата 80 (TWEEN™ 80), полисорбата 85 (TWEEN™ 85), TRITON™ N-101, TRITON™ X-100, окстоксинола 40, ноноксинола-9, триэтаноламина, олеата полипептида на основе триэтаноламина, гидроксистеарата полиоксиэтилена-660 (PEG-15, Solutol H 15), полиоксиэтилен-35-рицинолеата (CREMOPHOR® EL), соевого лецитина и полоксамера. В одном из вариантов осуществления изобретения, поверхностно-активное вещество выбрано из группы, состоящей из полисорбата 20 (TWEEN™ 20), полисорбата 40 (TWEEN™ 40), полисорбата 60 (TWEEN™ 60), полисорбата 65 (TWEEN ™ 65), полисорбата 80 (TWEEN™ 80), полисорбата 85 (TWEEN™ 85), TRITON™ N-101, TRITON™ X-100, окстоксинола 40, ноноксинола-9, триэтаноламина, олеата полипептида на основе триэтаноламина, гидроксистеарата полиоксиэтилена-660 (PEG-15, Solutol H 15), полиоксиэтилен-35-рицинолеата (CREMOPHOR® EL), соевого лецитина и полоксамера. В некоторых вариантах осуществления изобретения, композиция дополнительно включает любой из следующих полиоксиэтиленалкиловых эфиров, включая, но не ограничиваясь ими, BRIJ 58, BRIJ 35, TRITON X-100, TRITON X-114, NP40, SPAN 85 и ряд плюроников, состоящих из неионных поверхностно-активных веществ, например, PLURONIC 121. В одном конкретном варианте осуществления изобретения, поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80. В некоторых упомянутых вариантах осуществления изобретения, конечная концентрация полисорбата 80 в композиции составляет по меньшей мере от 0,0001% до 10% полисорбата 80 по массе (масс./масс.). В некоторых указанных вариантах осуществления изобретения, конечная концентрация полисорбата 80 в композиции составляет по меньшей мере от 0,001% до 1% полисорбата 80 по массе (масс./масс.). В некоторых указанных вариантах осуществления изобретения, конечная концентрация полисорбата 80 в композиции составляет по меньшей мере от 0,01% до 1% полисорбата 80 по массе (масс./масс.). В других вариантах осуществления изобретения, конечная концентрация полисорбата 80 в композиции составляет 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09% или 0,1% полисорбата 80 (масс./масс.). В другом варианте осуществления изобретения, конечная концентрация полисорбата 80 в композиции составляет 1% (масс./масс.).

В некоторых вариантах осуществления изобретения, иммуногенная композиция согласно изобретению имеет pH от 5,5 до 7,5, более предпочтительно, от 5,6 до 7,0, а еще более предпочтительно, от 5,8 до 6,0.

В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к контейнеру, заполненному любой из описанных здесь иммуногенных композиций. В одном варианте осуществления изобретения, контейнер выбран из флакона, шприца, колбы, ферментера, биореактора, пакета, сосуда, ампулы, кассеты и одноразового пера. В одном варианте осуществления изобретения, контейнер выбран из группы, состоящей из флакона, шприца, колбы, ферментера, биореактора, пакета, сосуда, ампулы, кассеты и одноразового пера. В некоторых вариантах осуществления изобретения, контейнер изготовлен из силикона. В одном из вариантов осуществления изобретения, контейнер согласно изобретению изготовлен из стекла, металлов (например, стали, нержавеющей стали, алюминия и т.п.) и/или полимеров (например, термопластов, эластомеров, термопластов-эластомеров). В одном варианте осуществления изобретения, контейнер согласно изобретению изготовлен из стекла.

В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к шприцу, заполненному любой из описанных здесь иммуногенных композиций. В некоторых вариантах осуществления изобретения, шприц изготовлен из силикона и/или из стекла.

Типичная доза иммуногенной композиции согласно изобретению для инъекции имеет объем от 0,1 мл до 2 мл, более предпочтительно от 0,2 мл до 1 мл, а еще более предпочтительно, приблизительно 0,5 мл.

Следовательно, контейнер или шприц, как определено выше, заполняют объемом от 0,1 мл до 2 мл, более предпочтительно от 0,2 мл до 1 мл, а еще более предпочтительно объемом приблизительно 0,5 мл любой из определенных здесь иммуногенных композиций.

Композиции согласно изобретению могут быть введены индивидууму одним или более известными способами, например, парентерально, через слизистую, трансдермально, внутримышечно, внутривенно, интрадермально, интраназально, подкожно, внутрибрюшинно, и эти композиции приготавливают соответствующим образом.

В одном варианте осуществления изобретения, композиции согласно изобретению вводят посредством эпидермальной инъекции, внутримышечной инъекции, внутривенной инъекции, внутриартериальной инъекции, подкожной инъекции или интра-респираторной инъекции жидкого препарата через слизистую. Композиция согласно изобретению может быть приготовлена в виде флаконов с разовой дозой, флаконов с многократными дозами или в виде предварительно заполненных шприцев.

В другом варианте осуществления изобретения, композиции согласно изобретению вводят перорально и, таким образом, ее приготавливают в форме, подходящей для перорального введения, то есть, в виде твердого или жидкого препарата. Твердые композиции для перорального введения включают таблетки, капсулы, пилюли, гранулы, драже и т.п. Жидкие композиции для перорального введения включают растворы, суспензии, дисперсии, эмульсии, масла и т.п. Фармацевтически приемлемые носители для жидких композиций представляют собой водные или безводные растворы, суспензии, эмульсии или масла. Примерами безводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и органические сложные эфиры для инъекций, такие как этилолеат.

Водные носители включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая физиологический раствор и забуференные среды. Примерами масел являются масла животного происхождения, растительного происхождения или синтетические масла, например, арахисовое масло, соевое масло, оливковое масло, подсолнечное масло, масло печени рыб, масло других морских организмов или липид из молока или яиц.

Фармацевтическая композиция может быть изотонической, гипотонической или гипертонической. Фармацевтическая композиция для инфузии или инъекции предпочтительно является, по существу, изотонической при ее введении. Для хранения, фармацевтическая композиция предпочтительно может быть изотонической или гипертонической. Если фармацевтическая композиция является гипертонической, то, для хранения, ее можно разбавить с получением изотонического раствора перед введением. Изотонический агент может представлять собой ионный изотонический агент, такой как соль, или неионный изотонический агент, такой как углевод. Примерами ионных изотонических агентов являются, но не ограничиваются ими, NaCl, CaCl₃, KCl и MgCl₂. Примерами неионных изотонических агентов являются, но не ограничиваются ими, сахароза, трегалоза, маннит, сорбит и глицерин.

Также предпочтительно, чтобы по меньшей мере одна фармацевтически приемлемая добавка представляла собой буфер. Для некоторых целей, например, если фармацевтическая композиция предназначена для инфузии или инъекции, то часто желательно, чтобы такая композиция содержала буфер, который способен забуферивать раствор до pH в пределах от 4 до 10, например, от 5 до 9, например, от 6 до 8. Так, например, буфер может быть выбран из трис-буфера, ацетатного, глутаматного, лактатного, малеатного, тартратного, фосфатного, цитратного, карбонатного, глицинатного, L-гистидинового, глицинового, сукцинатного и триэтаноламинового буфера. Кроме того, для парентерального введения, буфер может быть выбран, например, из совместимых буферов согласно USP, а в частности, если фармацевтическая композиция предназначена для парентерального введения. Так, например, буфер может быть выбран из любой из одноосновных кислот, таких как уксусная, бензойная, глюконовая, глицериновая и молочная кислоты; двухосновных кислот, таких как аконитовая, адипиновая, аскорбиновая, угольная, глутаминовая, яблочная, янтарная и винная кислоты; многоосновных кислот, таких как лимонная и фосфорная кислоты; и оснований, таких как аммиак, диэтаноламин, глицин, триэтаноламин и Трис. Носители для парентерального введения (для подкожных, внутривенных, внутриартериальных или внутримышечных инъекций) включают раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, лактат-содержащий раствор Рингера и жирные масла. Носители для внутривенного введения включают жидкие и питательные добавки, электролитные добавки, например, на основе декстрозы Рингера и т.п. Примерами являются стерильные жидкости, такие как вода и масла, с добавлением или без добавления поверхностно-активного вещества и других фармацевтически приемлемых адъювантов. Обычно, предпочтительными жидкими носителями, а в частности, носителями для растворов, вводимых в виде инъекций, являются вода, физиологический раствор, водные растворы декстрозы и родственных сахаров; гликоли, такие как пропиленгликоли или полиэтиленгликоль, полисорбат 80 (PS-80), полисорбат 20 (PS-20) и полоксамер 188 (PI 88). Примерами масел являются масла животного происхождения, растительного происхождения, или синтетические масла, например арахисовое масло, соевое масло, оливковое масло, подсолнечное масло, масло печени рыб, масло других морских организмов или липид молока или яиц.

Композиции могут дополнительно включать поверхностно-активное вещество. Предпочтительные поверхностно-активные вещества включают, но не ограничиваются ими, поверхностно-активные вещества на основе сложных эфиров полиоксиэтиленсорбитана (обычно называемые TWEEN), а особенно PS-20 и PS-80; сополимеры этиленоксида (EO), пропиленоксида (PO) и/или бутиленоксида (BO), поставляемые под торговым знаком DOWFAX™, такие как линейные блок-сополимеры EO/PO; октоксинолы, которые могут варьироваться по количеству повторяющихся этокси(окси-1,2-этандиил)-групп, причем, особый интерес представляет октоксинол-9 (TRITON X-100 или трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанол); (октилфенокси)полиэтоксиэтанол (IGEPAL CA-630/NP-40); фосфолипиды, такие как фосфатидилхолин (лецитин); этоксилаты нонилфенола, такие как соединения серии TERGITOL™ NP; простые эфиры полиоксиэтилена и жирных кислот, полученные из лаурилового, цетилового, стеарилового и олеилового спиртов (известные как поверхностно-активные вещества BRIJ), такие как монолауриловый эфир триэтиленгликоля (BRIJ 30); и сложные эфиры сорбитана (обычно известные как SPAN), такие как триолеат сорбитана (SPAN 85) и монолаурат сорбитана. Предпочтительным поверхностно-активным веществом для включения в эмульсию является PS-20 или PS-80. Могут быть использованы смеси поверхностно-активных веществ, например, смеси PS-80/SPAN 85. Также подходящей является комбинация сложного эфира полиоксиэтиленсорбитана, такого как моноолеат полиоксиэтиленсорбитана (PS-80), и октоксинола, такого как трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанол (TRITON X-100). Другая подходящая комбинация включает лаурет 9 плюс сложный эфир полиоксиэтиленсорбитана и/или октоксинол.

Композиция может также включать физиологический раствор, забуференый до нужного рН. Буфер может быть выбран, например, из Триса, ацетата, глутамата, лактата, малеата, тартрата, фосфата, цитрата, карбоната, глицината, L-гистидина, глицина, сукцината, HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-l-пиперазинэтансульфоновой кислоты), MOPS (3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты), MES (2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты) и триэтаноламина. Буфер может забуферивать раствор до pH в пределах от 4 до 10, от 5,2 до 7,5 или от 5,8 до 7,0. В некоторых аспектах изобретения, буфер выбран из фосфата, сукцината, L-гистидина, MES, MOPS, HEPES, ацетата или цитрата. Кроме того, для парентерального введения, буфер может быть выбран, например, из совместимых буферов согласно USP, а в частности, если фармацевтическая композиция предназначена для парентерального введения. Концентрация буфера может варьироваться от 1 до 50 мМ или от 5 до 50 мМ. В некоторых аспектах изобретения, буфер представляет собой L-гистидин в конечной концентрации от 5 до 50 мМ или сукцинат в конечной концентрации от 1 до 10 мМ. В некоторых аспектах изобретения, конечная концентрация L-гистидина составляет 20 мМ ± 2 мМ.

Хотя физиологический раствор (то есть, раствор, включающий NaCl) является предпочтительным, однако, для приготовления композиции могут быть использованы и другие соли, которыми являются, но не ограничиваются ими, CaCl₃, KCl и MgCl₂ и их комбинации. Вместо соли могут быть использованы неионные изотонические агенты, включая, но не ограничиваясь ими, сахарозу, трегалозу, маннит, сорбит и глицерин. Подходящие концентрации солей включают, но не ограничиваются ими, от 25 до 500 мМ или от 40 до 170 мМ. В одном аспекте изобретения, физиологический раствор представляет собой NaCl, необязательно присутствующий в концентрации от 20 мМ до 170 мМ. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, композиции содержат L-гистидиновый буфер с хлоридом натрия.

В другом варианте осуществления изобретения, фармацевтическая композиция доставляется в системе с регулируемым высвобождением. Так, например, агент может быть введен с помощью внутривенного вливания, трансдермального пластыря, липосом или других средств для введения. В другом варианте осуществления изобретения, полимерные материалы используют, например, в микросферах или в имплантате.

Активность

В одном варианте осуществления изобретения, описанный здесь сахарид способен индуцировать опсоническую активность. В другом варианте осуществления изобретения, описанный здесь сахарид способен индуцировать опсоническую и фагоцитарную активность (например, опсонофагоцитарную активность).

Авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что сахариды, имеющие повышенное число повторяющихся звеньев по сравнению с соответствующим сахаридом дикого типа, вызывают усиление иммунного ответа у млекопитающих по сравнению с сахаридами дикого типа. Авторами настоящего изобретения было также неожиданно обнаружено, что композиции, включающие конъюгат, который содержит белок-носитель и сахарид, имеющий повышенное число повторяющихся звеньев по сравнению с соответствующим сахаридом дикого типа, индуцируют усиление иммунного ответа у млекопитающих по сравнению с млекопитающими, которым вводили композицию, включающую конъюгат, содержащий белок-носитель и соответствующий сахарид дикого типа. Не ограничиваясь какими-либо конкретными механизмами или теориями, авторы лишь отмечают, что сахариды, имеющие увеличенное число повторяющихся звеньев, могут иметь увеличенное число консервативных эпитопов, что может приводить к усилению иммунного ответа.

Опсоническая активность или опсонизация относятся к процессу, посредством которого опсонин (например, антитело или фактор комплемента) связывается с антигеном (например, с сахаридом или с его конъюгатом, описанным в настоящей заявке), что облегчает присоединение антигена к фагоциту или к фагоцитарной клетке (например, к макрофагу, дендритной клетке и полиморфо-ядерному лейкоциту (PMNL). Некоторые бактерии, такие как, например, инкапсулированные бактерии, которые обычно не подвергаются фагоцитозу из-за присутствия капсулы, с большей вероятностью распознаются фагоцитами при покрытии опсоническим антителом. В одном варианте осуществления изобретения, сахарид индуцирует иммунный ответ, такой как, например, вырабатывание антитела, которое является опсоническим. В одном варианте осуществления изобретения, опсоническая активность направлена против грамотрицательных бактерий, а предпочтительно против видов Echerichia, а еще более предпочтительно, против по меньшей мере одного штамма E. coli.

Фагоцитарная активность или фагоцитоз относится к процессу, посредством которого фагоцитарная клетка поглощает вещество и заключает его в свою цитоплазму. В одном варианте осуществления изобретения, сахарид индуцирует иммунный ответ, такой как, например, вырабатывание антитела, которое способствует фагоцитозу. В одном варианте осуществления изобретения, фагоцитарная активность направлена против грамотрицательных бактерий, предпочтительно против видов Echerichia, а более предпочтительно против по меньшей мере одного штамма E. coli. Так, например, кроличьи антитела, продуцируемые против описанного здесь выделенного сахарида, могут опосредовать опсонофагоцитоз, а в частности, штамма, экспрессирующего сахарид, в присутствии комплемента, как показано, например, с помощью анализа на фагоцитоз in vitro.

В еще одном варианте осуществления изобретения, описанный здесь сахарид способен вызывать бактерицидный иммунный ответ. В одном варианте осуществления изобретения, бактерицидная активность направлена против грамотрицательных бактерий, предпочтительно против видов Echerichia, а более предпочтительно против по меньшей мере одного штамма E. coli.

Способы оценки опсонизации, фагоцитоза и/или бактерицидной активности известны специалистам, и могут быть осуществлены, например, путем измерения снижения бактериальной нагрузки in vivo (например, путем измерения уровней бактериемии у млекопитающих, зараженных Echerichia) и/или путем оценки степени уничтожения бактериальных клеток in vitro (например, посредством опсонофагоцитарного анализа in vitro). В одном варианте осуществления изобретения, сахарид способен вызывать опсоническую, фагоцитарную и/или бактерицидную активность по сравнению с соответствующим контролем, например, по сравнению с антисывороткой против термоинактивированных грамотрицательных бактерий.

Опсонофагоцитарный анализ, который позволяет выявить уничтожение клеток E. coli фагоцитарными эффекторными клетками в присутствии функциональных антител и комплемента, может быть альтернативным анализом для оценки эффективности вакцин E. coli по отношению к конкретному серотипу E. coli, например, для E. coli серотипа O25B. Опсонофагоцитарные анализы in vitro могут быть проведены путем совместного инкубирования смеси клеток E. coli, тестируемой термоинактивированной человеческой сыворотки, дифференцированных клеток HL-60 (фагоцитов) и источника экзогенного комплемента (например, комплемента, взятого у детенышей кроликов). Опсонофагоцитоз происходит во время инкубирования, и бактериальные клетки, покрытые антителами и комплементом, погибают при опсонофагоцитозе. Колониеобразующие единицы (КОЕ) выживших бактерий, которые ускользают от опсонофагоцитоза, определяют путем посева смеси для анализа. OPA-титр определяют как обратное разведение, которое приводит к снижению количества бактерий на 50% по сравнению с контрольными лунками без тестируемой сыворотки. OPA-титр интерполируется из двух разведений, которые охватывают этот 50%-ный порог уничтожения.

Конечная точка титра 1:8 или выше считается положительным результатом для анализа на уничтожение типа OPA.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, индивидуумы могут иметь серотип-специфические OPA-титры до вакцинации, например, из-за природного воздействия E. coli (например, у взрослых индивидуумов).

В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция согласно изобретению значительно увеличивает долю респондентов (то есть индивидуумов с сывороткой, имеющей титр по меньшей мере 1:8, как было определено с помощью ОРА in vitro) по сравнению с предварительно иммунизованной группой.

Сравнение OPA-активности сыворотки до и после иммунизации с иммуногенной композицией согласно изобретению может быть также осуществлено путем сравнения потенциального увеличения OPA-титров.

Следовательно, может быть проведено сравнение OPA-активности сыворотки до и после иммунизации с иммуногенной композицией согласно изобретению и сравнение их ответов на конкретный серотип E. coli, например, на серотип E. coli O25B, для оценки потенциального увеличения OPA-титров. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенные композиции согласно изобретению способны значительно увеличивать OPA-титр у людей по сравнению с предварительно иммунизованной группой.

В одном аспекте изобретения, композиция индуцирует иммунный ответ по меньшей мере против одного серотипа E. coli. Серотип E. coli может представлять собой любой серотип, включая, например, любой из следующих серотипов E. coli: O1 (например, O1A, O1B и O1C), O2, O3, O4 (например, O4:K52 и O4:K6), O5 (например, O5ab и O5aс (штамма 180/C3)), O6 (например, O6: K2; K13; K15 и O6:K54), O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18 (например, O18A, O18aс, O18A1, O18B и O18B1), O19, O20, O21, O22, O23 (например, O23A), O24, O25 (например, O25a и O25b), O26, O27, O28, O29, O30, O32, O33, O34, O35, O36, O37, O38, O39, O40, O41, O42, O43, O44, O45 (например, O45 и O45rel), O46, O48, O49, O50, O51, O52, O53, O54, O55, O56, O57, O58, O59, O60, O61, O62, 62D₁, O63, O64, O65, O66, O68, O69, O70, O71, O73 (например, O73 (штамма 73-1)), O74, O75, O76, O77, O78, O79, O80, O81, O82, O83, O84, O85, O86, O87, O88, O89, O90, O91, O92, O93, O95, O96, O97, O98, O99, O100, O101, O102, O103, O104, O105, O106, O107, O108, O109, O110, 0111, O112, O113, O114, O115, O116, O117, O118, O119, O120, O121, O123, O124, O125, O126, O127, O128, O129, O130, O131, O132, O133, O134, O135, O136, O137, O138, O139, O140, O141, O142, O143, O144, O145, O146, O147, O148, O149, O150, O151, O152, O153, O154, O155, O156, O157, O158, O159, О160, O161, O162, O163, O164, O165, O166, O167, O168, O169, O170, O171, O172, O173, O174, O175, O176, O177, O178, O179, O180, O181, O182, O183, O184, О185, O186 и O187. В одном варианте осуществления изобретения, серотипом является O25a. В другом варианте осуществления изобретения, серотипом является O25b. В другом варианте осуществления изобретения, серотипом является O1A. В другом варианте осуществления изобретения, серотипом является O2. В другом варианте осуществления изобретения, серотипом является O6. В другом варианте осуществления изобретения, серотипом является O6. В другом варианте осуществления изобретения, серотипом является O17. В другом варианте осуществления изобретения, серотипом является O15. В другом варианте осуществления изобретения, серотипом является O18A. В другом варианте осуществления изобретения, серотипом является O75. В другом варианте осуществления изобретения, серотипом является O4. В другом варианте осуществления изобретения, серотипом является O16. В другом варианте осуществления изобретения, серотипом является O13. В другом варианте осуществления изобретения, серотипом является O7. В другом варианте изобретения, серотипом является O8.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, композиция индуцирует иммунный ответ против по меньшей мере двух серотипов E. coli. В другом варианте осуществления изобретения, композиция индуцирует иммунный ответ против по меньшей мере 3 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция индуцирует иммунный ответ против по меньшей мере 4 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция включает О-антиген от 5 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция индуцирует иммунный ответ против по меньшей мере 6 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция индуцирует иммунный ответ против по меньшей мере 7 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция вызывает иммунный ответ против по меньшей мере 8 различных серотипов E. coli. В одном варианте изобретения, осуществления композиция индуцирует иммунный ответ против по меньшей мере 9 различных E. coli серотипы. В одном варианте осуществления изобретения, композиция вызывает иммунный ответ против по меньшей мере 10 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция индуцирует иммунный ответ против по меньшей мере 11 различных серотипов E. coli. В одном варианте осуществления изобретения, композиция индуцирует иммунный ответ против по меньшей мере 12 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения, композиция индуцирует иммунный ответ против по меньшей мере 13 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения, композиция вызывает иммунный ответ против по меньшей мере 14 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения, композиция индуцирует иммунный ответ против по меньшей мере 15 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения, композиция индуцирует иммунный ответ против по меньшей мере 16 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения, композиция индуцирует иммунный ответ против по меньшей мере 17 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения, композиция индуцирует иммунный ответ против по меньшей мере 18 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения, композиция вызывает иммунный ответ против по меньшей мере 19 различных серотипов. В одном варианте осуществления изобретения, композиция вызывает иммунный ответ против по меньшей мере 20 различных серотипов.

В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция согласно изобретению вырабатывает антитела IgG у человека, где указанные антитела способны связываться со специфическим сахаридом серотипа E. coli, таким как, например, сахарид E. coli серотипа O25B, как было определено с помощью ELISA. Предпочтительно, повышенный иммунный ответ может включать увеличение уровня продуцирования IgG1, и/или IgG2a, и/или IgM.

В методе ELISA (твердофазного иммуноферментного анализа), антитела из сыворотки вакцинированных индивидуумов инкубируют с полисахаридами, адсорбированными на твердом носителе. Связанные антитела детектируют с использованием вторых детектирующих антител, конъюгированных с ферментом. ELISA-анализ позволяет определять типоспецифические антитела IgG против сахарида E. coli, присутствующие в человеческой сыворотке. При разведении человеческой сыворотоки, добавляемой в микротитрационные планшеты, покрытые типоспецифическим полисахаридом, антитела, специфичные для этого полисахарида, связываются с микротитрационными планшетами. Антитела, связанные с планшетами, детектирют с использованием козьего антитела против человеческого IgG, меченного щелочной фосфатазой, с последующим использованием субстрата п-нитрофенилфосфата. Оптическая плотность окрашенного конечного продукта пропорциональна количеству антитела против полисахаридного О-антигена, присутствующего в сыворотке.

В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция согласно изобретению значительно увеличивает OPA-титры у человека против E. coli серотипов O25B, O1, O2 и O6 по сравнению с группой перед иммунизацией.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, композиция согласно изобретению является эффективной для повышения уровня продуцирования антител против E. coli у млекопитающего до уровня среднего геометрического титра (GMT), составляющего по меньшей мере 1000, предпочтительно по меньшей мере 5000 и до 200000 после введения начальной дозы, например, приблизительно через 30 дней после введения начальной дозы, а предпочтительно приблизительно через 60 дней после введения начальной дозы. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, композиция является эффективной для повышения уровня продуцирования антител против E. coli серотипа O25B у млекопитающего до уровня среднего геометрического титра (GMT), составляющего по меньшей мере 1000, предпочтительно по меньшей мере 5000 и до 200000 после введения начальной дозы.

В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция продуцирует антитела IgG у человека, где указанные антитела способны связываться с серотипом E. coli, соответствующим повторяющемуся звену сахарида в композиции. Так, например, композиция может продуцировать антитела IgG в концентрации по меньшей мере 0,2 пг/мл, 0,3 пг/мл, 0,35 пг/мл, 0,4 пг/мл или 0,5 пг/мл, как было определено с помощью ELISA-анализа. Следовательно, может быть проведено сравнение OPA-активности сыворотки до и после иммунизации иммуногенной композицией согласно изобретению и сравнение их ответа на соответствующий серотип для оценки потенциального увеличения числа респондентов. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция продуцирует антитела IgG у человека, где указанные антитела способны уничтожать серотип E. coli, соответствующий повторяющемуся звену сахарида в композиции, как было определено с помощью опсонофагоцитарного анализа in vitro. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция продуцирует у человека функциональные антитела, где указанные антитела способны уничтожать E. coli серотипа соответствующего повторяющемуся звену сахарида в композиции, как было определено с помощью опсонофагоцитарного анализа in vitro. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция согласно изобретению повышает число респондентов (то есть индивидуумов с сывороткой, имеющей титр по меньшей мере 1:8, как было определено с помощью ОРА in vitro), у которых наблюдается иммунный ответ на E. coli серотипа, соответствующего повторяющемуся звену сахарида в композиции, по сравнению с группой до иммунизации. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция дает титр по меньшей мере 1:8 против E. coli серотипа, соответствующего повторяющемуся звену сахарида в композиции, по меньшей мере у 50% индивидуумов, как было определено с помощью анализа на уничтожение опсонофагоцитов in vitro. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция согласно изобретению дает титр по меньшей мере 1:8 против E. coli серотипа, соответствующего повторяющемуся звену сахарида в композиции, по меньшей мере у 60%, 70%, 80% или по меньшей мере 90% индивидуумов, как было определено с помощью анализа на уничтожение опсонофагоцитов in vitro. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция согласно изобретению значительно увеличивает число респондентов в группе (то есть у индивидуума с сывороткой, имеющей титр по меньшей мере 1:8, как было определено с помощью ОРА in vitro), у которых вырабатывается ответ против E. coli серотипа, соответствующего повторяющемуся звену сахарида в композиции, по сравнению с группой до иммунизации. В одном варианте осуществления изобретения, иммуногенная композиция согласно изобретению значительно увеличивает OPA-титры у человека против E. coli серотипа, соответствующего повторяющемуся звену сахарида в композиции, по сравнению с группой до иммунизации.

