Композиции и способы для борьбы с насекомыми-вредителями

Авторы патента:

C12N15/113 - Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев (мутанты или микроорганизмы, полученные генной инженерией C12N 1/00,C12N 5/00,C12N 7/00; новые виды растений A01H; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; новые виды животных A01K 67/00; использование лекарственных препаратов, содержащих генетический материал, который включен в клетки живого организма, для лечения генетических заболеваний, для генной терапии A61K 48/00 пептиды вообще C07K)

C07K14/195 - из бактерий

Владельцы патента RU 2792660:

МОНСАНТО ТЕКНОЛОДЖИ ЛЛС (US)

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу вызывания гибели или задержки роста насекомого рода Phyllotreta spp. Также раскрыты инсектицидная композиция, трансгенное растение, рекомбинантный ДНК-конструкт, трансгенная растительная клетка. Раскрыты способ для борьбы с заражением растения насекомым рода Phyllotreta spp., способ обеспечения растения с улучшенной устойчивостью к насекомому рода Phyllotreta spp. Изобретение позволяет эффективно бороться с насекомыми рода Phyllotreta spp. 7 н. и 13 з.п. ф-лы, 6 табл., 28 ил., 11 пр.

[0001] В настоящей заявке запрашивается приоритет предварительной заявки на патент США № 62/287080, озаглавленной «Композиции и методы борьбы с насекомыми-вредителями», поданной 26 января 2016 года, которая включена во всей ее полноте. Перечень последовательностей, содержащихся в файле ʺP34170WO01_SL.TXTʺ (2289028 Кб, созданный 26 июля 2017 года), подан таким образом и включен посредством ссылки во всей своей полноте в данный документ.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0002] В данном документе описаны способы борьбы с заражениями беспозвоночными вредителями, особенно у растений, композиции и инсектицидные полинуклеотиды полезные в таких способах, и растения, имеющие повышенную устойчивость к беспозвоночным вредителям. Более конкретно, раскрыты инсектицидные полинуклеотиды и способы их использования для модификации экспрессии генов у насекомых-вредителей, в частности с помощью РНК-интерференции. Виды вредителей включают блошек, таких как Phyllotreta spp. и Psylliodes spp.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Коммерческие сельскохозяйственные культуры часто являются объектами нападений со стороны беспозвоночных вредителей, таких как насекомые. РНК-интерференция (РНКи, РНК-опосредованное подавление гена) - это подход, который демонстрирует перспективы для использования в экологически чистой борьбе с вредителями. У беспозвоночных, РНКи-основанное подавление гена было впервые продемонстрировано у нематод (Fire et al., (1998) Nature, 391:806-811; Timmons & Fire (1998) Nature, 395:854). Впоследствии, о РНКи-основанном подавлении генов беспозвоночных с использованием техник рекомбинантных нуклеиновых кислот сообщалось у ряда видов, включая сельскохозяйственно- или экономически значимых вредителей от различных таксонов насекомых и нематод, таких как: корневые нематоды (Meloidogyne spp.), см. Huang и др. (2006) Proc. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 14302-14306, doi: 10.1073/pnas.0604698103); совка хлопковая (Helicoverpa armigera), см. Mao et al. (2007) Nature Biotechnol., 25: 1307-1313, doi: 10.1038/nbt1352; западный кукурузный жук (Diabrotica virgifera LeConte), см. Baum et al. (2007) Nature Biotechnol., 25: 1322-1326, doi: 10.1038/nbt1359; свекловичная нематода (Heterodera schachtii), см. Sindhu et al. (2008) J. Exp. Botany, 60: 315-324, doi: 10.1093/jxb/ern289; комар желтолихорадочный (Aedes aegypti), см. Pridgeon et al. (2008) J. Med. Entomol., 45: 414-420, doi: полный/10.1603/0022-2585% 282008% 2945% 5B414% 3ATAADRK% 5D2.0.CO% 3B2; плодовые мухи (Drosophila melanogaster), хрущак малый булавоусый (Tribolium castaneum), гороховая тля (Acyrthosiphon pisum) и бражник табачный (Manduca sexta), см. Whyard et al. (2009) Insect Biochem. Mol. Biol., 39: 824-832, doi: 10.1016/j.ibmb.2009.09.00; капустная моль (Plutella xylostella), см. Gong et al. (2011) Pest Manag. Sci., 67: 514-520, doi: 10.1002/ps.2086; зеленая персиковая тля (Myzus persicae), см. Pitino et al. (2011) PLoS ONE, 6: e25709, doi: 10.1371/journal.pone.0025709; бурая рисовая цикадка (Nilaparvata lugens), см. Li et al. (2011) Pest Manag. Sci., 67: 852-859, doi: 10.1002/ps.2124; и белокрылка (Bemisia tabaci), см. Upadhyay et al. (2011) J. Biosci., 36:153-161, doi:10.1007/s12038-011-9009-1.

Краткое изложение содержания

[0004] Данные варианты осуществления изобретения относятся к контролю видов насекомых, особенно видов земляных блошек, которые являются экономически или сельскохозяйственно важными вредителями. Представленные в данном документе композиции и способы включают в себя инсектицидные молекулы полинуклеотида, которые полезны для борьбы или предотвращения заражения этим видом насекомых. Несколько вариантов осуществления изобретения, описанные в данном документе, относятся к композиции, содержащей полинуклеотид (например, композиции, содержащей дцРНК для подавления гена-мишени), которая местно применяется к виду насекомых или к растению, части растения или семенам, которые должны быть защищены от заражения насекомыми. Другие варианты осуществления изобретения относятся к способам выбора генов-мишеней насекомых, которые являются эффективными мишенями для опосредованного РНКи контроля над видами насекомых.

[0005] Несколько вариантов осуществления изобретения относятся к способу борьбы с заражением растения насекомыми, включающему контактирование насекомого с инсектицидным полинуклеотидом, содержащим по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% комплементарной фрагменту гена-мишени насекомого. В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит по меньшей мере один сегмент из 21 смежных нуклеотидов с последовательностью на 100% комплементарной фрагменту гена-мишени насекомого. В некоторых вариантах реализации изобретения, ген-мишень является выбранным из группы, состоящей из Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpS21, RpS4, Rpn2, Rpn3, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах реализации изобретения, ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит последовательность от около 95% до около 100% идентичную или комплементарную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или их фрагмента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит по меньшей мере один сегмент из 21 смежных нуклеотидов последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой дцРНК, содержащую цепь РНК с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975. В различных вариантах осуществления изобретения, контактирование с насекомым осуществляется путем пероральной доставки или не-пероральным контактом, например, путем абсорбции через кутикулу или посредством комбинации пероральной и не-пероральной доставки. В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидный полинуклеотид подавляет ген-мишень у насекомого и тормозит рост, развитие или размножение насекомого, или убивает насекомое.

[0006] Несколько вариантов реализации изобретения относятся к способу вызывания гибели или задержки роста в насекомого, включающему предоставление в рационе насекомого по меньшей мере одного инсектицидного полинуклеотида, содержащего по меньшей мере один подавляющий элемент, причем по меньшей мере один подавляющий элемент является по существу идентичным или по существу комплементарным фрагменту последовательности гена-мишени насекомого, и при этом поедание полинуклеотида насекомым приводит к гибели или задержке развития насекомого. В некоторых вариантах реализации изобретения, ген-мишень является выбранным из группы, состоящей из актина, Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpL13, RpL14, RpS21, RpS4, RpS14, Rpn2, Rpn3, Rpn7, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах реализации изобретения, последовательность гена-мишени является выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит последовательность от около 95% до около 100% идентичную или комплементарную по меньшей мере 21 смежным нуклеотидам последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или их фрагмента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержится в рационе насекомого в виде растения или бактериальной клетки, содержащей полинуклеотид, или в виде синтетической полинуклеотидной молекулы или в виде продукта ферментации (например, дцРНК типа шпилька, полученная в бактерии). В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой одноцепочечную молекулу РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой двухцепочечную молекулу РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой одноцепочечную молекулу ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой двухцепочечную молекулу ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой гибридную молекулу РНК/ДНК.

[0007] Несколько вариантов реализации изобретения относятся к инсектицидной композиции, содержащий инсектицидно-эффективное количество полинуклеотида, отличающегося тем, что полинуклеотид содержит 18 или более смежных нуклеотидов на около 95% до около 100% комплементарных соответствующей части гена-мишени насекомого, которое заражает растение. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид содержит 21 смежных нуклеотидов с последовательностью на 100% комплементарной соответствующей части гена-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения, ген-мишень является выбранным из группы, состоящей из актина, Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpL13, RpL14, RpS21, RpS4, RpS14, Rpn2, Rpn3, Rpn7, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид содержит 18 или более смежных нуклеотидов на около 95% до около 100% комплементарных последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859 или их фрагмента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид содержит 21 смежный нуклеотид с последовательностью на 100% комплементарной ДНК-последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859 или ее фрагмента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид представляет собой одноцепочечную молекулу РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид представляет собой молекулу дцРНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид представляет собой одноцепочечную молекулу ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид представляет собой двухцепочечную молекулу ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид представляет собой гибридную молекулу РНК/ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид содержит по меньшей мере один сегмент (например, цепь РНК или сегмент цепи РНК) с последовательностью от около 95% до около 100% идентичной или комплементарной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или ее фрагмента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид содержит по меньшей мере один сегмент (например, цепь РНК или сегмент цепи РНК) с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или ее фрагмента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид содержит по меньшей мере один сегмент из 21 смежных нуклеотидов (например, цепь РНК или сегмент цепи РНК), которая комплементарна или идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидная композиция дополнительно содержит один или более агент-переносчик, поверхностно-активное вещество, кремнийорганический, катионный липид, полинуклеотидную гербицидную молекулу, неполинуклеотидную гербицидную молекулу, неполинуклеотидный пестицид, фунгицид, антидот, аттрактант насекомых, и регулятор роста насекомых. Варианты осуществления инсектицидных композиций включают неполинуклеотидные инсектициды, например, продуцируемый бактериями инсектицидный белок.

[0008] Несколько вариантов осуществления изобретения относятся к способу обеспечения растения, имеющего улучшенную устойчивость к насекомому, включающему экспрессирование в растении рекомбинантной ДНК-конструкта, причем конструкт рекомбинантной ДНК кодирует инсектицидный полинуклеотид, содержащий последовательность, которая по существу идентична или по существу комплементарна фрагменту по меньшей мере одного гена-мишени насекомого, и причем прием внутрь насекомым инсектицидного полинуклеотида приводит к гибели или задержке роста насекомого. В некоторых вариантах реализации изобретения, ген-мишень является выбранным из группы состоящей из актина, Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpL13, RpL14, RpS21, RpS4, RpS14, Rpn2, Rpn3, Rpn7, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах реализации изобретения, ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой одноцепочечную РНК (оцРНК). В других вариантах реализации изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК (дцРНК), которая может включать одноцепочечные части, такие как петля в стволе-петля структуре. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой одноцепочечную молекулу ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой двухцепочечную молекулу ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой гибридную молекулу РНК/ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит последовательность от около 95% до около 100% идентичную или комплементарную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или их фрагмента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит последовательность по меньшей мере из 21 смежных нуклеотидов, которые комплементарны или идентичны последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой РНК (например, цепь РНК или сегмент цепи РНК), содержащую по меньшей мере 21 смежный нуклеотид последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или его фрагмент.

[0009] Несколько вариантов осуществления изобретения относятся к конструкту рекомбинантной ДНК, содержащей гетерологичный промотор, функционально связанный с ДНК, кодирующей инсектицидный полинуклеотид, содержащий последовательность от около 95% до около 100% идентичной или комплементарной по меньшей мере 21 смежному нуклеотидам последовательности, выбранной из группы состоящий из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или его фрагмента. Несколько вариантов осуществления изобретения относятся к коммерческой единице семян, такой как мешок, в котором все или практически все семена содержат конструкт рекомбинантной ДНК, содержащей гетерологичный промотор, функционально связанный с ДНК, кодирующей инсектицидный полинуклеотид, содержащий последовательность от около 95% до около 100% идентичной или комплементарной по меньшей мере 21 смежным нуклеотидам последовательности, выбранной из группы состоящий из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или его фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой одноцепочечную РНК (оцРНК). В других вариантах реализации изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК (дцРНК), которая может включать одноцепочечные части, такие как петля в стволе-петля структуре. В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой одноцепочечную ДНК (оцДНК). В других вариантах реализации изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой двухцепочечную ДНК (дцДНК), которая может включать одноцепочечные части, такие как петля в ствол-петля структуре. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой гибридную молекулу РНК/ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит цепь РНК или сегмент цепи РНК, содержащий последовательность от около 95% до около 100% идентичную или комплементарную по меньшей мере 21 смежным нуклеотидам последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или его фрагмент. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит цепь РНК или сегмент цепи РНК, состоящую из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или ее фрагмента.

[0010] В связанных аспектах, представленных в данном документе, представлены антропогенные композиции, содержащие описанный в данном документе инсектицидный полинуклеотид, такой как оцРНК, дцРНК, оцДНК, дцДНК или составы гибридных РНК/ДНК, используемые для местного нанесения на растение или вещество, нуждающееся в защите от заражения насекомыми; рекомбинантные конструкции и векторы, пригодные для получения трансгенных растительных клеток и трансгенных растений; составы и покрытия, используемые для обработки растений (включая семена растений или частей размножения, таких как клубни); семена растений или части размножения, такие как клубни, обработанные с или содержащие полинуклеотид как описано в данном документе, а также товарную продукцию и продукты питания, произведенные из таких растений; семена или части размножения (особенно товарную продукцию и продукты питания, имеющие обнаруживаемое количество полинуклеотида, описанного в данном документе). Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к поликлональным или моноклональным антителам которые связывают пептид или белок, кодируемый с помощью последовательности или фрагмента последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к поликлональным или моноклональным антителам которые связывают пептид или белок, кодируемый с помощью последовательности или фрагмента последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или ее комплемента. Такие антитела производят с помощью рутинных способов как известно среднему специалисту в данной области техники.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0011] Настоящие варианты осуществления изобретения относятся к способам и композициям для борьбы с насекомыми-вредителями, в частности группой жесткокрылых насекомых, широко известных как ʺблошкиʺ, среди которых существует несколько родов. Описанные в данном документе гены-мишени определены как полезные для разработки инсектицидных полинуклеотидных агентов для предотвращения или лечения заражений блошкой, особенно коммерчески важных растений. Способы и композиции являются особенно полезными для предотвращения или лечения заражений блошкой коммерчески важных видов Brassica, включая виды, используемые в промышленности в качестве масличного сырья, продуктов питания, или корма для скота (например, канола, рапс, репа, полевая горчица или масличная репа). Такие виды Brassica включают B. napus, B. juncea, B. carinata, B. rapa, B. oleracea, B. rupestris, B. septiceps, B. nigra, B. narinosa, B. perviridus, B. tournefortii, и B. fructiculosa. Также описаны последовательности для подавления одного или более генов-мишеней блошки. Несколько вариантов осуществления изобретения относятся к инсектицидным полинуклеотидным агентам, которые подавляют гены мишени земляной блошки. В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются инсектицидные полинуклеотиды и рекомбинантные молекулы ДНК и конструкты полезные для способов борьбы с насекомыми-вредителями, особенно земляными блошками. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к инсектицидным композициям, а также к трансгенным растениям устойчивым к заражению насекомыми-вредителями. Несколько вариантов осуществления изобретения относятся к способам идентификации эффективных инсектицидных полинуклеотидных агентов, например одноцепочечных молекул РНК, двухцепочечных молекул РНК, одноцепочечных молекул ДНК, двухцепочечных молекул ДНК или гибридных молекул РНК/ДНК для борьбы с насекомыми-вредителями и способы идентификации генов-мишеней, которые, вероятно, выполняют важные функции, что делает эти гены предпочтительными мишенями для РНКи-опосредуемого сайленсинга и борьбы с насекомыми-вредителями.

[0012] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к способам и композициям для ингибирования или контролирования заражения растения блошками с помощью ингибирования экспрессии одного или более гена-мишеней блошки, выбранными из группы состоящей из актина, Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpL13, RpL14, RpS21, RpS4, RpS14, Rpn2, Rpn3, Rpn7, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах реализации изобретения, ингибирование экспрессии одного или более гена-мишени у земляной блошки приводит к замедлению роста или гибели.

[0013] Несколько вариантов осуществления изобретения относятся к инсектицидной молекуле полинуклеотида, такой как оцРНК, дцРНК, оцДНК, дцДНК или гибридная РНК/ДНК, который содержит один или более сегментов, содержащих 18 или более смежных нуклеотидов, например 21 или более смежных нуклеотидов, имеющую от 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100%) комплементарности с фрагментом гена-мишени насекомого, выбранного из группы, состоящей из актина, Act5C, аргинин-киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpL13, RpL14, RpS21, RpS4, RpS14, Rpn2, Rpn3, Rpn7, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13 В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит множество сегментов, каждый из 18 или более смежных нуклеотидов, с последовательностью от около 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100%) комплементарности с фрагментом последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит по меньшей мере 21 смежный нуклеотид, имеющий 100% комплементарность с фрагментом последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит сегменты, комплементарные различным участкам гена-мишени, или может содержать несколько копий сегмента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид включает несколько сегментов, каждый из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100%) комплементарности с фрагментом другого гена-мишени; таким образом, можно подавить множественные гены-мишени или множественные виды насекомых.

[0014] Несколько вариантов осуществления относятся к инсектицидному полинуклеотиду (например, оцРНК, дцРНК, оцДНК, дцДНК или РНК/ДНК гибрид), которая ингибирует экспрессию одного или более генов-мишеней насекомых, выбранных из группы, состоящей из актина, Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpL13, RpL14, RpS21, RpS4, RpS14, Rpn2, Rpn3, Rpn7, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13 Несколько вариантов осуществления изобретения относятся к инсектицидному полинуклеотиду, имеющему длину, большую, чем та, которая характерна для встречающихся в природе регуляторных малых РНК (таких как эндогенно продуцируемые миРНК и зрелые микроРНК), например, полинуклеотид составляет по меньшей мере около 30 смежных пар оснований в длину. В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидный полинуклеотид имеет длину от между около 50 до около 500 пар оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидный полинуклеотид имеет по меньшей мере 50 пар оснований в длину. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид образуется из двух отдельных, по существу комплементарных нитей (например, где каждая цепь отдельно обеспечивается или где каждая нить кодируется отдельной молекулой ДНК или где две нити кодируются на отдельных участках ДНК и отдельно транскрибируются или разделяются, например, действием рекомбиназы или нуклеазы), где по меньшей мере одна нить содержит последовательность от около 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100%) идентичной или комплементарной по меньшей мере 21 смежному нуклеотидам последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или ее фрагмента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид является двухцепочечным и тупоконечным, например двумя отдельными нитями равной длины, которые образуют двухцепочечный полинуклеотид посредством межмолекулярной гибридизации. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид является двухцепочечным и имеет липкий конец на одном или обоих концах (концевые), например, две отдельные нити неравномерной длины, которые образуют двухцепочечный полинуклеотид посредством межмолекулярной гибридизации; липкий конец может представлять собой один нуклеотид или 2, 3, 4, 5, 6 или более нуклеотидов и может быть расположен на 5'-конце или на 3'-конце нити. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит по меньшей мере один петля-стебель, например, одну молекулу полинуклеотида, которая образует двухцепочечный участок посредством внутримолекулярной гибридизации рядом со вторичной структурой «шпильки». В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид образуется из одной самогибридизующейся шпильки, где одно «плечо» шпильки содержит последовательность от около 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100%) идентичной или комплементарной по меньшей мере 21 смежному нуклеотиду последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или ее фрагмента. В вариантах осуществления изобретения, самогибридизирующиеся полинуклеотиды, которые образуют шпильки (или частичные шпильки), включают полинуклеотидные молекулы, которые содержат «спейсерные» нуклеотиды или одноцепочечную «область петли» между двунитевыми образующими комплементарными «плечами» смысловой последовательности и анти-смысловой последовательности. В вариантах реализации изобретения, такие спейсеры или петли включают в себя нуклеотиды, имеющие последовательность несвязанного (не комплементарных или идентичных) гена-мишени, соответствующего двухцепочечному фрагменту шпильки. В вариантах осуществления изобретения, такие спейсеры или петли включают нуклеотиды, имеющие последовательность, комплементарную или идентичную гену-мишени. Примеры спейсеров или петель включают в себя те, которые кодируются SEQ ID NO: 1719-1721.В вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит множество петля-стебель с или без спейсерных нуклеотидов между каждой петлей-стеблем. В вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит модифицированную петлю-стебель, такую как «стабилизированная антисмысловая» петля или «стабилизированная смысловая» петля; см., например, патенты США 7855323 и 9006414, которые включены в данный документ в качестве ссылки во всей их полноте.

[0015] Инсектицидный полинуклеотид может быть химически синтезирован (например, с помощью in vitro транскрипции, такой как транскрипция с использованием T7 полимеразы или других полимераз), или может быть получен путем экспрессии в микроорганизме, путем экспрессии в растительной клетке, или путем микробной ферментации. Инсектицидный полинуклеотид может быть химически модифицирован, например, для улучшения стабильности, легкости приготовления или эффективности. В некоторых вариантах осуществления изобретения, молекула инсектицидного полинуклеотида предоставляется в микробной или растительной клетке, которая экспрессирует инсектицидный полинуклеотид (такой как шпилечная форма дцРНК) или в продукте микробной ферментации.

[0016] Различные способы для конструирования и производства разнообразных форм инсектицидного полинуклеотида известны в данной области техники и являются полезными в композициях и способах, описанных в данном документе. См., например, следующие патенты, которые включены в данный документ в качестве ссылки в полном объеме: (1) патент США № 8598332 Waterhouse и др., в котором раскрываются конструкты рекомбинантной ДНК, включая ДНК, кодирующую последовательность смысловой РНК и анти-смысловой РНК в одном транскрипте, который формирует искусственную ʺшпильковуюʺ РНК структуру с двухцепочечным стеблем РНК с помощью спаривания оснований между смысловыми и анти-смысловыми нуклеотидными последовательностями; варианты реализации изобретения включают шпильки со спейсерными нуклеотидами между смысловыми и анти-смысловыми нуклеотидными последовательностями; (2) патент США № 8158414 Rommens и др., в котором раскрываются конструкты рекомбинантной ДНК, включая конвергентно ориентированные первый и второй промоторы, которые производят, например, дуплекс РНК, которая сформирована с помощью отжига двух отдельных РНК транскриптов; и (3) патент США № 7855323 и 9006414 Huang и др., которые раскрывают рекомбинантные ДНК конструкты, содержащие ДНК, кодирующую ʺстабилизированные анти-смысловыеʺ транскрипты которые формируют петлю анти-смысл-ориентированной РНК для подавления одного или более генов-мишеней; рекомбинантные ДНК конструкты могут быть сконструированы для подобного кодирования ʺстабилизированных смысловыхʺ транскриптов, которые формируют петлю смысл-ориентированной РНК для подавления одного или более генов-мишеней.

[0017] Варианты композиций, содержащих инсектицидные полинуклеотиды, описанные в данном документе, дополнительно содержат один или более дополнительных компонентов или адъювантов, например агент-переносчик, инкапсулирующий агент, эмульгирующий агент, поверхностно-активное вещество, кремнийорганический, катионный липид, расширяющий агент, фотозащитный агент, агент устойчивости к осадкам, полинуклеотидную гербицидную молекулу, неполинуклеотидную гербицидную молекулу, неполинуклеотидный пестицид, неполинуклеотидный фунгицид, антидот, аттрактант насекомых, феромоны насекомых, и регулятор роста насекомых. В вариантах реализации изобретения, эти дополнительные компоненты или адъюванты являются съедобными или усваиваются, если попадают в организм блошки.

[0018] В вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид, описанный в данном документе, используется в сочетании с ненуклеотидным пестицидным агентом, таким как пестицидный агент с малой молекулой или белковоподобный пестицидный агент, одновременно или последовательно. Примеры ненуклеотидных пестицидных агентов включают пататины, лектины растений, фитоэкдистероиды и бактериальные инсектицидные белки (например, инсектицидные белки от Bacillus thuringiensis, Xenorhabdus sp., Photorhabdus sp., Brevibacillus laterosporus (ранее Bacillus laterosporus), Lysinibacillus sphaericus (ранее Bacillus sphaericus), Chromobacterium sp., Chromobacterium subtsugae, Paenibacillus sp., Paenibacillus lentimorbus и Paenibacillus popilliae), бактерия, которая продуцирует инсектицидный белок, и энтомицидных бактериальных видов. В вариантах осуществления изобретения, композиции, содержащие полинуклеотиды для борьбы с земляной блошкой, такие как инсектицидный полинуклеотид, описанный в данном документе, могут дополнительно содержать или могут использоваться одновременно или последовательно с обычными пестицидами, такими как спиромезифен, спиродиклофен, спиротетрамат, пиридабен, тебуфенпирад, толфенпирад, фенпироксимат, флуфенерим, пиримидифен, феназахин, ротенон, циенопирафен, гидраметилнон, ацехиноцил, флуакрипирим, фосфид алюминия, фосфид кальция, фосфин, фосфид цинка, цианид, диафентиурон, азоциклотин, цигексатин, оксид фенбутатина, пропаргит, тетрадифон, бенсультап, тиоциклам, тиосултап-натрия, флоникамид, этоксазол, клофентезин, дифловидазин, гекситиазокс, хлорфлуазурон,бистрифлурон, дифлубензурон, флуциклоксурон, флуфеноксурон, гексафлумурон, луфенурон, новалурон, новифлумурон, тефлубензурон, трифлумурон, бупрофезин, циромазин, гидропрен, кинопрен, метопрен, феноксикарб, пирипроксифеном, пиметрозин, пирифлукваиназон, хлорфенапир, тралопирил, B.t. (Bacillus thuringiensis) var. aizawai, B.t. var. israelensis, B.t. var. kurstaki, B.t. var. sphaericus, B.t. var. tenebrionensis, Bacillus thuringiensis белки сельскохозяйственных культур, включая Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Fa, Cry2Ab, mCry3A, Cry3Ab, Cry3Bb, Cry34/35Ab1, бромистый метил и другие алкилгалогениды, хлорпикрин, фторид серы, бенклотиаз, хинометионат, криолит, метилнеодеканамид, бензоксимат, цимиазол, флуенсульфон, азадирахтин, бифеназат, амидофлумет, дикофол, плифенат, цифлуметофен, пиридалил, Beauveria bassiana GHA, сульфоксафлор, спинеторам, спиносад, эмамектинбензоат, лепимектин, милбемектин, абамектин, метоксифенозид, хромафенозид, галофенозид, тебуфенозид, амитраз, хлорантранилипрол, циантранилипрол, флубендиамид, альфа-эндосульфан, хлордан, эндосульфан, фипронил, ацетопрол, этипрол, пирафлупрол, пирипрол, индоксакарб и метафлумизон, акринатрин, аллетрин, аллетрин-цис-транс, транс-аллетрина, бета-цифлутрин, бета-циперметрин, бифентрин, биоаллетрин, биоаллетрин S-циклопентенил, биоресметрин, циклопротрин, цифлутрин, цигалотрин, циперметрин, цифенотрин [(1R)-транс-изомеры], димефлутрин, эмпентрин [(EZ)-(1R)-изомеры], эсфенвалерат, этофенпрокс, фенпропатрин, фенвалерат, флюцитринат, флюметрин, гамма-цигалотрин, лямбда-Цигалотрин, меперфлутрин, метофлутрин, перметрин, фенотрин [(1R)-транс-изомер], праллетрин, профлутрин, протрифенбут, ресметрин, силафлуофен, тау-флувалинат, тефлутрин, тетраметрин, тетраметрин [(1R)-изомеры], тетраметилфлутрин, тета-циперметрин, тралометрин, трансфлутрин, дзета-циперметрин, альфа-циперметрин, дельтаметрин, DDT и Метоксихлор, тиодикарб, аланикарб, алдикарб, бендиокарб, бенфуракарб, бутоксикарбоксим, карбарил, карбофуран, карбосульфан, этиофенкарб, фенобукарб, форметанат, фуратиокарб, изопрокарб, метиокарб, метомил, метолкарб, оксамил, пиримикарб, пропоксур, тиофанокс, триазамат, триметакарб, ХМС, ксилилкарб, хлорпирифос, малатион, ацефат, азаметифос, азинфос-этил, азинфос-метил, кадусафос, хлоретоксифос, хлорфенвинфос, хлормефос, хлорпирифосметил, кумафос, цианофос, метилмеркаптофос, диазинон, дихлорвос/ДДВФ, дикротофос, диметоат, диметилвинфос, дисульфотон, EPN, этион, этопрофос, фамфос, фенамифос, фенитротион, фентион, фонофос, фостиазат, имициафос, изофенфос-метил, мекарбам, метамидофос, метидатион, мевинфос, монокротофос, налед, ометоат, оксидеметон-метил, паратион, паратион-метил, фентоат, форат, фосалон, фосмет, фосфамидон, фоксим, пиримофоз-этил, профенофос, пропафос, пропетамфос, протиофос, пираклофос, пиридафентион, хиналфосом, сульфотеп, тебупиримфос, темефос, тербуфос, тетрахлорвинфос, тиометон, триазофос, хлорофос, вамидотион имидаклоприд, тиаметоксам, ацетамиприд, клотиандин, динотефуран, нитенпирам, нитиозин, никотин, тиаклоприд, хлорантранилипрол и циантранилипрол. В вариантах осуществления изобретения, композиции, содержащие инсектицидный полинуклеотид для борьбы с земляной блошкой у видов Brassica,включая рапс, дополнительно содержат или используются одновременно или последовательно с лиственными спреями, содержащими один или более пестицидов, выбранных из группы, состоящей из дельтаметрина, циперметрина, лямбда-цигалотрина, перметрина, карбарила, карбофурана и малатиона, или обработкой семян, содержащей один или более пестицидов, выбранных из группы, состоящей из тиаметоксама, имидаклоприда и клотианадина.

[0019] В вариантах осуществления изобретения, композиции, содержащие инсектицидные полинуклеотиды для борьбы с земляной блошкой, описанные в данном документе, могут дополнительно включать, или могут использоваться параллельно или последовательно с обычными фунгицидами, такими как бупиримат, диметиримол, этиримол, ципродинил, пириметанил, мепанипирим, фенпиклонил, флудиоксонил; фениламиды, беналаксил, фуралаксил, металаксил, R-металаксил, офурак, оксадиксил, беномил, карбендазим, дебакарб, фуберидазол, тиабендазол, хлозолинат, дихлозолин, ипродин, миклозолин, процимидон, винклозолин, карбоксин, фенфурам, флутоланил, мепронил, оксикарбоксин, тифлузамид, гуазатин, додин, иминоктадин, азоксистробин, крезоксим-метил, метоминостробин или трифлоксистробин, фербам, манкозеб, манеб, метирам, пропинеб, тирам, зинеб, зирам, каптафол, каптан, дихлофлуанид, флуоромид, фолпет, толуфлуанид, гидроксид меди, оксихлорид меди, сульфат меди, оксид меди, манкуппер, оксин-медь, динокап, нитротал-изопропил, эдифенфос, ипробенфос, изопротиолан, фосдифен, пиразофо, токлофос-метил, ацибензолар-S-метил, харпин, анилазин, бластицидин-S, хинометионат, хлоронеб, хлороталонил, цимоксанил, дихион, дикломезин, диклоран, диэтофенкарб, диметоморфу, дитианон, этридиазол, фамоксадон, фенамидон, фентин, фенпиразамине, феримзон, флуазинам, флусульфамид, фосетил-алюминий, гимексазол, касугамицин, метасульфокарб, пенцикурон, фталид, полиоксины, пробеназол, пропамокарб, пироквуилон, хиноксифен, квинтозин, сера, триазоксид, трициклазол, валидамицин, азаконазол, битертанол, пропиконазол, дифеноконазол, диниконазол, ципроконазол, эпоксиконазол, флухинконазол, флусилазол, флутриафол, гексаконазол, имазалил, имибенконазол, ипконазол, тебуконазол, тетраконазол, фенбуконазол, метконазол, миклобутанил, перфуразоат, пенконазол, бромуконазол, пирифенокс, прохлораз, триадимефон, триадименол, трифлумизол, тритиконазол, трифорин, анцимидол, фенаримол или нуаримол, додеморф, фенпропидин, фенпропиморф, спироксамин, тридеморф и фенгексамид. В вариантах реализации изобретения, композиции, содержащие инсектицидные полинуклеотиды для борьбы с земляной блошкой у видов Brassica включая рапс, дополнительно содержат или используются одновременно или последовательно с лиственными спреями, содержащими один или более фунгицид, выбранный из группы, состоящей из азоксистробина, Bacillus subtilis штамма QST 2808, боскалида, флуксопироксада, пираклостробина, метконазола, протиоконазола, пентиопирада, пикоксистробина и тиофанат метила, или обработкой семян, содержащей один или более фунгицид, выбранный из группы, состоящей из азоксистробина, металаксила, трифлоксистробина, пираклостробина, седаксана, пенфлуфена, флудиоксонила и мефеноксама.

[0020] В вариантах осуществления изобретения, композиции, содержащие инсектицидные полинуклеотиды для борьбы с земляной блошкой, описанные в данном документе, могут дополнительно включать, или могут использоваться параллельно или последовательно с обычными гербицидами, такими как глифосат, ауксин-подобными гербицидами, такими как дикамба, фосфинотрицин, глюфосинат, 2,2-дихлоропропионовая кислота (далапон), ингибиторы ацетолактат синтазы, такие как сульфонилмочевины, имидазолинон, триазолопиримидин, пиримидилоксибензоаты, и фталид, бромоксинил, циклогександион (сетоксидим) и арилоксифеноксипропионат (галоксифоп), сульфонамид гербициды, триазиновые гербициды, 5-метилтриптофан, аминоэтил цистеин, пиридазиноновые гербициды, такие как норфлуразон, циклопропилизоксазол гербициды, такие как изоксафлютол, ингибиторы протопорфириноген-оксидазы, гербициды, содержащие фрагмент арилоксиалканоата, фенокси ауксины, такие как 2,4-D и дихлорпроп, пиридилокси ауксины, такие как фтороксипира и триклопира, арилоксифеноксипропионаты (AOPP), ингибиторы ацетил-коэнзим A карбоксилазы (ACCase), такие как галоксифоп, хизалофоп и дислофоп, и 5-замещенные ингибиторы феноксиацетат протопорфириноген-оксидазы IX, такие как пирафлуфен и флумиклорак. В вариантах реализации изобретения, композиции, содержащие инсектицидные полинуклеотиды для борьбы с блошкой у видов Brassica, включая рапс, дополнительно содержат или используются одновременно или последовательно с одним или более послевсходовых гербицидов, выбранных из группы, состоящей из хизалофопа, сетоксидима, клетодима, и клопиралида. В вариантах реализации изобретения, композиции, содержащие инсектицидные полинуклеотиды для борьбы с блошкой у устойчивых к гербицидам видов Brassica, включая устойчивый к гербицидам рапс, дополнительно содержат или используются одновременно или последовательно с одним или более гербицидов, выбранных из группы, состоящей из имазамокас, глифосата и глюфосината.

[0021] Описанные композиции и способы являются полезными для ингибирования или контролирования заражения блошкой растения, такого как виды Brassica. В вариантах осуществления изобретения, композиции и способы используются для лечения растущего растения, такого как полевые растения Brassica. Варианты осуществления изобретения включают композиции, содержащие инсектицидные полинуклеотиды, описанные в данном документе, в композиции в форме твердого вещества, жидкости, порошка, суспензии, эмульсии, спрея, инкапсуляции, микрогранул, частиц носителей, пленки, матрицы, орошения почвы, или композиции для обработки семян. В вариантах осуществления изобретения такие композиции наносятся на поверхность растения нуждающегося в защите от или лечении от заражения блошками, или наносятся прямо на блошек, или предусмотрены в пищевой для блошек форме. В вариантах осуществления изобретения, композиция, содержащая инсектицидные полинуклеотиды, описанные в данном документе, наносится прямо на не проросшие семена (такие как не проросшие семена видов Brassica), обеспечивая растению, проросшему из обработанных семян, повышенную устойчивость к заражению блошками; примеры способов обработки семян описаны в патентной заявке США 14/143836, которая включена посредством ссылки во всей своей полноте в данный документ. Вариант осуществления изобретения включает семя Brassica, которое обрабатывают путем непосредственного контактирования семян с инсектицидным полинуклеотидом (таким как оцРНК, дцРНК, оцДНК, дцДНК или гибридная молекула РНК/ДНК), описанным в данном документе, с последующим прорастанием в растение Brassica, которое проявляет повышенную устойчивость к заражениям земляной блошкой.

[0022] Если не указано иное, используемые технические и научные термины имеют то же значение, которое обычно понимается средним специалистом в данной области техники. Как правило, используемая номенклатура и производственные или лабораторные методики, описанные ниже, являются хорошо известными и широко используемыми в данной области техники. Обычные способы используются для выполнения этих процедур, таких, как те, которые предусмотрены в данной области техники и различных общих ссылках. В случае, когда термин предусмотрен в единственном числе, авторы данного изобретения также рассматривают аспекты, описываемые множественным числом этого термина. Там, где есть расхождения в терминах и определениях, используемых в ссылках, которые включены посредством ссылки, термины, используемые в данной заявке, должны иметь приведенные определения. Другие технические термины имеют их обычное значение в данной области техники, в которой они используются, как проиллюстрировано с помощью различных технико-специфических словарей, например, ʺThe American Heritage® Science Dictionaryʺ (Editors of the American Heritage Dictionaries, 2011, Хоутон Миффлин Харкорт, Бостон и Нью-Йорк), ʺMcGraw-Hill Dictionary of Scientific and Technical Termsʺ (6^th edition, 2002, МакГроу-Хилл, Нью-Йорк), или ʺOxford Dictionary of Biologyʺ (6^th edition, 2008, Oxford University Press, Оксфорд и Нью-Йорк). Авторы данного изобретения не намерены ограничиваться механизмом или способом действия. Ссылка к ним предоставляется только для иллюстрации.

