Рнк-частицы, включающие полисаркозин

Группа изобретений относится к области фармацевтики, а именно к композициям для доставки РНК в ткани-мишени после введения. Предложена композиция для доставки РНК к клеткам-мишеням или тканям-мишеням, включающая множество РНК-частиц, причем каждая частица включает РНК и один или несколько компонентов, которые соединяются с РНК с образованием РНК-частиц, причем по меньшей мере с одним из одного или нескольких компонентов конъюгирован полисаркозин, причем один или несколько компонентов, которые соединяются с РНК с образованием частиц, содержат один или более липидов или липидоподобных материалов. Также предложен вариант указанной композиции, в котором каждая частица включает РНК, катионный или ионизируемый по катионному типу липид или липидоподобный материал и конъюгат полисаркозин-липид или конъюгат полисаркозина и липидоподобного материала. Раскрыты также способы доставки РНК в клетки субъекта и доставки терапевтического пептида или белка субъекту, где РНК кодирует терапевтический пептид или белок, включающие введение субъекту указанной композиции. Предложены варианты способа лечения или предупреждения заболевания или расстройства у субъекта, включающие введение субъекту указанной композиции, причем доставка РНК в клетки субъекта благоприятна при лечении или предупреждении заболевания или расстройства или РНК кодирует терапевтический пептид или белок. Изобретение обеспечивает повышение эффективности нацеливания и безопасность доставки РНК к клеткам-мишеням. 6 н. и 28 з.п. ф-лы, 17 ил., 4 табл., 7 пр.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к РНК-частицам для доставки РНК в ткани-мишени после введения, в частности, после парентерального введения, такого как внутривенное, внутримышечное, подкожное или интратуморальное введение, и композициям, включающим такие РНК-частицы. РНК-частицы в одном воплощении включают одноцепочечную РНК, такую как мРНК, которая кодирует пептид или белок, представляющий интерес, такой как фармацевтически активный пептид или белок. РНК захватывается клетками ткани-мишени, и РНК транслируется в кодированный пептид или белок, который может проявить свою биологическую активность.

Уровень техники

Использование РНК для доставки чужеродной генетической информации в клетки-мишени является привлекательной альтернативой ДНК. Преимущества использования РНК включают временную экспрессию и нетрансформирующий характер. РНК не должна входить в ядро для экспрессии и, более того, не может интегрироваться в геном хозяина, причем посредством этого устраняется риск онкогенеза.

РНК может быть доставлена субъекту с использованием различных систем доставки, основанных главным образом на катионных полимерах или липидах, которые вместе с РНК образуют наночастицы. Предполагается, что наночастицы защищают РНК от разложения, делают возможной доставку РНК к месту мишени и облегчают клеточное поглощение и процессинг клетками-мишенями. Для эффективности доставки, кроме молекулярной композиции, играют роль параметры, подобные размеру частиц, заряду или прививки молекулярными частицами, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ) или лиганды. Полагают, что прививка ПЭГ уменьшает взаимодействия в сыворотке, повышает устойчивость сыворотки и повышает время циркуляции, что может быть полезным в случае некоторых подходов направленного воздействия. Лиганды, которые связываются с рецепторами как местом мишени, могут способствовать улучшению эффективности нацеливания. Кроме того, пегилирование можно использовать для инжеиерии частиц. Например, если липидные наночастицы (LNP) производят путем смешивания водной фазы РНК с органической фазой липидов, требуется определенная фракция ПЭГ-конъюгированного липида в липидной смеси, иначе частицы слипаются во время стадии смешивания. Показано, что путем изменения молярной фракции ПЭГ-липидов, включающей ПЭГ различной молекулярной массы, можно регулировать размер частиц. Так же размер частиц можно регулировать, изменяя молекулярную массу частицы ПЭГ пегилированных липидов. Типичные удобные размеры находятся в интервале между 30 и 200 нм (Belliveau et al., 2012, Molecular Therapy–Nucleic Acids 1, e37). Образовавшиеся таким образом частицы имеют такое дополнительное преимущество, что из-за фракции ПЭГ они меньше взаимодействуют с компонентами сыворотки и имеют более длительное время полужизни в кровотоке, что желательно при многих подходах к доставке лекарственных средств. Без ПЭГ-липидов нельзя получить частицы обособленного размера; частицы образуют крупные агрегаты и осадок.

Таким образом, в случае методов, в которых LNP образуются из этанольной и водной фазы, одной из основных ролей ПЭГ-липидов является облегчение самосборки частиц путем обеспечения стерического барьера на поверхности возникающих частиц, образовавшихся, когда нуклеиновые кислоты быстро смешивают с этанольными растворами, содержащими липиды для связывания РНК. Пространственное затруднение ПЭГ предотвращает слияние частиц и промотирует образование однородной совокупности популяции LNP с диаметрами <100 нм.

ПЭГ используется наиболее широко и является золотым стандартом «незаметного» полимера при доставке лекарственных средств. ПЭГ-липиды обычно включают в системы для получения однородной и устойчивой популяции коллоидных наночастиц из-за гидрофильности их пространственного препятствия (оболочка ПЭГ препятствует электростатическому или ван-дер-ваальсовому притяжению, которое ведет к агрегации). Пегилирование дает возможность образовать водную оболочку вокруг полимера, защищающего РНК-комплекс от опсонизации белками сыворотки, увеличить время полужизни в сыворотке, а также уменьшить быстрый почечный клиренс, что приводит к улучшению фармакокинетических свойств. Изменение длины ацильных цепей (С18, С16 или С14) липидов модифицирует стабильность включения ПЭГ-липида в частицы, что ведет к модуляции фармакокинетики. Применение ПЭГ-липида, содержащего короткие ацильные цепи (С14), который диссоциирует от LNP in vivo с временем полужизни <30 мин, приводит к оптимальной силе гепатоцитного сайленсинга генов (Chen et al., 2014, J. Control. Release, 196: 106-12; Ambegia et al., 2005, Biochimica et Biophysica Acta, 1669: 155– 163). Кроме того, можно получить жесткий контроль за размером частиц, изменяя параметр ПЭГ-липида: более высокая MW ПЭГ или более высокая молярная фракция ПЭГ-липидов в частицах ведет к более мелким частицам.

Несмотря на эти преимущества, пегилирование наночастиц может привести также к некоторым эффектам, которые являются вредными для предполагаемого применения их для доставки лекарственных средств. Известно, что пегилирование липосом и LNP снижает клеточное поглощение и эндосомальное высвобождение, таким образом снижая в итоге общую эффективность трансфекции. Действительно, ПЭГ-оболочка обеспечивает стерический барьер для эффективного связывания частиц с клеткой и также препятствует эндосомальному высвобождению путем предотвращения слияния мембран между липосомой и эндосомальной мембраной. Вот почему тип ПЭГ-липида и количество используемого ПЭГ-липида должны быть всегда тщательно отрегулированы. Следует обеспечить достаточною незаметность для in vivo аспектов и аспектов стабилизации, с одной стороны, и отсутствие препятствия трансфекции с другой стороны. Это явление известно как «ПЭГ-дилемма».

Кроме снижения эффективности трансфекции, пегилирование ассоциируется с явлением ускоренного очищения крови (АВС), вызванного анти-ПЭГ антителами и/или активацией комплемента, а также болезнями накопления (Bendele A. et al., 1998, Toxicolocical Sciences, 42, 152-157; Young MA et al., 2007, Translational Research, 149(6), 333-342; S.M. Moghimi, J. Szebeni, 2003, Progress in Lipid Research, 42: 463–478). Ishida et al. и Laverman et al. сообщают, что внутривенная инъекция крысам липосом с присоединенным ПЭГ может существенно изменить фармакокинетические свойства второй дозы, когда эту вторую дозу вводят после интервала в несколько дней (Laverman P. et al., 2001, J. Pharmacol. Exp. Ther., 298(2), 607-12; Ishida et al., 2006, J. Control. Release, 115(3), 251-8). Явление «ускоренного очищения крови» (ABC) оказывается обратно пропорционально связанным с содержанием ПЭГ в липосомах. Наличие анти-ПЭГ антител в плазме вызывает более высокий клиренс системой моно(нуклеарных)фагоцитов, что в итоге снижает эффективность лекарственного средства.

Также полагают, что ПЭГ индуцирует активацию комплемента, что может привести к реакции гиперчувствительности, также известной как псевдоаллергия, связанная с активацией комплемента (CARPA). Из литературы пока не ясно, обусловлена ли активация комплемента наночастицей в целом или присутствием ПЭГ в частности.

Присутствие ПЭГ в липидных наночастицах также может вызывать специфическую иммунную реакцию. Semple et al. сообщают, что липосомы, содержащие ПЭГ-липидные производные и инкапсулированный антисмысловой олигодезоксинуклеотид или плазмидную ДНК, выявляют сильную иммунную реакцию, которая у мышей приводит к быстрому очищению крови от последующих доз. Величина этой реакции была достаточной, чтобы вызвать значительную заболеваемость и в некоторых случаях смертность. Быстрое удаление липосоминкапсулированного ODN из крови зависит от присутствия ПЭГ-липида в мембране, поскольку использование непегилированных липосом или липосом, содержащих быстро обмениваемый ПЭГ-липид, отменяет реакцию. Генерация анти-ПЭГ антител и предполагаемая активация комплемента были вероятным объяснением быстрого удаления везикул из крови (Semple et al., 2005, J. Pharmacol. Exp. Ther., 312(3), 1020-6).

Так как ПЭГ может вызывать иммунные реакции, существует необходимость избегать его при некоторых применениях, где требуется несколько инъекций. Примерами являются терапии с использованием мРНК, например, в случае белковой заместительной терапии. В данном случае опасность может быть особенно высока из-за возможной присущей РНК иммуногенности.

Таким образом, в технике остается потребность в эффективных способах и композициях для введения РНК в клетки, которые избегают недостатков, сопровождающих применение ПЭГ. Настоящее раскрытие относится к этим и другим потребностям.

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что препараты РНК-частиц, описанные в настоящем описании, удовлетворяют упомянутым выше требованиям. В частности, показано, что конъюгаты полисаркозин-липид являются подходящими компонентами для сборки РНК-частиц. Полисаркозин состоит из повторяющихся звеньев природной аминокислоты саркозина (N-метилглицин) и является биоразлагаемым. Конъюгаты полисаркозин-липид дают возможность получать РНК-частицы различными методами, приводящими к определенным свойствам и регулируемым диапазонам размера. Производство можно осуществить надежными процессами, соответствующими требованиям фармацевтического производства. Частицы могут иметь различные концевые функциональные группы для модуляции заряда или для введения специфических молекулярных частиц, подобных лигандам.

Сущность изобретения

В одном аспекте изобретение относится к композиции, включающей множество РНК-частиц, причем каждая частица включает

(i) РНК

и

(ii) один или несколько компонентов, которые соединяются с РНК с образованием РНК-частиц,

причем по меньшей мере с одним из одного или I нескольких компонентов конъюгирован полисаркозин.

В одном воплощении РНК-частицы являются частицами с невирусной РНК. В одном воплощении один или несколько компонентов, которые соединяются с РНК с образованием частиц, включают один или несколько полимеров. В одном воплощении один или несколько полимеров включают катионный полимер. В одном воплощении катионный полимер представляет собой аминосодержащий полимер. В одном воплощении один или несколько полимеров включают один или несколько полимеров, выбранных из группы, включающей поли-L-лизин, полиамидоамин, полиэтиленимин, хитозан и сложные поли(β-аминоэфиры).

В одном воплощении один или несколько компонентов, которые соединяются с РНК с образованием частиц, включают один или несколько липидов или липидоподобных материалов. В одном воплощении один или несколько липидов или липидоподобных материалов включают катионный или ионизируемый по катионному типу липид или липидоподобный материал. В одном воплощении ионизируемый по катионному типу липид или липидоподобный материал является положительно заряженным только при кислотном рН и не остается катионным при физиологическом рН. В одном воплощении один или несколько липидов или липидоподобных материалов включают один или несколько дополнительных липидов или липидоподобных материалов. В одном воплощении с одним или несколькими дополнительными липидами или липидоподобными материалами конъюгирован полисаркозин.

В другом аспекте изобретение относится к композиции, включающей множество РНК-липидных частиц, причем каждая частица включает

(а) РНК;

(b) катионный или ионизируемый по катионному типу липид или липидоподобный материал; и

(с) конъюгат полисаркозин-липид или конъюгат полисаркозина и липидоподобного материала.

В одном воплощении каждая частица также включает

(d) некатионный липид или липидоподобный материал.

В одном воплощении катионный или ионизируемый по катионному типу липид или липидоподобный материал включает от примерно 20 мол.% до примерно 80 мол.% всего липида или липидоподобного материала, присутствующего в частицах.

В одном воплощении некатионный липид или липидоподобный материал включает от примерно 0 мол.% до примерно 80 мол.% всего липида или липидоподобного материала, присутствующего в частицах.

В одном воплощении конъюгат полисаркозин-липид или конъюгат полисаркозина и липидоподобного материала включает от примерно 0,25 мол.% до примерно 50 мол.% всего липида или липидоподобного материала, присутствующего в частицах.

В одном воплощении некатионный липид или липидоподобный материал включает фосфолипид. В одном воплощении некатионный липид или липидоподобный материал включает холестерин или производное холестерина. В одном воплощении некатионный липид или липидоподобный материал включает смесь фосфолипида и холестерина или производного холестерина. В одном воплощении фосфолипид выбирают из группы, включающей дистеароилфосфатидилхолин (DSCP), дипальмитоилфосфатидилхолин (DРPС) или их смесь. В одном воплощении некатионный липид или липидоподобный материал включает смесь DSCP и холестерина.

В одном воплощении конъюгат полисаркозин-липид или конъюгат полисаркозина и липидоподобного материала составляет следующую общую формулу (I):

.

В одном воплощении конъюгат полисаркозин-липид или конъюгат полисаркозина и липидоподобного материала составляет следующую общую формулу (II):

,

где один из R₁ и R₂ включает гидрофобную группу, и другой представляет собой Н, гидрофильную группу или функциональную группу, необязательно включающую нацеливающую частицу.

В одном воплощении конъюгат полисаркозин-липид или конъюгат полисаркозина и липидоподобного материала составляет следующую общую формулу (III):

,

где R представляет собой Н, гидрофильную группу или функциональную группу, необязательно включающую нацеливающую частицу.

В одном воплощении всех аспектов изобретения частицы не включают конъюгат полиэтиленгликоль-липид или конъюгат полиэтиленгликоля и липидоподобного материала и предпочтительно не включают полиэтиленгликоль.

В одном воплощении всех аспектов изобретения РНК представляет собой мРНК.

В одном воплощении всех аспектов изобретения катионный или ионизируемый по катионному типу липид или липидоподобный материал включает N,N-диметил-2,3-диолеилокси)пропиламин (DODMA), хлорид N,N-диолеил-N,N-диметиламмония (DODAC), бромид N,N-дистеарил-N,N-диметиламмония (DDAB), хлорид N-(1-(2,3-диолеоилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмония (DOTAP), хлорид N-(1-(2,3-диолеилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмония (DOTMA), 1,2-дилинолеилокси-N,N-диметиламинопропан (DLinDMA), 1,2-дилиноленилокси-N,N-диметиламинопропан (DLenDMA), 2,2-дилинолеил-4-(2-диметиламиноэтил)-[1,3]-диоксолан (DLin-KC2-DMA), 2,2-дилинолеил-4-диметиламинометил[1,3]-диоксолан (DLin-K-DMA) или их смесь.

В одном воплощении всех аспектов изобретения полисаркозин включает от 2 до 200 звеньев саркозина.

В одном воплощении всех аспектов изобретения конъюгат полисаркозин-липид или конъюгат полисаркозина и липидоподобного материала является элементом, выбранным из группы, включающей конъюгат полисаркозин-диацилглицерин, конъюгат полисаркозин-диалкилоксипропил, конъюгат полисаркозин-фосфолипид, конъюгат полисаркозин-церамид и их смесь.

В одном воплощении всех аспектов изобретения частицы представляют собой наночастицы.

В одном воплощении всех аспектов изобретения частицы включают наноструктурированное ядро.

В одном воплощении всех аспектов изобретения частицы имеют размер от примерно 30 нм до примерно 500 нм.

В одном воплощении всех аспектов изобретения конъюгат полисаркозина ингибирует агрегацию частиц.

В другом аспекте изобретение относится к способу доставки РНК в клетки субъекта, причем способ включает введение субъекту композиции, описанной в настоящем описании.

В другом аспекте изобретение относится к способу доставки терапевтического пептида или белка субъекту, причем способ включает введение субъекту композиции, описанной в настоящем описании, причем РНК кодирует терапевтический пептид или белок.

В другом аспекте изобретение относится к способу лечения или предупреждения заболевания или расстройства у субъекта, причем способ включает введение субъекту композиции, описанной в настоящем описании, где доставка РНК в клетки субъекта благоприятна при лечении или предупреждении заболевания или расстройства.

В другом аспекте изобретение относится к способу лечения или предупреждения заболевания или расстройства у субъекта, причем способ включает введение субъекту композиции, описанной в настоящем описании, где РНК кодирует терапевтический пептид или белок, и где доставка терапевтического пептида или белка РНК субъекту благоприятна при лечении или предупреждении заболевания или расстройства.

В одном воплощении субъект представляет собой млекопитающее. В одном воплощении млекопитающее является человеком.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Соотношение между размером частиц и молярной фракцией конъюгированных с полисаркозином LNP. Липидные наночастицы получены с использованием смесей липидов, включающих возрастающие молярные фракции C14PSarc20. В подходящих условиях можно получить устойчивые коллоидные частицы. Хотя с очень низкими фракциями PSarc (0,5 и 1%) частицы размером, поддающимся измерению, не образуются, при 2,5 мол.% и выше получают частицы обусловленного размера и с низким индексом полидисперсности. Размер частиц может быть хорошо отлажен путем изменения фракции PSarc. Размер частиц монотонно уменьшается от примерно 200-250 нм с 2,5 мол.% PSarc до примерно 50 нм с 20 мол.% PSarc.

Фиг. 2. Соотношение между длинами полисаркозина (звеньями полимера) PSarc-липидов, используемых для образования LNP, и экспрессией белка in vitro кодирующей люциферазу мРНК в LNP в различных клеточных линиях. LNP, составленные с мРНК, кодирующей люциферазу, испытывают в клетках опухоли легких (TC-1), мышечных клетках (C2C12), гепатоцитах (Hep-G2) и макрофагах (RAW 264.7). Через 24 часа после трансфекции измеряют сигнал биолюминесценции. Независимо от клеточной линии, возрастание числа звеньев полимера в полисаркозине не приводит к снижению уровней экспрессии белка, как это обычно наблюдают в ПЭГ-липидах.

Фиг. 3. Эффективность in vivo LNP, включающих постоянную фракцию PSarc-липида (5%), где длина полисаркозина изменяется от 11 до 65 звеньев. LNP, полученные с мРНК, кодирующей люциферазу, инъецируют внутривенно мышам (10 мкг РНК, n=3). Измеряют биолюминесценцию in vivo и ex vivo. Во всех случаях самые сильные сигналы обнаруживают в печени. На фигуре приводятся данные от измерений ex vivo в печени, которую извлекали через 6 часов после инъекции. Не смогли определить существенное влияние длины полисаркозина на уровень экспрессии белка в печени. Это допускает инженерию частиц с использованием PSarc с размерами в широком диапазоне без снижения эффективности трансфекции.

Фиг. 4. Влияние различных концевых групп полисаркозина на размер частиц и дзета-потенциал. PSarc, состоящий из 20 повторяющихся звеньев, с концевой аминогруппой, карбоксилированной или ацетилированной концевой группой проверяют при непосредственном сравнении. Все другие параметры композиций поддерживают постоянными. Образование LNP со всеми испытанными концевыми группами происходит успешно, где корреляция между фракцией PSarc и свойствами частиц (размер и дзета-потенциал) является схожей.

Фиг. 5. Определение свойств in vivo LNP, включающих полисаркозин-липиды с различными концевыми группами, описанными на фиг. 4. Используют PSarc-липиды в молярной фракции 5% и длиной в 20 звеньев. LNP, полученные с мРНК, кодирующей люциферазу, испытывают с гепатоцитами (Hep-G2), макрофагами (RAW 264.7), мышечными клетками (C2C12) и клетками первичной почки (HEK 293 T). Через 24 часа после трансфекции измеряют сигнал биолюминесценции. Сигнал биолюминесценции получают для всех LNP и клеточных линий. Зависимость силы сигнала как функции клеточной линии схожа для всех концевых групп.

Фиг. 6. Эффективность in vivo LNP, полученных с различными концевыми группами, описанных на фиг. 4 и 5. Используют PSarc-липиды в молярной фракции 5% и длиной в 20 звеньев. LNP, полученные с мРНК, кодирующей люциферазу, инъецируют внутривенно (10 мкг РНК, n=3). Измеряют биолюминесценцию in vivo и ex vivo. Во всех случаях самые сильные сигналы обнаруживают в печени. На фигуре приводятся данные от измерений ex vivo в печени, извлеченной через 6 часов после инъекции. Определяют сигналы схожей силы со всеми концевыми группами, что показывает, что все концевые группы подходят для получения схожей высокой трансфекции in vivo.