Способы

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способам профилактики инфекции у индивидуума, например, человека, где указанные способы включают введение индивидууму эффективного количества композиции (например, иммуногенной композиции), описанной в настоящей заявке.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способам лечения инфекции у индивидуума, например, у человека, где указанные способы включают введение индивидууму эффективного количества композиции (например, иммуногенной композиции), описанной в настоящей заявке.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способам индуцирования иммунного ответа у индивидуума, например, у человека, где указанные способы включают введение индивидууму эффективного количества композиции (например, иммуногенной композиции), описанной в настоящей заявке.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способам инициации продуцирования опсонофагоцитарных антител у индивидуума, например, у человека, где указанные способы включают введение индивидууму эффективного количества композиции (например, иммуногенной композиции), описанной в настоящей заявке.

Используемый здесь термин «эффективное количество», если он относится к введению описанной здесь композиции индивидууму, означает количество композиции, которое дает профилактический(е) и/или терапевтический(е) эффект(ы). В некоторых вариантах осуществления изобретения, «эффективное количество» означает количество композиции, которое является достаточным для достижения по меньшей мере одного, двух, трех, четырех или более из следующих эффектов: (i) уменьшения или ослабления тяжести инфекции E. coli или ассоциированных с ней симптомов; (ii) снижения продолжительности инфекционного заболевания, вызываемого E. coli или ассоциированных с ним симптомов; (iii) профилактики прогрессирования инфекции E. coli или ассоциированных с ней симптомов; (iv) индуцирования регрессии инфекции E. coli или ассоциированных с ней симптомов; (v) профилактики развития или возникновения инфекции E. coli или ассоциированных с ней симптомов; (vi) профилактики рецидива инфекции E. coli или ассоциированных с ней симптомов; (vii) снижения недостаточности органов, ассоциированной с инфекцией E. coli; (viii) снижения числа госпитализированных индивидуумов, инфицированных E. coli; (ix) сокращения продолжительности госпитализации индивидуума, инфицированного E. coli; (x) повышения продолжительности жизни индивидуума с инфекцией E. coli; (xi) устранения инфекции E. coli у индивидуума; (xii) ингибирования или снижения репликации E. coli у индивидуума; и/или (xiii) повышения или улучшения профилактического(их) или терапевтического(их) эффекта(ов) другой терапии.

В одном из вариантов осуществления изобретения, описанные здесь иммуногенные композиции предназначены для их использования в качестве лекарственного средства. Описанные здесь иммуногенные композиции могут быть использованы в различных способах терапии или профилактики для предотвращения, лечения или облегчения бактериальной инфекции, бактериального заболевания или состояния у индивидуума. В частности, описанные здесь иммуногенные композиции могут быть использованы для профилактики, лечения или ослабления инфекции E. coli, заболевания или состояния, ассоциированного с E. coli у индивидуума.

Таким образом, в одном своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу профилактики, лечения или ослабления инфекции, заболевания или состояния, ассоциированного с E. coli, у индивидуума, где указанный способ включает введение индивидууму иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции согласно изобретению.

В одном своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу профилактики, лечения или ослабления инфекции, заболевания или состояния, ассоциированного с E. coli, у индивидуума, где указанный способ включает введение индивидууму иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции согласно изобретению.

В одном аспекте, настоящее изобретение относится к способу индуцирования иммунного ответа на E. coli у индивидуума, включающему введение индивидууму иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции согласно изобретению.

В одном аспекте изобретения, иммуногенные композиции согласно изобретению предназначены для их использования в способе профилактики, лечения или ослабления инфекции, заболевания или состояния, вызываемого E. coli, у индивидуума. В другом аспекте изобретения, композиции согласно изобретению предназначены для их использования в способе защиты млекопитающего от инфекции, заболевания или состояния, вызываемого E. coli.

В одном варианте осуществления изобретения, любая из описанных здесь иммуногенных композиций предназначена для ее использования в способе иммунизации индивидуума против инфекции E. coli.

В одном своем аспекте, настоящее изобретение относится к применению описанной здесь иммуногенной композиции в целях приготовления лекарственного средства для профилактики, лечения или ослабления инфекции, заболевания или состояния, вызываемого E. coli, у индивидуума.

В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к применению описанной здесь иммуногенной композиции в целях приготовления лекарственного средства для иммунизации индивидуума против инфекции, вызываемой E. coli.

В одном из вариантов осуществления изобретения, описанные здесь иммуногенные композиции предназначены для их использования в качестве вакцины. Более конкретно, описанные здесь иммуногенные композиции могут быть использованы для профилактики инфекций E. coli у индивидуума. Таким образом, в одном своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу профилактики инфекции, вызываемой E. coli у индивидуума, где указанный способ включает введение индивидууму иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции согласно изобретению.

В некоторых таких вариантах, инфекция выбрана из инфекции мочевых путей, холецистита, холангита, диареи, гемолитическо-уремического синдрома, неонатального менингита, уросепсиса, внутрибрюшной инфекции, менингита, осложненной пневмонии, раневой инфекции, осложнений инфекции, связанной с биопсией предстательной железы, неонатального/детского сепсиса, нейтропенической лихорадки, пневмонии, бактериемии и сепсиса, а также других инфекций кровотока. Так, например, серотипы E. coli, которые ассоциированы с неонатальным менингитом, включают серотипы O1, O6, O7, O16, O18 и O83. Соответственно, в одном варианте осуществления изобретения, композиция включает конъюгат, который содержит сахарид, имеющий структуру, выбранную из Формулы O1, Формулы O6, Формулы O7, Формулы O16, Формулы O18, Формулы O83 и любой комбинации их конъюгатов. В другом примере, серотипы E. coli, которые ассоциированы с бактериемией, включают серотипы O1, O2, O6, O15 и O75. Соответственно, в другом варианте осуществления изобретения, композиция включает по меньшей мере один конъюгат, который содержит сахарид, имеющий структуру, выбранную из Формул О1, О2, О6, О15 и О75, и любую комбинацию таких конъюгатов. В качестве еще одного примера могут служить идентифицированные штаммы E. coli O1 и O2, такие как O1:K1:H7 или O2:K1:H4, O2:K1:H5, O2:K1:H6 и O2:K1:H7 как возбудители инфекции мочевых путей, сепсиса и неонатального менингита у людей и животных. Обе серогруппы O1 и O2 составляют большинство штаммов, вызывающих бактериемию и сепсис у людей. В соответствии с этим, в одном варианте осуществления изобретения, композиция включает конъюгат, который содержит сахарид, имеющий Формулу O1, и конъюгат, который содержит сахарид, имеющий Формулу O2.

В соответствии с этим, при повышении иммунного ответа у млекопитающего посредством таких применений и способов, у млекопитающего может вырабатываться иммунитет против инфекции E. coli, включая штаммы ExPEC и не-ExPEC. Настоящее изобретение является особенно полезным для обеспечения широкой защиты от патогенных E. coli, включая кишечные патотипы, такие как патотипы EPEC, EAEC, EIEC, ETEC и DAEC. Таким образом, млекопитающее может быть защищено от заболеваний, включая, но не ограничиваясь ими, перитонит, пиелонефрит, цистит, эндокардит, простатит, инфекции мочевых путей (ИМП), менингит (особенно неонатальный менингит), сепсис (или SIRS), обезвоживание, пневмонию, диарею (диарею у младенцев, у туристов, острую диарею, стойкую диарею и т.п.), бактериальную дизентерию, гемолитическо-уремический синдром (ГУС), перикардит, бактериурию и т.п.

В одном из аспектов изобретения, вакцинируемым индивидуумом является млекопитающее, такое как человек, кошка, овца, свинья, лошадь, корова или собака. Предпочтительно, вакцинируемым индивидуумом является человек. Если вакцина предназначена для профилактического применения, то человеком предпочтительно является ребенок (например, ребенок раннего возраста или младенец), подросток или взрослый; а если вакцина предназначена для терапевтического применения, то человеком предпочтительно является подросток или взрослый. Вакцина, предназначенная для детей, может быть также введена взрослым, например, для оценки безопасности, дозировки, иммуногенности и т.п.

Вакцины согласно изобретению могут быть использованы для лечения как детей, так и взрослых. Таким образом, возраст пациента может составлять менее, чем 1 год, 1-5 лет, 5-15 лет, 15-55 лет или по меньшей мере 55 лет. Предпочтительными пациентами для вакцинации являются пожилые люди (например, в возрасте ≥50 лет, ≥60 лет, а предпочтительно ≥65 лет), дети (например, ≤5 лет), госпитализированные пациенты, медицинские работники, военнослужащие и военный персонал, беременные женщины, больные с хроническими заболеваниями или пациенты с иммунодефицитом. Однако, вакцины подходят не только для этих групп и могут быть использованы для большего числа групп среди населения.

Вакцины согласно изобретению являются особенно полезными для пациентов, которым предстоит хирургическая операция, или для других пациентов, проходящих лечение в стационарах. Они также полезны для пациентов, которым предстоит катетеризация. Они также полезны для девочек-подростков (например, в возрасте 11-18 лет) и для пациентов с хроническими инфекциями мочевых путей.

В одном из вариантов осуществления изобретения, описанные здесь иммуногенные композиции вводят внутримышечно, внутрибрюшинно, интрадермально или подкожно. В одном из вариантов осуществления изобретения, описанные здесь иммуногенные композиции вводят путем внутримышечной, внутрибрюшинной, интрадермальной или подкожной инъекции. В одном из вариантов осуществления изобретения, описанные здесь иммуногенные композиции вводят путем внутримышечной или подкожной инъекции.

В одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится к способу, включающему стадии (i) инъекции индивидууму иммунологически эффективного количества любой из определенных здесь иммуногенных композиций; (ii) сбора пробы сыворотки у указанного индивидуума; (iii) тестирования указанной пробы сыворотки на опсонофагоцитарную активность против E. coli серотипа O25B с помощью in vitro анализа на уничтожение опсонофагоцитов (OPA).

Индивидуумы

Как раскрывается в настоящей заявке, описанные здесь иммуногенные композиции могут быть использованы в различных способах терапии или профилактики для предотвращения, лечения или ослабления бактериальной инфекции, бактериального заболевания или состояния у индивидуума.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, указанным индивидуумом является человек. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения, указанным индивидуумоя является новорожденный (то есть в возрасте до трех месяцев), младенец (то есть, в возрасте от 3 месяцев до одного года) или ребенок раннего возраста (то есть, от одного года до четырех лет).

В одном из вариантов осуществления изобретения, описанные здесь иммуногенные композиции предназначены для использования в качестве вакцины.

В одном из вариантов осуществления изобретения, вакцинируемый индивидуум может быть моложе 1 года. Так, например, индивидуум, который должен быть вакцинирован, может быть в возрасте приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11 или приблизительно 12 месяцев. В одном из вариантов осуществления изобретения, возраст вакцинируемого индивидуума составляет приблизительно 2, 4 или 6 месяцев. В другом варианте осуществления изобретения, возраст вакцинируемого индивидуума составляет менее, чем 2 года. Так, например, индивидуум, подлежащий вакцинации, может быть в возрасте приблизительно от 12 до приблизительно 15 месяцев. В некоторых случаях, требуется всего одна доза иммуногенной композиции согласно изобретению, но в некоторых случаях, может быть введена вторая, третья или четвертая доза.

В одном из вариантов осуществления изобретения, вакцинируемый индивидуум может быть моложе 18 лет. Так, например, индивидуум, который должен быть вакцинирован, может быть в возрасте приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16 или приблизительно 17 лет. Так, например, индивидуум, подлежащий вакцинации, может быть в возрасте приблизительно от 10 до приблизительно 18 лет. В некоторых случаях, требуется всего одна доза иммуногенной композиции согласно изобретению, но в некоторых случаях, может быть введена вторая, третья или четвертая доза.

В другом варианте осуществления изобретения, вакцинируемый индивидуум может быть человеком в возрасте 18 лет или старше. Так, например, индивидуум, подлежащий вакцинации, может быть в возрасте приблизительно от 18 до приблизительно 50 лет. В некоторых случаях, требуется всего одна доза иммуногенной композиции согласно изобретению, но в некоторых случаях, может быть введена вторая, третья или четвертая доза.

В одном из вариантов настоящего изобретения, вакцинируемым индивидуумом является человек в возрасте 50 лет или старше, а более предпочтительно, человек в возрасте 55 лет или старше. В одном из вариантов осуществления изобретения, вакцинируемым индивидуумом является человек в возрасте 65 лет или старше, 70 лет или старше, 75 лет или старше или 80 лет или старше. В одном из вариантов осуществления изобретения, вакцинируемым индивидуумом является человек с ослабленным иммунитетом. Индивидуум с ослабленным иммунитетом обычно определяется как человек, у которого наблюдается ослабленная или пониженная способность вырабатывать нормальную гуморальную или клеточную защиту от воздействия инфекционных агентов.

В одном из вариантов осуществления изобретения, индивидуум с ослабленным иммунитетом, который должен быть вакцинирован, страдает заболеванием или состоянием, которое ослабляет иммунную систему и приводит к гуморальному ответу, который является недостаточным для защиты или лечения от инфекции мочевых путей.

В одном из вариантов осуществления изобретения, указанное заболевание представляет собой первичное иммунодефицитное расстройство. Предпочтительно, указанное первичное иммунодефицитное расстройство выбрано из комбинированных иммунодефицитов Т- и В-клеток, дефицита антител, четко определенных синдромов, заболеваний, вызываемых нарушением регуляции иммунной системы, фагоцитарных расстройств, врожденного дефицита иммунитета, аутовоспалительных расстройств и дефицита комплемента.

В конкретном варианте осуществления изобретения, индивидуум с ослабленным иммунитетом, который должен быть вакцинирован, страдает заболеванием, выбранным из: ВИЧ-инфекции, синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД’а), рака, хронических сердечных или легочных заболеваний, застойной сердечной недостаточности, сахарного диабета, хронической заболевания печени, алкоголизма, цирроза, утечки спинномозговой жидкости, кардиомиопатии, хронического бронхита, эмфиземы, хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), дисфункции селезенки (например, серповидноклеточной анемии), нарушения функции селезенки (асплении), злокачественного новообразования крови, лейкоза, множественной миеломы, болезни Ходжкина, лимфомы, почечной недостаточности, нефротического синдрома и астмы.

В одном из вариантов настоящего изобретения, вакцинируемый индивидуум страдает от нарушения питания.

В одном из вариантов настоящего изобретения, индивидуум, который должен быть вакцинирован, принимает лекарственное средство или проходит лечение, которое снижает устойчивость организма к инфекции.

В одном из вариантов настоящего изобретения, вакцинируемый индивидуум является курильщиком.

В одном из вариантов настоящего изобретения, индивидуум, который должен быть вакцинирован, имеет количество лейкоцитов (число лейкоцитов) менее 5 × 10⁹ клеток на литр, или менее 4 × 10⁹ клеток на литр, или менее 3 × 10⁹ клеток на литр, или менее 2 × 10⁹ клеток на литр, или менее 1 × 10⁹ клеток на литр, или менее 0,5 × 10⁹ клеток на литр, или менее 0,3 × 10⁹ клеток на литр, или менее 0,1 × 10⁹ клеток на литр.

Количество лейкоцитов (число лейкоцитов) означает количество лейкоцитов (WBC) в крови. Уровень лейкоцитов обычно определяют как часть общего анализа крови (CBC). Лейкоциты представляют собой клетки крови, борющиеся с инфекциями, и эти клетки отличаются от красных кровяных (переносящих кислород) клеток, известных как эритроциты. Существуют различные типы лейкоцитов, включая нейтрофилы (полиморфоядерные лейкоциты; PMN), палочкоядерные клетки (почти незрелые нейтрофилы), лимфоциты T-типа (T-клетки), лимфоциты B-типа (B-клетки), моноциты, эозинофилы и базофилы. В число лейкоцитов входят лейкоциты всех типов. Количество лейкоцитов обычно составляет в пределах от 4300 до 10800 клеток на кубический миллиметр крови. Это может также называться числом лейкоцитов и может быть выражено в Международных единицах, составляющих 4,3-10,8 × 10⁹ клеток на литр.

В одном из вариантов осуществления изобретения, вакцинируемый индивидуум страдает нейтропенией. Так, например, у индивидуума, подлежащего вакцинации, число нейтрофилов может составлять менее 2 × 10⁹ клеток на литр, или менее 1 × 10⁹ клеток на литр, или менее 0,5 × 10⁹ клеток на литр, или менее 0,1 × 10⁹ клеток на литр, или менее 0,05 × 10⁹ клеток на литр.

Низкое количество лейкоцитов или «нейтропения» означает состояние, характеризующееся аномально низким уровнем нейтрофилов в кровотоке. Нейтрофилы представляют собой особый вид лейкоцитов, которые помогают предотвращать инфекцию и бороться с нею. Наиболее частой причиной возникновения нейтропении у онкологических больных является побочный эффект химиотерапии. Нейтропения, вызванная химиотерапией, увеличивает риск инфицирования пациента и препятствует лечению рака.

В одном из вариантов осуществления изобретения, у индивидуума, который должен быть вакцинирован, число CD4⁺-клеток составляет менее 500/мм³, либо число CD4⁺-клеток составляет менее 300/мм³, либо число CD4⁺-клеток составляет менее 200/мм³, либо число CD4⁺-клеток составляет менее 100/мм³, либо число CD4⁺-клеток составляет менее 75/мм³, либо число CD4⁺-клеток составляет менее 50/мм³.

Тесты на CD4⁺-клетки обычно указывают на число клеток в мм³. Нормальное количество CD4-клеток составляет от 500 до 1600, а CD8-клеток - от 375 до 1100. Количество CD4-клеток резко сокращается у людей с ВИЧ.

В варианте осуществления изобретения, любым из описанных здесь индивидуумов с ослабленным иммунитетом является мужчина или женщина.

Схема лечения

В некоторых случаях, эффективной является всего одна доза иммуногенной композиции согласно изобретению, а в других случаях, таких как более высокий уровень иммунодефицита, может быть введена вторая, третья или четвертая доза. После первоначальной вакцинации, индивидуумам может быть проведена одна или несколько бустер-иммунизаций с адекватным интервалом.

В одном из вариантов осуществления изобретения, схема вакцинации иммуногенной композицией согласно изобретению представляет собой введение одной дозы. В другом варианте осуществления изобретения, указанная схема введения одной дозы предназначена для здоровых людей в возрасте по меньшей мере 2 года.

В одном из вариантов осуществления изобретения, схема вакцинации иммуногенной композицией согласно изобретению представляет собой схему многократного введения доз. В другом варианте осуществления изобретения, указанная схема многократного введения доз включает схему введения 2 доз с интервалом приблизительно от 1 месяца до приблизительно 2 месяцев. В одном варианте осуществления изобретения, указанная схема многократного введения доз включает схему введения 2 доз с интервалом приблизительно в 1 месяц или схему введения 2 доз с интервалом приблизительно 2 месяца.

В другом варианте осуществления изобретения, указанная схема многократного введения доз включает схему введения 3 доз с интервалом приблизительно от 1 месяца до приблизительно 2 месяцев. В другом варианте осуществления изобретения, указанная схема многократного введения доз включает схему введения 3 доз с интервалом приблизительно в 1 месяц, или схему введения 3 доз с интервалом приблизительно в 2 месяца.

В другом варианте осуществления изобретения, указанная схема многократного введения доз включает схему введения 3 доз с интервалом приблизительно от 1 месяца до приблизительно 2 месяцев с последующим введением четвертой дозы приблизительно через 10-13 месяцев после введения первой дозы. В другом варианте осуществления изобретения, указанная схема многократного введения доз включает схему введения 3 доз с интервалом приблизительно в 1 месяц с последующим введением четвертой дозы приблизительно через 10-13 месяцев после введения первой дозы, или схему введения 3 доз с интервалом приблизительно в 2 месяца с последующим введением четвертой дозы приблизительно через 10-13 месяцев после введения первой дозы.

В одном из вариантов осуществления изобретения, схема многократного введения доз включает введение ребенку раннего возраста по меньшей мере одной дозы (например, 1, 2 или 3 доз) в первый год жизни, с последующим введением ему по меньшей мере еще одной дозы.

В одном варианте осуществления изобретения, схема многократного введения доз включает схему введения ребенку раннего возраста 2 доз или 3 доз с интервалом приблизительно от 1 месяца до приблизительно 2 месяцев (например, 28-56 дней между введением доз), начиная с 2-месячного возраста, с последующим введением дозы этому ребенку в возрасте 12-18 месяцев. В одном из вариантов осуществления изобретения, указанная схема многократного введения доз включает схему введения ребенку раннего возраста 3 доз с интервалом приблизительно от 1 месяца до 2 месяцев (например, 28-56 дней между введением доз), начиная с 2-месячного возраста, с последующим введением дозы этому ребенку в возрасте 12-15 месяцев. В другом варианте осуществления изобретения, указанная схема многократного введения доз включает схему введения ребенку раннего возраста 2 доз с интервалом приблизительно 2 месяца, начиная с 2-месячного возраста, с последующим введением дозы этому ребенку в возрасте 12-18 месяцев.

В одном из вариантов осуществления изобретения, схема многократного введения доз включает серию введения 4 доз вакцины в возрасте 2, 4, 6 и 12-15 месяцев.

В одном из вариантов осуществления изобретения, первую дозу вводят в день 0, и одну или более бустер-доз вводят с интервалами приблизительно от 2 до приблизительно 24 недель, а предпочтительно с интервалом 4-8 недель.

В одном из вариантов осуществления изобретения, первую дозу вводят в день 0, а затем приблизительно через 3 месяца вводят бустер-дозу.

Набор и способ

В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к набору, содержащему описанную здесь иммуногенную композицию и информационный буклет.

В одном из вариантов осуществления изобретения, в указанном информационном буклете указана способность композиции вырабатывать функциональные антитела против E. coli.

В одном из вариантов осуществления изобретения, в указанном информационном буклете описана способность композиции вырабатывать ОРА-титры против E. coli серотипа O25B у группы людей. В одном из вариантов осуществления изобретения, в указанном информационном буклете описана способность композиции вырабатывать ОРА-титры против E. coli серотипа O1 у группы людей. В одном из вариантов осуществления изобретения, в указанном информационном буклете описана способность композиции вырабатывать ОРА-титры против E. coli серотипа O2 у группы людей. В одном из вариантов осуществления изобретения, в указанном информационном буклете описана способность композиции вырабатывать ОРА-титры против E. coli серотипа O6 у группы людей.

В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к способу получения набора, содержащего иммуногенную композицию и информационный буклет, где указанный способ включает стадию (i) получения иммуногенной композиции согласно изобретению и (ii) объединение в одном наборе указанной иммуногенной композиции и информационного буклета, в котором приводится информация о способности указанной композиции вырабатывать функциональные антитела против E. coli.

В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к способу получения набора, содержащего иммуногенную композицию и информационный буклет, где указанный способ включает стадию (i) получения иммуногенной композиции согласно изобретению и (ii) объединение в одном наборе указанной иммуногенной композиции и информационного буклета, в котором приводится информация о способности указанной композиции вырабатывать антитела против О-антигена E. coli у группы людей.

В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к способу получения набора, содержащего иммуногенную композицию и информационный буклет, где указанный способ включает стадию (i) получения иммуногенной композиции согласно изобретению и (ii) объединения в одном наборе указанной иммуногенной композиции и информационного буклета, в котором приводится информация о способности указанной композиции вырабатывать ОPА-титры против E. coli у группы людей.

В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к способу получения набора, содержащего иммуногенную композицию и информационный буклет, где указанный способ включает стадию (i) получения иммуногенной композиции согласно изобретению; (ii) отпечатывания информационного буклета, в котором будет приводиться информация о способности указанной композиции вырабатывать функциональные антитела против E. coli; (iii) объединения в одном наборе указанной иммуногенной композиции и указанного информационного буклета.

В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к способу получения набора, содержащего иммуногенную композицию и информационный буклет, где указанный способ включает стадию (i) получения иммуногенной композиции согласно изобретению; (ii) отпечатывания информационного буклета, в котором будет приводиться информация о способности указанной композиции вырабатывать ОPА-титры против E. coli у группы людей; (iii) объединения в одном наборе указанной иммуногенной композиции и указанного информационного буклета.

Примеры

Для лучшего понимания настоящего изобретения представлены нижеследующие примеры. Эти примеры приводятся лишь в целях иллюстрации и никоим образом не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения. Нижеследующие примеры иллюстрируют некоторые варианты осуществления изобретения.

Пример 1: Штаммы E. coli и S. enterica.

Клинические штаммы и производные перечислены в Таблице 3. Дополнительные контрольные штаммы включают: O25K5H1, штамм клинического серотипа O25a и штамм LT2 S. enterica серотипа Typhimurium.

Были сконструированы штаммы E. coli с нокаутом генов, который удаляет целевую открытую рамку считывания, но сохраняет короткую последовательность бороздки.

Для простоты, гидролизованная цепь O-антигена и сахара сердцевины далее будут называться O-полисахаридом (OPS).