[0023] Если не указано иное, последовательности нуклеиновых кислот в тексте данного описания изобретения приведены так, что читаются слева направо в направлении 5' к 3' концу. Специалисту в данной области техники будет известно, что данная последовательность ДНК понимается для определения соответствующей последовательности РНК, которая идентична последовательности ДНК за исключением замены нуклеотидов тимина (T) в ДНК на нуклеотиды урацила (U). Таким образом, для обеспечения определенной последовательности ДНК понимают эквивалент РНК и наоборот. Данная первая полинуклеотидная последовательность, будь то ДНК или РНК, дополнительно определяет последовательность ее точного комплемента (который может быть ДНК или РНК), то есть второй полинуклеотид, который идеально гибридизируется с первым полинуклеотидом путем формирования Уотсона-Криковских пар оснований. Под термином "по существу комплементарный" подразумевается, что полинуклеотидная цепь (или по меньшей мере одна цепь двухцепочечного полинуклеотида) сконструирована для гибридизации (как правило, при физиологических условиях, таких как те, что можно найти в клетке живых растений или животных) с геном-мишенью, или с фрагментом гена-мишени, или с транскриптом гена-мишени или фрагмента гена-мишени; специалисту в данной области техники будет понятно, что такая гибридизация не обязательно требует 100% идентичности или комплементарности последовательности. Первая последовательность нуклеиновой кислоты "функционально" соединена или "связана" со второй последовательностью нуклеиновой кислоты, когда первая последовательность нуклеиновой кислоты находится в функциональной связи со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, последовательность промотора является ʺфункционально связаннойʺ с ДНК если промотор обеспечивает транскрипцию или экспрессию ДНК. Как правило, функционально связанные последовательности ДНК являются смежными.

[0024] Термин ʺполинуклеотидʺ обычно относится к молекуле ДНК или РНК, содержащей несколько нуклеотидов, и в общем относится к обеим ʺолигонуклеотидамʺ (полинуклеотидная молекула из 18-25 нуклеотидов в длину) и более длинным полинуклеотидам из 26 или более нуклеотидов. Полинуклеотиды также включают молекулы, содержащие несколько нуклеотидов, включая неканонические нуклеотиды или химически модифицированные нуклеотиды, как это обычно практикуется в данной области техники; см., например, химические модификации, раскрытые в техническом руководстве ʺRNA Interference (RNAi) and DsiRNAsʺ, 2011 (Integrated DNA Technologies Коралвиль, Айова).

[0025] Как правило, инсектицидные полинуклеотиды, как описано в данном документе, будь то ДНК или РНК, или оба, и будь то одно- или двухцепочечный, содержат по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов (или в случае двухцепочечных полинуклеотидов по меньшей мере 18 смежных пар оснований), которые, по сути, идентичны или комплементарны фрагменту эквивалентного размера ДНК гена-мишени или РНК транскрипта гена-мишени. На протяжении этого описания, "по меньшей мере 18 смежных" означает "от около 18 до около 10000, включая каждую целую точку между ними". Таким образом, варианты реализации изобретения включают композиции, содержащие олигонуклеотиды, имеющие длину от 18-25 нуклеотидов (18-членные, 19-членные, 20-членные, 21-членные, 22-членные, 23-членные, 24-членные, или 25-членные), или средней длины полинуклеотиды, имеющие длину от 26 или более нуклеотидов (полинуклеотиды из 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, около 65, около 70, около 75, около 80, около 85, около 90, около 95, около 100, около 110, около 120, около 130, около 140, около 150, около 160, около 170, около 180, около 190, около 200, около 210, около 220, около 230, около 240, около 250, около 260, около 270, около 280, около 290, или около 300 нуклеотидов), или длинные полинуклеотиды, имеющие длину, более чем около 300 нуклеотидов (например, полинуклеотиды от между около 300 до около 400 нуклеотидов, между около 400 до около 500 нуклеотидов, между около 500 до около 600 нуклеотидов, между около 600 до около 700 нуклеотидов, между около 700 до около 800 нуклеотидов, между около 800 до около 900 нуклеотидов, между около 900 до около 1000 нуклеотидов, между около 300 до около 500 нуклеотидов, между около 300 до около 600 нуклеотидов, между около 300 до около 700 нуклеотидов, между около 300 до около 800 нуклеотидов, между около 300 до около 900 нуклеотидов, или около 1000 нуклеотидов в длину, или даже более чем около 1000 нуклеотидов в длину, например, по всей длине гена-мишени, содержащего кодирующие или некодирующие или оба кодирующие или некодирующие участки гена-мишени). Когда инсектицидный полинуклеотид является двухцепочечным, таким как дцРНК, описанные в рабочих примерах, его длину можно аналогичным образом описать в терминах пар оснований. Двухцепочечные инсектицидные полинуклеотиды можно дополнительно описать в терминах одного или более одноцепочечных компонентов.

[0026] Инсектицидные полинуклеотиды, описанные в данном документе, могут быть одноцепочечными (оц) или двухцепочечными (дц). ʺДвухцепочечныйʺ относится к спариванию оснований, которое возникает между полностью комплементарными, анти-параллельными цепями нуклеиновой кислоты для формирования двухцепочечной структуры нуклеиновой кислоты, как правило, при физиологически соответствующих условиях. Варианты реализации изобретения включают те, в которых полинуклеотид выбирают из группы, состоящей из смысловой одноцепочечной ДНК (оцДНК), смысловой одноцепочечной РНК (оцРНК), двухцепочечной РНК (дцРНК), двухцепочечной ДНК (дцДНК), двухцепочечного ДНК/РНК гибрида, анти-смысловой оцДНК, или анти-смысловой оцРНК; смесь полинуклеотидов любого из этих видов может быть использована. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК длиной большей, чем та, которая является типичной для встречающиеся в природе регуляторных малых РНК (таких как эндогенно образующиеся миРНК и зрелые микроРНК). В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК из по меньшей мере 30 смежных пар оснований в длину. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК с длиной между 50 до около 500 пар оснований. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид может содержать компоненты, отличные от стандартных рибонуклеотидов, например, вариант осуществления изобретения представляет собой РНК, которая содержит терминальные дезоксирибонуклеотиды.

[0027] Инсектицидные полинуклеотиды любого размера могут быть использованы по отдельности или в сочетании, в различных способах и композициях, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения, один инсектицидный полинуклеотид используется для получения композиции (например, композиции для местного применения). В других вариантах осуществления изобретения, используется смесь или пул различных инсектицидных полинуклеотидов; в таких случаях инсектицидные полинуклеотиды могут быть для одного гена-мишени или для нескольких генов-мишеней.

[0028] В различных вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид, как описано в данном документе, включает встречающиеся в природе нуклеотиды, такие как те, которые возникают из ДНК и РНК. В определенных вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой комбинацию рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов, например, синтетические полинуклеотиды, состоящие в основном из рибонуклеотидов, но с одним или более терминальных дезоксирибонуклеотидов или одним или более терминальных дидеоксирибонуклеотидов или синтетических полинуклеотидов, состоящих в основном из дезоксирибонуклеотидов, но с одним или более терминальных дидеоксирибонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит неканонические нуклеотиды, такие как инозин, тиоуридин или псевдоуридин. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит химически модифицированные нуклеотиды. Примеры химически модифицированных олигонуклеотидов или полинуклеотидов хорошо известны в данной области техники; см., например, публикацию патента США 2011/0171287, публикацию патента США 2011/0171176, публикацию патента США 2011/0152353, публикацию патента США 2011/0152346, и публикацию патента США 2011/0160082, которые включены в данный документ посредством ссылки. Иллюстративные примеры включают, но без ограничения, встречающиеся в природе фосфодиэфирный остов олигонуклеотида или полинуклеотид, который может быть частично или полностью модифицирован с фосфоротиоатом, фосфородитиоатом, или метилфосфонатными межнуклеотидными модификациями связи, модифицированные основания нуклеозидов или модифицированные сахара могут быть использованы в синтезе олигонуклеотида или полинуклеотида, и олигонуклеотиды или полинуклеотиды могут быть помечены флуоресцентными фрагментами (

[0029] Термин «рекомбинантный», используемый для обозначения полинуклеотида (такого как молекулы инсектицидного полинуклеотида или конструкты рекомбинантных ДНК, описанные в данном документе), означает, что полинуклеотид не является естественной молекулой, т. е. требуется вмешательство человека для существования полинуклеотида. Рекомбинантный полинуклеотид получают с использованием методики рекомбинантной нуклеиновой кислоты, или путем химического синтеза, и может включать комбинации последовательностей, которые не встречаются в природе (например, комбинации гетерологичного промотора и ДНК, кодирующей экспрессируемую РНК, или молекулу РНК, содержащую связанные сегменты гена-мишени которые в природе не встречаются рядом друг с другом). Рекомбинантный полинуклеотид может быть биологически произведен в клетке (такой как бактериальная, или растительная или животная клетка), например, когда эту клетку трансфицируют или трансформируют с вектором, кодирующим рекомбинантный полинуклеотид (например, вектор, кодирующий дцРНК формы шпилька, продуцируемый в бактерии). Рекомбинантный полинуклеотид может содержать последовательности нуклеотидов, разработанных in silico, с использованием соответствующих алгоритмов.

[0030] Инсектицидные полинуклеотиды, описанные в данном документе, как правило, сконструированы для супрессии или подавления одного или более генов (ʺгенов-мишенейʺ). Термин ʺгенʺ относится к любому участку нуклеиновой кислоты, который обеспечивает экспрессию транскрипта или кодирует транскрипт, или который является наследуемой последовательностью нуклеиновой кислоты. ʺГенʺ может включать, но без ограничения, участок промотора, 5' нетранслируемый участок, кодирующий транскрипт участок, который может включать интронный участок, 3' нетранслируемый участок, или комбинации этих участков. В вариантах осуществления изобретения, гены-мишени могут включать кодирующую или некодирующую последовательность или обе. В других вариантах осуществления изобретения, ген-мишень имеет последовательность, идентичную или комплементарную к матричной РНК, например, в вариантах осуществления изобретения геном-мишенью является кДНК.

[0031] Как используется в данном документе, термин ʺизолированныйʺ относится к отделению молекулы от других молекул обычно связанных с ней в своем нативном или естественном состоянии. Термин ʺизолированныйʺ таким образом, может относиться к молекуле ДНК, которая была отделена от других молекул(ы) ДНК, которые обычно связаны с ней в своем нативном или естественном состоянии. Такая молекула ДНК может присутствовать в рекомбинированном состоянии, таком как рекомбинантная молекула ДНК. Таким образом, молекулы ДНК, слитые с регуляторными или кодирующими последовательностями с которыми они обычно не связаны, например посредством рекомбинантных технологий, рассматриваются изолированно, даже при интегрировании в качестве трансгена в хромосому клетки или присутствии с другими молекулами ДНК.

[0032] Под «инсектицидно-эффективным» подразумевается эффективный способ индуцирования физиологического или поведенческого изменения у насекомого (например, взрослого или личинок земляных блошек), которое заражает растение, таких как, но без ограничения, отставание в росте, повышенная смертность, снижение репродуктивного потенциала или снижение плодовитости, уменьшение или прекращение пищевого поведения или движения, или уменьшение или прекращение стадии развития метаморфоза. В некоторых вариантах реализации изобретения, применение инсектицидно-эффективного количества инсектицидного полинуклеотида, такого как молекула дцРНК, на растение повышает устойчивость растений к заражению насекомым. В некоторых вариантах осуществления изобретения, применение инсектицидно-эффективного количества инсектицидного полинуклеотида в растениеводстве улучшает урожай (например, увеличивает биомассу, повышает семенную или плодовую продукцию, или увеличивает содержание масла, крахмала, сахара или белка) культурного растения, в сравнении с культурным растением не обработанным инсектицидным полинуклеотидом. В то время как не существует верхнего предела концентраций и доз инсектицидного полинуклеотида, как описано в данном документе, которые могут быть полезны в способах и композициях, представленных в данном документе, более низкие эффективные концентрации и дозировки, как правило, будут искать для эффективности и экономии. Неограничивающие варианты осуществления изобретения эффективных количеств инсектицидного полинуклеотида включают диапазон от около 10 нанограмм на миллилитр до около 100 микрограмм на миллилитр инсектицидного полинуклеотида в жидкой форме распыляемого на растение, или от около 10 микрограмм на акр до около 100 грамм на акр полинуклеотида применяемого к полевым растениям, или от около 0,001 до около 0,1 микрограмм на миллилитр полинуклеотида в искусственном питании для кормления насекомых. В то время как композиции, описанные в данном документе, наружно применяют на растение, концентрация может быть скорректирована с учетом объема спрея или обработки, применяемой к листьям растений или другим частям поверхности растения, таким как лепестки цветка, стебли, клубни, плоды, пыльники, пыльца, листья, корни или семена. В одном варианте осуществления изобретения, полезная обработка травянистых растений с использованием инсектицидных полинуклеотидов, как описано в данном документе, составляет около 1 наномоля (нмоль) полинуклеотида на растение, например, от около 0,05 дo 1 нмоль полинуклеотида на растение. Другие варианты осуществления изобретения для травянистых растений включают полезные диапазоны от около 0,05 до около 100 нмоль, или около 0,1 до около 20 нмоль, или около 1 нмоль до около 10 нмоль полинуклеотидов на растение. В определенных вариантах осуществления изобретения, применяется от около 40 до около 50 нмоль одноцепочечного полинуклеотида, как описано в данном документе. В определенных вариантах осуществления изобретения, применяется от около 0,5 нмоль до около 2 нмоль инсектицидного полинуклеотида, как описано в данном документе. В определенных вариантах осуществления изобретения, применяется композиция, содержащая около 0,5 до около 2,0 миллиграмм на миллилитр, или около 0,14 миллиграмм на миллилитр инсектицидного полинуклеотида (или одноцепочечного 21-членного), как описано в данном документе. В определенных вариантах осуществления изобретения, применяется композиция от около 0,5 до около 1,5 миллиграмм на миллилитр инсектицидного полинуклеотида, как описано в данном документе, от около 50 до около 200 или более нуклеотидов. В определенных вариантах осуществления изобретения, применяется от около 1 нмоль до около 5 нмоль инсектицидного полинуклеотида на растение, как описано в данном документе. В определенных вариантах реализации изобретения, полинуклеотидная композиция как наружно применяемая к растению содержит по меньшей мере один полинуклеотид, как описано в данном документе, в концентрации от около 0,01 дo около 10 миллиграмм на миллилитр, или около 0,05 дo около 2 миллиграмм на миллилитр, или около 0,1 дo около 2 миллиграмм на миллилитр. Очень большие растения, деревья или лианы, требуют соответственно больших количествах инсектицидных полинуклеотидов. При использовании длинных инсектицидных молекул полинуклеотида, которые могут быть переработаны в несколько олигонуклеотидов (например, множественные олигонуклеотиды, кодируемые одной молекулой рекомбинантной ДНК, как описано в данном документе), могут использоваться более низкие концентрации. Неограничивающие примеры эффективных режимов обработки инсектицидным полинуклеотидом включают обработку от между около 0,1 дo около 1 нмоль молекул полинуклеотида на растение, или между около 1 нмоль дo около 10 нмоль молекул полинуклеотида на растение, или между около 10 нмоль дo около 100 нмоль молекул полинуклеотида на растение.

Способы, вызывающие гибель насекомых, и способы борьбы с инвазией насекомых

[0033] Несколько вариантов осуществления изобретения относятся к способу вызывания гибели или задержки роста в насекомого, включающему предоставление в рационе насекомого по меньшей мере одного инсектицидного полинуклеотида, содержащего по меньшей мере один подавляющий элемент по существу идентичный или по существу комплементарный фрагменту последовательности гена-мишени насекомого, отличающийся тем, что последовательность гена мишени выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1-859, и при этом поедание инсектицидного полинуклеотида насекомым приводит к гибели или задержке развития насекомого. Эти способы могут быть использованы для борьбы с заражением насекомыми растения, например, для предотвращения или лечения заражения земляной блошкой сельскохозяйственного растения, особенно коммерчески важных видов Brassica.

[0034] В вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере один подавляющий элемент содержит последовательность около 95% до около 100% идентичную или комплементарную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или их фрагмента. В вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере один подавляющий элемент содержит 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью на 100% комплементарной фрагменту гена-мишени насекомого, причем ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей их SEQ ID NOs: 1-859. В вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере один подавляющий элемент содержит по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или ее фрагмента. В вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере один подавляющий элемент содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или ее фрагмента. В вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере один подавляющий элемент содержит последовательность от около 95% до около 100% идентичную или комплементарную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или их фрагмента.

[0035] В вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид предоставляется в микробной или растительной клетке, которая экспрессирует инсектицидный полинуклеотид, или в продукте микробной ферментации, или химически синтезируется. В вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит дцРНК. В вариантах осуществления изобретения, дцРНК является тупоконечной, или имеет "липкий" конец на по меньшей мере одном конце, или содержит по меньшей мере одну шпильку. В вариантах осуществления изобретения, дцРНК обеспечивается удобными, обычно используемыми методами. В вариантах осуществления изобретения, дцРНК является химически синтезированной, полученной путем экспрессии в микроорганизме, полученной путем экспрессии в растительной клетке, или полученной путем микробной ферментации. В вариантах осуществления изобретения, дцРНК изготавливается из встречающихся в природе рибонуклеотидов; в других вариантах осуществления изобретения, дцРНК является химически модифицированной.

[0036] В вариантах осуществления изобретения, способ полезен для вызывания смертности или задержки роста у насекомых, которые являются вредителями коммерчески важных сельскохозяйственных растений, таких как насекомые-вредители видов Brassica. В вариантах осуществления изобретения, насекомое представляет собой земляную блошку. В вариантах осуществления изобретения, насекомое представляет собой вид рода, выбранного из группы, состоящей из родов Altica, Anthobiodes, Aphthona, Aphthonaltica, Aphthonoides, Apteopeda, Argopistes, Argopus, Arrhenocoela, Batophila, Blepharida, Chaetocnema, Clitea, Crepidodera, Derocrepis, Dibolia, Disonycha, Epitrix, Hermipyxis, Hermaeophaga, Hespera, Hippuriphila, Horaia, Hyphasis, Lipromima, Liprus, Longitarsus, Luperomorpha, Lythraria, Manobia, Mantura, Meishania, Minota, Mniophila, Neicrepidodera, Nonarthra, Novofoudrasia, Ochrosis, Oedionychis, Oglobinia, Omeisphaera, Ophrida, Orestia, Paragopus, Pentamesa, Philopona, Phygasia, Phyllotreta, Podagrica, Podagricomela, Podontia, Pseudodera, Psylliodes, Sangariola, Sinaltica, Sphaeroderma, Systena, Trachyaphthona, Xuthea и Zipangia. В вариантах осуществления изобретения, насекомое представляет собой вид, выбранный из группы, состоящей из Altica ambiens (блошки ольхи), Altica canadensis (блошки земляной), Altica chalybaea (блошки виноградной), Altica prasina (блошки тополя), Altica rosae (блошки розы), Altica sylvia (блошки голубики), Altica ulmi (блошки вяза), Chaetocnema pulicaria (блошки кукурузной), Chaetocnema conofinis (блошки сладкого картофеля), Epitrix cucumeris (блошки картофельной), Systena blanda (бледнополосатой блошки), и Systena frontalis (рыжей блошки). В вариантах осуществления изобретения, насекомое представляет собой вид, выбранный из группы, состоящей из Phyllotreta armoraciae (блошки хреновой), Phyllotreta cruciferae (блошки канолы), Phyllotreta pusilla (западной черной блошки), Phyllotreta nemorum (блошки земляной светлоногой), Phyllotreta atra (блошки репы), Phyllotreta robusta (садовой блошки), Phyllotreta striolata (блошки полосатой), Phyllotreta undulata, Psylliodes chrysocephala, и Psylliodes punctulata (блошки конопляной).

[0037] Варианты осуществления способа включают те, в которых инсектицидный полинуклеотид сконструирован для подавления гена-мишени родо- или видоспецифическим способом, например, где (a) насекомое представляет собой вид Phyllotreta и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1-551; (b) насекомое представляет собой Phyllotreta atra (блошка репы) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1-296; (c) насекомое представляет собой Phyllotreta cruciferae (блошка канолы) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 297-532; (d) насекомое представляет собой Phyllotreta striolata (полосатая блошка) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 533-551; (e) насекомое представляет собой виды Psylliodes и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 552-859; или (f) насекомое представляет собой Psylliodes chrysocephala и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 552-859. Варианты осуществления способа также включают те, в которых (а) насекомое представляет собой вид Phyllotreta, а инсектицидный полинуклеотид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1410 или ее фрагмента; (b) насекомое представляет собой Phyllotreta atra (блошка репы), а инсектицидный полинуклеотид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1155 или ее фрагмента; (c) насекомое представляет собой Phyllotreta cruciferae (блошка канолы), а инсектицидный полинуклеотид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1156-1391, 1731-1972 и 1974 или ее фрагмента; (d) насекомое представляет собой Phyllotreta striolata (полосатая блошка), а инсектицидный полинуклеотид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1392-1410, 1973 и 1975 или ее фрагмента; (e) насекомое представляет собой вид Psylliodes, а инсектицидный полинуклеотид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1411-1718 или ее фрагмента; или (f) насекомое представляет собой Psylliodes chrysocephala, а инсектицидный полинуклеотид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1411-1718 или ее фрагмента.

[0038] Варианты осуществления способа включают те, в которых по меньшей мере один инсектицидный полинуклеотид представлен в композиции, содержащей инсектицидный полинуклеотид, причем композицию наносят на поверхность насекомого или на поверхность семян или растений, нуждающихся в защите от заражения насекомым. Варианты осуществления изобретения таких композиций, включают те, где композиция представляет собой твердое вещество, жидкость, порошок, суспензию, эмульсию, спрей, инкапсуляцию, микрогранулы, частицы носителей, пленки, матрицы, орошения почвы, или обработку семян. Во многих вариантах осуществления изобретения, композицию составляют в форме, которая поедается насекомым. В вариантах осуществления изобретения, композиция дополнительно содержит один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из агента-переносчика, поверхностно-активного вещества, кремнийорганики, полинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидного пестицида, фунгицида, антидота, удобрения, микроэлемента, аттрактанта насекомых, и регулятора роста насекомых. В вариантах осуществления изобретения, композиция дополнительно содержит по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous, инсектицидного белка Bacillus sphaericus, бактерии, которая продуцирует инсектицидный белок, энтомицидных видов бактерий, Lysinibacillus sphaericus (Bacillus sphaericus), Brevibacillus laterosporus (Bacillus laterosporus), видов Chromobacterium, Chromobacterium subtsugae, видов Paenibacillus, Paenibacillus lentimorbus и Paenibacillus popilliae.

[0039] Несколько вариантов осуществления изобретения относятся к способу борьбы с заражением насекомыми растения, включающему контактирование растения и/или насекомого, которое заражает растение, с инсектицидным полинуклеотидом, причем инсектицидный полинуклеотид содержит по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100%) комплементарности с фрагментом гена-мишени насекомого, выбранного из группа, состоящей из актина, Act5C, аргинин-киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpL13, RpL14, RpS21, RpS4, RpS14, Rpn2, Rpn3, Rpn7, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью на около 95% до около 100% комплементарной фрагменту последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1-859. В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит по меньшей мере один сегмент из 21 смежных нуклеотидов с последовательностью на 100% комплементарной фрагменту последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1-859. В этом контексте ʺконтролированиеʺ включает стимулирование физиологических или поведенческих изменений у насекомого (взрослого, или личинки. или нимфы) таких как, но без ограничения, отставание в росте, повышенная смертность, снижение репродуктивного потенциала, уменьшение или прекращение пищевого поведения или движения, или уменьшение или прекращение стадии развития метаморфоза. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1155 или ее фрагмента, или его комплемента.

[0040] В различных вариантах осуществления изобретения, насекомое представляет собой земляную блошку, например, вид рода, выбранного из группы, состоящей из родов Altica, Anthobiodes, Aphthona, Aphthonaltica, Aphthonoides, Apteopeda, Argopistes, Argopus, Arrhenocoela, Batophila, Blepharida, Chaetocnema, Clitea, Crepidodera, Derocrepis, Dibolia, Disonycha, Epitrix, Hermipyxis, Hermaeophaga, Hespera, Hippuriphila, Horaia, Hyphasis, Lipromima, Liprus, Longitarsus, Luperomorpha, Lythraria, Manobia, Mantura, Meishania, Minota, Mniophila, Neicrepidodera, Nonarthra, Novofoudrasia, Ochrosis, Oedionychis, Oglobinia, Omeisphaera, Ophrida, Orestia, Paragopus, Pentamesa, Philopona, Phygasia, Phyllotreta, Podagrica, Podagricomela, Podontia, Pseudodera, Psylliodes, Sangariola, Sinaltica, Sphaeroderma, Systena, Trachyaphthona, Xuthea и Zipangia. В некоторых вариантах осуществления изобретения, насекомое выбирают из группы, состоящей из Altica ambiens (блошки ольхи), Altica canadensis (блошки земляной), Altica chalybaea (блошки виноградной), Altica prasina (блошки тополя), Altica rosae (блошки розы), Altica sylvia (блошки голубики), Altica ulmi (блошки вяза), Chaetocnema pulicaria (блошки кукурузной), Chaetocnema conofinis (блошки сладкого картофеля), Epitrix cucumeris (блошки картофельной), Systena blanda (бледнополосатой блошки), и Systena frontalis (рыжей блошки). В некоторых вариантах осуществления изобретения, насекомое выбирают из группы, состоящей из Phyllotreta armoraciae (блошки хреновой), Phyllotreta cruciferae (блошки канолы), Phyllotreta pusilla (западной черной блошки), Phyllotreta nemorum (блошки земляной светлоногой), Phyllotreta atra (блошки репы), Phyllotreta robusta (садовой блошки), Phyllotreta striolata (блошки полосатой), Phyllotreta undulata, Psylliodes chrysocephala, и Psylliodes punctulata (блошки конопляной).

[0041] Растением может быть любое растение, которое подвержено заражению насекомым, которые могут контролироваться инсектицидными полинуклеотидами, описанными в данном документе. Растения, представляющие особый интерес, включают коммерчески значимые растения, включая пропашные культуры растений, овощи и фрукты, а также другие растения сельскохозяйственного или декоративного использования. Примеры подходящих растений представлены под рубрикой ʺРастенияʺ. Способ особенно полезен для борьбы с заражением насекомыми у декоративного растения или сельскохозяйственного растения. Различные варианты осуществления способа включают те, в которых растение представляет собой растение семейства Brassicaceae, включая виды Brassica, выбранные из группы, состоящей из B. napus, B. juncea, B. carinata, B. rapa, B. oleracea, B. rupestris, B. septiceps, B. nigra, B. narinosa, B. perviridus, B. tournefortii, и B. fructiculosa. В других вариантах осуществления изобретения, растение выбирают из группы, состоящей из Glycine max, Linum usitatissimum, Zea mays, Carthamus tinctorius, Helianthus annuus, Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana, Betholettia excelsa, Ricinus communis, Cocus nucifera, Coriandrum sativum, Gossypium spp., Arachis hypogaea, Simmondsia chinensis, Solanum tuberosum, Elaeis guineensis, Olea europaea, Oryza sativa, Cucurbita maxim, Hordeum vulgare и Triticum aestivum.

[0042] Способы включают те, которые разработаны для конкретных вредителей земляных блошек для данного растения, например, где растение представляет собой растение картофеля, а насекомым является Epitrix cucumeris (блошка картофельная). В некоторых вариантах осуществления изобретения, конкретные гены-мишени идентифицируются как мишени для РНКи-опосредованного контроля у данного вида насекомых. Различные варианты осуществления способа включают те, в которых (a) насекомое представляет собой Phyllotreta atra (блошка репы) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1-296; (b) насекомое представляет собой Phyllotreta cruciferae (блошка канолы) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 297-532; (с) насекомое представляет собой Phyllotreta striolata (полосатая блошка) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 533-551; или (d) насекомое представляет собой Psylliodes chrysocephala и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 552-859.

[0043] В некоторых вариантах осуществления изобретения, определенные инсектицидные полинуклеотиды разработаны для конкретных генов-мишеней данного вида насекомых. Варианты осуществления способа включают те, в которых (а) насекомое представляет собой Phyllotreta atra (блошка репы), а инсектицидный полинуклеотид содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1155 или ее фрагмента; (b) насекомое представляет собой Phyllotreta cruciferae (блошка канолы), а инсектицидный полинуклеотид содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1156-1391, 1731-1972 и 1974 или ее фрагмента; (с) насекомое представляет собой Phyllotreta striolata (полосатая блошка), а инсектицидный полинуклеотид содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1392-1410, 1973 и 1975 или ее фрагмента; или (d) насекомое представляет собой Psylliodes chrysocephala, а инсектицидный полинуклеотид содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1411-1718 или ее фрагмента.

[0044] Способ включает контактирование насекомого, такого как блошка, с инсектицидным полинуклеотидом. Варианты осуществления изобретения включают контактирование через пероральное введение насекомому, или не пероральное введение насекомому, или комбинацию перорального и не перорального введения насекомому. Варианты осуществления изобретения включают контактирование насекомых во взрослой стадии, или в личиночной стадии, или в стадии яйца. В некоторых вариантах осуществления изобретения, контактирование приводит к гибели (смерти) или задержки роста (отставание в росте, или снижение или прекращение стадии развития метаморфоза) насекомого, тем самым предотвращая или вылечивая заражение растения насекомым. В некоторых вариантах осуществления изобретения, контактирование приводит к стимулированию физиологических или поведенческих изменений у насекомого (взрослого, или личинки, или нимфы), что приводит к уменьшенной способности насекомого заражать или повреждать растение, например, снижение репродуктивного потенциала, уменьшение или прекращение пищевого поведения или движения.

[0045] В некоторых вариантах осуществления способа контактирование включает в себя применение композиции, содержащей один или более инсектицидных полинуклеотидов, к поверхности насекомого или к поверхности растения, зараженного насекомым. Композиция может содержать или быть в форме твердого вещества, жидкости, порошка, суспензии, эмульсии, спрея, инкапсуляции, микрогранул, частиц носителей, пленки, матрицы, орошения почвы, или обработки семян. В вариантах осуществления изобретения, контактирование включает предоставление инсектицидного полинуклеотида в композиции, которая дополнительно включает один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из агента-переносчика, поверхностно-активного вещества, кремнийорганики, полинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидного пестицида, фунгицида, антидота, аттрактанта насекомых, и регулятора роста насекомых. В некоторых вариантах осуществления изобретения, контактирование включает в себя предоставление одного или более инсектицидных полинуклеотидов в композиции, которая дополнительно содержит по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous, инсектицидного белка Bacillus sphaericus, бактерии, которая продуцирует инсектицидный белок, энтомицидных видов бактерий, Lysinibacillus sphaericus (Bacillus sphaericus), Brevibacillus laterosporus (Bacillus laterosporus), видов Chromobacterium, Chromobacterium subtsugae, видов Paenibacillus, Paenibacillus lentimorbus и Paenibacillus popilliae.

[0046] В некоторых вариантах осуществления способа, контактирование включает предоставление одного или более инсектицидных полинуклеотидов в композиции, которая поедается насекомым, такой как жидкость, эмульсия или порошок, применяемые к растению на котором питается насекомое или в виде приманки. Такие композиции могут дополнительно содержат один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из агента-переносчика, поверхностно-активного вещества, кремнийорганики, полинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидного пестицида, фунгицида, антидота, аттрактанта насекомых, и регулятора роста насекомых. Такие композиции могут дополнительно содержать по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous, инсектицидного белка Bacillus sphaericus, бактерии, которая продуцирует инсектицидный белок, энтомицидных видов бактерий, Lysinibacillus sphaericus (Bacillus sphaericus), Brevibacillus laterosporus (Bacillus laterosporus), видов Chromobacterium, Chromobacterium subtsugae, видов Paenibacillus, Paenibacillus lentimorbus и Paenibacillus popilliae. В вариантах осуществления изобретения, комбинация инсектицидного полинуклеотида и неполинуклеотидного пестицидного агента, обеспечивает уровень контроля над насекомыми, который больше, чем сумма эффектов компонентов инсектицидного полинуклеотида и неполинуклеотидного пестицидного агента, если они тестируются отдельно.

Инсектицидные Композиции

[0047] Несколько вариантов осуществления изобретения относятся к инсектицидной композиции, содержащей инсектицидно-эффективное количество инсектицидного полинуклеотида, такого как оцРНК, дцРНК, оцДНК, дцДНК или гибридная молекула РНК/ДНК, причем инсектицидный полинуклеотид содержит по меньшей мере 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100%) комплементарности с фрагментом гена-мишени насекомого, выбранного из группы, состоящей из актина, Act5C, аргинин-киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpL13, RpL14, RpS21, RpS4, RpS14, Rpn2, Rpn3, Rpn7, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит по меньшей мере 18 или более смежных нуклеотидов, имеющих около 95% до около 100% комплементарности фрагменту последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1-859. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит по меньшей мере 21 смежный нуклеотид, имеющий 100% комплементарность с фрагментом последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. В вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или ее фрагмента.

[0048] В различных вариантах осуществления инсектицидной композиции, насекомое представляет собой земляную блошку, например, вид рода, выбранного из группы, состоящей из родов Altica, Anthobiodes, Aphthona, Aphthonaltica, Aphthonoides, Apteopeda, Argopistes, Argopus, Arrhenocoela, Batophila, Blepharida, Chaetocnema, Clitea, Crepidodera, Derocrepis, Dibolia, Disonycha, Epitrix, Hermipyxis, Hermaeophaga, Hespera, Hippuriphila, Horaia, Hyphasis, Lipromima, Liprus, Longitarsus, Luperomorpha, Lythraria, Manobia, Mantura, Meishania, Minota, Mniophila, Neicrepidodera, Nonarthra, Novofoudrasia, Ochrosis, Oedionychis, Oglobinia, Omeisphaera, Ophrida, Orestia, Paragopus, Pentamesa, Philopona, Phygasia, Phyllotreta, Podagrica, Podagricomela, Podontia, Pseudodera, Psylliodes, Sangariola, Sinaltica, Sphaeroderma, Systena, Trachyaphthona, Xuthea и Zipangia. В некоторых вариантах осуществления изобретения, насекомое выбирают из группы, состоящей из Altica ambiens (блошки ольхи), Altica canadensis (блошки земляной), Altica chalybaea (блошки виноградной), Altica prasina (блошки тополя), Altica rosae (блошки розы), Altica sylvia (блошки голубики), Altica ulmi (блошки вяза), Chaetocnema pulicaria (блошки кукурузной), Chaetocnema conofinis (блошки сладкого картофеля), Epitrix cucumeris (блошки картофельной), Systena blanda (бледнополосатой блошки), и Systena frontalis (рыжей блошки). В некоторых вариантах осуществления изобретения, насекомое выбирают из группы, состоящей из Phyllotreta armoraciae (блошки хреновой), Phyllotreta cruciferae (блошки канолы), Phyllotreta pusilla (западной черной блошки), Phyllotreta nemorum (блошки земляной светлоногой), Phyllotreta atra (блошки репы), Phyllotreta robusta (садовой блошки), Phyllotreta striolata (блошки полосатой), Phyllotreta undulata, Psylliodes chrysocephala, и Psylliodes punctulata (блошки конопляной).

[0049] Инсектицидная композиция применима для обработки растения или участка в непосредственной близости от растения для обеспечения защиты или лечения от насекомых, особенно блошек. Связанный аспект представляет собой растение, обработанное инсектицидной композицией, как описано в данном документе, или семена обработанных растений, отличающиеся тем, что растение проявляет повышенную устойчивость к насекомым (например, улучшенная устойчивость к земляным блошкам). В некоторых вариантах осуществления изобретения, растение, проявляющее улучшенную стойкость к насекомым, характеризуется улучшенным урожаем, по сравнению с растением, не обработанным инсектицидной композицией. В одном варианте осуществления изобретения, урожай (биомасса семян масличных культур или содержание масла) канолы или растений масличного рапса улучшается путем применения инсектицидно-эффективного количества инсектицидного полинуклеотида, содержащего один или более генов, идентифицированных у Phyllotreta cruciferae (блошки канолы); в конкретных вариантах осуществления изобретения, ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 297-532. Растением может быть любое растение, которое подвержено заражению насекомым, которые могут контролироваться с помощью инсектицидной композиции. Растения, представляющие особый интерес, включают коммерчески значимые растения, включая пропашные культуры растений, овощи и фрукты, а также другие растения сельскохозяйственного или декоративного использования. Примеры подходящих растений представлены под рубрикой ʺРастенияʺ. Способ особенно полезен для борьбы с заражением насекомыми у декоративного растения или сельскохозяйственного растения. Различные варианты осуществления включают те, в которых растение представляет собой растение семейства Brassicaceae, включая виды Brassica, выбранные из группы, состоящей из B. napus, B. juncea, B. carinata, B. rapa, B. oleracea, B. rupestris, B. septiceps, B. nigra, B. narinosa, B. perviridus, B. tournefortii, и B. fructiculosa. В других вариантах осуществления изобретения, растение выбирают из группы, состоящей из Glycine max, Linum usitatissimum, Zea mays, Carthamus tinctorius, Helianthus annuus, Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana, Betholettia excelsa, Ricinus communis, Cocus nucifera, Coriandrum sativum, Gossypium spp., Arachis hypogaea, Simmondsia chinensis, Solanum tuberosum, Elaeis guineensis, Olea europaea, Oryza sativa, Cucurbita maxim, Hordeum vulgare и Triticum aestivum.

[0050] В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидная композиция разработана для конкретных вредителей земляных блошек для данного растения, например, где растение представляет собой растение картофеля, а насекомым является Epitrix cucumeris (блошка картофельная). В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидная композиция разработана для конкретных генов-мишеней у данного вида насекомых. Конкретные варианты осуществления инсектицидной композиции включают те, в которых (a) насекомое представляет собой Phyllotreta atra (блошка репы) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1-296; (b) насекомое представляет собой Phyllotreta cruciferae (блошка канолы) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 297-532; (с) насекомое представляет собой Phyllotreta striolata (полосатая блошка) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 533-551; или (d) насекомое представляет собой Psylliodes chrysocephala и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 552-859.

[0051] В некоторых вариантах осуществления изобретения молекула инсектицидного полинуклеотида, используемая в этом способе, предоставляется в виде изолированной молекулы инсектицидного полинуклеотида (не является частью экспрессируемого конструкта, например, не содержит дополнительных элементов, таких как промотор или последовательности терминатора). Такие молекулы инсектицидных полинуклеотидов могут быть относительно короткими, такими как одно- или двухцепочечные молекулы РНК, ДНК или гибридные молекулы РНК/ДНК от между около 18 до около 300 или между около 50 до около 500 нуклеотидов (для одноцепочечных полинуклеотидов) или между около 18 до около 300 или между около 50 до около 500 пар оснований (для двухцепочечных полинуклеотидов). В вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид представляет собой дцРНК, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или ее фрагмента.