Фиг. 7. Действие пегилирования и конъюгирования с полисаркозином на размер липосом. Липосомы получают или с одними DOTMA и DOPE (2:1 моль/моль), или используют смеси липидов, которые включают ПЭГ- или pSarс-липид в молярной фракции 2%. Как ПЭГ, так и pSarc ведут к существенному уменьшению измеряемого размера, хотя, однако, индекс полидисперсности более высокий (мультимодальный).

Фиг. 8. Образование липоплексов с использованием липосом, которые включают ПЭГ и pSarc, описанных на фиг. 7. Из всех трех типов липосом (одни DOTMA и DOPE (2:1 моль/моль), или включающие ПЭГ- или pSarс-липид в молярной фракции 2%), образуются липоплексы ограниченного размера и с низким индексом полидисперсности. Липоплексы из пегилированных и конъюгированных с полисаркозином липосом показывают неожиданно низкий индекс полидисперсности по сравнению с липосомами-предшественниками, где величины PDI высокие. Это показывает, что pSarc-липосомы с высоким индексом полидисперсности также могут быть подходящими для образования определенных РНК-липоплексов достаточно малых размеров - 50 нм и PDI примерно 0,2.

Фиг. 9. Определение свойств in vitro липоплексов, полученных из липосом, состоящих или из одних DOTMA и DOPE (2:1 моль/моль), или смесей тех же липидов, включающих ПЭГ- или pSarс-липид в молярной фракции 2%. Липоплексы с мРНК, кодирующей люциферазу, испытывают с гепатоцитами (Нер-G2). Через 24 часа после трансфекции измеряют сигнал биолюминесценции. Хотя пегилирование существенно ослабляет сигнал, это ослабление значительно меньше выражено в случае присутствия pSarс. Оказывается, pSarс снижает эффективность трансфекции в значительно меньшей степени, чем ПЭГ.

Фиг. 10. Определение свойств in vitro липоплексов, полученных из липосом, состоящих или из одних DOTMA и DOPE (2:1 моль/моль), или смесей тех же липидов, включающих ПЭГ- или pSarс-липид в молярной фракции 2%. Липоплексы с мРНК, кодирующей люциферазу, испытывают с мышечными клетками (С2С12). Через 24 часа после трансфекции измеряют сигнал биолюминесценции. Хотя пегилирование существенно ослабляет сигнал, это ослабление значительно меньше выражено в случае присутствия pSarс. Оказывается, pSarс снижает эффективность трансфекции в значительно меньшей степени, чем ПЭГ.

Фиг. 11. Соотношение между размером частиц и длиной цепи и молярным соотношением полисаркозина в композиции.

Фиг. 12. Кривые рассеяния (SAXS) конъюгированных с полисаркозином липидных частиц.

Фиг. 13. Доступность РНК, оцененная анализом с Quant-It Ribogreen.

Фиг. 14. Внутривенное введение различных доз мРНК, кодирующей ЕРО (эритропоэтин), загруженных в LNP в композиции с липидами, конъюгированными с РSarс или ПЭГ.

Фиг. 15. Высвобождение ферментов печени как ранний маркер токсичности для печени после инъекции LNP в композиции с РSarс с возрастающей длиной цепи.

Фиг. 16. Активация комплемента через комплекс С3а пегилированных и конъюгированных с полисаркозиом LNP при теоретической концентрации в плазме человека.

Фиг. 17. Изображение Cryo-TEM LNP, полученных со смесью DODMA:холестерин:DSPC:РSarс 23 в соответствующих мол.% 40:45:15:10:5. Масштаб = 200 нм.

Подробное описание

Хотя настоящее раскрытие описывается ниже подробно, следует понимать, что настоящее раскрытие не ограничивается частными методологиями, протоколами и реагентами, описанными в настоящем описании, так как они могут изменяться. Также следует иметь в виду, что терминология, используемая в настоящем описании, используется с целью описания только определенных воплощений и не предназначена для ограничения объема настоящего раскрытия, который будет ограничиваться только прилагаемой формулой изобретения. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеет те же значения, какие им обычно придают специалисты в данной области техники.

Предпочтительно термины, используемые в настоящем описании, определяются в «A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)», H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995).

На практике настоящее раскрытие будет использовать, если не указано иное, обычные методы химии, биохимии, биологии клетки, иммунологии и методы рекомбинантных ДНК, которые поясняются в литературе в данной области (см., например, Моlecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

Далее будут описываться элементы настоящего раскрытия. Эти элементы перечисляются с конкретными воплощениями, однако следует иметь в виду, что их можно комбинировать в любом числе с созданием других воплощений. Отдельно описанные примеры и воплощения не следует истолковывать как ограничивающие настоящее раскрытие только открыто описанными воплощениями. Настоящее описание следует понимать как раскрывающее и охватывающее воплощения, которые объединяют открыто описанные воплощения с любым числом раскрытых элементов. Кроме того, любые перестановки и комбинации всех описанных элементов должны рассматриваться как раскрытые настоящим описанием, если контекст не указывает иное.

Термин «примерно» означает приблизительно или около и в контексте численной величины или интервала, установленного в настоящем описании в одном воплощении, означает ±20%, ±10%, ±5%, или ±3% численной величины или интервала, цитированных или заявленных.

Термины в единственном числе, используемые в контексте, описывающем раскрытие (особенно в контексте формулы изобретения), следует истолковывать как охватывающие как единственное число, так и множественное, если в настоящем описании не указано иное или нет явного противоречия контексту. Перечисление интервалов величин в настоящем описании предназначено только служить в качестве способа сокращения обращения по отдельности к каждой отдельной величине, попадающей в интервал. Если в настоящем описании не указано иное, каждая отдельная величина включена в описание как если бы она приводилась в настоящем описании отдельно. Все способы, описанные в настоящем описании, можно выполнять в любом подходящем порядке, если в настоящем описании не указано иное, или иное не диктуется четко контекстом. Использование любого и всех примеров или примерной формулировки (например, «такой как»), приведенных в настоящем описании, предназначено только для лучшего пояснения раскрытия и не устанавливает ограничение объема формулы изобретения. Никакие формулировки в описании не должны толковаться как указывающие на какой-либо незаявленный элемент, существенный для практики раскрытия.

Если четко не указано иное, термин «включающий» используется в контексте настоящего документа для указания, что могут присутствовать другие члены, кроме членов списка, введенных путем «включения». Однако предполагается как конкретное воплощение настоящего раскрытия, что термин «включающий» охватывает возможность отсутствия других присутствующих членов, т.е. для цели этого воплощения «включающий» следует понимать как имеющий значение «состоящий из».

В тексте настоящего описания процитированы некоторые документы. Каждый из документов, процитированных в настоящем описании (включая все патенты, заявки на патент, научные публикации, спецификации изготовителей, инструкции и т.д.) выше или ниже, полностью включены в настоящее описание в качестве ссылок. Ничто в настоящем описании не должно истолковываться как признание того, что настоящее раскрытие не давало право датироваться более ранним числом.

Определения

Далее приводятся определения, которые применимы ко всем аспектам настоящего раскрытия. Приведенные далее термины имеют следующие далее значения, если не указано иное. Любые не определенные термины имеют их известные значения.

Такие термины, как «уменьшать» или «ингибировать», используемые в настоящем описании, обозначают возможность вызвать общее снижение от уровня, например, примерно на 5% или больше, примерно на 10% или больше, примерно на 20% или больше, примерно на 50% или больше или примерно на 75% или больше. Термин «ингибировать» или похожие выражения включают полное или по существу полное ингибирование, т.е. снижение до нуля или по существу до нуля.

Такие термины, как «повышать» или «усиливать» в одном воплощении относятся к повышению или усилению по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 80% или по меньшей мере примерно на 100%.

Термин «физиологический рН», используемый в настоящем описании, относится к рН примерно 7,4.

При использовании в настоящем раскрытии «%, мас./об.» относится к проценту массы на объем, который является единицей концентрации, измеряющей количество растворенного вещества в граммах (г), выраженное как процент от общего объема раствора в миллилитрах (мл).

При использовании в настоящем раскрытии «мол.%» определяется как отношение числа молей одно компонента к общему числу молей всех компонентов, умноженное на 100.

Термин «ионная сила» относится к математическому соотношению между числом различных видов ионов в определенном растворе и их соответствующими зарядами. Так, ионная сила I представляется математически формулой

,

в которой с представляет собой молярную концентрацию определенного вида ионов, и z представляет собой абсолютную величину его заряда. Сумма Σ берется как сумма всех различных видов ионов (i) в растворе.

Согласно раскрытию термин «ионная сила» в одном воплощении относится к присутствию одновалентных ионов. Что касается присутствия двухвалентных ионов, в частности, двухвалентных катионов, то их концентрация или эффективная концентрация (присутствие свободных ионов) из-за присутствия хелатирующих агентов в одном воплощении является достаточно низкой для того, чтобы предотвратить деградацию РНК. В одном воплощении концентрация или эффективная концентрация двухвалентных ионов ниже каталитического уровня для гидролиза фосфодиэфирных связей между нуклеотидами РНК. В одном воплощении концентрация свободных двухвалентных ионов составляет 20 мкМ или меньше. В одном воплощении свободные двухвалентные ионы отсутствуют или по существу отсутствуют.

Термин «осмоляльность» относится к концентрации растворенных веществ, выраженной как число осмолей растворенного вещества на килограмм растворителя.

Термин «замораживание» относится к фазовому переходу из жидкого состояния в твердое. Он обычно происходит при понижении температуры системы ниже критической температуры и сопровождается характерным изменением энтропии системы.

Термин «лиофилизация» относится к сушке вымораживанием вещества путем замораживания его и последующим понижением давления окружающей среды, чтобы позволить замороженной среде в веществе сублимировать из твердой фазы непосредственно в газовую фазу.

Термин «сушка распылением» относится к сушке распылением вещества путем смешивания (нагретого) газа с жидкостью, которая измельчается (распыляется) внутри сосуда (распылительная сушилка), где из образовавшихся капель испаряется растворитель, что ведет к сухому порошку.

Термин «криопротектор» относится к веществу, которое добавляют в композицию для того, чтобы защитить активные ингредиенты во время стадий замораживания.

Термин «лиопротектор» относится к веществу, которое добавляют в композицию для того, чтобы защитить активные ингредиенты во время стадий сушки.

Термин «восстановление» относится к добавлению растворителя, такого как вода, к сухому продукту для того, чтобы вернуть его в жидкое состояние, такое как исходное жидкое состояние.

Термин «рекомбинант» в контексте настоящего раскрытия означает «полученный генной инженерией». В одном воплощении «рекомбинантный объект» в контексте настоящего раскрытия не встречается в природе.

Термин «встречающийся в природе», используемый в настоящем описании, относится к факту, что объект можно обнаружить в природе. Например, пептид или нуклеиновая кислота, которые присутствуют в организме (включая вирусы) и могут быть выделены из источника в природе, и которые не были предумышленно модифицированы человеком в лаборатории, являются встречающимися в природе. Термин «обнаружен в природе» означает «присутствует в природе» и включает известные объекты, а также объекты, которые еще не обнаружены и/или не выделены из природы, но которые могут быть обнаружены и/или выделены в будущем из природного источника.

В контексте настоящего раскрытия термин «частица» относится к структурной сущности, образованной молекулами, или молекулярным комплексам. В одном воплощении термин «частица» относится к структуре микро- или наноразмера, такой как компактная структура микро- или наноразмера, диспергированная в среде.

В контексте настоящего раскрытия термин «РНК-частица» относится к частице, которая содержит РНК. В образование частицы вовлечены электростатические взаимодействия между положительно заряженными молекулами, такими как полимеры и липиды, и отрицательно заряженной РНК. Это приводит к комплексообразованию и спонтанному образованию РНК-частиц. В одном воплощении РНК-частица представляет собой наночастицу.

При использовании в настоящем раскрытии термин «наночастица» относится к частице, имеющей средний диаметр, подходящий для внутривенного введения.

Термин «средний диаметр» относится к среднему гидродинамическому диаметру частиц, измеренному динамическим рассеянием лазерного света (DLS), с анализом данных с использованием так называемого кумулятивного алгоритма, который предоставляет как результаты так называемый Z_{средний} с размерностью длины, и индекс полидисперсности (PI), который является безразмерным (Koppel, D., J. Chem. Phys. 57, 1972, pp 4814-4820, ISO 13321). В настоящем описании «средний диаметр», «диаметр» или «размер» для частиц применяют как синонимы с этой величиной Z_{средний}.

«Индекс полидисперсности» предпочтительно вычисляют на основании измерений динамического рассеяния света с помощью так называемого кумулятивного анализа, как упоминалось в определении «среднего диаметра». При некоторых предварительных условиях его можно принимать за меру распределения частиц по размерам в совокупности наночастиц.

Вообще, РНК-липидные частицы, описанные в настоящем описании, можно получить путем смешивания фазы, содержащей РНК, с фазой, содержащей липид. Это может быть смешивание этанольной фазы или другого смешивающегося с водой растворителя, включающего липиды, такие как катионные липиды, подобные DODMA, и другие липиды, с водной фазой, включающей РНК. Другим выбором является смешивание водной фазы, включающей липиды, например, включающей липиды в форме липосом или других типов жидкостных дисперсий, с другой водной фазой, включающей РНК.

РНК-содержащие частицы

Ранее описаны различные типы РНК-содержащих частиц, подходящих для доставки РНК в форме частиц (например, Kaczmarek, J. C. et al., 2017, Genome Medicine 9, 60). В случае везикул для доставки невирусной РНК инкапсулирование наночастиц РНК физически защищает РНК от деградации и, в зависимости от специфической химии, может содействовать клеточному поглощению и эндосомальному высвобождению.

В настоящем раскрытии описываются частицы, включающие РНК и один или несколько компонентов, которые ассоциируются с РНК с образованием РНК-частиц, и композиции, включающие такие частицы. РНК-частицы могут включать РНК, которая образует комплекс в различных формах за счет нековалентных взаимодействий с частицей. Частицы, описанные в настоящем описании, не являются вирусными частицами, в частности, инфекционными вирусными частицами, т.е. они не способны заражать клетки как вирусы. РНК-содержащие частицы могут находиться, например, в форме белковых частиц, в форме включающих полимер частиц или в форме липидсодержащих частиц. Подходящие белки, полимеры или липиды включены под термином «формирующие частицы компоненты» или «формирующие частицы агенты». Термин «формирующие частицы компоненты» или «формирующие частицы агенты» относится к любым компонентам, которые ассоциируются с РНК с образованием РНК-частиц. Такие компоненты включают любой компонент, который может являться частью РНК-частиц.

Белки, полимеры, липиды, а также другие гидрофильные, гидрофобные или амфифильные соединения являются типичными составляющими композиций РНК-частиц.

Благодаря высокой степени их химической гибкости, полимеры являются широко используемыми материалами для доставки наночастиц. Типично используются катионные полимеры для электростатической конденсации отрицательно заряженной РНК в наночастицы. Эти положительно заряженные группы часто состоят из аминов, которые изменяют свое состояние протонирования в интервале рН между 5,5 и 7,5, что, как полагают, ведет к дисбалансу ионов, что приводит к эндосомальному разрыву. Полимеры, такие как поли-L-лизин, полиамидоамин, протамин и полиэтиленимин, а также встречающиеся в природе полимеры, такие как хитозан, применяют для доставки РНК. Кроме того, некоторые исследователи синтезировали полимеры специально для доставки нуклеиновых кислот. В частности, сложные поли(β-аминоэфиры) получили широкое распространение в доставке нуклеиновых кислот благодаря простоте их синтеза и биоразлагаемости.

При использовании в настоящем описании «полимер» имеет свое обычное значение, т.е. обозначает молекулярную структуру, включающую одно или несколько повторяющихся звеньев (мономеров), соединенных ковалентными связями. Повторяющиеся звенья все могут быть идентичными, или в некоторых случаях они могут представлять больше одного типа повторяющегося звена, присутствующего в полимере. В некоторых случаях полимер имеет биологическое происхождение, т.е. является биополимером, таким как белок. В некоторых случаях в полимере могут присутствовать также другие группы, например, нацеливающие группы, такие как описанные в настоящем описании.

Если в полимере присутствует больше одного типа повторяющихся звеньев, тогда говорят, что полимер представляет собой «сополимер». Следует понимать, что в любом воплощении используемого полимера в некоторых случаях используемый полимер может представлять собой сополимер. Повторяющиеся звенья, образующие сополимер, могут располагаться в любом порядке. Например, повторяющиеся звенья могут располагаться в произвольном порядке, в порядке чередования или как в «блок»-сополимере. т.е. включать один или несколько участков, где каждый включает второе повторяющееся звено (т.е. второй блок), и т.д. Блоксополимеры могут иметь два (диблоксополимер), три (триблоксопоолимер) или больше составляющих их различных блоков.

В некоторых воплощениях полимер является биосовместимым. Биосовместимые полимеры являются полимерами, которые обычно не приводят к существенной гибели клеток в средних концентрациях. В некоторых воплощениях биосовместимый полимер является биоразлагаемым, т.е. полимер способен разрушаться, химически и/или биологически, в физиологической окружающей среде, такой как в организме.

В некоторых воплощениях образующий частицы полимер может представлять собой протамин или полиалкиленимин, такой как полиэтиленимин.

Термин «протамин» относится к любым различным сильно основным белкам относительно низкой молекулярной массы, которые богаты аргинином и обнаруживаются, в частности, в ДНК вместо соматических гистонов в сперматозоидах различных животных (например, рыб). В частности, термин «протамин» относится к обнаруженным в сперме рыб белкам, которые являются сильно основными, растворяются в воде и не коагулируют путем нагревания, и дают после гидролиза главным образом аргинин. В очищенной форме их используют в препарате инсулина длительного действия и для нейтрализации антикоагулирующего действия гепарина.

Согласно раскрытию, термин «протамин», используемый в настоящем описании, предназначен для включения любой аминокислотной последовательности протамина, полученной или извлеченной из природных или биологических источников, включая ее фрагменты, и полимерные формы аминокислотной последовательности или ее фрагментов, а также (синтезированных) полипептидов, которые являются искусственными и созданы специально для конкретных целей, и не могут быть выделены из нативных или биологических источников.

В одном воплощении полиалкиленимин включает полиэтиленимин и/или полипропиленимин, предпочтительно полиэтиленимин. Предпочтительным полиалкиленимином является полиэтиленимин (PEI). Средняя молекулярная масса PEI предпочтительно составляет 0,75∙10²–10⁷ Да, предпочтительно 1000–10⁵ Да, предпочтительнее 10000–40000 Да, предпочтительнее 15000–30000 Да, еще предпочтительнее 20000–25000 Да.

Предпочтительным согласно раскрытию является линейный полиалкиленимин, такой как линейный полиэтиленимин (PEI).

Липидсодержащие частицы

В одном воплощении РНК-частицы, описанные в настоящем описании, включают по меньшей мере один липид или липидоподобный материал как образующий частицу агент. Липидные носители, предполагаемые для применения в настоящем изобретении, включают любые вещества, с которыми можно ассоциировать РНК, например, путем образования комплексов с РНК или образования везикул, в которые заключена или инкапсулирована РНК.

Термины «липид» и «липидоподобный материал» в широком смысле определяются в настоящем описании как молекулы, которые включают одну или несколько гидрофобных частиц или групп, и также, необязательно, одну или больше гидрофильных частиц или групп. Молекулы, включающие гидрофобные частицы и гидрофильные частицы, также обычно называют амфифильными. Липиды обычно плохо растворяются в воде. В водной среде амфифильный характер позволяет молекулам самим собираться в организованные структуры и различные фазы. Одна из таких фаз состоит из липидных бислоев, когда они присутствуют в везикулах, мультиламеллярных/моноламеллярных липосомах или мембранах в водной среде. Гидрофобность можно придать путем включения аполярных групп, которые включают, но без ограничения, длинноцепные насыщенные и ненасыщенные алифатические углеводородные группы и такие группы, замещенные одной или несколькими ароматическими, циклоалифатическими или гетероциклическими группами. Гидрофильные группы могут включать полярные и/или заряженные группы и включают углеводы, фосфатные, карбоксильные, сульфатные, амино-, сульфгидрильные, нитро-, гидроксильные и другие подобные группы.

При использовании в настоящем описании термин «амфифильный» относится к молекуле, имеющей как полярную составляющую, так и неполярную составляющую. Обычно амфифильное соединение имеет полярную голову, присоединенную к длинному гидрофобному хвосту. В некоторых воплощениях полярная составляющая растворима в воде, в то время как неполярная составляющая в воде не растворяется. Кроме того, полярная составляющая может иметь или формальный положительный заряд или формальный отрицательный заряд. С другой стороны, полярная составляющая может иметь как формальный положительный, так и отрицательный заряд и представлять собой цвиттерион или внутреннюю соль. Для целей раскрытия амфифильное соединение может представлять собой, но без ограничения, один или несколько природных или неприродных липидов и липидоподобных соединений.

