Композиции и способы для борьбы с насекомыми-вредителями

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу вызывания гибели или задержки роста насекомого рода Phyllotreta spp. Также раскрыты инсектицидная композиция, трансгенное растение, рекомбинантный ДНК-конструкт, трансгенная растительная клетка. Раскрыты способ для борьбы с заражением растения насекомым рода Phyllotreta spp., способ обеспечения растения с улучшенной устойчивостью к насекомому рода Phyllotreta spp. Изобретение позволяет эффективно бороться с насекомыми рода Phyllotreta spp. 7 н. и 13 з.п. ф-лы, 6 табл., 28 ил., 11 пр.

 

[0001] В настоящей заявке запрашивается приоритет предварительной заявки на патент США № 62/287080, озаглавленной «Композиции и методы борьбы с насекомыми-вредителями», поданной 26 января 2016 года, которая включена во всей ее полноте. Перечень последовательностей, содержащихся в файле ʺP34170WO01_SL.TXTʺ (2289028 Кб, созданный 26 июля 2017 года), подан таким образом и включен посредством ссылки во всей своей полноте в данный документ.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0002] В данном документе описаны способы борьбы с заражениями беспозвоночными вредителями, особенно у растений, композиции и инсектицидные полинуклеотиды полезные в таких способах, и растения, имеющие повышенную устойчивость к беспозвоночным вредителям. Более конкретно, раскрыты инсектицидные полинуклеотиды и способы их использования для модификации экспрессии генов у насекомых-вредителей, в частности с помощью РНК-интерференции. Виды вредителей включают блошек, таких как Phyllotreta spp. и Psylliodes spp.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Коммерческие сельскохозяйственные культуры часто являются объектами нападений со стороны беспозвоночных вредителей, таких как насекомые. РНК-интерференция (РНКи, РНК-опосредованное подавление гена) - это подход, который демонстрирует перспективы для использования в экологически чистой борьбе с вредителями. У беспозвоночных, РНКи-основанное подавление гена было впервые продемонстрировано у нематод (Fire et al., (1998) Nature, 391:806-811; Timmons & Fire (1998) Nature, 395:854). Впоследствии, о РНКи-основанном подавлении генов беспозвоночных с использованием техник рекомбинантных нуклеиновых кислот сообщалось у ряда видов, включая сельскохозяйственно- или экономически значимых вредителей от различных таксонов насекомых и нематод, таких как: корневые нематоды (Meloidogyne spp.), см. Huang и др. (2006) Proc. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 14302-14306, doi: 10.1073/pnas.0604698103); совка хлопковая (Helicoverpa armigera), см. Mao et al. (2007) Nature Biotechnol., 25: 1307-1313, doi: 10.1038/nbt1352; западный кукурузный жук (Diabrotica virgifera LeConte), см. Baum et al. (2007) Nature Biotechnol., 25: 1322-1326, doi: 10.1038/nbt1359; свекловичная нематода (Heterodera schachtii), см. Sindhu et al. (2008) J. Exp. Botany, 60: 315-324, doi: 10.1093/jxb/ern289; комар желтолихорадочный (Aedes aegypti), см. Pridgeon et al. (2008) J. Med. Entomol., 45: 414-420, doi: полный/10.1603/0022-2585% 282008% 2945% 5B414% 3ATAADRK% 5D2.0.CO% 3B2; плодовые мухи (Drosophila melanogaster), хрущак малый булавоусый (Tribolium castaneum), гороховая тля (Acyrthosiphon pisum) и бражник табачный (Manduca sexta), см. Whyard et al. (2009) Insect Biochem. Mol. Biol., 39: 824-832, doi: 10.1016/j.ibmb.2009.09.00; капустная моль (Plutella xylostella), см. Gong et al. (2011) Pest Manag. Sci., 67: 514-520, doi: 10.1002/ps.2086; зеленая персиковая тля (Myzus persicae), см. Pitino et al. (2011) PLoS ONE, 6: e25709, doi: 10.1371/journal.pone.0025709; бурая рисовая цикадка (Nilaparvata lugens), см. Li et al. (2011) Pest Manag. Sci., 67: 852-859, doi: 10.1002/ps.2124; и белокрылка (Bemisia tabaci), см. Upadhyay et al. (2011) J. Biosci., 36:153-161, doi:10.1007/s12038-011-9009-1.