Таблица 3. Штаммы E. coli
Штамм	Другое название штамма	Генотип	Серотип
GAR2401	PFEEC0100	wt (изолят крови)	O25b
‘2401ΔwzzB	--	ΔwzzB	O25b
'2401ΔAraAΔ(OPS)	--	ΔAraA Δ(rflB-wzzB)	OPS-
O25K5H1	PFEEC0101	wt	O25a
O25K5H1ΔwzzB		ΔwzzB	O25a
BD559	--	W3110 ΔAraA ΔfhuA ΔrecA	OPS-
BD559ΔwzzB	--	W3110ΔAraA ΔfhuA ΔrecAΔwzzB	OPS-
BD559Δ(OPS)	--	BD559 Δ(rflB-wzzB)	OPS-
GAR2831	PFEEC0102	wt (изолят крови)	O25b
GAR865	PFEEC0103	wt (изолят крови)	O2
GAR868	PFEEC0104	wt (изолят крови)	O2
GAR869	PFEEC0105	wt (изолят крови)	O15
GAR872	PFEEC0106	wt (изолят крови)	O1
GAR878	PFEEC0107	wt (изолят крови)	O75
GAR896	PFEEC0108	wt (изолят крови)	O15
GAR1902	PFEEC0109	wt (изолят крови)	O6
Atlas187913	PFEEC0068	wt (изолят крови)	O25b
Штамм LT2 Salmonella enterica серотипа Typhimurium	--	Дикого типа	N/A

Пример 2: Олигонуклеотидные праймеры для клонирования кластера генов wzzB, fepE и О-антигенов

Таблица 4. Олигонуклеотидные праймеры

Название	Последовательность праймера	Комментарии
LT2wzzB_S	GAAGCAAACCGTACGCGTAAAG (SEQ ID NO: 1)	Штамм LT2 Salmonella enterica серотипа Typhimurium, Genbank GCA_000006945.2
LT2wzzB_AS	CGACCAGCTCTTACACGGCG (SEQ ID NO: 2)
O25bFepE_S	GAAATAGGACCACTAATAAATACACAAATTAATAAC (SEQ ID NO: 3)	Штамм O25b EC958 под общим номером ST131 в Genbank GCA_000285655.3 и обозначенный O25b GAR2401 WGS
O25bFepE_A	ATAATTGACGATCCGGTTGCC (SEQ ID NO: 4)
wzzB P1_S	Gctatttacgccctgattgtcttttgt (SEQ ID NO: 5)	Последовательность штамма K-12 E. coli , Genbank MG1655 NC_000913.3 или под общим номером W3110 GCA_000010245.1
wzzB P2_AS	ATTGAGAACCTGCGTAAACGGC (SEQ ID NO: 6)
wzzB P3_S	TGAAGAGCGGTTCAGATAACTTCC (SEQ ID NO: 7) (UDP-глюкозо-6-дегидрогеназа)
wzzB P4_AS	CGATCCGGAAACCTCCTACAC (SEQ ID NO: 8) (Фосфорибозил-AMP-циклогидролаза/ Фосфорибозил-ATP пирофосфогидролаза)
O157 FepE_S	GATTATTCGCGCAACGCTAAACAGAT (SEQ ID NO: 9)	E. coli O157 fepE (на основе штамма EDL933, Genbank GCA_000732965.1)
O157 FepE_AS	TGATCATTGACGATCCGGTAGCC (SEQ ID NO: 10)
pBAD33_adaptor_S	CGGTAGCTGTAAAGCCAGGGGCGGTAGCGTGGTTTAAACCCAAGCAACAGATCGGCGTCGTCGGTATGGA (SEQ ID NO: 11)	Адаптор имеет центральный сайт PmeI и гомологичен консервативному промотору оперона 5’-OAg и 3’-последовательностям гена gnd
pBAD33_adaptor_AS	AGCTTCCATACCGACGACGCCGATCTGTTGCTTGGGTTTAAACCACGCTACCGCCCCTGGCTTTACAGCTACCGAGCT (SEQ ID NO: 12)
JUMPSTART_r	GGTAGCTGTAAAGCCAGGGGCGGTAGCGTG (SEQ ID NO: 13)	Универсальный «горячий старт» (промотор оперона OAg)
gnd_f	CCATACCGACGACGCCGATCTGTTGCTTGG (SEQ ID NO: 14)	Универсальный антисмысловой праймер оперона 3’- OAg (gnd)

Пример 3: Плазмиды

Плазмидные векторы и субклоны перечислены в Таблице 5. ПЦР-фрагменты, несущие различные гены wzzB и fepE E. coli и Salmonella, амплифицировали из очищенной геномной ДНК и субклонировали в плазмиду с большим числом копий, предоставленную в наборе для клонирования Invitrogen PCR®Blunt. Как показано на фиг. 1, эта плазмида основана на репликоне pUC. Праймеры P3 и P4 были использованы для амплификации генов wzzB E. coli с их нативным промотором и были сконструированы для связывания с областями в проксимальных и дистальных генах, кодирующих UDP-глюкозо-6-дегидрогеназу и фосфорибозиладенин-нуклеотидгидролазу, соответственно (представлены в Genbank MG1655 NC_000913.3). ПЦР-фрагмент, содержащий ген и промотор fepE Salmonella, амплифицировали с использованием ранее описанных праймеров. Аналогичные праймеры fepE E. coli были сконструированы на основе доступных геномных последовательностей Genbank или данных для полного генома, полученных в собственной лаборатории (в случае GAR2401 и O25K5H1). Плазмиду pBAD33 с низким числом копий использовали для экспрессии генов биосинтеза О-антигена под контролем промотора арабинозы. Плазмиду сначала модифицировали для облегчения клонирования (методом Гибсона) длинных ПЦР-фрагментов, амплифицированных с использованием универсальных праймеров, гомологичных 5'-промотору и гену 3'-6-фосфоглюконатдегидрогеназы (gnd), Таблица 5. Субклон pBAD33, содержащий оперон биосинтеза Q25b, проиллюстрирован на фиг. 1.

Таблица 5 Плазмиды
Название	Репликон	Маркер резистентности	Комментарии
PCR®Blunt II TOPO	pUC	KanR	Клонирующий ПЦР-вектор Invitrogen
pBAD33	P15a	CamR	Индуцибельный вектор арабинозы
pBAD33-OAg	P15a	CamR	Вектор для клонирования оперона OAg по Гибсону
pBAD33-O25b	P15a	CamR	Экспрессионная плазмида OAg O25b
pBAD33-O21	P15a	CamR	Экспрессионная плазмида OAg O21
pBAD33-O16	P15a	CamR	Экспрессионная плазмида OAg O16
pBAD33-O75	P15a	CamR	Экспрессионная плазмида OAg O75
pBAD33-O1	P15a	CamR	Экспрессионная плазмида OAg O1
pBAD33-O2	P15a	CamR	Экспрессионная плазмида OAg O2
pTOPO-O25b 2401 wzzB	pUC	KanR	Матричная гДНК GAR 2401
pTOPO-O25b 2401 fepE	pUC	KanR
pTOPO-K12 wzzB	pUC	KanR	Матричная гДНК штамма K-12 E. coli
pTOPO-O25a wzzB	pUC	KanR	Матричная гДНК штамма O25a E. coli O25K5H1
pTOPO-O25a fepE	pUC	KanR
pTOPO-Salmonella LT2 wzzB	pUC	KanR	Матричная гДНК штамма LT2 Salmonella enterica серотипа Typhimurium
pTOPO-Salmonella LT2 fepE	pUC	KanR
pTOPO-O25a ETEC wzzB	pUC	KanR	гДНК штамма O25a ETEC, закупленного в ATCC ("NR-5" E2539-C1)
pTOPO-O25a ETEC fepE	pUC	KanR
pTOPO-O157fepE	pUC	KanR	гДНК штамма O157:H7:K-токсина Shigella, закупленного в ATCC (EDL933 #43895D-5)

Пример 4: Очистка О-антигена

Бульон для ферментации обрабатывали уксусной кислотой до конечной концентрации 1-2% (конечный pH 4,1). Экстракция OAg и делипидизация были достигнуты путем нагревания обработанного кислотой бульона до 100°С в течение 2 часов. По окончании кислотного гидролиза, партию охлаждали до температуры окружающей среды и добавляли 14% NH₄OH до конечного значения pH 6,1. Нейтрализованный бульон центрифугировали и концентрат собирали. В концентрат добавляли CaCl₂в фосфате натрия, и полученную суспензию инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Твердые вещества удаляли центрифугированием и концентрат был концентрирован 12 раз с использованием мембраны с отсечкой в 10 кДа, с последующими двумя диафильтрациями против воды. Затем ретентат, содержащий OAg, очищали с использованием угольного фильтра. Угольный фильтрат разводили 1:1 (об./об.) 4,0М сульфатом аммония. Конечная концентрация сульфата аммония составляла 2М. Угольный фильтрат, обработанный сульфатом аммония, дополнительно очищали с использованием мембраны с 2М сульфатом аммония в качестве рабочего буфера. OAg собирали в проточной фракции. Для длинного OAg, фильтрат HIC концентрировали, а затем проводили буферный обмен против воды (20 объемов диафильтрации) с использованием мембраны с отсечкой в 5 кДа. Для короткого (нативного) полисахарида OAg, отсечку молекулярной массы дополнительно снижали для увеличения выхода.

Пример 5: Конъюгирование длинного O-антигена O25b с CRM₁₉₇

Первый набор конъюгатов длинноцепочечного полисахарида O25b-CRM₁₉₇ был получен путем окисления периодатом с последующим конъюгированием посредством химической реакции восстановительного аминирования (RAC) (Таблица 7). Варианты конъюгата с тремя уровнями активации (низким, средним и высоким) получали путем изменения уровней окисления. Конъюгаты получали посредством реакции взаимодействия лиофилизованных активированных полисахаридов с лиофилизованным CRM_197, а затем восстанавливали в среде ДМСО с использованием цианоборгидрида натрия в качестве восстановителя. Реакции конъюгирования проводили при 23°С в течение 24 часов с последующим блокированием с использованием боргидрида натрия в течение 3 часов. После проведения стадии гашения реакции конъюгирования, конъюгаты очищали ультрафильтрацией/диафильтрацией с регенерированной целлюлозной мембраной с отсечкой молекулярной массы 100K, с использованием 5 мМ сукцината/0,9% NaCl, pH 6,0. Конечную фильтрацию конъюгатов проводили с использованием мембраны 0,22 мкм.

Если это не оговорено особо, то конъюгаты, раскрытые в следующих примерах, включают фрагмент сахарида сердцевины.

1.1. Экспрессия длинного О-антигена, обеспечиваемая регуляторами длины цепи гетерологичной полимеразы

Первоначальное конструирование штамма E. coli было осуществлено на серотипе O25. Это было проведено в целях сверхэкспрессии гетерологичных генов wzzB или fepE для подтверждения того, что они способствуют удлинению цепи в штаммах O25 с нокаутом wzzB. Сначала, изоляты крови подвергали скринингу с помощью ПЦР для идентификации штаммов подтипа O25a и O25b. Затем, штаммы скринировали на чувствительность к ампициллину. Был идентифицирован единственный чувствительный к ампициллину изолят O25b GAR2401, в который была введена делеция wzzB. Аналогичным образом, делеция wzzB была сделана в штамме O25a O25K5H1. Для генетической комплементации этих мутаций, гены wzzB из GAR 2401 и O25K5H1 были субклонированы в высококопийный клонирующий вектор с помощью ПЦР-Blunt II и введены в оба штамма путем электропорации. Дополнительные гены wzzB из E. coli K-12 и S. enterica серотипа Typhimurium LT2 были аналогичным образом клонированы и перенесены; аналогичная процедура была проведена для генов fepE от E. coli O25K5H1, GAR 2401, O25a ETEC NR-5, O157:H7:K- и LT2 S. enterica серотипа Typhimurium.

Генетическая комплементация экспрессии ЛПС в плазмидных трансформантах штаммов с нокаутом по wzzB O25K5H1 (O25a) и GAR2401 (O25b) показана на фиг. 2. Бактерии культивировали в течение ночи в среде LB, и ЛПС экстрагировали фенолом, разделяли с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ (4-12% акриламида) и окрашивали. В каждую лунку с гелем загружали ЛПС, экстрагированный из того же самого количества бактериальных клеток (приблизительно 2 единицы OD₆₀₀). Размер ЛПС оценивали по внутреннему нативному стандарту ЛПС E. coli и путем подсчета лэддеров, отличающихся от лэддеров субсерии образцов, показывающих широкое распределение длин цепей (отличающихся одним повторяющимся звеном). На левой стороне панели А фиг. 3 показаны профили ЛПС плазмидных трансформантов O25a O25K5H∆wzzB; а справа показаны аналогичные профили трансформантов O25b GAR 2401∆wzzB. Иммуноблот реплицированного геля, зондированного O25-специфической сывороткой, показан на панели B на фиг. 3.

Результаты этого эксперимента показали, что введение гомологичного гена wzzB хозяину E. coli O25a∆wzzB восстанавливает экспрессию короткого ЛПС O25 (10-20×), как и wzzB LT2 Salmonella. Введение гена wzzB O25b из GAR2401 не осуществляет такой функции, что позволяет предположить, что фермент WzzB этого штамма является дефектным. Сравнение аминокислотных последовательностей WzzB E. coli позволяет предположить, что ответственными за такую функцию могут быть замены A210E и P253S. Примечательно то, что Salmonella LT2 fepE и E. coli fepE из O25a O25K5H1 сообщают способность экспрессировать очень длинный (VL) ЛПС OAg, причем, fepE LT2 Salmonella приводит к увеличению размера OAg по сравнению с fepE E. coli.

Аналогичный паттерн экспрессии наблюдался для трансформантов GAR2401∆wzzB: штамм O25a или штамм K12 E. coli с wzzB восстанавливали свою способность продуцировать короткий ЛПС. fepE LT2 Salmonella продуцировал самый длинный ЛПС, fepE E. coli продуцировал несколько более короткий ЛПС, тогда как wzzB LT2 Salmonella давал ЛПС с длиной среднего размера (L). Способность других генов fepE E. coli продуцировать очень длинные ЛПС оценивали в отдельном эксперименте с трансформантами E. coli O25a∆wzzB. Гены fepE от штамма GAR2401, штамма O25a ETEC и штамма, продуцирующего токсин O157 Shigella, также сообщали способность продуцировать очень длинный ЛПС, но не такой длины, как ЛПС, продуцируемый fepE LT2 Salmonella (фиг. 4). Выравнивание аминокислотных последовательностей FepE показано на фиг. 5.

После установления того факта, что в штаммах серотипов O25a и O25b, fepE LT2 Salmonella продуцирует самый длинный ЛПС из оцениваемых регуляторов полимеразы, авторы попытались определить, будет ли этот ген также продуцировать очень длинные ЛПС в других серотипах E. coli. Изоляты бактерий дикого типа серотипов О1, О2, О6, О15 и О75 трансформировали плазмидой fepE Salmonella и экстрагировали ЛПС. Результаты, показанные на фиг. 6, подтвердили, что fepE Salmonella может сообщать способность продуцировать очень длинные ЛПС у других распространенных серотипов, ассоциированных с инфекциями крови. Эти результаты также показали, что экспрессия fepE Salmonella на основе плазмиды, по-видимому, блокирует регуляцию длины цепи, обычно осуществляемую эндогенным wzzB в этих штаммах.

1.2. Экспрессия О-антигенов на основе плазмид в обычном штамме-хозяине E. coli.

С точки зрения перспектив разработки биологических процессов, способность продуцировать О-антигены разных серотипов в обычном хозяине E. coli вместо множества штаммов значительно упростила бы получение отдельных антигенов. С этой целью, кластеры генов О-антигена различных серотипов амплифицировали с помощью ПЦР и клонировали в плазмиду с низким числом копий (pBAD33) под контролем промотора, регулируемого арабинозой. Эта плазмида совместима (может сосуществовать) с плазмидой fepE LT2 Salmonella в E. coli, поскольку она содержит другой репликон (p15a) и другой селективный маркер (хлорамфеникол в отличие от канамицина). В первом эксперименте, субклон плазмиды оперона pBAD33 O25b котрансфицировали плазмидой fepE LT2 Salmonella в GAR2401∆wzzB, и трансформанты культивировали в присутствии или в отсутствии 0,2% арабинозы. Результаты, показанные на фиг. 7, продемонстрировали, что очень длинный ЛПС О-антигена продуцируется по механизму, зависимому от арабинозы.

Кластеры генов О-антигена, клонированные из других серотипов, оценивали аналогичным образом, и результаты, были представлены на фиг. 8. Совместная экспрессия плазмид fepE LT2 Salmonella и pBAD33-OAg давала детектируемый длинноцепочечный ЛПС, соответствующий серотипам O1, O2 (для двух из четырех клонов), O16, O21 и O75. По неизвестным причинам, плазмида pBAD33-O6 не давала детектируемого ЛПС во всех четырех протестированных изолятах. Хотя уровень экспрессии варьировался, однако, результаты показали, что экспрессия длинноцепочечных О-антигенов в общем хозяине является возможной. Однако, в некоторых случаях может потребоваться дополнительная оптимизация для повышения уровня экспрессии, например, путем модификации последовательностей промотора плазмиды.

Профили ЛПС от другого штамма E. coli серотипа O25 с плазмидой fepE LT2 Salmonella или без нее показаны на фиг. 11. Два штамма были исследованы на ферментацию, экстракцию и очистку О-антигенов: GAR2831, для продуцирования нативного короткого OAg O25b; и GAR2401∆wzzB/fepE для продуцирования длинного OAg O25b. Соответствующие ЛПС короткой и длинной формы показаны на фиг. 11, где ДСН-ПААГ-гель выделен красным. Полисахариды экстрагировали непосредственно из ферментированных бактерий уксусной кислотой и очищали. Профили эксклюзионной хроматографии очищенного короткого, длинного или очень длинного полисахарида O25b показаны на фиг. 12. Свойства двух партий короткого полисахарида (от GAR2831) сравнивали со свойствами одного очень длинного полисахарида (от штамма GAR2401∆wzzB/fepE). Молекулярная масса длинного О-антигена была в 3,3 раза больше, чем у короткого О-антигена, а количество повторяющихся звеньев было оценено как ~65 (очень длинные) против ~ 20. См. Таблицу 6.

Таблица 6

Партия полисахаридов #	Нативный	Нативный	Модифицированный (с длинной цепью)
Партия полисахаридов #	709766-24A	709722-24B	709766-25A
Молекулярная масса полисахарида (кДа)	17,3	16,3	55,3
# Повторяющихся звеньев	20	19	64

Очень длинный полисахарид O-антигена O25b конъюгировали с дифтерийным токсином CRM₁₉₇ путем проведения стандартной химической реакции восстановительного аминирования. Были приготовлены три различные партии гликоконъюгата с различной степенью активации периодатом: средняя (5,5%), низкая (4,4%) и высокая (8,3%). Было показано, что полученные препараты и неконъюгированный полисахарид не содержат эндотоксиновых примесей (Таблица 7).

Каждую группу из четырех кроликов (самок новозеландской белой породы) вакцинировали 10 мкг гликоконъюгата и 20 мкг адъюванта QS21 и отбирали образцы сыворотки (VAC-2017-PRL-EC-0723) в соответствии со схемой, показанной на фиг. 13А. Следует отметить, что доза 10 мкг находится в нижней части интервала доз, обычно вводимых кроликам при оценке бактериальных гликоконъюгатов (обычно 20-50 мкг). В отдельном исследовании, группу кроликов также вакцинировали (VAC-2017-PRL-GB-0698) неконъюгированным полисахаридом в той же дозе (10 мкг полисахарида+20 мкг адъюванта QS21) и по идентичной схеме введения.

Гуморальные ответы у кроликов на три препарата гликоконъюгата O25b оценивали в анализе LUMINEX, в котором карбокси-сферы покрывали метилированным человеческим сывороточным альбумином, предварительно связанным с неконъюгированным длинным полисахаридом O25b. Присутствие O25b-специфических антител IgG в пробах сыворотки детектировали с использованием второго антитела против IgG, меченного фикоэритрином (ФЭ). Профили иммунных ответов, наблюдаемые в пробе сыворотки, взятой на неделе 0 (до иммунизации), на 6-й неделе (после введения дозы 2, PD2), на 8-й неделе (после введения дозы 3, PD3) и на 12-й неделе (после введения дозы 4, PD4) у кроликов с наилучшим ответом (по одному из четырех кроликов в каждой группе), показаны на фиг. 14. Ни у одного из 12 кроликов не было обнаружено значимых титров IgG в сыворотке до иммунизации. В противоположность этому, вырабатывание антител, специфичных к антигену O25b, было детектировано в сыворотке после вакцинации кроликов во всех трех группах, при этом, ответы гликоконъюгатных групп с низкой активацией имели тенденцию к некоторому увеличению по сравнению с гликоконъюгатными группами со средней или высокой активацией. Максимальные ответы наблюдались на момент времени после введения дозы 3. У одного кролика в группе с низкой активацией и у одного кролика в группе с высокой активацией не наблюдалось ответа на вакцинацию (не респонденты).

Для оценки влияния конъюгирования белка-носителя CRM₁₉₇ на иммуногенность длинного полисахарида O25b OAg, присутствие антител в сыворотках кроликов, вакцинированных неконъюгированным полисахаридом, сравнивали с присутствием антител в сыворотке кроликов, вакцинированных гликоконъюгатом CRM₁₉₇ с низкой активацией, фиг. 15. Примечательно то, что свободный полисахарид не был иммуногенным и практически не вызывал IgG-ответов в иммунной сыворотке по сравнению с неиммунной сывороткой (панель A). И напротив, средние величины интенсивности флуоресценции (MFI) для IgG, специфичных к OAg O25b, приблизительно в десять раз превышали величины в неимунной сыворотке, и такие величины наблюдались в сыворотке PD4 у трех из четырех кроликов, вакцинированных OAg-CRM₁₉₇ O25b во всех интервалах разведения сыворотки (от 1:100 до 1:6400). Эти результаты продемонстрировали необходимость конъюгирования с белком-носителем для продуцирования антител IgG против полисахарида OAg O25b в дозе 10 мкг.

Бактерии, выращенные на планшетах TSA, суспендировали в PBS, доводили до OD₆₀₀ 2,0 и фиксировали в 4% параформальдегиде в PBS. После блокирования в 4% BSA/PBS в течение 1 часа, бактерии инкубировали с серийными разведениями неиммунных и PD3-иммунных сывороток в 2% BSA/PBS и связанные IgG детектировали с использованием ФЭ-меченого второго антитела F(ab).

Специфичность антител против O25b, вырабатываемых O25b OAg-CRM_197, была продемонстрирована в экспериментах по проточной цитометрии с интактными бактериями. Связывание IgG с целыми клетками детектировали с использованием ФЭ-конъюгированного фрагмента F(ab')₂ козьего антитела против кроличьих IgG на проточном цитометре Accuri.

Как показано на фиг. 16, неиммунные кроличьи антитела не могли связываться с изолятами GAR2831 и GAR2401 серотипа O25b дикого типа или со штаммом K-12 E.coli, тогда как соответствующие антитела PD3 окрашивали бактерии O25b в зависимости от концентрации. Штамм K-12, используемый в качестве негативного контроля, который не экспрессировал OAg, показал лишь очень слабое связывание антител PD3, очевидно, из-за присутствия на его поверхности открытых эпитопов олигосахарида сердцевины. Введение плазмиды fepE Salmonella в изоляты O25b дикого типа приводило к значительно более интенсивному окрашиванию, что соответствует более высокой плотности иммуногенных эпитопов, обеспечиваемых более длинным полисахаридом OAg.

Вывод. Описанные результаты показали, что fepE Salmonella не только является детерминантой очень длинных полисахаридов O-антигена у видов Salmonella, но также может сообщать штаммам E. coli различных серотипов O-антигенов способность продуцировать очень длинные OAg. Это свойство может быть использовано для получения полисахаридов вакцин с О-антигеном с улучшенными свойствами для разработки биопроцессов, благодаря облегчению очистки и химическому конъюгированию с соответствующими белками-носителями, а также благодаря потенциальному повышению иммуногенности за счет образования комплексов с более высокой молекулярной массой.

Пример 6: Первоначальные исследования на кроликах позволили получить первые поликлональные антитела и ответы IgG на RAC O25b OAg-CRM_197.

Конъюгаты длинноцепочечного полисахарида O25b-CRM₁₉₇ получали посредством окисления периодатом с последующим конъюгированием посредством химической реакции восстановительного аминирования (RAC) (Таблица 7). См. Также Таблицу 17.

Таблица 7

Конъюгат CRM₁₉₇	132242-28 Умеренная активация 5,5%	132242-27 Низкая активация 4,5%	132242-29 Высокая активация 8,3%	709766-29 Свободный полисахарид O25b
Концентрация полисахарида (мг/мл)	0,7	0,6	0,67	1
Эндотоксин (ЭЕ/мкг)	0,02	0,02	0,02	<0,6 ЭЕ
Матрица	5 мкм сукцинатного буфера/физиологического раствора, pH 6.0

В исследовании 1 на кроликах (VAC-2017-PRL-EC-0723) (также описанном выше в Примере 5), пяти (5) кроликам на группу с 10 мкг RAC с низкой (L), умеренной (M) или высокой (H) активацией (+QS21) вводили композицию по схеме, представленной на фиг. 13А. В последующем исследовании на кроликах (VAC-2017-PRL-GB-0698) было обнаружено, что неконъюгированный свободный полисахарид O25b не является иммуногенным (см. Фиг. 18).

В исследовании 2 на кроликах (VAC-2018-PRL-EC-077), 2 кроликам/группу с L-RAC (AlOH₃, QS21 или без адъюванта) вводили композицию по схеме, представленной на фиг. 13B.

Кроликам 4-1, 4-2, 5-1, 5-2, 6-1 и 6-2 вводили очень длинный неконъюгированный полисахарид O25b как описано в Примере 5, и тестировали сыворотки на неделю 18.

Более конкретно, кролику 4-1 вводили композицию, включающую 50 мкг неконъюгированного O25b, 100 мкг адъюванта AlOH₃. Кролику 4-2 вводили композицию, включающую 50 мкг неконъюгированного O25b, 100 мкг адъюванта AlOH₃. Кролику 5-1 вводили композицию, включающую 50 мкг неконъюгированного O25b, 50 мкг адъюванта QS-21. Кролику 5-2 вводили композицию, включающую 50 мкг неконъюгированного O25b, 50 мкг адъюванта QS-21. Кролику 6-1 вводили композицию, включающую 50 мкг неконъюгированного O25b, без адъюванта. Кролику 6-2 вводили композицию, включающую 50 мкг неконъюгированного Q25b, без адъюванта.

Пример 7: Исследования на кроликах с конъюгатом O25b RAC: титры разведения сыворотки dLIA

В исследовании 2 на кроликах (VAC-2018-PRL-EC-077) сравнивали титры разведения сыворотки O25b dLIA с титрами для кроликов с наилучшим ответом в исследовании 1 (VAC-2017-PRL-EC-0723). В этих экспериментах был проведен модифицированный анализ на прямое связывание Luminex, в котором полилизиновый конъюгат длинного O-антигена O25b пассивно адсорбировался на карбокси-сферах Luminex вместо описанной ранее смеси метилированного сывороточного альбумина и длинного O-антигена. Использование конъюгата полилизин-O25b повышало чувствительность анализа и качество зависимых от концентрации IgG-ответов, что позволило определить титры разведения сыворотки посредством построения кривой (по четырехпараметрическому нелинейному уравнению). Титры IgG для O25b в сыворотке кроликов с самым высоким титром в первом исследовании сравнивали с сыворотками кроликов во втором исследовании, как показано в Таблице 8.