Термины «липидоподобный материал», «липидоподобное соединение» или «липидоподобная молекула» относятся к веществам, которые структурно и/или функционально относятся к липидам, но не могут считаться липидами в строгом смысле. Например, термин включает соединения, которые способны образовывать амфифильные слои, когда они присутствуют в везикулах, мультиламеллярных/моноламеллярных липосомах или мембранах в водной среде, и включает поверхностно-активные вещества или синтезированные соединения как с гидрофильными, так и липофильными группами. Вообще говоря, термин относится к молекулам, которые включают гидрофильные и гидрофобные группы с различной структурной организацией, которые могут или не могут походить на группы в липидах. При использовании в настоящем описании термин «липид» должен рассматриваться как перекрывающий как липиды, так и липидоподобные материалы, если иное не указано в настоящем описании или не диктуется четко контекстом.

Конкретные примеры амфифильных соединений, которые могут быть включены в амфифильный слой, включают, но без ограничения, фосфолипиды, аминолипиды и сфинголипиды.

В некоторых воплощениях амфифильным соединением является липид. Термин «липид» относится к группе органических соединений, которые характеризуются тем, что не растворяются в воде, но растворяются во многих органических растворителях. Вообще липиды можно разделить на восемь категорий: жирные кислоты, глицеролипиды, глицерофосфолипиды, сфинголипиды, сахаролипиды, поликетиды (образованные конденсацией кетоацильных субъединиц), стероидные липиды и пренольные липиды (образованные конденсацией изопреновых субъединиц). Хотя термин «липид» иногда используется как синоним жиров, жиры представляют собой подгруппу липидов, называемую триглицеридами. Липиды также охватывают молекулы, такие как жирные кислоты и их производные (включая три-, ди- и моноглицериды и фосфолипиды), а также стеролсодержащие метаболиты, такие как холестерин.

Жирные кислоты или остатки жирных кислот являются разнотипной группой молекул, образованных углеводородной цепью, которая заканчивается карбоксильной группой; такое строение сообщает молекуле полярный гидрофильный конец и неполярный гидрофобный конец, который не растворяется в воде. Углеродная цепь длиной обычно от четырех до 24 атомов углерода может быть насыщенной или ненасыщенной, и может быть присоединена к функциональным группам, содержащим кислород, галогены, азот и серу. Если жирная кислота содержит двойную связь, вероятен геометрический цис- или транс-изомеризм, который существенно влияет на конфигурацию молекулы. цис-Двойные связи вынуждают цепь жирной кислоты изгибаться, эффект, который осложняется несколькими двойными связями в цепи. Другими основными классами липидов в категории жирных кислот являются эфиры жирных кислот и амиды жирных кислот.

Глицеролипиды включают моно-, ди- и тризамещенные глицерины, причем наиболее известны триэфиры жирных кислот и глицерина, называемые триглицеридами. Иногда как синоним «триглицерида» используют слово «триацилглицерол». В этих соединениях три гидроксильные группы глицерина обычно этерифицированы каждая различными жирными кислотами. Другие подклассы глицеролипидов представлены гликозилглицеролами, которые характеризуются присутствием одного или больше остатков сахаров, присоединенных к глицерину через гликозидную связь.

Глицерофосфолипиды являются амфипатическими молекулами (содержащими как гидрофобные, так и гидрофильные участки), которые содержат глицериновую середину, соединенную с двумя происходящими от жирных кислот «хвостами» сложноэфирными связями и одной «головной» группой сложноэфирной фосфатной связью. Примерами глицерофосфолипидов, обычно называемых фосфолипидами (хотя сфингомиелины также классифицируют как фосфолипиды), являются фосфатидилхолин (также известный как PC, GPCho или лецитин), фосфатидилэтаноламин (PE или GPEtn) и фосфатидилсерин (PS или GPSer).

Сфинголипиды являются комплексным семейством соединений, которые разделяют общую структурную особенность главную цепь сфингоидного основания. Наиболее распространенное сфингоидное основание у млекопитающих обычно называют сфингозином. Церамиды (N-ацилсфингоидные основания) составляют основной класс производных сфингоидных оснований с жирной кислотой, присоединенной амидной связью. Жирные кислоты обычно являются насыщенными или ненасыщенными с длиной цепи от 16 до 26 атомов углерода. Основными фосфосфинголипидами млекопитающих являются сфингомиелины (церамидфосфохолины), в то время как насекомые содержат главным образом церамидфосфоэтаноламины, а грибы имеют фитоцерамидфосфоинозитолы и маннозосодержащие головные группы. Гликосфинголипиды являются разнотипным семейством молекул, состоящих из одного или нескольких остатков сахаров, соединенных гликозидной связью с сфингоидным основанием. Примерами являются простые и сложные гликосфинголипиды, такие как цереброзиды и ганглиозиды.

Стероловые липиды, такие как холестерин и его производные или токоферол и его производные, являются важным компонентом мембранных липидов наряду с глицерофосфолипидами и сфингомиелинами.

Сахаролипиды описывают соединения, в которых жирные кислоты соединены непосредственно с главной цепью сахара, образуя структуры, которые совместимы с бислоями мембран. В сахаролипидах моносахарид заменяет главную цепь глицерина, присутствующую в глицеролипидах и глицерофосфолипидах. Наиболее обычными сахаролипидами являются ацилированные глюкозамины, предшественники липида А компонента липополисахаридов в грамотрицательных бактериях. Типичными молекулами липида А являются дисахариды глюкозамина, которые дериватизированы целыми семью жирно-ацильными цепями. Минимальным липополисахаридом, требуемым для роста в E. coli, является Kdo2-липид A, гексаацилированный дисахарид глюкозамина, который гликозилирован двумя остатками 3-дезокси-D-маннооктулозоновой кислоты (Kdo).

Поликетиды синтезируют путем полимеризации ацетил- и пропионилсубъединиц классическими ферментами, а также итеративными и мультимодулярными ферментами, которые разделяют особенности механизмов с синтазами жирных кислот. Они включают большое число вторичных метаболитов и природных продуктов из животных, растительных, бактериальных, грибных и морских источников, и имеют большое структурное разнообразие. Многие поликетиды представляют собой циклические молекулы, чьи цепи обычно дополнительно модифицированы гликозилированием, метилированием, гидроксилированием, окислением и другими процессами.

Согласно раскрытию, липиды и липидоподобные материалы могут быть катионными, анионными или нейтральными. Нейтральные липиды или липидоподобные материалы существуют в форме незаряженных или нейтральных цвиттерионов при выбранном рН.

Предпочтительно РНК-частицы, описанные в настоящем описании, включают катионный или ионизуемый по катионному типу липид или липидоподобный материал. Катионные или ионизуемые по катионному типу липиды или липидоподобные материалы можно использовать с электростатически связанной РНК. Ионизуемые по катионному типу липиды или липидоподобные материалы являются материалами, которые являются предпочтительно заряженными положительно только при кислотном рН. Такое поведение при ионизации, как полагают, способствуя высвобождению липосом и снижая токсичность, усиливает эффективность по сравнению с частицами, которые остаются катионными при физиологическом рН, Частицы также могут включать некатионные липиды или липидоподобные материалы. Вместе анионные и нейтральные липиды или липидоподобные материалы в настоящем описании также называются некатионными липидами или липидоподобными материалами. Оптимизация композиции РНК-частиц путем добавления других, кроме ионизируемого/катионного липида или липидоподобного материала, гидрофобных частиц, таких как холестерин и липиды, усиливает устойчивость частиц и может значительно повысить эффективность доставки РНК.

В одном воплощении катионный или ионизируемый по катионному типу липид или липидоподобный материал включает головную группу, которая включает по меньшей мере один атом азота (N), который является положительно заряженным или способным к протонированию.

Конъюгат полисаркозина

Один или несколько образующих частицу компонентов, описанных в настоящем описании, таких как полимеры, липиды или липидоподобные материалы, используемых в частицах, описанных в настоящем описании, включают полисаркозин (поли(N-метилглицин)). Полисаркозин может включать ацетилированные (нейтральные концевые группы) или другие функционализированные концевые группы. В случае РНК-липидных частиц полисаркозин в одном воплощении конъюгируют, предпочтительно ковалентно связывают, с некатионным липидом или липидоподобным материалом, заключенным в частицах.

В некоторых воплощениях концевые группы полисаркозина могут быть функционализированы одной или несколькими молекулярными частицами, придающими определенные свойства, такие как положительный или отрицательный заряд, или агентом нацеливания, который будет направлять частицу к определенному типу клеток, собранию клеток или ткани.

В технике известен ряд агентов нацеливания. Неограничивающие примеры агентов нацеливания включают пептид, белок, фермент, нуклеиновую кислоту, жирную кислоту, гормон, антитело, углевод, моно-, олиго- или полисахариды, пептидогликан, гликопептид или подобное вещество. Например, можно использовать любое число различных материалов, которые связываются с антигенами на поверхностях клеток-мишеней. Антитела к антигенам на поверхности клеток-мишеней, как правило, будут проявлять необходимую специфичность в отношении мишени. Кроме антител также можно использовать подходящие иммунореактивные фрагменты, такие как фрагменты Fab, Fab′, F(ab′)2 или scFv, или однодоменные антитела (например, V_HH фрагменты камелидов). В технике уже доступны некоторые фрагменты антител, подходящие для применения при формировании механизма нацеливания. Подобным образом, в качестве агента нацеливания соответственно можно использовать лиганды для любых рецепторов на поверхности клеток-мишеней. Они включают любую небольшую молекулу или биомолекулу, природную или синтетическую, которая специфически связывается с рецептором клеточной поверхности, белком или гликопротеином, обнаруженным на поверхности нужной клетки-мишени.

В некоторых воплощениях полисаркозин включает от 2 до 200, от 2 до 190, от 2 до 180, от 2 до 170, от 2 до 160, от 2 до 150, от 2 до 140, от 2 до 130, от 2 до 120, от 2 до 110, от 2 до 100, от 2 до 90, от 2 до 80, от 2 до 70, от 5 до 200, от 5 до 190, от 5 до 180, от 5 до 170, от 5 до 160, от 5 до 150, от 5 до 140, от 5 до 130, от 5 до 120, от 5 до 110, от 5 до 100, от 5 до 90, от 5 до 80, от 5 до 70, от 10 до 200, от 10 до 190, от 10 до 180, от 10 до 170, от 10 до 160, от 10 до 150, от 10 до 140, от 10 до 130, от 10 до 120, от 10 до 110, от 10 до 100, от 10 до 90, от 10 до 80 или от 10 до 70 звеньев саркозина.

В некоторых воплощениях полисаркозин соответствует общей формуле (I)

,

в которой х относится к числу звеньев саркозина. Полисаркозин через одну из связей может соединяться с образующим частицу компонентом или гидрофобным компонентом. Полисаркозин через другую связь может связываться с Н, гидрофильной группой, ионизируемой группой или с линкером к функциональной группе, такой как группа нацеливания.

Катионный липид

В одном воплощении РНК-липидные частицы, описанные в настоящем описании, включают по меньшей мере один катионный липид. При использовании в настоящем описании «катионный липид» относится к липиду, имеющему чистый положительный заряд. Катионные липиды связывают отрицательно заряженную РНК с липидной матрицей электростатическим взаимодействием. Как правило, катионные липиды обладают липофильной группой, такой как стерольная, ацильная цепь, диацильная или более длинная ацильная цепь, и головная группа липида обычно несет положительный заряд. В некоторых воплощениях катионный липид имеет чистый положительный заряд только при определенном рН, в частности, кислотном рН, хотя предпочтительно он не имеет чистого положительного заряда, предпочтительно не имеет заряда, т.е. он является нейтральным при различных, предпочтительно более высоких рН, таких как физиологический рН. Для целей настоящего раскрытия такие «ионизируемые по катионному типу» липиды включаются под термином «катионный липид», если это не противоречит обстоятельствам. Примеры катионных липидов включают, но без ограничения, N,N-диметил-2,3-диолеилоксипропиламин (DODMA), 1,2-ди-O-октадеценил-3-триметиламмонийпропан (DOTMA), 3-(N-(N′,N′-диметиламиноэтан)-карбамоил)холестерин (DC-Chol), диметилдиоктадециламмоний (DDAB); 1,2-диолеоил-3-триметиламмонийпропан (DOTAP); 1,2-диолеоил-3-диметиламмонийпропан (DODAP); 1,2-диацилокси-3-диметиламмонийпропаны; 1,2-диалкилокси-3-диметиламмонийпропаны; хлорид диоктадецилдиметиламмония (DODAC), 1,2-дистеарилокси-N,N-диметил-3-аминопропан (DSDMA), 2,3-ди(тетрадецокси)пропил(2-гидроксиэтил)диметилазаний (DMRIE), 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-этилфосфохолин (DMEPC), l,2-димиристоил-3-триметиламмонийпропан (DMTAP), бромид 1,2-диолеилоксипропил-3-диметилгидроксиэтиламмония (DORIE) и трифторацетат 2,3-диолеоилокси-N-[2(сперминкарбоксамид)этил]-N,N-диметил-l-пропанамия (DOSPA), 1,2-дилинолеилокси-N,N-диметиламинопропан (DLinDMA), 1,2-дилиноленилокси-N,N-диметиламинопропан (DLenDMA), диоктадециламидоглицилспермин (DOGS), 3-диметиламино-2-(холест-5-ен-3-бета-оксибутан-4-окси)-1-(цис,цис-9,12-октадекадиенокси)пропан (CLinDMA), 2-[5′-(холест-5-ен-3-бета-окси)-3′-оксапентокси)-3-диметил-1-(цис,цис-9′,12′-октадекадиенокси)пропан (CpLinDMA), N,N-диметил-3,4-диолеилоксибензиламин (DMOBA), 1,2-N,N′-диолеилкарбамил-3-диметиламинопропан (DOcarbDAP), 2,3-дилинолеоилокси-N,N-диметилпропиламин (DLinDAP), 1,2-N,N′-дилинолеилкарбамил-3-диметиламинопропан (DLincarbDAP), 1,2-дилинолеоилкарбамил-3-диметиламинопропан (DLinCDAP), 2,2-дилинолеил-4-диметиламинометил-[1,3]-диоксолан (DLin-K-DMA), 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан (DLin-K-XTC2-DMA), 2,2-дилинолеил-4-(2-диметиламиноэтил)-[1,3]-диоксолан (DLin-KC2-DMA), гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил-4-(диметиламино)бутаноат (DLin-MC3-DMA), бромид N-(2-гидроксиэтил)-N,N-диметил-2,3-бис(тетрадецилокси)-1-пропанаминия (DMRIE), бромид (±)-N-(3-аминопропил)-N,N-диметил-2,3-бис(цис-9-тетрадеценилокси)-1-пропанаминия (GAP-DMORIE), бромид (±)-N-(3-аминопропил)-N,N-диметил-2,3-бис(додецилокси)-1-пропанаминия (GAP-DLRIE), бромид (±)-N-(3-аминопропил)-N,N-диметил-2,3-бис(тетрадецилокси)-1-пропанаминия (GAP-DMRIE), бромид N-(2-аминоэтил)-N,N-диметил-2,3-бис(тетрадецилокси)-1-пропанаминия (βAE-DMRIE), N-(4-карбоксибензил)-N,N-диметил-2,3-бис(олеоилокси)пропан-1-аминий (DOBAQ), 2-({8-[(3β)-холест-5-ен-3-илокси]октил}окси)-N,N-диметил-3-[(9Z,12Z)-октадека-9,12-диен-1-илокси]пропан-1-амин (Octyl-CLinDMA), 1,2-димиристоил-3-диметиламмонийпропан (DMDAP), 1,2-дипальмитоил-3-диметиламмонийпропан (DPDAP), N1-[2-((1S)-1-[(3-аминопропил)амино]-4-[ди(3-аминопропил)амино]бутилкарбоксамидо)этил]-3,4-ди[олеилокси]бензамид (MVL5), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-этилфосфохолин (DOEPC), бромид 2,3-бис(додецилокси)-N-(2-гидроксиэтил)-N,N-диметилпропан-1-аммония (DLRIE), бромид N-(2-аминоэтил)-N,N-диметил-2,3-бис(тетрадецилокси)пропан-1-аминия (DMORIE), ди((Z)-нон-2-ен-1-ил)-8,8'-((((2(диметиламино)этил)тио)карбонил)азанедиил)диоктаноат (ATX), N,N-диметил-2,3- бис(додецилокси)пропан-1-амин (DLDMA), N,N-диметил-2,3-бис(тетрадецилокси)пропан-1-амин (DMDMA), ди((Z)-нон-2-ен-1-ил)-9-((4-(диметиламинобутаноил)окси)гептадекандиоат (L319), N-додецил-3-((2-додецилкарбамоилэтил)-{2-[(2-додецилкарбамоилэтил)-2-{(2-додецилкарбамоилэтил)-[2-(2-додецилкарбамоилэтиламино)этил]амино}этиламино)пропионамид (липидоид 98N₁₂-5), 1-[2-[бис(2-гидроксидодецил)амино]этил-[2-[4-[2-[бис(2 гидроксидодецил)амино]этил]пиперазин-1-ил]этил]амино]додекан-2-ол (липидоид C12-200). Предпочтительными являются DODMA, DOTMA, DOTAP, DODAC и DOSPA. В конкретных воплощениях по меньшей мере один катионный липид представляет собой DODMA.

В некоторых воплощениях катионный липид может составлять от примерно 10 мол.% до примерно 80 мол.%, от примерно 20 мол.% до примерно 60 мол.%, от примерно 25 мол.% до примерно 55 мол.%, от примерно 30 мол.% до примерно 50 мол.%, от примерно 35 мол.% до примерно 45 мол.% или примерно 40 мол.% всех липидов, присутствующих в частице.

Дополнительные липиды

Кроме катионного липида РНК-частицы, описанные в настоящем описании, могут включать один или несколько дополнительных липидов. Может быть включен дополнительный липид, который может или не может влиять на общий заряд РНК-частиц. В некоторых воплощениях дополнительный липид является некатионным липидом. Некатионный липид может включать, например, один или несколько анионных липидов и/или нейтральных липидов. При использовании в настоящем описании «нейтральный липид» относится к любому виду из ряда липидов, который существует или в незаряженной или нейтральной цвиттерионной форме при выбранном рН. В предпочтительных воплощениях дополнительный липид включает один из следующих нейтральных липидных компонентов: (1) фосфолипид, (2) холестерин или его производное или (3) смесь фосфолипида и холестерина или его производного. Примеры производных холестерина включают, но без ограничения, холестанол. холестанон, холестенон, копростанол, холестерил-2'-гидроксиэтиловый эфир, холестерил-4'-гидроксибутиловый эфир, токоферол и его производные и их смеси.

Конкретные фосфолипиды, которые могут быть использованы, включают, но без ограничения, фосфатидилхолины, фосфатидилэтаноламины, фосфатидилглицерины, фосфатидные кислоты, фосфатидилсерины или сфингомиелин. Такие фосфолипиды включают, в частности, диацилфосфатидилхолины, такие как дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), диолеоилфосфатидилхолин (DOPC), дтмиристоилфосфатидилхолин (DMPC), дипентадеканоилфосфатидилхолин, дилауроилфосфатидилхолин, дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), диарахидоилфосфатидилхолин (DAPC), дибегеноилфосфатидилхолин (DBPC), дитрикозаноилфосфатидилхолин (DTPC), дилигноцероилфтадихолин (DLPC), пальмитоилолеоилфосфатидилхолин (POPC), 1,2-ди-O-октадеценил-sn-глицеро-3-фосфохолин (18:0 диэфир PC), 1-олеоил-2-холестерилгемисукциноил-sn-глицеро-3-фосфохолин (OChemsPC), 1-гексадецил-sn-глицеро-3-фосфохолин (C16 Lyso PC), и фосфатидилэтаноламины, в частности, диацилфосфатидилэтаноламины, такие как диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE), дистеароилфосфатидилэтаноламин (DSPE), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), димиристоилфосфатидилэтаноламин (DMPE), дилауроилфосфатидилэтаноламин (DLPE), дифитаноилфосфатидилэтаноламин (DPyPE) и другие липиды фосфатидилэтаноламины с различными гидрофобными цепями.

В некоторых предпочтительных воплощениях дополнительным липидом является DSPC или DSPC и холестерин.

В некоторых воплощениях РНК-частицы включают как катионный липид, так и дополнительный липид. В примере воплощения катионным липидом является DODMA и дополнительным липидом является DSPC или DSPC и холестерин.