[0052] В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидная композиция находится в форме, выбранной из группы, состоящей из твердого вещества, жидкости, порошка, суспензии, эмульсии, спрея, инкапсуляции, микрогранул, частиц носителей, пленки, матрицы, орошения почвы, пищи насекомых или приманки насекомых, и обработки семян. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидная композиция представлена в форме, которая поедается насекомым, такой как жидкость, эмульсия или порошок, применяемые к растению на котором питается насекомое или в виде приманки. Инсектицидные композиции могут дополнительно содержат один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из агента-переносчика, поверхностно-активного вещества, кремнийорганики, полинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидного пестицида, фунгицида, антидота, аттрактанта насекомых, и регулятора роста насекомых. Инсектицидные композиции могут дополнительно содержать по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous, инсектицидного белка Bacillus sphaericus, бактерии, которая продуцирует инсектицидный белок, энтомицидных видов бактерий, Lysinibacillus sphaericus (Bacillus sphaericus), Brevibacillus laterosporus (Bacillus laterosporus), видов Chromobacterium, Chromobacterium subtsugae, видов Paenibacillus, Paenibacillus lentimorbus и Paenibacillus popilliae. В некоторых вариантах осуществления изобретения, комбинация молекулы инсектицидного полинуклеотида и неполинуклеотидного пестицидного агента, обеспечивает уровень контроля над насекомыми, который больше, чем сумма эффектов молекулы инсектицидного полинуклеотида и неполинуклеотидного пестицидного агента, если они тестируются отдельно.

[0053] Варианты реализации композиций дополнительно содержат соответствующие наклейки и смачиватели, необходимые для эффективного лиственного покрытия, а также УФ-протекторы для защиты инсектицидных полинуклеотидов, такие как дцРНК от УФ-повреждений. Такие добавки обычно используются в биоинсектицидной промышленности и известны специалистам в данной области техники. Композиции для нанесения на грунт могут содержать гранулированные составы, которые служат приманкой для личинок насекомых. Варианты осуществления изобретения включают агент-переносчик, поверхностно-активное вещество, кремнийорганику, полинуклеотидную гербицидную молекулу, неполинуклеотидную гербицидную молекулу, неполинуклеотидный пестицид, фунгицид, антидот, аттрактант насекомых, и регулятор роста насекомых.

[0054] Варианты реализации композиций могут включать ʺагент переносаʺ: агент, который в сочетании с композицией, содержащей инсектицидный полинуклеотид, как описано в данном документе, который наружно применяют на поверхность организма, давая возможность полинуклеотиду проникать в клетки этого организма. Такие агенты переносчики могут быть включены как часть композиции, содержащей инсектицидный полинуклеотид, как описано в данном документе, или могут быть применены до, одновременно с или после нанесения композиции, содержащей инсектицидный полинуклеотид, как описано в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения, агент переноса представляет собой агент, который улучшает поглощение инсектицидного полинуклеотида насекомым. В некоторых вариантах осуществления изобретения, агентом переноса является агент, который находится на поверхности растительной ткани, например, семян, листьев, стеблей, корней, цветов, или плодов, для проникновения полинуклеотида в клетки растений. В некоторых вариантах осуществления изобретения, агент переноса обеспечивает путь для полинуклеотида через кутикуло-восковые барьеры, устьица, и/или клеточную стенку или мембранные барьеры в клетки растений.

[0055] Подходящие агенты переноса включают в себя агенты, которые повышают проницаемость внешней части организма, или которые увеличивают проницаемость клеток организма для полинуклеотидов. Подходящие агенты переноса включают в себя химический агент, или физический агент, или их сочетания. Химические агенты для создания необходимых условий или переноса включают (a) поверхностно-активные вещества, (b) органический растворитель, или водный раствор или водную смесь органических растворителей, (c) окисляющие агенты, (d) кислоты, (e) основания, (f) масла, (g) ферменты, или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления изобретения, применение инсектицидного полинуклеотида и агента переноса необязательно включает один или более этапов инкубации, стадию нейтрализации (например, для нейтрализации кислоты, основания или окисляющего агента или для инактивации фермента), стадию отмывания, или их комбинации. Подходящий агент переноса может быть в форме эмульсии, обратной эмульсии, липосомы, или другой мицелло-подобной композиции, или может вызывать переход полинуклеотидной композиции в форму эмульсии, обратной эмульсии, липосомы, или другой мицелло-подобной композиции. Варианты реализации агентов переноса включают противоионы или другие молекулы, которые, как известно, ассоциируются с молекулами нуклеиновых кислот, например, катионные липиды, неорганические ионы аммония, ионы алкил аммония, ионы лития, полиамины такие как спермин, спермидин или путресцин, и другие катионы. Варианты реализации агентов переноса включают органические растворители, такие как ДМСО, ДМФ, пиридин, N-пирролидин, гексаметилфосфорамид, ацетонитрил, диоксан, полипропилен гликоль или другие растворители смешиваемые с водой или растворяющие фосфонуклеотиды в неводных системах (такие как, используются в синтетических реакциях). Варианты осуществления агентов переноса включают природные или синтетические масла с поверхностно-активными веществами или эмульгаторами или без них, например, масла из растительных источников, растительных масел (таких как те, которые перечислены в 9th Compendium of Herbicide Adjuvants, в открытом доступе в режиме онлайн на herbicide.adjuvants.com), парафиновых масел, эфиров жирной кислоты и многоатомного спирта, или масел с короткими цепочками молекул, модифицированных амидами или полиаминами, такими как полиэтиленимин или N-пирролидин.

[0056] Варианты реализации агентов переноса включают кремнийорганические препараты. Например, подходящий агент переноса представляет собой кремнийорганический препарат, который коммерчески доступен как SILWET L-77® бренд поверхностно-активного вещества, имеющего номер CAS 27306-78-1 и номер EPA: CAL.REG.NO. 5905-50073-AA, и в настоящее время доступен в Momentive Performance Materials, Олбани, Нью-Йорк. В вариантах осуществления изобретения, где кремнийорганический препарат SILWET L-77® с поверхностно-активным веществом используется в качестве агента переноса в форме обработки распылением (применяется перед, одновременно с, или после нанесения композиции, содержащей инсектицидный полинуклеотид, как описано в данном документе) листьев растений или других растительных поверхностей, свежеприготовленные концентрации в диапазоне от около 0,015 до около 2 мас.% (мас.%) (например, около 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,5 массового процента) эффективны при подготовке листа или другой поверхности растения для переноса полинуклеотида, как описано в данном документе, в растительные клетки через местное нанесение на поверхность. Один вариант осуществления изобретения включает композицию, которая содержит полинуклеотид и агент переноса, включающий кремнийорганический препарат, такой как Silwet L-77, в диапазоне от около 0,015 до около 2 мас.% (мас.%) (например, около 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,5 мас.%). Один вариант реализации изобретения включает композицию, которая содержит полинуклеотид и агент переноса, содержащий SILWET L-77® бренд поверхностно-активного вещества в диапазоне от около 0,3 до около 1 мас.% (мас.%) или около 0,5 до около 1% по массе (мас.%).

[0057] Кремнийорганические соединения, используемые как агенты переноса для использования в композициях и способах, описанных в данном документе, включают, но без ограничения, соединения, которые включают: (a) головную группу трисилоксана, которая ковалентно связана с, (b) алкильный линкер, включая, но без ограничения, n-пропил линкер, который ковалентно связан с, (c) цепь полигликоля, которая ковалентно связана с, (d) терминальной группой. Головные группы трисилоксана таких кремнийорганических соединений включают, но без ограничения, гептаметилтрисилоксан. Алкильные линкеры могут включать, но без ограничения, n-пропил линкер. Полигликолевые цепи включают, но без ограничения, полиэтиленгликоль или полипропиленгликоль. Полигликолевые цепи могут включать смесь, которая обеспечивает среднюю длину цепи ʺnʺ около ʺ7,5ʺ. В определенных вариантах осуществления изобретения, средняя длина цепи ʺnʺ может варьировать от около 5 дo около 14. Терминальные группы могут включать, но без ограничения, алкильные группы, такие как метильная группа. Кремнийорганические соединения, используемые как агенты переноса для использования в композициях и способах, описанных в данном документе, включают, но без ограничения, трисилоксан этоксилатных поверхностно-активных веществ или полиалкиленоксид модифицированный гептаметил трисилоксаном. Пример агента переноса для использования в композициях и способах, описанных в данном документе, представляет собой Соединение I:

(Соединение I: полиалкиленоксид гептаметилтрисилоксан, среднее n=7,5).

[0058] Кремнийорганические соединения, используемые в качестве агентов переноса для использования в композициях и способах, описанных в данных документах, используются, например, в виде свежеприготовленных концентраций в диапазоне от около 0,015 до около 2 мас.% (мас.%) (например, около 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,5 мас.%).

[0059] Варианты реализации агентов переноса включают одну или более солей, таких как хлорид аммония, тетрабутилфосфонил бромид, и сульфат аммония, представленные в или используемые в композиции, содержащей инсектицидный полинуклеотид, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения, хлорид аммония, тетрабутилфосфонил бромид, и/или сульфат аммония используют в концентрации от около 0,5% до около 5% (м./об.), или около 1% до около 3% (м./об.), или около 2% (м./об.). В некоторых вариантах осуществления изобретения, композиция, содержащая инсектицидный полинуклеотид, содержит соль аммония в концентрации большей или равной 300 миллимолям. В определенных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая инсектицидный полинуклеотид, содержит кремнийорганический агент переноса в концентрации около 0,015 до около 2 процентов по массе (массовый процент), а также сульфат аммония в концентрации от около 80 до около 1200 миллимолей или около 150 миллимолей до около 600 миллимолей.

[0060] Варианты реализации агентов переноса включают фосфатные соли. Фосфатные соли используемые в композиции, содержащей инсектицидный полинуклеотид, включают, но без ограничения, кальциевые, магниевые, калиевые, или фосфат-натриевые соли. В определенных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая инсектицидный полинуклеотид, содержит фосфатную соль в концентрации по меньшей мере около 5 миллимолей, по меньшей мере около 10 миллимолей, по меньшей мере около 20 миллимолей. В определенных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая инсектицидный полинуклеотид, содержит фосфатную соль в диапазоне от около 1 миллимоля до около 25 миллимолей или в диапазоне от около 5 миллимолей до около 25 миллимолей. В определенных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая инсектицидный полинуклеотид, содержит фосфат натрия в концентрации по меньшей мере около 5 миллимолей, по меньшей мере около 10 миллимолей, по меньшей мере около 20 миллимолей. В определенных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая инсектицидный полинуклеотид, содержит фосфат натрия в концентрации от около 5 миллимолей, около 10 миллимолей, или около 20 миллимолей. В определенных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая инсектицидный полинуклеотид, содержит соль фосфата натрия в диапазоне от около 1 миллимоля до около 25 миллимолей или в диапазоне от около 5 миллимолей до около 25 миллимолей. В определенных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая инсектицидный полинуклеотид, содержит соль фосфата натрия в диапазоне от около 10 миллимоля до около 160 миллимолей или в диапазоне от около 20 миллимолей до около 40 миллимолей. В определенных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая инсектицидный полинуклеотид, содержит натрий-фосфатный буфер при рН около 6,8.

[0061] Варианты реализации агентов переноса включают поверхностно-активные вещества и/или эффективные молекулы, содержащиеся в них. Поверхностно-активные вещества и/или эффективные молекулы, содержащиеся в них, включают, но без ограничения, натриевые или литиевые соли жирных кислот (таких как талловый жир или амины или фосфолипиды таллового жира) и кремнийорганические поверхностно-активные вещества. В определенных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая инсектицидный полинуклеотид, составлена из противоионов или других молекул, которые, как известно, связываются с молекулами нуклеиновых кислот. Не ограничивающие примеры включают, ионы тетраалкил аммония, ионы триалкил аммония, ионы сульфония, ионы лития, и полиамины, такие как спермин, спермидин или путресцин. В некоторых вариантах осуществления изобретения, композиция, содержащая инсектицидный полинуклеотид, составлена с использованием не полинуклеотидного гербицида, например, глифосата, ауксин-подобных гербицидов бензойной кислоты, включающих дикамбу, хлорамбен и ТВА, глуфосинат, ауксин-подобных гербицидов, включающих гербицид фенокси карбоксильной кислоты, гербицид пиридин карбоксильной кислоты, гербицид хинолин карбоксильной кислоты, гербицид пиримидин карбоксильной кислоты, и беназолин-этиловый гербицид, сульфонилмочевину, имидазолиноны, бромоксинил, делапон, циклохезанедион, ингибиторы протопорфириноген-оксидазы, и 4-гидроксифенил-пируват-диоксигеназо ингибирующих гербицидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, композиция, содержащая инсектицидный полинуклеотид, составлена с использованием не полинуклеотидного пестицида, например пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous, и инсектицидного белка Bacillus sphaericus.

Способы обеспечения растений с улучшенной устойчивостью к насекомым

[0062] Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к способу обеспечения растения, имеющего повышенную устойчивость к насекомому, включающему экспрессию в растении рекомбинантного ДНК конструкта, причем рекомбинантный ДНК конструкт, содержит ДНК, кодирующую инсектицидный полинуклеотид, содержащую последовательность по меньшей мере из 21 смежных нуклеотидов, которые по существу идентичны или по существу комплементарны фрагменту по меньшей мере одного гена-мишени насекомого, выбранного из группы, состоящей из актина, Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpL13, RpL14, RpS21, RpS4, RpS14, Rpn2, Rpn3, Rpn7, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VАТФaзы E, VАТФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФазы A), Vha68-2 (V-ATФазы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах осуществления изобретения, ДНК конструкт содержит ДНК, кодирующую инсектицидный полинуклеотид, содержащий последовательность по существу идентичную или по существу комплементарную фрагменту последовательности ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1-859. Несколько вариантов осуществления изобретения относятся к растению, полученному с помощью такого способа. В некоторых вариантах осуществления изобретения, конструкция ДНК содержит ДНК, кодирующую инсектицидный полинуклеотид, имеющий от около 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100%) идентичности или комплементарность по меньшей мере с 21 смежными нуклеотидами последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или ее фрагмента.

[0063] В некоторых вариантах осуществления изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт дополнительно содержит гетерологичный промотор функционально связанный с ДНК, кодирующей инсектицидный полинуклеотид, причем гетерологичный промотор является функционирующим в растительной клетке. ʺГетерологичныйʺ относится к последовательностям нуклеиновой кислоты, которые обычно функционально не связаны в нативном или встречающемся в природе геноме; с помощью ʺгетерологичного промотораʺ означает, что промотор изначально функционально не связан с ДНК, кодирующей инсектицидный полинуклеотид. Промоторы, функционирующие в растительной клетке, содержат те, которые перечислены под заголовком ʺПромоторыʺ.

[0064] В некоторых вариантах осуществления изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт экспрессируется в растении путем трансгенной экспрессии или транзиторной экспрессии. В некоторых вариантах осуществления изобретения, способ дополнительно включает экспрессию в растении по меньшей мере одного пестицидного агента, выбранного из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous, инсектицидного белка Bacillus sphaericus, бактерии, которая продуцирует инсектицидный белок, энтомицидных видов бактерий, Lysinibacillus sphaericus (Bacillus sphaericus), Brevibacillus laterosporus (Bacillus laterosporus), видов Chromobacterium, Chromobacterium subtsugae, видов Paenibacillus, Paenibacillus lentimorbus и Paenibacillus popilliae. Пестицидный агент может быть экспрессирован из того же рекомбинантного ДНК конструкта, который содержит ДНК, кодирующую инсектицидный полинуклеотид, или из другого рекомбинантного ДНК конструкта.

[0065] Связанный аспект представляет собой растение, обладающее повышенной устойчивостью к насекомому (например, повышенной стойкостью к блошкам), или семена такого растения, причем растение предусматривается способом, включающим экспрессию в растении рекомбинантного ДНК конструкта, причем рекомбинантный ДНК конструкт, содержит ДНК, кодирующую инсектицидный полинуклеотид, имеющий последовательность, по существу идентичную или по существу комплементарную фрагменту по меньшей мере одного гена-мишени насекомого, причем ген-мишень является выбранным из группы, состоящей из актина, Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpL13, RpL14, RpS21, RpS4, RpS14, Rpn2, Rpn3, Rpn7, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VАТФaзы E, VАТФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФазы A), Vha68-2 (V-ATФазы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах осуществления изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт содержит ДНК, кодирующую инсектицидный полинуклеотид, содержащий последовательность по существу идентичную или по существу комплементарную фрагменту последовательности ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1-859. В некоторых вариантах осуществления изобретения, растение, проявляющее улучшенную стойкость к насекомым, характеризуется улучшенным урожаем, по сравнению с растением не экспрессирующим рекомбинантный ДНК конструкт. В варианте осуществления изобретения, урожай (биомасса семян масличных культур или содержание масла) канолы или растений масличного рапса улучшается путем экспрессии в растениях канолы или масличного рапса инсектицидного полинуклеотида, такого как молекула дцРНК, нацеливающего один или более генов Phyllotreta cruciferae (блошки канолы), например, где ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 297-532. Несколько вариантов осуществления изобретения относятся к плоду, семенам, или частям размножения растения, предусмотренные этим способом, и проявляющие повышенную устойчивость к насекомым. Растением может быть любое растение, которое подвержено заражению насекомым, которое может контролироваться с помощью экспрессии у растения рекомбинантного ДНК конструкта соответственно этому способу. Растения, представляющие особый интерес, включают коммерчески значимые растения, включая пропашные культуры растений, овощи и фрукты, а также другие растения сельскохозяйственного или декоративного использования. Примеры подходящих растений представлены под рубрикой ʺРастенияʺ. Способ особенно полезен для создания декоративного растения или сельскохозяйственного растения с повышенной устойчивостью к блошкам. Различные варианты осуществления способа включают те, в которых растение представляет собой растение семейства Brassicaceae, включая виды Brassica, выбранные из группы, состоящей из B. napus, B. juncea, B. carinata, B. rapa, B. oleracea, B. rupestris, B. septiceps, B. nigra, B. narinosa, B. perviridus, B. tournefortii, и B. fructiculosa. В других вариантах осуществления изобретения, растение выбирают из группы, состоящей из Glycine max, Linum usitatissimum, Zea mays, Carthamus tinctorius, Helianthus annuus, Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana, Betholettia excelsa, Ricinus communis, Cocus nucifera, Coriandrum sativum, Gossypium spp., Arachis hypogaea, Simmondsia chinensis, Solanum tuberosum, Elaeis guineensis, Olea europaea, Oryza sativa, Cucurbita maxim, Hordeum vulgare и Triticum aestivum. В варианте осуществления способ предусматривает растение картофеля с повышенной устойчивостью к Epitrix cucumeris (картофельной блошке).

[0066] Варианты осуществления способа обеспечивают растение, обладающее повышенной устойчивостью к одному или более видам земляных блошек, например, вид рода, выбранного из группы, состоящей из родов Altica, Anthobiodes, Aphthona, Aphthonaltica, Aphthonoides, Apteopeda, Argopistes, Argopus, Arrhenocoela, Batophila, Blepharida, Chaetocnema, Clitea, Crepidodera, Derocrepis, Dibolia, Disonycha, Epitrix, Hermipyxis, Hermaeophaga, Hespera, Hippuriphila, Horaia, Hyphasis, Lipromima, Liprus, Longitarsus, Luperomorpha, Lythraria, Manobia, Mantura, Meishania, Minota, Mniophila, Neicrepidodera, Nonarthra, Novofoudrasia, Ochrosis, Oedionychis, Oglobinia, Omeisphaera, Ophrida, Orestia, Paragopus, Pentamesa, Philopona, Phygasia, Phyllotreta, Podagrica, Podagricomela, Podontia, Pseudodera, Psylliodes, Sangariola, Sinaltica, Sphaeroderma, Systena, Trachyaphthona, Xuthea и Zipangia. В вариантах осуществления изобретения, насекомое выбирают из группы, состоящей из Altica ambiens (блошки ольхи), Altica canadensis (блошки земляной), Altica chalybaea (блошки виноградной), Altica prasina (блошки тополя), Altica rosae (блошки розы), Altica sylvia (блошки голубики), Altica ulmi (блошки вяза), Chaetocnema pulicaria (блошки кукурузной), Chaetocnema conofinis (блошки сладкого картофеля), Epitrix cucumeris (блошки картофельной), Systena blanda (бледнополосатой блошки), и Systena frontalis (рыжей блошки). В вариантах осуществления изобретения, способ обеспечивает растение, имеющее улучшенную устойчивость к насекомому, выбранному из группы, состоящей из Phyllotreta armoraciae (блошки хреновой), Phyllotreta cruciferae (блошки канолы), Phyllotreta pusilla (западной черной блошки), Phyllotreta nemorum (блошки земляной светлоногой), Phyllotreta atra (блошки репы), Phyllotreta robusta (садовой блошки), Phyllotreta striolata (блошки полосатой), Phyllotreta undulata, Psylliodes chrysocephala, и Psylliodes punctulata (блошки конопляной).

[0067] В некоторых вариантах осуществления изобретения, способ разработан для конкретных генов-мишеней у данного вида насекомых. В некоторых вариантах реализации изобретения, представлено растение, имеющее повышенную стойкость к Phyllotreta atra (блошке репы), причем ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1-296. В некоторых вариантах реализации изобретения, представлено растение, имеющее повышенную стойкость к Phyllotreta cruciferae (блошке канолы), причем ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs:297-532. В некоторых вариантах реализации изобретения, представлено растение, имеющее повышенную стойкость к Phyllotreta striolata (блошке полосатая), причем ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs:533-551. В некоторых вариантах осуществления изобретения, представлено растение, имеющее повышенную стойкость к Psylliodes chrysocephala, причем ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs:552-859. В некоторых вариантах реализации изобретения, представлено растение, имеющее повышенную стойкость к Phyllotreta atra (блошке репы), которое экспрессирует из рекомбинантного ДНК конструкта цепь дцРНК, содержащую последовательность от около 95% до около 100% идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 860-1155 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, представлено растение, имеющее повышенную стойкость к Phyllotreta cruciferae (блошке канолы), которое экспрессирует из рекомбинантного ДНК конструкта инсектицидный полинуклеотид, содержащий последовательность от около 95% до около 100% идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1156-1391, 1731-1972 и 1974 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, представлено растение, имеющее повышенную стойкость к Phyllotreta striolata (полосатой блошке), которое экспрессирует из рекомбинантного ДНК конструкта инсектицидный полинуклеотид, содержащий цепь, содержащую последовательность от около 95% до около 100% идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1392-1410, 1973 и 1975 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, представлено растение, имеющее повышенную стойкость к Psylliodes chrysocephala, которое экспрессирует из рекомбинантного ДНК конструкта инсектицидный полинуклеотид, содержащий цепь, содержащую последовательность от около 95% до около 100% идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs:1411 -1718 или их фрагмента.

Рекомбинантные ДНК-конструкты, кодирующие инсектицидные полинуклеотиды для борьбы с насекомыми

[0068] Несколько вариантов осуществления относятся к рекомбинантному конструкту ДНК, содержащему гетерологичный промотор, функционально связанный с ДНК, кодирующей инсектицидный полинуклеотидный транскрипт, содержащий последовательность от около 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100%) идентичной или комплементарной по меньшей мере 21 смежным нуклеотидов последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или ее фрагмента.

[0069] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантного ДНК конструкта транскрипт инсектицидного полинуклеотида содержит последовательность от около 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100%) идентичной или комплементарной по меньшей мере с 21 смежными нуклеотидами последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или ее фрагмента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, транскрипт инсектицидного полинуклеотида образует дцРНК двухцепочечного инсектицидного полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления изобретения, транскрипт инсектицидного полинуклеотида представляет собой дцРНК, содержащую цепь РНК, содержащую по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов последовательности РНК, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или фрагмента его. В некоторых вариантах осуществления изобретения, транскрипт инсектицидного полинуклеотида представляет собой дцРНК, содержащую цепь РНК, содержащую по меньшей мере один сегмент из 21 смежных нуклеотидов последовательности РНК, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или фрагмента его. В некоторых вариантах осуществления изобретения, транскрипт инсектицидного полинуклеотида представляет собой дцРНК, содержащую по меньшей мере одну цепь РНК, содержащую последовательность от около 95% до около 100% идентичную или комплементарную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или их фрагмента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, транскрипт инсектицидного полинуклеотида представляет собой дцРНК, содержащую цепь РНК, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или фрагмента его. В некоторых вариантах осуществления изобретения, транскрипт инсектицидного полинуклеотида образует одноцепочечный инсектицидный полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления изобретения, транскрипт инсектицидного полинуклеотида представляет собой оцРНК, содержащую по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов последовательности РНК, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или фрагмента его. В некоторых вариантах осуществления изобретения, транскрипт инсектицидного полинуклеотида представляет собой оцРНК, содержащую по меньшей мере один сегмент из 21 смежных нуклеотидов последовательности РНК, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или фрагмента его. В некоторых вариантах осуществления изобретения, транскрипт инсектицидного полинуклеотида представляет собой оцРНК, содержащую последовательность от около 95% до около 100% идентичную или комплементарную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или их фрагмента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, транскрипт инсектицидного полинуклеотида представляет собой оцРНК, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или фрагмента его.

[0070] В некоторых вариантах реализации рекомбинантного ДНК конструкта, гетерологичный промотор является функционирующим для экспрессии инсектицидного полинуклеотидного транскрипта в бактериях. В некоторых вариантах реализации изобретения, отличающихся тем, что рекомбинантный ДНК конструкт должен экспрессироваться в бактерии, бактерию выбирают из группы, состоящей из Escherichia coli, видов Bacillus, видов Pseudomonas, видов Xenorhabdus, или видов Photorhabdus. В других вариантах осуществления изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт содержит гетерологичный промотор, который является функционирующим в растительной клетке.

[0071] В некоторых вариантах осуществления изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт содержится в рекомбинантном векторе, таком как вектор рекомбинантного растительного вируса или рекомбинантный вектор бакуловируса. В вариантах осуществления изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт интегрирован в растительную хромосому или пластиду, например, путем стабильной трансформации.

[0072] Связанные аспекты включают трансгенную растительную клетку, содержащую в своем геноме рекомбинантный ДНК конструкт, и трансгенное растение, содержащее такую трансгенную растительную клетку. Трансгенные растительные клетки и растения созданы с помощью способов, известных в данной области техники, таких как описанные под заголовком ʺСоздание и использование трансгенных растительных клеток и трансгенных растенийʺ. Дополнительные аспекты включают товарный продукт, полученный из такого трансгенного растения, и семян трансгенных потомства или частей размножения трансгенного растения.

Дополнительная информация и методы

Растения

[0073] Способы и композиции, описанные в данном документе, для лечения и защиты растений от насекомых-вредителей могут быть использованы у широкого спектра растений. Подходящие растения, у которых способы и композиции, описанные в данном документе, могут быть использованы, включают, но без ограничения, зерновые и кормовые травы (рис, кукурузу, пшеницу, ячмень, овес, сорго, просо, пальчатое просо, кормовые травы холодного сезона и гречку заметную), масличные культуры (сою, масличные рода капусты, включая канолу и масличный рапс, подсолнечник, арахис, лен, кунжут и сафлор), бобовые, зерновые и кормовые растения (обыкновенную фасоль, китайскую вигну, горох, стручковую фасоль, чечевицу, фасоль остролистную, азиатскую фасоль, голубиный горох, вику, нут, люпин, люцерну и клеверы), фрукты и орехи умеренного пояса (яблоко, грушу, персик, сливы, ягодные культуры, вишни, виноград, оливы, миндаль и грецкий орех), тропические и субтропические фрукты и орехи (цитрусовые, включая лимоны, апельсины и грейпфруты; банан и банан райский, ананас, папайю, манго, авокадо, киви, маракуйю и хурму), овощные культуры (растения семейства пасленовых, включая помидоры, баклажаны и перцы; овощи рода капуста; редис, морковь, тыквы, луки, спаржи и листовые овощи), сахарные, клубневые и лубяные культуры (сахарный тростник, сахарную свеклу, стевию, картофель, сладкий картофель, маниоку и хлопок), плантационные культуры, декоративные растения и газонные травы (табак, кофе, какао, чай, каучуковое дерево, лекарственные растения, декоративные растения и газонные травы) и виды лесных деревьев. Особыми видами растений являются растения семейства Brassicaceae, в том числе виды Brassica включают B. napus, B. juncea, B. carinata, B. rapa, B. oleracea, B. rupestris, B. septiceps, B. nigra, B. narinosa, B. perviridus, B. tournefortii, и B. fructiculosa. Дополнительные виды растений, представляющие интерес: Glycine max, Linum usitatissimum, Zea mays, Carthamus tinctorius, Helianthus annuus, Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana, Betholettia excelsa, Ricinus communis, Cocus nucifera, Coriandrum sativum, Gossypium spp., Arachis hypogaea, Simmondsia chinensis, Solanum tuberosum, Elaeis guineensis, Olea europaea, Oryza sativa, Cucurbita maxim, Hordeum vulgare и Triticum aestivum.

Дополнительные элементы конструкта

[0074] Варианты осуществления полинуклеотидов и молекул нуклеиновых кислот, описанных в данном документе, могут содержать дополнительные элементы, такие как промоторы, сайты распознавания малых РНК, аптамеры и рибозимы, дополнительные и дополнительные кассеты экспрессии для экспрессирования кодирующих последовательностей (например, для экспрессии трансгена, такого как инсектицидный белок или выбираемый маркер) или некодирующие последовательности (например, для экспрессии дополнительных подавляющих элементов). Например, аспект обеспечивает рекомбинантный ДНК конструкт, содержащий гетерологичный промотор функционально связанный с ДНК, кодирующей РНК транскрипт, содержащий последовательность от около 95% до около 100% идентичную или комплементарную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 860-1718 и 1722-1975 или их фрагмента. В другом варианте осуществления изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт, содержащий промотор функционально связанный с ДНК, кодирующей: (a) РНК транскрипт, содержащий последовательность от около 95% до около 100% идентичную или комплементарную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 860-1718 и 1722-1975 или их фрагмента, и (b) аптамер, стабильно интегрированный в растительный геном, из которого РНК транскрипт, содержащий РНК аптамер и подавленный элемент РНК, экспрессируются в клетках растения; аптамер служит для направления подавленного элемента РНК в нужное место в клетке. В другом варианте осуществления изобретения, включение одного или более сайтов распознавания для связывания и расщепления с помощью малой РНК (например, с помощью микроРНК или миРНК, которые экспрессируются только в определенной клетке или ткани) позволяет более точно экспрессировать паттерны в растении, в котором экспрессия рекомбинантного ДНК конструкта подавляется, где экспрессируются малые РНК. Такие дополнительные элементы описаны ниже.

Промоторы

[0075] Промоторы, используемые в композициях и способах, описанных в данном документе, являются функциональными в клетке, в которой данная конструкция предназначена для транскрипции. Как правило, эти промоторы являются гетерологичными промоторами, как используется в рекомбинантных конструктах, т.е. они не обнаружены в природе функционально связанными с другими нуклеиновыми элементами, используемыми в конструктах. В различных вариантах осуществления изобретения, промотор является выбранным из группы, состоящей из конститутивного промотора, пространственно специфического промотора, специфического во времени промотора, связанного с развитием специфического промотора и индуцибельного промотора. Во многих вариантах осуществления изобретения, промотор представляет собой промотор функциональный в растении, например, pol II промотор, pol III промотор, pol IV промотор, или pol V промотор.

[0076] Неконститутивные промоторы, пригодные для применения с конструктами рекомбинантной ДНК, описанными в данном документе, включают пространственно специфические промоторы, специфические во времени промоторы и индуцибельные промоторы. Пространственно специфические промоторы могут включать органело-, клеточно-, ткане- или органоспецифические промоторы (например, пластидспецифический, корнеспецифический, пыльцаспецифический или семяспецифический промотор для экспрессии в пластидах, корнях, пыльце или семенах соответственно). Во многих случаях особенно пригоден семяспецифический, эмбрионоспецифический, алейроноспецифический или эндоспермоспецифический промотор. Специфические во времени промоторы могут включать промоторы, которые имеют тенденцию промотировать экспрессию во время определенных стадий развития в цикле роста растения или в течении различного времени дня или ночи, или в различные времена года. Индуцибельные промоторы включают промоторы, индуцируемые химическими веществами или условиями окружающей среды, таким как, но без ограничения, биотический или абиотический стресс (например, недостаток воды или засуха, жара, холод, высокие или низкие количества питательных веществ или соли, высокие или низкие уровни света, или вредитель или патогенная инфекция). Промоторы микроРНК могут быть полезны, особенно те, которые имеют паттерн временной специфичности, пространственной специфичности или индуцибельной специфичности; примеры миРНК промоторов, а также способов для идентификации миРНК промоторов, имеющих специфические паттерны экспрессии, представлены в публикации заявки на патент США 2006/0200878, 2007/0199095 и 2007/0300329, которые специально включены в данный документ в качестве ссылки. Промотор со специфической экспрессией может также включать промоторы, которые обычно конститутивно экспрессируются, но с разной степенью или "силой" экспрессии, включая промоторы, обычно рассматриваемые как "сильные промоторы" или как "слабые промоторы.

[0077] Промоторы включают следующие примеры: промотор опалинсинтазы, выделенный из Т-ДНК Agrobacterium; промотор вируса мозаики цветной капусты 35S; усовершенствованные промоторные элементы или химерные промоторные элементы, такие как усовершенствованный промотор вируса мозаики цветной капусты (CaMV) 35S, связанный с энхансерным элементом (интрон белка теплового шока 70 Zea mays); корнеспецифические промоторы, такие как те, что описаны в патентах США 5837848; 6437217 и 6426446; промотор олеозина кукурузы L3, описанный в патенте США 6433252; промотор для гена ядра растений, кодирующий пластидлокализованную альдолазу, описанную в публикации заявки на патент США 2004/0216189; промоторы, индуцируемые холодом, описанные в патенте США 6084089; соли-индуцируемые промоторы, описанные в патенте США 6140078; светоиндуцируемые промоторы, описанные в патенте США 6294714; индуцируемые патогеном промоторы, описанные в патенте США 6252138; и промоторы, индуцируемые дефицитом воды, описанные в публикации заявки на патент США 2004/0123347 A1. Все описанные выше патенты и патентные публикации, описывающие промоторы и их использование, особенно в рекомбинантных ДНК конструктах, функциональных в растениях, включены в данный документ посредством ссылки.

[0078] Интересующие растительные сосудо- или флоэмоспецифические промоторы включают rolC или rolA промотор Agrobacterium rhizogenes, промотор Т-ДНК гена 5 Agrobacterium tumefaciens, промотор гена RSs1 сахарозосинтазы риса, промотор баднавируса желтой крапчатости Commelina, промотор вируса лиственного распада кокоса, промотор палочковидного вируса риса тунгро, промотор гена GS3A глутамин синтетазы гороха, промоторы генов invCD111 и invCD141 инвертазы картофеля, промотор, изолированный из Arabidopsis, который имеет флоэмоспецифическую экспрессию у табака, что показано Kertbundit и др. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 88:5212-5216, промотор VAHOX1 участка, промотор гена инвертазы клеточной стенки гороха, промотор гена кислой инвертазы из моркови, промотор гена сульфат транспортера Sultr1;3, промотор гена синтазы сахарозы растения и промотор гена переносчика сахарозы растений.

[0079] Промоторы, пригодные для применения с конструктом рекомбинантной ДНК или полинуклеотидом, описанными в данном документе, включают промоторы полимеразы II (ʺpol IIʺ) и промоторы полимеразы III (ʺpol IIIʺ). РНК полимераза II транскрибирует структурные и каталитические РНК, которые обычно короче, чем 400 нуклеотидов в длину, и распознает простой запуск Т-остатков в качестве сигнала терминации; она была использована для транскрибирования миРНК дуплексов (см., например, Lu et al. (2004) Nucleic Acids Res., 32:e171). Промоторы рol II являются предпочтительными в некоторых вариантах реализации изобретения, где короткий РНК-транскрипт должен быть получен из рекомбинантного ДНК конструкта. В одном варианте осуществления изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт содержит промотор pol II для экспрессирования РНК транскрипта, фланкированного с помощью саморасщепляющихся последовательностей рибозима (например, саморасщепляющихся рибозимов типа hammerhead), в результате чего обработанная РНК, такая как одноцепочечная РНК, которая связывается с транскриптом гена-мишени блошки, с определенными 5' и 3' концами, свободна от потенциально интерферирующих фланкирующих последовательностей. В альтернативный подходе используются промоторы pol III для создания транскриптов с относительно определенными 5' и 3' концами, т.е. для транскрибирования РНК с минимальными 5' и 3' фланкирующими последовательностями. В некоторых вариантах осуществления изобретения, промоторы Pol III (например, промоторы U6 или H1) являются предпочтительными для добавления короткого AT-насыщенного сайта терминации транскрипции, что приводит к 2 парам оснований липких концов (UU) в транскрибируемой РНК; это полезно, например, для экспрессии конструктов миРНК-типа. Сообщалось об использование промоторов pol III для запуска экспрессии конструктов миРНК; см. van de Wetering и др. (2003) EMBO Rep., 4: 609-615, и Tuschl (2002) Nature Biotechnol., 20: 446-448. Промоторы бакуловируса, такие как полиэдрин бакуловируса и промоторы p10, известны в данной области техники и коммерчески доступны; см., например, Invitrogen's ʺGuide to Baculovirus Expression Vector Systems (BEVS) and Insect Cell Culture Techniquesʺ, 2002 (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния) и F. J. Haines и др. ʺBaculovirus Expression Vectorsʺ, без указания даты (Oxford Expression Technologies, Оксфорд, Великобритания).

[0080] Элемент промотора может содержать последовательности нуклеиновых кислот, которые не являются природными промоторами, или промоторными элементами или их гомологами, но которые могут регулировать экспрессию гена. Примеры таких "ген независимых" регуляторных последовательностей включают природные или искусственно созданные последовательности РНК, которые содержат лиганд-связывающий участок, или аптамер (см. ʺАптамерыʺ, ниже) и регуляторный участок (который может быть цис-активным). См., например, Isaacs et al. (2004) Nat. Biotechnol., 22:841-847, Bayer and Smolke (2005) Nature Biotechnol., 23:337-343, Mandal and Breaker (2004) Nature Rev. Mol. Cell Biol., 5:451-463, Davidson and Ellington (2005) Trends Biotechnol., 23:109-112, Winkler et al. (2002) Nature, 419:952-956, Sudarsan et al. (2003) RNA, 9:644-647, и Mandal and Breaker (2004) Nature Struct. Mol. Biol., 11:29-35. Такие "риборегуляторы" можно выбирать или конструировать для конкретной пространственной или временной специфичности, например, для регуляции трансляции ДНК, которая кодирует подавленный элемент гена-мишени только в присутствии (или в отсутствие) данной концентрации подходящего лиганда. Одним из примеров является риборегулятор, который реагирует на эндогенный лиганд (например, жасмонова кислота или салициловая кислота), продуцируемый растением при стрессе (например, абиотическом стрессе, такого как вода, температура, или стресса питательных веществ, или биотическом стрессе, такого как прикрепление вредителей или патогенов); при стрессе, уровень эндогенного лиганда увеличивается до уровня, достаточного для риборегулятора для начала транскрипции ДНК, которая кодирует подавленный элемент для подавления гена-мишени.