Таблица 8

	Конъюгат O25b-CRM с низкой активацией и с квасцами в качестве адъюванта (EC₅₀ при разведении сыворотки)	Конъюгат O25b-CRM с низкой активацией и с адъювантом QS21 (EC₅₀ при разведении сыворотки)	Конъюгат O25b-CRM с низкой активацией и без адъюванта (EC₅₀ при разведении сыворотки)
	Кролик 1-1	Кролик 1-2	Кролик 2-1	Кролик 2-2	Кролик 3-1	Кролик 3-2
Антисыворотка на неделю 3 (через 3 недели после первой дозы)	~1:200	~1:200	<1:100	<1:100	~1:200	~1:200
Антисыворотка на неделю 7 (через 1 неделю после бустер- дозы 1)	1:1600	1:4000	1:250	1:500	1:250	1:1500
Антисыворотка на неделю 10 (через 1 неделю после после бустер- дозы 2)	1:1100	1:1900	1:250	1:500	1:800	1:1200
Антисыворотка на неделю 183 (через 1 неделю после бустер- дозы 4)	1:1600	1:4000	1:1300	1:1200	1:1400	1:1600
	Среднее для 6 репликатов наилучшей антисыворотки у кролика 2-3 (стандартный анализ в первом исследования) ЕС₅₀= 1:1700

Более высокие дозы во втором исследовании на кроликах (50/20 мкг против 10 мкг) не повышали титры IgG.

Двухмесячный перерыв усиливал IgG-ответы (эти ответы не наблюдались с более короткими перерывами).

Квасцы, по-видимому, усиливали IgG-ответ у кроликов по сравнению с ответом в присутствии QS21 или без адъюванта.

Опсонофагоцитарный анализ (OPA) с использованием комплемента детеныша кролика (BRC) и клеток HL60 в качестве источника нейтрофилов был разработан для оценки функциональной иммуногенности гликоконъюгатов О-антигена. Предварительно замороженные исходные штаммы бактерий E. coli GAR2831 культивировали в среде бульона Луриа (LB) при 37°C. Клетки осаждали и суспендировали до концентрации OD₆₀₀=1 на мл в PBS с добавлением 20% глицерина и замораживали. Предварительно оттитрованные и оттаянные бактерии разводили до 0,5 × 10⁵ КОЕ/мл в HBSS (в сбалансированном солевом растворе Хэнкса) с 1% желатином) и 10 мкл (10³ КОЕ) в комбинации с 20 мкл серийно разведенной сыворотки в микропланшете с U-образным дном для культивирования ткани, и смесь встряхивали при 700 об/мин на шейкере BELLCO в течение 30 минут при 37°C в инкубаторе с 5% CO_2.10 мкл 2,5% комплемента (сыворотки детеныша кролика, PEL-FREEZ 31061-3, предварительно разведенной в HBG) и 20 мкл клеток HL-60 (0,75 × 10⁷/мл) и 40 мкл HBG добавляли в микропланшет с U-образным дном для культивирования тканей, и смесь встряхивали при 700 об/мин на шейкере BELLCO в течение 45 минут при 37°C в инкубаторе с 5% CO₂. Затем, 10 мкл каждой из 100 мкл реакционной смеси переносили в соответствующие лунки предварительно смоченного фильтровального планшета MILLIPORE MULTISCREENHTS HV, приготовленного путем добавления 100 мкл воды, а затем подвергали вакуумной фильтрации и наносили 150 мкл 50% LB. Планшет фильтровали под вакуумом и инкубировали в течение ночи при 37°C в инкубаторе с 5% CO₂. На следующий день после фиксации, окрашивания красителем Кумасси и обесцвечивания обесцвечивающими растворами, колонии подсчитывали на анализаторе IMMUNOSPOT® с помощью компьютерной программы IMMUNOCAPTURE. Для определения специфичности активности OPA, иммунные сыворотки предварительно инкубировали со 100 мкг/мл очищенного длинного O-антигена O25b, а затем объединяли с другими компонентами анализа в OPA-реакции. OPA-анализ включает контрольные реакции без клеток HL60 или комплемента для того, чтобы продемонстрировать зависимость любого наблюдаемого цитолиза от этих компонентов.

Соответствующие пробы сыворотки до иммунизации и после вакцинации, взятые у репрезентативных кроликов в обоих исследованиях, оценивали в анализе и определяли титры разведения сыворотки (Таблица 9, фиг. 19 A-B). Предварительное инкубирование с неконъюгированным полисахаридом длинного О-антигена O25b блокировало бактерицидную активность, что указывало на OPA-специфичность (фиг. 19C).

Кролику 2-3 вводили следующую дозу: 10/10/10/10 мкг конъюгата RAC+QS21, а затем проводили забор крови после введения 4 дозы (PD). Кролику 1-2 вводили следующие дозы: 50/20/20/20 мкг конъюгата RAC+Al(OH)₃, и проводили забор крови после введения 4-й дозы.

Таблица 9. ОРА-Титры

Таблица 9
Образец	Титр
Неиммунная сыворотка кролика 2-3	537
Сыворотка кролика 2-3 на неделю 13 (последний забор крови)	13686
Неиммунная сыворотка кролика 1-2	<200
Сыворотка кролика 1-2 на неделю 19 (последний забор крови)	22768

Пример 8: Уровни IgG против O-антигена O25b, вырабатываемые неконъюгированным полисахаридом длинного O-антигена O25b и производным гликоконъюгата длинного O-антигена O25b RAC/ДМСО.

Группам из десяти мышей CD-1 вводили подкожную инъекцию 0,2 или 2,0 мкг/животное гликоконъюгата длинного O-антигена O25b, RAC/ДМСО, на недели 0, 5 и 13, с забором крови на неделю 3 (после введения дозы 1, PD1), на неделю 6 (после введения дозы 2, PD2) и на неделю 13 (после введения дозы 3, PD3) для тестирования на иммуногенность. Уровни антиген-специфического IgG определяли с помощью количественного анализа Luminex (подробно см. в Примере 7) с использованием O25b-специфического мышиного mAb в качестве внутреннего стандарта. Базовые уровни IgG (пунктирная линия) определяли в сыворотке, взятой у 20× случайно выбранных невакцинированных мышей. Свободный неконъюгированный полисахаридный иммуноген длинного О-антигена O25b не индуцировал IgG выше базовых уровней в любой момент времени. И наоборот, IgG-ответы наблюдались после введения двух доз гликоконъюгата длинного конъюгата O25b-CRM197, полученного посредством RAC: устойчивые однородные IgG-ответы наблюдались на PD3, с промежуточными и более вариабельными уровнями IgG на PD2. Значения GMT для IgG (нг/мл) указаны с величиной ошибки в пределах 95% ДИ. См. Фиг. 20.

Пример 9: OPA-специфичность комплемента детеныша кролика с O25b (BRC). A-B) Сыворотка после иммунизации кроликов 2-3 и 1-2 длинным O-антигеном O25b, полученным с помощью RAC/ДМСО (но не соответствующая неиммунная контрольная сыворотка) продемонстрировала бактерицидную OPA-активность. C) ОРА-активность иммунной сыворотки кролика 1-2 блокировали путем предварительного инкубирования со 100 мкг/мл полисахарида длинного O-антигена O25b. Бактериальные штаммы GAR2831 инкубировали с HL60, а затем с 2,5% BRC и серийными разведениями сыворотки в течение 1 часа при 37°C, а выжившие бактерии подсчитывали путем подсчета микроколоний (КОЕ) на фильтровальных планшетах. См. Фиг. 19.

Пример 10: Длинные гликоконъюгаты O25b, полученные с помощью RAC и eTEC, являются более иммуногенными, чем гликоконъюгаты по одному концу. OPA-анализ на BRC проводили с использованием резистентного к карбапенему и фторхинлону штамма MDR Atlas187913. Группы из 20 мышей CD-1 вакцинировали 2 мкг гликоконъюгата по той же схеме, как показано на фиг. 21 и OPA-ответы определяли в моменты времени после введения дозы 2 (PD2) (панель A) и после введения дозы 3 (PD3) (панель B). Величины ошибок выражали как GMT с 95% ДИ. Было показано, что число респондентов превышало число невакцинированных животных. Преобразованные логарифмические данные от различных групп оценивали для того, чтобы определить, являются ли такие различия статистически значимыми, с применением непарного t-критерия с поправкой Вельча (Graphpad Prism). Результаты представлены в Таблице 10. См. Фиг. 21. У мышей, вакцинированных 2 мкг длинных гликоконъюгатов eTEC-O1a, OPA-титры против O1a, наблюдаемые на PD2 и PD3 (данные не приводятся), превышали OPA-титры против O25b на PD2 и PD3, соответственно, как показано в Таблице 10.

Таблица 10

Описание	% Респондентов (n/N)*	Геометрически средний титр на PD2	% Респондентов (n/N)*	Геометрически средний титр на PD3
Короткий по одному концу, 2 мкг	45 (9/20)	1552	85 (17/20)	17 070
Длинный по одному концу, 2 мкг	30 (6/20)	763	85 (17/20)	10 838
Длинный, RAC/ДМСО, 2 мкг	65 (13/20)	8297	95 (19/20)	163210
Длинный, eTEC (10%), 2 мкг	90 (18/20)	27368	100 (19/19)	161526

Пример 11: OPA-Иммуногенность химического соединения eTEC может быть улучшена путем изменения уровней активации полисахарида. OPA-анализ на BRC проводили с использованием резистентного к карбапенему и фторхинлону штамма MDR Atlas187913. Группы из 20 мышей CD-1 вакцинировали 0,2 мкг или 2 мкг указанного длинного гликоконъюгата eTEC O25b и определяли OPA-ответы в момент времени PD2. Суммарные логарифмически преобразованные данные для групп с 4% активацией и для групп с 17% активацией были оценены с применением непарного t-критерия с поправкой Вельча (Graphpad Prism) для того, чтобы подтвердить, что различия в OPA-ответах были статистически значимыми. Геометрическое среднее значение и количество респондентов для отдельных групп были систематизированы в Таблице 11. См. Фиг. 22.

Таблица 11

Описание	% Респондентов (n/N)	Геометрический средний титр
4% активация длинного eTEC (0,2 мкг)	35 (7/20)	628
4% активация длинного eTEC (0,2 мкг)	65 (13/20)	8185
10% активация длинного eTEC (0,2 мкг)	45 (9/20)	1085
10% активация длинного eTEC (0,2 мкг)	90 (18/20)	27368
17% активация длинного eTEC (0,2 мкг)	70 (14/20)	3734
17% активация длинного eTEC (0,2 мкг)	80 (16/20)	25461

Пример 12: Исследование заражения показало, что длинные конъюгаты E. coli 025b eTEC обеспечиваают защиту после введения трех доз. Группы из 20 мышей CD-1, иммунизованных дозой 2 мкг в соответствии с указанной схемой, были внутрибрюшинно инфицированы 1 × 10⁹ бактериями штамма GAR2831. Затем проводили мониторинг выживаемости в течение шести дней. Группы мышей, вакцинированных гликоконъюгатами eTEC, активированными на уровнях 4%, 10% или 17%, были защищены от летальной инфекции, тогда как невакцинированные контрольные мыши или мыши, вакцинированные 2 мкг неконъюгированного длинного полисахарида O25b, не обладали такой защитой. См. Фиг. 23.

Пример 13: Способ получения гликоконъюгатов, связанных с eTEC

Активация сахарида и тиолирование дигидрохлоридом цистамина. Сахарид восстанавливали в безводном диметилсульфоксиде (ДМСО). Содержание влаги в растворе определяли с помощью анализа Карла Фишера (KF) и доводили до значения 0,1 и 1,0%, а обычно, до 0,5%.

Для инициации активации приготавливали свежий раствор 1,1'-карбонил-ди-1,2,4-триазола (CDT) или 1,1'-карбонилдиимидазола (CDI) в концентрации 100 мг/мл в ДМСО. Сахарид активировали различными количествами CDT/CDI (1-10 молярных эквивалентов), и оставляли для реакции на 1-5 часов при комнатной температуре или при 35°C. Затем добавляли воду для гашения любого остаточного CDI/CDT в растворе для реакции активации. После этого определяли добавленное количество воды для того, чтобы окончательное содержание влаги составляло 2-3% от общего количества воды. Реакционную смесь оставляли для прохождения реакции на 0,5 часа при комнатной температуре. Затем приготавливали свежий раствор дигидрохлорида цистамина в безводном ДМСО в концентрации 50 мг/мл. Активированный сахарид подвергали реакции взаимодействия с 1-2 мол. экв. дигидрохлорида цистамина. В качестве альтернативы, активированный сахарид подвергали реакции взаимодействи с 1-2 мол. экв. гидрохлорида цистеамина. Реакцию тиолирования проводили в течение 5-20 часов при комнатной температуре с получением тиолированного сахарида. Уровень тиолирования определяли путем добавления определенного количества CDT/CDI.

Восстановление и очистка активированного тиолированного сахарида. К реакционной смеси тиолированного сахарида добавляли раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP), 3-6 мол. экв., и реакционную смесь оставляли для реакции на 3-5 часов при комнатной температуре. Затем реакционную смесь 5-10-кратно разбавляли путем добавления предварительно охлажденного 10 мМ одноосновного фосфата натрия и фильтровали через 5 мкм-фильтр. Диафильтрацию тиолированного сахарида проводили против 30-40 объемов диафильтрации предварительно охлажденного 10 мМ одноосновного фосфата натрия. Аликвоту активированного ретентата тиолированного сахарида отбирали для определения концентрации сахарида и для анализа на содержание тиола (по Элману).

Активация и очистка бромацетилированного белка-носителя. Свободные аминогруппы белка-носителя подвергали бромацетилированию посредством реакции взаимодействия с бромацетилирующим агентом, таким как N-гидроксисукцинимидоэфир бромуксусной кислоты (BAANS), бромацетилбромид или другой подходящий реагент.

Сначала, белок-носитель (в 0,1 М фосфате натрия, pH 8,0±0,2), перед активацией, выдерживали при 8±3°С, приблизительно при pH 7. К белковому раствору добавляли N-гидроксисукцинимидоэфир бромуксусной кислоты (BAANS) в виде исходного раствора диметилсульфоксида (ДМСО) (20 мг/мл) в отношении 0,25-0,5 BAANS:белок (масс./масс.). Реакционную смесь осторожно перемешивали при температуре 5 ± 3°С в течение 30-60 минут. Полученный бромацетилированный (активированный) белок очищали, например, с помощью ультрафильтрации/диафильтрации с использованием мембраны с отсечкой молекулярной массы (MWCO) 10 кДа и с использованием 10 мМ фосфатного (pH 7,0) буфера. После очистки концентрацию бромацетилированного белка-носителя оценивали с помощью анализа Лаури на белок.

Степень активации определяли с помощью анализа на общий бромид посредством ионообменной жидкостной хроматографии в комбинации с детектированием снижения проводимости (ионная хроматография). Связанный бромид на активированном бромацетилированном белке отщепляли от белка при приготовлении аналитического образца и количественно определяли вместе с любым свободным бромидом, который может присутствовать. Любой оставшийся ковалентно связанный бром на белке высвобождается в результате реакции превращения в ионный бромид при нагревании образца в щелочном 2-меркаптоэтаноле.

Активация и очистка бромацетилированного CRM₁₉₇. CRM₁₉₇ разводили до 5 мг/мл 10 мМ фосфатного буфера, содержащего 0,9% NaCl, pH 7 (PBS), а затем приготовливали раствор 0,1 М NaHCO_3, pH 7,0, с использованием 1 М маточного раствора. Затем добавляли BAANS в отношении CRM₁₉₇:BAANS=1:0,35 (масс./масс.) с использованием маточного раствора BAANS, содержащего 20 мг/мл ДМСО. Реакционную смесь инкубировали при температуре от 3°С до 11°C в течение периода времени от 30 минут до 1 часа, а затем очищали ультрафильтрацией/диафильтрацией с использованием мембраны с отсечкой молекулярной массы 10 кДа (MWCO) и 10 мМ фосфата натрия/0,9% NaCl, pH 7,0. Очищенный активированный CRM₁₉₇ анализировали методом Лаури для определения концентрации белка, а затем разводили PBS до 5 мг/мл. Затем добавляли сахарозу до 5% масс./об. в качестве криозащитного агента, и активированный белок замораживали и хранили при -25°С до проведения реакции конъюгирования.

В высокой степени последовательное бромацетилирование лизиновых остатков CRM₁₉₇ приводило к активации от 15 до 25 лизинов из 39 доступных лизинов. Эта реакция давала высокие выходы активированного белка.

Конъюгирование активированного тиолированного сахарида с бромацетилированным белком-носителем.

Затем добавляли бромацетилированный белок-носитель и активированный тиолированный сахарид. Сахарид/белок добавляли в отношении 0,8±0,2. рH реакции доводили до 9,0±0,1 с помощью 1 М раствора NaOH. Реакция конъюгирования проходила при 5°С в течение 20±4 часов.

Блокирование остаточных реакционноспособных функциональных групп. Непрореагировавшие бромацетилированные остатки на белке-носителе гасили посредством реакции взаимодействия с 2 мол. экв. N-ацетил-L-цистеина, используемого в качестве блокирующего реагента в течение 3-5 часов при 5°С. Остаточные свободные сульфгидрильные группы блокировали 4 мол. экв. иодацетамида (IAA) в течение 20-24 часов при 5°С.

Очистка гликоконъюгата, связанного с eTEC. Реакционную смесь для конъюгирования (после IAA-блокирования) фильтровали через 0,45 мкм-фильтр. Ультрафильтрацию/диафильтрацию гликоконъюгата проводили против 5 мМ сукцината-0,9% физиологического раствора, pH 6,0. Затем ретентат гликоконъюгата фильтровали через 0,2 мкм-фильтр. Аликвоту гликоконъюгата отбирали для анализа. Оставшийся гликоконъюгат хранили при 5°С. См. Таблицу 14, Таблицу 15, Таблицу 16, Таблицу 17 и Таблицу 18.

Пример 14: Получение коньюгатов eTEC E. coli-o25b

Способ активации - Активация липополисахарида E. coli-O25b. Лиофилизованный полисахарид E. coli-O25b восстанавливали в безводном диметилсульфоксиде (ДМСО). Содержание влаги в лиофилизованном растворе O25b/ДМСО определяли с помощью анализа Карла Фишера (KF). Содержание влаги регулировали путем добавления WFI к раствору O25b/ДМСО до достижения содержания влаги 0,5%.

Для инициации активации приготавливали свежий 1,1'-карбонилдиимидазол (CDI) в концентрации 100 мг/мл в растворе ДМСО. Полисахарид E. coli-O25b активировали различными количествами CDI перед стадией тиолирования. Активацию CDI проводили при комнатной температуре или при 35°C в течение 1-3 часов. Для гашения любого остаточного CDI в растворе для реакции активации добавляли воду. После этого определяли добавленное количество воды для того, чтобы окончательное содержание влаги составляло 2-3% от общего количества воды. Реакционную смесь оставляли для прохождения реакции на 0,5 часа при комнатной температуре.

Тиолирование активированного полисахарида E. coli-O25b. Дигидрохлорид цистамина приготавливали в свежем виде в безводном ДМСО, и к реакционному раствору активированного полисахарида добавляли 1-2 мол. экв. дигидрохлорида цистамина. Реакционную смесь оставляли для реакции на 20±4 часов при комнатной температуре.

Восстановление и очистка активированного тиолированного полисахарида E. coli-O25b. К реакционной смеси тиолированного сахарида добавляли раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP), 3-6 мол. экв., и реакционную смесь оставляли для реакции на 3-5 часов при комнатной температуре. Затем реакционную смесь 5-10-кратно разводили путем добавления предварительно охлажденного 10 мМ одноосновного фосфата натрия и фильтровали через 5 мкм-фильтр. Диафильтрацию тиолированного сахарида проводили против 30-40 объемов диафильтрации предварительно охлажденного 10 мМ одноосновного фосфата натрия с использованием мембранных кассет для ультрафильтрации с отсечкой молекулярной массы 5 кДа. Ретентат тиолированного полисахарида O25b отбирали для определения концентрации сахарида и для анализа на содержание тиола (по Элману). Блок-схема процесса активации представлена на фиг. 25А.

Способ конъюгирования - Конъюгирование тиолированного полисахарида E. coli-O25b с бромацетилированным CRM₁₉₇. Белок-носитель CRM₁₉₇ активировали отдельно путем бромацетилирования, как описано в Примере 13, а затем подвергали взаимодействию с активированным полисахаридом E. coli-O25b для реакции конъюгирования. Бромацетилированный CRM₁₉₇ и тиолированный полисахарид O25b смешивали вместе в реакционном сосуде. Отношение добавленного сахарида/белка составляло 0,8±0,2. рH реакции доводили до 8,0-10,0. Реакционную смесь для конъюгирования оставляли для прохождения реакции на 20±4 часа при 5°С.

Блокирование реакционноспособных групп на бромацетилированном CRM₁₉₇ и тиолированном полисахариде E. coli-O25b. Непрореагировавшие бромацетилированные остатки на белках CRM₁₉₇ блокировали посредством реакции взаимодействия с 2 мол. экв. N-ацетил-L-цистеина в течение 3-5 часов при 5°С с последующим блокированием любых остаточных свободных сульфгидрильных групп тиолированного O25b-полисахарида под действием 4 мол. экв. иодацетамида (IAA) в течение 20-24 часов при 5°С.

Очистка гликоконъюгата E. coli-O25b, связанного с eTEC. Раствор для конъюгирования фильтровали через 0,45 мкм-фильтр или 5 мкм-фильтр. Диалфильтрацию гликоконъюгата O25b проводили с использованием ультрафильтрационных мембранных кассет с отсечкой молекулярной массы 100 кДа. Диафильтрацию осуществляли против 5 мМ сукцината-0,9% физиологического раствора, pH 6,0. Ретентат гликоконъюгата E. coli-O25b 100K затем фильтровали через 0,22 мкм-фильтр и хранили при 5°С.

Блок-схема процесса конъюгирования представлена на фиг. 25B.

Результаты

Параметры реакции и данные характеризации для нескольких партий гликоконъюгатов E. coli-O25b eTEC представлены в Таблице 12. Активация-тиолирование CDI дигидрохлоридом цистамина приводили к образованию гликоконъюгатов, имеющих выход сахаридов от 41% до 92% и свободных сахаридов от <5 до 14%. См. также Таблицу 14, Таблицу 15, Таблицу 16, Таблицу 17 и Таблицу 18.

Таблица 12. Экспериментальные параметры и данные характеризации конъюгатов E. coli-O25b eTEC

Партия конъюгатов	O25b-1A	O25b-2B	O25b-3C	O25b-4D	O25b-5E	O25b-6F
Уровень активации (моль тиола/моль полисахарида), %	10	20	22	17	25	24
Отношение вводимого сахарида/белка	0,8	0,8	0,8	0,8	0,8	0,8
Выход сахарида (%)	56	57	79	92	41	59
Отношение сахарида/белка на выходе	0,88	1	1,18	1,32	2,9	1,4
Свободный сахарид, %	8	˂5	6	5	14	5
Свободный белок, %	< 1	< 1	< 1	< 1	< 1	< 1
Молекулярная масса. конъюгата, кДа	1057	4124	2259	2306	1825	1537
Всего CMCA	3	na	na	7,2	na	na

Пример 15: Процедура получения конъюгатов полисахарида О-антигена E. coli - CRM197 eTEC (применительно к О-антигенам серотипов E. coli O25b, O1a, O2 и O6). Активация полисахарида.

Полисахарид О-антигена E. coli восстанавливали в безводном диметилсульфоксиде (ДМСО). Для инициации активации, к раствору полисахарида добавляли различные количества 1,1'-карбонилдиимидазола (CDI) (1-10 молярных эквивалентов), и реакционную смесь оставляли для прохождения реакции на 1-5 часов при комнатной температуре или при 35°C. Затем, для гашения любого остаточного CDI в растворе для реакции активации добавляли воду (2-3%, об./об.). После прохождения реакции в течение 0,5 часа при комнатной температуре добавляли 1-2 мол. экв. дигидрохлорида цистамина. Реакционную смесь оставляли для прохождения реакции на 5-20 часов при комнатной температуре, а затем обрабатывали 3-6 мол. экв. трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) для получения тиолированного сахарида. Уровень тиолирования определяли путем добавления определенного количества CDI.

Затем реакционную смесь 5-10-кратно разводили путем добавления к ней предварительно охлажденного 10 мМ одноосновного фосфата натрия и фильтровали через 5 мкм-фильтр. Диафильтрацию тиолированного сахарида проводили против 30-40 объемов диафильтрации предварительно охлажденного 10 мМ одноосновного фосфата натрия. Аликвоту активированного ретентата тиолированного сахарида отбирали для определения концентрации сахарида и для анализа на содержание тиола (по Элману).

Активация белка-носителя (CRM₁₉₇)

Сначала, CRM₁₉₇ (в 0,1 М фосфате натрия, pH 8,0 ± 0,2), перед активацией, выдерживали при 8 ±3°С, приблизительно при pH 8. К белковому раствору добавляли N-гидроксисукцинимидоэфир бромуксусной кислоты (BAANS) в виде исходного раствора диметилсульфоксида (ДМСО) (20 мг/мл) в отношении 0,25-0,5 BAANS:белок (масс./масс.). Реакционную смесь осторожно перемешивали при температуре 5±3°С в течение 30-60 минут. Полученный бромацетилированный (активированный) белок очищали, например, с помощью ультрафильтрации/диафильтрации с использованием мембраны с отсечкой молекулярной массы (MWCO) 10 кДа и с использованием 10 мМ фосфатного (pH 7,0) буфера. После очистки, концентрацию бромацетилированного белка-носителя оценивали с помощью анализа Лаури на белок.

Конъюгирование

Активированный CRM₁₉₇и активированный полисахарид О-антигена E. coli затем добавляли в реактор и перемешивали. Отношение вводимого сахарида/белка составляло 1±0,2. рH реакции доводили до 9,0±0,1 с помощью 1 М раствора NaOH. Реакционную смесь для конъюгирования оставляли для прохождения реакции на 20±4 часа при 5°С. Непрореагировавшие бромацетилированные остатки на белке-носителе гасили путем реакции взаимодействия с 2 мол. экв. N-ацетил-L-цистеина в качестве блокирующего реагента в течение 3-5 часов при 5°С. Остаточные свободные сульфгидрильные группы блокировали 4 мол. экв. иодацетамида (IAA) в течение 20-24 часов при 5°С. Затем реакционную смесь очищали с помощью ультрафильтрации/диафильтрации, проводимой против 5 мМ сукцината-0,9% физиологического раствора, pH 6,0. Затем очищенный конъюгат фильтровали через 0,2 мкм-фильтр. См. Таблицу 14, Таблицу 15, Таблицу 16, Таблицу 17 и Таблицу 18.

Пример 16: Общая процедура - Конъюгирование полисахарида О-антигена (из E. coli серотипов O1, O2, O6, 25b) с помощью химической реакции восстановительного аминирования (RAC)

Конъюгирование в диметилсульфоксиде (RAC/ДМСО)

Активация полисахарида

Окисление полисахаридов проводили в 100 мМ натрий-фосфатного буфера (pH 6,0±0,2) путем последовательного добавления расчетного количества 500 мМ натрий-фосфатного буфера (pH 6,0) и воды для инъекций (WFI) до конечной концентрации полисахарида 2,0 г/л. При необходимости, pH реакции доводили до pH приблизительно 6,0. После коррекции pH, температуру реакции снижали до 4°C. Окисление инициировали добавлением приблизительно 0,09-0,13 молярных эквивалентов периодата натрия. Реакцию окисления проводили при 5±3°С в течение приблизительно 20±4 часа.