Без желания привязываться к какой-либо теории, количество по меньшей мере одного катионного липида по сравнению с количеством по меньшей мере одного дополнительного липида может существенно влиять на важные свойства РНК-частиц, такие как заряд, размер частиц, устойчивость, тканеселективность и биоактивность РНК. Соответственно, в некоторых воплощениях молярное отношение по меньшей мере одного катионного липида к по меньшей мере одному дополнительному липиду составляет от примерно 10:0 до примерно 1:9, примерно 4:1 – примерно 1:2 или примерно 3:1 – примерно 1:1.

В некоторых воплощениях некатионный липид, в частности, нейтральный липид (например, один или несколько фосфолипидов и/или холестерин), может составлять от примерно 0 мол.% до примерно 90 мол.%, от примерно 20 мол.% до примерно 80 мол.%, от примерно 25 мол.% до примерно 75 мол.%, от примерно 30 мол.% до примерно 70 мол.%, от примерно 35 мол.% до примерно 65 мол.% или от примерно 40 мол.% до примерно 60 мол. % всего липида, присутствующего в частице.

В некоторых предпочтительных воплощениях некатионный липид, в частности, нейтральный липид, включает фосфолипид, такой как DSCP, от примерно 0 мол.% до примерно 90 мол.%, от примерно 20 мол.% до примерно 80 мол.%, от примерно 25 мол.% до примерно 75 мол.%, от примерно 30 мол.% до примерно 70 мол.%, от примерно 35 мол.% до примерно 65 мол.% или от примерно 40 мол.% до примерно 60 мол.% всего липида, присутствующего в частице.

В некоторых предпочтительных воплощениях некатионный липид, в частности, нейтральный липид, включает холестерин или его производное, от примерно 10 мол.% до примерно 80 мол.%, от примерно 10 мол.% до примерно 70 мол.%, от примерно 15 мол.% до примерно 65 мол.%, от примерно 20 мол.% до примерно 60 мол.%, от примерно 235 мол.% до примерно 55 мол.% или от примерно 30 мол.% до примерно 50 мол.% всего липида, присутствующего в частице.

В некоторых предпочтительных воплощениях некатионный липид, в частности, нейтральный липид, включает смесь (i) фосфолипида, такого как DSPC, в количестве от примерно 5 мол.% до примерно 50 мол.%, от примерно 5 мол.% до примерно 45 мол.%, от примерно 5 мол.% до примерно 40 мол.%, от примерно 5 мол.% до примерно 35 мол.%, от примерно 5 мол.% до примерно 30 мол.%, от примерно 5 мол.% до примерно 25 мол.%, or от примерно 5 мол.% до примерно 20 мол.% всего липида, присутствующего в частице; и (ii) холестерина или его производного, например, холестерина, в количестве от примерно 10 мол.% до примерно 80 мол.%, от примерно 10 мол.% до примерно 70 мол.%, от примерно 15 мол.% до примерно 65 мол.%, от примерно 20 мол.% до примерно 60 мол.%, от примерно 25 мол.% до примерно 55 мол.% или от примерно 30 мол.% до примерно 50 мол.% всего липида, присутствующего в частице. Как неограничивающий пример, липидная частица, включающая смесь фосфолипида и холестерина, может включать DSPC в количестве от примерно 5 мол.% до примерно 50 мол.%, от примерно 5 мол.% до примерно 45 мол.%, от примерно 5 мол.% до примерно 40 мол.%, от примерно 5 мол.% до примерно 35 мол.%, от примерно 5 мол.% до примерно 30 мол.%, от примерно 5 мол.% до примерно 25 мол.% или от примерно 5 мол.% до примерно 20 мол.% всего липида, присутствующего в частице, и холестерин в количестве от примерно 10 мол.% до примерно 80 мол.%, от примерно 10 мол.% до примерно 70 мол.%, от примерно 15 мол.% до примерно 65 мол.%, от примерно 20 мол.% до примерно 60 мол.%, от примерно 25 мол.% до примерно 55 мол.% или от примерно 30 мол.% до примерно 50 мол.% всего липида, присутствующего в частице.

Конъюгат полисаркозин-липид

РНК-частицы, описанные в настоящем описании, такие как РНК-частицы, описанные выше, включающие катионный липид и дополнительный липид, также включают конъюгат полисаркозина, такой как конъюгат полисаркозин-липид. Полисаркозин может образовать конъюгат, в частности, будучи ковалентно связан или соединен с любым образующим частицу компонентом, таким как липид или липидоподобный материал. Конъюгат полисаркозин-липид представляет собой молекулу, в которой полисаркозин конъюгирован с липидом, описанным в настоящем описании, таким как катионный липид или ионизируемый по катионному типу липид, или дополнительный липид. С другой стороны, полисаркозин конъюгирован с липидом или липидоподобным материалом, который отличается от катионного или ионизируемого по катионному типу липида или дополнительного липида.

В некоторых воплощениях конъюгат полисаркозин-липид или конъюгат полисаркозина и липидоподобного материала имеет следующую общую формулу (II)

,

в которой один из R₁ и R₂ включает гидрофобную группу, а другой представляет собой Н, гидрофильную группу, ионизируемую группу или функциональную группу, включающую нацеливающую группу. В одном воплощении гидрофобная группа включает линейную или разветвленную алкильную группу или арильную группу, предпочтительно включающую от 10 до 50, 10-40 или 12-20 атомов углерода. В одном воплощении R₁ или R₂, который включает гидрофобную группу, включает частицу, такую как гетероатом, в частности, N, соединенный с одной или несколькими линейными или разветвленными алкильными группами.

В некоторых воплощениях конъюгат полисаркозин-липид или конъюгат полисаркозина и липидоподобного материала, заключается в следующей общей формуле (III)

,

в которой R представляет собой Н, гидрофильную группу, ионизируемую группу или функциональную группу, необязательно включающую нацеливающую группу.

В настоящем описании символ «х» в общих формулах, например, общих формулах (II) и (III), относится к числу звеньев саркозина и может представлять собой число, определенное в настоящем описании.

В некоторых воплощениях конъюгат полисаркозин-липид или конъюгат полисаркозина и липидоподобного материала является членом, выбранным из группы, включающей конъюгат полисаркозин-диацилглицерин, полисаркозин-диалкилоксипропиловый конъюгат, конъюгат полисаркозин-фосфолипид, конъюгат полисаркозин-церамид и их смесь.

В некоторых случаях конъюгат полисаркозин-липид может включать от примерно 0,2 мол.% до примерно 50 мол.%, от примерно 0,25 мол.% до примерно 30 мол.%, от примерно 0,5 мол.% до примерно 25 мол.%, от примерно 0,75 мол.% до примерно 25 мол.%, от примерно 1 мол.% до примерно 25 мол.%, от примерно 1 мол.% до примерно 20 мол.%, от примерно 1 мол.% до примерно 15 мол.%, от примерно 1 мол.% до примерно 10 мол.%, от примерно 1 мол.% до примерно 5 мол.%, от примерно 1,5 мол.% до примерно 25 мол.%, от примерно 1,5 мол.% до примерно 20 мол.%, от примерно 1,5 мол.% до примерно 15 мол.%, от примерно 1,5 мол.% до примерно 10 мол.%, от примерно 1,5 мол.% до примерно 5 мол.%, от примерно 2 мол.% до примерно 25 мол.%, от примерно 2 мол.% до примерно 20 мол.%, от примерно 2 мол.% до примерно 15 мол.%, от примерно 2 мол.% до примерно 10 мол.% или от примерно 2 мол.% до примерно 5 мол.% всего липида, присутствующего в частице.

Типично полисаркозиновая группа имеет от 2 до 200, от 5 до 200, от 5 до 190, от 5 до 180, от 5 до 170, от 5 до 160, от 5 до 150, от 5 до 140, от 5 до 130, от 5 до 120, от 5 до 110, от 5 до 100, от 5 до 90, от 5 до 80, от 10 до 200, от 10 до 190, от 10 до 180, от 10 до 170, от 10 до 160, от 10 до 150, от 10 до 140, от 10 до 130, от 10 до 120, от 10 до 110, от 10 до 100, от 10 до 90 или от 10 до 80 звеньев саркозина.

РНК-липидные частицы

«РНК-липидная частица» включает липидную композицию, которую можно использовать для доставки РНК к месту цели, представляющей интерес (например, клетке, ткани, органу и т.п.). РНК-липидная частица обычно образуется из катионного липида, такого как DODMA, одного или нескольких некатионных липидов, таких как фосфолипиды (например, DSPC), холестерин или его аналоги, и конъюгата полисаркозин-липид.

Без предположения связи с какой-либо теорией, полагают, что катионный липид и дополнительные липиды объединяются вместе с РНК с образованием агрегатов, причем нуклеиновая кислота связывается с липидным матриксом, и эта спонтанная агрегация приводит к устойчивым в коллоиде частицам.

В некоторых воплощениях РНК-липидные частицы включают молекулы РНК больше одного типа, где молекулярные параметры молекул РНК могут быть схожими или отличающимися друг от друга, например, в отношении молекулярной массы или фундаментальных структурных элементов, таких как молекулярная архитектура, кэпирование, кодирующие участки или другие особенности.

В некоторых воплощениях РНК-липидные частицы включают, кроме РНК, (i) катионный липид, который может включать от примерно 10 мол.% до примерно 80 мол.%, от примерно 20 мол.% до примерно 60 мол.%, от примерно 25 мол.% до примерно 55 мол.%, от примерно 30 мол.% до примерно 50 мол.%, от примерно 35 мол.% до примерно 45 мол.% или примерно 40 мол.% всего липида, присутствующего в частице, (ii) некатионный липид, в частности, нейтральный липид (например, один или несколько фосфолипидов и/или холестерин), который может включать от примерно 0 мол.% до примерно 90 мол.%, от примерно 20 мол.% до примерно 80 мол.%, от примерно 25 мол.% до примерно 75 мол.%, от примерно 30 мол.% до примерно 70 мол.%, от примерно 35 мол.% до примерно 65 мол.% или от примерно 40 мол.% до примерно 60 мол.% всего липида, присутствующего в частице, и (iii) конъюгат полисаркозин-липид, который может включать от примерно 0,2 мол.% до примерно 50 мол.%, от примерно 0,25 мол.% до примерно 30 мол.%, от примерно 0,5 мол.% до примерно 25 мол.%, от примерно 0,75 мол.% до примерно 25 мол.%, от примерно 1 мол.% до примерно 25 мол.%, от примерно 1 мол.% до примерно 20 мол.%, от примерно 1 мол.% до примерно 15 мол.%, от примерно 1 мол.% до примерно 10 мол.%, от примерно 1 мол.% до примерно 5 мол.%, от примерно 1,5 мол.% до примерно 25 мол.%, от примерно 1,5 мол.% до примерно 20 мол.%, от примерно 1,5 мол.% до примерно 15 мол.%, от примерно 1,5 мол.% до примерно 10 мол. %, от примерно 1,5 мол. % до примерно 5 мол. %, от примерно 2 мол. % до примерно 25 мол.%, от примерно 2 мол.% до примерно 20 мол.%, от примерно 2 мол.% до примерно 15 мол.%, от примерно 2 мол.% до примерно 10 мол.% или от примерно 2 мол.% до примерно 5 мол.% всего липида, присутствующего в частице.

В некоторых предпочтительных воплощениях некатионный липид, в частности нейтральный липид, включает фосфолипид в количестве от примерно 5 мол.% до примерно 50 мол.%, от примерно 5 мол.% до примерно 45 мол.%, от примерно 5 мол.% до примерно 40 мол.%, от примерно 5 мол.% до примерно 35 мол.%, от примерно 5 мол.% до примерно 30 мол.%, от примерно 5 мол.% до примерно 25 мол.% или от примерно 5 мол.% до примерно 20 мол.% всего липида, присутствующего в частице.

В некоторых предпочтительных воплощениях некатионный липид, в частности нейтральный липид, включает холестерин или его производное в количестве от примерно 10 мол.% до примерно 80 мол.%, от примерно 10 мол.% до примерно 70 мол.%, от примерно 15 мол.% до примерно 65 мол.%, от примерно 20 мол.% до примерно 60 мол.%, от примерно 25 мол.% до примерно 55 мол.% или от примерно 30 мол.% до примерно 50 мол.% всего липида, присутствующего в частице.

В некоторых предпочтительных воплощениях некатионный липид, в частности нейтральный липид, включает смесь (i) фосфолипида, такого как DSPC, от примерно 5 мол.% до примерно 50 мол.%, от примерно 5 мол.% до примерно 45 мол.%, от примерно 5 мол.% до примерно 40 мол.%, от примерно 5 мол.% до примерно 35 мол.%, от примерно 5 мол.% до примерно 30 мол.%, от примерно 5 мол.% до примерно 25 мол.% или от примерно 5 мол.% до примерно 20 мол.% всего липида, присутствующего в частице; и (ii) холестерина или его производного, например, холестерина, от примерно 10 мол.% до примерно 80 мол.%, от примерно 10 мол.% до примерно 70 мол.%, от примерно 15 мол.% до примерно 65 мол.%, от примерно 20 мол.% до примерно 60 мол.%, от примерно 25 мол.% до примерно 55 мол.% или от примерно 30 мол.% до примерно 50 мол.% всего липида, присутствующего в частице. Как неограничивающий пример, липидная частица, включающая смесь фосфолипида и холестерина, может включать DSPC от примерно 5 мол.% до примерно 50 мол.%, от примерно 5 мол.% до примерно 45 мол.%, от примерно 5 мол.% до примерно 40 мол.%, от примерно 5 мол.% до примерно 35 мол.%, от примерно 5 мол.% до примерно 30 мол.%, от примерно 5 мол.% до примерно 25 мол.% или от примерно 5 мол.% до примерно 20 мол.% всего липида, присутствующего в частице, и холестерин от примерно 10 мол.% до примерно 80 мол.%, от примерно 10 мол.% до примерно 70 мол.%, от примерно 15 мол.% до примерно 65 мол.%, от примерно 20 мол.% до примерно 60 мол.%, от примерно 25 мол.% до примерно 55 мол.% или от примерно 30 мол.% до примерно 50 мол.% всего липида, присутствующего в частице.

Типично полисаркозиновая группа имеет от 2 до 200, от 5 до 200, от 5 до 190, от 5 до 180, от 5 до 170, от 5 до 160, от 5 до 150, от 5 до 140, от 5 до 130, от 5 до 120, от 5 до 110, от 5 до 100, от 5 до 90, от 5 до 80, от 10 до 200, от 10 до 190, от 10 до 180, от 10 до 170, от 10 до 160, от 10 до 150, от 10 до 140, от 10 до 130, от 10 до 120, от 10 до 110, от 10 до 100, от 10 до 90 от 10 до 80 звеньев саркозина.

В некоторых воплощениях РНК-липидные частицы кроме РНК включают (i) DODMA, который может включать от примерно 10 мол.% до примерно 80 мол.%, от примерно 20 мол.% до примерно 60 мол.%, от примерно 25 мол.% до примерно 55 мол.%, от примерно 30 мол.% до примерно 50 мол.%, от примерно 35 мол.% до примерно 45 мол.% или примерно 40 мол.% всего липида, присутствующего в частице, (ii) DSPC, который может включать от примерно 5 мол.% до примерно 50 мол.%, от примерно 5 мол.% до примерно 45 мол.%, от примерно 5 мол.% до примерно 40 мол.%, от примерно 5 мол.% до примерно 35 мол.%, от примерно 5 мол.% до примерно 30 мол.%, от примерно 5 мол.% до примерно 25 мол.% или от примерно 5 мол.% до примерно 20 мол.% всего липида, присутствующего в частице, (iii) холестерин, который может включать от примерно 10 мол.% до примерно 80 мол.%, от примерно 10 мол.% до примерно 70 мол.%, от примерно 15 мол.% до примерно 65 мол.%, от примерно 20 мол.% до примерно 60 мол.%, от примерно 25 мол.% до примерно 55 мол.% или от примерно 30 мол.% до примерно 50 мол.% всего липида, присутствующего в частице, и (iv) конъюгат полисаркозин-липид, который может включать от примерно 0,2 мол.% до примерно 50 мол.%, от примерно 0,25 мол.% до примерно 30 мол.%, от примерно 0,5 мол.% до примерно 25 мол.%, от примерно 0,75 мол.% до примерно 25 мол.%, от примерно 1 мол.% до примерно 25 мол.%, от примерно 1 мол.% до примерно 20 мол.%, от примерно 1 мол.% до примерно 15 мол.%, от примерно 1 мол.% до примерно 10 мол.%, от примерно 1 мол.% до примерно 5 мол.%, от примерно 1,5 мол.% до примерно 25 мол.%, от примерно 1,5 мол.% до примерно 20 мол.%, от примерно 1,5 мол.% до примерно 15 мол.%, от примерно 1,5 мол.% до примерно 10 мол.%, от примерно 1,5 мол.% до примерно 5 мол.%, от примерно 2 мол.% до примерно 25 мол.%, от примерно 2 мол.% до примерно 20 мол.%, от примерно 2 мол. % до примерно 15 мол. %, от примерно 2 мол. % до примерно 10 мол. % или от примерно 2 мол.% до примерно 5 мол.% всего липида, присутствующего в частице.

В некоторых воплощениях РНК-частицы включают конъюгат полисаркозин-липид согласно общей формуле (II) или (III), DODMA, DSPC и холестерин.

Диаметр РНК-частиц

РНК-частицы, описанные в настоящем описании, имеют средний диаметр, который в одном воплощении колеблется от примерно 30 нм до примерно 1000 нм, от примерно 30 нм до примерно 800 нм, от примерно 30 нм до примерно 700 нм, от примерно 30 нм до примерно 600 нм, от примерно 30 нм до примерно 500 нм, от примерно 30 нм до примерно 450 нм, от примерно 30 нм до примерно 400 нм, от примерно 30 нм до примерно 350 нм, от примерно 30 нм до примерно 300 нм, от примерно 30 нм до примерно 250 нм, от примерно 30 нм до примерно 200 нм, от примерно 30 нм до примерно 190 нм, от примерно 30 нм до примерно 180 нм, от примерно 30 нм до примерно 170 нм, от примерно 30 нм до примерно 160 нм, от примерно 30 нм до примерно 150 нм, от примерно 50 нм до примерно 500 нм, от примерно 50 нм до примерно 450 нм, от примерно 50 нм до примерно 400 нм, от примерно 50 нм до примерно 350 нм, от примерно 50 нм до примерно 300 нм, от примерно 50 нм до примерно 250 нм, от примерно 50 нм до примерно 200 нм, от примерно 50 нм до примерно 190 нм, от примерно 50 нм до примерно 180 нм, от примерно 50 нм до примерно 170 нм, от примерно 50 нм до примерно 160 нм или от примерно 50 нм до примерно 150 нм.

В некоторых воплощениях РНК-частицы, описанные в настоящем описании, имеют средний диаметр, который колеблется от примерно 40 нм до примерно 800 нм, от примерно 50 нм до примерно 700 нм, от примерно 60 нм до примерно 600 нм, от примерно 70 нм до примерно 500 нм, от примерно 80 нм до примерно 400 нм, от примерно 150 нм до примерно 800 нм, от примерно 150 нм до примерно 700 нм, от примерно 150 нм до примерно 600 нм, от примерно 200 нм до примерно 600 нм, от примерно 200 нм до примерно 500 нм или от примерно 200 нм до примерно 400 нм.

РНК-частицы, описанные в настоящем описании, например, полученные способами, описанными в настоящем описании, показывают индекс полидисперсности меньше примерно 0,5, меньше примерно 0,4, меньше примерно 0,3, меньше примерно 0,2 или меньше примерно 0,1 или меньше. Как пример, РНК-частицы могут показывать индекс полидисперсности в интервале от примерно 0,1 до примерно 0,3.

РНК

В настоящем раскрытии термин «РНК» относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые включают рибонуклеотидные остатки. В предпочтительных воплощениях РНК содержит все или большинство рибонуклеотидных остатков. При использовании в настоящем описании «рибонуклеотид» относится к нуклеотиду с гидроксильной группой в 2'-положении β-D-рибофуранозильной группы. РНК охватывает, без ограничения, двухцепочечную РНК, одноцепочечную РНК, изолированную РНК, такую как частично очищенная РНК, по существу чистую РНК, синтетическую РНК, полученную рекомбинантно РНК, а также модифицированную РНК, которая отличается от встречающейся в природе РНК добавлением, делецией, заменой и/или изменением одного или нескольких нуклеотидов. Такие изменения могут относиться к добавлению ненуклеотидного материала к внутренним нуклеотидам РНК или к концу(ам) РНК. В настоящем изобретении также предполагается, что нуклеотиды в РНК могут быть нестандартными нуклеотидами, такими как химически синтезированные нуклеотиды или дезоксинуклеотиды. Для настоящего раскрытия такие измененные РНК считаются аналогами встречающейся в природе РНК. В отдельных воплощениях РНК согласно изобретению включает популяцию различных молекул РНК, например, смесь различных молекул РНК, необязательно кодирующих различные пептиды и/или белки. Таким образом, согласно изобретению термин «РНК» может включать смесь молекул РНК.