Трансгенные транскрипционные единицы

[0081] В некоторых вариантах осуществления изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт или полинуклеотид, описанные в данном документе, содержат трансгенную транскрипционную единицу. Трансгенная транскрипционная единица содержит последовательность ДНК, кодирующую представляющий интерес ген, например природный белок или гетерологичный белок. Представляющий интерес ген может быть кодирующей или некодирующей последовательностью любых видов (включая, но без ограничения, не эукариотов, таких как бактерии и вирусы; грибы, протисты, растения, беспозвоночные и позвоночные животные). Конкретные гены, представляющие интерес, представляют собой гены, кодирующие один или более белков, придающих устойчивость к гербициду и генам, кодирующим по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка, Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous, инсектицидного белка Bacillus sphaericus, и инсектицидного белка, продуцируемого любым из Lysinibacillus sphaericus (Bacillus sphaericus),Brevibacillus laterosporus (Bacillus laterosporus), видов Chromobacterium, Chromobacterium subtsugae, видов Paenibacillus, Paenibacillus lentimorbus и Paenibacillus popilliae. Трансгенная транскрипционная единица может дополнительно содержать 5' или 3' последовательность или оба как требуется для транскрипции трансгена.

Интроны

[0082] В некоторых вариантах осуществления изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт или полинуклеотид содержат ДНК, кодирующую сшивающий интрон. ʺИнтронʺ обычно означает сегмент ДНК (или РНК, транскрибированную из такого сегмента), который расположен между экзонами (белок-кодирующими сегментами ДНК или соответствующей транскрибированной РНК), причем, в ходе созревания матричной РНК, интрон присутствует ферментативно "сращенным из" или удален из цепи РНК с помощью процесса расщепления/лигирования, который происходит в ядре эукариот. Термин ʺинтронʺ также применяется для некодирующих последовательностей ДНК, которые транскрибируются в сегментах РНК, которые могут быть сращены из созревания РНК-транскрипта, но интроны не обнаружены между белок-кодирующих экзонами. Один пример этих сшивающих последовательностей, которые обладают способностью усиливать экспрессию расположенной ниже кодирующей последовательности в растениях (в некоторых случаях, особенно у однодольных); эти сшивающие последовательности в норме расположены в 5' нетранслируемом участке некоторых генов растений, а также в некоторых вирусных генах (например, 5' лидерная последовательность вируса мозаики табака или лидер «омега», описанный как усиление экспрессии в растительных генах Gallie и Walbot (1992) Nucleic Acids Res., 20: 4631-4638). Эти сшивающие последовательности или ʺусиливающие экспрессию интроныʺ могут быть искусственно вставлены в 5' нетранслируемый участок гена растения между промотором, но до любого белок-кодирующих экзонов. Примеры таких усиливающих экспрессию интронов включают, но без ограничения, алкогольдегидрогеназу кукурузы (Zm-Adh1), Bronze-1 усиливающий экспрессию интрон кукурузы, интрон актина 1 (Os-Act1) риса, Shrunken-1 (Sh-1) интрон, интрон синтетазы сахарозы кукурузы, интрон белка теплового шока 18 (hsp18) и интрон белка теплового шока 82 килодальтон (hsp82). Патенты США 5593874 и 5859347, специально включены в данный документ посредством ссылки, описывают способы улучшения рекомбинантных ДНК конструктов для применения у растений с помощью включения усиливающего экспрессию интрона, полученного из белка теплового шока 70 килодальтон (hsp70) в нетранслируемом лидере, расположенном в 3' от промотора гена и 5' от первого белок-кодирующего экзона.

Элементы супрессии генов

[0083] В некоторых вариантах осуществления изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт или полинуклеотид содержат ДНК, кодирующую дополнительный элемент супрессии гена для подавления гена-мишени отличного от гена-мишени блошки. Ген-мишень который должен быть подавлен может содержать кодирующую или не кодирующую последовательность или обе.

[0084] Подходящие элементы супрессии гена подробно описаны в публикации заявки на патент США 2006/0200878, описание которых специально включено в данный документ с помощью ссылки, и содержат один или более из:

(a) ДНК, которая содержит по меньшей мере один сегмента анти-смысловой ДНК, который является анти-смысловым к по меньшей мере одному сегменту гена, который должен быть подавлен;

(b) ДНК, которая содержит многочисленные копии по меньшей мере одного сегмента анти-смысловой ДНК, который является анти-смысловым к по меньшей мере одному сегменту гена, который должен быть подавлен;

(c) ДНК, которая содержит по меньшей мере один сегмента смысловой ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом гена, который должен быть подавлен;

(d) ДНК, которая содержит многочисленные копии по меньшей мере одного сегмента смысловой ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом гена, который должен быть подавлен;

(e) ДНК, которая транскрибирует РНК для подавления гена, который должен быть подавлен с помощью формирования двухцепочечной РНК, и содержит по меньшей мере один сегмент анти-смысловой ДНК, который является анти-смысловым к по меньшей мере одному сегменту гена, который должен быть подавлен, и по меньшей мере один сегмент смысловой ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом гена, который должен быть подавлен;

(f) ДНК, которая транскрибирует РНК для подавления гена, который должен быть подавлен с помощью формирования двухцепочечной РНК, и содержит многочисленные серии сегментов анти-смысловой ДНК, которые являются анти-смысловыми к меньшей мере одному сегменту гена, который должен быть подавлен, и многочисленным сериям сегментов смысловой ДНК, которые являются по меньшей мере одним сегментом гена, который должен быть подавлен;

(g) ДНК, которая транскрибирует РНК для подавления гена, который должен быть подавлен, с помощью формирования многочисленных двойных цепочек РНК и содержит многочисленные сегменты анти-смысловой ДНК, которые являются анти-смысловыми к по меньшей мере к одному сегменту гена, который должен быть подавлен, и многочисленными сегментами смысловой ДНК, которые являются по меньшей мере одним сегментом гена, который должен быть подавлен, и при этом многочисленные сегменты анти-смысловой ДНК и многочисленные сегменты смысловой ДНК расположены в серии инвертированных повторов;

(h) ДНК, которая содержит нуклеотиды, полученные из растительной микроРНК;

(i) ДНК, которая содержит нуклеотиды миРНК;

(j) ДНК, которая транскрибируется в РНК аптамер, способный связываться с лигандом; и

(k) ДНК, которая транскрибируется в РНК аптамер, способный связываться с лигандом и ДНК, которая транскрибируется в регуляторную РНК, способную к регулированию экспрессии гена, который должен быть подавлен, причем регулирование зависит от конформации регуляторных РНК и конформация регуляторной РНК аллостерически влияет на состояния связывания РНК аптамеров.

[0085] В некоторых вариантах осуществления изобретений, интрон используется для доставки элемента супрессии гена в отсутствии любого белок-кодирующего экзона (кодирующей последовательности). В одном примере, интрон, такой как усиливающий экспрессию интрон (предпочтительный в некоторых вариантах реализации изобретения), прерывается путем встраивания в интрон элемента супресси гена, причем, при транскрипции элемент супресси гена вырезается из интрона. Таким образом, белок-кодирующие экзоны не требуются для обеспечения функции подавления гена конструктов рекомбинантной ДНК, описанных в данном документе.

Транскрипционные регуляторные элементы

[0086] В некоторых вариантах осуществления изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт или полинуклеотид содержат ДНК, кодирующую транскрипционный регуляторный элемент. Транскрипционные регуляторные элементы содержат элементы, которые регулируют уровень экспрессии рекомбинантного ДНК конструкта (относительно их экспрессии в отсутствии таких регуляторных элементов). Примеры подходящих транскрипционных регуляторных элементов включают рибопереключатель (цис- или транс-действующие), стабилизирующие транскрипт последовательности и сайты узнавания микроРНК, как подробно описано в публикации заявки на патент США 2006/0200878, специально включенной в данный документ с помощью ссылки.

Трансгенные растительные клетки и трансгенные растения

[0087] Рекомбинантные ДНК конструкты, описанные в данном документе, могут быть уложены с другой рекомбинантной ДНК для придания дополнительных особенностей (например, в случае трансформированных растений, особенности включают устойчивости к гербицидам, устойчивости к вредителям, устойчивости к холодному проращиванию, устойчивости к водному дефициту и так далее), например, с помощью экспрессирования или подавления других генов. Конструкты для скоординированного уменьшения и увеличения экспрессии генов представлены в публикации заявки на патент США 2004/0126845 A1, специально включенные в качестве ссылки.

[0088] В определенных трансгенных растительных клетках и трансгенных растениях, иногда желательно, чтобы одновременно экспрессировался интересующий ген, в то время как также модулируется экспрессия гена-мишени блошки. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретений, трансгенное растение содержит рекомбинантную ДНК, дополнительно содержащую элемент экспрессии гена для экспрессирования по меньшей мере одного интересующего гена, и транскрипция рекомбинантного ДНК конструкта для борьбы с блошкой предпочтительно осуществляется с одновременной транскрипцией элемента экспрессии гена. В вариантах реализации изобретения, трансгенное растение экспрессирует ДНК, кодирующую транскрипт инсектицидного полинуклеотида, как описано в данном документе, для подавления гена-мишени блошки, и также экспрессирует ДНК, кодирующую не-нуклеотидный пестицидный агент, такой как пестицидный агент с малой молекулой или белковоподобный пестицидный агент; такие ДНК могут быть уложены в один рекомбинантный конструкт или экспрессионную кассету, или, альтернативно, могут быть экспрессированы из дискретных рекомбинантных конструкций или кассет экспрессии. Примеры ненуклеотидных пестицидных агентов включают пататины, лектины растений, фитоэкдистероиды и бактериальные инсектицидные белки (например, инсектицидные белки от Bacillus thuringiensis, Xenorhabdus sp., Photorhabdus sp., Brevibacillus laterosporus (Bacillus laterosporus), Lysinibacillus sphaericus (Bacillus sphaericus), Chromobacterium sp., Chromobacterium subtsugae, Paenibacillus sp., Paenibacillus lentimorbus и Paenibacillus popilliae). В вариантах реализации изобретения, трансгенное растение экспрессирует ДНК, кодирующую рекомбинантный РНК транскрипт, как описано в данном документе, для подавления гена-мишени блошки, и также экспрессирует ДНК, кодирующую один или более белков, отвечающих за толерантность к гербицидам. Примеры белков, несущих толерантность к гербициду, включают 5-енолпирувильшикимат-3-фосфатсинтазы (EPSPS, см., например, патенты США 5627061, 5633435, RE39247, 6040497 и 5094945 и публикации международной заявки PCT WO04074443 и WO04009761), глифозат-оксидоредуктазу (GOX, патент США № 5463175), глифосатдекарбоксилазу (публикация международной заявки PCT WO05003362, патент США 7405347 и публикация заявки на патент США 2004/0177399), глифосат-N-ацетилтрансферазу (GAT, патент США 7,714,188), дающую толерантность к глифосату; дикамба-монооксигеназу, придающую устойчивость к ауксиноподобным гербицидам, таким как дикамба (патент США № 7105724); фосфинотрицин-ацетилтрансферазу (pat или bar), придающую толерантность к фосфинотрицину или глюфосинату (патент США № 5646024); 2,2-дихлорпропионовую кислоту, дающую устойчивость к 2,2-дихлорпропионовой кислоте (Далапон) (публикация международной заявки PCT WO9927116); ацетогидроксикислота-синтазу или ацетолактатсинтазу, придающую толерантность к ингибиторам ацетолактатсинтазы, таким как сульфонилмочевина, имидазолинон, триазолопиримидин, пиримидилоксибензоаты и фталид (патент США № 6225105); галогенарилнитрилазу (Bxn) для обеспечения толерантности к бромоксинилу (патент США №4810648); модифицированный ацетил-коэнзим А карбоксилазу для обеспечения устойчивости к циклогександиону (сетоксидиму) и арилоксифеноксипропионату (галоксифоп) (патент США № 6414222); дигидроптероат-синтазу (sul I) для обеспечения толерантности к сульфонамидным гербицидам (патент США № 5719046); 32 кДа полипептид фотосистемы II (psbA) для обеспечения толерантности к триазиновым гербицидам (Hirschberg et al., 1983, Science, 222: 1346-1349); антранилатсинтазу для обеспечения толерантности к 5-метилтриптофану (патент США № 4581847); синтазу дигидродипиколиновой кислоты (dap A) для обеспечения толерантности к аминоэтилцистеину (публикация международной заявки PCT WO8911789); фитоендесатуразу (crtI) для обеспечения толерантности к пиридазиноновым гербицидам, таким как норфлуразон (патент Японии JP06343473); гидроксифенилпируват диоксигеназу, оксидазу 4-гидроксифенилуксусной кислоты и 4-гидроксифенилуксусную 1-гидролазу (патент США 7304209) для обеспечения толерантности к гербицидам циклопропилизоксазола, таким как изоксафлутол (патент США 6268549); модифицированную протопорфириноген оксидазу I (protox) для обеспечения толерантности к ингибиторам протопорфириногеноксидазы (патент США № 5939602); арилоксиалканоат диоксигеназу (AAD-1) для обеспечения толерантности к гербициду, содержащему арилоксиалканоатную часть (WO 05107437); серин гидроксиметилтрансферазу (публикация патентной заявки США, 2008/0155716), глифозинат-толерантную глутаминсинтазу (публикация заявки на патент США 2009/0018016). Примеры таких гербицидов включают фенокси ауксины (такие как 2,4- D и дихлорпроп), пиридоксин ауксины (такие как флуроксипир и трихлопир), ингибиторы арилоксифеноксипропионат (AOPP) ацетилкоэнзим A карбоксилазы (ACCase) (такие как галоксифоп, хизалофоп и диклофоп), и ингибиторы 5-замещенной феноксиацетат протопорфириноген-оксидазы IX (такие как пирафлуфен и флумиклорак). Нуклеотидные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие белки гербицид-толерантности и последовательности белков гербицид-толерантности, как описано в патенте США и публикациях заявки на патент, цитируемые в этом параграфе, включены в данный документ посредством ссылки.

[0089] В некоторых вариантах осуществления изобретения, конструкты рекомбинантный ДНК, описанные в данном документе, могут быть транскрибированы в любой растительной клетке или ткани или в целом растении на любой стадии развития. Трансгенные растения могут быть получены из любого однодольного или двудольного растения, такого как, но без ограничения, растения коммерческого или сельскохозяйственного интереса, такие как культурные растения (особенно сельскохозяйственные растения, используемые для продуктов питания человека или корма для животных), дерево- или целлюлозо-продуцирующие деревья, овощные растения, плодовые растения и декоративные растения. Примеры растений, представляющих интерес, включают растения зерновых злаков (таких как пшеница, овес, ячмень, кукуруза, рожь, тритикале, рис, просо, сорго, квиноа, амарант и гречку); растения кормовых культур (например, кормовые травы и кормовые двудольные включая люцерну, вику, клевер и т.п.); растения масличных культур (таких как хлопок, сафлор, подсолнечник, соя, канолу, рапс, лен, арахис и масличную пальму); древесные орехи (такие как грецкий орех, кешью, фундук, пекан, миндаль, и т.п.); сахарный тростник, кокос, финиковую пальму, оливу, сахарную свеклу, чай, кофе; дерево- или целлюлозно-продуцирующие деревья; растения овощных культур, таких как бобовые (например, фасоли, горохи, чечевицы, люцерна, арахис), салат-латук, спаржа, артишоки, сельдерей, морковь, редис, крестоцветные (например, капусты, кормовые капусты, горчицы и другие листовые крестоцветные, брокколи, цветная капусту, брюссельскую капусту, репу, кольраби), пищевые тыквенные (например, огурцы, дыни, летние тыквы, зимние тыквы), пищевые луковые (например, луки, чеснок, луки-порей, луки-шалот, лук-резанец), съедобные представители Solanaceae (например, помидоры, баклажаны, картофель, перец, физалис), и съедобные представители Chenopodiaceae (например, свекла, мангольд, шпинат, квиноа, амарант); растения плодовых культур, таких как яблоки, груши, цитрусовые (например, апельсин, лайм, лимон, грейпфрут и другие), косточковые плоды (например, абрикос, персик, слива, нектарин), банан, ананас, виноград, киви, папайя, авокадо, и ягоды; растения, выращенные для биомассы или биотоплива (например, травы Miscanthus, просо, ятрофа, масличная пальма, эукариотические микроводоросли, такие как Botryococcus braunii, Chlorella spp. и Dunaliella spp., и эукариотические макроводоросли, такие как Gracilaria spp. и Sargassum spp.); и декоративных растений, включая декоративные цветущие растения, декоративные деревья и кустарники, декоративные почвопокровные растения и декоративные травы. Особые виды растений, представляющие интерес, в которых рекомбинантный ДНК конструкт транскрибируется для обеспечения устойчивости к земляным блошкам, являются растениями семейства Brassicaceae, в том числе виды Brassica включают B. napus, B. juncea, B. carinata, B. rapa, B. oleracea, B. rupestris, B. septiceps, B. nigra, B. narinosa, B. perviridus, B. tournefortii, и B. fructiculosa. Дополнительные виды растений, представляющие интерес, в которых рекомбинантный ДНК конструкт транскрибируется для обеспечения устойчивости к земляным блошкам, представляют собой Glycine max, Linum usitatissimum, Zea mays, Carthamus tinctorius, Helianthus annuus, Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana, Betholettia excelsa, Ricinus communis, Cocus nucifera, Coriandrum sativum, Gossypium spp., Arachis hypogaea, Simmondsia chinensis, Solanum tuberosum, Elaeis guineensis, Olea europaea, Oryza sativa, Cucurbita maxim, Hordeum vulgare и Triticum aestivum.

[0090] Кроме того, в данном документе описаны товарные продукты, полученные из трансгенной растительной клетки, растения или семян, экспрессирующих рекомбинантный ДНК конструкт, придающий повышенную устойчивость к блошкам, описанным в данном документе, включающие, но без ограничения, собранные листья, корни, побеги, клубни, стебли, плоды, семена или другие части растения, муку, масла, экстракты, продукты ферментации или расщепления, дробленые или цельные зерна или семена растения, или любой пищевой или непищевой продукт, включая такие товарные продукты полученные из трансгенной растительной клетки, растения или семян как описано в данном документе. Обнаружение одной или более последовательностей нуклеиновой кислоты конструктов рекомбинантной ДНК для борьбы с блошками, как описано в данном документе, в одном или более товаров или товарных продуктах, рассмотренных в данном документе, является de facto доказательством того, что товар или товарный продукт содержит или получено из трансгенной клетки растения, растения или семян, экспрессирующих такой рекомбинантный ДНК конструкт.

[0091] Обычно трансгенное растение, имеющее в своем геноме рекомбинантный ДНК, как описано в данном документе, проявляет повышенную стойкость к заражению насекомым, в частности, повышенную устойчивость к заражению блошкой. В различных вариантах осуществления изобретения, например, где трансгенное растение экспрессирует рекомбинантный ДНК конструкт для борьбы с блошкой, который уложен с другой рекомбинантной ДНК для придания дополнительных особенностей, трансгенное растение имеет по меньшей мере один дополнительный измененный признак по отношению к растению с отсутствующим рекомбинантным ДНК конструктом, выбранный из группы признаков, состоящей из:

(a) повышенной толерантности к абиотическому стрессу;

(b) повышенной толерантности к биотическому стрессу;

(d) модифицированного состава вторичных метаболитов;

(e) модифицированного состава микроэлементов, каротиноидов или витаминов;

(f) повышенного урожая;

(g) повышенной способности усваивать азот, фосфат или другие питательные вещества;

(h) модифицированных агротехнических характеристик;

(i) модифицированных характеристик роста и репродукции; и

(j) улучшенных качества сбора урожая, хранения и обработки.

[0092] В некоторых вариантах осуществления изобретения, трансгенное растение характеризуется: повышенной толерантностью к абиотическому стрессу (например, толерантность к дефициту воды или засухе, теплу, холоду, неоптимальным уровням питательных веществ или соли, неоптимальные уровни освещенности) или биотическому стрессу (например, скученность, аллелопатия или ранение); модифицированным основным метаболитным составом (например, жирной кислотой, маслом, аминокислотой, белком, сахаром или углеводом); модифицированным вторичным метаболитным составом (например, алкалоиды, терпеноиды, поликетиды, не рибосомальные пептиды и вторичные метаболиты смешанного биосинтетического происхождения); модифицированным составом микроэлементов (например, железо, цинк), каротиноидов (например, бета-каротин, ликопен, лютеин, зеаксантин или другие каротиноиды и ксантофилы) или витаминов (например, токоферолов); улучшенным урожаем (например, улучшенный урожай в условиях отсутствия стресса или улучшенный урожай при биотическом или абиотическом стрессе); улучшенной способностью использовать азот, фосфат или другие питательные вещества; модифицированными агрономическими характеристиками (например, замедленное созревание, замедленное старение, ранняя или поздняя зрелость, повышенная толерантность к тени, улучшенная устойчивость к полеганию корней или стеблей, улучшенная устойчивость к «зеленой привязке» стеблей, модифицированная реакция на фотопериода); модифицированным ростом или репродуктивными характеристиками (например, преднамеренная карликовость, преднамеренная мужская стерильность, полезная, например, в улучшенных процедурах гибридизации, улучшенная вегетативная скорость роста, улучшенное прорастание, улучшенная мужская или женская фертильность); улучшение качества урожая, хранения или обработки (например, повышенная устойчивость к вредителям при хранении, повышенная устойчивость к поломке, улучшение доставки к потребителям); или любой комбинаций этих признаков.

[0093] В другом варианте осуществления изобретения, трансгенные семена или семена, образуемые трансгенным растением, имеют модифицированный состав первичных метаболитов (например, жирной кислоты, масла, аминокислоты, белка, сахара или углевода), модифицированный состав вторичных метаболитов, модифицированный состав микроэлементов, каротиноидов или витаминов, улучшенные свойства для сбора урожая, хранения и качества обработки или их комбинацию. В другом варианте осуществления изобретения, может быть желательно изменить уровни нативных компонентов трансгенного растения или семян трансгенного растения, например, уменьшить уровни аллергенного белка или гликопротеина или токсичного метаболита.

Примеры

Пример 1:

[0094] Этот пример иллюстрирует неограничивающие варианты реализации кодирующих ДНК последовательностей, полезных в качестве генов-мишеней для борьбы с видами насекомых и для изготовления композиций для борьбы с насекомыми и устойчивых к насекомым трансгенных растений, и определяет последовательности инсектицидного полинуклеотида, полезного для борьбы с видами насекомых. Более конкретно, варианты реализации генов-мишеней, идентифицированных по имени (аннотации) и идентификатору последовательности (SEQ ID NO.), для борьбы с блошками представлены в SEQ ID NOs: 1-859, и варианты осуществления последовательностей дцРНК, расположенные по размеру от 135 дo 352 пар оснований и сконструированные для подавления этих генов-мишеней, представлены в SEQ ID NOs: 860-1718.

Таблица 1

Ген-мишень SEQ ID NO.	дцРНК SEQ ID NO.*		Ген-мишень SEQ ID NO.	дцРНК SEQ ID NO.*		Ген-мишень SEQ ID NO.	дцРНК SEQ ID NO.*	Ген-мишень SEQ ID NO.	дцРНК SEQ ID NO.*
1	860		216	1075		431	1290	646	1505
2	861		217	1076		432	1291	647	1506
3	862		218	1077		433	1292	648	1507
4	863		219	1078		434	1293	649	1508
5	864		220	1079		435	1294	650	1509
6	865		221	1080		436	1295	651	1510
7	866		222	1081		437	1296	652	1511
8	867		223	1082		438	1297	653	1512
9	868		224	1083		439	1298	654	1513
10	869		225	1084		440	1299	655	1514
11	870		226	1085		441	1300.	656	1515
12	871		227	1086		442	1301.	657	1516
13	872		228	1087		443	1302.	658	1517
14	873		229	1088		444	1303.	659	1518
15	874		230	1089		445	1304.	660	1519
16	875		231	1090		446	1305.	661	1520
17	876		232	1091		447	1306.	662	1521
18	877		233	1092		448	1307.	663	1522
19	878		234	1093		449	1308.	664	1523
20	879		235	1094		450	1309.	665	1524
21	880		236	1095		451	1310.	666	1525
22	881		237	1096		452	1311.	667	1526
23	882		238	1097		453	1312.	668	1527
24	883		239	1098		454	1313.	669	1528
25	884		240	1099		455	1314.	670	1529
26	885		241	1100		456	1315.	671	1530.
27	886		242	1101		457	1316.	672	1531.
28	887		243	1102		458	1317.	673	1532.
29	888		244	1103		459	1318.	674	1533.
30	889		245	1104		460	1319.	675	1534.
31	890		246	1105		461	1320.	676	1535.
32	891		247	1106		462	1321.	677	1536.
33	892		248	1107		463	1322.	678	1537.
34	893		249	1108		464	1323.	679	1538.
35	894		250	1109		465	1324.	680	1539.
36	895		251	1110		466	1325.	681	1540
37	896		252	1111		467	1326.	682	1541
38.	897		253	1112		468	1327.	683	1542
39	898		254	1113		469	1328.	684	1543
40	899		255	1114		470	1329.	685	1544
41	900		256	1115		471	1330.	686	1545
42	901		257	1116		472	1331.	687	1546
43	902		258	1117		473	1332.	688	1547
44	903		259	1118		474	1333.	689	1548
45	904		260	1119		475	1334.	690	1549
46	905		261	1120		476	1335.	691	1550
47	906		262	1121		477	1336.	692	1551
48	907		263	1122		478	1337.	693	1552
49	908		264	1123		479	1338.	694	1553
50	909		265	1124		480	1339.	695	1554
51	910		266	1125		481	1340.	696	1555
52	911		267	1126		482	1341.	697	1556
53	912		268	1127		483	1342.	698	1557
54	913		269	1128		484	1343.	699	1558
55	914		270	1129		485	1344.	700	1559
56	915		271	1130.		486	1345.	701	1560
57	916		272	1131.		487	1346.	702	1561
58	917		273	1132.		488	1347.	703	1562
59	918		274	1133.		489	1348.	704	1563
60	919		275	1134.		490	1349.	705	1564
61	920		276	1135.		491	1350.	706	1565
62	921		277	1136.		492	1351.	707	1566
63	922		278	1137.		493	1352.	708	1567
64	923	279	1138.	494	1353.	709	1568
65	924	280	1139.	495	1354.	710	1569
66	925	281	1140	496	1355.	711	1570
67	926	282	1141	497	1356.	712	1571
68	927	283	1142	498	1357.	713	1572
69	928	284	1143	499	1358.	714	1573
70	929	285	1144	500	1359.	715	1574
71	930	286	1145	501	1360.	716	1575
72	931	287	1146	502	1361.	717	1576
73	932	288	1147	503	1362.	718	1577
74	933	289	1148	504	1363.	719	1578
75	934	290	1149	505	1364.	720	1579
76	935	291	1150	506	1365.	721	1580
77	936	292	1151	507	1366.	722	1581
78	937	293	1152	508	1367.	723	1582
79	938	294	1153	509	1368.	724	1583
80	939	295	1154	510	1369.	725	1584
81	940	296	1155	511	1370.	726	1585
82	941	297	1156	512	1371.	727	1586
83	942	298	1157	513	1372.	728	1587
84	943	299	1158	514	1373.	729	1588
85	944	300	1159	515	1374.	730	1589
86	945	301	1160	516	1375.	731	1590
87	946	302	1161	517	1376.	732	1591
88	947	303	1162	518	1377.	733	1592
89	948	304	1163	519	1378.	734	1593
90	949	305	1164	520	1379.	735	1594
91	950	306	1165	521	1380.	736	1595
92	951	307	1166	522	1381.	737	1596
93	952	308	1167	523	1382.	738	1597
94	953	309	1168	524	1383.	739	1598
95	954	310	1169	525	1384.	740	1599
96	955	311	1170	526	1385.	741	1600
97	956	312	1171	527	1386.	742	1601
98	957	313	1172	528	1387.	743	1602
99	958	314	1173	529	1388.	744	1603
100	959	315	1174	530	1389.	745	1604
101	960	316	1175	531	1390.	746	1605
102	961	317	1176	532	1391.	747	1606
103	962	318	1177	533	1392.	748	1607
104	963	319	1178	534	1393.	749	1608
105	964	320	1179	535	1394.	750	1609
106	965	321	1180	536	1395.	751	1610
107	966	322	1181	537	1396.	752	1611
108	967	323	1182	538	1397.	753	1612
109	968	324	1183	539	1398.	754	1613
110	969	325	1184	540	1399.	755	1614
111	970	326	1185	541	1400	756	1615
112	971	327	1186	542	1401	757	1616
113	972	328	1187	543	1402	758	1617
114	973	329	1188	544	1403	759	1618
115	974	330	1189	545	1404	760	1619
116	975	331	1190	546	1405	761	1620
117	976	332	1191	547	1406	762	1621
118	977	333	1192	548	1407	763	1622
119	978	334	1193	549	1408	764	1623
120	979	335	1194	550	1409	765	1624
121	980	336	1195	551	1410	766	1625
122	981	337	1196	552	1411	767	1626
123	982	338	1197	553	1412	768	1627
124	983	339	1198	554	1413	769	1628
125	984	340	1199	555	1414	770	1629
126	985	341	1200	556	1415	771	1630.
127	986	342	1201	557	1416	772	1631.
128	987	343	1202	558	1417	773	1632.
129	988	344	1203	559	1418	774	1633.
130	989	345	1204	560	1419	775	1634.
131	990	346	1205	561	1420	776	1635.
132	991	347	1206	562	1421	777	1636.
133	992	348	1207	563	1422	778	1637.
134	993	349	1208	564	1423	779	1638.
135	994	350	1209	565	1424	780	1639.
136	995	351	1210	566	1425	781	1640
137	996	352	1211	567	1426	782	1641
138	997	353	1212	568	1427	783	1642
139	998	354	1213	569	1428	784	1643
140	999	355	1214	570	1429	785	1644
141	1000	356	1215	571	1430.	786	1645
142	1001	357	1216	572	1431.	787	1646
143	1002	358	1217	573	1432.	788	1647
144	1003	359	1218	574	1433.	789	1648
145	1004	360	1219	575	1434.	790	1649
146	1005	361	1220	576	1435.	791	1650
147	1006	362	1221	577	1436.	792	1651
148	1007	363	1222	578	1437.	793	1652
149	1008	364	1223	579	1438.	794	1653
150	1009	365	1224	580	1439.	795	1654
151	1010	366	1225	581	1440	796	1655
152	1011	367	1226	582	1441	797	1656
153	1012	368	1227	583	1442	798	1657
154	1013	369	1228	584	1443	799	1658
155	1014	370	1229	585	1444	800	1659
156	1015	371	1230.	586	1445	801	1660
157	1016	372	1231.	587	1446	802	1661
158	1017	373	1232.	588	1447	803	1662
159	1018	374	1233.	589	1448	804	1663
160	1019	375	1234.	590	1449	805	1664
161	1020	376	1235.	591	1450	806	1665
162	1021	377	1236.	592	1451	807	1666
163	1022	378	1237.	593	1452	808	1667
164	1023	379	1238.	594	1453	809	1668
165	1024	380	1239.	595	1454	810	1669
166	1025	381	1240	596	1455	811	1670
167	1026	382	1241	597	1456	812	1671
168	1027	383	1242	598	1457	813	1672
169	1028	384	1243	599	1458	814	1673
170	1029	385	1244	600	1459	815	1674
171	1030.	386	1245	601	1460	816	1675
172	1031.	387	1246	602	1461	817	1676
173	1032.	388	1247	603	1462	818	1677
174	1033.	389	1248	604	1463	819	1678
175	1034.	390	1249	605	1464	820	1679
176	1035.	391	1250	606	1465	821	1680
177	1036.	392	1251	607	1466	822	1681
178	1037.	393	1252	608	1467	823	1682
179	1038.	394	1253	609	1468	824	1683
180	1039.	395	1254	610	1469	825	1684
181	1040	396	1255	611	1470	826	1685
182	1041	397	1256	612	1471	827	1686
183	1042	398	1257	613	1472	828	1687
184	1043	399	1258	614	1473	829	1688
185	1044	400	1259	615	1474	830	1689
186	1045	401	1260	616	1475	831	1690
187	1046	402	1261	617	1476	832	1691
188	1047	403	1262	618	1477	833	1692
189	1048	404	1263	619	1478	834	1693
190	1049	405	1264	620	1479	835	1694
191	1050	406	1265	621	1480	836	1695
192	1051	407	1266	622	1481	837	1696
193	1052	408	1267	623	1482	838	1697
194	1053	409	1268	624	1483	839	1698
195	1054	410	1269	625	1484	840	1699
196	1055	411	1270	626	1485	841	1700
197	1056	412	1271	627	1486	842	1701
198	1057	413	1272	628	1487	843	1702
199	1058	414	1273	629	1488	844	1703
200	1059	415	1274	630	1489	845	1704
201	1060	416	1275	631	1490	846	1705
202	1061	417	1276	632	1491	847	1706
203	1062	418	1277	633	1492	848	1707
204	1063	419	1278	634	1493	849	1708
205	1064	420	1279	635	1494	850	1709
206	1065	421	1280	636	1495	851	1710
207	1066	422	1281	637	1496	852	1711
208	1067	423	1282	638	1497	853	1712
209	1068	424	1283	639	1498	854	1713
210	1069	425	1284	640	1499	855	1714
211	1070	426	1285	641	1500	856	1715
212	1071	427	1286	642	1501	857	1716
213	1072	428	1287	643	1502	858	1717
214	1073	429	1288	644	1503	859	1718
215	1074	430	1289	645	1504

*Последовательности РНК предоставлены для анти-смысловой цепи дцРНК в 5' дo 3' направлении.

** T44966 и T44967 являются положительным контролем, основанным на мРНК аргинин киназы Phyllotreta striolata, описанной в Zhao и др. (2008), Eur. J. Entomol., 5:815.

[0095] Варианты осуществления последовательностей дцРНК, предоставленные в Таблице 1, как правило, полезны для РНК-опосредованного подавления соответствующего гена-мишени указанного в Таблице 1. Эти дцРНК полезны для борьбы с насекомыми, особенно с блошками, включая вид-источник, у которого гены-мишени из Таблицы 1 были идентифицированы. РНК-опосредованное подавление одного или более генов-мишеней, представленных в Таблице 1, или использование одной или более дцРНК, представленных в Таблице 1, полезно для того, чтобы вызвать смертность или задержку роста или иным образом контролировать целевые виды насекомых в следующих родах: Altica, Anthobiodes, Aphthona, Aphthonaltica, Aphthonoides, Apteopeda, Argopistes, Argopus, Arrhenocoela, Batophila, Blepharida, Chaetocnema, Clitea, Crepidodera, Derocrepis, Dibolia, Disonycha, Epitrix, Hermipyxis, Hermaeophaga, Hespera, Hippuriphila, Horaia, Hyphasis, Lipromima, Liprus, Longitarsus, Luperomorpha, Lythraria, Manobia, Mantura, Meishania, Minota, Mniophila, Neicrepidodera, Nonarthra, Novofoudrasia, Ochrosis, Oedionychis, Oglobinia, Omeisphaera, Ophrida, Orestia, Paragopus, Pentamesa, Philopona, Phygasia, Phyllotreta, Podagrica, Podagricomela, Podontia, Pseudodera, Psylliodes, Sangariola, Sinaltica, Sphaeroderma, Systena, Trachyaphthona, Xuthea и Zipangia. В вариантах осуществления изобретения, композиции, содержащие дцРНК для подавления одного или более генов-мишеней, представленных в Таблице 1 (например, композиция, содержащая эффективное количество одной или более дцРНК, представленных в Таблице 1), полезны для контроля по меньшей мере одного из Altica ambiens (блошки ольхи), Altica canadensis (блошки земляной), Altica chalybaea (блошки виноградной), Altica prasina (блошки тополя), Altica rosae (блошки розы), Altica sylvia (блошки голубики), Altica ulmi (блошки вяза), Chaetocnema pulicaria (блошки кукурузной), Chaetocnema conofinis (блошки сладкого картофеля), Epitrix cucumeris (блошки картофельной), Systena blanda (бледнополосатой блошки), и Systena frontalis (рыжей блошки), что предотвращает или вылечивает заражение растений этими видами. Например, композиция, содержащая эффективное количество одной или более из дцРНК, представленных в Таблице 1, полезна для предотвращения или лечения заражения растений картофеля Epitrix cucumeris (картофельная блошка).

[0096] В вариантах осуществления изобретения, РНК-опосредованное подавление одного или более генов-мишеней, представленных в Таблице 1, или использование одной или более дцРНК, представленных в Таблице 1, полезно для вызывания смертности или задержки роста у видов блошек в родах Phyllotreta и Psylliodes, таким образом предотвращая или вылечивая заражение растений этими видами. В конкретных вариантах осуществления изобретения, РНК-опосредуемое подавление одного или более генов-мишеней, представленных в Таблице 1, или использование одной или более из дцРНК, представленных в Таблице 1, полезно для того, чтобы вызвать смертность или задержку роста по меньшей мере у одного вида блошек из группы, состоящей из Phyllotreta armoraciae (блошки хреновой), Phyllotreta cruciferae (блошки канолы), Phyllotreta pusilla (западной черной блошки), Phyllotreta nemorum (блошки земляной светлоногой), Phyllotreta atra (блошки репы), Phyllotreta robusta (садовой блошки), Phyllotreta striolata (блошки полосатой), Phyllotreta undulata, Psylliodes chrysocephala, и Psylliodes punctulata (блошки конопляной). В вариантах реализации изобретения, РНК-опосредованное подавление одного или более генов-мишеней, имеющих последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1-296, используется для вызывания гибели или задержки роста у взрослой или личинок Phyllotreta atra (блошки репы), например, с помощью контактирования взрослых, личинок или яиц Phyllotreta atra с эффективным количеством дцРНК, содержащей последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 860-1155. В вариантах реализации изобретения, РНК-опосредованное подавление одного или более генов-мишеней, имеющих последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 297-532, используется для вызывания гибели или задержки роста у взрослой или личинок Phyllotreta cruciferae (блошка канолы), например, с помощью контактирования взрослых, личинок или яиц Phyllotreta cruciferae с эффективным количеством дцРНК, содержащей последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1156-1391, 1731-1972 и 1974. В вариантах реализации изобретения, РНК-опосредованное подавление одного или более генов-мишеней, имеющих последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 533-551, используется для вызывания гибели или задержки роста у взрослой или личинок Phyllotreta striolata (полосатая блошка), например, с помощью контактирования взрослых, личинок или яиц Phyllotreta striolata с эффективным количеством дцРНК, содержащей последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1392-1410, 1973 и 1975. В вариантах реализации изобретения, РНК-опосредованное подавление одного или более генов-мишеней, имеющих последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 552-859, используется для вызывания гибели или задержки роста у взрослой или личинок Phyllotreta chrysocephala, например, с помощью контактирования взрослых, личинок или яиц Phyllotreta chrysocephala с эффективным количеством дцРНК, содержащей последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1411-1718.