Концентрирование и диафильтрацию активированного полисахарида проводили с использованием кассет для ультрафильтрации с отсечкой молекулярной массы 5 кДа (MWCO). Диафильтрацию проводили против 20 объемов диафильтации WFI. Затем очищенный активированный полисахарид хранили при 5±3°С. Очищенный активированный сахарид охарактеризовывали inter alia по (i) концентрации сахарида с помощью колориметрического анализа; (ii) концентрации альдегида с помощью колориметрического анализа; (iii) степени окисления; и (iv) молекулярной массы по SEC-MALLS.

Смешивание активированного полисахарида с сахарозным наполнителем и лиофилизация

Активированный полисахарид смешивали с сахарозой до отношения 25 граммов сахарозы на грамм активированного полисахарида. Затем бутыль с компаундированной смесью лиофилизовали. После лиофилизации, бутыли, содержащие лиофилизованный активированный полисахарид, хранили при -20±5°С. Расчетное количество белка CRM₁₉₇ замораживали в герметичных условиях и лиофилизовали отдельно. Лиофилизованный CRM₁₉₇ хранили при -20±5°С.

Восстановление лиофилизованного активированного полисахарида и белка-носителя

Лиофилизованный активированный полисахарид восстанавливали в безводном диметилсульфоксиде (ДМСО). После полного растворения полисахарида, к лиофилизованному CRM₁₉₇добавляли равное количество безводного ДМСО для восстановления.

Конъюгирование и блокирование

Восстановленный активированный полисахарид объединяли с восстановленным CRM₁₉₇ в реакционном сосуде с последующим тщательным перемешиванием до получения прозрачного раствора перед началом реакции конъюгирования с цианоборгидридом натрия. Конечная концентрация полисахарида в реакционном растворе составляла приблизительно 1 г/л. Конъюгирование инициировали добавлением к реакционной смеси 0,5-2,0 мол. экв. цианоборгидрида натрия с последующим инкубированием при 23±2°С в течение 20-48 часов. Реакцию конъюгирования завершали добавлением 2 мол. экв. боргидрида натрия (NaBH₄) для блокирования непрореагировавших альдегидов. Эту реакцию блокирования продолжали при 23±2°С в течение 3±1 часа.

Очистка конъюгата

Раствор конъюгата разводили 1:10 охлажденным 5 мМ сукцинатом-0,9% физиологическим раствором (pH 6,0) в процессе подготовки к очистке путем фильтрации в тангенциальном потоке с использованием мембран MWCO100-300K.

Разведенный раствор конъюгата пропускали через 5 мкм-фильтр и проводили диафильтрацию с использованием 5 мМ сукцината/0,9% физиологического раствора (pH 6,0) в качестве среды. После завершения диафильтрации, ретентат конъюгата пропускали через 0,22 мкм-фильтр. Конъюгат дополнительно разводили 5 мМ сукцината/0,9% физиологического раствора (pH 6) до конечной концентрации сахарида приблизительно 0,5 мг/мл. Альтернативно, конъюгат очищали с использованием 20 мМ гистидина-0,9% физиологического раствора (pH 6,5) путем фильтрации в тангенциальном потоке с использованием мембран 100-300K MWCO. Заключительную стадию фильтрации на 0,22 мкм-фильтре завершали и получали иммуногенный конъюгат. См. Таблицу 14, Таблицу 15, Таблицу 16, Таблицу 17 и Таблицу 18.

Пример 17: Конъюгирование в водном буфере (RAC/вода) применительно к серотипам E. coli O25B, O1A, O2 и O6.

Активацию и диафильтрацию полисахаридов проводили таким же образом, как и для конъюгирования на основе ДМСО.

Отфильтрованный активированный сахарид смешивали с CRM₁₉₇ в массовом соотношении полисахарида к белку в пределах от 0,4 до 2 (масс./масс.) в зависимости от серотипа. Это исходное соотношение было выбрано для регуляции отношения полисахарида к CRM₁₉₇ в полученном конъюгате.

Затем компаундированную смесь лиофилизовали. После конъюгирования, смесь полисахарида и белка растворяли в 0,1 М натрийфосфатном буфере при концентрации полисахарида от 5 до 25 г/л в зависимости от серотипа, а pH регулировали от 6,0 до 8,0 в зависимости от серотипа. Конъюгирование инициировали добавлением к реакционной смеси 0,5-2,0 мол. экв. цианоборгидрида натрия и инкубированием при 23±2°С в течение 20-48 часов. Реакцию конъюгирования прекращали добавлением 1-2 мол. экв. борогидрида натрия (NaBH₄) для блокирования непрореагировавших альдегидов.

Альтернативно, отфильтрованный активированный сахарид и рассчитанное количество белка CRM₁₉₇ замораживали замораживали в герметичных условиях и лиофилизовали отдельно, а затем, объединяли после растворения в 0,1 М натрийфосфатном буфере, с последующим продолжением, если это необходимо, реакции конъюгирования, как описано выше.

В Таблице 13 систематизированы результаты для обоих конъюгатов, полученных в ДМСО и водном буфере.

	RAC/ДМСО	RAC/вода
Мол. масса. полисахарида (кДа)	48K	46K
Степень окисления (DO)	12	12
Отношение сахарид/белок	0,8	1,0
% Свободного сахарида	<5%	32%
Мол. масса. конъюгата по SEC-MALLS, кДа	7950	260

Пример 18: Методика получения конъюгатов полисахарида О-антигена E. coli-CRM₁₉₇ по одному концу

Липополисахариды (ЛПС), которые являются обычными компонентами внешней мембраны грамотрицательных бактерий, включают липид А, область сердцевины и О-антиген (также называемый О-специфическим полисахаридом или О-полисахаридом). Различные серотипы повторяющихся звеньев О-антигена различаются по своему составу, структуре и серологическим свойствам. О-антиген, используемый в настоящем изобретении, присоединяли к домену сердцевины, который содержит сахарное звено, называемое 2-кето-3-дезоксиоктановой кислотой (KDO), на конце своей цепи, в отличие от некоторых методов конъюгирования, основанных на рандомизированной активации полисахаридной цепи (например, активации периодатом натрия или карбодиимидом). В настоящем изобретении раскрывается способ конъюгирования, включающий селективную активацию KDO дисульфидным аминовым линкером, после снятия защитной тиоловой функциональной группы с последующим конъюгированием с бром-активированным белком CRM_197, как показано на фиг. 24 (Получение конъюгатов по одному концу).

Конъюгирование на основе цистаминового линкера (A1)

Полисахарид О-антигена и цистамин (50-250 мол. экв. KDO) смешивали в фосфатном буфере и pH доводили до 6,0-7,0. К смеси добавляли цианоборгидрид натрия (NaCNBH₃) (5-30 мол. экв. KDO) и смесь перемешивали при 37°C в течение 48-72 часов. После охлаждения до комнатной температуры и разведения равным объемом фосфатного буфера, смесь обрабатывали трис(2-карбоксиэтил)фосфином (TCEP) (1,2 мол. экв. добавленного цистамина). Затем смесь очищали путем диафильтрации с использованием мембраны с отсечкой молекулярной массы 5 кДа против 10 мМ раствора одноосновного фосфата натрия с получением тиол-содержащего полисахарида О-антигена. Содержание тиола может быть определено с помощью анализа по Элману.

Затем, реакцию конъюгирования проводили путем смешивания вышеупомянутого активированного тиолом полисахарида О-антигена с бром-активированным белком CRM₁₉₇ в отношении 0,5-2,0. рH реакционной смеси доводили до 8,0-10,0 с помощью 1М раствора NaOH. Реакцию конъюгирования проводили при 5°С в течение 24 ± 4 часов. Остатки непрореагировавшего брома на белке-носителе гасили посредством реакции взаимодействия с 2 мол. экв. N-ацетил-L-цистеина в течение 3-5 часов при 5°С. Затем добавляли 3 мол. экв. иодацетамида (в случае добавления N-ацетил-L-цистеина) для блокирования остаточных свободных сульфгидрильных групп. Эту реакцию блокирования продолжали еще 3-5 часов при 5°С, и pH в обеих стадиях блокирования поддерживали на уровне 8,0-10,0 путем добавления 1М NaOH. Конъюгат получали после ультрафильтрации/диафильтрации с использованием мембраны с отсечкой молекулярной массы 30 кДа против 5 мМ сукцината-0,9% физиологического раствора, pH 6,0. См. Таблицу 14, Таблицу 15, Таблицу 16, Таблицу 17 и Таблицу 18.

Пример 19: Конъюгирование на основе линкера: 3,3'-дитио-бис (дигидразида пропановой кислоты) (A4)

Полисахарид О-антигена и 3,3'-дитио-бис(дигидразид пропановой кислоты) (5-50 мол. экв. KDO) смешивали в ацетатном буфере, и pH доводили до 4,5-5,5. К смеси добавляли цианоборгидрид натрия (NaCNBH₃) (5-30 мол. экв. KDO) и смесь перемешивали при 23-37°C в течение 24-72 часов. Затем смесь обрабатывали трис(2-карбоксиэтил)фосфином (TCEP) (1,2 мол. экв. добавленного линкера 3,3'-дитио-бис(дигидразида пропановой кислоты)). Затем смесь очищали посредством диафильтрации с использованием мембраны с отсечкой молекулярной массы (MWCO) 5 кДа против 10 мМ одноосновного раствора фосфата натрия с получением тиол-содержащего полисахарида О-антигена. Содержание тиола может быть определено с помощью анализов по Элману.

Пример 20: Конъюгирование на основе линкера 2,2'-дитио-N, N'-бис (этан-2,1-диил)бис(2-(аминоокси)ацетамида) (A6)

Полисахарид O-антигена и 2,2'-дитио-N, N'-бис(этан-2,1-диил) бис(2-(аминоокси)ацетамид) (5-50 мол. экв. KDO) смешивали в ацетатном буфере и рH доводили до 4,5-5,5. Затем смесь перемешивали при 23-37°C в течение 24-72 часов с последующим добавлением цианоборгидрида натрия (NaCNBH₃) (5-30 мол. экв. KDO), и смесь перемешивали еще 3-24 часа. Затем смесь обрабатывали трис(2-карбоксиэтил)фосфином (TCEP) (1,2 мол. экв. добавленного линкера). Затем смесь очищали посредством диафильтрации с использованием мембраны с отсечкой молекулярной массы (MWCO) 5 кДа против 10 мМ одноосновного раствора фосфата натрия с получением тиол-содержащего полисахарида О-антигена. Содержание тиола может быть определено с помощью анализов по Элману.

Пример 21: Получение активированного бромом CRM₁₉₇

CRM₁₉₇ получали в 0,1 М растворе фосфата натрия, pH 8,0±0,2, и охлаждали до 5±3°С. К белковому раствору добавляли N-гидроксисукцинимидоэфир бромуксусной кислоты (BAANS) в виде исходного раствора диметилсульфоксида (ДМСО) (20 мг/мл) в соотношении 0,25-0,5 BAANS:белок (масс./масс.). Реакционную смесь осторожно перемешивали при температуре 5±3°С в течение 30-60 минут. Полученный бромацетилированный (активированный) белок очищали, например, путем ультрафильтрации/диафильтрации с использованием мембраны с отсечкой молекулярной массы (MWCO) 10 кДа с использованием 10 мМ фосфатного буфера (pH 7,0). После очистки, концентрацию бромацетилированного белка-носителя оценивали с помощью анализа Лаури на белок.

Таблица 14: Конъюгаты O1a

Конъюгат, партия #	132240-112-2	132242-106	132242-124	132242-127	132242-130
Полисахарид партия #	709756-160	709756-160	709756-160	710958-116	710958-116
Тип полисахарида	Длинная цепь	Короткая цепь
MW полисахарида (кДа)	33	33	33	11	11
Вариант	eTEC	По одному концу	RAC/ДМСО	По одному концу	RAC/ДМСО
Активация	8% SH	2,1% SH	DO: 13	6,4% SH	DO: 16
Данные для конъюгата
Выход (%)	30	26	77	45	35
Отношение SP	0,6	0,5	1,0	0,7	0,6
Свободный сахарид (%)	9	9	20	5	6
MW (кДа)	1035	331	1284	280	2266
Конц. сахарида (мг/мл)	0,31	0,37	0,58	0,59	0,37
Эндотоксин (ЭЕ/мкг)	0,03	0,02	0,01	0,01	0,01
Буфер	5 мM сукцината/физиологического раствора, pH 6,0

Таблица 15. Конъюгаты О2

Конъюгат, партия #	00709749-0003-1	132242-161	132242-152	132242-159	132242-157
Полисахарид партия #	709766-33	709766-65	710958-141-2
Тип полисахарида	Длинная цепь	Короткая цепь
MW полисахарида (кДа)	36	39	14
Вариант	eTEC	По одному концу	RAC/ДМСО	По одному концу	RAC/ДМСО
Активация	6,8% SH	1,6% SH	DO: 17	6,3% SH	DO: 19
Данные для конъюгата
Выход (%)	26	33	50	38	36
Отношение SP	1,5	0,8	0,8	1,0	0,6
Свободный сахарид (%)	11	24%	<5	<5	6
MW (кДа)	1161	422	3082	234	1120
Эндотоксин (ЭЕ/мкг)	0,025	0,02	0,01	0,01	0,01
Буфер	5 мM сукцината/физиологического раствора, pH 6,0

Таблица 16. Конъюгаты О6

Конъюгат, партия #	132240-117-1	132242-134	132242-137	132242-146	132242-145
Полисахарид партия #	710958-121-1	710958-143-3
Тип полисахарида	Длинная цепь	Короткая цепь
MW полисахарида (кДа)	44	15
Вариант	eTEC	По одному концу	RAC/ДМСО	По одному концу	RAC/ДМСО
Активация	18% SH	2,2% SH	DO: 16,5	6,1% SH	DO: 22
Данные для конъюгата
Выход (%)	27	23	58	48	30
Отношение SP	0,78	0,6	0,82	0,7	0,6
Свободный сахарид (%)	9	4	4	<5	8
MW (кДа)	1050	340	1910	256	2058
Конц. сахарида (мг/мл)	0,39	0,45	0,59	0,88	0,41
Эндотоксин (ЭЕ/мкг)	0,03	0,02	0,01	0,004	0,005
Буфер	5 мM сукцината/физиологического раствора, pH 6,0

Таблица 17. Конъюгаты О25b

Конъюгат, партия #	132242-28	132242-98	132240-73-1-1	132240-62-1	132240-81	132242-116	132242-121	132242-27	132242-29
Полисахарид партия #	709766-28	709766-29	709766-30	709766-30	709766-30	710958-117/118	710958-117/118	709766-28	709766-28
Тип полисахарида	Длинная цепь	Короткая цепь	Длинная цепь	Длинная цепь
MW полисахарида (кДа)	51	48	48	48	48	14	14	51	51
Вариант	RAC/ДМСО	По одному концу	eTEC	eTEC	eTEC	По одному концу	RAC/ДМСО	RAC/ДМСО	RAC/ДМСО
Активация	DO: 18	2,4% SH	10% SH	4% SH	17% SH	6,6% SH	DO: 17	21	12
Данные для конъюгата
Выход (%)	82	26	56	32	92	28	18	71	80
Отношение SP	0,9	0,82	0,88	0,64	1,32	0,7	0,36	0,81	0,84
Свободный сахарид (%)	7,2	5	< 5	11	< 5	< 5	< 5	8,3	<5
MW конъюгата (кДа)	4415	840	1057	1029	2306	380	9114	3303	7953
Конц. сахарида (мг/мл)	0,7	0,4	0,43	0,36	0,9	0,45	0,19	0,6	0,67
Эндотоксин (ЭЕ/мкг)	0,01	0,02	0,08	0,08	0,01	0,01	0,01	0,02	0,22
Буферная матрица для конъюгата (DS)	5 мM сукцината/физиологического раствора, pH 6,0

Таблица 18. Конъюгаты K-12 О25b

Конъюгат, партия #	709749-015-2	709744-0016
Полисахарид партия #	710958-137
Тип полисахарида	Длинная цепь (K12)
MW полисахарида (кДа)	44
Вариант	eTEC	RAC/ДМСО
Активация	SH: 24%	DO: 19
Данные для конъюгата
Выход (%)	59%	33%
Отношение SP	1,4	0,83
Свободный сахарид (%)	5%	5,2%
MW (кДа)	1537	4775
Конц. сахарида (мг/мл)	0,91	0,29
Эндотоксин (ЭЕ/мкг)	0,08	0,01
Буфер	5 мM сукцината/физиологического раствора, pH 6,0

Пример 22: Получение конъюгатов O-Ag-TT E. coli

Длинный лиофилизованный полисахарид E. coli серотипа O25b, партия № 709766-30 (приблизительно 6,92 мг/мл, молекулярная масса: приблизительно 39 кДа), 50 мг, использовали для конъюгирования со столбнячным токсоидом (ТТ).

Длинный полисахарид 710958-142-3 E. coli серотипа O1a (приблизительно 6,3 мг/мл, молекулярная масса: приблизительно 44,3 кДа) (50 мг, 7,94 мл) был лиофилизован.

Длинный полисахарид E. coli серотипа O6, 710758-121-1 (приблизительно 16,8 мг/мл, молекулярная масса: приблизительно 44 кДа) (50 мг, 2,98 мл) был лиофилизован.

Каждый из перечисленных выше лиофилизованных полисахаридов растворяли в WFI приблизительно до 5-10 мг/мл, а затем добавляли 0,5 мл (100 мг (раствора тетрафторбората 1-циано-4-диметиламинопиридиния (CDAP) в 1 мл ацетонитрила) и перемешивали при комнатной температуре. Затем добавляли 0,2М (2 мл) триэтиламина (TEA) и перемешивали при комнатной температуре.

Получение столбнячного токсоида (TT):TT (100 мг, 47 мл) концентрировали приблизительно до 20 мл и дважды промывали физиологическим раствором (2×50 мл) с использованием фильтровальных трубок. После этого, его разбавляли HEPES и физиологическим раствором до конечной концентрации HEPES приблизительно 0,25M. ТТ получали, как описано выше, и рH реакционной смеси доводили приблизительно до 9,1-9,2. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре.

Через 20-24 часа, реакцию гасили глицином (0,5 мл). После этого, продукт концентрировали с использованием регенерированных целлюлозных мембран с отсечкой молекулярной массы и проводили диафильтрацию против физиологического раствора. Затем продукт фильтровали и анализировали. См. Таблицу 19.

Таблица 19.

Репрезентативные варианты:

Конъюгат серотипа O25b—TT E. coli

Конъюгат серотипа O6-TT E. coli e

Объем: 41 мл
Концентрация сахарида (Антрона): 1,122 мг/мл (выход 92%)
Концентрация белка (Лаури): 1,133 мг/мл
Отношение SP : 0,99
Свободный сахарид (DOC): 74,7%
Полученный продукт концентрировали до 15 мл с использованием регенерированных целлюлозных мембран с отсечкой молекулярной массы и проводили диафильтрацию против физиологического раствора (40 объемов диафильтрации). Продукт отфильтровывали на 0,22 мкм-фильтре и анализировали.
Объем: 27 мл
Концентрация сахарида (Антрона): 1,041 мг/мл (выход 56%)
Концентрация белка (Лаури): 1,012 мг/мл
Отношение SP: 1,03
Свободный сахарид (DOC): 60.6% (выход полисахарида 100%)

Объем: 42 мл
Концентрация сахарида (Антрона): 0,790 мг/мл (выход: 66%)
Концентрация белка (Лаури): 1,895 мг/мл
Отношение SP: 0,42
Свободный сахарид (DOC):
<5%
MW (кДа): 1192
Эндотоксин (ЭЕ/мкг): 0,022

Пример 23: Дополнительные результаты ферментации О-антигена, очистки и конъюгирования

Репрезентативные процессы, описанные ниже, обычно применимы ко всем серотипам E. coli. Получение каждого полисахарида включает периодическую ферментацию с последующей химической инактивацией перед очисткой.

Штаммы и хранение. Штаммы, используемые для биосинтеза короткоцепочечного О-антигена, представляют собой клинические штаммы E. coli дикого типа. О-антиген с длинной цепью был получен с использованием производных продуцентов с короткой цепью, которые были сконструированы методом Уоннера-Доценко для делеции нативного гена wzzb, и им была сообщена дополнительная функция удлинителя «длинной цепи» fepE Salmonella. Функция fepE экспрессировалась с его нативного промотора на высококопийном векторе «topo» на основе colE1 или на низкокопийном производном вектора pET30a на основе colE1, из которого была удалена область промотора Т7.

Банки клеток получали путем культивирования клеток у любого животного в среде, не содержащей LB, или в минимальной среде до OD₆₀₀ по меньшей мере 3,0. Затем бульон разводили в свежей среде и объединяли с 80% глицерином для получения конечной концентрации глицерина 20% с OD₆₀₀=2,0 на мл.

Среды, используемые для посева культуры и ферментации. Используемые посевная среда и среда для ферментации имеют следующий состав: KH₂PO₄, K₂HPO₄, (NH₄)₂SO₄, цитрат натрия, Na₂SO₄, аспарагиновая кислота, глюкоза, MgSO₄, FeSO₄-7H₂О, Na₂MoO₄-2H₂О, Н₃ВО₃, COCl₂-6H₂O, CuCl₂-2H₂O, MnCl₂-4H₂O, ZnCl₂ и CaCl₂-2H₂O.

Условия посева и ферментации. Посевную культуру инокулировали при 0,1% из одного флакона для посева. Колбу с посевным материалом инкубировали при 37°C в течение 16-18 часов и обычно доводили до OD₆₀₀= 10-20/мл.

Ферментацию проводили в 10-литровом ферментере из нержавеющей стали с подачей пара.

Инокуляция ферментера обычно составляла 1:1000 из посевного материала OD₆₀₀=10. Периодическая фаза, то есть период, в течение которого происходит рост культуры на партии с 10 г/л глюкозы, обычно продолжается 8 часов. После истощения глюкозы, происходит резкое повышение уровня растворенного кислорода, и в этот момент глюкозу подают на ферментацию. Затем ферментацию обычно продолжают в течение 16-18 часов с получением продукта с OD₆₀₀>120/мл.

Первоначальная оценка продуцирования О-антигена с короткой/длинной цепью для серотипов O1a, O2, O6 и O25b. Штаммы дикого типа O1a, O2, O6 и O25b ферментировали в минимальной среде с добавками в периодическом режиме до OD₆₀₀=15-20. После истощения глюкозы, которое приводит к внезапному снижению потребления кислорода, из раствора глюкозы подавали глюкозную подпитку, ограничивающую рост культуры, в течение 16-18 часов. Плотность клеток достигала OD₆₀₀₌124-145 единиц/мл. Затем pH бульонов продукта доводили до приблизительно 3,8 и нагревали до 95°С в течение 2 часов. Затем гидролизованный бульон охлаждали до 25°С, доводили до pH 6,0 и центрифугировали для удаления твердых частиц. Полученный супернатант затем наносили на ЭХ-ВЭЖХ-колонку для количественной оценки O-антигена. Была достигнута продуктивность в пределах 2240-4180 мг/л. Было обнаружено, что молекулярная масса очищенного короткоцепочечного O-антигена из этих партий составляет в пределах 10-15 кДа. Также было отмечено, что ЭХ-хроматография гидролизатов O2 и O6 выявила отчетливый и отделяемый примесный полисахарид, который не наблюдался в гидролизатах O1a и O25b.

Длинноцепочечные варианты O-антигенов O1a, O2, O6 и O25b были получены путем ферментации варианта каждого штамма с делецией wzzb, который имеет гетерологичный комплементирующий ген fepE на высококопийной плазмиде «topo», селективной для канамицина. Ферментацию проводили так же, как и для короткоцепочечных вариантов, хотя и с отбором с использованием канамицина. Конечные плотности клеток, наблюдаемые при OD₆₀₀=124-177 на мл, были ассоциированы с выходом О-антигена 3500-9850 мг/л. Основанный на комплементации синтез длинноцепочечного О-антигена был по меньшей мере таким же продуктивным, как и в случае исходного штамма с короткой цепью, а в некоторых случаях, даже еще более продуктивным. Молекулярная масса очищенного полисахарида О-антигена составляла 33-49 кДа или приблизительно в 3 раза превышала молекулярную массу соответствующего полисахарида с короткой цепью.

Было отмечено, что длинноцепочечные гидролизаты для O2 и O6 указывали на наличие пика загрязняющего полисахарида, который, в случае длинноцепочечного антигена, наблюдался как плечо на основном пике O-антигена; O1 и O25b не указывали на какое-либо присутствие примесного полисахарида, как это наблюдалось ранее для короткоцепочечного родителя.

Было обнаружено, что подавление скорости роста связано с присутствием topo-репликона в отсутствии fepE. Кроме того, мутация ∆wzzb сама по себе не оказывала негативного влияния на скорость роста, что указывает на то, что нарушенная скорость роста сообщалась плазмидным вектором.

Анализ штаммов на продуцирование O-антигена O11, O13, O16, O21 и O75. Множество штаммов дикого типа серотипов O11, O13, O16, O21 и O75 оценивали на их способность к продуцированию нежелательного полисахарида при ферментации с помощью ЭХ-ВЭЖХ. Штаммы O11, O13, O16, O21 и O75 были выбраны из-за отсутствия примесного полисахарида, а также из-за их способности продуцировать >1000 мг/л O-антигена и для отображения профиля чувствительности к антибиотикам, который позволил Уоннеру- Доценко осуществлять рекомбинацию для введения признака ∆wzzb.

Были сконструированы селективные по хлорамфениколу варианты topo-fepE и pET-fepE, которые позволяют вводить fepE в штаммы O11, O13, O16, O21 и O75 ∆wzzb, которые в целом оказались устойчивыми к канамицину. Полученные штаммы, несущие topo-fepE и pET-fepE, ферментировали с отбором по хлорамфениколу, и супернатант гидролизованного кислотой бульона оценивали с помощью ЭХ-ВЭЖХ. Высококопийные (topo) и низкокопийные конструкции (pET) fepE направляли синтез О-антигена с продуктивностью для каждого штамма, которая была эквивалентна продуктивности родительского штамма дикого типа. Экспрессия потенциально интерферирующих полисахаридов не наблюдалась.

Оценка скорости роста штаммов, несущих плазмиду wzzb, показала, что рост O11, O13 и O21 задерживается из-за присутствия topo-fepE, но не pET-fepE; а штаммы O16 и O75 показали приемлемую скорость роста независимо от выбора репликона.