В некоторых воплощениях настоящего раскрытия РНК является мессенджерной РНК (мРНК), которая относится к транскрпту РНК, который кодирует пептид или белок. Как установлено в технике, мРНК обычно содержит 5'-нетранслируемую область (5'-UTR), пептидкодирующую область и 3'-нетранслируемую область (3'-UTR). В некоторых воплощениях РНК получают транскрипцией in vitro или химическим синтезом. В одном воплощении мРНК получают транскрипцией in vitro с использованием ДНК-матрицы, где ДНК относится к нуклеиновой кислоте, которая содержит дезоксирибонуклеоиды.

В одном воплощении РНК представляет собой транскрибированную in vitro РНК (IVT-RNA) и может быть получена транскрипцией in vitro соответствующей ДНК-матрицы. Промотором для регулирования транскрипции может быть любой промотор для любой РНК-полимеразы. ДНК-матрица для транскрипции in vitro может быть получена клонированием нуклеиновой кислоты, в частности кДНК, и введением ее в соответствующий вектор для транскрипции in vitro. кДНК можно получить обратной транскрипцией РНК.

В некоторых воплощениях настоящего раскрытия РНК является репликоном РНК или просто «репликоном», в частности самореплицирующейся РНК. В одном особенно предпочтительном воплощении репликон или самореплицирующаяся РНК происходит из или включает элементы из оцРНК вируса, в частности, вируса с положительной цепью оцРНК, такого как альфавирус. Альфавирусы являются типичными представителями вирусов с положительной цепью РНК. Альфавирусы реплицируются в цитоплазме инфицированных клеток (обзор жизненного цикла альфавирусов см. в et al., Future Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 837–856). Общая длина генома многих альфавирусов обычно колеблется от 11000 до 12000 нуклеотидов, и геномная РНК типично имеет 5’-кэп и 3’-поли(A) хвост. Геном альфавирусов кодирует неструктурные белки (вовлеченные в транскрипцию, модификацию и репликацию вирусной РНК и в модификацию белков) и структурные белки (образующие вирусную частицу). В геноме обычно имеются две открытые рамки считывания (ORF). Четыре неструктурных белка (nsP1–nsP4) типично кодированы вместе первой ORF, начинающейся около 5′-конца генома, в то время как структурные белки альфавирусов кодируются вместе второй ORF, которая находится ниже первой ORF и продолжается до почти 3’-конца генома. Типично первая ORF больше второй ORF, причем соотношение составляет приблизительно 2:1. В клетках, инфицированных альфавирусом, только нуклеотидная последовательность, кодирующая неструктурные белки, транслируется из геномной РНК, в то время как генетическая информация, кодирующая структурные белки, может транслироваться из субгеномного транскрипта, который представляет собой молекулу РНК, которая имеет сходство с эукариотической мессенджерной РНК (мРНК; Gould et al., 2010, Antiviral Res., vol. 87 pp. 111–124). После заражения, т.е. на ранних этапах жизненного цикла вируса, (+)-цепочечная геномная РНК действует непосредственно, подобно мессенджерной РНК, на трансляцию открытой рамки считывания, кодирующей неструктурный полипротеин (nsP1234). Происходящие из альфавируса векторы предложены для доставки чужеродной генетической информации в клетки-мишени или организмы-мишени. В простых подходах открытую рамку считывания, кодирующую структурные белки альфавируса, заменяют открытой рамкой считывания, кодирующей белок, представляющий интерес. Системы трансрепликации на основе альфавирусов зависят от элементов нуклеотидной последовательности альфавируса в двух отдельных молекулах нуклеиновой кислоты: одна молекула нуклеиновой кислоты кодирует вирусную репликазу, и другая молекула нуклеиновой кислоты способна реплицироваться указанной репликазой в транс (отсюда обозначение «система трансрепликации»). Трансрепликация требует присутствия обеих этих молекул нуклеиновой кислоты в данной клетке-хозяине. Молекула нуклеиновой кислоты, способная реплицироваться репликазой в транс, должна включать некоторые элементы последовательности альфавируса для возможности узнавания и синтеза РНК репликазой альфавируса.

В некоторых воплощениях настоящего раскрытия РНК в РНК-частицах, описанных в настоящем описании, находится в концентрации от примерно 0,002 мг/мл до примерно 5 мг/мл, от примерно 0,002 мг/мл до примерно 2 мг/мл, от примерно 0,005 мг/мл до примерно 2 мг/мл, от примерно 0,01 мг/мл до примерно 1 мг/мл, от примерно 0,05 мг/мл до примерно 0,5 мг/мл или от примерно 0,1 мг/мл до примерно 0,5 мг/мл. В конкретных воплощениях РНК находится в концентрации от примерно 0,005 мг/мл до примерно 0,1 мг/мл, от примерно 0,005 мг/мл до примерно 0,09 мг/мл, от примерно 0,005 мг/мл до примерно 0,08 мг/мл, от примерно 0,005 мг/мл до примерно 0,07 мг/мл, от примерно 0,005 мг/мл до примерно 0,06 мг/мл или от примерно 0,005 мг/мл до примерно 0,05 мг/мл.

В одном воплощении РНК может иметь модифицированные рибонуклеотиды. Примеры модифицированных рибонуклеотидов включают, без ограничения, 5-метилцистидин, псевдоуридин (ψ), N1-метилпсевдоуридин (m¹ψ) или 5-метиуридин (m⁵U).

В некоторых воплощениях РНК согласно настоящему раскрытию включает 5'-кэп. В одном воплощении РНК по настоящему раскрытию не имеет некэпированные 5'-трифосфаты. В одном воплощении РНК может быть модифицирована 5'-кэп-аналогом. Термин «5'-кэп» относится к структуре, обнаруженной в 5'-конце молекулы РНК, и обычно состоящей изнуклеотида гуанозина, соединенного с мРНК через трифосфатную связь 5'-5'. В одном воплощении этот гуанозин метилирован в положении 7. Предоставления РНК с 5'-кэпом или 5'-кэп-аналога можно добиться транскрипцией in vitro, в которой 5'-кэп экспрессируется совместной транскрипцией в цепь РНК, или можно присоединить к РНК после транскрипции с использованием кэпирующих ферментов.

В некоторых воплощениях РНК согласно настоящему раскрытию включает 5'-UTR и/или 3'-UTR. Термин «нетранслируемая область» или «UTR» относится к участку в молекуле ДНК, который транскрибируется, но не транслируется в аминокислотную последовательность или к соответствующему участку в молекуле РНК, такой как молекула мРНК. Нетранслируемая область (UTR) может присутствовать 5' (выше) открытой рамки считывания (5'-UTR) и/или 3' (ниже) открытой рамки считывания (3'-UTR). 5'-UTR, если присутствует, располагается в 5'-конце выше стартового кодона кодирующего белок участка. 5'-UTR находится ниже 5'-кэпа (если присутствует), например, в непосредственной близости к 5'-кэпу. 3'-UTR, если присутствует, располагается в 3'-конце ниже кодона терминации кодирующего белок участка, но термин «3'-UTR» предпочтительно не включает хвост поли-(А). Таким образом, 3'-UTR находится выше последовательности поли-(А) (если присутствует), например, в непосредственной близости к последовательности поли-(А).

В некоторых воплощениях РНК согласно настоящему раскрытию включает последовательность 3'-поли-(А). Термин «последовательность поли-(А)» относится к последовательности адениловых (А) остатков, которая типично располагается в 3'-конце молекулы РНК. Согласно раскрытию, в одном воплощении последовательность поли-(А) включает по меньшей мере примерно 20, по меньшей мере примерно 40, по меньшей мере примерно 80, по меньшей мере примерно 100 и до примерно 500, до примерно 400, до примерно 300, до примерно 200 или до примерно 150 А нуклеотидов, и в частности, примерно 120 А нуклеотидов.

В контексте настоящего раскрытия термин «транскрипция» относится к процессу, в котором генетический код в последовательности ДНК транскрибируется в РНК. Впоследствии РНК может быть транслирована в пептид или белок.

В отношении РНК, термин «экспрессия» или «трансляция» относится к процессу в рибосомах клетки, путем которого цепочка мРНК управляет сборкой последовательности аминокислот для образования пептида или белка.

РНК может представлять собой кодирующую РНК, т.е. РНК, кодирующую пептид или белок. Указанная РНК может экспрессировать кодированный пептид или белок. С другой стороны, указанная РНК может представлять собой некодирующую РНК, такую как антисмысловая РНК, микро РНК (миРНК) или сиРНК.

РНК, используемая в настоящем изобретении, может представлять собой фармацевтически активную РНК. «Фармацевтически активной РНК» является РНК, которая кодирует фармацевтически активный пептид или белок или является фармацевтически активной сама по себе, например, она имеет одну или несколько фармацевтических активностей, таких как активности, описанные для фармацевтически активных белков, например, иммуностимулирующую активность. Например, РНК может представлять собой одну или несколько цепей РНК-интерференции (РНКи). Такие агенты включают короткие интерферирующие РНК (киРНК) или короткие шпилькообразные РНК (кшРНК) или предшественника миРНК или РНК, подобную микроРНК, нацеленные на транскрипт-мишень, например, транскрипт эндогенного связанного с болезнью транскрипта субъекта.

Некоторые аспекты раскрытия включают направленную доставку РНК, раскрытой в настоящем описании, в определенные клетки или ткани. В одном воплощении раскрытие включает нацеливание на лимфатическую систему, в частности, вторичные лимфоидные органы, конкретнее селезенки. Нацеливание на лимфатическую систему, в частности, вторичные лимфоидные органы, конкретнее селезенку, является особенно предпочтительным, если вводимая РНК представляет собой РНК, кодирующую антиген или эпитоп для индукции иммунного ответа. В одном воплощении клеткой-мишенью является клетка селезенки. В одном воплощении клеткой-мишенью является антигенпредставляющая клетка, такая как профессиональная антигенпредставляющая клетка селезенки. В одном воплощении клеткой-мишенью является дендритная клетка в селезенке. «Лимфатическая система» является частью системы кровообращения и важной частью иммунной системы, включающей сеть лимфатических сосудов, которые несут лимфу. Лимфатическая система состоит из лимфатических органов, проводящей сети лимфатических сосудов и циркулирующей лимфы. Первичные или центральные лимфоидные органы генерируют лимфоциты из незрелых клеток-предшественников. Тимус и костный мозг составляют первичные лимфоидные органы. Вторичные или периферические лимфоидные органы, которые включают лимфатические узлы и селезенку, сохраняют зрелые наивные лимфоциты и инициируют адаптивный иммунный ответ.

Системы доставки РНК на основе липидов предпочтительны для печени. Накопление в печени вызывается прерывистым характером сосудистой системы печени или метаболизмом липидов (конъюгатов липосом и липидов или холестерина). В одном воплощении органом-мишенью является печень, и тканью-мишенью является ткань печени. Доставка в такую ткань-мишень предпочтительна, в частности, если в этом органе желательно присутствие РНК или кодированного пептида или белка, и/или если желательно экспрессировать большие количества кодированного пептида или белка, и/или если желательно или требуется системное присутствие кодированного пептида или белка, в частности, в значительных количествах.

В одном воплощении после введения РНК-частиц, описанных в настоящем описании, по меньшей мере часть РНК доставляется в клетку-мишень или орган-мишень. В одном воплощении по меньшей мере часть РНК доставляется в цитозоль клетки-мишени. В одном воплощении РНК представляет собой РНК, кодирующую пептид или белок, и РНК транслируется клеткой-мишенью с продуцированием пептида или белка. В одном воплощении клетка-мишень является клеткой печени. В одном воплощении клетка-мишень является мышечной клеткой. В одном воплощении клетка-мишень является эндотелиальной клеткой. В одном воплощении клетка-мишень является клеткой опухоли или клеткой в микроокружении опухоли. В одном воплощении клетка-мишень является клеткой крови. В одном воплощении клетка-мишень является клеткой в лимфатических узлах. В одном воплощении клетка-мишень является клеткой в легком. В одном воплощении клетка-мишень является клеткой крови. В одном воплощении клетка-мишень является клеткой кожи. В одном воплощении клетка-мишень является клеткой селезенки. В одном воплощении клетка-мишень является антигенпредставляющей клеткой, такой как профессиональная антигенпредставляющая клетка в селезенке. В одном воплощении клетка-мишень является дентдритной клеткой в селезенке. В одном воплощении клетка-мишень представляет собой Т-клетку. В одном воплощении клетка-мишень представляет собой В-клетку. В одном воплощении клетка-мишень представляет собой NK-клетку. В одном воплощении клетка-мишень представляет собой моноцит. Таким образом, РНК-частицы, описанные в настоящем описании, можно использовать для доставки РНК в такие клетки-мишени. Соответственно, настоящее раскрытие также относится к способу доставки РНК в клетку-мишень субъекта, включающему введение субъекту РНК-частиц, описанных в настоящем описании. В одном воплощении РНК представляет собой РНК, кодирующую пептид или белок, и РНК транслируется клеткой-мишенью с продуцированием пептида или белка.

В одном воплощении РНК кодирует фармацевтически активный пептид или белок.

Согласно раскрытию, термин «РНК кодирует» означает, что РНК, если присутствует в соответствующем окружении, таком как в клетках ткани-мишени, может управлять сборкой аминокислот для продуцирования пептида или белка, (которые) она кодирует во время процесса трансляции. В одном воплощении РНК способна взаимодействовать с клеточным механизмом трансляции, позволяющим трансляцию пептида или белка. Клетка может продуцировать кодированный пептид или белок внутриклеточно (например, в цитоплазме), может секретировать кодированный пептид или белок или может продуцировать его на поверхности.

Согласно раскрытию, термин «пептид» включает олиго- и полипептиды и относится к веществам, которые включают примерно два или три, примерно 3 или больше, примерно 4 или больше, примерно 6 или больше, примерно 8 или больше, примерно 10 или больше, примерно 13 или больше, примерно 16 или больше, примерно 20 или больше и до примерно 50, примерно 100 или примерно 150 последовательных аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями. Термин «белок» относится к крупным пептидам, в частности, пептидам, имеющим по меньшей мере примерно 151 аминокислоту, но термины «пептид» и «белок» в настоящем описании используются как синонимы.

«Фармацевтически активный пептид или белок» или «терапевтический пептид или белок» оказывает положительное или благоприятное действие на состояние или болезненное состояние субъекта, когда предоставляется субъекту в терапевтически эффективном количестве. В одном воплощении фармацевтически активный пептид или белок имеет лечебные или паллиативные свойства и может вводиться для уменьшения интенсивности, ослабления, облегчения, реверсии, отсрочки начала или уменьшения тяжести одного или нескольких симптомов заболевания или расстройства. Фармацевтически активный пептид или белок может иметь профилактические свойства и может использоваться для отсрочки начала заболевания или уменьшения тяжести такого заболевания или патологического состояния. Термин «фармацевтически активный пептид или белок» включает полные белки или полипептиды и также может относиться к их фармацевтически активным фрагментам. Он также может включать фармацевтически активные аналоги пептида или белка.

Примеры фармацевтически активных белков включают, но без ограничения, цитокины и их производные, такие как слитые цитокины (подобные цитокинам, слитым с альбумином), и белки иммунной системы, такие как иммунологически активные соединения (например, интерлейкины, колониестимулирующий фактор (CSF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), эритропоэтин, фактор некроза опухоли (TNF), интерфероны, интегрины, аддрессины, селетины, хоминг-рецепторы, Т-клеточные рецепторы, химерные рецепторы антигена (CAR), иммуноглобулины, включая антитела или биспецифические антитела, например, для иммунной стимуляции или продуцирования нейтрализующих антител в случае вирусной/бактериальной инфекции, растворимые антигены главного комплекса гистосовместимости, иммунологически активные антигены, такие как антигены бактерий, паразитов или вирусов, аллергены, аутоантигены, антитела), гормоны (инсулин, тиреоидный гормон, катехоламины, гонадотропины, тропные гормоны, пролактин, окситоцин, допамин, бычий соматотропин, лептины и т.п.), гормоны роста (например, человеческий гормон роста), факторы роста (например, эпидермальный фатор роста, фактор роста нервов, инсульиноподобный фактор роста и т.п.), рецепторы факторов роста, ферменты (тканевый активатор плазминогена, стрептокиназа, холестерин биосинтезируемый или деградирующий (degradative), стероидогенные ферменты, киназы, фосфодиэстеразы, метилазы, деметилазы, дегидрогеназы, целлюлазы, протеазы, липазы, фосфолипазы, ароматазы, цитохромы, аденилат- или гуанилатциклазы, нейроамидазы, лизосомные ферменты и т.п.), рецепторы (рецепторы стероидных гормонов, пептидные рецепторы) связывающие белки (белки, связывающие гормон роста или факторы роста и т.п.), факторы транскрипции и трансляции, белки, подавляющие рост опухолей (например, белки, которые ингибируют ангиогенез), структурные белки (такие как коллаген, фибрин, фибриноген, эластин, тубулин, актин и миозин), белки крови (тромбин, сывороточный альбумин, фактор VII, фактор VIII, инсулин, фактор IX, фактор Х, тканевый активатор плазминогена, белок С, фактор фон Виллебранда, антитромбин III, глюкоцереброзидаза, эритропоэтин, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (GCSF) или модифицированный фактор VIII, антикоагулянты и т.п.

Термин «иммунологически активное соединение» относится к любому соединению, изменяющему иммунный ответ, например, путем вызывания и/или подавления созревания иммунных клеток, вызывания и/или подавления биосинтеза цитокинов и/или изменения гуморального иммунитета путем стимуляции продуцирования антител В-клетками. Иммунологически активные соединения обладают сильной иммуностимулирующей активностью, включая, но без ограничения, антивирусную и противоопухолевую активность, и также могут даунрегулировать другие аспекты иммунного ответа, например, смещая иммунный ответ от ТН2 иммунного ответа, который полезен для лечения широкого ряда заболеваний, опосредуемых ТН2. Иммунологически активные соединения могут быть полезны в качестве адъювантов вакцин.

В одном воплощении фармацевтически активный пептид или белок включает цитокин. Термин «цитокин» относится к классу небольших белков (~5-20 кДа), которые являются важными в передаче сигналов клеток. Их высвобождение оказывает действие на поведение окружающих их клеток. Цитокины вовлечены в аутокринную передачу сигналов, паракринную передачу сигналов и эндокринную передачу сигналов как иммуномодуляторы. Цитокины включают хемокины, интерфероны, интерлейкины, лимфолейкины и факторы некроза опухоли, но как правило, не гормоны или факторы роста (несмотря на некоторое совпадение в терминологии). Цитокины продуцируются широким рядом клеток, включая иммунные клетки, подобные макрофагам, В-лимфоцитам, Т-лимфоцитам и тучным клеткам, а также эндотелиальными клетками, фибробластами и различными стромальными клетками. Данный цитокин может продуцироваться больше чем одним типом клеток. Цитокины действуют через рецепторы и являются особенно важными в иммунной системе; цитокины модулируют баланс между гуморальным и клеточным иммунным ответом, и они регулируют созревание, рост и реактивность отдельных клеточных популяций. Некоторые цитокины усиливают или ингибируют действие других цитокинов сложными путями.

В одном воплощении фармацевтически активный белок согласно изобретению представляет собой цитокин, который вовлечен в регуляцию лимфоидного гомеостаза, предпочтительно цитокин, который вовлечен в и предпочтительно индуцирует или усиливает развитие, примирование, экспансию, дифференцировку и/или выживание Т-клеток. В одном воплощении цитокин представляет собой интелейкин. В одном воплощении фармацевтически активный белок согласно изобретению представляет собой интелейкин, выбранный из группы, включающей IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 и IL-21.

В одном воплощении фармацевтически активный пептид или белок включает заменяющий белок. В этом воплощении настоящее изобретение относится к способу лечения субъекта с расстройством, требующим замены белка (например, из расстройств, связанных с дефицитом белка), включающему введение субъекту РНК, описанной в настоящем описании, кодирующей заменяющий белок. Термин «замена белка» относится к введению белка (включая его функциональные варианты) субъекту, имеющему дефицит такого белка. Термин также относится к введению белка субъекту, иначе требующему или имеющему пользу от предоставления белка, например, страдающему от белковой недостаточности. Термин «расстройство, характеризующееся дефицитом белка» относится к любому расстройству, которое имеет место с патологией, вызванной отсутствием или недостаточными количествами белка. Этот термин охватывает нарушения фолдинга белка, т.е. конформационные нарушения, которые приводят к биологически неактивносму белковому продукту. Белковая недостаточность может вовлекаться в инфекционные заболевания, иммуносупрессию, недостаточность органов, в проблемы с железом, лучевую болезнь, дефицит питательных веществ, отравление или другие травмирующие воздействия окружающей среды или пришедшие извне поражения.

В одном воплощении фармацевтически активный пептид или белок включает один или несколько антигенов или один или несколько эпитопов, т.е. введение пептида или белка субъекту добивается иммунного ответа у субъекта против одного или нескольких антигенов или одного или нескольких эпитопов, который может быть терапевтически полностью или частично защитным.