[0097] Растения, которые могут быть защищены от такого заражения с помощью трансгенной экспрессии или местного применения одной или более дцРНК, представленных в Таблице 1, включают любой вид растения или сорт, который подвержен заражению блошками, особенно растений, имеющих важное экономическое значение, включая декоративные растения и сельскохозяйственных растения. Варианты реализации таких растений включают растения из семейства Brassicaceae (семейство крестоцветных), такие как растение из рода Brassica включающие, например, один из следующих вариантов: B. napus (рапс, включая сорта, такие как канола и рутабага), B. juncea (индийская горчица), B. carinata (абиссинская горчица), B. rapa (репа), B. oleracea (дикая капуста, включая одомашненные сорта, такие как, кормовая капуста, капуста, брокколи, цветная капуста, брюссельская капуста и т. д.), B. rupestris (коричневая горчица), B. septiceps (семилетняя горчица), B. nigra (черная горчица), B. narinosa (капуста ноздреватая), B. perviridus (горчица шпинатная), B. turstfortii (азиатская горчица) и B. fructiculosa (средиземноморская капуста). В дополнительных вариантах осуществления изобретения, растения-мишени могут включать, но без ограничения, один из следующих вариантов: Glycine max (соя), Linum usitatissimum (льняное семя/лен), Zea mays (кукуруза), Carthamus tinctorius (сафлор), Helianthus annuus (подсолнечник), Nicotiana tabacum (табак), Arabidopsis thaliana, Betholettia excelsa (бразильский орех), Ricinus communis (клещевина), Cocos nucifera (кокосовый орех), Coriandrum sativum (кориандр), Gossypium spp. (хлопок), Arachis hypogaea (земляной орех или арахис), Simmondsia chinensis (жожоба), Solanum tuberosum (картофель), Elaeis guineensis (масляная пальма), Olea europaea (олива), Oryza sativa (рис), Cucurbita maxima (тыква), Hordeum vulgare (ячмень) и Triticum aestivum (пшеница).

[0098] Аспект включает композиции, содержащие эффективное количество одной или более дцРНК, представленных в Таблице 1, для местного лечения растения которое нужно обработать для, или защищать от заражения блошкой. Другой аспект включает рекомбинантный ДНК конструкт, кодирующий по меньшей мере одну цепь по меньшей мере одной дцРНК, представленных в Таблице 1, для трансгенной экспрессии в растении, которое имеет повышенную устойчивость к заражению блошкой по сравнению с растением не экспрессирующим такой конструкт.

Пример 2:

[0099] Этот пример иллюстрирует неограничивающие варианты осуществления тестирования эффективности последовательностей дцРНК и проверки полезности дцРНК для подавления экспрессии генов-мишеней для борьбы с видами насекомых. Более конкретно, этот пример иллюстрирует способ, включающий контактирование насекомого, такого как взрослая земляная блошка или личинка, с одной или более дцРНК, предназначенными для вызывания задержки роста или смертности у насекомого. Другие варианты осуществления изобретения включают способы, в которых дцРНК доставляется насекомому перорально (например, на или в пищевом материале, попадающем в организм насекомого), или посредством не-пероральной доставки (например, доставка через кутикулу насекомого или доставки с помощью контактирования с яйцом насекомого).

[00100] В одном варианте осуществления изобретения, анализ питания используется для определения эффективности дцРНК, вызывающей задержку роста или смертность у насекомых, таких как блошки. Для того, чтобы проверить эффективность дцРНК для уничтожения или задержки роста блошек, одна дискриминирующая доза (например, 100 нанограмм/миллилитр) используется для идентификации дцРНК с измеряемой способностью уничтожать или задерживать рост блошек в этой дозе. Отрицательный контроль дцРНК, такой как нацеливающийся зеленый флуоресцентный белок дцРНК (GFP), также включены в анализ. Каждую дцРНК наносят равномерно на диски листьев рапса диаметром 1,0 сантиметр и помещают в многолуночные планшеты с 2 самцами и 2 самками взрослых блошек или 4 личинками блошки на лунку. Каждые 24 часа в течение заданного периода (например, 2 недели) предоставляются новые листья с новым покрытием. Отставание в росте и смертности периодически оцениваются (например, ежедневно или каждые 2 или 3 дня).

[00101] ДцРНК, которые демонстрируют эффективность в этом одно дозовом анализе, тестируются дополнительно. Используя подобный протокол, тестируются различные дозы дцРНК, как описано выше, для определения LC50 дозы для каждой из активных дцРНК. Биоанализы включают 12-24 насекомых на дозу, выполненных в трех повторностях. Отставание в росте и смертность, оценивающиеся в течение 2-недельного периода, оценивают каждый третий день.

[00102] Последовательности дцРНК, которые подтвердили свою эффективность в подавлении гена-мишени последовательность-специфичным образом, полезны для идентификации эффективных агентов доставки РНК и составов. Инсектицидная активность составов, содержащих дцРНК, может быть оптимизирована с помощью различных методов, таких как модифицирование химических объектов в составе или модифицирование соотношения химических компонентов в составе. Не ограничивающие примеры агентов доставки и составов представлены в Примере 5.

Пример 3:

[00103] Этот пример иллюстрирует неограничивающие варианты реализации способов для проверки эффективности дцРНК для подавления или сайленсинга гена-мишени в клетке насекомого или вызывания отставания в росте или смертности у насекомого. Более конкретно, этот пример иллюстрирует методы тестирования дцРНК на эффективность в предотвращении или лечении заражений блошкой у целых растений.

[00104] Полинуклеотиды (такие как последовательности дцРНК, описанные в Примерах 1 и 2), у которых была подтверждена эффективность в подавлении гена-мишени последовательность-специфичным образом, дополнительно оценивали в анализах целого растения. В одном способе полинуклеотиды (например, антисмысловая РНК, дцРНК) наносят непосредственно на поверхность насекомых (например, путем распыления или пыления). В другом способе полинуклеотиды предоставляются насекомому в рационе насекомых (например, в бактериальной или растительной клетке, экспрессирующей полинуклеотид, такой как дцРНК формы шпилька, или искусственная приманка, содержащая полинуклеотид). Отставание в росте и смертности периодически оцениваются, как описано в Примере 2.

[00105] В различных способах, которые также подходят для крупномасштабного применения (например, на полях сельскохозяйственных культур), полинуклеотиды наносятся внекорневой подкормкой через воздушное или наземное распыление или опудривание, или внесение ядохимикатов с поливной водой на листовую поверхность, чтобы контролировать ранние сезонные повреждения от взрослой стадии жизненного цикла, или наносятся как обработка семян, чтобы контролировать личиночную или взрослую стадию жизненного цикла насекомого, или наносятся в грунт внутрирядно или нанесением смачиванием, чтобы контролировать личиночную или взрослую стадию жизненного цикла насекомого. Пример режима лиственного тестирования включает обработку растения сразу же после появления из земли и оценки лиственного повреждения, причиненного взрослыми блошками через 1-2 недели после появления всходов. Для внутрирядной или обработки семян следует аналогичный временной паттерн для оценки ущерба.

Пример 4:

[00106] Полинуклеотиды, как правило, сконструированы для модулирования экспрессии путем индукции регулирования или подавления гена-мишени насекомого и сконструированы, чтобы иметь нуклеотидную последовательность, по существу, одинаковую или по существу, комплементарную нуклеотидной последовательности гена-мишени насекомого или кДНК (например, SEQ ID NO: 1-859) или к последовательности РНК, транскрибируемой из гена-мишени насекомого, которая может быть кодирующей последовательностью или некодирующей последовательностью. Этот пример описывает неограничивающие методики полезные в конструировании и выборе полинуклеотидов для модулирования экспрессии гена-мишени насекомого.

Выбор эффективных полинуклеотидов методом «Перекрывания"

[00107] Полинуклеотиды, используемые в композициях и способах, описанных в данном документе, не обязательно должны быть полной длины гена-мишени и во многих вариантах реализации изобретения имеют гораздо меньшую длину по сравнению с геном-мишенью. Примером методики, которая будет полезна для выбора эффективных полинуклеотидов для борьбы с насекомыми, является ʺперекрываниеʺ, или оценка полинуклеотидов, соответствующих смежным или частично перекрывающим друг друга сегментам гена-мишени.

[00108] Эффективные полинуклеотиды можно идентифицировать с помощью «перекрывающихся» генов-мишеней в фрагментах выбранной длины, например, фрагменты длиной 200-300 нуклеотидов с частично перекрывающимися участками, например, около 25 нуклеотидов по длине гена-мишени. Для подавления одного гена, полинуклеотиды, сконструированные для соответствия (имеют нуклеотидную идентичность или комплементарность с) участками, которые являются уникальными для гена-мишени; выбранный участок гена-мишени может содержать кодирующую последовательность или некодирующую последовательность (например, участки промотора, 3' нетранслируемые участки, интроны и тому подобное) или их комбинацию.

[00109] Там, где это представляет интерес для конструирования полинуклеотида, эффективного в подавлении множественных генов-мишеней, множественные последовательности гена-мишени выравниваются и полинуклеотиды, сконструированные для соответствия участкам с высокой гомологией последовательности общей среди множественных мишеней. И наоборот, там, где это представляет интерес для разработки полинуклеотида, эффективного в селективном подавлении одной среди нескольких последовательностей-мишеней, последовательности множественных генов-мишеней были выровнены и полинуклеотиды сконструированы для соответствия участкам с отсутствующей или низкой гомологией последовательности общей среди множественных мишеней.

[00110] В неограничивающем примере полинуклеотиды (например, антисмысловые одноцепочечные РНК, дцРНК, антисмысловые одноцепочечные ДНК, дцДНК), способные индуцировать подавление, предназначены для каждого из генов-мишеней, перечисленных в Таблице 1 следующим образом. Несколько полинуклеотидов, каждый из 200-300 нуклеотидов в длину и содержащих последовательность, комплементарную фрагменту гена-мишени, имеющего последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-859, сконструированы так, что каждая последовательность полинуклеотида перекрывает около 25 нуклеотидов следующего смежного полинуклеотида, таким образом, что множественные полинуклеотиды в комбинации охватывают всю длину гена-мишени. (Аналогично, двухцепочечные полинуклеотиды могут быть сконструированы путем обеспечения пар смысловых и антисмысловых полинуклеотидов, причем каждая пара полинуклеотидов перекрывает следующую соседнюю пару полинуклеотидов.)

[00111] Полинуклеотиды тестируются любым удобным способом на эффективность в подавление экспрессии гена-мишени насекомого. Примеры подходящего теста включают биоанализы, описанные в данном документе в рабочих примерах. Другой тест включает местное применение полинуклеотидов либо напрямую к отдельным насекомых, или на поверхности растения, которое должно быть защищено от заражения насекомым. Одним из желаемых результатов лечения полинуклеотидом, описанным в данном документе, является предотвращение или контроль заражения насекомыми, например, с помощью индуцирования у насекомого физиологических или поведенческих изменений таких как, но без ограничения, отставание в росте, повышенная смертность, снижение репродуктивного потенциала, уменьшение или прекращение пищевого поведения или движения, или уменьшение или прекращение стадии развития метаморфоза. Другим желаемым результатом обработки полинуклеотидом, как описано в данном документе, является обеспечение растения, которое демонстрирует повышенную устойчивость к заражению насекомыми.

[00112] Процедуру перекрывания при желании можно повторить. Полинуклеотид, обеспечивающий требуемую активность, может быть сам подвергнут процедуре перекрывания. Например, сконструированы множественные перекрывающиеся полинуклеотиды, каждый из которых имеет длину 50-60 нуклеотидов и содержит последовательность, комплементарную фрагменту гена-мишени, имеющую последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-859, для которой была установлена эффективность одного полинуклеотида из 300 нуклеотидов. Дополнительные циклы анализа перекрывания могут быть проведены, где тестируются полинуклеотиды короче, чем 18, 19, 20 или 21 нуклеотидов.

[00113] Эффективные полинуклеотиды любого размера могут использоваться по отдельности или в комбинации, в различных способах, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения, один полинуклеотид используют для получения композиции (например, композиции для местного применения, или рекомбинантный ДНК-конструкт, пригодный для получения трансгенного растения). В других вариантах осуществления изобретения, используется смесь или пул различных полинуклеотидов; в таких случаях полинуклеотиды могут быть для одного гена-мишени или для нескольких генов-мишеней. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид предназначен для нацеливания на различные участки гена-мишени, например, инсектицидный полинуклеотид может содержать несколько сегментов, которые соответствуют различным экзонным участкам гена-мишени, и «спейсерные» нуклеотиды, которые не соответствуют гену-мишени могут быть необязательно использованы между сегментами или рядом с ними.

Термодинамические соображения при выборе инсектицидных полинуклеотидов

[00114] Полинуклеотиды могут быть сконструированы или их последовательность оптимизирована с использованием термодинамических соображений. Например, инсектицидные полинуклеотиды могут быть выбраны на основе термодинамики, контролирующей гибридизацию между одной цепью нуклеиновой кислоты (например, полинуклеотидом или индивидуальной миРНК) и другой (например, транскриптом гена-мишени)

[00115] Способы и алгоритмы для прогнозирования нуклеотидных последовательностей, которые, вероятно, будут эффективными при РНКи-опосредованном подавлении гена-мишени, известны в данной области техники. Не ограничивающие примеры таких способов и алгоритмов включают ʺi-scoreʺ, описанную Ichihara и др. (2007) Nucleic Acids Res., 35 (18): 123e; «Oligowalk», общедоступный в rna.urmc.rochester.edu/servers/oligowalk и описанный в Lu et al. (2008) Nucleic Acids Res., 36: W104-108; и «оценка Рейнольдса», описанная Khovorova и др. (2004) Nature Biotechnol., 22:326-330.

Допустимые несовпадения

[00116] "По существу идентичный" или "по существу комплементарный" означает, что полинуклеотид (или по меньшей мере одна цепь двухцепочечного полинуклеотида) обладает достаточной идентичностью и комплементарностью к гену-мишени или РНК, транскрибированной из гена-мишени (например, транскрипт) для подавления экспрессии гена-мишени (например, для снижения уровня или активности транскрипта гена-мишени и/или кодируемого белка). Полинуклеотидам не нужно иметь 100-процентную идентичность или комплементарности к гену-мишени или РНК, транскрибированной из гена-мишени, для подавления экспрессии гена-мишени (например, для снижения уровня или активности транскрипта гена-мишени или закодированного белка или для обеспечения контроля над видами насекомых). В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид или его часть сконструированы, чтобы быть по существу идентичными или по существу комплементарными последовательности по меньшей мере 18 или 19 смежных нуклеотидов в любом гене-мишени или РНК, транскрибированной из гена-мишени. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид или его часть сконструированы, чтобы быть точно идентичными или точно комплементарными последовательности из 21 смежного нуклеотида в любом гене-мишени или РНК, транскрибированной из гена-мишени. В определенных вариантах реализации изобретения, ʺпо существу идентичныйʺ полинуклеотид имеет 100-процентную идентичность или по меньшей мере около 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99-процентную идентичность последовательности при сравнении с последовательностью из 18 или более смежных нуклеотидов гена-мишени или РНК, транскрибируемой из гена-мишени. В определенных вариантах реализации изобретения, ʺпо существу комплементарныйʺ полинуклеотид имеет 100-процентную комплементарность последовательности или по меньшей мере около 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99-процентную комплементарность последовательности к 18 или более смежным нуклеотидам гена-мишени или РНК, транскрибируемой из гена-мишени.

[00117] Полинуклеотиды, содержащие несовпадения гена-мишени или транскрипта, могут быть использованы в определенных вариантах реализации композиций и способов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид содержит по меньшей мере 18 или по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов, которые по существу идентичны или по существу комплементарны сегменту эквивалентной длины в гене-мишени или транскрипте гена-мишени. В определенных вариантах реализации изобретения, полинуклеотид из 19 смежных нуклеотидов, которые являются по существу идентичными или по существу комплементарными сегменту эквивалентной длины в гене-мишени или транскрипте гена-мишени, может иметь 1 или 2 несовпадения с геном-мишенью или транскриптом. В определенных вариантах реализации изобретения, полинуклеотид из 20 или более нуклеотидов, который содержит смежный 19 нуклеотидный промежуток идентичности или комплементарности к сегменту эквивалентной длины в гене-мишени или транскрипте гена-мишени, может иметь 1 или 2 несовпадения с геном-мишенью или транскриптом. В определенных вариантах реализации изобретения, полинуклеотид из 21 непрерывных нуклеотидов, которые являются по существу идентичными или по существу комплементарными сегменту эквивалентной длины в гене-мишени или транскрипте гена-мишени, может иметь 1, 2 или 3 несовпадения с геном-мишенью или транскриптом. В определенных вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид из 22 или более нуклеотидов, который содержит смежный 21 нуклеотидный промежуток идентичности или комплементарности к сегменту эквивалентной длины в гене-мишени или транскрипте гена-мишени, может иметь 1, 2 или 3 несовпадения с геном-мишенью или транскриптом.

[00118] При конструировании полинуклеотидов с несовпадениями с геном-мишенью или РНК, транскрибированной из гена-мишени, могут быть использованы несовпадения определенных типов и в определенных позициях, которые, скорее всего, будут допускаться. В определенных иллюстративных вариантах реализации изобретения, используются несовпадения образованные между остатками аденина и цитозина или гуанозина и урацила, как описано Du и др. (2005) Nucleic Acids Res., 33:1671-1677. В некоторых вариантах осуществления изобретения, несовпадения в 19 паре оснований участков перекрытия расположены при низкой толерантности к позициям 5, 7, 8 или 11 (от 5' конца 19-нуклеотидной мишени), при средней толерантности к позициям 3, 4 и 12-17 (от 5' конца 19-нуклеотидной мишени), и/или при высокой толерантности к позициям на любом конце участка комплементарности, например, положения 1, 2, 18 и 19 (от 5'-конца 19-нуклеотидной мишени), как описано Du et al. (2005) Nucleic Acids Res., 33:1671-1677. Допускаемые несовпадения могут быть эмпирически определены в рутинных анализах, такие как те, что описаны в данном документе в рабочих примерах.

[00119] В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотиды содержат дополнительные нуклеотиды (например, для обеспечения стабильности или для удобства клонирования и синтеза). В одном вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид представляет собой одноцепочечную РНК, содержащую РНК цепь с сегментом из по меньшей мере 21 смежных нуклеотидов последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 860-1718 и 1722-1975, и дополнительно содержащую дополнительный 5' G или дополнительный 3' C или оба, смежные с сегментом. В одном вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид представляет собой дцРНК, содержащую РНК цепь с сегментом из по меньшей мере 21 смежных нуклеотидов последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 860-1718 и 1722-1975, и дополнительно содержащую дополнительный 5' G или дополнительный 3' C или оба, смежные с сегментом. В другом варианте осуществления изобретения, полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК, содержащую дополнительные нуклеотиды для формирования "липкого" конца, например, дцРНК, содержащая 2 дезоксирибонуклеотида для формирования 3' "липкого" конца.

Встраивание активных инсектицидных полинуклеотидов в нейтральную последовательность

[00120] В одном варианте осуществления изобретения, полинуклеотид с последовательностью, комплементарной гену-мишени и которая ответственна за наблюдаемое подавление гена-мишени, встраивается в «нейтральную» последовательность, например, вставлена в дополнительные нуклеотиды, которые не имеют идентичности или комплементарности последовательности к гену-мишени. Нейтральная последовательность может быть желательной, например, для увеличения общей длины полинуклеотида. Например, может быть желательно, чтобы полинуклеотид был определенного размера для обеспечения стабильности, эффективности в производстве или биологической активности.

[00121] Сообщалось, что в другого вида жесткокрылых, Diabrotica virgifera, дцРНК, большие чем или равные приблизительно 60 парам оснований (п.о.), необходимы для биологической активности в биоанализе искусственного корма; см. Bolognesi и др. (2012) PLoS ONE 7(10): e47534. doi:10.1371/journal.pone.0047534. Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения, дцРНК из 21-пары оснований, соответствующий гену-мишени из Таблицы 1 и обеспечивающий контроль за заражением насекомым, вставлен в нейтральную последовательность из дополнительных 39 пар оснований, формируя таким образом полинуклеотид из около 60 пар оснований. В другом варианте осуществления изобретения, один полинуклеотид из 21-пары оснований оказывается эффективным, когда он встроен в большие участки нейтральной последовательности, например, когда общая длина полинуклеотида составляет от около 60 до около 300 пар оснований. В другом варианте реализации изобретения, по меньшей мере один сегмент из по меньшей мере 21 смежных нуклеотидов последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 860-1718 и 1722-1975, вставлен в большие участки нейтральной последовательности для обеспечения эффективного инсектицидного полинуклеотида. В другом варианте осуществления изобретения, сегменты из нескольких последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 860-1718 и 1722-1975, вставлены в большие участки нейтральной последовательности для обеспечения эффективного инсектицидного полинуклеотида.

[00122] Предполагается, что комбинация определенных рекомбинантных полинуклеотидов, описанных в данном документе (например, одноцепочечная РНК, дцРНК, одноцепочечная ДНК или дцДНК, состоящая из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или ее активных фрагментов), с одним или более не полинуклеотидными пестицидными агентами приведет к улучшению профилактики или борьбы с заражениями насекомыми, по сравнению с эффектом, полученным только с одним полинуклеотидом или не полинуклеотидным пестицидным агентом. Рутинные биоанализы насекомого, такие как биоанализы, описанные в данном документе в рабочих примерах, могут быть использованы для определения дозы-ответов для гибели личинок или ингибирования роста, используя комбинации из полинуклеотидов, описанных в данном документе, и один или более не-полинуклеотдиных пестицидных агентов (например, пататин, растительный лектин, фитоэкдистероид, инсектицидный белок Bacillus thuringiensis, инсектицидный белок Xenorhabdus, инсектицидный белок Photorhabdus, инсектицидный белок Bacillus laterosporous, и инсектицидный белок Bacillus sphaericus). Специалист в данной области может тестировать комбинации полинуклеотидов и пептидных агентов, отличных от полинуклеотидов, в обычных биоанализах для определения комбинаций биоактивных веществ, которые эффективны для использования в защите растений от заражения насекомыми.

Пример 5:

[00123] Этот пример иллюстрирует неограничивающие варианты реализации способов тестирования эффективности инсектицидных полинуклеотидов у блошек. Более конкретно этот пример иллюстрирует способ, включающий пероральное введение полинуклеотидов блошкам, в результате чего задерживается рост или наступает гибель блошек.

[00124] P. cruciferae были собраны с поля канолы, где никакие пестициды не применялась в предыдущие 3-х месяца. Три группы дцРНК (SEQ ID NO: 1169, 1193 и 1392), нацеленные на гены Phyllotreta, и одну дцРНК отрицательного контроля, нацеленную на GFP, тестировали в группах по 30 P. cruciferae. ДцРНК были ресуспендированы в воде и нанесены на 6 миллиметровые диски листа (55 ± 6 миллиграмм каждый) в дискриминирующей дозе 50 нанограмм дцРНК/миллиграмм ткани листа, которые были даны с кормом группам из 5 блошек. Листовые диски с свеженанесенной дцРНК заменяли каждый день, и количество выживших особей был зарегистрировано за 2-недельный период. Низкий показатель коэффициента неспецифической смертности наблюдался в группе отрицательного контроля насекомых (3 из 30 насекомых, умирающих за 2 недели, или 10% от неспецифической смертности). Смертности наблюдается в начале 4-й дня и продолжается в течение 2 недельного периода. Специфическая смертность наблюдалось для всех дцРНК обработок (Таблица 2). Исправление для неспецифической смертности (вычитая коэффициент неспецифической смертности для 3 насекомых на группу для исправления N=27), процент смертности, наблюдаемый в конце 2-недельного периода, составил 85% (SEQ ID NO: 1169), 0,70% (SEQ ID NO: 1193) и 0,63% (SEQ ID NO: 1392). Эти результаты показали эффективность дцРНК для вызывания гибели блошек при предоставлении в рационе блошек.

Таблица 2 Совокупное количество мертвых P. cruciferae (N=30)

День	Отрицательный контроль	SEQ ID NO:1169	SEQ ID NO:1193	SEQ ID NO:1392
0	0	0	0	0
2	1	2	1	1
4	2	6	2	2
6	2	9	3	3
8	2	13	8	9
10	3	18	16	15
12	3	23	19	18
14	3	26	22	20

[00125] Во второй серии экспериментов, проведенных аналогичным образом, несколько дцРНК испытывали при различной дозе 50 нанограмм дцРНК/миллиграмм ткани листа на P. cruciferae; также были испытаны две более низкие дозы (15 нанограмм дцРНК/миллиграмм ткани листа и 2 нанограмма дцРНК/миллиграмм ткани листа). Десять блошек были протестированы в каждой дозе. Используемый отрицательный контроль (пять повторов) представлял собой дцРНК, нацеленную на бактериальный ген uidA, кодирующий бета-глюкуронидазу (номер доступа NCBI NC_000913.3). Листовые диски с свеженанесенной дцРНК заменяли каждый день, и смертность была зафиксирована в течение 12-дневного периода. Общий коэффициент смертности для отрицательного контроля составил ~4% вероятно из-за манипуляционных повреждений) в течение 12-дневного периода наблюдения. Наблюдаемая кумулятивная смертность (N=10) после 12 дней воздействия дцРНК представлена в Таблице 3; значения отрицательного контроля смертности приведены как среднее (N=5). Восемь дцРНК (показаны с помощью рейтинга смертности +++) вызывали 90-100% смертность при самой высокой дозе и были все еще эффективны (80% смертность или выше) при самой низкой протестированной дозе. Некоторые дцРНК (показаны с помощью рейтинга смертности ++) вызывали смертность у части насекомых при самой высокой дозе, но были менее эффективны при более низких дозах (<20% смертности).

Таблица 3

	совокупная смертность (N=10)	Оценка смертности*
дцРНК SEQ ID NO :**	50 нг/мг	15 нг/мг	2 нг/мг
870	3	1	0	-
876	3	1	0	-
1156	2	0	0	-
1157	10	3	0	-
1158	2	0	0	-
1159	5	2	0	-
1160	2	0	0	-
1161	10	3	1	-
1163	4	4	2	-
1164	10	8	4	++
1165	8	7	5	++
1166	5	2	2	-
1167	6	2	0	-
1168	8	5	0	-
1169	10	10	8	+++
1170	9	5	3	-
1171	10	10	6	++
1392	3	2	0	-
1393	6	1	0	-
1186	9	7	5	-
1394	9	9	5	-
1187	9	9	8	+++
1193	10	10	9	+++
1210	6	3	1	-
1219	8	3	2	-
1224	10	9	8	+++
1234	10	7	6	++
1243	5	2	0	-
1258	9	4	2	-
1396	9	6	5	++
1397	6	3	0	-
1398	8	7	7	++
1399	10	10	8	+++
1400	2	1	1	-
1403	9	6	6	-
1404	10	7	4	-
1405	6	6	2	-
1406	9	9	7	+++
1407	10	9	8	+++
1408	9	9	9	+++
отрицательный контроль (GFP)	0,6	0,6	0,4	-
отрицательный контроль (бета-глюкуронидаза)	0,4	0,6	0,2	-
отрицательный контроль (только вода)	0,2	0,4	0,6	-

*+++ оценка указывает на высокую (>80%) смертность для всех трех доз; ++ оценка указывает на высокую смертность для самой высокой дозы, и в пределах 40 дo 70% смертности с двумя низкими дозами.

**последовательности предоставлены для анти-смысловой цепи дцРНК в 5' дo 3' направлении.

[00126] Рассматриваются другие способы доставки этих или подобных инсектицидных полинуклеотидов и включают нанесение полинуклеотидов непосредственно на поверхность насекомых (например, путем распыления или опудривания) или предоставление полинуклеотида для насекомых в рационе или приманке (например, в бактериальной или растительной клетке, экспрессирующей дцРНК или в искусственной приманке, содержащей дцРНК). В одном варианте осуществления изобретения, сконструирован вариант «шпилька» инсектицидного полинуклеотида Phyllotreta с последовательностью SEQ ID NO: 1169; эта версия «шпильки» кодируется последовательностью ДНК SEQ ID NO: 1722, которая содержит в последовательности от 5 'до 3' антисмысловую последовательность (положения нуклеотидов 1-267), последовательность «петли» (положения нуклеотидов 268-373), которая не содержат совпадения с последовательностями Phyllotreta, и последовательность восприятия (положения нуклеотидов 374-640). Эта последовательность ДНК экспрессируется как одноцепочечный РНК транскрипт, в котором анти-смысловые и смысловые участки отжигаются для формирования двухцепочечного участка ʺстебляʺ шпильки. Конструкт экспрессируется в бактерии, такой как E. coli; полученная дцРНК «шпилька», произведенная в бактерии, предоставляется блошкам в виде неочищенного или очищенного продукта ферментации, или в форме бактериальных клеток. Подобные конструкты сконструированы кодирующими дцРНК, имеющими модифицированные шпильки, такие как ʺстабилизированные анти-смысловыеʺ и ʺстабилизированные смысловыеʺ версии, которые содержат стабилизированные петли, образованные с помощью расширенной анти-смысловой или смысловой последовательности, соответственно, последовательности, соответствующей предполагаемому гену-мишени.

Пример 6:

[00127] Этот пример описывает варианты осуществления изобретения, относящиеся к полинуклеотидным молекулам, имеющим нуклеотидную последовательность, содержащую определенные модификации, такие как нуклеотидные замены. Варианты реализации таких модификаций содержат модифицированные полинуклеотиды, которые обеспечивают улучшенную дискриминацию последовательности между предполагаемым геном-мишенью интересующего насекомого-вредителя и генетическими последовательностями других, не целевых видов.

[00128] Выбранные дцРНК, идентифицированные в таблице 1, были подвергнуты скринингу на незапланированные совпадения последовательности с последовательностью по меньшей мере из 19 смежных нуклеотидов, идентифицированных в нецелевом гене или нецелевом организме (NTO, например Apis mellifera, Bombus impatiens и B. terrestris; Coleomegilla sрp., Danaus plexippus, Homo sapiens, Megachile rotundata, Mus musculus и Brassica rapa). Изменения нуклеотидов производятся в оригинальной полинуклеотидной последовательности, чтобы исключить смежные последовательности, совпадающие с нецелевым геном или нецелевым организмом. Примеры таких модифицированных полинуклеотидных последовательностей приведены в SEQ ID NO: 1723, что соответствует SEQ ID NO: 1393 (которая нацелена на один и тот же ген земляной блошки, как и инсектицидный полинуклеотид SEQ ID NO: 1392) и SEQ ID NO: 1724, что соответствует SEQ ID NO: 1169.

Пример 7:

[00129] Этот пример описывает варианты осуществления изобретения, относящиеся к полинуклеотидным молекулам, имеющим нуклеотидную последовательность для подавления гена-мишени у более чем одного вида. Варианты осуществления изобретения включают последовательности дцРНК из по меньшей мере 21 смежных нуклеотидов, определенных как имеющие 100% комплементарность или идентичность с более чем одному ортологу гена-мишени.

[00130] Таблица 4 содержит перечень последовательностей, каждая из по меньшей мере 21 смежных нуклеотидов в длину и идентифицированных по координатам последовательности в дцРНК для одного вида блошки, причем идентичная последовательность также находится в дцРНК для разных видов блошек. Эти последовательности полезны для разработки инсектицидных полинуклеотидов против множества видов, у которых последовательности встречаются совместно. Например, SEQ ID NO: 1186 (нацеливающаяся на COPI альфа ген-мишень Phyllotreta cruciferae, SEQ ID NO: 327) содержит пять последовательностей по меньшей мере из 21 смежных нуклеотидов в положениях 1-71, 88-116, 136-209, 238-266, и 274-296, все из которых совпадают с последовательностью в SEQ ID NO: 882 и 888 (нацеливающаяся на COPI альфа ген-мишень Phyllotreta atra, SEQ ID NO: 23 и 29, соответственно); эти пять последовательностей поэтому полезны для нацеливания на ген в двух видах Phyllotreta.