Таблица 20

Тип O-антигена	Тип IHMA	Короткая (SC) или длинная цепь (LC)	Плазмида типа fepE	маркер	Конечная плотность клеок OD₆₀₀	Конечный выход Oag (мг/л)	MW - кДа	ЭХ-примеси
O1a	дикого типа	SC	нет	нет	125	2550	11	N
O1a	Δwzzb/fepE	LC	topo	Kana	130	5530	33	N
O1a	Δwzzb/fepE	LC	pET	Kana	Не оценивали (ND)	ND	ND	ND
O2	дикого типа	SC	нет	нет	127	2240	13	Y
O2	Δwzzb/fepE	LC	topo	Kana	177	3750	49	Y
O2	x	LC	pET	x	NA	NA	NA	NA
O6	дикого типа	SC	нет	нет	145	4180	16	Y
O6	Δwzzb/fepE	LC	topo	Kana	124	9850	44	Y
O6	Δwzzb/fepE	LC	pET	Kana	ND	ND	ND	ND
O11	дикого типа	SC	нет	нет	194	4720	x	N
O11	Δwzzb/fepE	LC	topo	Kana	142	7220	x	N
O11	x	LC	pET	x	NA	NA	NA	NA
O13	дикого типа	SC	нет	x	113	4770	x	N
O13	Δwzzb/fepE	LC	topo	cam	101	4680	x	N
O13	Δwzzb/fepE	LC	pET	cam	108	4600	x	N
O16	дикого типа	SC	нет	x	154	1870	x	N
O16	Δwzzb/fepE	LC	topo	cam	129	1180	x	N
O16	Δwzzb/fepE	LC	pET	cam	137	1280	x	N
O21	дикого типа	SC	нет	x	140	1180	x	N
O21	Δwzzb/fepE	LC	topo	cam	ND	ND	x	N
O21	Δwzzb/fepE	LC	pET	cam	131	820	x	N
O25b	2831	SC	нет	нет	126	3550	10	N
O25b	Δwzzb/fepE	LC	topo	Kana	152	3500	49	N
O25b	x	LC	pET	x	NA	NA	NA	NA
O75	дикого типа	SC	нет	x	149	1690	x	N
O75	Δwzzb/fepE	LC	topo	cam	132	1500	x	N
O75	Δwzzb/fepE	LC	pET	cam	138	1520	x	N

Способ очистки полисахаридов включает кислотный гидролиз для высвобождения О-антигенов. Неочищенную суспензию культуры E. coli, специфичную для определенного серотипа, в реакторе ферментации непосредственно обрабатывали уксусной кислотой до конечного значения pH 3,5±0,5, и подкисленный бульон нагревали до температуры 95±5°С в течение по меньшей мере одного часа. Эта обработка приводила к расщеплению лабильной связи между KDO на проксимальном конце олигосахарида и липидом A, высвобождая, таким образом, цепь O-Ag. Подкисленный бульон, содержащий высвободившийся O-Ag, охлаждали до 20±10°С, а затем нейтрализовали до pH 7±1,0 с помощью NH₄OH. Этот способ также включал несколько стадий центрифугирования, фильтрации и концентрирования/диафильтрации.

Таблица 21

Серотип (сердцевины)	Описание	Ожидаемый размер полисахарида	Титр (г/л)	MW очищенного полисахарида (кДа)	Число повторяющихся звеньев	Увеличение MW (кДа) по сравнению с короткой цепью	ЯМР	MW (кДа) очищенного конъюгата	Партия конъюгатов #
O25b (R1)	ΔwzzB+LT2FepE	Длинный	5,3	47	55	34		5365	132242-28 (RAC/ДМСО)
	ΔwzzB+LT2FepE	Длинный	5,3	47	55	34		1423	132242-98 (По одному концу)
	1258	132240-73-1-1 (eTEC)
	ΔwzzB + O25a wzzB	Короткий	2,3	13/14	15	NA		380	132242-116 (По одному концу)
9114	132242-121 (RAC/ДМСО)
O25b (K12)	ΔwzzB+ LT2FepE	Длинный	3,5	44	51	27		1537	709749-015-2 (eTEC)
O25b (K12)	4775	709744-0016 (RAC/ДМСО
Дикого типа	Короткий	3,5	17	17	NA
O1a (R1)	ΔwzzB+LT2FepE	Длинный	5,5	33	39			1035	132240-112-2 (eTEC)
	ΔwzzB+LT2FepE	Длинный	5,5	33	39	22		331	132242-106 (По одному концу)
		1284	132242-124 (RAC/ДМСО)
	Дикого типа	Короткий	2,5	11	13	NA		280	132242-127 (По одному концу)
2266	132242-130 (RAC/ДМСО)
O2 (R1)	ΔwzzB+LT2FepE	Длинный	4,9	36	43	22		1161	00707947-0003-1 (eTEC)
	ΔwzzB+LT2FepE	Длинный	4,9	39	47	25		422	132242-161 (По одному концу)
	3082	132242-152 (RAC/ДМСО)
	Дикого типа	Короткий	2,8	14	17	NA		234	132242-159 (По одному концу)
1120	1322421-157 (RAC/ДМСО)
O2 (R4)	ΔwzzB+LT2FepE	Длинный	5,1	NA	NA	NA	NA
дикого типа	Короткий	2,1	14,7	18	NA
O6 (R1)	ΔwzzB+LT2FepE	Длинный	6,9	37,2	42	22,2
O6 (R1)	Дикого типа	Короткий	3,5	15	17	NA		256	132242-146 (По одному концу)
		2058	123342-145 (RAC/ДМСО)
O6 (R1)	ΔwzzB+LT2FepE	Длинный	8,4	44,4	50	28,2		1050	132240-117-1 (eTEC)
	ΔwzzB+LT2FepE	Длинный	8,4	44,4	50	28,2		340	132242-134 (По одному концу) 132242-137
	1910	(RAC/ДМСО)
Дикого типа	Короткий t	3,6	16,2	18	NA

В следующих пунктах описаны дополнительные варианты осуществления изобретения:

C1. Сахарид, содержащий любую структуру, выбранную из Формулы O1 (например, Формулы O1A, Формулы O1B и Формулы O1C), Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4 (например, Формулы O4:K52 и Формулы O4:K6), Формулы O5 (например, Формулы O5ab и Формулы O5ac (штамма 180/C3)), Формулы O6 (например, Формулы O6:K2; K13; K15 и Формулы O6:K54), Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18 (например, Формулы O18A, Формулы O18ac, Формулы O18A1, Формулы O18B, и Формулы O18B1), Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23 (например, Формулы O23A), Формулы O24, Формулы O25 (например, Формулы O25a и Формулы O25b), Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45 (например, Формулы O45 и Формулы O45rel), Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы 62D₁, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73 (например, Формулы O73 (штамма 73-1)), Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144, Формулы O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, формула O184, формула O185, формула O186 и Формулы O187, где n представляет собой целое число от 1 до 100.

C2. Сахарид в соответствии с пунктом C1, содержащий структуру, выбранную из формулы O1 (например, формулы O1A, формулы O1B и формулы O1C), формулы O2, формулы O3, формулы O4 (например, формулы O4:K52 и формулы O4:K6), Формулы O5 (например, Формулы O5ab и Формулы O5ao (штамма 180/C3)), Формулы O6 (например, Формулы O6:K2; K13; K15 и Формулы O6:K54), Формулы O7, Формулы O10, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18 (например, Формулы O18A, Формулы O18ao, Формулы O18A1, Формулы O18B и Формулы O18B1), Формулы O21, Формулы O23 (например, Формулы O23A), Формулы O24, Формулы O25 (например, Формулы O25a и Формулы O25b), Формулы O26, Формулы O28, Формулы O44, Формулы O45 (например, Формулы O45 и Формулы O45rel), Формулы O55, Формулы O56, Формулы O58, Формулы O64, Формулы O69, Формулы O73 (например, Формулы O73 (штамма 73-1)), Формулы O75, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O86, Формулы O88, Формулы O90, Формулы O98, Формулы O104, Формулы 0111, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O119, Формулы O121, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O136, Формулы O138, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O147, Формулы O149, Формулы O152, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O164, Формулы O173, Формулы 62D₁, Формулы O22, Формулы O35, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O83, Формулы O91, Формулы O105, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O139, Формулы O153, Формулы O167 и Формулы O172, где n представляет собой целое число от 20 до 100.

C3. Сахарид в соответствии с пунктом C2, содержащий структуру, выбранную из формулы O1 (например, формулы O1A, формулы O1B и формулы O1C), формулы O2, формулы O3, формулы O4 (например, формулы O4:K52 и формулы O4:K6), Формулы O5 (например, Формулы O5ab и Формулы O5aс (штамма 180/C3)), Формулы O6 (например, Формулы O6:K2; K13; K15 и Формулы O6:K54), Формулы O7, Формулы O10, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18 (например, Формулы O18A, Формулы O18aс, Формулы O18A1, Формулы O18B и Формулы O18B1), Формулы O21, Формулы O23 (например, Формулы O23A), Формулы O24, Формулы O25 (например, Формулы O25a и Формулы O25b), Формулы O26, Формулы O28, Формулы O44, Формулы O45 (например, Формулы O45 и Формулы O45rel), Формулы O55, Формулы O56, Формулы O58, Формулы O64, Формулы O69, Формулы O73 (например, Формулы O73 (штамма 73-1)), Формулы O75, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O86, Формулы O88, Формулы O90, Формулы O98, Формулы O104, Формулы 0111, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O119, Формулы O121, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O136, Формулы O138, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O147, Формулы O149, Формулы O152, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O164, Формулы O173 и Формулы 62D₁, где n представляет собой целое число от 20 до 100.

C4. Сахарид в соответствии с пунктом C2, содержащий структуру, выбранную из формулы O1 (например, формулы O1A, формулы O1B и формулы O1C), формулы O2, формулы O6 (например, формулы O6:K2; K13; K15 и формула O6:K54), Формулы O15, Формулы O16, Формулы O21, Формулы O25 (например, Формулы O25a и Формулы O25b) и Формулы O75.

C5. Сахарид в соответствии с пунктом C1, где сахарид не содержит структуру, выбранную из Формулы O8, Формулы O9a, Формулы O9, Формулы O20ab, Формулы O20ac, Формулы O52, Формулы O97 и Формулы O101.

С6. Сахарид в соответствии с пунктом С1, где сахарид не содержит структуру, выбранную из Формулы O12.

С7. Сахарид в соответствии с пунктом С4, где сахарид получают посредством экспрессии белка семейства wzz в грамотрицательной бактерии с образованием указанного сахарида.

С8. Сахарид в соответствии с пунктом С7, где белок семейства wzz выбран из группы, состоящей из wzzB, wzz, wzz_SF, wzz_ST, fepE, wzz_fepE, wzz1 и wzz2.

С9. Сахарид в соответствии с пунктом С7, где белок семейства wzz представляет собой wzzB.

C10. Сахарид в соответствии с пунктом C7, где белок семейства wzz представляет собой fepE.

C11. Сахарид в соответствии с пунктом C7, где белок семейства wzz представляет собой wzzB и fepE.

C12. Сахарид в соответствии с пунктом C7, где белок семейства wzz происходит от Salmonella enterica.

C13. Сахарид в соответствии с пунктом C7, где белок семейства wzz содержит любую последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19.

C14. Сахарид в соответствии с пунктом C7, где белок семейства wzz содержит последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична любой из SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19.

C15. Сахарид в соответствии с пунктом C7, где белок семейства wzz содержит любую последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19.

C16. Сахарид в соответствии с пунктом С1, где сахарид является синтезированным.

C17. Сахарид в соответствии с любым из пунктов С1-С16, где сахарид дополнительно содержит фрагмент R1 E. coli.

C18. Сахарид в соответствии с любым из пунктов С1-С16, где сахарид дополнительно содержит фрагмент R2 E.coli.

C19. Сахарид в соответствии с любым из пунктов С1-С16, где сахарид дополнительно содержит фрагмент R3 E. coli.

C20. Сахарид в соответствии с любым из пунктов С1-С16, где сахарид дополнительно содержит фрагмент R4 E. coli.

C21. Сахарид в соответствии с любым из пунктов С1-С16, где сахарид дополнительно содержит фрагмент К-12 E. coli.

C22. Сахарид в соответствии с любым из пунктов С1-С21, где сахарид дополнительно содержит фрагмент 3-дезокси-d-манно-окт-2-улозоновой кислоты (KDO).

C23. Сахарид в соответствии с любым из пунктов С1-С16, где сахарид дополнительно не содержит фрагмент R1 E. coli.

C24. Сахарид в соответствии с любым из пунктов С1-С16, где сахарид дополнительно не содержит фрагмент R2 E. coli.

C25. Сахарид в соответствии с любым из пунктов С1-С16, где сахарид дополнительно не содержит фрагмент R3 E. coli.

C26. Сахарид в соответствии с любым из пунктов С1-С16, где сахарид дополнительно не содержит фрагмент R4 E. coli.

C27. Сахарид в соответствии с любым из пунктов С1-С16, где сахарид дополнительно не содержит фрагмент К-12 E. coli.

C28. Сахарид в соответствии с любым из пунктов С1-С21, где сахарид дополнительно не содержит фрагмент 3-дезокси-d-манноокт-2-улозоновой кислоты (KDO).

C29. Сахарид в соответствии с любым из пунктов С1-С22, где сахарид не содержит липид А.

C30. Сахарид в соответствии с любым из пунктов С1-С29, где полисахарид имеет молекулярную массу от 10 кДа до 2000 кДа или от 50 кДа до 2000 кДа.

C31. Сахарид в соответствии с любым из пунктов C1-C30, где сахарид имеет среднюю молекулярную массу 20-40 кДа.

C32. Сахарид в соответствии с любым из пунктов С1-С31, где сахарид имеет среднюю молекулярную массу от 40000 до 60000 кДа.

C33. Сахарид по любому из пунктов от C1 до C32, где n представляет собой целое число от 31 до 90.

C34. Конъюгат, содержащий сахарид, ковалентно связанный с белком-носителем, где сахарид происходит от E. coli.

C35. Конъюгат, содержащий сахарид в соответствии с любым из пунктов C1 - C33, ковалентно связанный с белком-носителем.

C36. Конъюгат в соответствии с любым из пунктов C34 - C35, где белок-носитель выбран из CRM_197, фрагмента B дифтерийного токсина (DTFB), DTFB C8, дифтерийного токсоида (DT), столбнячного токсоида (TT), фрагмента C TT, коклюшного токсоида, холерного токсоида или экзотоксина A от Pseudomonas aeruginosa; детоксифицированного экзотоксина A от P. aeruginosa (EPA), белка, связывающегося с мальтозой (MBP), детоксифицированного гемолизина A от S. aureus, фактора свертывания крови A, фактора свертывания крови B, субъединицы холерного токсина B (CTB), пневмолизина Streptococcus pneumoniae и его детоксифицированных вариантов, AcrA C. jejuni и природных гликопротеинов C. jejuni.

C37. Конъюгат в соответствии с любым из пунктов C34 - C36, где белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

C38. Конъюгат в соответствии с любым из пунктов C34 - C36, где белок-носитель представляет собой столбнячный токсоид (ТТ).

C39. Конъюгат в соответствии с любым из пунктов C34 - C38, где конъюгат получают посредством восстановительного аминирования.

C40. Конъюгат в соответствии с любым из пунктов C34 - C38, где конъюгат получают посредством химической реакции CDAP.

C41. Конъюгат в соответствии с любым из пунктов C34 - C38, где конъюгат представляет собой конъюгированный сахарид, связанный по одному концу.

C42. Конъюгат в соответствии с любым из пунктов C34 - C38, где сахарид конъюгирован с белком-носителем посредством (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбаматного (eTEC) спейсера.

C43. Конъюгат в соответствии с пунктом C42, где сахарид конъюгирован с белком-носителем посредством (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбаматного (eTEC) спейсера, где сахарид ковалентно связан со спейсером eTEC посредством карбаматной связи, и где белок-носитель ковалентно связан со спейсером eTEC посредством амидной связи.

C44. Конъюгат в соответствии с любым из пунктов C42 - C43, где CRM₁₉₇ содержит от 2 до 20 или от 4 до 16 лизиновых остатков, ковалентно связанных с полисахаридом посредством спейсера eTEC.

C45. Конъюгат в соответствии с любым из пунктов C34 - C44, где отношение сахарид:белок-носитель (масс./масс.) составляет от 0,2 до 4.

C46. Конъюгат в соответствии с любым из пунктов C34 - C44, где отношение сахарида к белку составляет по меньшей мере 0,5 и максимум 2.

C47. Конъюгат в соответствии с любым из пунктов C34 - C44, где отношение сахарида к белку составляет от 0,4 до 1,7.

C48. Конъюгат в соответствии с любым из пунктов C41 - C47, где сахарид конъюгирован с белком-носителем посредством остатка 3-дезокси-d-манно-окт-2-улозоновой кислоты (KDO).

C49. Конъюгат, содержащий сахарид, ковалентно связанный с белком-носителем, где сахарид включает структуру, выбранную из Формулы O8, Формулы O9a, Формулы O9, Формулы O20ab, Формулы O20ac, Формулы O52, Формулы O97 и Формулы O101, где n представляет собой целое число от 1 до 10.

C50. Композиция, содержащая сахарид в соответствии с любым из пунктов C1 - C33 и фармацевтически приемлемый разбавитель.

C51. Композиция, содержащая конъюгат в соответствии с любым из пунктов C34 - C49 и фармацевтически приемлемый разбавитель.

C52. Композиция в соответствии с пунктом C51, содержащая максимум приблизительно 25% свободных сахарида от общего количества сахарида в композиции.

C53. Композиция в соответствии с любым из пунктов C50 - C51, дополнительно содержащая адъювант.

C54. Композиция в соответствии с любым из пунктов C50 - C51, дополнительно содержащая алюминий.

C55. Композиция в соответствии с любым из пунктов C50-C51, дополнительно содержащая QS-21.

C56. Композиция в соответствии с любым из пунктов C50-C51, дополнительно содержащая CpG-олигонуклеотид.

C57. Композиция в соответствии с любым из пунктов C50 - C51, где композиция не включает адъювант.

C58. Композиция, содержащая сахарид, происходящий от E. coli и конъюгированный с белком-носителем посредством (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбаматного (eTEC) спейсера, где полисахарид ковалентно связан со спейсером eTEC посредством карбаматной связи, и где белок-носитель ковалентно связан со спейсером eTEC посредством амидной связи.

C59. Композиция в соответствии с пунктом C58, где сахарид представляет собой O-антиген, происходящий от E. coli.

C60. Композиция в соответствии с пунктом C58, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый наполнитель, носитель или разбавитель.

C61. Композиция в соответствии с пунктом C58, где сахарид представляет собой O-антиген, происходящий от E. coli.

C62. Композиция, содержащая сахарид в соответствии с любым из пунктов C1-C16, конъюгированный с белком-носителем посредством (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбаматного (eTEC) спейсера, где полисахарид ковалентно связан со спейсером eTEC посредством карбаматной связи, и где белок-носитель ковалентно связан со спейсером eTEC посредством амидной связи.

C63. Композиция, содержащая: (i) конъюгат антигена E. coli O25B, ковалентно связанного с белком-носителем, (ii) конъюгат антигена O1A E. coli, ковалентно связанного с белком-носителем, (iii) конъюгат антигена O2 E. coli, ковалентно связанного с белком-носителем, и (iv) конъюгат антигена O6, ковалентно связанного с белком-носителем, где антиген O25B E. coli имеет структуру Формулы O25B, где n представляет собой целое число больше 30.

C64. Композиция в соответствии с пунктом C63, где антиген O1A, антиген O6 и антиген O2 включает следующие Формулы, соответственно:

C65. Композиция в соответствии с пунктом C63, где белок-носитель выбран из CRM_197, фрагмента B дифтерийного токсина (DTFB), DTFB C8, дифтерийного токсоида (DT), столбнячного токсоида (TT), фрагмента C TT, коклюшного токсоида, холерного токсоида или экзотоксина A от Pseudomonas aeruginosa; детоксифицированного экзотоксина A от P. aeruginosa (EPA), белка, связывающегося с мальтозой (MBP), детоксифицированного гемолизина A от S. aureus, фактора свертывания крови A, фактора свертывания крови B, субъединицы холерного токсина B (CTB), пневмолизина Streptococcus pneumoniae и его детоксифицированных вариантов, AcrA C. jejuni и природных гликопротеинов C. jejuni.

C66. Способ получения конъюгата, содержащего сахарид, конъюгированный с белком-носителем посредством (2-((2-оксоэтил) тио)этил)карбаматного (eTEC) спейсера, где указанный способ включает стадии а) реакции взаимодействия сахарида с 1,1’-карбонил-ди-(1,2,4-триазолом) (CDT) или 1,1'-карбонилдиимидазолом (CDI) в органическом растворителе с получением активированного сахарида; b) реакции взаимодействия активированного сахарида с цистамином или цистеамином или их солью с образованием тиолированного сахарида; c) реакции взаимодействия тиолированного сахарида с восстанавителем с образованием активированного тиолированного сахарида, содержащего один или более свободных сульфгидрильных остатков; d) реакции взаимодействия активированного тиолированного сахарида с активированным белком-носителем, содержащим одну или более α-галогенацетамидных групп, с образованием конъюгата «тиолированный сахарид - белок-носитель»; и e) реакции взаимодействия конъюгата «тиолированный сахарид - белок-носитель» (i) с первым блокирующим реагентом, способным блокировать неконъюгированные α-галогенацетамидные группы активированного белка-носителя; и/или (ii) со вторым блокирующим реагентом, способным блокировать неконъюгированные свободные сульфгидрильные остатки, с получением гликоконъюгата, связанного с eTEC, где сахарид происходит от E. coli.

C67. Способ в соответствии с пунктом C66, где сахарид включает сахарид в соответствии с любым из пунктов C1 - C33.

C68. Способ в соответствии с любым из пунктов C66 - C67, где стадия блокирования е) включает реакцию взаимодействия конъюгата «тиолированный сахарид - белок-носитель» с (i) N-ацетил-L-цистеином в качестве первого блокирующего реагента и/или (ii) иодацетамидом в качестве второго блокирующего реагента.

C69. Способ в соответствии с любым из пунктов C66 - C68, дополнительно включающий стадию компаундирования сахарида посредством реакции взаимодействия с триазолом или имидазолом с получением компаундированного сахарида, где компаундированный сахарид замораживают в герметичных условиях, лиофилизуют и восстанавливают в органическом растворителе перед проведением стадии а).

C70. Способ в соответствии с любым из пунктов C66 - C69, дополнительно включающий очистку тиолированного полисахарида, полученного на стадии c), где стадия очистки включает диафильтрацию.

C71. Способ в соответствии с любым из пунктов C66 - C70, где способ дополнительно включает очистку гликоконъюгата, связанного с eTEC, путем диафильтрации.

C72. Способ в соответствии с любым из пунктов C66 - C71, где органический растворитель стадии а) представляет собой полярный апротонный растворитель, выбранный из диметилсульфоксида (ДМСО), диметилформамида (ДМФ), диметилацетамида (ДМА), N-метил-2-пирролидона (NMP), ацетонитрила, 1,3-диметил-3,4,5,6-тетрагидро-2(1H)-пиримидинона (DMPU) и гексаметилфосфорамида (HMPA) или их смеси.

C73. Среда, содержащая KH₂PO₄, K₂HPO₄, (NH₄)₂SO₄, цитрат натрия, Na₂SO₄, аспарагиновую кислоту, глюкозу, MgSO₄, FeSO₄-7H₂O, Na₂MoO₄-2H₂O, H₃BO₃, CoCl₂-6H₂O, CuCl₂-2H₂O, MnCl₂-4H₂O, ZnCl₂ и CaCl₂-2H₂O.

C74. Среда в соответствии с пунктом C73, где среду используют для культивирования E. coli.

C75. Способ получения сахарида в соответствии с любым из пунктов C1 - C33, включающий культивирование рекомбинантной E. coli в среде; получение указанного сахарида путем культивирования указанной клетки в указанной среде, где указанная клетка продуцирует указанный сахарид.

C76. Способ в соответствии с пунктом C75, где среда содержит элемент, выбранный из KH₂PO₄, K₂HPO₄, (NH₄)₂SO₄, цитрата натрия, Na₂SO₄, аспарагиновой кислоты, глюкозы, MgSO₄, FeSO₄-7H₂O, Na₂MoO₄-2H₂O, H₃BO₃, CoCl₂-6H₂O, CuCl₂-2H₂O, MnCl₂-4H₂O, ZnCl₂ и CaCl₂-2H₂O.

C77. Способ в соответствии с пунктом C75, где среда содержит гидролизат сои.

C78. Способ в соответствии с пунктом C75, где среда содержит дрожжевой экстракт.

C79. Способ в соответствии с пунктом C75, где среда дополнительно не содержит гидролизат сои и дрожжевой экстракт.

C80. Способ в соответствии с пунктом C75, где клетка E. coli содержит гетерологичный белок семейства wzz, выбранный из wzzB, wzz, wzz_SF, wzz_ST, fepE, wzz_fepE, wzz1 и wzz2.

C81. Способ в соответствии с пунктом C75, где клетка E. coli содержит белок семейства wzz Salmonella enterica, выбранный из wzzB, wzz, wzz_SF, wzz_ST, fepE, wzz_fepE, wzz1 и wzz2.

C82. Способ в соответствии с пунктом C81, где белок семейства wzz включает любую последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19.

C83. Способ в соответствии с пунктом C75, где культивирование дает выход с OD₆₀₀ > 120/мл.

C84. Способ в соответствии с пунктом C75, дополнительно включающий очистку сахарида.

C85. Способ в соответствии с пунктом C75, где стадия очистки включает любую из следующих процедур: диализ, концентрирование, диафильтрацию, фильтрацию в тангенциальном потоке, осаждение, элюирование, центрифугирование, преципитацию, ультрафильтрацию, глубинную фильтрацию и колоночную хроматографию (ионообменную хроматографию, мультимодальную ионообменную хроматографию, DEAE и гидрофобную хроматографию).

C86. Способ индуцирования иммунного ответа у млекопитающего, включающий введение индивидууму композиции в соответствии с любым из пунктов C50 - C62.

C87. Способ в соответствии с пунктом C73, где иммунный ответ включает продуцирование сывороточного антитела против O-специфического полисахарида E. coli.

C88. Способ в соответствии с пунктом C73, где иммунный ответ включает продуцирование антитела IgG против E. coli.

C89. Способ в соответствии с пунктом C73, где иммунный ответ включает индуцирование бактерицидной активности против E. coli.

C90. Способ в соответствии с пунктом C73, где иммунный ответ включает индуцирование опсонофагоцитарных антител против E. coli.

C91. Способ в соответствии с пунктом C73, где иммунный ответ включает среднее геометрическое значение титра (GMT), составляющее по меньшей мере от 1000 до 200000 после введения первой дозы.

C92. Способ в соответствии с пунктом C73, где композиция содержит сахарид, имеющий формулу O25, где n равно целому числу от 40 до 100, и где иммунный ответ включает среднее геометрическое значение титра (GMT), составляющее по меньшей мере от 1000 до 200000 после введения первой дозы.