Термин «антиген» относится к агенту, включающему эпитоп, против которого он может генерировать иммунный ответ. Термин «антиген» включает, в частности, белки и пептиды. В одном воплощении антиген презентуется клетками иммунной системы, такими как антигенпредставляющие клетки, подобные дендритам или макрофагам. Антиген или продукт его процессинга, такой как Т-клеточный эпитоп, в одном воплощении связан Т- или В-клеточным рецептором или молекулой иммуноглобулина, такой как антитело. Соответственно, антиген или продукт его процессинга может специфически взаимодействовать с антителами или Т-лимфоцитами (Т-клетками). В одном воплощении антиген представляет собой антиген, ассоциированный с заболеванием, такой как опухолевый антиген, антиген вируса или антиген бактерии, и эпитоп происходит из такого антигена.

Термин «антиген, ассоциированный с заболеванием» используется в его самом широком смысле как относящийся к любому антигену, ассоциированному с заболеванием. Антиген, ассоциированный с заболеванием, представляет собой молекулу, которая содержит эпитопы, которые будут стимулировать иммунную систему хозяина для получения клеточного антигенспецифического иммунного ответа и/или гуморального ответа антител против заболевания. Поэтому антиген, ассоциированный с заболеванием, или его эпитоп можно использовать в терапевтических целях. Антигены, ассоциированные с заболеваниями, могут быть ассоциированными с инфекцией через микробов, типично антигены микробов, или ассоциированы с раком, типично опухолями.

Термин «опухолевый антиген» относится к элементу раковых клеток, который может происходить из цитоплазмы, клеточной поверхности и клеточного ядра. В частности, он относится к тем антигенам, которые продуцируются внутри клеток или как поверхностные антигены на опухолевых клетках.

Термин «антиген вируса» относится к любому компоненту вируса, имеющему антигенные свойства, т.е. способному вызывать иммунный ответ у индивидуума. Антиген вируса может представлять собой рибонуклеопротеин вируса или белок оболочки.

Термин «антиген бактерии» относится к любому компоненту бактерии, имеющему антигенные свойства, т.е. способному вызывать иммунный ответ у индивидуума. Антиген бактерии может происходить из клеточной стенки или цитоплазматической мембраны бактерии.

Термин «эпитоп» относится к части или фрагменту молекулы, такой как антиген, которая узнается иммунной системой. Например, эпитоп может распознаваться Т-клетками, В-клетками или антителами. Эпитоп антигена может включать непрерывную или прерывистую часть антигена и может составлять от примерно 5 до примерно 100, например, примерно от 5 до примерно 50, предпочтительнее от примерно 8 до примерно 30, наиболее предпочтительно от примерно 10 до примерно 25 аминокислот в длину, например, эпитоп предпочтительно может составлять 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 аминокислот в длину. В одном воплощении эпитоп составляет от примерно 10 до примерно 25 аминокислот в длину. Термин «эпитоп» включает Т-клеточные эпитопы.

Термин «Т-клеточный эпитоп» относится к части или фрагменту белка, который узнается Т-клеткой, когда представлен в контексте молекул MHC. Термин «главный комплекс гистосовместимости» и аббревиатура «MHC» включают молекулы MHC I класса и MHC II класса и относится к комплексу генов, которые присутствуют у всех позвоночных. Белки или молекулы MHC являются важными для передачи сигналов между лимфоцитами и антигенпредставляющими клетками или больными клетками в иммунных реакциях, причем белки или молекулы MHC связывают эпитопы пептида и представляют их для узнавания Т-клеточными рецепторами на Т-клетках. Белки, кодированные MHC, экспрессируются на поверхности клеток и отражают как собственные антигены (пептидные фрагменты из самой клетки), так и несобственные антигены (например, фрагменты вторгающихся микроорганизмов) для Т-клеток. В случае MHC I класса/пептидных комплексов связывающие пептиды типично составляют примерно 8 – примерно 10 аминокислот в длину, хотя эффективными могут быть более длинные или более короткие пептиды. В случае MHC II класса/пептидных комплексов связывающие пептиды типично составляют примерно 10 – примерно 25 аминокислот в длину, и, в частности, имеют длину в примерно 13 – примерно 18 аминокислот, хотя эффективными могут быть более длинные или более короткие пептиды.

Термины «Т-клетка» и «Т-лимфоцит» в настоящем описании используются взаимозаменяемо и включают Т-хелперные клетки (CD4+ T-клетки) и цитотоксические T-клетки (CTL, CD8+ T-клетки), которые включают T-клетки цитолиза. Термин «антигенспецифическая Т-клетка» или подобные термины относятся к Т-клетке, которая узнает антиген, на который нацелена Т-клетка, в частности, когда презентуется на поверхности антигенпредставляющих клеток или больных клеток, таких как раковые клетки, в контексте молекул MHC, и предпочтительно проявляет эффекторные функции Т-клеток. T-Клетки считаются специфическими для антигена, если клетки убивают клетки-мишени, экспрессирующие антиген. Специфичность T-клеток можно оценить с использованием различных стандартных методов, например, анализа на высвобождение хрома или анализа пролиферации. С другой стороны, можно измерить синтез лимфокинов (таких как интерферон-γ). В некоторых воплощениях настоящего раскрытия РНК кодирует по меньшей мере один эпитоп.

В некоторых воплощениях эпитоп происходит из опухолевого антигена. Опухолевый антиген может представлять собой «стандартный» антиген, который, как вообще известно, экспрессируется при различных раковых заболеваниях. Опухолевый антиген также может представлять собой «неоантиген», который является специфическим для опухоли у индивидуума и ранее не узнавался иммунной системой. Неоантиген или неоэпитоп может привести к одной или нескольким канцерспецифическим мутациям в геноме раковых клеток, приводящим к замене аминокислот. Примеры опухолевых антигенов включают, без ограничения, p53, ART-4, BAGE, бета-катенин/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, белки клеточной поверхности семейства клаудина, такие как CLAUD ΓΝ-6, CLAUDIN-18.2 и CLAUDIN-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap 100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (или hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, предпочтительно MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A 10, MAGE-A 1 1 или MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/мелан-A, MC1R, миозин/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, pl90 минорный BCR-abL, Pml/RARa, PRAME, протеиназу 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 или RU2, SAGE, SART-1 или SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, сурвивин, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE, WT и WT-1.

Раковые мутации изменяются с каждым индивидуумом. Так, раковые мутации, которые кодируют новые эпитопы (неоэпитопы), представляют собой притягательные мишени при разработке композиций вакцин и иммунотерапий. Эффективность иммунотерапии опухолей имеет в основании отбор канцерспецифических антигенов и эпитопов, способных индуцировать сильный иммунный ответ у хозяина. Можно использовать РНК для доставки пациенту опухолевых эпитопов, специфических для пациента. Дендритные клетки (DC), находящиеся в селезенке, представляют собой антигенпредставляющие клетки, особенно интересные для экспрессии РНК иммуногенных эпитопов или антигенов, таких как опухолевые эпитопы. Показано, что применение нескольких эпитопов промотирует терапевтическую эффективность в композициях противоопухолевых вакцин. Быстрое секвенирование метанома опухоли может обеспечить множество эпитопов для индивидуализированных вакцин, которые могут быть кодированы РНК, описанной в настоящем описании, например, как отдельный пептид, причем эпитопы необязательно разделяются линкерами. В некоторых воплощениях настоящего раскрытия РНК кодирует по меньшей мере один эпитоп, по меньшей мере два эпитопа, по меньшей мере три эпитопа, по меньшей мере четыре эпитопа, по меньшей мере пять эпитопов, по меньшей мере шесть эпитопов, по меньшей мере семь эпитопов, по меньшей мере восемь эпитопов, по меньшей мере девять эпитопов или по меньшей мере десять эпитопов. Примеры воплощений включают РНК, которая кодирует по меньшей мере пять эпитопов (названную «пентатоп»), РНК, которая кодирует по меньшей мере десять эпитопов (названную «декатоп»), РНК, которая кодирует по меньшей мере двадцать эпитопов (названную «эйкозатоп»).

Композиции, включающие РНК-частицы

Термин «множество РНК-частиц» или «множество РНК-липидных частиц» относится к популяции некоторого числа частиц. В некоторых воплощениях термин относится к популяции больше чем 10, 10², 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³, 10¹⁴, 10¹⁵, 10¹⁶, 10¹⁷, 10¹⁸, 10¹⁹, 10²⁰, 10²¹, 10²² или 10²³ или больше частиц.

Для специалистов в данной области техники будет очевидно, что множество частиц может включать любую фракцию вышеуказанных интервалов или любого интервала в настоящем описании.

В воплощениях композиция по настоящему раскрытию является жидкой или твердой. Неограничивающие примеры твердой композиции включают замороженную форму, лиофилизованную форму или высушенную распылением форму. В предпочтительном воплощении композиция является жидкой.

Согласно настоящему раскрытию композиции, описанные в настоящем описании, могут включать соли, такие как органические или неорганические соли, включая, но без ограничения, хлорид натрия, хлорид калия, дикалийфосфат, монокалийфосфат, ацетат калия, бикарбонат калия, сульфат калия, динатрийфосфат, мононатрийфосфат, ацетат натрия, бикарбонат натрия, сульфат натрия, хлорид лития, хлорид магния, фосфат магния, хлорид кальция и натриевые соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК) и аминокислот.

Композиции, описанные в настоящем описании, также могут включать стабилизатор для того, чтобы избежать существенной потери качества продукта, и в частности, существенной потери активности РНК во время хранения, замораживания, лиофилизации и/или сушки распылением, например, для уменьшения или предотвращения агрегации, сплющивания частиц, разрушения РНК и/или других типов повреждения.

В одном воплощении стабилизатор представляет собой криопротектор или лиопротектор.

В одном воплощении стабилизатор представляет собой углевод. Термин «углевод», используемый в настоящем описании, относится к и охватывает моносахариды, дисахариды, трисахариды, олигосахариды и полисахариды.

В одном воплощении стабилизатор представляет собой аминокислоту или поверхностно-активное вещество (например, полоксамер).

Согласно настоящему раскрытию композиции РНК-частиц, описанные в настоящем описании, имеют рН, подходящий для устойчивости РНК-частиц, и, в частности, для устойчивости РНК. В одном воплощении композиции РНК-частиц, описанные в настоящем описании, имеют рН от примерно 4,0 до примерно 8,0 или примерно 5,0 – примерно 7,5. Без желания привязываться к какой-либо теории, применение буфера поддерживает pH композиции во время производства, хранения и применения композиции. В некоторых воплощениях настоящего раскрытия буфером может являться бикарбонат натрия, мононатрийфосфат, монокалийфосфат, дикалийфосфат, [трис(гидроксиметил)метиламино]пропансульфоновая кислота (TAPS), 2-(бис(2-гидроксиэтил)амино)уксусная кислота (бицин), 2-амино-2-(гидроксиметил)пропан-1,3-диол (трис), N-(2-гидрокси-1,1-бис(гидроксиметил)этил)глицин (трицин), 3-[[1,3-дигидрокси-2-(гидроксиметил)пропан-2-ил]амино]-2-гидроксипропан-1-сульфоновая кислота (TAPSO), 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновая кислота (HEPES), 2-[[1,3-дигидрокси-2-(гидроксиметил)пропан-2-ил]амино]этансульфоновая кислота (TES), 1,4-пиперазиндиэтансульфоновая кислота (PIPES), диметиларсиновая кислота, 2-морфолин-4-илэтансульфоновая кислота (MES), 3-морфолино-2-гидроксипропансульфоновая кислота (MOPSO) или забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS). Другими подходящими буферирующими системами могут являться одна уксусная кислота или с солью, одна лимонная кислота или с солью, одна борная кислота или с солью и одна фосфорная кислота или с солью, или аминокислоты и производные аминокислот.

Некоторые воплощения настоящего раскрытия предполагают применение хелатирующего агента в композиции, описанной в настоящем описании. Хелатирующие агенты относятся к химическим соединениям, которые способны образовывать по меньшей мере две координационные ковалентные связи с ионом металла, причем посредством этого генерируется устойчивый водорастворимый комплекс. Без желания привязываться к какой-либо теории, хелатирующие агенты снижают концентрацию свободных двухвалентных ионов, которые в ином случае могут вызывать ускоренное разрушение РНК по настоящему раскрытию. Примеры подходящих хелатирующих агентов включают, без ограничения, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТК), соль ЭДТК, дезферриоксамин В, дефероксамин, дитиокарбнатрия, пеницилламин, пентетат кальция, натриевую соль пентетиновой кислоты, сукцимер, триентин, нитрилотриуксусную кислоту, транс-диаминоциклогексантетрауксусную кислоту (DCTA), диэтилентриаминопентауксусную кислоту (DTPA), бис(аминоэтил)гликолевый эфир N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, иминодиуксусную кислоту, лимонную кислоту, винную кислоту, фумаровую кислоту или их соли. В некоторых воплощениях хелатирующим агентом является ЭДТК или соль ЭДТК. В примере воплощения хелатирующим агентом является дигидрат динатриевой соли ЭДТК.

В некоторых воплощениях ЭДТК находится в концентрации от примерно 0,05 мМ до примерно 5 мМ, от примерно 0,1 ММ до примерно 2,5 мМ или от примерно 0,25 мМ до примерно 1 мМ.

Фармацевтические композиции

Композиции, включающие РНК-частицы, описанные в настоящем описании, применимы в качестве или для получения фармацевтических композиций или лекарственных средств для лечения или профилактики.

В одном аспекте РНК-частицы, описанные в настоящем описании, присутствуют в фармацевтической композиции. В другом аспекте композиция, описанная в настоящем описании, представляет собой фармацевтическую композицию.

Частицы по настоящему раскрытию могут быть введены в форме любой подходящей фармацевтической композиции.

Термин «фармацевтическая композиция» относится к композиции, включающей терапевтически эффективный агент предпочтительно вместе с фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями и/или эксципиентами. Указанную фармацевтическую композицию применяют для лечения, предупреждения или уменьшения тяжести заболевания или расстройства путем введения субъекту указанной фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция также известна в технике как фармацевтический препарат. В контексте настоящего раскрытия фармацевтическая композиция включает РНК-частицы, описанные в настоящем описании.

Фармацевтические композиции по настоящему раскрытию могут включать один или несколько адъювантов, или могут вводиться с одним или несколькими адъювантами. Термин «адъювант» относится к соединению, которое пролонгирует, усиливает или ускоряет иммунный ответ. Адъюванты включают неоднородную группу смесей, таких как эмульсии (например, адъюванты Фрейнда), неорганических соединений (таких как квасцы), бактериальных продуктов (таких как коклюшный токсин) или иммуностимулирующие комплексы. Примеры адъювантов включают, без ограничения, LPS, GP96, олигодезоксинуклеотиды CpG, факторы роста и цитокины, такие как монокисны, лимфокины, интерлейкины, хемокины. Хемокины могут представлять собой IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, INFa, INF-γ, GM-CSF, LT-a. Другими известными адъювантами являются гидроксид алюминия, адъювант Фрейнда или масло, такое как монтанид® ISA51. Другие адъюванты, подходящие для применения в настоящем раскрытии, включают липопептиды, такие как Pam3Cys, а также липофильные компоненты, такие как сапонины, трегалоза-6,6-дибегенат (TDB), монофосфориллипид A (MPL), мономиколоилглицерин (MMG) или адъювант глюкопиранозиллипид (GLA).

Фармацевтические композиции согласно настоящему раскрытию обычно применяют в «фармацевтически приемлемом количестве» и в «фармацевтически приемлемом препарате». Термин «фармацевтически приемлемый» относится к отсутствию токсичности у материала, который не взаимодействует с действующим активным компонентом фармацевтической композиции.

Термин «фармацевтически эффективное количество» относится к количеству, при котором достигается желательная реакция или желательный эффект, одном или вместе с другими дозами. В случае лечения определенного заболевания желательная реакция предпочтительно относится к торможению хода заболевания. Это включает замедление прогресса заболевания и, в частности, прерыванию или реверсии прогресса заболевания. Желательной реакцией при лечении заболевания также может являться отсрочка начала или предупреждение начала указанного заболевания или указанного состояния. Эффективное количество частиц или композиций, описанных в настоящем описании, будет зависеть от состояния, от которого лечат, тяжести заболевания, индивидуальных параметров пациента, включая возраст, физиологическое состояние, величину и массу, длительность лечения, тип сопутствующей терапии (если присутствует), конкретного способа введения и подобных факторов. Соответственно дозы вводимых частиц или композиций, описанных в настоящем описании, могут зависеть от многих таких параметров. В случае, когда реакция у пациента недостаточная при начальной дозе, могут быть использованы более высокие дозы (или эффективно более высокие дозы, достигаемые другим более локализованным путем введения).

Фармацевтические композиции по настоящему раскрытию могут содержать соли, буферы, консерванты и, необязательно, другие терапевтические агенты. В одном воплощении фармацевтические композиции по настоящему раскрытию включают один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей и/или эксципиентов.

Подходящие консерванты для применения в фармацевтических композициях по настоящему раскрытию включают, без ограничения, хлорид бензалкония, хлорбутанол, парабен и тимеросал. Термин «эксципиент», используемый в настоящем описании, относится к веществу, которое может присутствовать в фармацевтической композиции по настоящему раскрытию, но не является активным ингредиентом. Примеры эксципиентов включают, без ограничения, носители, связующие вещества, разбавители, лубриканты, загустители, поверхностно-активные вещества, консерванты, стабилизаторы, эмульгаторы, буферы, отдушки или красители.

Термин «разбавитель» относится к разбавляющему и/или разжижающему агенту. Кроме того, термин «разбавитель» включает любую одну или несколько жидкостей, жидкую или твердую суспензию и/или смешанные среды. Примеры подходящих разбавителей включают этанол, глицерин и воду.

Термин «носитель» относится к компоненту, который может быть природным, синтетическим, органическим, неорганическим, с которым объединен активный компонент для того, чтобы облегчить, усилить или сделать возможным введение фармацевтической композиции. Носитель при использовании в настоящем изобретении может представлять собой один или несколько совместимых жидких или твердых наполнителей, разбавителей или инкапсулирующих веществ, которые подходят для введения субъекту. Подходящий носитель включает, без ограничения, стерильную воду, раствор Рингера, Рингера-лактат, стерильный раствор хлорида натрия, изотонический солевой раствор, полиалкиленгликоли, гидрированные нафталины и, в частности, биосовместимые полилактиды, сополимеры лактида и гликолида или сополимеры полиоксиэтилен/полиоксипропилен. В одном воплощении фармацевтическая композиция по настоящему раскрытию включает изотонический солевой раствор.

Фармацевтически приемлемые носители, эксципиенты или разбавители для терапевтического применения хорошо известны в области фармацеи и описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985).

Фармацевтические носители, эксципиенты или разбавители можно выбирать с учетом предполагаемого пути введения и обычной фармацевтической практики.

Пути введения фармацевтических композиций

В одном воплощении фармацевтические композиции, описанные в настоящем описании, можно вводить внутривенно, внутриартериально, подкожно, интрадермально, дермально, внутримышечно или интратуморально. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция составлена для локального введения или системного введения. Системное введение может включать энтеральное введение, которое включает всасывание через желудочно-кишечный тракт, или парентеральное введение. При использовании в настоящем описании «парентеральное введение» относится к введению любым способом, иным чем через желудочно-кишечный тракт, таким как внутривенная инъекция. В предпочтительном воплощении фармацевтические композиции составлены для системного введения. В другом предпочтительном воплощении системное введение осуществляется путем внутривенной инъекции.

Применение фармацевтических композиций

РНК-частицы, описанные в настоящем описании, можно использовать при терапевтическом или профилактическом лечении различных заболеваний, в частности, заболеваний, при которых предоставление субъекту пептида или белка приводит к терапевтическому или профилактическому эффекту. Например, предоставление антигена или эпитопа, который получен из вируса, может быть полезным при лечении вирусного заболевания, вызванного указанным вирусом. Предоставление опухолевого антигена или эпитопа может быть полезным при лечении ракового заболевания, причем раковые клетки экспрессируют указанный опухолевый антиген. Предоставление функционального белка или фермента может быть полезным при лечении генетического нарушения, характеризующегося дисфункциональным белком, например, при лизосомных болезнях накопления (например, мукополисахаридозах) или дефицитах факторов. Предоставление цитокина или слитого цитокина может быть полезным для модуляции микроокружения опухоли.

Термин «заболевание» (также упоминается в настоящем описании как «расстройство») относится к анормальному состоянию, которое поражает организм индивидуума. Заболевание часто интерпретируют как медицинское состояние, ассоциированное со специфическими симптомами и признаками. Заболевание может быть вызвано факторами, исходящими из внешнего источника, такого как инфекционное заболевание, или оно может быть вызвано внутренней дисфункцией, такой как аутоиммунное заболевание. У людей термин «заболевание» часто используется более широко для обозначения любого состояния, которое вызывает боль, дисфункцию, дистресс, социальные проблемы или смерть человека, страдающего этим заболеванием, или схожие проблемы у тех, кто контактирует с этим человеком. В более широком смысле он иногда включает травмы, инвалидность, расстройства, нарушения, синдромы, инфекции, изолированные симптомы, девиантное поведение и атипичные изменения структуры и функции, хотя в других контекстах и для других целей их можно рассматривать как различимые категории. Заболевания обычно влияют на людей не только физически, но эмоционально, так как приобретение и жизнь со многими заболеваниями могут изменить взгляд на жизнь и на личность.