Таблица 4

Полинуклеотид ЗАПРОСА	Полинуклеотид СУБЪЕКТА		Полинуклеотид ЗАПРОСА	Полинуклеотид СУБЪЕКТА
SEQ ID NO:	старт	конец	SEQ ID NO:		SEQ ID NO:	старт	конец	SEQ ID NO:
1186	1	71	882, 888		1333	329	351	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1186	88	116	882, 888		1334	42	98	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1186	136	209	882, 888		1334	109	185	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1186	238	266	882, 888		1334	187	254	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1186	274	296	882, 888		1334	271	302	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191	51	96	900-908, 910		1335	2	47	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191	137	177	900-908, 910		1335	49	116	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191	179	216	900-908, 910		1335	133	164	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191	218	255	900-908, 910		1335	229	251	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191	257	342	900-908, 910		1336	34	90	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192	2	25	900-908, 910		1336	101	177	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192	66	106	900-908, 910		1336	179	246	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192	108	145	900-908, 910		1336	263	294	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192	147	184	900-908, 910		1338	40	96	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192	186	271	900-908, 910		1338	107	183	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192	273	298	900-908, 910		1338	185	252	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192	300	330	900-908, 910		1338	269	300	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191	58	96	900-908, 910		1328	35	59	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192	300	336	900-908, 910		1331	60	84	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191	44	96	900-908, 910		1332	1	26	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191	179	200	900-908, 910		1333	36	60	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192	108	129	900-908, 910		1334	74	98	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191	218	242	900-908, 910		1336	66	90	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192	147	171	900-908, 910		1338	72	96	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191	257	277	900-908, 910		1331	1	26	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192	186	206	900-908, 910		1334	2	40	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191	257	334	900-908, 910		1336	2	32	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192	186	263	900-908, 910		1338	2	38	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191	257	320	900-908, 910		1328	36	59	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192	186	249	900-908, 910		1331	61	84	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1193	15	101	911, 915, 916, 919		1332	3	26	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1194	6	92	911, 915, 916, 919		1333	37	60	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1195	2	107	911, 915, 916, 919		1334	75	98	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1195	121	207	911, 915, 916, 919		1336	67	90	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1196	2	122	911, 915, 916, 919		1338	73	96	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1196	136	222	911, 915, 916, 919		1329	172	191	1039-1043 1045
1197	2	20	911, 915, 916, 919		1329	265	296	1039-1043 1045
1197	22	42	911, 915, 916, 919		1329	298	317	1039-1043 1045
1197	44	180	911, 915, 916, 919		1329	319	343	1039-1043 1045
1197	194	280	911, 915, 916, 919		1330	181	200	1039-1043 1045
1198	18	38	911, 915, 916, 919		1330	274	305	1039-1043 1045
1198	40	176	911, 915, 916, 919		1330	307	326	1039-1043 1045
1198	190	276	911, 915, 916, 919		1330	328	352	1039-1043 1045
1199	5	25	911, 915, 916, 919		1335	283	302	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1199	27	163	911, 915, 916, 919		1337	1	19	1043, 1045
1199	177	263	911, 915, 916, 919		1337	93	124	1043, 1045
1200	16	152	911, 915, 916, 919		1337	126	145	1043, 1045
1200	166	252	911, 915, 916, 919		1337	147	171	1043, 1045
1201	19	105	911, 915, 916, 919		1329	319	352	1039-1043 1045
1202	2	119	911, 915, 916, 919		1337	147	180	1043, 1045
1202	133	219	911, 915, 916, 919		1386	2	38	1054-1057, 1060, 1496, 1498
1203	14	100	911, 915, 916, 919		1386	40	59	1054-1057, 1060, 1496, 1498
1193	123	189	911, 915, 916, 919		1386	70	95	1054-1057, 1060, 1496, 1498
1194	114	180	911, 915, 916, 919		1386	103	161	1054-1057, 1060, 1496, 1498
1195	229	295	911, 915, 916, 919		1386	196	262	1054-1057, 1060, 1496, 1498
1196	244	310	911, 915, 916, 919		1388	2	51	1054-1057, 1060, 1496, 1498
1197	302	350	911, 915, 916, 919		1388	53	72	1054-1057, 1060, 1496, 1498
1198	298	350	911, 915, 916, 919		1388	83	108	1054-1057, 1060, 1496, 1498
1199	285	352	911, 915, 916, 919		1388	116	174	1054-1057, 1060, 1496, 1498
1200	274	340	911, 915, 916, 919		1388	209	275	1054-1057, 1060, 1496, 1498
1201	127	193	911, 915, 916, 919		1390	88	119	1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1202	241	307	911, 915, 916, 919		1390	145	194	1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1203	122	188	911, 915, 916, 919		1390	196	215	1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1193	123	196	911, 915, 916, 919		1390	226	251	1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1193	198	230	911, 915, 916, 919		1390	259	317	1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1194	114	187	911, 915, 916, 919		1391	19	50	1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1194	189	221	911, 915, 916, 919		1391	76	125	1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1195	229	302	911, 915, 916, 919		1391	127	146	1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1195	304	336	911, 915, 916, 919		1391	157	182	1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1196	1	122	911, 915, 916, 919		1391	190	248	1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1196	244	317	911, 915, 916, 919		1391	283	349	1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1196	319	351	911, 915, 916, 919		1384	20	39	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1197	60	180	911, 915, 916, 919		1384	62	84	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1198	56	176	911, 915, 916, 919		1384	134	204	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1199	43	163	911, 915, 916, 919		1384	206	249	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1199	285	351	911, 915, 916, 919		1384	251	270	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1200	32	152	911, 915, 916, 919		1384	284	305	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1200	274	347	911, 915, 916, 919		1385	21	40	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1201	127	200	911, 915, 916, 919		1385	63	85	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1201	202	234	911, 915, 916, 919		1385	135	205	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1202	241	314	911, 915, 916, 919		1385	207	250	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1202	316	348	911, 915, 916, 919		1385	252	271	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1203	122	195	911, 915, 916, 919		1385	285	306	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1203	197	229	911, 915, 916, 919		1387	2	21	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1204	6	25	920, 921, 922, 923, 924		1387	23	42	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1204	27	49	920, 921, 922, 923, 924		1387	56	77	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1204	51	118	920, 921, 922, 923, 924		1389	1	55	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1204	186	214	920, 921, 922, 923, 924		1389	57	100	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1204	219	268	920, 921, 922, 923, 924		1389	102	121	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1204	270	295	920, 921, 922, 923, 924		1389	135	156	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1204	306	351	920, 921, 922, 923, 924		1386	196	255	1054-1057, 1060, 1496, 1498
1205	180	199	920, 921, 922, 923, 924		1388	209	268	1054-1057, 1060, 1496, 1498
1205	201	223	920, 921, 922, 923, 924		1391	283	342	1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1205	225	292	920, 921, 922, 923, 924		1387	257	321	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1206	10	29	920, 921, 922, 923, 924		1387	332	351	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1206	31	53	920, 921, 922, 923, 924		1390	25	56	1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1206	55	122	920, 921, 922, 923, 924		1384	284	321	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1206	190	218	920, 921, 922, 923, 924		1385	285	322	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1206	223	272	920, 921, 922, 923, 924		1387	56	93	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1206	274	299	920, 921, 922, 923, 924		1389	135	172	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1206	310	351	920, 921, 922, 923, 924		1386	196	332	1054-1057, 1060, 1496, 1498
1207	11	33	920, 921, 922, 923, 924		1388	209	345	1054-1057, 1060, 1496, 1498
1207	35	102	920, 921, 922, 923, 924		1391	283	352	1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1207	170	198	920, 921, 922, 923, 924		1384	323	348	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1207	203	252	920, 921, 922, 923, 924		1385	324	349	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1207	254	279	920, 921, 922, 923, 924		1387	95	120	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1207	290	335	920, 921, 922, 923, 924		1387	128	153	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1208	18	40	920, 921, 922, 923, 924		1387	161	186	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1208	42	109	920, 921, 922, 923, 924		1387	191	210	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1208	177	205	920, 921, 922, 923, 924		1389	174	199	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1208	210	259	920, 921, 922, 923, 924		1389	207	232	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1208	261	286	920, 921, 922, 923, 924		1389	240	265	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1208	297	342	920, 921, 922, 923, 924		1389	270	289	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1209	101	120	920, 921, 922, 923, 924		1283	177	208	1064-1070
1209	122	144	920, 921, 922, 923, 924		1284	130	161	1064-1070
1209	146	213	920, 921, 922, 923, 924		1284	301	351	1064-1070
1209	281	309	920, 921, 922, 923, 924		1286	210	241	1064-1070
1209	314	351	920, 921, 922, 923, 924		1287	126	157	1064-1070
1205	2	91	920, 921, 922, 923, 924		1287	297	351	1064-1070
1205	114	142	920, 921, 922, 923, 924		1288	326	351	1064-1070, 1071
1205	144	178	920, 921, 922, 923, 924		1289	41	72	1064-1070
1209	35	63	920, 921, 922, 923, 924		1289	212	288	1064-1070
1209	65	99	920, 921, 922, 923, 924		1289	320	351	1064-1070
1204	306	347	920, 921, 922, 923, 924		1290	178	209	1064-1070
1207	290	331	920, 921, 922, 923, 924		1291	228	259	1064-1070, 1071
1208	297	338	920, 921, 922, 923, 924		1292	43	74	1064-1070
1207	290	352	920, 921, 922, 923, 924		1292	214	290	1064-1070
1208	297	351	920, 921, 922, 923, 924		1292	322	351	1064-1070
1205	18	91	920, 921, 922, 923, 924		1293	330	351	1064-1070, 1071
1224	1	43	947-949, 951-956		1377	37	68	1064-1070
1224	57	95	947-949, 951-956		1377	208	284	1064-1070
1224	97	145	947-949, 951-956		1377	316	348	1064-1070
1224	147	175	947-949, 951-956		1289	212	274	1064-1070
1224	177	208	947-949, 951-956		1292	214	276	1064-1070
1224	210	262	947-949, 951-956		1377	208	270	1064-1070
1224	285	350	947-949, 951-956		1285	123	148	1067-1069, 1071
1225	150	192	947, 949, 951-956		1288	107	132	1064-1070, 1071
1225	206	244	947, 949, 951-956		1291	9	34	1064-1070, 1071
1225	246	294	947, 949, 951-956		1293	111	136	1064-1070, 1071
1225	296	324	947, 949, 951-956		1287	297	347	1064-1070
1225	326	351	947, 949, 951-956		1289	212	262	1064-1070
1226	258	300	947, 949, 951-955		1292	214	264	1064-1070
1226	314	351	947, 949, 951-955		1377	208	258	1064-1070
1227	253	295	947, 949, 951-955		1287	297	352	1064-1070
1227	309	347	947, 949, 951-955		1289	212	266	1064-1070
1228	206	248	947, 949, 951-956		1292	214	268	1064-1070
1228	262	300	947, 949, 951-956		1377	208	262	1064-1070
1228	302	350	947, 949, 951-956		1285	18	61	1067-1069, 1071
1229	171	213	947, 949, 951-956		1288	2	45	1064-1070, 1071
1229	227	265	947, 949, 951-956		1293	6	49	1064-1070, 1071
1229	267	315	947, 949, 951-956		1357	1	40	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1229	317	345	947, 949, 951-956		1357	63	85	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1230	252	294	947, 949, 951-955		1357	102	157	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1230	308	346	947, 949, 951-955		1357	159	189	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1231	191	233	947, 949, 951-956		1357	191	322	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1231	247	285	947, 949, 951-956		1358	25	47	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1231	287	335	947, 949, 951-956		1358	64	119	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1232	196	238	947, 949, 951-956		1358	121	151	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1232	252	290	947, 949, 951-956		1358	153	284	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1232	292	340	947, 949, 951-956		1359	31	53	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1233	209	251	947, 949, 951-956		1359	70	125	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1233	265	303	947, 949, 951-956		1359	127	157	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1233	305	351	947, 949, 951-956		1359	159	290	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1224	177	202	947-949, 951-956		1360	38	60	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1225	1	72	947, 949, 951-956		1360	77	132	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1225	74	135	947, 949, 951-956		1360	134	164	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1225	137	192	947, 949, 951-956		1360	166	297	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1226	110	180	947, 949, 951-955		1361	1	41	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1226	182	243	947, 949, 951-955		1361	64	86	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1226	245	300	947, 949, 951-955		1361	103	158	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1227	105	175	947, 949, 951-955		1361	160	190	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1227	177	238	947, 949, 951-955		1361	192	323	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1227	240	295	947, 949, 951-955		1362	31	53	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1228	58	128	947, 949, 951-956		1362	70	125	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1228	130	191	947, 949, 951-956		1362	127	157	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1228	193	248	947, 949, 951-956		1362	159	290	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1229	23	93	947, 949, 951-956		1363	33	55	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1229	95	156	947, 949, 951-956		1363	72	127	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1229	158	213	947, 949, 951-956		1363	129	159	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1230	104	174	947, 949, 951-955		1363	161	292	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1230	176	237	947, 949, 951-955		1364	4	59	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1230	239	294	947, 949, 951-955		1364	61	91	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1231	43	113	947, 949, 951-956		1364	93	224	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1231	115	176	947, 949, 951-956		1365	35	57	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1231	178	233	947, 949, 951-956		1365	74	129	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1232	48	118	947, 949, 951-956		1365	131	161	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1232	120	181	947, 949, 951-956		1365	163	294	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1232	183	238	947, 949, 951-956		1366	2	26	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1233	61	131	947, 949, 951-956		1366	28	58	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1233	133	194	947, 949, 951-956		1366	60	191	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1233	196	251	947, 949, 951-956		1367	2	116	1079, 1080, 1081, 1082, 1152, 1153, 1154
1224	227	262	947-949, 951-956		1358	322	345	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1224	57	94	947-949, 951-956		1359	328	350	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1225	2	72	947, 949, 951-956		1362	328	351	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1225	206	243	947, 949, 951-956		1363	330	352	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1226	1	96	947, 949, 951-955		1364	262	285	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1226	98	180	947, 949, 951-955		1365	332	351	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1227	2	91	947, 949, 951-955		1366	229	252	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1227	93	175	947, 949, 951-955		1367	154	177	1079-1082, 1152-1154
1227	309	346	947, 949, 951-955		1358	322	344	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1228	2	44	947, 949, 951-956		1362	328	350	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1228	46	128	947, 949, 951-956		1364	262	284	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1228	262	299	947, 949, 951-956		1366	229	251	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1229	11	93	947, 949, 951-956		1367	154	176	1079-1082, 1152-1154
1229	227	264	947, 949, 951-956		1368	126	145	1083, 1087
1230	2	90	947, 949, 951-955		1368	153	177	1083, 1087
1230	92	174	947, 949, 951-955		1368	186	208	1083, 1087
1230	308	345	947, 949, 951-955		1368	224	253	1083, 1087
1231	2	29	947, 949, 951-956		1369	161	180	1083, 1084, 1089
1231	31	113	947, 949, 951-956		1370	124	143	1083, 1087
1231	247	284	947, 949, 951-956		1370	151	175	1083, 1087
1232	2	34	947, 949, 951-956		1370	184	206	1083, 1087
1232	36	118	947, 949, 951-956		1370	222	251	1083, 1087
1232	252	289	947, 949, 951-956		1369	278	303	1083, 1084, 1089
1233	2	47	947, 949, 951-956		1369	182	201	1083, 1084, 1089
1233	49	131	947, 949, 951-956		1371	1	71	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1233	265	302	947, 949, 951-956		1371	82	122	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1226	7	96	947, 949, 951-955		1371	124	180	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1227	1	91	947, 949, 951-955		1371	182	244	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1226	8	96	947, 949, 951-955		1372	16	56	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1227	3	91	947, 949, 951-955		1372	58	114	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1230	1	90	947, 949, 951-955		1372	116	178	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1226	54	96	947, 949, 951-955		1373	2	61	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1227	49	91	947, 949, 951-955		1373	72	112	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1228	1	44	947, 949, 951-956		1373	114	170	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1230	48	90	947, 949, 951-955		1373	172	234	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1233	5	47	947, 949, 951-956		1374	1	68	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1224	125	145	947-949, 951-956		1374	79	119	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1225	274	294	947, 949, 951-956		1374	121	177	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1228	330	350	947, 949, 951-956		1374	179	241	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1229	295	315	947, 949, 951-956		1375	2	41	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1231	315	335	947, 949, 951-956		1375	52	92	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1232	320	340	947, 949, 951-956		1375	94	150	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1233	333	351	947, 949, 951-956		1375	152	214	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1234	50	135	960, 964		1376	7	47	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1234	149	168	960, 964		1376	49	105	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1234	170	350	960, 964		1376	107	169	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1235	175	260	960, 963, 964		1371	124	148	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1235	274	293	960, 963, 964		1372	58	82	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1235	295	351	960, 963, 964		1373	114	138	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1236	190	275	960, 963, 964		1374	121	145	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1236	289	308	960, 963, 964		1375	94	118	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1236	310	351	960, 963, 964		1376	49	73	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1237	269	350	960, 963, 964		1371	182	276	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1238	51	136	960, 964		1371	278	333	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1238	150	169	960, 964		1372	116	210	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1238	171	350	960, 964		1372	212	267	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1239	50	135	960, 964		1372	269	309	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1239	149	168	960, 964		1372	311	352	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1239	170	351	960, 964		1373	172	266	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1240	103	188	960, 963, 964		1373	268	323	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1240	202	221	960, 963, 964		1373	325	351	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1240	223	351	960, 963, 964		1374	179	273	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1241	269	351	960, 963, 964		1374	275	330	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1242	87	172	960, 963, 964		1374	332	351	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1242	186	205	960, 963, 964		1375	152	246	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1242	207	351	960, 963, 964		1375	248	303	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1235	2	23	960, 963, 964		1375	305	345	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1235	25	114	960, 963, 964		1376	107	201	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1236	2	38	960, 963, 964		1376	203	258	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1236	40	129	960, 963, 964		1376	260	300	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1237	2	39	960, 963, 964		1376	302	342	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1237	41	117	960, 963, 964		1371	278	303	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1237	119	208	960, 963, 964		1372	212	237	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1240	2	42	960, 963, 964		1373	268	293	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1241	2	39	960, 963, 964		1374	275	300	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1241	41	117	960, 963, 964		1375	248	273	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1241	119	208	960, 963, 964		1376	203	228	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1242	2	26	960, 963, 964		1371	124	155	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1234	38	135	960, 964		1372	58	89	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1234	170	211	960, 964		1373	114	145	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1235	25	136	960, 963, 964		1374	121	152	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1235	163	260	960, 963, 964		1375	94	125	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1235	295	336	960, 963, 964		1376	49	80	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1236	1	38	960, 963, 964		1371	182	241	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1236	40	151	960, 963, 964		1372	116	175	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1236	178	275	960, 963, 964		1373	172	231	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1237	81	117	960, 963, 964		1374	179	238	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1237	119	230	960, 963, 964		1375	152	211	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1237	257	350	960, 963, 964		1376	107	166	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1238	39	136	960, 964		1371	278	325	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1238	171	212	960, 964		1372	212	259	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1239	38	135	960, 964		1373	268	315	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1239	170	211	960, 964		1374	275	322	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1240	2	64	960, 963, 964		1375	248	295	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1240	91	188	960, 963, 964		1376	203	250	1093-1095, 1098, 1100 -1103
1240	223	264	960, 963, 964		1309	1	69	1114, 1115
1241	81	117	960, 963, 964		1309	71	96	1114, 1115
1241	119	230	960, 963, 964		1309	98	144	1114, 1115
1241	257	351	960, 963, 964		1309	152	195	1114, 1115
1242	2	48	960, 963, 964		1309	197	237	1114, 1115
1242	75	172	960, 963, 964		1309	254	352	1114, 1115
1242	207	248	960, 963, 964		1310	25	92	1114, 1115
1243	118	158	965, 966, 968, 969		1310	94	119	1114, 1115
1243	283	304	965, 966, 968, 969		1310	121	167	1114, 1115
1243	310	348	965, 966, 968, 969		1310	175	218	1114, 1115
1244	165	205	965, 966, 968, 969		1310	220	260	1114, 1115
1244	330	351	965, 966, 968, 969		1310	277	351	1114, 1115
1246	205	245	965, 966, 967, 968, 969		1311	7	74	1114, 1115
1247	206	246	965, 966, 967, 968, 969		1311	76	101	1114, 1115
1248	163	203	965, 966, 968, 969		1311	103	149	1114, 1115
1248	328	349	965, 966, 968, 969		1311	157	200	1114, 1115
1245	1	20	967		1311	202	242	1114, 1115
1245	22	42	967		1311	259	351	1114, 1115
1245	104	135	967		1312	9	76	1114, 1115
1245	137	155	967		1312	78	103	1114, 1115
1245	187	209	967		1312	105	151	1114, 1115
1246	36	58	965, 966, 967, 968, 969		1312	159	202	1114, 1115
1247	37	59	965, 966, 967, 968, 969		1312	204	244	1114, 1115
1244	330	352	965, 966, 968, 969		1312	261	352	1114, 1115
1249	2	20	970, 973, 974, 978, 979		1309	2	69	1114, 1115
1250	5	84	969-971, 973-979		1309	254	327	1114, 1115
1250	86	270	969-971, 973-979		1310	22	92	1114, 1115
1250	278	306	969-971, 973-979		1310	277	350	1114, 1115
1250	326	351	969-971, 973-979		1311	4	74	1114, 1115
1251	2	52	969-971, 973-979		1311	259	332	1114, 1115
1251	54	238	969-971, 973-979		1312	6	76	1114, 1115
1251	246	274	969-971, 973-979		1312	261	334	1114, 1115
1251	294	322	969-971, 973-979		1315	56	87	1117, 1119-1125
1253	115	194	969-971, 973-979		1315	91	114	1117, 1119-1125
1253	196	351	969-971, 973-979		1315	116	144	1117, 1119-1125
1254	3	31	970, 971, 973, 974, 977-979		1315	146	171	1117, 1119-1125
1254	51	79	970, 971, 973, 974, 977-979		1315	185	225	1117, 1119-1125
1255	282	352	970, 971, 973-978, 1626, 1629		1315	275	294	1117, 1119-1125
1256	1	53	970, 971, 973-978		1315	317	342	1117, 1119-1125
1256	55	239	970, 971, 973-978		1316	22	45	1117, 1119-1125
1256	247	275	970, 971, 973-978		1316	47	75	1117, 1119-1125
1256	295	323	970, 971, 973-978		1316	77	102	1117, 1119-1125
1257	6	85	970, 971, 973-978		1316	116	156	1117, 1119-1125
1257	87	271	970, 971, 973-978		1316	206	225	1117, 1119-1125
1257	279	307	970, 971, 973-978		1316	248	273	1117, 1119-1125
1257	327	351	970, 971, 973-978		1316	275	317	1117, 1119-1125
1250	1	84	969-971, 973-979		1318	144	175	1117, 1119-1125
1250	326	352	969-971, 973-979		1318	179	202	1117, 1119-1125
1251	294	319	969-971, 973-979		1318	204	232	1117, 1119-1125
1253	112	194	969-971, 973-979		1318	234	259	1117, 1119-1125
1254	51	76	970, 971, 973, 974, 977-979		1318	273	313	1117, 1119-1125
1255	279	352	970, 971, 973-978, 1626, 1629		1319	2	20	1117, 1119-1125
1256	295	320	970, 971, 973-978		1319	24	47	1117, 1119-1125
1257	3	85	970, 971, 973-978		1319	49	77	1117, 1119-1125
1252	31	89	972		1319	79	104	1117, 1119-1125
1252	91	236	972		1319	118	158	1117, 1119-1125
1252	238	266	972		1319	208	227	1117, 1119-1125
1252	277	337	972		1319	250	275	1117, 1119-1125
1249	2	23	970, 973, 974, 978, 979		1319	277	319	1117, 1119-1125
1249	25	44	970, 973, 974, 978, 979		1313	17	81	1118, 1125
1250	34	84	969-971, 973-979		1313	92	117	1118, 1125
1251	1	52	969-971, 973-979		1313	137	204	1118, 1125
1251	294	325	969-971, 973-979		1313	215	240	1118, 1125
1251	327	346	969-971, 973-979		1313	242	291	1118, 1125
1253	144	194	969-971, 973-979		1313	293	329	1118, 1125
1254	51	82	970, 971, 973, 974, 977-979		1314	22	89	1118-1125
1254	84	103	970, 971, 973, 974, 977-979		1314	100	125	1118-1125
1255	311	352	970, 971, 973-978, 1626, 1629		1314	127	176	1118-1125
1256	3	53	970, 971, 973-978		1314	178	214	1118-1125
1256	295	326	970, 971, 973-978		1317	25	92	1118, 1120-1122, 1124, 1125
1256	328	347	970, 971, 973-978		1317	103	128	1118, 1120-1122, 1124, 1125
1257	35	85	970, 971, 973-978		1317	130	179	1118, 1120-1122, 1124, 1125
1250	47	84	969-971, 973-979		1317	181	217	1118, 1120-1122, 1124, 1125
1251	15	52	969-971, 973-979		1314	332	351	1118-1125
1253	157	194	969-971, 973-979		1315	27	51	1117, 1119-1125
1255	324	352	970, 971, 973-978, 1626, 1629		1316	275	306	1117, 1119-1125
1256	16	53	970, 971, 973-978		1318	115	139	1117, 1119-1125
1257	48	85	970, 971, 973-978		1319	277	308	1117, 1119-1125
1250	2	84	969-971, 973-979		1314	330	351	1118-1125
1250	86	241	969-971, 973-979		1315	25	51	1117, 1119-1125
1251	54	209	969-971, 973-979		1316	275	303	1117, 1119-1125
1253	1	68	969-971, 973-979		1317	333	351	1118, 1120-1122, 1124, 1125
1253	91	194	969-971, 973-979		1318	113	139	1117, 1119-1125
1253	196	352	969-971, 973-979		1319	277	305	1117, 1119-1125
1255	169	235	970, 971, 973-978, 1626, 1629		1314	262	293	1118-1125
1255	258	352	970, 971, 973-978, 1626, 1629		1314	295	314	1118-1125
1256	55	210	970, 971, 973-978		1314	316	351	1118-1125
1257	1	85	970, 971, 973-978		1315	11	51	1117, 1119-1125
1257	87	242	970, 971, 973-978		1317	265	296	1118, 1120-1122, 1124, 1125
1250	86	110	969-971, 973-979		1317	298	317	1118, 1120-1122, 1124, 1125
1251	54	78	969-971, 973-979		1317	319	351	1118, 1120-1122, 1124, 1125
1253	2	68	969-971, 973-979		1318	45	76	1117, 1119-1125
1253	196	220	969-971, 973-979		1318	78	97	1117, 1119-1125
1255	39	130	970, 971, 973-978, 1626, 1629		1318	99	139	1117, 1119-1125
1255	132	235	970, 971, 973-978, 1626, 1629		1316	275	324	1117, 1119-1125
1256	55	79	970, 971, 973-978		1319	277	326	1117, 1119-1125
1257	87	111	970, 971, 973-978		1299	50	96	1126-1131, 1651-1653
1250	326	350	969-971, 973-979		1300	2	43	1126-1131, 1651-1653
1251	294	318	969-971, 973-979		1300	66	112	1126-1131, 1651-1653
1253	110	194	969-971, 973-979		1300	123	154	1126-1131, 1651-1653
1254	51	75	970, 971, 973, 974, 977-979		1300	183	211	1126-1131, 1651-1653
1255	277	352	970, 971, 973-978, 1626, 1629		1300	213	232	1126-1131, 1651-1653
1256	295	319	970, 971, 973-978		1300	264	310	1126-1131, 1651-1653
1257	327	352	970, 971, 973-978		1301	1	35	1126-1131
1250	32	84	969-971, 973-979		1301	37	84	1126-1131
1253	142	194	969-971, 973-979		1301	107	153	1126-1131
1255	309	352	970, 971, 973-978, 1626, 1629		1301	164	195	1126-1131
1257	33	85	970, 971, 973-978		1301	224	252	1126-1131
1249	46	68	970, 973, 974, 978, 979		1301	254	273	1126-1131
1250	61	84	969-971, 973-979		1301	305	351	1126-1131
1251	29	52	969-971, 973-979		1302	26	54	1126-1131, 1651-1653
1253	171	194	969-971, 973-979		1302	56	75	1126-1131, 1651-1653
1254	105	127	970, 971, 973, 974, 977-979		1302	107	153	1126-1131, 1651-1653
1256	30	53	970, 971, 973-978		1303	11	39	1126-1131, 1651-1653
1257	62	85	970, 971, 973-978		1303	41	60	1126-1131, 1651-1653
1259	192	226	999-1004		1303	92	138	1126-1131, 1651-1653
1259	249	298	999-1004		1299	50	114	1126-1131, 1651-1653
1259	321	352	999-1004		1299	131	162	1126-1131, 1651-1653
1260	190	224	999-1004		1299	215	236	1126-1131, 1651-1653
1260	247	296	999-1004		1299	248	270	1126-1131, 1651-1653
1260	319	351	999-1004		1299	272	309	1126-1131, 1651-1653
1261	99	133	999-1004		1300	264	328	1126-1131, 1651-1653
1261	156	205	999-1004		1302	107	171	1126-1131, 1651-1653
1261	228	289	999-1004		1302	188	219	1126-1131, 1651-1653
1261	300	334	999-1004		1302	272	293	1126-1131, 1651-1653
1262	82	116	999-1004		1302	305	327	1126-1131, 1651-1653
1262	139	188	999-1004		1302	329	351	1126-1131, 1651-1653
1262	211	272	999-1004		1303	92	156	1126-1131, 1651-1653
1262	283	317	999-1004		1303	173	204	1126-1131, 1651-1653
1262	319	350	999-1004		1303	257	278	1126-1131, 1651-1653
1263	324	351	999-1004		1303	290	312	1126-1131, 1651-1653
1264	191	225	999-1004		1303	314	351	1126-1131, 1651-1653
1264	248	297	999-1004		1299	272	352	1126-1131, 1651-1653
1264	320	351	999-1004		1299	272	344	1126-1131, 1651-1653
1265	98	132	999-1004		1299	272	318	1126-1131, 1651-1653
1265	155	204	999-1004		1299	272	310	1126-1131, 1651-1653
1265	227	288	999-1004		1304	2	25	1132, 1134, 1135, 1136
1265	299	333	999-1004		1304	36	169	1132, 1134, 1135, 1136
1259	95	145	999-1004		1304	186	214	1132, 1134, 1135, 1136
1259	165	226	999-1004		1304	231	250	1132, 1134, 1135, 1136
1260	93	143	999-1004		1304	264	307	1132, 1134, 1135, 1136
1260	163	224	999-1004		1306	2	70	1132, 1134, 1135, 1136
1261	1	52	999-1004		1306	87	115	1132, 1134, 1135, 1136
1261	72	133	999-1004		1306	132	151	1132, 1134, 1135, 1136
1262	1	35	999-1004		1306	165	208	1132, 1134, 1135, 1136
1262	55	116	999-1004		1307	1	27	1132, 1134, 1135, 1136
1263	227	277	999-1004		1307	29	69	1132, 1134, 1135, 1136
1263	297	351	999-1004		1307	80	213	1132, 1134, 1135, 1136
1264	94	144	999-1004		1307	230	258	1132, 1134, 1135, 1136
1264	164	225	999-1004		1307	275	294	1132, 1134, 1135, 1136
1265	2	51	999-1004		1307	308	351	1132, 1134, 1135, 1136
1265	71	132	999-1004		1308	2	33	1132, 1134, 1135, 1136
1259	15	40	999-1004		1308	44	177	1132, 1134, 1135, 1136
1259	42	64	999-1004		1308	194	222	1132, 1134, 1135, 1136
1259	66	88	999-1004		1308	239	258	1132, 1134, 1135, 1136
1259	90	145	999-1004		1308	272	315	1132, 1134, 1135, 1136
1259	165	219	999-1004		1347	2	28	1132, 1134, 1135, 1136
1260	13	38	999-1004		1347	39	172	1132, 1134, 1135, 1136
1260	40	62	999-1004		1347	189	217	1132, 1134, 1135, 1136
1260	64	86	999-1004		1347	234	253	1132, 1134, 1135, 1136
1260	88	143	999-1004		1347	267	310	1132, 1134, 1135, 1136
1260	163	217	999-1004		1305	1	133	1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1261	2	52	999-1004		1305	135	154	1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1261	72	126	999-1004		1305	156	178	1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1262	55	109	999-1004		1305	195	280	1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1263	1	60	999-1004		1305	330	351	1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1263	105	127	999-1004		1344	13	35	1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1263	147	172	999-1004		1344	52	137	1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1263	174	196	999-1004		1344	187	208	1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1263	198	220	999-1004		1345	50	181	1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1263	222	277	999-1004		1345	183	202	1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1263	297	352	999-1004		1345	204	226	1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1264	14	39	999-1004		1345	243	328	1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1264	41	63	999-1004		1346	2	81	1133, 1137, 1138
1264	65	87	999-1004		1346	131	152	1133, 1137, 1138
1264	89	144	999-1004		1304	1	25	1132, 1134, 1135, 1136
1264	164	218	999-1004		1304	264	334	1132, 1134, 1135, 1136
1265	71	125	999-1004		1306	165	235	1132, 1134, 1135, 1136
1259	190	226	999-1004		1307	46	69	1132, 1134, 1135, 1136
1260	188	224	999-1004		1308	10	33	1132, 1134, 1135, 1136
1261	97	133	999-1004		1308	272	342	1132, 1134, 1135, 1136
1262	80	116	999-1004		1347	5	28	1132, 1134, 1135, 1136
1263	322	351	999-1004		1347	267	337	1132, 1134, 1135, 1136
1264	189	225	999-1004		1304	101	169	1132, 1134, 1135, 1136
1265	96	132	999-1004		1306	1	70	1132, 1134, 1135, 1136
1259	96	145	999-1004		1306	237	310	1132, 1134, 1135, 1136
1260	94	143	999-1004		1306	312	352	1132, 1134, 1135, 1136
1261	3	52	999-1004		1307	145	213	1132, 1134, 1135, 1136
1263	228	277	999-1004		1308	109	177	1132, 1134, 1135, 1136
1264	95	144	999-1004		1347	104	172	1132, 1134, 1135, 1136
1265	1	51	999-1004		1307	38	69	1132, 1134, 1135, 1136
1259	165	218	999-1004		1308	1	33	1132, 1134, 1135, 1136
1260	163	216	999-1004		1344	187	239	1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1261	72	125	999-1004		1344	241	272	1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1262	55	108	999-1004		1344	286	308	1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1263	2	60	999-1004		1344	310	329	1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1263	297	350	999-1004		1346	131	183	1133, 1137, 1138
1264	164	217	999-1004		1346	185	216	1133, 1137, 1138
1265	71	124	999-1004		1346	230	252	1133, 1137, 1138
1266	2	39	1016-1023		1346	254	273	1133, 1137, 1138
1266	41	87	1016-1023		1305	227	280	1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1266	89	129	1016-1023		1344	84	137	1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1267	2	74	1016-1023		1345	275	328	1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1267	76	122	1016-1023		1346	28	81	1133, 1137, 1138
1267	124	164	1016-1023		1346	290	351	1133, 1137, 1138
1268	2	53	1016-1023		1348	44	66	1139, 1140, 1141, 1142
1268	55	101	1016-1023		1348	104	129	1139, 1140, 1141, 1142
1268	103	143	1016-1023		1348	131	156	1139, 1140, 1141, 1142
1269	2	72	1016-1023		1348	158	195	1139, 1140, 1141, 1142
1269	74	120	1016-1023		1348	167	189	1139, 1140, 1141, 1142
1269	122	162	1016-1023		1348	197	237	1139, 1140, 1141, 1142
1270	2	107	1016-1023		1348	215	234	1139, 1140, 1141, 1142
1270	109	155	1016-1023		1348	4	49	1139, 1140, 1141, 1142
1270	157	197	1016-1023		1348	4	74	1139, 1140, 1141, 1142
1271	2	62	1016-1023		1348	4	85	1139, 1140, 1141, 1142
1271	64	110	1016-1023		1349	19	90	1143
1271	112	152	1016-1023		1349	146	207	1143
1266	131	177	1016-1023		1349	209	256	1143
1266	179	207	1016-1023		1350	32	51	1144-1151, 1703
1266	209	243	1016-1023		1350	71	90	1144-1151, 1703
1267	166	212	1016-1023		1351	118	137	1144-1151
1267	214	242	1016-1023		1351	157	176	1144-1151
1267	244	278	1016-1023		1353	81	100	1144-1151
1268	145	191	1016-1023		1353	120	139	1144-1151
1268	193	221	1016-1023		1354	1	42	1144-1151
1268	223	257	1016-1023		1354	218	237	1144-1151
1269	164	210	1016-1023		1354	257	276	1144-1151
1269	212	240	1016-1023		1356	43	62	1144-1151
1269	242	276	1016-1023		1356	82	101	1144-1151
1270	199	245	1016-1023		1350	176	201	1144-1151, 1703
1270	247	275	1016-1023		1350	209	231	1144-1151, 1703
1270	277	311	1016-1023		1350	236	267	1144-1151, 1703
1271	154	200	1016-1023		1351	262	287	1144-1151
1271	202	230	1016-1023		1351	295	317	1144-1151
1271	232	266	1016-1023		1351	322	351	1144-1151
1266	209	294	1016-1023		1353	225	250	1144-1151
1266	296	316	1016-1023		1353	258	280	1144-1151
1267	1	74	1016-1023		1353	285	316	1144-1151
1267	244	329	1016-1023		1356	187	212	1144-1151
1267	331	351	1016-1023		1356	220	242	1144-1151
1268	223	308	1016-1023		1356	247	278	1144-1151
1268	310	330	1016-1023		1350	236	265	1144-1151, 1703
1269	242	327	1016-1023		1351	322	352	1144-1151
1269	329	349	1016-1023		1353	285	314	1144-1151
1270	35	107	1016-1023		1356	247	276	1144-1151
1270	277	351	1016-1023		1350	287	306	1144-1151, 1703
1271	232	317	1016-1023		1350	323	348	1144-1151, 1703
1271	319	339	1016-1023		1352	2	21	1147, 1150, 1151, 1703
1266	296	318	1016-1023		1352	38	63	1147, 1150, 1151, 1703
1267	4	74	1016-1023		1355	5	24	1147, 1150, 1151, 1703
1268	310	332	1016-1023		1355	41	66	1147, 1150, 1151, 1703
1269	1	72	1016-1023		1356	298	317	1144-1151
1269	329	351	1016-1023		1358	322	351	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1270	37	107	1016-1023		1364	262	291	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1271	319	341	1016-1023		1366	229	258	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1266	131	157	1016-1023		1367	154	183	1079-1082, 1152-1154
1267	166	192	1016-1023		1361	2	41	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1268	145	171	1016-1023		1210	1	35	1431
1269	164	190	1016-1023		1211	30	63	1431
1270	199	225	1016-1023		1213	15	48	1431
1271	154	180	1016-1023		1217	19	52	1431
1295	113	168	1026, 1027, 1024		1357	162	200	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1295	170	201	1026, 1027, 1024		1358	124	162	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1295	203	233	1026, 1027, 1024		1359	130	168	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1295	236	258	1026, 1027, 1024		1360	137	175	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1297	128	183	1026, 1027, 1024		1361	163	201	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1297	185	216	1026, 1027, 1024		1362	130	168	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1297	218	248	1026, 1027, 1024		1363	132	170	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1296	1	44	1025, 1028, 1029, 1515-1518, 1520		1364	64	102	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1298	7	57	1025, 1028, 1029		1365	134	172	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1298	59	96	1025, 1028, 1029		1366	31	69	1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1298	110	132	1025, 1028, 1029		1054	198	244	1492, 1496, 1497, 1498
1298	143	210	1025, 1028, 1029		1054	285	319	1492, 1496, 1497, 1498
1295	17	87	1026, 1027, 1024		1056	191	237	1492, 1496, 1497, 1498
1297	32	102	1026, 1027, 1024		1056	278	312	1492, 1496, 1497, 1498
1294	127	153	1027		1057	14	60	1492, 1496, 1497, 1498
1295	17	46	1026, 1027, 1024		1057	101	135	1492, 1496, 1497, 1498
1297	32	61	1026, 1027, 1024		1057	233	264	1492, 1496, 1497, 1498
1298	5	57	1025, 1028, 1029		1060	269	315	1492, 1496, 1497, 1498
1320	249	268	1033, 1035, 1076		1390	10	50	1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1324	2	23	1036, 1037, 1038		1390	142	173	1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1326	14	38	1036, 1037, 1038		1391	73	104	1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1326	95	117	1036, 1037, 1038		1055	85	131	1493, 1494, 1495, 1499, 1500
1326	152	174	1036, 1037, 1038		1058	117	163	1493, 1494, 1495, 1499, 1500
1326	227	248	1036, 1037, 1038		1059	118	164	1493, 1494, 1495, 1499, 1500
1327	44	65	1036, 1037, 1038		1061	109	155	1493, 1494, 1495, 1499, 1500
1321	65	86	1037		1062	222	268	1493, 1494, 1495, 1499, 1500
1321	88	132	1037		1063	262	308	1493, 1494, 1495, 1499, 1500
1322	2	34	1037		1054	15	64	1492, 1496, 1497, 1498
1322	36	67	1037		1054	165	196	1492, 1496, 1497, 1498
1322	135	156	1037		1056	8	57	1492, 1496, 1497, 1498
1322	158	202	1037		1056	158	189	1492, 1496, 1497, 1498
1323	1	35	1037		1060	86	135	1492, 1496, 1497, 1498
1323	37	68	1037		1060	236	267	1492, 1496, 1497, 1498
1323	136	157	1037		1386	199	248	1054-1057, 1060, 1496, 1498
1323	159	203	1037		1388	212	261	1054-1057, 1060, 1496, 1498
1324	2	51	1036, 1037, 1038		1391	286	335	1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1324	56	93	1036, 1037, 1038		1384	311	351	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1324	95	126	1036, 1037, 1038		1385	312	351	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1324	194	215	1036, 1037, 1038		1387	83	123	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1324	217	261	1036, 1037, 1038		1389	162	202	1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1325	2	31	1037		1296	69	101	1025, 1028, 1029, 1515, 1516, 1517, 1518, 1520
1325	33	64	1037		909	305	340	1531
1325	132	153	1037		960	70	101	1543, 1551
1325	155	199	1037		964	259	290	1543, 1551
1326	227	276	1036, 1037, 1038		1305	180	226	1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1326	281	318	1036, 1037, 1038		1133	195	226	1580, 1581
1326	320	350	1036, 1037, 1038		1137	52	83	1580, 1581
1327	44	93	1036, 1037, 1038		1344	37	83	1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1327	98	135	1036, 1037, 1038		1345	228	274	1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1327	137	168	1036, 1037, 1038		1305	180	217	1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1327	236	257	1036, 1037, 1038		1344	37	74	1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1327	259	303	1036, 1037, 1038		1345	228	265	1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1324	2	24	1036, 1037, 1038		1039	176	210	1590, 1594, 1597, 1598
1326	227	249	1036, 1037, 1038		1040	142	176	1590, 1594, 1597, 1598
1327	44	66	1036, 1037, 1038		1041	248	282	1590, 1594, 1597, 1598
1328	3	59	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598		1042	141	175	1590, 1594, 1597, 1598
1328	70	146	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598		1328	175	209	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1328	148	215	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598		1331	2	54	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1328	232	263	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598		1331	200	234	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1328	328	350	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598		1332	142	176	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1329	22	53	1039-1043 1045		1333	176	210	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1329	118	140	1039-1043 1045		1334	16	68	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1330	31	62	1039-1043 1045		1334	214	248	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1330	127	149	1039-1043 1045		1335	76	110	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1331	28	84	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598		1336	8	60	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1331	95	171	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598		1336	206	240	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1331	173	240	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598		1338	14	66	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1331	257	288	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598		1338	212	246	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1332	2	26	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598		1255	165	199	970, 971, 973-978, 1626, 1629
1332	37	113	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598		976	129	163	1626, 1629
1332	115	182	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598		1299	98	129	1126-1131, 1651-1653
1332	199	230	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598		1300	312	343	1126-1131, 1651-1653
1332	295	317	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598		1302	155	186	1126-1131, 1651-1653
1333	4	60	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598		1303	140	171	1126-1131, 1651-1653
1333	71	147	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598		1350	314	345	1144-1151, 1703
1333	149	216	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598		1352	29	60	1147, 1150, 1151, 1703
1333	233	264	1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598		1355	32	63	1147, 1150, 1151, 1703

Пример 8:

[00131] Этот пример описывает варианты осуществления изобретения, относящиеся к полинуклеотидным молекулам, имеющим нуклеотидную последовательность, содержащую определенные модификации, такие как нуклеотидные замены. Варианты реализации таких модификаций содержат модифицированные полинуклеотиды, которые обеспечивают улучшенную дискриминацию последовательности между предполагаемым геном-мишенью интересующего насекомого-вредителя и генетическими последовательностями других, не целевых видов.