C93. Способ в соответствии с пунктом C73, где млекопитающее подвержено риску развития любого из состояний, выбранных из инфекции мочевых путей, холецистита, холангита, диареи, гемолитическо-уремического синдрома, неонатального менингита, уросепсиса, внутрибрюшинной инфекции, менингита, осложнений пневмонии, раневой инфекции, инфекции после биопсии предстательной железы, неонатального/детского сепсиса, нейтропенической лихорадки и другой инфекции системного кровотока; пневмонии, бактериемии и сепсиса.

C94. Способ в соответствии с пунктом C73, где млекопитающее имеет любое состояние, выбранное из инфекции мочевых путей, холецистита, холангита, диареи, гемолитическо-уремического синдрома, неонатального менингита, уросепсиса, внутрибрюшинной инфекции, менингита, осложнений пневмонии, раневой инфекции, инфекции после биопсии предстательной железы, неонатального/детского сепсиса, нейтропенической лихорадки и другой инфекции системного кровотока; пневмонии, бактериемии и сепсиса.

C95. Способ (i) индуцирования иммунного ответа у индивидуума против внекишечных патогенных Escherichia coli, (ii) индуцирования иммунного ответа у индивидуума против внекишечных патогенных Escherichia coli или (iii) индуцирования продуцирования опсонофагоцитарных антител у индивидуума, которые являются специфичными к внекишечным патогенным Escherichia coli, где указанный способ включает введение индивидууму эффективного количества композиции в соответствии с любым из пунктов C50- C65.

C96. Способ в соответствии с пунктом C95, где индивидуум подвержен риску развития инфекции мочевых путей.

C97. Способ в соответствии с пунктом C95, где индивидуум подвержен риску развития бактериемии.

C98. Способ в соответствии с пунктом C95, где ндивидуум подвержен риску развития сепсиса.

C99. Композиция, содержащая (i) конъюгат антигена O25B E. coli, ковалентно связанного с белком-носителем, (ii) конъюгат антигена O1A E. coli, ковалентно связанного с белком-носителем, (iii) конъюгат антигена O2 E. coli, ковалентно связанного с белком-носителем, и (iv) конъюгат антигена O6, ковалентно связанного с белком-носителем, где антиген O25B E. coli имеет структуру Формулы O25B, где n представляет собой целое число больше 30.

C100. Композиция в соответствии с пунктом C1, где антиген O1A, антиген O6 и антиген O2 включают следующие Формулы, соответственно:

C101. Композиция в соответствии с пунктом C1, где белок-носитель выбран из группы, состоящей из детоксифицированного экзотоксина A от P. aeruginosa (EPA), CRM197, белка, связывающегося с мальтозой (MBP), дифтерийного токсоида, столбнячного токсоида, детоксифицированного гемолизина A от S. aureus, фактора свертывания крови А, фактора свертывания крови В, субъединицы холерного токсина B (CTB), холерного токсина, детоксифицированных вариантов холерного токсина, пневмолизина Streptococcus pneumoniae и его детоксифицированных вариантов, AcrA C. jejuni и природных гликопротеинов C. jejuni.

C102. Способ (i) индуцирования иммунного ответа у индивидуума против внекишечной патогенной Escherichia coli, (ii) индуцирования иммунного ответа у индивидуума против внекишечной патогенной Escherichia coli, или (iii) индуцирования продуцирования опсонофагоцитарных антител у индивидуума, специфичных к внекишечным патогенным Escherichia coli, где указанный способ включает введение индивидууму эффективного количества композиции по пункту C1.

C103. Способ в соответствии с пунктом C102, где индивидуум подвержен риску развития инфекции мочевых путей.

C104. Способ в соответствии с пунктом C102, где индивидуум подвержен риску развития бактериемии.

C105. Способ в соответствии с пунктом C102, где индивидуум подвержен риску развития сепсиса.

C106. Сахарид, содержащий по меньшей мере на 5 повторяющихся звеньев больше, чем соответствующий O-полисахарид дикого типа E. coli.

C107. Сахарид в соответствии с пунктом C106, где сахарид имеет Формулу O25a, а E. coli представляет собой E. coli серотипа O25a.

C108. Сахарид в соответствии с пунктом C106, где сахарид имеет Формулу O25b, а E. coli представляет собой E. coli серотипа O25b.

C109. Сахарид в соответствии с пунктом C106, где сахарид имеет Формулу O2, а E. coli представляет собой E. coli серотипа O2.

С110. Сахарид в соответствии с пунктом С106, где сахарид имеет Формулу O6, а E. coli представляет собой E. coli серотипа О6.

C111. Сахарид в соответствии с пунктом C106, где сахарид имеет Формулу O1, а E. coli представляет собой E. coli серотипа O1.

C112. Сахарид в соответствии с пунктом C106, где сахарид имеет Формулу O17, а E. coli представляет собой E. coli серотипа O17.

C113. Сахарид в соответствии с пунктом C106, где сахарид имеет структуру, выбранную из: Формулы O1, Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4, Формулы O5, Формулы O6, Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18, Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23, Формулы O24, Формулы O25, Формулы O25b, Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45, Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73, Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144, Формулы O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186 и Формулы O187, где n представляет собой целое число от 5 до 1000.

C114. Сахарид в соответствии с пунктом C106, где E. coli представляет собой E. coli серотипа, выбранного из группы, состоящей из: O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18, O19, O20, O21, O22, O23, O24, O25, O25b, O26, O27, O28, O29, O30, O32, O33, O34, O35, O36, O37, O38, O39, O40, O41, O42, O43, O44, O45, O46, O48, O49, O50, O51, O52, O53, O54, O55, O56, O57, O58, O59, O60, O61, O62, O63, O64, O65, O66, O68, O69, O70, O71, O73, O74, O75, O76, O77, O78, O79, O80, O81, O82, O83, O84, O85, O86, O87, O88, O89, O90, O91, О92, О93, О95, О96, О97, O98, O99, O100, O101, O102, O103, O104, O105, O106, O107, O108, O109, O110, 0111, O112, O113, O114, O115, O116, O117, O118, O119, O120, O121, O123, O124, O125, O126, O127, O128, O129, O130, O131, O132, O133, O134, O135, O136, O137, O138, O139, O140, O141, O142, O143, O144, O145, O146, O147, O146, O147 O149, O150, O151, O152, O153, O154, O155, O156, O157, O158, O159, O160, O161, O162, O163, O164, O165, O166, O167, O168, O169, O170, O171, O172, О173, O174, O175, O176, O177, O178, O179, O180, O181, O182, O183, O184, O185, O186 и O187.

C115. Сахарид в соответствии с пунктом C106, где сахарид получают посредством увеличения количества повторяющихся звеньев O-полисахаридов, продуцируемых грамотрицательной бактерией в культуре, посредством сверхэкспрессии белков семейства wzz в грамотрицательной бактерии с образованием указанного сахарида.

C116. Сахарид в соответствии с пунктом C115, где сверхэкспрессированный белок семейства wzz выбран из группы, состоящей из wzzB, wzz, wzz_SF, wzz_ST, fepE, wzz_fepE, wzz1 и wzz2.

C117. Сахарид в соответствии с пунктом C115, где сверхэкспрессируемый белок семейства wzz представляет собой wzzB.

C118. Сахарид в соответствии с пунктом C115, где сверхэкспрессируемый белок семейства wzz представляет собой fepE.

C119. Сахарид в соответствии с пунктом C115, где сверхэкспрессируемый белок семейства wzz представляет собой wzzB и fepE.

C120. Сахарид в соответствии с пунктом C106, где сахарид является синтетическим.

C121. Конъюгат, содержащий сахарид в соответствии с пунктом C106, ковалентно связанный с белком-носителем.

C122. Конъюгат в соответствии с пунктом C121, где белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

C123. Конъюгат в соответствии с пунктом C121, где сахарид имеет структуру, выбранную из: Формулы O1, Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4, Формулы O5, Формулы O6, Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18, Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23, Формулы O24, Формулы O25, Формулы O25b, Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45, Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73, Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144, Формулы O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186, и Формулы O187, где n представляет собой целое число от 5 до 1000.

C124. Конъюгат в соответствии с пунктом C121, где указанный сахарид содержит по меньшей мере на 5 повторяющихся звеньев больше, чем соответствующий O-полисахарид дикого типа.

C125. Композиция, содержащая сахарид в соответствии с пунктом 1 и дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый разбавитель.

C126. Композиция в соответствии с пунктом C125, дополнительно содержащая адъювант.

C127. Композиция в соответствии с пунктом C125, дополнительно содержащая алюминий.

C128. Композиция в соответствии с пунктом C125, дополнительно содержащая QS-21.

C129. Композиция в соответствии с пунктом C125, где композиция не включает адъювант.

C130. Способ индуцирования иммунного ответа у индивидуума, включающий введение индивидууму композиции в соответствии с пунктом C125.

C131. Композиция, содержащая конъюгат в соответствии с пунктом C121 и дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый разбавитель.

C132. Способ индуцирования иммунного ответа у индивидуума, включающий введение индивидууму композиции в соответствии с пунктом C131.

C133. Способ в соответствии с пунктами C130 или C132, где иммунный ответ включает продуцирование сывороточного антитела против O-специфического полисахарида E. coli.

C134. Способ в соответствии с пунктом C133, где сывороточное антитело против O-специфического полисахарида E. coli представляет собой антитело IgG.

C135. Способ в соответствии с пунктом C133, где сывороточное антитело против O-специфического полисахарида E. coli представляет собой антитело IgG, обладающее бактерицидной активностью против E. coli.

C136. Иммуногенная композиция, содержащая сахарид, происходящий от E. coli и конъюгированный с белком-носителем посредством (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбаматного (eTEC) спейсера, где полисахарид ковалентно связан со спейсером eTEC посредством карбаматной связи, и где белок-носитель ковалентно связан со спейсером eTEC посредством амидной связи.

C137. Иммуногенная композиция в соответствии с пунктом C136, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый наполнитель, носитель или разбавитель.

C138. Иммуногенная композиция в соответствии с пунктом C136, где сахарид представляет собой О-антиген, происходящий от E. coli.

C139. Иммуногенная композиция в соответствии с пунктом C136, где сахарид имеет структуру, выбранную из: Формулы O1, Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4, Формулы O5, Формулы O6, Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18, Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23, Формулы O24, Формулы O25, Формулы O25b, Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45, Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73, Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O115, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144, Формулы O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы О150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186 и Формулы O187, где n целое число от 5 до 1000.

C140. Иммуногенная композиция в соответствии с пунктом C136, где сахарид имеет степень O-ацетилирования 75-100%.

C141. Иммуногенная композиция в соответствии с пунктом C136, где белок-носитель представляет собой CRM197.

C142. Иммуногенная композиция в соответствии с пунктом C141, где CRM197 содержит от 2 до 20 лизиновых остатков, ковалентно связанных с полисахаридом посредством спейсера eTEC.

C143. Иммуногенная композиция в соответствии с пунктом C141, где CRM197 содержит от 4 до 16 лизиновых остатков, ковалентно связанных с полисахаридом посредством спейсера eTEC.

C144. Иммуногенная композиция в соответствии с пунктом C136, дополнительно содержащая дополнительный антиген.

C145. Иммуногенная композиция в соответствии с пунктом C136, дополнительно содержащая адъювант.

C146. Иммуногенная композиция в соответствии с пунктом C145, где адъювант представляет собой адъювант на основе алюминия, выбранный из группы, состоящей из фосфата алюминия, сульфата алюминия и гидроксида алюминия.

C147. Иммуногенная композиция в соответствии с пунктом C136, где композиция не содержит адъювант.

C148. Иммуногенная композиция, содержащая гликоконъюгат, включающий сахарид, происходящий от E. coli и конъюгированный с белком-носителем, где гликоконъюгат получают посредством восстановительного аминирования.

C149. Иммуногенная композиция в соответствии с пунктом C148, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый наполнитель, носитель или разбавитель.

C150. Иммуногенная композиция в соответствии с пунктом C148, где сахарид представляет собой О-антиген, происходящий от E. coli.

C151. Иммуногенная композиция в соответствии с пунктом C148, где сахарид имеет структуру, выбранную из: Формулы O1, Формулы O2, Формулы O3, Формулы O4, Формулы O5, Формулы O6, Формулы O7, Формулы O8, Формулы O9, Формулы O10, Формулы O11, Формулы O12, Формулы O13, Формулы O14, Формулы O15, Формулы O16, Формулы O17, Формулы O18, Формулы O19, Формулы O20, Формулы O21, Формулы O22, Формулы O23, Формулы O24, Формулы O25, Формулы O25b, Формулы O26, Формулы O27, Формулы O28, Формулы O29, Формулы O30, Формулы O32, Формулы O33, Формулы O34, Формулы O35, Формулы O36, Формулы O37, Формулы O38, Формулы O39, Формулы O40, Формулы O41, Формулы O42, Формулы O43, Формулы O44, Формулы O45, Формулы O46, Формулы O48, Формулы O49, Формулы O50, Формулы O51, Формулы O52, Формулы O53, Формулы O54, Формулы O55, Формулы O56, Формулы O57, Формулы O58, Формулы O59, Формулы O60, Формулы O61, Формулы O62, Формулы O63, Формулы O64, Формулы O65, Формулы O66, Формулы O68, Формулы O69, Формулы O70, Формулы O71, Формулы O73, Формулы O74, Формулы O75, Формулы O76, Формулы O77, Формулы O78, Формулы O79, Формулы O80, Формулы O81, Формулы O82, Формулы O83, Формулы O84, Формулы O85, Формулы O86, Формулы O87, Формулы O88, Формулы O89, Формулы O90, Формулы O91, Формулы O92, Формулы O93, Формулы O95, Формулы O96, Формулы O97, Формулы O98, Формулы O99, Формулы O100, Формулы O101, Формулы O102, Формулы O103, Формулы O104, Формулы O105, Формулы O106, Формулы O107, Формулы O108, Формулы O109, Формулы O110, Формулы 0111, Формулы O112, Формулы O113, Формулы O114, Формулы O116, Формулы O116, Формулы O117, Формулы O118, Формулы O119, Формулы O120, Формулы O121, Формулы O123, Формулы O124, Формулы O125, Формулы O126, Формулы O127, Формулы O128, Формулы O129, Формулы O130, Формулы O131, Формулы O132, Формулы O133, Формулы O134, Формулы O135, Формулы O136, Формулы O137, Формулы O138, Формулы O139, Формулы O140, Формулы O141, Формулы O142, Формулы O143, Формулы O144, Формулы O145, Формулы O146, Формулы O147, Формулы O148, Формулы O149, Формулы O150, Формулы O151, Формулы O152, Формулы O153, Формулы O154, Формулы O155, Формулы O156, Формулы O157, Формулы O158, Формулы O159, Формулы O160, Формулы O161, Формулы O162, Формулы O163, Формулы O164, Формулы O165, Формулы O166, Формулы O167, Формулы O168, Формулы O169, Формулы O170, Формулы O171, Формулы O172, Формулы O173, Формулы O174, Формулы O175, Формулы O176, Формулы O177, Формулы O178, Формулы O179, Формулы O180, Формулы O181, Формулы O182, Формулы O183, Формулы O184, Формулы O185, Формулы O186 и Формулы O187, где n представляет собой целое число от 5 до 1000.

C152. Иммуногенная композиция в соответствии с пунктом C148, где сахарид имеет степень O-ацетилирования 75-100%.

C153. Иммуногенная композиция в соответствии с пунктом C148, где белок-носитель представляет собой CRM197.

C154. Иммуногенная композиция в соответствии с пунктом C148, также содержащая дополнительный антиген.

C155. Иммуногенная композиция в соответствии с пунктом C148, дополнительно содержащая адъювант.

C156. Иммуногенная композиция в соответствии с пунктом C155, где адъювант представляет собой адъювант на основе алюминия, выбранный из группы, состоящей из фосфата алюминия, сульфата алюминия и гидроксида алюминия.

C157. Иммуногенная композиция в соответствии с пунктом C148, где композиция не содержит адъювант.

C158. Способ индуцирования иммунного ответа у индивидуума, включающий введение индивидууму композиции в соответствии с любым из пунктов C136-C157.

C159. Способ в соответствии с пунктом C158, где иммунный ответ включает индуцирование вырабатывания сывороточного антитела против O-специфического полисахарида E. coli.

C160. Способ в соответствии с пунктом C133, где сывороточное антитело против O-специфического полисахарида E. coli представляют собой антитело IgG.

C161. Способ в соответствии с пунктом C133, где сывороточное антитело против O-специфического полисахарида E. coli представляют собой антитело IgG, обладающее бактерицидной активностью против E. coli.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Pfizer Inc.

Donald, Robert G.K.

<120> КОМПОЗИЦИИ ESCHERICHIA COLI И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> PC72429

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая последовательность; LT2wzzB_S

<400> 1

gaagcaaacc gtacgcgtaa ag 22

<210> 2

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая последовательность; LT2wzzB_AS

<400> 2

cgaccagctc ttacacggcg 20

<210> 3

<211> 36

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая последовательность; O25bFepE_S

<400> 3

gaaataggac cactaataaa tacacaaatt aataac 36

<210> 4

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая последовательность; O25bFepE_A

<400> 4

ataattgacg atccggttgc c 21

<210> 5

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая последовательность; wzzB P1_S

<400> 5

gctatttacg ccctgattgt cttttgt 27

<210> 6

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая последовательность; wzzB P2_AS

<400> 6

attgagaacc tgcgtaaacg gc 22

<210> 7

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая последовательность; wzzB P3_S

<400> 7

tgaagagcgg ttcagataac ttcc 24

<210> 8

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая последовательность; wzzB P4_AS

<400> 8

cgatccggaa acctcctaca c 21

<210> 9

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая последовательность; O157 FepE_S

<400> 9

gattattcgc gcaacgctaa acagat 26

<210> 10

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая последовательность; O157 FepE_AS

<400> 10

tgatcattga cgatccggta gcc 23

<210> 11

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая последовательность; pBAD33_адаптор_S

<400> 11

cggtagctgt aaagccaggg gcggtagcgt ggtttaaacc caagcaacag atcggcgtcg 60

tcggtatgga 70

<210> 12

<211> 78

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая последовательность; pBAD33_адаптор_AS

<400> 12

agcttccata ccgacgacgc cgatctgttg cttgggttta aaccacgcta ccgcccctgg 60

ctttacagct accgagct 78

<210> 13

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая последовательность; JUMPSTART_r

<400> 13

ggtagctgta aagccagggg cggtagcgtg 30

<210> 14

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая последовательность; gnd_f

<400> 14

ccataccgac gacgccgatc tgttgcttgg 30

<210> 15

<211> 377

<212> БЕЛОК

<213> Escherichia coli

<400> 15

Met Ser Ser Leu Asn Ile Lys Gln Gly Ser Asp Ala His Phe Pro Asp

1 5 10 15

Tyr Pro Leu Ala Ser Pro Ser Asn Asn Glu Ile Asp Leu Leu Asn Leu

20 25 30

Ile Ser Val Leu Trp Arg Ala Lys Lys Thr Val Met Ala Val Val Phe

35 40 45

Ala Phe Ala Cys Ala Gly Leu Leu Ile Ser Phe Ile Leu Pro Gln Lys

50 55 60

Trp Thr Ser Ala Ala Val Val Thr Pro Pro Glu Pro Val Gln Trp Gln

65 70 75 80

Glu Leu Glu Lys Ser Phe Thr Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Asp Ile

85 90 95

Lys Ile Asp Arg Thr Glu Ala Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Gln

100 105 110

Ser Val Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met

115 120 125

Asp Gln Leu Lys Glu Ala Lys Ile Asp Glu Leu Asp Leu His Arg Ala

130 135 140

Ile Val Ala Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Asp Asn Ala Ser

145 150 155 160

Lys Lys Lys Asp Glu Pro Ser Leu Tyr Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe

165 170 175

Thr Ala Pro Thr Ser Glu Glu Ala Gln Thr Val Leu Ser Gly Tyr Ile

180 185 190

Asp Tyr Ile Ser Thr Leu Val Val Lys Glu Ser Leu Glu Asn Val Arg

195 200 205

Asn Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gln Phe Glu Lys Glu Lys Leu Ala Gln

210 215 220

Asp Arg Ile Lys Thr Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu

225 230 235 240

Asn Tyr Ser Leu Asp Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Lys Pro Val

245 250 255

Tyr Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser

260 265 270

Leu Gly Ala Asp Gly Ile Glu Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Ala Val

275 280 285

Thr Asp Val Ala Glu Leu Asn Gly Glu Leu Arg Asn Arg Gln Tyr Leu

290 295 300

Val Glu Gln Leu Thr Lys Ala His Val Asn Asp Val Asn Phe Thr Pro

305 310 315 320

Phe Lys Tyr Gln Leu Ser Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Pro

325 330 335

Gly Lys Ala Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Ile Gly Gly Met Val

340 345 350

Ala Cys Gly Gly Val Leu Leu Arg Tyr Ala Met Ala Ser Arg Lys Gln

355 360 365

Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val

370 375

<210> 16

<211> 377

<212> БЕЛОК

<213> Escherichia coli

<400> 16

Met Ser Ser Leu Asn Ile Lys Gln Gly Ser Glu Ala His Phe Pro Glu

1 5 10 15

Tyr Pro Leu Ala Ser Pro Ser Asn Asn Glu Ile Asp Leu Leu Asn Leu

20 25 30

Ile Glu Val Leu Trp Arg Ala Lys Lys Thr Val Met Ala Val Val Phe

35 40 45

Ala Phe Ala Cys Ala Gly Leu Leu Ile Ser Phe Ile Leu Pro Gln Lys

50 55 60

Trp Thr Ser Ala Ala Val Val Thr Pro Pro Glu Pro Val Gln Trp Gln

65 70 75 80

Glu Leu Glu Lys Thr Phe Thr Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Asp Ile

85 90 95

Lys Ile Asp Arg Thr Glu Ala Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Gln

100 105 110

Ser Val Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met

115 120 125

Asp Gln Leu Lys Glu Ala Lys Ile Asp Pro Leu Asp Leu His Arg Ala

130 135 140

Ile Val Ala Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Asp Asn Ala Ser

145 150 155 160

Lys Lys Lys Asp Glu Ser Ala Leu Tyr Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe

165 170 175

Thr Ala Pro Thr Ser Glu Glu Ala Gln Lys Val Leu Ala Gly Tyr Ile

180 185 190

Asp Tyr Ile Ser Ala Leu Val Val Lys Glu Ser Ile Glu Asn Val Arg

195 200 205

Asn Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gln Phe Glu Lys Glu Lys Leu Ala Gln

210 215 220

Asp Arg Ile Lys Thr Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu

225 230 235 240

Asn Tyr Ser Leu Asp Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Lys Pro Val

245 250 255

Tyr Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser

260 265 270

Leu Gly Ala Asp Gly Ile Glu Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Ala Val

275 280 285

Thr Asp Val Ala Glu Leu Asn Gly Glu Leu Arg Asn Arg Gln Tyr Leu

290 295 300

Val Glu Gln Leu Thr Lys Thr Asn Ile Asn Asp Val Asn Phe Thr Pro

305 310 315 320

Phe Lys Tyr Gln Leu Arg Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Gln

325 330 335

Gly Lys Ala Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Val Gly Gly Met Val

340 345 350

Ala Cys Gly Gly Val Leu Leu Arg His Ala Met Ala Ser Arg Lys Gln

355 360 365

Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val

370 375

<210> 17

<211> 377

<212> БЕЛОК

<213> Escherichia coli

<400> 17

Met Ser Ser Leu Asn Ile Lys Gln Gly Ser Asp Ala His Phe Pro Asp

1 5 10 15

Tyr Pro Leu Ala Ser Pro Ser Asn Asn Glu Ile Asp Leu Leu Asn Leu

20 25 30

Ile Ser Val Leu Trp Arg Ala Lys Lys Thr Val Met Ala Val Val Phe

35 40 45

Ala Phe Ala Cys Ala Gly Leu Leu Ile Ser Phe Ile Leu Pro Gln Lys

50 55 60

Trp Thr Ser Ala Ala Val Val Thr Pro Pro Glu Pro Val Gln Trp Gln

65 70 75 80

Glu Leu Glu Lys Ser Phe Thr Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Asp Ile

85 90 95

Lys Ile Asp Arg Thr Glu Ala Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Gln

100 105 110

Ser Val Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met

115 120 125

Asp Gln Leu Lys Glu Ala Lys Ile Asp Glu Leu Asp Leu His Arg Ala

130 135 140

Ile Val Ala Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Asp Asn Ala Ser

145 150 155 160

Lys Lys Lys Asp Glu Pro Ser Leu Tyr Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe

165 170 175

Thr Ala Pro Thr Ser Glu Glu Ala Gln Thr Val Leu Ser Gly Tyr Ile

180 185 190

Asp Tyr Ile Ser Thr Leu Val Val Lys Glu Ser Leu Glu Asn Val Arg

195 200 205

Asn Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gln Phe Glu Lys Glu Lys Leu Ala Gln

210 215 220

Asp Arg Ile Lys Thr Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu

225 230 235 240

Asn Tyr Ser Leu Asp Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Lys Pro Val

245 250 255

Tyr Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser

260 265 270

Leu Gly Ala Asp Gly Ile Glu Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Ala Val

275 280 285

Thr Asp Val Ala Glu Leu Asn Gly Glu Leu Arg Asn Arg Gln Tyr Leu

290 295 300

Val Glu Gln Leu Thr Lys Ala His Val Asn Asp Val Asn Phe Thr Pro

305 310 315 320

Phe Lys Tyr Gln Leu Ser Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Pro

325 330 335

Gly Lys Ala Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Ile Gly Gly Met Val

340 345 350

Ala Cys Gly Gly Val Leu Leu Arg Tyr Ala Met Ala Ser Arg Lys Gln

355 360 365

Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val

370 375

<210> 18

<211> 377

<212> БЕЛОК

<213> Escherichia coli

<400> 18

Met Ser Ser Leu Asn Ile Lys Gln Gly Ser Asp Ala His Phe Pro Asp

1 5 10 15

Tyr Pro Leu Ala Ser Pro Ser Asn Asn Glu Ile Asp Leu Leu Asn Leu

20 25 30

Ile Ser Val Leu Trp Arg Ala Lys Lys Thr Val Met Ala Val Val Phe

35 40 45

Ala Phe Ala Cys Ala Gly Leu Leu Ile Ser Phe Ile Leu Pro Gln Lys

50 55 60

Trp Thr Ser Ala Ala Val Val Thr Pro Pro Glu Pro Val Gln Trp Gln

65 70 75 80

Glu Leu Glu Lys Thr Phe Thr Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Asp Ile

85 90 95

Lys Ile Asp Arg Thr Glu Ala Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Gln

100 105 110

Ser Val Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met

115 120 125

Asp Gln Leu Lys Glu Ala Lys Ile Asp Glu Leu Asp Leu His Arg Ala

130 135 140

Ile Val Ala Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Asp Asn Ala Ser

145 150 155 160

Lys Lys Lys Asp Glu Pro Ser Leu Tyr Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe

165 170 175

Thr Ala Pro Thr Ser Glu Glu Ala Gln Thr Val Leu Ser Gly Tyr Ile

180 185 190

Asp Tyr Ile Ser Ala Leu Val Val Lys Glu Ser Ile Glu Asn Val Arg

195 200 205

Asn Lys Leu Glu Ile Lys Thr Gln Phe Glu Lys Glu Lys Leu Ala Gln

210 215 220

Asp Arg Ile Lys Met Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu

225 230 235 240

Asn Tyr Ser Leu Asp Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Lys Pro Val

245 250 255

Tyr Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser

260 265 270

Leu Gly Ala Asp Gly Ile Glu Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Ala Val

275 280 285

Thr Asp Val Ala Glu Leu Asn Gly Glu Leu Arg Asn Arg Gln Tyr Leu

290 295 300

Val Glu Gln Leu Thr Lys Ala Asn Ile Asn Asp Val Asn Phe Thr Pro

305 310 315 320

Phe Lys Tyr Gln Leu Ser Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Pro

325 330 335

Gly Lys Ala Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Ile Gly Gly Met Val

340 345 350

Ala Cys Gly Ser Val Leu Leu Arg Tyr Ala Met Ala Ser Arg Lys Gln

355 360 365

Asp Ala Met Met Ala Asp His Leu Val

370 375

<210> 19

<211> 378

<212> БЕЛОК

<213> Salmonella enterica

<400> 19

Met Pro Ser Leu Asn Val Lys Gln Glu Lys Asn Gln Ser Phe Ala Gly

1 5 10 15

Tyr Ser Leu Pro Pro Ala Asn Ser His Glu Ile Asp Leu Phe Ser Leu

20 25 30

Ile Glu Val Leu Trp Gln Ala Lys Arg Arg Ile Leu Ala Thr Val Phe

35 40 45

Ala Phe Ala Cys Val Gly Leu Leu Leu Ser Phe Leu Leu Pro Gln Lys

50 55 60

Trp Thr Ser Gln Ala Ile Val Thr Pro Ala Glu Ser Val Gln Trp Gln

65 70 75 80

Gly Leu Glu Arg Thr Leu Thr Ala Leu Arg Val Leu Asp Met Glu Val

85 90 95

Ser Val Asp Arg Gly Ser Val Phe Asn Leu Phe Ile Lys Lys Phe Ser

100 105 110

Ser Pro Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Leu Arg Ser Ser Pro Tyr Val Met

115 120 125

Asp Gln Leu Lys Gly Ala Gln Ile Asp Glu Gln Asp Leu His Arg Ala

130 135 140

Ile Val Leu Leu Ser Glu Lys Met Lys Ala Val Asp Ser Asn Val Gly

145 150 155 160

Lys Lys Asn Glu Thr Ser Leu Phe Thr Ser Trp Thr Leu Ser Phe Thr

165 170 175

Ala Pro Thr Arg Glu Glu Ala Gln Lys Val Leu Ala Gly Tyr Ile Gln

180 185 190

Tyr Ile Ser Asp Ile Val Val Lys Glu Thr Leu Glu Asn Ile Arg Asn

195 200 205

Gln Leu Glu Ile Lys Thr Arg Tyr Glu Gln Glu Lys Leu Ala Met Asp

210 215 220

Arg Val Arg Leu Lys Asn Gln Leu Asp Ala Asn Ile Gln Arg Leu His

225 230 235 240

Tyr Ser Leu Glu Ile Ala Asn Ala Ala Gly Ile Lys Arg Pro Val Tyr

245 250 255

Ser Asn Gly Gln Ala Val Lys Asp Asp Pro Asp Phe Ser Ile Ser Leu

260 265 270

Gly Ala Asp Gly Ile Ser Arg Lys Leu Glu Ile Glu Lys Gly Val Thr

275 280 285

Asp Val Ala Glu Ile Asp Gly Asp Leu Arg Asn Arg Gln Tyr His Val

290 295 300

Glu Gln Leu Ala Ala Met Asn Val Ser Asp Val Lys Phe Thr Pro Phe

305 310 315 320

Lys Tyr Gln Leu Ser Pro Ser Leu Pro Val Lys Lys Asp Gly Pro Gly

325 330 335

Lys Ala Ile Ile Ile Ile Leu Ala Ala Leu Ile Gly Gly Met Met Ala

340 345 350

Cys Gly Gly Val Leu Leu Arg His Ala Met Val Ser Arg Lys Met Glu

355 360 365

Asn Ala Leu Ala Ile Asp Glu Arg Leu Val

370 375

<210> 20

<211> 325

<212> БЕЛОК

<213> Escherichia coli

<400> 20

Met Arg Val Glu Asn Asn Asn Val Ser Gly Gln Asn His Asp Pro Glu

1 5 10 15

Gln Ile Asp Leu Ile Asp Leu Leu Val Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met

20 25 30

Thr Ile Ile Ile Ser Val Ile Val Ala Ile Ala Leu Ala Ile Gly Tyr

35 40 45

Leu Ala Val Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln

50 55 60

Pro Asp Val Gly Gln Ile Ala Gly Tyr Asn Asn Ala Met Asn Val Ile

65 70 75 80

Tyr Gly Gln Ala Ala Pro Lys Val Ser Asp Leu Gln Glu Thr Leu Ile

85 90 95

Gly Arg Phe Ser Ser Ala Phe Ser Ala Leu Ala Glu Thr Leu Asp Asn

100 105 110

Gln Glu Glu Pro Glu Lys Leu Thr Ile Glu Pro Ser Val Lys Asn Gln

115 120 125

Gln Leu Pro Leu Thr Val Ser Tyr Val Gly Gln Thr Ala Glu Gly Ala

130 135 140

Gln Met Lys Leu Ala Gln Tyr Ile Gln Gln Val Asp Asp Lys Val Asn

145 150 155 160

Gln Glu Leu Glu Lys Asp Leu Lys Asp Asn Ile Ala Leu Gly Arg Lys

165 170 175

Asn Leu Gln Asp Ser Leu Arg Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln

180 185 190

Lys Asp Leu Arg Ile Arg Gln Ile Gln Glu Ala Leu Gln Tyr Ala Asn

195 200 205

Gln Glu Gln Val Thr Lys Pro Gln Val Gln Gln Thr Glu Asp Val Thr

210 215 220

Gln Asp Thr Leu Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ala Leu Glu Ser Met Ile

225 230 235 240

Lys His Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Ser Asn Tyr Tyr Gln

245 250 255

Thr Arg Gln Asn Leu Leu Asp Ile Glu Ser Leu Lys Val Asp Asp Leu

260 265 270

Asp Ile His Ala Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Thr Leu Pro Ile Arg

275 280 285

Arg Asp Ser Pro Lys Lys Ala Ile Thr Leu Ile Leu Ala Val Leu Leu

290 295 300

Gly Gly Met Val Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu Arg

305 310 315 320

Asn Tyr Asn Ala Lys

325

<210> 21

<211> 326

<212> БЕЛОК

<213> Escherichia coli

<400> 21

Met Arg Val Glu Asn Asn Asn Val Ser Gly Gln Asn Asn Asp Pro Glu

1 5 10 15

Gln Ile Asp Leu Ile Asp Leu Leu Val Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met

20 25 30

Thr Ile Ile Ile Ser Val Ile Val Ala Ile Ala Leu Ala Ile Gly Tyr

35 40 45

Leu Ala Val Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln

50 55 60

Pro Asp Val Gly Gln Ile Ala Gly Tyr Asn Asn Ala Met Asn Val Ile

65 70 75 80

Tyr Gly Gln Ala Ala Pro Lys Val Ser Asp Leu Gln Glu Thr Leu Ile

85 90 95

Gly Arg Phe Ser Ser Ala Phe Ser Ala Leu Ala Glu Thr Leu Asp Asn

100 105 110

Gln Asp Glu Pro Glu Lys Leu Thr Ile Glu Pro Ser Val Lys Asn Gln

115 120 125

Gln Leu Pro Leu Thr Val Ser Tyr Val Gly Gln Thr Ala Glu Gly Ala

130 135 140

Gln Met Lys Leu Ala Gln Tyr Ile Gln Gln Val Asp Asp Lys Val Asn

145 150 155 160

Gln Glu Leu Glu Lys Asp Leu Lys Asp Asn Ile Ala Leu Gly Arg Lys

165 170 175

Asn Leu Gln Asp Ser Leu Arg Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln

180 185 190

Lys Asp Leu Arg Ile Arg Gln Ile Gln Glu Ala Leu Gln Tyr Ala Asn

195 200 205

Gln Ala Gln Val Thr Lys Pro Gln Ile Gln Gln Thr Gly Glu Asp Ile

210 215 220

Thr Gln Asp Thr Leu Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ala Leu Glu Ser Met

225 230 235 240

Ile Lys His Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Pro Asn Tyr Tyr

245 250 255

Gln Thr Arg Gln Asn Leu Leu Asp Ile Glu Ser Leu Lys Val Asp Asp

260 265 270

Leu Asp Ile His Ala Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Thr Leu Pro Ile

275 280 285

Arg Arg Asp Ser Pro Lys Lys Ala Ile Thr Leu Ile Leu Ala Val Leu

290 295 300

Leu Gly Gly Met Val Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu

305 310 315 320

Arg Asn Tyr Asn Ala Lys

325

<210> 22

<211> 326

<212> БЕЛОК

<213> Escherichia coli

<400> 22

Met Arg Val Glu Asn Asn Asn Val Ser Gly Gln Asn His Asp Pro Glu

1 5 10 15

Gln Ile Asp Leu Ile Asp Leu Leu Val Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met

20 25 30

Thr Ile Ile Ile Ser Val Val Val Ala Ile Ala Leu Ala Ile Gly Tyr

35 40 45

Leu Ala Val Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln

50 55 60

Pro Asp Val Gly Gln Ile Ala Gly Tyr Asn Asn Ala Met Asn Val Ile

65 70 75 80

Tyr Gly Gln Ala Ala Pro Lys Val Ser Asp Leu Gln Glu Thr Leu Ile

85 90 95

Gly Arg Phe Ser Phe Ala Phe Ser Ala Leu Ala Glu Thr Leu Asp Asn

100 105 110

Gln Lys Glu Pro Glu Lys Leu Thr Ile Glu Pro Ser Val Lys Asn Gln

115 120 125

Gln Leu Pro Leu Thr Val Ser Tyr Val Gly Gln Thr Ala Glu Asp Ala

130 135 140

Gln Met Lys Leu Ala Gln Tyr Ile Gln Gln Val Asp Asp Lys Val Asn

145 150 155 160

Gln Glu Leu Glu Lys Asp Leu Lys Asp Asn Leu Ala Leu Gly Arg Lys

165 170 175

Asn Leu Gln Asp Ser Leu Arg Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln

180 185 190

Lys Asp Leu Arg Ile Arg Gln Ile Gln Glu Ala Leu Gln Tyr Ala Asn

195 200 205

Gln Ala Gln Val Thr Lys Pro Gln Ile Gln Gln Thr Gly Glu Asp Ile

210 215 220

Thr Gln Asp Thr Leu Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ala Leu Glu Ser Met

225 230 235 240

Ile Lys His Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Pro Asn Tyr Tyr

245 250 255

Gln Thr Arg Gln Asn Leu Leu Asp Ile Glu Asn Leu Lys Val Asp Asp

260 265 270

Leu Asp Ile His Ala Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Thr Leu Pro Ile

275 280 285

Arg Arg Asp Ser Pro Lys Lys Ala Ile Thr Leu Ile Leu Ala Val Leu

290 295 300

Leu Gly Gly Met Val Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu

305 310 315 320

Arg Asn Tyr Asn Ser Lys

325

<210> 23

<211> 326

<212> БЕЛОК

<213> Escherichia coli

<400> 23

Met Arg Val Glu Asn Asn Asn Val Ser Gly Gln Asn His Asp Pro Glu

1 5 10 15

Gln Ile Asp Leu Ile Asp Leu Leu Val Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met

20 25 30

Thr Ile Ile Ile Ser Val Ile Val Ala Ile Ala Leu Ala Ile Gly Tyr

35 40 45

Leu Ala Val Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln

50 55 60

Pro Asp Val Gly Gln Ile Ala Gly Tyr Asn Asn Ala Met Asn Val Ile

65 70 75 80

Tyr Gly Gln Ala Ala Pro Lys Val Ser Asp Leu Gln Glu Thr Leu Ile

85 90 95

Gly Arg Phe Ser Ser Ala Phe Ser Ala Leu Ala Glu Thr Leu Asp Asn

100 105 110

Gln Glu Glu Arg Glu Lys Leu Thr Ile Glu Pro Ser Val Lys Asn Gln

115 120 125

Gln Leu Pro Leu Thr Val Ser Tyr Val Gly Gln Thr Ala Glu Gly Ala

130 135 140

Gln Met Lys Leu Ala Gln Tyr Ile Gln Gln Val Asp Asp Lys Val Asn

145 150 155 160

Gln Glu Leu Glu Lys Asp Leu Lys Asp Asn Ile Ala Leu Gly Arg Lys

165 170 175

Asn Leu Gln Asp Ser Leu Arg Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln

180 185 190

Lys Asp Leu Arg Ile Arg Gln Ile Gln Glu Ala Leu Gln Tyr Ala Asn

195 200 205

Gln Ala Gln Val Thr Lys Pro Gln Ile Gln Gln Thr Gly Glu Asp Ile

210 215 220

Thr Gln Asp Thr Leu Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ala Leu Glu Ser Met

225 230 235 240

Ile Lys His Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Pro Asn Tyr Tyr

245 250 255

Gln Thr Arg Gln Asn Leu Leu Asp Ile Glu Ser Leu Lys Val Asp Asp

260 265 270

Leu Asp Ile His Ala Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Met Leu Pro Ile

275 280 285

Arg Arg Asp Ser Pro Lys Lys Ala Ile Thr Leu Ile Leu Ala Val Leu

290 295 300

Leu Gly Gly Met Val Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu

305 310 315 320

Arg Asn Tyr Asn Ala Lys

325

<210> 24

<211> 327

<212> БЕЛОК

<213> Salmonella enterica

<400> 24

Met Thr Val Asp Ser Asn Thr Ser Ser Gly Arg Gly Asn Asp Pro Glu

1 5 10 15

Gln Ile Asp Leu Ile Glu Leu Leu Leu Gln Leu Trp Arg Gly Lys Met

20 25 30

Thr Ile Ile Val Ala Val Ile Ile Ala Ile Leu Leu Ala Val Gly Tyr

35 40 45

Leu Met Ile Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Thr Ala Ile Ile Thr Gln

50 55 60

Pro Asp Ala Ala Gln Val Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Leu Asn Val Leu

65 70 75 80

Tyr Gly Gly Asn Ala Pro Lys Ile Ser Glu Val Gln Ala Asn Phe Ile

85 90 95

Ser Arg Phe Ser Ser Ala Phe Ser Ala Leu Ser Glu Val Leu Asp Asn

100 105 110

Gln Lys Glu Arg Glu Lys Leu Thr Ile Glu Gln Ser Val Lys Gly Gln

115 120 125

Ala Leu Pro Leu Ser Val Ser Tyr Val Ser Thr Thr Ala Glu Gly Ala

130 135 140

Gln Arg Arg Leu Ala Glu Tyr Ile Gln Gln Val Asp Glu Glu Val Ala

145 150 155 160

Lys Glu Leu Glu Val Asp Leu Lys Asp Asn Ile Thr Leu Gln Thr Lys

165 170 175

Thr Leu Gln Glu Ser Leu Glu Thr Gln Glu Val Val Ala Gln Glu Gln

180 185 190

Lys Asp Leu Arg Ile Lys Gln Ile Glu Glu Ala Leu Arg Tyr Ala Asp

195 200 205

Glu Ala Lys Ile Thr Gln Pro Gln Ile Gln Gln Thr Gln Asp Val Thr

210 215 220

Gln Asp Thr Met Phe Leu Leu Gly Ser Asp Ala Leu Lys Ser Met Ile

225 230 235 240

Gln Asn Glu Ala Thr Arg Pro Leu Val Phe Ser Pro Ala Tyr Tyr Gln

245 250 255

Thr Lys Gln Thr Leu Leu Asp Ile Lys Asn Leu Lys Val Thr Ala Asp

260 265 270

Thr Val His Val Tyr Arg Tyr Val Met Lys Pro Thr Leu Pro Val Arg

275 280 285

Arg Asp Ser Pro Lys Thr Ala Ile Thr Leu Val Leu Ala Val Leu Leu

290 295 300

Gly Gly Met Ile Gly Ala Gly Ile Val Leu Gly Arg Asn Ala Leu Arg

305 310 315 320

Ser Tyr Lys Pro Lys Ala Leu

325

<---

1. Сахарид для вырабатывания иммунного ответа против Escherichia coli у млекопитающего, имеющий структуру

где n представляет собой целое число от 31 до 100 в его Формуле для каждой молекулы сахарида.

2. Сахарид по п.1, где сахарид продуцируют в рекомбинантной клетке-хозяине, которая экспрессирует белок семейства wzz, имеющий последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична любой из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19.

3. Сахарид по п.2, где белок содержит любую из SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19.

4. Сахарид по п. 1, где сахарид получают путем синтеза.

5. Конъюгат для вырабатывания иммунного ответа против Escherichia coli у млекопитающего, содержащий белок-носитель, ковалентно связанный с сахаридом, где указанный сахарид имеет структуру

где n представляет собой целое число от 31 до 100 в его Формуле для каждой молекулы сахарида.

6. Конъюгат по п. 5, где сахарид дополнительно содержит любой из фрагмента R1 E. coli, фрагмента R2 E. coli, фрагмента R3 E. coli, фрагмента R4 E. coli и фрагмента K-12 E. coli.

7. Конъюгат по п. 5, где сахарид дополнительно не содержит фрагмент R2 E. coli.

8. Конъюгат по п. 5, где сахарид дополнительно содержит фрагмент 3-дезокси-d-манно-окт-2-улозоновой кислоты (KDO).

9. Конъюгат по п. 5, где белок-носитель выбран из дифтерийного токсина CRM_197, фрагмента B дифтерийного токсина (DTFB), DTFB C8, дифтерийного токсоида (DT), столбнячного токсоида (TT), фрагмента C TT, коклюшного токсоида, холерного токсоида, экзотоксина A от Pseudomonas aeruginosa, детоксифицированного экзотоксина A от P. aeruginosa (EPA), белка, связывающегося с мальтозой (MBP), детоксифицированного гемолизина A от S. aureus, фактора свертывания крови A, фактора свертывания крови B, субъединицы холерного токсина B (CTB), пневмолизина Streptococcus pneumoniae и его детоксифицированных вариантов, AcrA C. jejuni или природных гликопротеинов C. jejuni.

10. Конъюгат по п. 5, где белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

11. Конъюгат по п. 5, где белок-носитель представляет собой столбнячный токсоид.

12. Конъюгат по п. 5, где отношение по массе сахарида к белку-носителю составляет от по меньшей мере 0,5 до максимум 2.

13. Конъюгат по п. 5, где конъюгат получают посредством восстановительного аминирования.

14. Конъюгат по п. 5, где сахарид конъюгирован с белком-носителем посредством (2-((2-оксоэтил)тио)этил)карбаматного (eTEC) спейсера.

15. Конъюгат по п. 5, где сахарид представляет собой конъюгированный сахарид, связанный по одному концу.

16. Конъюгат по п. 8, где сахарид конъюгирован с белком-носителем посредством остатка 3-дезокси-d-манно-окт-2-улозоновой кислоты (KDO).

17. Конъюгат по п. 5, где конъюгат получают посредством химической реакции тетрафторбората 1-циано-4-диметиламинопиридиния (CDAP).

18. Сахарид для вырабатывания иммунного ответа против Escherichia coli у млекопитающего, имеющий структуру

[→3)-α-l-Rha-(1→3)-α-l-Rha-(1→3)-β-l-Rha-(1→4)-β-d-GlcNAc-(1→|β-d-ManNAc-(1→2)]_n,

где n представляет собой целое число от 31 до 100 в его Формуле для каждой молекулы сахарида.

19. Сахарид для вырабатывания иммунного ответа против Escherichia coli у млекопитающего, имеющий структуру

[→3)-α-l-Rha-(1→2)-α-l-Rha-(1→3)-β-l-Rha-(1→4)-β-d-GlcNAc-(1→|α-d-Fuc3NAc-(1→2)]_n,

где n представляет собой целое число от 31 до 100 в его Формуле для каждой молекулы сахарида.

20. Сахарид для вырабатывания иммунного ответа против Escherichia coli у млекопитающего, имеющий структуру

[→4)-α-d-GalNAc-(1→3)-β-d-Man-(1→4)-β-d-Man-(1→3)-β-d-GlcNAc-(1→|β-d-Glc-(1→2)]_n или

[→4)-α-d-GalNAc-(1→3)-β-d-Man-(1→4)-β-d-Man-(1→3)-α-d-GlcNAc-(1→|β-d-GlcNAc-(1→2)]_n,

где n представляет собой целое число от 31 до 100 в его Формуле для каждой молекулы сахарида.

Изобретение относится к химической переработке древесины сосны. Способ сульфатирования галактоглюкоманнана древесины сосны предусматривает сульфатирование в расплаве смеси сульфаминовой кислоты с мочевиной при температуре 100-130°С в течение 20 минут.

Способ получения сополимеров хитозана с акриламидом как рн-чувствительного средства доставки биологически активных веществ // 2786240

Изобретение относится к области химии полимеров и может найти применение в областях пищевой, фармацевтической, биотехнологической, медицинской промышленности. Предложенный способ получения сополимеров хитозана с акриламидом включает химическое взаимодействие хитозана с акриламидом.

Способ извлечения пектиновых веществ из ягодного сырья // 2785670

Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к получению пектиновых веществ и может использоваться при производстве продуктов питания, содержащих пектин. Задачей настоящего изобретения является сокращение времени экстракции, повышения выхода пектиновых веществ, повышение экологичности процесса производства пектина.

Усовершенствованный способ получения дальтепарина натрия // 2783697

Изобретение относится к химии полисахаридов. Предложены варианты способа получения дальтепарина натрия.

Протез синовиальной жидкости и способ его получения // 2782921

Группа изобретений относится к области биодеградируемых гелей и гидрогелей. Протез синовиальной жидкости в виде гидрогелевой водорастворимой композиции на основе модифицированной гиалуроновой кислоты представляет собой 2,0-2,5 мас.% раствор в деионизированной воде хелатного комплекса цинка с гиалуроновой кислотой, имеющей молекулярную массу 15-50 кДа, и с содержанием цинка в хелатном комплексе 0,015-0,030%.

Способ выделения целлюлозы из биомассы арктических бурых водорослей // 2782259

Изобретение относится к технологии комплексной переработки бурых водорослей. Способ выделения целлюлозы из биомассы арктических бурых водорослей включает выделение белково-полисахаридного комплекса путем сверхкритической флюидной экстракции измельченных водорослей углекислым газом с использованием этанола в качестве сорастворителя, дальнейшей экстракции обезжиренных водорослей раствором соляной кислоты в трех повторностях, промывки биомассы дистиллированной водой до нейтральной реакции, экстракции раствором карбоната натрия для удаления альгинатов в три последовательных стадии, отмывки биомассы водой в шесть стадий с получением белково-полисахаридного комплекса.

Твердофазный способ получения биоактивной композиции на основе хелатных комплексов цинка, магния, марганца, меди и хрома с гиалуроновой кислотой // 2780485

Изобретение относится к твердофазному способу получения биоактивных композиций, представляющих собой хелатные комплексы гиалуроновой кислоты с жизненно важными микроэлементами: цинком, магнием, марганцем, медью и хромом. Способ заключается в обработке порошкообразной смеси гиалуроновой кислоты с молекулярной массой 15-50 кДа с хлоридом металла в двухшнековом механохимическом экструдере с зоной питания и двумя реакционными зонами при соотношении длин зон соответственно 20:40:40% с последовательным в одном цикле обработки непрерывным проведением операций: загрузки сухого порошка гиалуроновой кислоты и сухого порошка хлорида металла, где металл выбран из группы цинк, магний, марганец, медь, хром, при соотношении по массе 1:0,015-0,035 соответственно, в зону питания механохимического экструдера и гомогенизации перемешиванием в этой зоне в течение 2-3 минут при 5-10°С; дальнейшего последовательного автоматического перемещения гомогенизированной смеси во вторую и третью зоны механохимического экструдера, где механохимическая реакция проводится с одновременным воздействием давления в пределах 200-300 МПа и деформации сдвига на кулачковых механизмах с углом сдвига суммарно 180° в течение 1-2 минут в токе азота при температуре во второй механохимической зоне 70-80°С, в третьей механохимической зоне 5-7°С.

Нанокомпозиты на основе гадолинийсодержащих соединений для диагностики, терапии и тераностики онкологических заболеваний головного мозга и способы их получения // 2778928

Изобретение может быть использовано для получения водорастворимых магнитоконтрастных средств для проведения диагностики, терапии и тераностики онкологических заболеваний головного мозга. Магнитоконтрастные средства представляют собой гадолинийсодержащие нанокомпозиты, стабилизирующая и транспортная матрица которых состоит из макромолекул полисахарида, выбранного из арабиногалактана и арабиногалактана-сырца.

Гидрогель, содержащий в качестве субстрата производное гиалуроновой кислоты, модифицированное галлольной группой, и его применение // 2778054

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая способ получения гидрогеля гиалуроновой кислоты (варианты), гидрогель гиалуроновой кислоты, применение гидрогеля гиалуроновой кислоты в качестве скаффолда для тканевой инженерии, в качестве носителя для доставки лекарственного средства in vivo или ex vivo, композицию филлера для улучшения состояния кожи, включающего морщины, композицию противоспаечного барьера, композицию для раневой повязки, композицию для доставки лекарственного средства с замедленным высвобождением in vivo или ex vivo, производное гиалуроновой кислоты, способ разглаживания морщин, применение производного гиалуроновой кислоты в качестве скаффолда для тканевой инженерии, в качестве носителя для доставки лекарственного средства in vivo или ex vivo, композиции, включающие производное гиалуроновой кислоты: композиция филлера для улучшения состояния кожи, включающего морщины, композиция противоспаечного барьера, композиция для раневой повязки, композиция для доставки лекарственного средства с замедленным высвобождением in vivo или ex vivo.

Способ производства гуаровой камеди из семян гуара // 2777054

Изобретение относится к пищевой промышленности. Способ производства гуаровой камеди из семян гуара предусматривает засыпку в приемочный бункер при помощи ковшового элеватора семян гуара, подъем семян посредством трубопровода и циклонов на систему очистки, транспортировку по системе трубопровода для очистки на вибрационном воздушном сепараторе.

Мутанты белка f rsv // 2788403

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к мутантам белка F респираторного синцитиального вируса (RSV), к вакцинам против RSV, содержащим мутанты белка F RSV, а также к способу профилактики инфекции RSV у человека путем введения вышеупомянутой вакцины. Мутанты белка F по настоящему изобретению позволяют получать эффективные вакцины против RSV.