В контексте настоящего изобретения термин «лечение» или «терапевтическое вмешательство» относится к плану лечения и ухода за субъектом с целью борьбы с состоянием, таким как заболевание или расстройство. Термин предназначен для включения полного спектра методов лечения данного состояния, от которого страдает субъект, таких как введение терапевтически эффективного соединения для облегчения симптомов или осложнений, для задержания прогрессирования заболевания, расстройства или состояния, для облегчения или устранения заболевания, расстройства или состояния, а также для предупреждения состояния, причем предупреждение следует понимать как план лечения и уход за субъектом с целью борьбы с заболеванием, расстройством или состоянием и включает введение активных соединений для предотвращения появления симптомов или осложнений.

Термин «терапевтическое лечение» относится к любому лечению, которое улучшает состояние здоровья и продлевает (повышает) продолжительность жизни индивидуума. Указанное лечение может устранить заболевание у индивидуума, остановить или замедлить развитие заболевания у индивидуума, ингибировать или замедлить развитие заболевания у индивидуума, снизить частоту или тяжесть симптомов у индивидуума и/или уменьшить рецидивы у индивидуума, который болеет в настоящее время или который имел заболевание ранее.

Термины «профилактическое лечение» или «превентивное лечение» относятся к любому лечению, которое предназначено для предупреждения появления заболевания у индивидуума. Термины «профилактическое лечение» или «превентивное лечение» в настоящем описании используются как взаимозаменяемые.

Термины «индивидуум» и «субъект» используются в настоящем описании как взаимозаменяемые. Они относятся к человеку или другому млекопитающему (например, мыши, крысе, кролику, собаке, кошке, крупному рогатому скоту, свинье, овце, лошади или примату) или любому другому животному не-млекопитающему, включая птиц (кур), рыб или любой другой вид животных, который может быть поражен или восприимчив к заболеванию или расстройству (например, раку, инфекционным заболеваниям), но может иметь заболевание или расстройство или не иметь, и может нуждаться в профилактическом вмешательстве, таком как вакцинация, или может нуждаться во вмешательствах, таких как замещение белка. Во многих воплощениях индивидуумом является человек. Если не указано иное, термины «индивидуум» и «субъект» не обозначают определенный возраст и таким образом охватывают взрослых, пожилых, детей и новорожденных. В воплощениях настоящего раскрытия «индивидуумом» или «субъектом» является «пациент».

Термин «пациент» обозначает индивидуума или субъекта для лечения, в частности, заболевшего индивидуума или субъекта.

В одном воплощении раскрытия целью является предоставление защиты от инфекционного заболевания путем вакцинации.

В одном воплощении раскрытия целью является предоставление субъекту, в частности, субъекту, нуждающемуся в этом, секретированных терапевтических белков, таких как антитела, биспецифические антитела, цитокины, цитокины, слитые с белками, ферменты.

В одном воплощении раскрытия целью является предоставление субъекту, в частности, субъекту, нуждающемуся в этом, белковой заместительной терапии, такой как продуцирование эритропоэтина, фактора VII, фактора фон Виллебранда, β-галактозидазы, альфа-N-ацетилглюкозаминидазы.

В одном воплощении раскрытия целью является модуляция/перепрограммирование иммунных клеток в крови.

Специалисту в данной области техники будет известно, что один из принципов иммунотерапии и вакцинации основан на факте, что иммунозащитная реакция на заболевание вырабатывается путем иммунизации субъекта антигеном или эпитопом, который иммунологически релевантен в отношении заболевания, от которого лечат. Соответственно, фармацевтические композиции, описанные в настоящем описании, применимы для вызывания или усиления иммунного ответа. Фармацевтические композиции, описанные в настоящем описании, применимы поэтому при профилактическом и/или терапевтическом лечении заболевания с участием антигена или эпитопа.

Термин «иммунизация» или «вакцинация» описывает процесс введения антигена индивидууму с целью вызывания иммунного ответа, например, по терапевтическим или профилактическим причинам.

Цитирование документов и исследований, упомянутых в настоящем документе, не предполагает, что любое из вышеизложенного относится к известному уровню техники. Все заявления относительно содержания этих документов основаны на информации, доступной Заявителям, и не являются каким-либо признанием правильности содержания этих документов.

Последующее описание представлено для возможности специалисту в данной области техники осуществить и применить различные воплощения. Описания конкретных устройств, методов и применений предоставляются только как примеры. Различные модификации примеров, описанных в настоящем описании, будут вполне очевидны для специалистов в данной области техники, и общие принципы, определенные в настоящем описании, могут быть применены к другим примерам и применениям без отклонения от сущности и объема различных воплощений. Таким образом, не предполагается, что различные воплощения ограничиваются примерами, описанными в настоящем описании и показанными, но должны быть представлены в объеме, соответствующем формуле изобретения.

Примеры

Пример 1. Материалы и методы

Материалы

Кодирующую люциферазу или секретированную люциферазу NanoLuc® (secNLuc) мРНК получают с установки RNA Biochemistry (BioNTech RNA Pharmaceuticals, Mainz, Германия) (концентрация мРНК от 2 до 5 мг/мл в воде или 10 мM Hepes; 0,1 мM ЭДТК; pH 7,0).

Ионизируемый по катионному типу липид DODMA (1,2-диолеилокси-N,N-диметил-3-аминопропан) и липид-хелпер DOPE (1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин) закупают у Merck. Липид-хелпер DSPC (1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин) получают у Avanti Polar Lipids. Холестерин от Sigma Aldrich. Додецилсульфат натрия (SDS) получают у Sigma Adlrich.

Перед получением (липидных наночастиц) липиды растворяют в абсолютном этаноле (Carl Roth) до концентрации от 5 до 100 мМ, и этанольные растворы липида хранят при -20°C.

Перед получением (липидных наночастиц) этанольный раствор липидов, стерильный цитратный буфер 100 мМ, рН 5,4, и РНК уравновешивают при комнатной температуре.

Протокол 1 для получения липидных наночастиц

Липидные наночастицы получают, смешивая этанольную фазу, содержащую липиды, с водной фазой, содержащей РНК, с использованием микрофлюидного смешивающего устройства NanoAssemblr™ Benchtop Instrument (Precision NanoSystems, Vancouver, BC). Один объем этанолсодержащей смеси липидов с 9 мМ всех липидов и 3 объема РНК, 0,15 мг/мл в цитратном буфере 100 мM, pH 5,4, смешивают с помощью микрофлюидного картриджа при скорости объединенного потока 12 мл/мин. Полученную смесь смешивают непосредственно с 2 объемами цитратного буфера 100 мM, pH 5,4. Если не указано иное, частицы диализуют против забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) в течение 2,5 час в кассете для диализа 10K MWCO (Slide-A-Lyser, ThermoFisher Scientific). Затем частицы снова концентрируют путем ультрафильтрации с использованием ультрацентрифужных фильтров Amicon® (30 кДа NMWL, Merck Millipore) до теоретической концентрации РНК примерно 0,2-0,5 мг/мл. Физико-химические свойства (размер, полидисперсность, дзета-потенциал, доступность РНК и общую концентрацию РНК) проверяют в день получения. После полной характеризации препараты хранят при 4°C, но не дольше 2 дней. Липидные частицы перед испытанием in vitro или инъекцией in vivo растворяют в PBS до нужной концентрации РНК.

Протокол 2 для получения липидных наночастиц

Липидные наночастицы получают, смешивая водную фазу, содержащую липиды, с водной фазой, содержащей РНК. Получают pSarc-липосомы путем впрыскивания 600 мкл этанола на 75 мМ всех липидов, содержащих катионный липид, липиды-хелперы с pSarc или без него в различных молярных фракциях, в общий объем 14,4 мл воды при перемешивании в течение 30 мин. Затем липосомы добавляют к РНК в воде при N/P 4 с последующим быстрым образованием при встряхивании и перемешивании pSarc-LPX с конечной концентрацией РНК 0,05 мг/мл. Физико-химические свойства (размер, полидисперсность, доступность РНК и общую концентрацию РНК) проверяют в день получения. После полной характеризации препараты хранят при 4°C, но не дольше 2 дней. Липидные наночастицы перед испытанием in vitro растворяют в воде до нужной концентрации РНК.

Измерение размера частиц

Размер частиц и полидисперсность (PDI) липидных наночастиц измеряют методом динамического светорассеяния. Препараты разбавляют PBS до конечной концентрации РНК 0,005 мг/мл. Измерения проводят на 120 мкл разбавленного образца при трехкратном повторе в 96-луночном планшете. Размер измеряют прибором планшет-ридером II DynaPro, технология WYATT, GmbH (Dernbach, Германия).

Измерение дзета-потенциала (электрофоретической подвижности)

РНК-липидные наночастицы разбавляют до концентрации РНК 0,01 мг/мл в 1 мл PBS 0,1х. Получают по три образца по 1,05 мл для каждого препарата в пластиковых кюветах. Электрофоретическую подвижность частиц измеряют методом лазерного доплеровского электрофореза прибором ζ-Wallis (Corduan technologies, Франция). Для каждого образца используют измерение среднего разрешения с 1 последовательностью 10 циклов. Измерение с низкими отношениями сигнала к шуму или с предельной подвижностью µ (>3 или <-3 мкм*см/V*S) исключают из итогового анализа.

Анализ с RiboGreen на доступность RNA и общую концентрацию RNA

РНК-липидные наночастицы всегда концентрируют до конечной концентрации примерно 0,2-0,5 мг/мл РНК. Используют анализ с Quant-iT RiboGreen RNA (Thermo Fischer Scientific) для количественной оценки доступности РНК, а также общей концентрации РНК в препарате. Коротко, определяют эффективность инкапсулирования с использованием РНК-связывающего красителя RiboGreen путем сравнения флуоресценции образцов в присутствии и в отсутствие 2% тритона X-100. В отсутствие детергента флуоресценцию можно измерить только от доступной свободной РНК, в то время как в присутствии детергента флуоресценцию измеряют от общего количества РНК. Флуоресценцию образцов в присутствии детергента тритона X-100 также используют для вычисления общей концентрации РНК на основе калибровочной кривой.

Жидкие образцы наночастиц или PBS (отрицательный контроль) разбавляют 1х буфером ТЕ (Thermo Fisher Scientist) до концентрации мРНК от 2 до 5 мкг/мл.

Аликвоты каждого разбавленного образца разбавляют дополнительно 1:1 1х буфером ТЕ (измерение доступной мРНК) или 1:1 1× буфером ТЕ, содержащим 2% тритона X-100 (измерение общей мРНК, как доступной в частице, так и свободной мРНК). Образцы получают в двух повторностях. Образцы инкубируют 10 мин при 37°С для уверенности в достаточной диссоциации липидов. Затем к каждому образцу добавляют 1,1 реагента Quant-iT RiboGreen RNA (разведения 1:100 из исходного раствора в буфере TE), и измеряют флуоресценцию красителя при длине волны возбуждения 485 нм и испускания 535 нм (многомодовый спектрофотометр для прочтения планшетов Tecan Infinite M200 Pro Multimode Plate Reader).

Доступность РНК определяют по следующей формуле:

Общую концентрацию РНК определяют с использованием калибровочной кривой РНК в 1х буфере ТЕ с 2% тритона Х-100.

Электрофорез в агарозном геле

Электрофорез в агарозном геле выполняют для оценки свободной РНК. Гель отливают, используя 1 г агарозы, растворенной в 100 мл 1× буфера ТАЕ (трис-ацетат-ЭДТК) (ThermoFisher), 1 мл 5% гипохлорита натрия и 10 мкл GelRed Nucleic Acid Gel Stain (Biotium). Гелю дают возможность застывать в течение по меньшей мере 25 мин при комнатной температуре. Затем гель помещают в камеру для электрофореза, и используют рабочий буфер TAE 1× (ThermoFisher). Перед загрузкой образцы инкубируют при 40°C с 2% тритона X-100 или без него для общей или свободной РНК, соответственно. Гель работает при 80 В в течение 40 минут. Электрофореграммы получают на системе визуализации Chemidoc XRS (Bio-Rad).

Анализ трансфекции in vitro и анализ жизнеспособности клеток

Клетки высевают в бесцветный 96-луночный планшет (плоскодонные лунки) в концентрации 5000 клеток на лунку для клеток С2С12 и 20000 клеток на лунку для клеток HepG2 и TC1. Клетки выдерживают при 37°C и 5% CO2, но C2C12 при 7,5% CO2. Через 18-24 час супернатант отбрасывают и заменяют 90 мкл соответствующих сред с добавлением 10% неинактивировнного FCS. Препараты разбавляют PBS до конечной концентрации 1-10 мкг/мл. Затем к клеткам добавляют 10 мкл раствора липидных частиц, и получают конечный объем среды 100 мкл. Итоговое количество РНК в лунках колеблется от 33 до 100 нг. Планшеты центрифугируют 5 мин при 500g при комнатной температуре. После 24-час инкубации с клетками выполняют анализ на люциферазу Bright-Glo™ (кат. #E260, Promega GmbH, Mannheim, Германия) согласно инструкциям. Сигналы биолюминесценции (RLU) измеряют с использованием многомодового спектрофотометра для прочтения планшетов Tecan Infinite M200 Pro Multimode Plate Reader, и экспрессию люциферазы вычисляют, вычитая фон нетрансфицированных клеток (используя PBS в качестве контроля).

Для измерения жизнеспособности клеток следуют такой же процедуре. После 24-час инкубации препарата с клетками выполняют анализ с CellTiter-Glo™ (кат. G9242, Promega GmbH, Mannheim, Германия) согласно инструкциям. Включают контроль с PBS для 100% жизнеспособности и ДМСО для токсичности. Жизнеспособность вычисляют следующим образом:

Трансфекция in vivo у мышей

Мышам дают наркоз изофлураном, и в ретроорбитальный синус инъецируют внутривенно 200 мкл исследуемых препаратов с 0,05 мг/мл кодирующей люциферазу мРНК с помощью инсулинового шприца, предварительно снабженного канюлей размером 30G. Мышь наблюдают на признаки боли, страдания и дистресса до тех пор, пока она приходит в сознание.

На момент измерения (6 час и 24 часа после дозы) мышей инъецируют интраперитонеально раствором D-люциферина по 100 мкг/кг массы тела. Затем мышам дают наркоз изофлураном и помещают на теплый мат (37°С) в камеру для визуализации IVIS® Spectrum (Perkin Elmer) с постоянной подачей изофлурана/кислорода через индивидуальные анестезирующие маски. Через пять минут после инъекции люциферина с помощью камеры выполняют детекцию свечения биолюминесценции. Затем мышей умерщвляют смещением позвонков, органы, подобные печени, легкому, селезенке, сердцу, почкам, головному мозгу, лимфатическим узлам, собирают и снова измеряют ex-vivo с помощью устройства для визуализации IVIS® Spectrum. Полученные изображения анализируют с использованием программы «LivingImage» (Perkin Elmer). Очерчивают интересующие области (ROI) вокруг органов для количественного определения общего потока [p/s]. Из отобранной крови получают сыворотку центрифугированием цельной крови при 1000×g в течение 3 мин. Определяют уровни ферментов печени аланинаминотрансферазы (ALT), аспартатаминотрансферазы (AST) и LDH с помощью высокопроизводительного анализатора для клинических и химических анализов Indiko, Thermo.

Для экспериментов с ЕРО мышам Balb/c (n=5) вводят внутривенно дозу мРНК от 30 до 3 мкг. Берут цельную кровь через 3, 6, 24 и 48 час, и получают плазму центрифугированием при 13000× об/мин в течение 3 мин. Секрецию EPO определяют с использованием набора DuoSet Mouse Erythropoietin ELISA (системы R&D).

Малоугловое рентгеновское рассеяние

Эксперименты с малоугловым рентгеновским рассеянием (SAXS) проводят на немецком синхротроне EMBL (DESY) Гамбург [P12]. Расстояние от образца до детектора можно регулировать от 1,6 до 6 м для возможности измерений от q = 0,6 Å-1 до q = 3 Å-1. Концентрированные суспензии LNP загружают на место в кварцевые капилляры с использованием шприца.

Активация комплемента

Уровни С3а in vitro определяют с использованием набора Human C3a EIA (Quidel). Коротко, LNP и контроли (положительный (кремофор El) и отрицательный (1x PBS и ЭДТК (18 мМ)) инкубируют с комплементом в сыворотке здорового человека (NHS, Quidel) в соотношении 20:80 (образец: NHS) в течение 1 часа при 37°C. LNP испытывают при 5×, 1× и 0,02× относительно теоретической концентрации в плазме от дозы мРНК 1 мг/кг. EIA с набором C3a EIA выполняют согласно протоколу изготовителей.

Cryo-ТЕМ

Образцы хранят в аморфном льду, поддерживаемыми дырявыми углеродными пленками на медных сетках 200 меш (QuantiFoil® R2/1). Стеклование выполняют в жидком этане при -180°C с помощью Leica EM GP. Сетки хранят в жидком азоте до переноса на электронный микроскоп для получения изображений. Криогенное получение изображений TEM выполняют с помощью Zeiss Libra® 120 в условиях крио в жидком N2 на медных сетках с нанесенным с дырками углеродом. Микроскоп используют при ускоряющем напряжении 120 кВ, и изображения получают с помощью ccd-камеры Gatan UltraScan®. Изображения каждой сетки получают в нескольких масштабах для оценки общего распределения образца.

Пример 2. Получение РНК-липидных наночастиц, включающих pSarc

Получают мРНК-липидные наночастицы с использованием полипептоида на основе аминокислот - липида : липидов, конъюгированных с полисаркозином.

Получают LNP, смешивая этанольную фазу, содержащую липиды DODMA, холестерин, DSPC и C14pSarc20 в молярном соотношении 40:50-X:10:X, и 3 объема РНК, 0,15 мг/мл, в цитратом буфере 100 мМ, pH 5,4.

Таблица 1. Физико-химические свойства РНК-липидных наночастиц, полученных с различной молярной фракцией (%) С14pSarc20

Композиция	Соотношение	N/P	Z-Av (нм)	PdI	Доступность РНК (%)
DODMA:Chol:DSPC:C14PSARC20	40:49,5:10:0,5	2,7	--	--	51,2
DODMA:Chol:DSPC:C14PSARC20	40:49:10:1	2,7	--	--	72,5
DODMA:Chol:DSPC:C14PSARC20	40:48,5:10:2,5	2,7	222,8	0,159	74,2
DODMA:Chol:DSPC:C14PSARC20	40:45:10:5	2,7	117,8	0,177	52,3
DODMA:Chol:DSPC:C14PSARC20	40:42,5:10:7,5	2,7	129,4	0,195	75,9
DODMA:Chol:DSPC:C14PSARC20	40:40:10:10	2,7	81	0,193	68,3
DODMA:Chol:DSPC:C14PSARC20	40:35:10:15	2,7	63,1	0,173	62,0
DODMA:Chol:DSPC:C14PSARC20	40:30:10:20	2,7	57,3	0,238	72,2

Фиг. 1 показывает соотношение между размером частиц и молярной фракцией конъюгированных с полисаркозином LNP. Липидные наночастицы получают с использованием смеси липидов, включающей возрастающие молярные фракции C14PSarc20. В подходящих условиях можно получить устойчивые коллоидные частицы. Хотя с очень маленькими фракциями PSarc (0,5 и 1 %) частицы размером, поддающимся измерению, не образуются, при 2,5 мол.% и больше получают частицы обособленного размера и низким индексом полидисперсности. Размер частиц можно точно регулировать путем изменения фракции PSarc. Размер частиц монотонно снижается от примерно 200-250 нм с 2,5 мол.% PSarc до примерно 50 нм с 20 мол.% PSarc.

Пример 3. Частицы с рSarc-липидами с полимеризованным саркозином с различным числом звеньев

Получают LNP, смешивая один объем этанольной фазы, содержащей липиды DODMA, холестерин, DSPC и C14pSarcX с полимером различной длины (X = 11, 20, 34 или 65) при молярном отношении 40:45:10:5, и 3 объема РНК, 0,15 мг/мл, в цитратном буфере 100 мМ, pH 5,4.