[00132] Двухцепочечные РНК, идентифицированные в таблице 1, были подвергнуты скринингу на соответствие последовательности по меньшей мере 19 смежным нуклеотидам, идентифицированным в нецелевом гене или нецелевом организме (NTO, например, Apis mellifera, Bombus impatiens и B. terrestris; Bombyx mori; Bos taurus; Canis lupus familiaris, Coleomegilla maculata, Danio rerio, Danaus plexippus, Daphnia pulex, Equus caballus, Gallus gallus, Homo sapiens, Megachile rotundata, Mus musculus, Sus scrofa, Brassica napus, Brassica oleracea, Brassica rapa, Glycine max, Gossypium raimondii, Solanum tuberosum, Solanum lycopersicum и Zea mays) Нуклеотидные изменения производятся для устранения смежных последовательностей, соответствующих более 19 нуклеотидам, к нецелевому генам или нецелевому организму. Примеры таких модифицированных полинуклеотидных последовательностей представлены в SEQ ID NO: 1725, что соответствует SEQ ID NO: 870 (которая нацелена на ген-мишень, имеющий SEQ ID NO: 11), SEQ ID NO: 1726, которая соответствует SEQ ID NO: 1224 (которая нацелена на ген-мишень, имеющий SEQ ID NO: 365), SEQ ID NO: 1727, которая соответствует SEQ ID NO: 875 (которая нацелена на ген-мишень с SEQ ID NO: 16), SEQ ID NO: 1728, которая соответствует SEQ ID NO: 1193 (которая нацелена на ген-мишень, имеющий SEQ ID NO: 334), SEQ ID NO: 1729, которая соответствует SEQ ID NO: 871 (которая нацелена на ген-мишень с SEQ ID NO: 12) и SEQ ID NO: 1730, которая соответствует SEQ ID NO: 1187 (которая нацелена на ген-мишень, имеющий SEQ ID NO: 328).

[00133] Эти модифицированные полинуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1725-1730 полезны для конструирования полинуклеотидов для обеспечения улучшенной дискриминации между предполагаемыми видами-мишенями и нецелевыми организмами. Например, варианты осуществления инсектицидных композиций, полезных для борьбы или предотвращения заражения блошками, содержат эффективное количество дцРНК, содержащее одну цепь РНК, имеющую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1725-1730 или ее фрагмента. В вариантах осуществления изобретения, инсектицидные композиции для вызывания замедления или смертности у блошек содержат эффективное количество дцРНК, содержащее одну цепь РНК, имеющую по меньшей мере один сегмент по меньшей мере из 21 смежных нуклеотидов последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1725-1730. В вариантах осуществления изобретения, инсектицидные композиции для вызывания замедления или смертности у блошек содержат эффективное количество молекулы РНК, содержащей по меньшей мере один сегмент по меньшей мере из 21 смежных нуклеотидов последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1725-1730, причем по меньшей мере один сегмент встроен в большие участки нейтральной последовательности, чтобы обеспечить эффективный инсектицидный полинуклеотид. В другом варианте осуществления изобретения, сегменты по меньшей мере из 21 смежных нуклеотидов из множества последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1725-1730, введены в большие участки нейтральной последовательности, чтобы обеспечить эффективный инсектицидный полинуклеотид для борьбы с блошками. Способы отбора эффективных инсектицидных полинуклеотидов описаны в другом месте в этой заявке, например, способ, включающий пероральную доставку инсектицидных полинуклеотидов блошкам, что приводит к задержке роста или смертности у блошек, описанных в примере 5. Эти модифицированные полинуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1725-1730 полезны в способе вызывания смерти или задержки роста у насекомого, включая обеспечение в рационе насекомого, такого как земляная блошка, по меньшей мере одного полинуклеотида, который содержит по меньшей мере один сегмент по меньшей мере из 21 смежных нуклеотидов последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1725-1730, причем прием полинуклеотида насекомым приводит к смерти или задержке роста у насекомого; в вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1725-1730. Полинуклеотиды, содержащие последовательность SEQ ID NO: 1725-1730, полезны в способе борьбы с заражением насекомыми растения, включающим контактирование с полинуклеотидом насекомого, которое заражает растение, причем полинуклеотид содержит по меньшей мере один сегмент по меньшей мере из 21 смежных нуклеотидов последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1725-1730, посредством которой контролируется заражение насекомыми; в вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1725-1730. Полинуклеотиды, как описано в данном документе, применимы в способе обеспечения растения с повышенной устойчивостью к насекомому, включающему экспрессию в растении рекомбинантного ДНК-конструкта, причем рекомбинантная ДНК кодирует полинуклеотид, который содержит по меньшей мере один сегмент по меньшей мере из 21 смежных нуклеотидов последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1725-1730, причем прием полинуклеотида насекомым приводит к смерти или задержке роста у насекомых; в некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1725-1730.

Пример 9:

[00134] Этот пример описывает дополнительные молекулы инсектицидных полинуклеотидов с комплементарностью как к Phyllotreta cruciferae, так и Psylloides striolata. Были сконструированы в общей сложности двести сорок (240) полинуклеотидных последовательностей (SEQ ID NO: 1731-1971). Эти полинуклеотиды нацеливаются на транскрипты гена для кальмодулина, казеинкиназы 1а и фактора удлинения 1-альфа у обоих видов блошек. Пятьдесят один полинуклеотид являются перекрывающимися полинуклеотидами, которые покрывают длину транскрипта этих генов. В следующей таблице 5 приведены эти пятьдесят один перекрывающийся полинуклеотид и целевые транскрипты.

Таблица 5. Инсектицидные полинуклеотиды и транскрипты мишени

Инсектицидный полинуклеотид SEQ ID NO:	Транскрипт мишень
1731	Rpn7_PHYST-05JAN16-TRPT0002041:1
1732	Rpn7_PHYST-05JAN16-TRPT0002041:3
1733	ТубулинG_PHYST-05JAN16-TRPT0002886:1
1734	ТубулинG_PHYST-05JAN16-TRPT0002886:2
1735	ТубулинG_PHYST-05JAN16-TRPT0002886:3
1736	ТубулинG_PHYST-05JAN16-TRPT0002886:4
1737	ТубулинG_PHYST-05JAN16-TRPT0002886:5
1738	COPI_Дельта_PHYST-05JAN16-TRPT0009108:2
1739	COPI_Дельта_PHYST-05JAN16-TRPT0009108:5
1740	COPI_Дельта_PHYST-05JAN16-TRPT0009108:6
1741	COPI_Дельта_PHYST-05JAN16-TRPT0009108:11
1742	COPI_Дельта_PHYST-05JAN16-TRPT0009108:12
1743	sec23_PHYST-05JAN16-TRPT0011013:1
1744	sec23_PHYST-05JAN16-TRPT0011013:2
1745	sec23_PHYST-05JAN16-TRPT0011013:3
1746	sec23_PHYST-05JAN16-TRPT0011013:4
1747	COPI_Гамма_PHYST-05JAN16-TRPT0018736:1
1748	COPI_гамма_PHYST-05JAN16-TRPT0018736:2
1749	COPI_Гамма_PHYST-05JAN16-TRPT0018736:3
1750	COPI_Гамма_PHYST-05JAN16-TRPT0018736:4
1751	COPI_Гамма_PHYST-05JAN16-TRPT0018736:5
1752	Rpt6_PHYST-05JAN16-TRPT0036466:1
1753	Rpt6_PHYST-05JAN16-TRPT0036466:2
1754	Rpt6_PHYST-05JAN16-TRPT0036466:3
1755	Rpt6_PHYST-05JAN16-TRPT0036466:4
1756	Rpt6_PHYST-05JAN16-TRPT0036466:5
1757	актин_PHYST-05JAN16-TRPT0037252:1
1758	актин_PHYST-05JAN16-TRPT0037252:3
1759	актин_PHYST-05JAN16-TRPT0037252:5
1760	vАТФазаA_PHYST-05JAN16-TRPT0041323:1
1761	RpL13_PHYST-05JAN16-TRPT0045203:1
1762	RpL13_PHYST-05JAN16-TRPT0045203:2
1763	RpS14_PHYST-05JAN16-TRPT0045884:1
1764	RpS14_PHYST-05JAN16-TRPT0045884:2
1765	актин_PHYCR-05JAN16-TRPT0000169:2
1766	актин_PHYCR-05JAN16-TRPT0000169:3
1767	vАТФаза-A_PHYCR-05JAN16-TRPT0001064:1
1768	vАТФаза-A_PHYCR-05JAN16-TRPT0001064:3
1769	vАТФаза-A_PHYCR-05JAN16-TRPT0001064:4
1770	vАТФаза-A_PHYCR-05JAN16-TRPT0001064:5
1771	vАТФаза-A_PHYCR-05JAN16-TRPT0001064:6
1772	vАТФаза-A_PHYCR-05JAN16-TRPT0001064:7
1773	vАТФаза-A_PHYCR-05JAN16-TRPT0001064:8
1774	тубулинG_PHYCR-05JAN16-TRPT0001496:1
1775	тубулинG_PHYCR-05JAN16-TRPT0001496:2
1776	тубулинG_PHYCR-05JAN16-TRPT0001496:3
1777	тубулинG_PHYCR-05JAN16-TRPT0001496:4
1778	тубулинG_PHYCR-05JAN16-TRPT0001496:5
1779	тубулинG_PHYCR-05JAN16-TRPT0001496:6
1780	RpS14_PHYCR-05JAN16-TRPT0002697:1
1782	RpS14_PHYCR-05JAN16-TRPT0002697:2

Пример 10:

[00135] Этот пример иллюстрирует неограничивающие варианты осуществления способов тестирования эффективности инсектицидных полинуклеотидов у блошек. Более конкретно этот пример иллюстрирует способ, включающий пероральное введение дцРНК блошкам, в результате чего задерживается рост или наступает гибель блошек.

[00136] P. cruciferae и P. striolata были собраны с поля канолы, где никакие пестициды не применялась в предыдущие 3-х месяца. Две дцРНК (SEQ ID NO: 1972 и 1974), нацеленные на гены Phyllotreta cruciferae (COPI_дельта и Rpt6 соответственно), и две дцРНК (SEQ ID NO: 1973 и 1975), нацеленные на гены Phyllotreta striolata (COPI_дельта и Rpt6 соответственно), и одну дцРНК отрицательного контроля, нацеленную на GFP, тестировали в группах по 30 P. cruciferae или P. striolata, используя 10 насекомых в трех отдельных повторениях. ДцРНК были ресуспендированы в воде и нанесены на 9 миллиметровые диски листа (55 ± 6 миллиграмм каждый) в дозе 50 нанограмм дцРНК/миллиграмм ткани листа, которые были даны с кормом группам из 5 блошек. Листовые диски с свеженанесенной дцРНК заменяли каждый день, и количество выживших особей был зарегистрировано за 12-дневный период.

[00137] Низкая неспецифическая смертность наблюдалась в группах насекомых с отрицательным контролем (4 из 30 насекомых умирали в течение 12 дней для P. cruciferae или 13% неспецифической смертности и 8 из 30 насекомых умирали в течение 12 дней для P. striolata, или 26% неспецифической смертности). Смертность наблюдалась в начале 2-го дня и продолжалась в течение 12-дневного периода. Специфическая смертность наблюдалось для всех дцРНК обработок (Таблица 6). Исправление для неспецифической смертности (вычитая коэффициент неспецифической смертности для 4 или 8 насекомых на группу для исправления N=26 и N=22), процент смертности, наблюдаемый в конце 12-дневного периода, колебалась от 36-38% для тестируемой дцРНК. Эти результаты показали эффективность дцРНК для вызывания гибели блошек при предоставлении в рационе блошек и их кросс-видовом эффекте.

Таблица 6. Смертность у блошек, которых кормили искусственной диетой, содержащей инсектицидный полинуклеотид.

			Совокупная смертность (дни после обработки, N=30)
SEQ ID NO:	Виды целевого гена	Виды, против котрых тестировалось	d0	d2	d5	d7	d9	*d12*
		Crucifer	0	0	1	1	2	4
	NA	Crucifer	0	1	2	2	3	5
1972	crucifer	Crucifer	0	0	4	8	10	10
1973	striped	Crucifer	0	0	2	6	6	9
1974	crucifer	Crucifer	0	1	3	7	8	9
1975	striped	Crucifer	0	0	0	2	6	8
		Striped	0	0	1	4	7	8
	NA	Striped	0	0	1	2	6	8
1972	crucifer	Striped	0	0	3	9	10	10
1973	striped	Striped	0	0	3	9	9	10
1974	crucifer	Striped	0	0	3	7	7	8
1975	striped	Striped	0	1	3	5	8	9

[00138] Все материалы и способы, раскрытые и заявленные в данном документе, могут быть сделаны и использованы без проведения лишних экспериментов в соответствии с инструкциями описанными выше. Хотя материалы и способы, описанные в данном документе, были описаны в терминах предпочтительных вариантов реализации изобретения и иллюстративными примерами, специалистам в данной области техники будет очевидно, что вариации могут быть применены к материалам и методам, описанных в данном документе, без отступления от концепции, сущности и объема данного изобретения. Все такие сходные замены и модификации, очевидные для специалистов в данной области техники рассматриваются здесь в пределах сущности, области и концепции данного изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Monsanto Technology LLC

Beattie, Jodi

Crawford, Michael James

Eads, Brian Donovan

<120> КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ БОРЬБЫ С НАСЕКОМЫМИ-ВРЕДИТЕЛЯМИ

<130> P34170WO01

<150> США 62/287080

<151> 2016-01-26

<160> 1975

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 959

<212> ДНК

<213> Phyllotreta atra

<220>

<221> misc_feature

<223> ProsAlfa2

<400> 1

ttgtgtttat tttatcttta ccaaaaaacc gatgcagttc aaataatcaa tatacaccta 60

atgaatttcg ttgaacaatg caccgtttgc atagctcgag gtaaaaaata agaaaagaaa 120

aatcaatgaa tattacctta aagtataaaa ttttatgtac caaatacagg acaagcttaa 180

ggaatatttg ccaaaaaatc ttttactgta gaaggatcga atctcctaaa tccttgtgga 240

tcgcatatgc caacctcgat gttatcagcg gtcatttggc cctcgaaact ttctttaagc 300

gttaaaatgg cggtgtgcac agcatcatcc aattccaact cttcgctata ccttttctcg 360

aggaaggtct tcccgttgac gtaattcttt cccattgcgg tggctttcca agcgaaatac 420

gccccggaag gatcgcactg gaataagtaa ggcctgttgt tgtcccatcc gcagatcaac 480

agggacactc cgaagggtct aactcccccg gattgagtgt attcctgcat cacagtggct 540

acacgttgaa ctagctgaac agtaggaatt ggttctttgt aaaccaggta atactgttgg 600

gccattttac gcgcttgctt gaccaacaaa cggtagtcgg gtcccatccc ggaatagacc 660

attccgatgt gcttcgtgat catttccact ttgtggacgc tgtgttcgtc gtaaagaatg 720

gatttgtgct tgttttccgt ggctattacc actccatttg atgcttttat tcctactgac 780

ggagcaccag ccgctactgc cgctaaagca tattcgattt ggactagttt acctgaaggg 840

ctgaaagttg ttaaagaaaa actataacgt tcagatgaca ttttcacaaa tgattacttg 900

caagttatca acaaatgtct atagaaaaat tataggttag aatgtagctg acaggtgac 959

<210> 2

<211> 880

<212> ДНК

<213> Phyllotreta atra

<220>

<221> misc_feature

<223> ProsBeta5

<400> 2

attacaagct acaattccga ggattacgag cgactcgcct acgacgagag cctgcagaag 60

tattgcacca atttcaagaa tggcatgaac ttagctgttc ccccttttcc tgatcccagc 120

aacaactttg caaggttcac caaagatgat aacggccgtg agatcaaaat caagttcgac 180

cacggtacca ccacattggg attcatgtac aaagggggcg tagtgctcgc agtggattcc 240

cgagccactg gcggccaatt cattggatca caaactgtag agaaaatcat aaaaatcaac 300

agttttctac tagctacaat ggcaggaggc gcggctgatt gcacctactg ggaccgagta 360

ttagctaaac aatgtaggct gtacgagctg agaaacaggg aacgtatctc ggtggctgcg 420

gcttccaagt taatggccaa catggtttat aattacaagg gaatgggctt gtccatggga 480

atgatgctgg ctggatggga caaaaggggt cctcaactct actatgtcga ttcagaaggt 540

ctaaggacag ccgggaaagt gttcagcgta ggttcgggtt ccatttacgc tttcggggtg 600

ctggattctg ggtacaaatg ggacttatcc gatgaggaag cttatgattt aggtcgtaga 660

tcgatttacc acgctactca cagagacgcc tattcaggtg gtattgttag agtgtaccac 720

atgaaggaga ctggctgggt gcacatcgat gataatgatt gcatggactt gcattacaag 780

tttgtggagg aaaaggagaa gatgggtggc gcttgaatta atttgtgaat ttatattttt 840

taagagtaat aaatttcttt taataaatgc ttgataagga 880

<210> 3

<211> 720

<212> ДНК

<213> Phyllotreta atra

<220>

<221> misc_feature

<223> RpL19

<400> 3

cttcaccttt atgacattga cagttcctaa cgcagccata tttctttttc ggatacacgt 60

tgttaagagc gtgtgaaaaa tgagttcgtt aaaactccag aagaggctcg cagcctctgt 120

tatgagatgc ggcaaaaaga aggtatggtt ggatcccaac gaaatcaacg aaatcgccaa 180

cacaaattca cgacaaaaca tccgcaagct gatcaaagac ggtctgatca tcaagaagcc 240

cgtggcggtg cactcgcgcg cccgcgtccg caagaacacc gaagcccgca ggaagggcag 300

gcactgcggt ttcggtaaaa ggaaaggtac agcgaacgct cgaacaccaa gaaaagaatt 360

atggattcaa cgtatgaggg tgctccgtcg tttgttgaag aagtaccgcg aggccaagaa 420

aatcgacagg catctgtacc attcgctgta catgaaggcg aagggtaacg tgttcaagaa 480

caagcgcgtc ctgatggaat acatccacaa gaagaaggcc gagaaggcgc gcgccaagat 540

gttggccgac caggcgaacg ccaagagaat gaaggtgaaa cgggccaggg agagacgcga 600

agaacgtatc gctacgaaga agcaggaagt tttgcagaat taccagcggg aagacgaagc 660

tgccgctgct actaaaaaat aggttattct tttttcattt gatgactaat aaaaagttaa 720

<210> 4

<211> 1434

<212> ДНК

<213> Phyllotreta atra

<220>

<221> misc_feature

<223> RpL3

<400> 4

gtgaattaga catgttgctg gtgacgtttt actttatctg ccatttcatt tttcgacgtc 60

aacatgtcgc acaggaagtt tagtgcaccc cgtcacggat ctatgggatt ctaccccaag 120

aaaagatccc aaaggcaccg tggtaaagta aaggctttcc ccaaagatga cccctcgaaa 180

cccgtccatt taacagcttt cattggctac aaagccggta tgacccacgt gctacgtgag 240

gcagacaggc ctggttcgaa aatcaacaag aaggaaatcg tagaggctgt gaccattttg 300

gaaacccctc cgatgattgt agtaggcgtt gtgggttaca tcgaaactcc acatggcatg 360

agggctttgg ccaccgtttg ggctgaacat ttgtctgaag attgccgtag acgtttctac 420

aagaactggt acaagagcaa gaagaaggcc ttcaccaagg catccaagaa atggaccgac 480

gatttgggta aaaagtcaat tgagcgcgac ttgaagaaaa tcgtcaaata ctgcaaggtt 540

gtcagagtca tcgctcacac tcagatgaaa ttgttgaaac aacgccaaaa gaaagcccac 600

attatggaaa ttcaactcaa cggcggtacc attgccgaca aagtggcatg ggctaaggag 660

catttggaga agcccattcc cgttggcaac gttttcgctc aagatgagat gatcgattgc 720

atcggtgtaa ccaaaggtca tggatacaaa ggtgttacat ctcgttggca tacgaagaaa 780

ttgccccgca agacgcacaa gggtcttagg aaagtcgcct gtattggagc ctggcatcct 840

tctcgagtgt cgttcactgt cgctcgtgct ggtcaaaagg gttaccatca caggacggag 900

atgaacaaga aaatctacag aatcggcgct ggaattcaca ctaaggacgg aaaggtcatc 960

aaaaacaatg ctgctaccga ttacgatctt agtgagaaaa ctattacacc gatgggtggt 1020

ttccctcatt acggtgaagt taacaacgac ttcgtcatga ttaagggttg ttgtattgga 1080

cctaagaagc gcgtcattac actgagaaaa tctctcttgg ttcacactaa gcgtattgct 1140

ttggagaaga tcaatttgaa attcatcgat acgtcgtcca aattcggaca cggtagattc 1200

caaaccgccg ccgacaaggc tgcgttcatg ggacccctta agaaagatag agttaaggaa 1260

gaagacaaga ctgcggctcc agctgcagct gctgcttcga gttaattttt atgcaatgta 1320

ttttattgtt gacaatatac attgattcag agtatttatt tttgttataa ttttatttat 1380

tgttaccctc taatgtgctg tatttcatta attaataaaa tggatgcatt taaa 1434

<210> 5

<211> 691

<212> ДНК

<213> Phyllotreta atra

<220>

<221> misc_feature

<223> RpL40

<400> 5

ggaaggagaa agaaaggaaa agatacaaga tacgccattt tgtgtctagt gtcgtaaaga 60

gaaagttgtg aaactaaaaa cagctgttct ttcatatcaa acttctgaaa atcattaaag 120

aatgcagatc ttcgtgaaaa ccctgactgg gaaaaccatc accctcgagg tggagccgtc 180

cgataccatc gagaacgtga aagcaaaaat tcaagacaaa gaggggatcc caccagatca 240

gcaacgtttg atctttgccg gcaaacaact ggaagatgga agaaccttat ctgactacaa 300

tattcaaaaa gaatctactc tacatttagt acttcgtctc cgtggaggga tgcaaatatt 360

cgttaaaacc cttactggta aaactataac cctcgaagtt gaaccatctg atactattga 420

gaacgttaag gcgaaaatcc aagacaaaga ggggattcct ccagatcagc aacgtttaat 480

cttcgccggt aaacaactgg aagatggcag aacattgtct gactacaata ttcaaaaaga 540

gtccacactg catttagttc ttcgtctacg tggaggaatg caaatattcg ttaaaactct 600

tactggtaaa acaattactc ttgaagttga accatctgat actatcgaaa atgttaaggc 660

caaaattcaa gacaaagagg gaattcctcc a 691

<210> 6

<211> 689

<212> ДНК

<213> Phyllotreta atra

<220>

<221> misc_feature

<223> RpS21

<400> 6

tttttttttt ttaaccttag aagatagttt atttattaga aaagtttaaa ttacattttc 60

tgaatgattt aacgaagttg tgatttagaa gtttttggct aagattccat ctttcttcgt 120

taacctcaca atacaatcgt ccgattctcc catacgcctg atagctccgc agagggcgta 180

gcttttggaa ctttcggtca tccttccggt taaaggatcg acatcggcta cgctgagttg 240

aatgctagcg tggtccttag catgaataat tctgttgcta gcagagcatt tccttgggca 300

gtacaagtcg acggtttcac cagcgtcgtt ttccatgttt tatatgattg ttataaaata 360

acacacaaga aaatggatga acgtcaaaaa agaaaggaga caatgttgcc aacctgtagt 420

tacgaattta tttctttata aatttatttt catagagaaa gaaatatgag agagttcgac 480

gctgtactaa aaattggcat agcgtttgat gatcagcgct gcatgcggtt cccgcggctt 540

aaacgtgaac taagcaaggt tcgattatgt agatttcttc tgagtttctc aaaatcaaaa 600

atagggggta aatttatatt ttaattataa attggattgt gaaaattata aataaaaatt 660

acaacttttg ttaattttat aaatgtatt 689

<210> 7

<211> 591

<212> ДНК

<213> Phyllotreta atra

<220>

<221> misc_feature

<223> RpS4

<400> 7

ggttttatgg atgttatcac cattgagaaa actggtgaat tcttccgtct catctatgat 60

gtaaaaggca gattcgctat tcaccgtatt actgctgaag aagctaaata caaactgtgc 120

aaagttaaga gggttcaaac tggtccgaaa ggaattccgt ttttggtgac ccatgatgga 180

cgtaccatcc gttatcctga tcctaatatc aaggtgaatg acaccattca actagagatc 240

gctacgtcga aaattctgga ttacatcaag tttgaatcaa acaacttgtg catgattacc 300

ggaggtagaa atttgggacg tgttggtaca attatgaaca gggagcgtca tcccggttcc 360

ttcgatattg tacacattaa ggacgccaat ggtcatgctt ttgcaactag attaaataat 420

gtattcgtga ttggtaaagg agctaaagcc tttgtatctc ttccaagagg taagggtgtt 480

aagttgtcca tagccgaaga aagggataaa aggctagctg caaaaacaca ctaaacatgt 540

gttaatatta ttttcaataa aacttgcgaa aagtgttaaa aaaaaaaaaa a 591

<210> 8

<211> 3291

<212> ДНК

<213> Phyllotreta atra

<220>

<221> misc_feature

<223> Rpn2

<400> 8

gcgtatttta ttatcatatg ctcaacgatg gcttatttat aaaaatttat cgaagattac 60

agcatacaag aaatatatga ataaataatt caacactgta tgtaaaaaaa acatcttaag 120

ctgaatgaaa aaaaccaagt ttaatattta gattttagaa ataactagtg aatttctcta 180

atcctcggtc cattcgaatg gttctggtgg ttctggttcc ttttcatcat cgccctttgg 240

accgaatgct gctacgggtt ccaccaattc ctcttcacca ggtttcaaat tgcgaaccat 300

aataatccct ccgatcgaaa catccttcat tgcaacgtat tgcgagttat cattaagcgt 360

aatcactttc agctgttgcc tcatggtcct ggcaggattt tgcaggattt cgaaactagg 420

ctcgggctcc tttttcttct cctccttatc atctttctta tcttttttgt cgtcgctcga 480

cgacgccgct tttttatcgt cggttttctt atcatcggac tttttctcct ctttcttctc 540

ttcggttttc ttctccttct cctccttctc gggcttctta tcgtctttat cttcgtccac 600

atccattttc tcatcgcgat gtttcctctc gtgatccctt ctcctttgcc tggcagctat 660

actcaatacg gcagtggtga ctttctccct ttcttcgcgt ttcttttcct ccatgggcgc 720

cgggtaggcg tacaagctcg gcttcgcgtt cgatttgaac tccagtttag gcatcttaag 780

ttgagtgttc aacgctataa cgcacgtcgg ggtaaaggct aaagccagac aatgtgacag 840

agggaaccaa taccaatact gcgtaaacac caatgtaccg acaacggcca gcatattagt 900

gtggccagtt ctggattgca acgatagagt cacgttcctg ccaccggcgt cgattatacc 960

ttgcgccaag atggcgccga acttcgccat gacgtcttcg tgcttgttgg agatgacttg 1020

ggagtaggtc tgcctgaaga agctgacctt cgggcaggtc tgctcggtct gctggatgag 1080

gatcatcgcg gaggcgatga gggccccctg ccggacgaag ttcaccggat cgaacatcac 1140

catgggctcg agcagggcta tggcctcgcg aaggcccgtg ccggcgcagg ctatgcccag 1200

cgccatggcg gcgccgtaac gtacgtgggg gttgtagctt tccgctaaca gggacaccac 1260

gctgggacat tgctcggggg ttctgaacaa caggaaaccg agcgctgtga ctgccgctct 1320

tctcacgtca tcgtttacat cagaaaccgc aacgtgtaat aattttctaa tcgcctggtt 1380

gtgtcccgtg ccgcaataag ccatagctaa tgtatacatg ccggatcttc tcaggattgg 1440

atccttatca gaagtaagct gttgtattag ggtatcagct tcttctaatc ggccgtacat 1500

cgtgaagctt ataccaacag ccaaaccgcg aagaatcttt tcgtgttgac tctcttgcgc 1560

gtacgctacc atatccataa tcgtagtgga attactggat cctaacataa ccatgcccat 1620

cgcaattcca gcggcctctc cggtattagc atcatcttga tagagattga acttcagctg 1680

ttcgtagaca tcttgcctgt gtgtccccat ggcagccaaa ccaagcccta aacaaccgcc 1740

gtgcctaacc atctcattct gagcgtcttt caattgaccg agaagataat cgattatatt 1800

agcaccgtga ttggcgtgta taagacccag agcgtataaa ccaccgcctt cggaatatcc 1860

ggaactcggc ccgacttcct tcggcaaata gctttgcatg agtgtcaaag cctcttgttc 1920

gtgtccacgg tggatgacgc cgagagacgc tgttgctgta agtttcgccc aattcgtagc 1980

tcgagctagc cattccaaat tatcccttag aaattggtcg ctggtagtac cgctgtgcat 2040

gaaagcgtta gcgatgactg tagcagtgtg gcaaatacta actcgaaccg tttctttggt 2100

ttgcttcaga ataagaagat cggcgtggtt agatctaatg aggaattgaa gatgaagttc 2160

tattgatact tcgccggata ggatggtatg caatttttca attcgctttt ggtgttcctt 2220

ttcactttca gtcaaactct caatagattt ttcttccttt ttagcctcga ctttagtttc 2280

gctgctaacc ggatctttgc tagcctctgc cgaagtgcta ctagattgtt cagtagcttt 2340

agctttcacc ttttcctcta acagcgatgg aatgggagca gtagctctaa gggcaaccaa 2400

aactctttcc aaaaactgtt gggttgcaga ctcatacaga tcgaaagcta tttggtaagc 2460

catcaattcg gactcttctt taccagacac taatttatcc aaaatttctg cgactggcag 2520

tgcatcgtcc aagaaaatta gacattggca catgttaacg taatccggtg tagttaaacc 2580

gcgatacaag ccaaccaacg atcttaaaac ggtgttacga aatgccctat tctgaattag 2640

gctcatcgcc acttggaaag cgtaggtgag catgctaata atatcctcgg cttgtgtgat 2700

agataattcg aagatgtcca ttctcctggt ctctaaggcg agccccatag cctggcggtt 2760

ttgaccatca tctaaacaac gttggaacat tcgatttaca atcgcttcga gtctcgaatc 2820

aataggtttc gcatcggttg cgccttctgc caaggcgatg cgttgttgtg tatagaagtc 2880

gatgcatttt gcaagagtgg tttcaacata ttctgttcta gcatttacgt cgaagagatc 2940

accagctccc aaagcgtacg ttaacgagtc ttcgaacgca cccagatggt agtatacttt 3000

actagcgact aaagcagcta actggtgttg ttgaaacact ttgtcttcgt gcagaatttc 3060

tatcttttca atagcttctg aaatttctgg ccagaattcg tcgactatgg agtctagttt 3120

tcttaacgcg aatactttaa gttctggtct tggttcttct aaaagggata taatccccgc 3180

agccgaagta atattcatcc tttaagcgct tgaaaatatc tcaattaaat tttcagcacc 3240

agcacaaata aaaattttta ggaagtaaaa tgtcaaaatt gttttctgtc a 3291

<210> 9

<211> 1321

<212> ДНК

<213> Phyllotreta atra

<220>

<221> misc_feature

<223> Rpt6

<400> 9

tccttctgca tgaccttggc cacagccatt tcgaaatctt cttgggtaac gtgcaccctt 60

ctctctctta acgcgtacat accagcctcg gtgcaaacac ccttcacttc ggcaccgcta 120

gcgcccggca tcaattcggc gattttcctc agattgattc ctctggtcaa attcattttt 180

ctagagtgaa ttttcaggat gtccaatcgg gcttcctcgt tcggtggcgg gaattcgatt 240

ttcctgtcga ttctgccggg tctgagcaaa gccgggtcta aaatatcgat tctgttggtg 300

gccatgatga ctttaatgtt tttcgtcgct tcgaatccgt ccaattgatt gagcaactcc 360

aacattgttc tctggacttc ggaatcaccg cccgaacctg attcgatacg agaagatcca 420

atagaatcga tttcgtccat gaaaattatg gaaggtgcgt gttctctggc cataacgaaa 480

agttctctaa ccatcctgga accttctccg atgaattttt gcaccaactc cgatccagat 540

acacgaataa acgtacattc tgtatgatga gccactgctc tggccaaaag agtttttcca 600

gttcctggag gaccgtataa aagcacaccc ttcggttgag cgatacccaa ggcatcgaaa 660

agttcaggat gcttcacggg caattcaatg acctctttga tttcttttat ttgcttgtcc 720

agaccaccga ccatttcgta agtggaatcc ggcacttttt ccaccatcat aagagacact 780

aaaggatcca ccttattcgg taaaattttg tgcaaagtgt aagattcatt tcgaagagca 840

actctacaat tgggtgtgac atcgttaatg tcgatattct tatcgatatc gaccacaaat 900

tttccctccg gatgaacttt gacgaggact ttcttcttgt ccatcggttt tactacttca 960

cctacgtagc ttccttgttc ttgaagcaac atcagttctt ctctaagcat acgaactttg 1020

gcgttaagtt cgttcctttg ggcctgcaat cttcgaaggt tttgactctt ttcggcaacg 1080

ataagttgca attcttcgat tttcgtaatg taatacgacc tgaagccttc ccccttcagg 1140

cctccgtcga cctccatctt attgataaca gtcatcgtcg gtttttaatc gctcgatagt 1200

tattagagca atttttctat ttgattcaat aacaggaaac accaaacacc atataactcg 1260

gcaaagtgaa attccgaaaa tcatttaatt tgacttttga cacttgcgtg acgtaccaga 1320

c 1321

<210> 10

<211> 2552

<212> ДНК

<213> Phyllotreta atra

<220>

<221> misc_feature

<223> sec23

<400> 10

cgcgtaacct tgaaatttga tagaaaagtc aaaagtcaaa gtgcaggtga tcacgtattt 60

actatacata acttttattt aatctctttt aaaacggaaa caatatttta aatcacgagt 120

taatatcaag tttattgcat gctttaattt ggcgaagaca cgtaaaaaaa atgggtaaca 180

ggtcttcact tctgcttcgc gaagaagaaa ttgctcaaat tcaaactgaa acaggcttta 240

cgccgaatca aatcgaaagg ctgtattcaa ggttcacctc actggacaga ggagactgtg 300

gaacactgag ccgagatgat ttcctgcgga tacccgaact ggcaattaac cctctgggcg 360

aaagaatcgt gaattcgttc ttccaaaacg acgatttcaa cgacagagta aatttcaggc 420

aattcatgca agtcctcgcc cattttatac ccatcaaaaa gaacaaggaa aacaagctga 480

attctcgaga agagaaatta agatttgcct tcaaaatgta cgatttggac aatgatgata 540

tgatttcgaa ggatgaactg ttggccatat tgcacatgat ggtcggaaca aacataagcg 600

aagaacaact gaacagtatc gcagagagat cgatcacaga agcagatgaa gacggtgatc 660

agatgatttc gttcgaagaa ttttgcaagg cgctgcaaag gactgatgtg gaacagaaaa 720

tgagtataag atttttaaat taattgcgga aatcatgagt aaatcaggat atgtaaaacg 780

cttaaaaatt cttttaggca atactctata ttttgtgata gataaattat ttattatgta 840

agtttattcg ggaaatggta gttacctcac ggttgtggct gtaagttata catctgatgc 900

atttttagga taaaggtttt aaaaacgtca accgtttaca cttgttttat tcttattcca 960

tttaataata taatttgtta ctcgatgatt ttctaaataa ttcactttca ttggatacat 1020

taaaatgtgt aaagtgaatg tagcttatca caaacaacca acatctgaaa atctatgaaa 1080

taaatacata aaaaaatatt taagcttaaa attcatacaa tttttttagt ttgattagca 1140

attaccactt aagccgtgga cgaaactgcc aattttttca aatgatccat aaatacttga 1200

agtgatacat cgtctgttaa aaccggagcg ccagcgtccc ctccatatga atacatgtta 1260

ttgtgagtct gactcggatt gactttggac aataaaaatc tagcctgcga tcctccttgt 1320

tcggtatcga tatatctcgg catgggaaat ctcgtttgta atatctcttg agcatcgtcc 1380

acgggcgctt gcaaaagttg cctaaagttt tcgtattcgg gcatatcctg gtacttcaaa 1440

tttcgccatt gcgctatagt ctctccgtgg aatatcaaaa tttggaaaaa cgtgtccata 1500

agcagtattc tatcgggctg tatggaactc gtatctaata gaacaggctc cggagggccg 1560

ttgaaactgt aactgtacaa aattggttga atcatgatca atgattgagt aagatcttct 1620

ctcatcagca tatgtcgata gaacgacgtt tcatcaggag aattattgaa aacttgcagg 1680

aactgagacc tccttagatg gtacatgaat tgcggataga ggctaaagtt ttggcccaat 1740

ctgaatgaac cagcatcgtc tttattgtat tctccgaatt tttgacacaa tcgaatcagc 1800

attctatcga cccatctcag aacgtcggga ctttcatctg attcagctct ataaacagcc 1860

attctggcca taattacagc tgctgcttct tgatcaaaac cagcgctgat gtggtggata 1920

ttagtagtgg cgtcagccca gtttcgagcc actgttgtca ctctaattct tctttgacca 1980

ctcgagtgtt gatactgagt aatgaattgt atgcaacctc ttcctccttg cggaatcggt 2040

gcagaatgct gattgacgac ttcgaagaac aaggccatcg tagtgcttgg agtaagcgta 2100

cacattttcc attgtacagt gttgcccatg ccgatttctg tgtcggagac cagttgactt 2160

ttgacgttta atgatacaca ggatccaatg cctccttgca cttttaattc tcgagaacat 2220

ttcacttcta atgttccgtt aaaagccatt ttcaaatcgt ttttctgatc tctggtaaac 2280

actctttgga acgtttgttt gaacaacgag gaattgaacg agtctcccat caccatatga 2340

cctcctgtag aattgacgca ttgcttcatt tccatcaaac cagtttgatc aagagcgcag 2400

gaatagatgt caatacaatg accgttagtc gccgctctca tagccagagt atcgtaatgt 2460

ttaatagctt ttttcatgta tttcgcgtta tctttttgga tgtcatgatg ggatctaata 2520

ggttgtttca aatcgtcatt caaaacttga cc 2552

<210> 11

<211> 2471

<212> ДНК

<213> Phyllotreta atra

<220>

<221> misc_feature

<223> sec6

<400> 11

aaaaaatgtc tattttgaca ttaaagaatg aggttaacgt aaaaaaatcc tcatagatat 60

ttgtttagaa aattagttat caattaatag aatctacaaa atgactacaa aaaaaattaa 120

tatgagagag ctggaagcta ctgctaaagc ctcaggaaca gccaaagtca ttaacacatt 180

aaataggcca ggccagttag aaaaaatcga ccaaattaag caaaggtatg ttcgaaaaaa 240

agcatctgtt gaagcccttc tgaaatcggc aatgcaacag caattggacg gggttcgaac 300

tggattggtg cagttgcatc gatgtctcga agaagtttgt gaaatcgatg atagtatgaa 360

gaaaatgtct gaattgtttg ccgacgtgcc tgaactcagc aagaagctta tcgatattag 420

agatgaaaat atgcgtcatt cacaatacgt aacagctaaa gaaaacctca agcatatttt 480

tactgttccg gaaagtgttg agaaaacgaa agcttggatt aacgaaggaa aattgcttca 540

tacacatcaa tgtttaaggg atttagagaa ctcgagagac gacctactat ttgagttaca 600

caaactacca aatcaatctg tgcatgacaa atcgatgtta aaagcatatt tcgccgatgt 660

ggaagtacta tcgaaattat tggagaagca actaacgttc attttatcta gaaccttaaa 720

tacagtaaga aaagacccga cagtaatcgt aacagccttg cggatcatag aaagagaaga 780

aaaagcggac gaagaagctt taaagcaaca aaaacaaact ggattcattc ctccagctcg 840

accgaagaaa tggagagaaa tggcttttaa aattttggag aagaccgtgt catccaaaat 900

cgagggtact caagttgaag aaagagagga caataaacat tggcttatac gttatttaga 960

actaattaga atgatgatct tagaagattt gagaattgtt aaaacactct gtcttccttg 1020

ttttccacca agttacaaaa tattagacaa atacattcat atgtatcatg gtggtctttc 1080

tgtacatcta caagaaatta tacaaaacgg gctcaaaggt aacgaatacg ttacaatact 1140

ttcttgggcc ttgaaaacgt ataaatcaaa agacatgttg ggccatccag atctaacagc 1200

ttcaactgaa agtttacctc ctttattacc taaagccgtg ctagaccatt tggaaggaga 1260

ctatttgaaa aatatcgaag ggaattacag tgaatggatg cagaacactc tcaaatcaga 1320

aaaagaggaa tggagatcaa atactgaacc gttctcagaa tcgtattctc ggacaccggc 1380

ccccattatt atatttcaaa tgattgatca gaatttgcaa gtagccaaaa caataagtga 1440

agaattaaca ataaaagtac taaatttaag catccagcaa gtaattatat ttgcagatgc 1500

ttttagagaa gcgattatcg aattcaagaa taaatatttt gaagacagga aacaagttgt 1560

atattttact caatacatga tcttaattat caacaatatc ctgcaacttg ttgaattagg 1620

ttctcaattg gaaaaagaat atgttactaa caacagttcg catgaactta ctaggaattt 1680

tggagcatta aaagcgactt atattaaaat gagaaacgag gcagtccatt atctcttaga 1740

agaattattt gtcgactcgg accaacattt cgacaaactg tttacatcac attggttcgc 1800

ttccaatcct gcggacacaa tttatgtaac catcgaagat tacttccagg attacaaccg 1860

cttagtggaa gcgaattaca aatatttaat cgagcaatta attacctccg tcggtagaaa 1920

atacctcaca gccatgctgt ccaggcgcat atcgtttaaa acttacgaag aatgcacgaa 1980

agcagcacaa aaagcgtcgg aagaggccaa ccgattgaac agattgtttc agacccttag 2040

caaagacatc gaatgcgaaa acccattcga tgccatcatt atgctctcgg aggtattgaa 2100

aagtgatgac gatatgatgt cgtttgagct tcacagagtc gtggaaaaat atcccgatat 2160

cacggatgat catctcctga ggttgctaaa tttgagaggc gatctatcaa ggtctgaagt 2220

tagagacaaa gttgcgcata tagataaacc taaagttcta cacaaaagta cgatttttag 2280

gactttgttg tttccaaaac ttgtaaatat caatttgaac ttttaaaatt gtatatattt 2340

taacaatatt aatgctcacg ccatttttat ttatttcatt ccatcctgta agtctgtgct 2400

agactttata aaaataaatc attgtattat aataaatgat tgtcacacat aatatgtaca 2460

ataaattgag g 2471

<210> 12

<211> 1356

<212> ДНК

<213> Phyllotreta atra

<220>

<221> misc_feature

<223> shrb

<400> 12

gagcaattcc gcaccagcca gcgaacaaac cgatgaaccc tctatttttg atggatgact 60

aataacagtg aaataaatat caaaagtgct gctcggtttt tcgtagtttt cccttatttc 120

cattggaaaa atgagtttct ttagtaaaat attcggagga aaggaaaaag acgagggccc 180

tacgcccggg gaggccatcc aaaagctcag ggaaaccgag gacatgttat ataaaaaaca 240

agagttttta gaaaagaaaa tagaggaata cactttagta gccaaaaaga atgcatcgaa 300

gaacaaaaga gtggcgcttc aagcgctcaa aaagaagaaa cgattggaaa aaacgcaact 360

acaaatagat ggaactctta cgacgatcga aatgcaaaga gaggccttgg aaggagccag 420

caccaacaca gccgtcttag actccatgag gaacgccgct gaggccctcc agaaggccca 480

caaaaacttg aacgtcgatg atgtccacga tatcatggac gacatagctg aacaacacga 540

tattgccaat gagattacaa ctgctattag tcaacctgtg ggcttcgccg acgatttgga 600

cgaggacgaa ttggaaagcg aactggagaa actggaacaa gaaggattag aggaagattt 660

actgaaagtt ccgggtccta ctgaattacc cgctgtacct acgggggcta tcgctaaacc 720

ggttaaacct gctgctaaaa aagtggagga tgatgatgac atgaaggaat tggaggcttg 780

ggcttcgtaa ggattgctcg aagtggtaac acgcgtgaaa tggaacacac aaaaaaaata 840

ttgtagctat taacggcttg tttttttcgg cttcaaggtt taggcgttac atctactttt 900

ctgataggta tatttcaaat atttgaagtc cctcttgtta tttttaatta actttaaata 960

gtaacgattt attgtctatt tttgtaatat aagtgcaaat cagatatact ttaatctcca 1020

attataaata tttgattatg tatcaataaa ctgtacaaaa agtatttgtt taatttgtca 1080

ttacatatta atttggtata tctgatttac gaattaataa agaggataat attcacatac 1140

ttattaggca gggcaattaa ttaattaaat aattaacaac atttagctaa atgaatatgt 1200

aacttctttt tgtacagatt taaagtattt tgtaattgca cttaggtgat gttcaaaata 1260

attcgattag ctttaaaagt actaaatgca tattgttcgt tgttaaattg tataaagttc 1320

atatttgtag taaacaatta tctttttaaa aaaaaa 1356

<210> 13

<211> 2859

<212> ДНК

<213> Phyllotreta atra

<220>

<221> misc_feature

<223> Vps16A

<400> 13

tttttagcga tttttaatac caaattaacg aaaaagcgac gaaaaactga aaatgtcggc 60

ggcaatgttg actgcagaat ggtttctttt aggaagagat tcatattaca ggaaattcga 120

aatctactcc atgtcatggc aaagggagga aatcaatatg gaatcgctta ctttttccac 180

ggcctcatac ggtggtccca tagccaccag aaacaatcga cagaaactga tcaaagtaca 240

aggcggtcat caaccaatcg tttccgttta ttccgcatca ggaaaattca tttcctcctt 300

taaatggact aaacgaccca tcgtcaaaat gggctggact aatagggaag aattgctgtg 360

cattttggac gacgccaccg tggtcaaaca cgacatgttc ggtaaatacc tgcacgcctt 420

caacgccgtc ggcaggcaaa aggacgtcaa agtgacggac gctaaaatct tcactaattg 480

tcacaatttg acgggcgtcg tcgtcatgac gtccgattgg aaattctacg ctgtcaataa 540

cgtcgatgaa ccgaaaagta gacggttgtc ggagttgccc agatctgcta tccagcctac 600

tggttgggcg attgtttctg atgacaatag gacggagatt ttggtggcta gaagcttgga 660

attgtacagg ttgaaacagg acgaagatcg aaccagttca atgctggaac cggatataac 720

gaacaaatac acatctataa tcaaaatgtc ggtgtcttta aacgctagac atttggcttt 780

ttacacggat tccggttttt tgtggttggg ttcgacagat ctgagaacga aatattgcga 840

aatcgattgc gattttgttt tcaaaccgaa acaaatgtta tggtgcggta acgaagccgt 900

ggtcatctat tgggaaaaag acaatacgtt aatgatagta agcaagcacg gtgaaaaatt 960

gaaacacttt tacgagtcga cggtgcattt aacgccggaa gtggacggcg tcaggatact 1020

gtcgaatcaa caacacgaat tcctgcaaaa agtaccggaa gtggtgcaaa agattttccg 1080

aataaacagc accgaaccgg gtagtttttt gttggaggct tccaagcaat tccagaaagg 1140

cagccacaaa gccaacgaat acgtttgttt ggtgaaaaac gatctggaaa cggccgttaa 1200

tcaatgcatc gaagccgtca gttatgaatt tgacgttgac gttcaaaaaa tcctactgag 1260

agctgctcaa ttcggcaaat gtttcgtgcc gacgatgaag tccgacagtt acgtcaacat 1320

gtgtcgaatt ttgagggttt tgaacaacgt tagagacccg aaaatcggaa ttcccatcac 1380

cattactcaa ttaaatttca cgaaaaccgg tcgatcgtcg atcctcgtac gactcatcgc 1440

caggaatcac tattatctcg ccctgaaaat ttcggaatat ctaaaactac cgcccaggga 1500

gggctccacg tatgttttgg tgcattgggc caaacataag gtcggtcaaa gtcgactcga 1560

cgaggagacg gtcgccagag agatagccgc caaattgggc gaaaagggta gcggcggcgg 1620

ggtgagtttt agcgaaatag cggcgacggc gtcggagtgc ggcaggaaaa agttggccat 1680

caagctttta gattacgaat cgaaggcgag cgatcaagtg aaattactat tggaattggg 1740

cgaaaacgtg ccggctttgg tcaaagccat cgaaagcggc gatacggatt tagtttatac 1800

tgtcatattg aaattgagag aaaacatgcc tttaggggac tttaagatga ccatcagaaa 1860

tttccctatc gctcaatcgc tgttcataaa atactgtaaa gagcacaacg cgcaggctct 1920

aagcgaaatt tacattcaag aagacgattt ttgcgctcaa gccgaacttt tcatcaaaga 1980

ctcgctggat gttaagaaaa accacgcgaa agacgccctt ttgtcgtcgg ccttggaggc 2040

gtacaaaaaa tcccgcaaag acctcaacgc caccatcgtg gaggaacacc tgcgcttgtg 2100

caggttccaa agggaattgg aggatacgct gccggaggcg cgaggtggaa aattcgccgg 2160

aaaatccgta caagacacgt gtaaattact attggaattg aacgaaacca aattggccga 2220

aaagtttcgc aacgatttca aaattcccga taaaagatat tggtgggcga aaatcgccag 2280

tttggccgat cgaaacgatt ggatcgaatt ggagaagttc tccaaatgga aaaaatcccc 2340

gatcggctac catcccttcg tcgacgtttg tttggcgcac gataaaccgc aggaggcgtt 2400

gaaatattta cacaaagttg gcgaggatgt caaagtcaaa tattacatca aagcgggacg 2460

tttagaggaa gcagccgaaa tagcctatca acaaagggac gtccaaagtt tgttgtacgt 2520

tcagggaaaa tgtcagggaa atcgattttc cgacgaaaat cgacgacgat tgatggagaa 2580

aatcgcccaa atgatcgccc aaatcgaatc gaaaaaataa aaacccggaa acatcaaaat 2640

tcaatgatta aggggtgagg tacagttaaa acgccaaaaa atacgttttt tttgataaca 2700

tatttaaata tttcttatat aaataataca tacagggtaa accaaaattc agtgcaaaga 2760

tttcaagggc atatttacca gccaaaaata agaaaatttt ttcatatagt cgtatgtcct 2820

aacttccttc tgttccaaca tacagggtgt caaagttta 2859

<210> 14

<211> 1131

<212> ДНК

<213> Phyllotreta atra

<220>

<221> misc_feature

<223> VATФ-E

<400> 14

tgatatttta agttttttgt gggttgtaac gaatattatc taataatgtt tgtgcaattc 60

gatgaaaaat tgcaattaac tagacaacca attaatatag aatcaccccg tttgtttcat 120

tctacagaaa aaacctttct ttttaattat taaagaatcc aaaacgttcg aaaattgcgt 180

agttaccaaa ttattttcag ttttttatgg gttgaatcga aattaatact aaaaatttta 240

atccattaag tgtacttttc attacatcct atttgaacta tctaaagtac tatattgaaa 300

acccgataat cttatattgc agtgtaattt ttacagaaaa aaacatccta tgtacatgca 360

ttacaatcgc ctcccaatat ttcttcaatt aaaatcaaaa caaaaccgga acagcaaccg 420

caacattgca atttaaaaaa caaaaacaag tttcacagaa tattaaaata tacaaggaat 480

gatacaatag agcaacgaat taatcctaaa caacatcatc tgatgataac attacaataa 540

attttataaa tcgaatacta ttttatttcg accgatgtaa atattatacg atcgcacaaa 600

ccccaagcaa cctaatcggt gaatttcctg ttcacgttac gcccgaacag agcgttacgg 660

atttgaggca ccaattgctg cgagatcaag tccaatcgcg cctccagcgt gttgttgatc 720

ttcactttgt tcttcaacgc cagcaaatcg atcccccccg tagtctcctg cgacaagtgc 780

gactcgtcgt cgatcttcag gtgcacctcc ttgcccgtta tgtccttgta cttggtctgc 840

acgttgccca gaatcgactt gaccagctcc ctgtcctgcg ggcgcacgcg caccgttact 900

tctttctcga acagctggta gagtccttgg aggatgaggc tttcgatgat gtggccgtac 960

ttcccttggt ctttggtgac ttcgccgagt cgtttgcggg cgtcttccag cacggaccga 1020

acgtggtcct ctctcacttt caacaccttc agtctggcct ggttcagcat gttggacgat 1080

tggattttct tctggagttc gacttgtttc tctttcttct cgtagtattc c 1131

<210> 15

<211> 2566

<212> ДНК

<213> Phyllotreta atra

<220>

<221> misc_feature

<223> VATФ-A

<400> 15

agcaaatatg gtccacgtga aagtattgaa tttgataagt ttatcagtta tttgtcagtc 60

agctgactta tcttgtgaca agttgtggat tttaagaaaa tcgtcgattt gctgtacttg 120

atagttcagt gggtgaggtt gaattagaaa catcacgtct aatcgccctc gttttcagaa 180

catccacaaa aatgtcgaaa gtacgtgttg gagacgaaga aaaagagagc cagtatgggt 240

acgtccatgc tgtatctggt ccagtcgtca cagcagaaaa gatgtccgga tctgctatgt 300

acgaattggt acgtgtgggc tacttcgaat tagtcggtga aattatccgt ttggaaggag 360

atatggcaac tattcaggtc tacgaagaaa cttccggtgt aactgtcggt gatcccgtgt 420

tgagatcagg aaaaccgcta tccgttgaac ttggtcccgg tatcatgggt tcgattttcg 480

acggtatcca acgtcctttg aaagacatca acgttttgac cgaaagtatc tacatcccga 540

aaggtatcaa cgtacctgcg ctatccagaa cagcaaaatg ggatttcaac cccattaaca 600

taaagttggg ttctcatttg accggtggcg atatctacgg tatcgttcac gaaaacacgc 660

tggtcaagca caaaatgctt cttccaccta aagccaaagg taccgttacg tacatcgcag 720

atcctggaaa ctacacagta gacgaagttg tgctggaaac cgaattcgac ggcgaacgtt 780

cgaaatacac tatgttgcaa gtatggccag tccgtcaagc cagaccggtc agcgaaaaat 840

tgcccgccaa tcatccctta ctcaccgggc aacgtgtttt ggacgctctt ttcccttgcg 900

tacaaggcgg tactacagct attcccggtg ccttcggttg cggaaaaacc gtaatttccc 960

aatcgctatc caaatactcc aactccgacg tcatcatcta cgtaggttgc ggagaaagag 1020

gtaacgaaat gtctgaagta ttgagagatt tcccggaact cagcgtggaa atcgacggtc 1080

acaccgaatc catcatgaaa cgtaccgcct tggtggccaa cacctccaac atgcccgtgg 1140

cggcccgtga ggcctccatc tacaccggta tcacgttgtc cgagtacttc cgtgatatgg 1200

gttacaacgt gtccatgatg gccgattcga cctctcgttg ggccgaggct ttgagagaaa 1260

tttccggtcg tttggccgag atgcccgccg attccggtta cccggcctac ttgggggccc 1320

gattggcctc gttctacgag cgcgccggtc gcgttaagtg cttgggtaac cccgataggg 1380

aaggctctgt ttcgatcgta ggagcagtgt cgccgcctgg tggtgatttc tctgatcccg 1440

tcacttctgc tactctcggt atcgtgcaag tgttttgggg gttggataag aaactcgccc 1500

agcgtaagca tttcccgtct gtcgactggc tcagttctta ctctaaatac ctgagagcct 1560

tagatgattt ctatgacaaa aactttgcgg aattcatacc gctcagaacc aaagttaagg 1620

aaattcttca agaagaagac gatcttacag aaatcgtgca gctggtagga aaagcttcat 1680

tggccgaagc tgataaaatt acattggaaa tcgccaagct gttgaaagaa gatttcctgc 1740

aacagaactc gtactcatcg tacgacagat tctgtccctt ctacaaaacc gtgggtatgt 1800

tgaagaacat gattgggatg tacgatatgg cgagacacgc cgtagagtcg accgctcaat 1860

ctgagaacaa gatcacgtgg acggtgatca gggattcgat gagcaacatt ctgtaccaat 1920

tgagcagtat gaagttcaag gatccggtga aagacggcga ggcgaagatc aaggcggatt 1980

tcgatcagct gtacgaggat atccagcagg cgttcagaaa tctggaggat taattcgtcg 2040

cagatatgtt aggatttctc tttaaatttt tcagcagtgt aagttttaaa gaaaaaagat 2100

agagataata tcaaatacaa taaataatta agttaaaagt aagtcacctg tccctcaatt 2160

taataattaa ttgatgagcc attttagtag cagagacggt tggttgatat atattaccat 2220

gtaaaatatt ttatgtaaat tgttgaatat tgtatagttt tttattggtg agggtacagt 2280

gcttataaat atttaaaaaa ttattcctgt cattccaatt tattattatt aagttcttcc 2340

tttttttcat atcttttttt aaacaggtgc ttaattgtca tttatattca gtattaggtt 2400

tttctttttt tgattgtgta accctcctgg tatcatcctc gtcgttttta tttacaatct 2460

gttgtaaaaa agccacgttc acttctattt tatcaaacaa ttgtacagta tatcgtgaat 2520

taataaaata aaatatcgtg tattgtatct tattaatcgc agttaa 2566

<210> 16

<211> 2429

<212> ДНК

<213> Phyllotreta atra

<220>

<221> misc_feature

<223> COP I бета

<400> 16

accggctgcg gcttctccac caacttcaaa tcgcccagcg tcgccaactc cagcgtgcaa 60

ttctgcagcg tgtcgctcgt ttggttcacc accaacacat ccagcacgat atcgtactga 120

ttaacgtgca catacgcttc ggagtaaaca ggatccgaga aacccgtcag ctgggctatt 180

ttattcaatt tactcgagcc gatggtggag tccgattgcc ccgtcttgcc gcccatgagg 240

gcttgcgaca gggaggtctc gaagacgttt tcgccgagct cgccgctccg gtcggtctcc 300

agttgcacga aggtgatggc gtcgtcggtt tggacggcgg cccgggactt ttctcgcgat 360

ttttgatcgg tcgcctcttc ggtttccttg gccagcagca tgtcgttgag ggcgttgcgg 420

cacagggccg agaacacttg aacgacgggc tccgtgcgat cggatagcac gcgcagacag 480

aagagaatgt ggtcgttgtc gtcgttagtt atctgtttta ccggcaaacc tgatttgcct 540

aaatgcaaaa tgccagccat aatcagcata acttcagcat cgaatttatt cctatcggaa 600

gcggaaacgt tttcaccata tctcaacgcc aatttggtca aagtagaggc caaagaagct 660

gcaatgaaaa aatctccatc catgagatat tgcctcaatg gaggtctctt ctcttttgta 720

gatttgctgg ccacgttgaa agcagattga gtggcgtaag ttccatccga agtaaccaaa 780

gtggtggccc cggctggtgc atgagctggc gcactatcat ctgtactacc cgatataatc 840

ttttgctcag actccaacag agggcattcg cccaatgttt gaacaatctc tttgattaca 900

gcttcgatgt cagcagtaga tgtagcatat tcacctaata tccaaagagc agctcgatga 960

actttcacag atttgatgtc tttgaaggtc tccaataatt tctcgataat gagcggctcc 1020

aaattatcga atttctgtat ggcttccctc aaaaatagca acacatcggt ggccgccaat 1080

tcattgctat cagacaggaa ttccatcaga acaggaatga cggtagcagc tatatcaggg 1140

aatttgatgc aacaagaatg caacgttctg accaacagtt gcctatattt cccagtatcc 1200

tcgtgttcgc tatccacagt cttcgacacc tccttcttca gcacaaacac catttcttcg 1260

acgttacgtg aagagaccaa ttcgagcgct aaattaagcg ttttctttcg cacttccaaa 1320

tcaggagccg acaacactct caatatatcc atcaccaagt cctgcaggac tctctcgtgg 1380

ctgggatgct ccttcaaggc gatcaatcta tccaaaacga tcaatttgac gttgttgtcg 1440

ctttctttaa tgatcaattc aatgtaacaa ctggcggcgg ctttaatggc cgtaggggcg 1500

ctggacaaag tgatcagagt accggccgcc tcgtatctca cagcaggact gctcgagttt 1560

aatagattgt atatgcagcg aatgaacctg gatctctcag ttgggttaga gtggcacact 1620

ttgtatatca attcaacgat caccaactgc agaatatccc cgaatgatgc cacttgatct 1680

aagcaattgg ataggtaagt tagtgctcga tcttgatcgg catgcaagag catgaggaaa 1740

gcgtttcttt tgcaagacat gtcttgttcg ccatctaggt aagtggaaat caactcaggg 1800

gcgtccggaa tgagaaactc gaaattcttg tatatcgtaa aaatggccag aacggcattc 1860

cttcggacgt agctgtgcct gtgctccagg caaattcgaa tgctgggcat caagggctcc 1920

aatagctcgg gctccttcag cttgcatagg aatctcaatg tggatcctcg caggaattcg 1980

ttggggtgtt gcaggtcctt tctgtaggcg tcgcaaacta ggatcatttc ctgcagtaat 2040

ttgccatcag gggtggtttt cggcacgatt tcccaaaaaa tgagcaaaag cttcttggcc 2100

aggtgatctt gaagaggcag aacgtttcgt atgattgtca tcaggaatcc attgggcaac 2160

ctctcgcctg ccagtatcat gtgaatgatt ctttccaaag cccttatctt cactttcact 2220

tcgccctttt cgagatccat tttcaattgc atttcattgt aaggctccga atcggtcggt 2280

aaattaatta aagtgtaaca gggctgttcg accgcggtca tgtttatttc tgtttaatta 2340

acgcaacaat gccgtaaaat atcgaattgt tattagaaaa ctaaaataaa agtttgtatt 2400

attcgcgata cgtgtcaagt aaacgtttt 2429

<210> 17

<211> 2915

<212> ДНК

<213> Phyllotreta atra

<220>

<221> misc_feature

<223> COP I бетаПрайм

<400> 17

tttttttttt aattaatata taaagactgt tttatttctt aaaataggaa tgaacaattt 60

acataataat ataatactaa aaaactgcat taaaattata ttcaatcact taacaagtcg 120

tcatctatat tgatatccgt tgtatctata ttttcatcaa tgttcactcc atcaagatcc 180

aaatccaaat cgtcctcatc agcttcttca ttatcaacag agggtttgtt cgtttgttca 240

accggtgttt cgccgagcaa attatcgaaa taacttgcac ctgaattttt gactttcgct 300

tgaacctccg ctatcatatt tctgtcgtga ttcggtgtaa cggtgacagc cgaagcggca 360

ggaatgaaac ccggttcgtt ttgttccaaa tatttctgcg ccgctatggc ctcttgcagc 420

cctggaaaca gattttcgta atccttggga tcggccaaac tttggccggc tttctgattg 480

acagtcgaca attgggccct ccaaaggtcc accacctccg aaattttatc gggaagataa 540

gatctcgcga aaaacgccgc ttcgggaagc ctaccggtgc ttatcaaaat gtccagacat 600

ttgttcaagt caccgactaa taagtgggac aagaatgcca agttatgctt gccctcggct 660

tccgtggctt cgcctaatgt cctcactacc tcgtcatctc cagaactggt agctaagagc 720

aacaatccac cgtaatcttg ggctttctgc atgcactctt tggccaacac gagattattc 780

gtggaggccg ccaaatcggc cagttggctc catttctgcg ggttgttagc ctcctgggcc 840

aacattttgg ccgtattcaa atcctccaaa gccacggcca attcgaacct gtgctcgggg 900

tcggtactaa cagccaaagc ttgctgcttg aaaccctgct tttccaagaa atgagccacc 960

ctggttctat gttctttggg tatggaaggc aacactcggt cggccgtcga gaaatctctt 1020

ctcataacgg ccgtttgata ctccaacacc gaaagtagca actggtagct aacgactcgc 1080

aattctttgt cgactaagta cagtctatcg tctttcggga cgtagccgag cacgtacaaa 1140

ggcccgtcta ggtgcgctat ggtcaccaat tcgccgccga cgaagtaatt gatgcgattc 1200

acggcgttgg tgtagatgaa acaatcgccc acccaaagcc ccgttcgaac ggtctcgttg 1260

acttcgccta gaagattgaa ggcggactcc acgccgtcgt cggccacttg gttgttttct 1320

ttcgccttgt ggacctcctc cacgtcgtag gagagtataa aataactatc ttcggtggct 1380

aaacacacca atttgccgct gtccgaccag tagatcgaac ggggctgtat ttcgattctt 1440

ctgaccaaat ccaacgtttc ccagtcgtag aaagccaatc ccgagacgga ttttaccccc 1500

aaaagataac cgccgtatat accttcggct ccgaagtcgg atttgaaatt ctttttttct 1560

ttgaaatttt tgaatattct tatagtggaa ccggattctc tgatggcgta ttcgctggaa 1620

tcctgcgccc aaacgaattc ttgcgcgctt ccgaaagctt tatttctgag cgccatggcg 1680

gtgtaaataa tgtattcccc gtctccacaa acgaccacaa atctaccatt cggattgtgc 1740

tgaatagttt gcgggtagat atcacaagcg cccatatctt tgatagaaac cggcaagcgt 1800

tcaccgtctc ttatttcagc accttcgggc aacgctttaa gattagcttg ctgtagttcc 1860

gaatgtctgg cccagatgat tttaccgccg ctggcgtcca tactcacagc gggttcttct 1920

ctaccgactt taaccagaat gctaccctcg tcgtaaccca gcgccacgtt attggaacct 1980

ttcagacaaa aaatggtcca tactctttcg aaaccgtagt tcaaactgct ctctaatcgg 2040

tgcgtgttgg cgtgccacac tcgaaccgtg ccgtcttcgc tgccggtgag agcgatcggt 2100

aattccggat ggaaacacac ggccgtgacg ttctgtccgt gcccctctaa cgtttgtacg 2160

cacgttttgt tctggtaatc ccagatttta accagcctgt cgtcggcgcc cgatattagg 2220

tagggtttat cgccaccgtg atagtaatcg acgcaattaa cgcccttttc gtgaccctcc 2280

aacgtgaaat tagcagtaga ggcgcctaac tgccaaactt ttattgttcg gtccaaagaa 2340

gcgctggcga acgtattgtt gtctttgggg ttgatggaaa tttgcatgat gtaatgcacg 2400

tgcccttcga acacttgttg gcacgcccac gctttttccc agttccacag ctttatcagc 2460

atatcatcgc tactggtcag tatgtaaggt tgtgtgggat gaacaacaat ggatcgcacg 2520

taatcagagt gagcttcgaa agcgtgcacg cgatctagag tgttgtaatt gaaaactctg 2580

atttgcatgt catcggagcc actaacgatc cagtttttcc tcggtacgaa tttggccgct 2640

ctgaccggta gatcgcacac ttcgaatgtt ttgacgagct gctggttttc gtggttccac 2700

acgtttatgt tgccgctgta tagggaacag agcatccaag gctccgtggg atgtaggtcc 2760

acgcatttta cccggtcaga acgggctgtt agctttcttt tgatgtctaa ccgaagtggc 2820

atttttaagc ggttttattt aagaatttta tttattttct tcaattgaca cgaattataa 2880

acacatcaca catcaccatt ctacaaatgt catcg 2915

<210> 18

<211> 1596

<212> ДНК

<213> Phyllotreta atra

<220>

<221> misc_feature

<223> Act5C

<400> 18

cttgcgttag cctactgcga gtacagcttg tttgttagaa aaattcggct gtgccttttt 60

ttgttcgatt atccaaccac ctactagatt tttcaaatac taattcaaaa tgtgtgaaga 120

agaagtcgcc gctttagtcg tagacaatgg ctccggtatg tgcaaggccg gtttcgccgg 180

agacgacgct ccgcgcgccg tctttccctc catcgtcggt cgcccaagac atcaaggagt 240

catggtcggt atgggtcaaa aagattccta cgtaggtgac gaagcccaaa gcaaaagagg 300

tatcctcact ttgaaatacc ccatcgaaca cggtatcatc accaactggg atgatatgga 360

aaagatctgg caccacacct tctacaacga actccgtgtg gctccggaag aacaccccgt 420

tcttttgacc gaagctcctc ttaaccctaa agccaacagg gaaaagatga ctcaaatcat 480

gtttgaaacc ttcaacaccc ccgctatgta cgtcgccatc caagccgtac tttccttgta 540

cgcttccggt cgtaccaccg gtatcgtttt ggactccggt gacggtgtca cccacaccgt 600

acccatctac gaaggttacg ctttgcctca cgccatcctc cgtttggact tggccggtcg 660

cgatttgacc gactacctca tgaaaatcct caccgaaaga ggttactcat tcaccaccac 720

cgctgaaaga gaaatcgtcc gtgacatcaa ggaaaaactc tgctatgtcg cattggactt 780

cgaacaggaa atggccaccg ccgccgcttc cacctcattg gaaaagagct acgaattacc 840

cgacggtcaa gtcatcacca tcggtaacga gagattccgt tgtcctgagg ctctattcca 900

accttccttc ttgggtatgg aatcctgcgg tatccacgaa accgtctaca actccatcat 960

gaagtgtgac gtcgatatcc gtaaggactt gtacgccaac accgtcttgt ccggtggtac 1020

caccatgtac cctggtattg ctgaccgtat gcaaaaggaa atcaccgcct tggcccccag 1080

cacgatcaaa atcaagatca tcgctccccc agaaaggaaa tactccgtat ggatcggtgg 1140

atccatcttg gcttctcttt ccactttcca acagatgtgg atctccaaac aggaatacga 1200

cgaatccggc cctggaatcg ttcaccgcaa gtgcttctaa gctatttact acttttacct 1260

atattatata tactactata tcatgttgtt tgtactgtat tttacatcaa ttatgcgacc 1320

gtggttgttt tactgccaga cagacatttc aagatcattt taacacctta tttgttatat 1380

ataaatatat tttaatttgt aaccgggcag gttgaaataa agcctatcta agtaaaaaaa 1440

cctgcctctt ttatttctaa tttttaagac aaaacgaaac gagaatatga tgttatgtta 1500

tattatataa taactattgt aacatttttt tttaataaat ttttggcata gtttatacaa 1560

tatatatata tatatacaca cacaataaaa ttcaaa 1596

<210> 19

<211> 3693

<212> ДНК

<213> Phyllotreta atra

<220>

<221> misc_feature

<223> COPI альфа

<400> 19

cgcgctcatt gtaagtcagc cgaaatgttg accaagttcg aaaccaaatc agcaagggta 60

aaggggctgt ctttccatcc caaaaggcca tggattttag ccagtttaca caacggctgc 120

atccagttgt gggattatcg aatgtgcact cttctggaga agttcgacga gcacgatgga 180

cccgtaagag gcatatgttt ccacagccaa cagcccctat tcgtatcagg tggcgatgat 240

tacaaaataa aagtatggaa ctacaaacag aaacgttgca tcttcacact gcttgggcat 300

ttggattaca ttcgcacgac tatgttccac cacgaatatc cctggatagt atccgcatcc 360

gatgatcaaa ccatccggat atggaactgg caatccagaa cgtgcatttg cgttttaacc 420

ggccacaatc actatgtcat gtgcgctact ttccatccta gcgaggatct actgttatcc 480

gcttcattgg attctactgt tagagtttgg gatatttctg gactacgtaa gaagaacgta 540

tcaccgggtc cctcggggct cgaagatcac ctcaaaaatc ctggcgctac tgagctattc 600

ggccaagccg atgctgtggt gaaacacgtt ttggaagggc acgatcgagg agtgaattgg 660

gcatcttttc atcctttcct acctttaata gcttccggag ccgatgacag gcaaataaag 720

ctgtggagaa tgaacgattc gaaagcttgg gaagtagata cttgtagagg acattacaac 780

aacgtgtctt gcgttttgtt tcatcctaga caggagctga ttctgtctaa cggtgaagat 840

agaagtataa gggtttggga tatggctaaa aggacttgct tgcatacttt tagaagggaa 900

cacgaacgat tttgggtgat gacgagccac ccgaatctta atttattcgc tgctggccac 960

gatggcggca tggtgatatt caaattagaa cgcgaacgac cagcttacac ggtacacggg 1020

aacctactgt attacgtcaa agagaagtat ttaagaaaac tcgattttac cacttcgaag 1080

gacgtccccg ttattcaaat cagaggcggc ggtaaaatac cagtatacaa gatgtccttt 1140

aatcctgccg aaaacgctgt actactatct actcgcactt ccaatctgga taacagcaca 1200

tacgatttgt acatgattcc caaggatcaa gaaagggagg atcacgtgcc tgaagccgaa 1260

agcaagagat catcgggtct taccgctttg tgggtggcca gaaatcgatt tgctgtactg 1320

gacaggacgc accagttgat cattaaaaat ctgaaaaacg aggtaactaa aaaagttcaa 1380

acgcccactt gcgatgaagt cttttacgcc ggaactggca tgcttttatt gagagattcc 1440

gaacacgtta cgttgtttga tgtccaacaa aagaggacat tggctcaagt taaaatcagc 1500

aaatgtagat acgtcgtgtg gtcttctgat atgtcgcatc tagctcttct atctaagcat 1560

aacgtgacga tttgtaatag aaaattggat gttctgtgtt cgttacacga gaataccaga 1620

gttaagtcgg gcgcttggga tgatagcggc gttttcattt acactactag taatcatatt 1680

aaatacacgt tgaaaaatgg tgatcacgga attattagaa ccctggatct tcccatttac 1740

ataactagag tcagaggtag tcaggtgttc tgtttggaca gggaatgtaa gcctcgcctg 1800

ttggtaatcg atcccactga atacaaattc aaactcgcat tgatcaatca caagtacgaa 1860

gaggttttgt acatggtcag gaattctcga ttggtaggcc aaagtattat atcctacttg 1920

caacaaaaag gatatccgga agtagctttg cattttgtaa aagatgacaa aactaggttt 1980

gctctggctt tggaatgcgg caacattgaa atcgctttag aagccgctaa agctctaaac 2040

gataaaaatt gttgggatca attagcacaa gccgcattgt ggcaaggcaa tcatcaaatc 2100

gtagaaatgt gctaccaacg tacgaaaagc ttcgagaaac tatcgttcct ctacctaatc 2160

accggcaatt tggagaagtt gagaaaaatg atgaaaatcg ctgaaattag aaaggccaga 2220

tcgtcccaat accacgccgc tttgctgtta ggggatctcg aagaacgtgt aaaactactc 2280

aaagcttcca atcaattatc tctagcgtat ttaaccgccg ccacgcacgg tatgcgagag 2340

gaggcagagc aactcaaaga acaaatcggc gatgataaaa aactacccga tgtcgatcct 2400

aacgcgaagt tcttgaaacc cccaccgccg atccaacaag ccgaatccaa ctggccatta 2460

ctcacagtca gcaggagttt cttcgaaaat accgctgccg tggccaccgc atcggccaac 2520

atgaaatccc tgatggccga accgatttcc gacgtcggaa tggaggacgc ccaaggatgg 2580

ggcgacgacg acgagctgga attagacccc gaagacaaaa aagccgaggt cgtcgcggcc 2640

ggcggcgacg gcgaaggcgg ctgggacgtc gaagacgaag gtctggaaat tcccgattta 2700

ggacccaccg ccgcggcgga aggcgaagga aatttcgtgc atttacccac gcaaggcccc 2760

tcgccgcctc taacgtggac gaaaaactcg caattggtgg ccgatcacgt ggcggccggt 2820

tcgttcgaat ccgccgctcg attgcttcac gatcaactcg gaatcgtcga tttcaaaccg 2880

ttcgaaagct tgttcatcaa tttgtacagt acttcgaaga cggtgtcgtc ttggcaacaa 2940

aacgtaccgc cttcgtttag ttacccgttg agaaactgga aggaagccaa tattaaaaac 3000

cagttacccg cttctggggt gaaattgaac gatttggtcg ctaaattgca gatttgctat 3060

caactgacca ctggtggtaa attcactgaa gccatcgaga aattacaaac tctgctgttg 3120

tccgttacat tgcttgtggt ggacaacaaa caagaaattt ccgaggctca gcaattactg 3180

agaatagcca gcgaatatat ttgcggtttg caaatggaaa ccttgaggaa aaccttaccg 3240

aaaacttcag ccgaagagca gaaacgtcag tgcgagatgg ctgcctattt cacgcattgt 3300

aaactacagc cgatacatca aatcctcacg cttaggacgg cgctcaacat gtttttcaag 3360

ctcaagaact acaaaacagc cgcttctttc gccaagaggc tgttggaact tggtcctagg 3420

cctgaagtag cccagcaagc tagaaaaata ttacaggctt gcgattctaa tcttacagat 3480

gatttgcaat tgcagtatga cgagcacaat cctttcaact tgtgtgggca ctcttataca 3540

cccatttaca ggggaaaggc cgaagagaaa tgtccattat gcggtacttc atatttacct 3600

aaatacaaag gggtattgtg taatatttgc aaagtggcgg aagttggaaa ggatacgatt 3660

ggattgagga ttagcacgca tcagtttagg taa 3693

<210> 20

<211> 3693

<212> ДНК

<213> Phyllotreta atra

<220>

<221> misc_feature

<223> COPI альфа

<400> 20