Таблица 2. Физико-химические свойства РНК-липидных наночастиц, полученных с молярной фракцией C14pSarcX 5% с полимерами различной длины

Композиция	Отноше-ние	N/P	Z-Av (нм)	PdI	Дзета-потенциал	Доступ-ность РНК, %	Своб РНК (%)
DODMA:Chol:DSPC:C14PSARC11	40:45:10:5	2,7	106,8	0,317	2,09 ± 1,43	72,5	1,6
DODMA:Chol:DSPC:C14PSARC20	40:45:10:5	2,7	107,5	0,174	2,6 ± 0,7	75,9	5,1
DODMA:Chol:DSPC:C14PSARC34	40:45:10:5	2,7	83,4	0,202	2,04 ± 1,82	72,2	16,8
DODMA:Chol:DSPC:C14PSARC65	40:45:10:5	2,7	114,7	0,237	1,15 ± 2,43	69,1	16,0

Фиг. 2 показывает соотношение между длиной полисаркозина (звенья полимера) pSarc-липидов, используемых для образования LNP, и экспрессией in vitro белков LNP кодирующей люциферазу мРНК в различных клеточных линиях. LNP в композиции с мРНК, кодирующей люциферазу, испытывают в клетках опухоли легкого (ТС-1), мышечных клетках (C2C12), гепатоцитах (Hep-G2) и макрофагах (RAW 264.7). Через 24 часа после трансфекции измеряют сигнал биолюминесценции. Независимо от клеточной линии, увеличение числа звеньев в полисаркозине не ведет к снижению уровней экспрессии белков, какие обычно наблюдают для ПЭГ-липидов.

Фиг. 3 показывает эффективность in vivo LNP, включающих постоянную фракцию РSarc-липида (5%), где длина полисаркозина изменяется от 11 до 65 звеньев. LNP в композиции с мРНК, кодирующей люциферазу, инъецируют внутривенно мышам (10 мкг РНК, n=3). Измеряют биолюминесценцию in vivo и ex vivo. Во всех случаях самые сильные сигналы обнаруживают в печени. На фигуре приводятся данные измерений ex vivo в печенях, которые экстрагировали через 6 часов после инъекции. Не удалось определить значимое влияние длины полисаркозина на уровень экспрессии белков в печени. Это допускает инженерию частиц с использованием РSarc с широким диапазоном размеров без снижения эффективности трансфекции.

Пример 4. Влияние концевой группы полисаркозин-липида

Получают LNP, смешивая один объем этанольной фазы, содержащей липиды DODMA, холестерин, DSPC и C14pSarc20 с различными концевыми группами (NH₂, COOH и C₂H₃O) при молярном отношении 40:50-x:10:x, и 3 объема РНК, 0,15 мг/мл, в цитратном буфере 100 мМ, pH 5,4.

Таблица 3. Физико-химические свойства РНК-липидных наночастиц, полученных с различными молярными фракциями (%) C14pSarc20 с 3 различными концевыми группами

Композиция	Молярное отношение	N/P	Размер [d.нм]	PdI	ζ [мВ]	σ	Дос-туп- ность (%)	Σ	Своб. РНК
DODMA:Chol:DSPC:C14PSARC20-NH2	40:47,5:10: 2,5	2,7	187	0,325	10	1,04	64,9	3,1	63,7
DODMA:Chol:DSPC:C14PSARC20-NH2	40:45:10:5	2,7	110	0,175	4,5	1	61,7	2,0	0,0
DODMA:Chol:DSPC:C14PSARC20-NH2	40:40:10:10	2,7	95,6	0,201	1,4	1,13	72,8	0,2	14,5
DODMA:Chol:DSPC:C14PSARC20-COOH	40:47,5:10: 2,5	2,7	193	0,131	6,9	1,73	56,6	1,6	0,0
DODMA:Chol:DSPC:C14PSARC20-COOH	40:45:10:5	2,7	97,1	0,162	0,7	1,21	17,4	0,3	0,0
DODMA:Chol:DSPC:C14PSARC20-COOH	40:40:10:10	2,7	69,7	0,199	-2,2	1	12,9	0,8	0,0
DODMA:Chol:DSPC:C14PSARC20-C2H3O	40:47,5:10: 2,5	2,7	240	0,141	2,2	0,76	57,1	0,4	0,0
DODMA:Chol:DSPC:C14PSARC20-C2H3O	40:45:10:5	2,7	139	0,17	5,2	0,73	57,4	1,9	13,5
DODMA:Chol:DSPC:C14PSARC20-C2H3O	40:40:10:10	2,7	69,3	0,226	1,1	1,65	49,3	1,6	0,0

Фиг. 4 показывает влияние различных концевых групп полисаркозина на размер частиц и дзета-потенциал. РSarc, состоящий из 20 повторяющихся звеньев с аминогруппой, карбоксильной группой или ацетильной концевой группой, проверяют при прямом сравнении. Все другие параметры препаратов поддерживаются постоянными. Препарат LNP с испытываемыми концевыми группами является удачным, когда корреляция между фракцией РSarc и свойствами частиц (размер и дзета-потенциал) является схожей.

Фиг. 5 показывает определение in vitro свойств LNP, включающих полисаркозин-липиды с различными концевыми группами, описанных на фиг. 4. Используют рSarc-липиды с молярной фракцией 5% и длиной в 20 звеньев. LNP в композиции с мРНК, кодирующей люциферазу, испытывают в гепатоцитах (Hep-G2), макрофагах (RAW 264.7), мышечных клетках (C2C12), клетках эмбриональной почки (HEK 293 T). Измеряют сигнал биолюминесценции через 24 часа после трансфекции. Получают сигнал биолюминесценции для всех LNP и клеточных линий. Зависимость силы сигнала как функции клеточной линии схожа для всех концевых групп.

Фиг. 6 показывает эффективность in vivo LNP в композициях с различными концевыми группами, описанными на фиг. 5 и 6. Используют рSarc-липиды с молярной фракцией 5% и длиной в 20 звеньев. LNP в композиции с мРНК, кодирующей люциферазу, инъецируют внутривенно (10 мкг РНК, n=3). Измеряют биолюминесценцию in vivo и ex vivo. Во всех случаях самый сильный сигнал обнаруживают в печени. На фигуре приводятся данные измерений ex vivo в печенях, которые экстрагировали через 6 часов после инъекции. Со всеми концевыми группами определяют схожие по силе сигналы, что указывает, что все концевые группы подходят для получения схожей высокой трансфекции in vivo.

Пример 5. Получение РSarc-РНК-липидных наночастиц с различными катионными липидами

Результаты последующих экспериментов показывают универсальность полисаркозина для образования РНК-липидных наночастиц с различными типами катионных частиц.

Таблица 4. Физико-химические свойства пегилированных или конъюгированных с полисаркозином РНК-липидных наночастиц, полученных с различными катионными частицами, а также с нестандартными отношениями DOPE

Композиция	Молярн. отнош	N/P	Размер [d.нм]	PdI	ζ [мВ]	σ	Дос-туп-ность (%)	σ	Своб. РНК
KC2:DOPE:CHOL:PEG	40:20:38:2	4	107,2	0,14	-1,17	1,97	48,4	2	8,4
KC2:DOPE:CHOL:C14 pSarcC 20	40:20:35:5	4	0	0	1,89	2,17	4,1	0,2	0
C12-200:DOPE:Chol:PEG	40:40:18:2	16	81,55	0,128	-0,44	2,05	18,8	0,3	0
C12-200:DOPE:хол.: C14 pSarcC 20	40:40:15:5	16	155,75	0,234	6,04	1,36	3,4	0,2	0

Пример 6. рSarc-липосомы и РНК-липоплексы

Результаты следующих экспериментов показывают, что включение полисаркозин-конъюгированных липидов подходит для образования липосом и скрытных РНК-липоплексов. В соответствующих условиях образуются мелкие частицы с высокой эффективностью трансфекции.

рSarc-липосомы получают впрыскиванием 600 мкл этанольного раствора липидов при 75 мМ всех липидов, содержащих катионные, хелперные липиды и рSarc или ПЭГ, в общий объем 14,4 мл воды при перемешивании в течение 30 мин. Липосомы добавляют к РНК в воде при N/P 4 с последующим быстрым образованием при встряхивании и перемешивании рSarc-LPX.

Фиг. 7 показывает влияние пегилирования и конъюгирования с полисаркозином на размер липосом. Получают липосомы или с одними DOTMA и DOPE (2:1, моль/mмоль), или используют смеси липидов, которые включают ПЭГ- или pSarс-липид в молярной фракции 2%. Как ПЭГ, так и pSarc приводит к существенному снижению измеренного размера, однако в то же время индекс полидисперсности более высокий (мультимодальный).

Фиг. 8 показывает образование липоплексов с использованием липосом, которые включают ПЭГ и pSarс, описанных на фиг. 7. Из всех трех типов липосом (одни DOTMA и DOPE (2:1, моль/моль) или включающих ПЭГ- или pSarс-липид в молярной фракции 2%) образуются липоплексы ограниченного размера и с низким индексом полидисперсности. Липоплексы из пегилированных и конъюгировнных с полисаркозином липосом показывают неожиданно низкий индекс полидисперсности по сравнению с липосомами-предшественниками, где величины PDI были большими. Это показывает, что pSarc-липосомы с высоким индексом полидисперсности также могут подходить для образования четко определенных РНК-липоплексов размерами меньше 50 нм и PDI примерно 0,2.

Фиг. 9 описывает определение in vitro свойств липоплексов, полученных из липосом, состоящих или одних DOTMA и DOPE (2:1, моль/моль) или смесей тех же липидов, включающих ПЭГ- или pSarc-липид в молярной фракции 2%. Липоплексы в композиции с мРНК, кодирующей люциферазу, испытывают в гепатоцитах (Hep-G2). Через 24 часа после трансфекции измеряют сигнал биолюминесценции. Хотя пегилирование значимо уменьшает сигнал, это уменьшение значительно меньше выраженного в случае присутствия PSarc. Оказывается, что PSarc уменьшает эффективность трансфекции в значительно меньшей степени, чем ПЭГ.

Фиг. 10 описывает определение in vitro свойств липоплексов, полученных из липосом, состоящих или одних DOTMA и DOPE (2:1, моль/моль) или смесей тех же липидов, включающих ПЭГ- или pSarc-липид в молярной фракции 2%. Липоплексы в композиции с мРНК, кодирующей люциферазу, испытывают в мышечных клетках (С2С12). Через 24 часа после трансфекции измеряют сигнал биолюминесценции. Хотя пегилирование значимо уменьшает сигнал, это уменьшение значительно меньше выраженного в случае присутствия PSarc. Оказывается, что PSarc уменьшает эффективность трансфекции в значительно меньшей степени, чем ПЭГ.

Пример 7. Дополнительное испытание рSarc-частиц

Фиг. 11 показывает соотношением между размером частиц и длиной цепи полисаркозина и молярным отношением в препарате. В то время, как при короткой цепи полисаркозина образование частиц возможно только при более высоком молярном отношении, при длинной цепи полисаркозина образование частиц возможно при молярных отношениях 1%. Вообще размер частиц снижается с возрастанием длины цепи или молярного отношения полисаркозина, присутствующего в препарате.

Фиг. 12 поясняет кривые рассеяния (SAXS) препаратов липидных наночастиц с полисаркозином. LNP включают в композиции с полисаркозином с изменяющейся длиной цепи (11-34 звена) и в различных молярных отношениях (2,5-10%). Кривые рассеяния LNP показывают, что LNP характеризуются низкой внутренней организацией, которая уменьшается с возрастанием длины цепи или молярного отношения pSar. Наличие двух пиков показывает, что значительные вклады вносятся фактором формы отдельных липидных бислоев.

Фиг. 13 показывает доступность РНК, оцененную анализом Quant-It Ribogreen. PSarc-LNP показывают высокую доступность РНК независимо от длины цепи и молярного отношения полисаркозина.

Фиг. 14 представляет результаты внутривенного введения различных доз мРНК, кодирующей ЕРО (эритропоэтин), загруженной в LNP в композиции с липидами, конъюгированными или с PSarc или с ПЭГ. Извлекают плазму через 3, 6, 24 и 48 час, и методом ELISA количественно определяют ЕРО. Результаты показывают, что полисаркозин может непосредственно заменить другие скрытые частицы, подобные ПЭГ-конъюгированным липидам, на ставя под угрозу эффективность. PSarc даже может промотировать длительную секрецию белка, что будет преимуществом для заместительной терапии с применением белков.

Фиг. 15 показывает высвобождение ферментов печени как раннего маркера токсичности для печени. Ферменты печени, такие как аланинаминотрансфераза (ALT), аспартатаминотрансфераза (AST) и LDH, определяют в сыворотке через 6 и 24 часа после инъекции LNP в композиции с PSarc с возрастающей длиной цепи. Результаты показывают, что возрастание длины цепи PSarc не запускает какое-либо высвобождение ферментов печени (горизонтальные линии показывают интервал величин, полученных для здоровой мыши), демонстрируя, что этот полимер на биологической основе безопасен для применения.

Фиг. 16 иллюстрирует активацию комплемента с помощью комплекса С3а пегилированных и конъюгированных с полисаркозином LNP при теоретических концентрациях в плазме человека. Липидные препараты и контроли (положительный и отрицательный) инкубируют с человеческой сывороткой в отношении 20:80 (образец:сыворотка) в течение 1 часа при 37°С.

Данные показывают пониженные уровни комплекса С3а с PSarc-LNP при сравнении с ПЭГ-LNP при более высоких дозах, а именно, пятикратной предполагаемой для людей дозе. Более низкие дозы не запускают образование комплекса С3а при сравнении с PBS (буфер для препарата). Эти результаты предполагают, что PSarc может быть менее иммуногенным, чем конъюгированные с ПЭГ липиды.

Фиг. 17 показывает Crto-ТЕМ изображение LNP в комбинации с DODMA:холестерин:DSPC:PSarc 23 в соответствующих мол.% 40:45:10:5. Морфология конъюгированных с полисаркозином LNP показывает мелкие мультиламеллярные везикулы, в которых мРНК может находиться между близко расположенными бислоями. Масштаб = 200 нм.

В итоге результаты еще раз показывают, что рSarc является универсальной платформой для получения препаратов мелких частиц РНК, независимо от способа, для эффективной доставки РНК.

1. Композиция для доставки РНК к клеткам-мишеням или тканям-мишеням, включающая множество РНК-частиц, причем каждая частица включает

(i) РНК

и

(ii) один или несколько компонентов, которые соединяются с РНК с образованием РНК-частиц,

причем по меньшей мере с одним из одного или нескольких компонентов конъюгирован полисаркозин, причем один или несколько компонентов, которые соединяются с РНК с образованием частиц, содержат один или более липидов или липидоподобных материалов.

2. Композиция по п. 1, причем РНК-частицы являются частицами с невирусной РНК.

3. Композиция по п. 1 или 2, причем один или несколько липидов или липидоподобных материалов включают катионный или ионизируемый по катионному типу липид или липидоподобный материал.

4. Композиция по п. 3, причем ионизируемый по катионному типу липид или липидоподобный материал является положительно заряженным только при кислотном рН и не остается катионным при физиологическом рН.

5. Композиция по п. 3 или 4, причем один или несколько липидов или липидоподобных материалов включают один или несколько дополнительных липидов или липидоподобных материалов.

6. Композиция по п. 5, причем по меньшей мере с одним из одного или нескольких дополнительных липидов или липидоподобных материалов конъюгирован полисаркозин.

7. Композиция для доставки РНК к клеткам-мишеням или тканям-мишеням, включающая множество РНК-липидных частиц, причем каждая частица включает

(а) РНК;

(b) катионный или ионизируемый по катионному типу липид или липидоподобный материал; и

(с) конъюгат полисаркозин-липид или конъюгат полисаркозина и липидоподобного материала.

8. Композиция по п. 7, причем каждая частица также включает

(d) некатионный липид или липидоподобный материал.

9. Композиция по любому из пп. 1-8, причем частицы не включают конъюгат полиэтиленгликоль-липид или конъюгат полиэтиленгликоля и липидоподобного материала и предпочтительно не включают полиэтиленгликоль.

10. Композиция по любому из пп. 7-9, причем катионный или ионизируемый по катионному типу липид или липидоподобный материал включает от примерно 20 мол.% до примерно 80 мол.% всего липида или липидоподобного материала, присутствующего в частицах.

11. Композиция по любому из пп. 8-10, причем некатионный липид или липидоподобный материал включает от примерно 0 мол.% до примерно 80 мол.% всего липида или липидоподобного материала, присутствующего в частицах.

12. Композиция по любому из пп. 7-11, причем конъюгат полисаркозин-липид или конъюгат полисаркозина и липидоподобного материала включает от примерно 0,25 мол.% до примерно 50 мол.% всего липида или липидоподобного материала, присутствующего в частицах.

13. Композиция по любому из пп. 1-12, причем РНК представляет собой мРНК.

14. Композиция по любому из пп. 3-13, причем катионный или ионизируемый по катионному типу липид или липидоподобный материал включает N,N-диметил-2,3-диолеилокси)пропиламин (DODMA), хлорид N,N-диолеил-N,N-диметиламмония (DODAC), бромид N,N-дистеарил-N,N-диметиламмония (DDAB), хлорид N-(1-(2,3-диолеоилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмония (DOTAP), хлорид N-(1-(2,3-диолеилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмония (DOTMA), 1,2-дилинолеилокси-N,N-диметиламинопропан (DLinDMA), 1,2-дилиноленилокси-N,N-диметиламинопропан (DLenDMA), 2,2-дилинолеил-4-(2-диметиламиноэтил)-[1,3]-диоксолан (DLin-KC2-DMA), 2,2-дилинолеил-4-диметиламинометил[1,3]-диоксолан (DLin-K-DMA) или их смесь.

15. Композиция по любому из пп. 8-14, причем некатионный липид или липидоподобный материал включает фосфолипид.

16. Композиция по любому из пп. 8-15, причем некатионный липид или липидоподобный материал включает холестерин или производное холестерина.

17. Композиция по любому из пп. 8-16, причем некатионный липид или липидоподобный материал включает смесь фосфолипида и холестерина или производного холестерина.

18. Композиция по любому из пп. 15-17, причем фосфолипид выбирают из группы, включающей дистеароилфосфатидилхолин (DSCP), дипальмитоилфосфатидилхолин (DРPC) или их смесь.

19. Композиция по любому из пп. 8-18, причем некатионный липид или липидоподобный материал включает смесь DSCP и холестерина.

20. Композиция по любому из пп. 1-19, причем полисаркозин включает от 2 до 200 звеньев саркозина.

21. Композиция по любому из пп. 7-20, причем конъюгат полисаркозин-липид или конъюгат полисаркозина и липидоподобного материала имеет следующую общую формулу (I):

,

где х означает количество звеньев саркозина и имеет значения от 2 до 200.

22. Композиция по любому из пп. 7-21, причем конъюгат полисаркозин-липид или конъюгат полисаркозина и липидоподобного материала имеет следующую общую формулу (II):

,

где х означает количество звеньев саркозина и имеет значения от 2 до 200 и один из R₁ и R₂ включает гидрофобную группу, и другой представляет собой Н, гидрофильную группу или функциональную группу, необязательно включающую нацеливающую частицу.

23. Композиция по любому из пп. 7-22, причем конъюгат полисаркозин-липид или конъюгат полисаркозина и липидоподобного материала имеет следующую общую формулу (III):

,

где х означает количество звеньев саркозина и имеет значения от 2 до 200 и R представляет собой Н, гидрофильную группу или функциональную группу, необязательно включающую нацеливающую частицу.

24. Композиция по любому из пп. 1-23, причем конъюгат полисаркозин-липид или конъюгат полисаркозина и липидоподобного материала является элементом, выбранным из группы, включающей конъюгат полисаркозин-диацилглицерин, конъюгат полисаркозин-диалкилоксипропил, конъюгат полисаркозин-фосфолипид, конъюгат полисаркозин-церамид и их смесь.

25. Композиция по любому из пп. 1-24, причем частицы представляют собой наночастицы.

26. Композиция по любому из пп. 1-25, причем частицы включают наноструктурированное ядро.

27. Композиция по любому из пп. 1-26, причем частицы имеют размер от примерно 30 нм до примерно 500 нм.

28. Композиция по любому из пп. 1-27, причем конъюгат полисаркозина ингибирует агрегацию частиц.

29. Способ доставки РНК в клетки субъекта, включающий введение субъекту композиции по любому из пп. 1-28.

30. Способ доставки терапевтического пептида или белка субъекту, включающий введение субъекту композиции по любому из пп. 1-28, причем РНК кодирует терапевтический пептид или белок.

31. Способ лечения или предупреждения заболевания или расстройства у субъекта, включающий введение субъекту композиции по любому из пп. 1-28 в терапевтически эффективном количестве, причем доставка РНК в клетки субъекта благоприятна при лечении или предупреждении заболевания или расстройства.

32. Способ лечения или предупреждения заболевания или расстройства у субъекта, включающий введение субъекту композиции по любому из пп. 1-28 в терапевтически эффективном количестве, причем РНК кодирует терапевтический пептид или белок, и при этом доставка терапевтического пептида или белка РНК субъекту благоприятна при лечении или предупреждении заболевания или расстройства.

33. Способ по любому из пп. 29-32, причем субъект представляет собой млекопитающее.

34. Способ по п. 33, причем млекопитающее является человеком.