Краткое изложение содержания

[0004] Данные варианты осуществления изобретения относятся к контролю видов насекомых, особенно видов земляных блошек, которые являются экономически или сельскохозяйственно важными вредителями. Представленные в данном документе композиции и способы включают в себя инсектицидные молекулы полинуклеотида, которые полезны для борьбы или предотвращения заражения этим видом насекомых. Несколько вариантов осуществления изобретения, описанные в данном документе, относятся к композиции, содержащей полинуклеотид (например, композиции, содержащей дцРНК для подавления гена-мишени), которая местно применяется к виду насекомых или к растению, части растения или семенам, которые должны быть защищены от заражения насекомыми. Другие варианты осуществления изобретения относятся к способам выбора генов-мишеней насекомых, которые являются эффективными мишенями для опосредованного РНКи контроля над видами насекомых.

[0005] Несколько вариантов осуществления изобретения относятся к способу борьбы с заражением растения насекомыми, включающему контактирование насекомого с инсектицидным полинуклеотидом, содержащим по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% комплементарной фрагменту гена-мишени насекомого. В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит по меньшей мере один сегмент из 21 смежных нуклеотидов с последовательностью на 100% комплементарной фрагменту гена-мишени насекомого. В некоторых вариантах реализации изобретения, ген-мишень является выбранным из группы, состоящей из Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpS21, RpS4, Rpn2, Rpn3, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах реализации изобретения, ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит последовательность от около 95% до около 100% идентичную или комплементарную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или их фрагмента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит по меньшей мере один сегмент из 21 смежных нуклеотидов последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой дцРНК, содержащую цепь РНК с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975. В различных вариантах осуществления изобретения, контактирование с насекомым осуществляется путем пероральной доставки или не-пероральным контактом, например, путем абсорбции через кутикулу или посредством комбинации пероральной и не-пероральной доставки. В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидный полинуклеотид подавляет ген-мишень у насекомого и тормозит рост, развитие или размножение насекомого, или убивает насекомое.

[0006] Несколько вариантов реализации изобретения относятся к способу вызывания гибели или задержки роста в насекомого, включающему предоставление в рационе насекомого по меньшей мере одного инсектицидного полинуклеотида, содержащего по меньшей мере один подавляющий элемент, причем по меньшей мере один подавляющий элемент является по существу идентичным или по существу комплементарным фрагменту последовательности гена-мишени насекомого, и при этом поедание полинуклеотида насекомым приводит к гибели или задержке развития насекомого. В некоторых вариантах реализации изобретения, ген-мишень является выбранным из группы, состоящей из актина, Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpL13, RpL14, RpS21, RpS4, RpS14, Rpn2, Rpn3, Rpn7, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах реализации изобретения, последовательность гена-мишени является выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит последовательность от около 95% до около 100% идентичную или комплементарную по меньшей мере 21 смежным нуклеотидам последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или их фрагмента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержится в рационе насекомого в виде растения или бактериальной клетки, содержащей полинуклеотид, или в виде синтетической полинуклеотидной молекулы или в виде продукта ферментации (например, дцРНК типа шпилька, полученная в бактерии). В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой одноцепочечную молекулу РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой двухцепочечную молекулу РНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой одноцепочечную молекулу ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой двухцепочечную молекулу ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой гибридную молекулу РНК/ДНК.

[0007] Несколько вариантов реализации изобретения относятся к инсектицидной композиции, содержащий инсектицидно-эффективное количество полинуклеотида, отличающегося тем, что полинуклеотид содержит 18 или более смежных нуклеотидов на около 95% до около 100% комплементарных соответствующей части гена-мишени насекомого, которое заражает растение. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид содержит 21 смежных нуклеотидов с последовательностью на 100% комплементарной соответствующей части гена-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения, ген-мишень является выбранным из группы, состоящей из актина, Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpL13, RpL14, RpS21, RpS4, RpS14, Rpn2, Rpn3, Rpn7, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид содержит 18 или более смежных нуклеотидов на около 95% до около 100% комплементарных последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859 или их фрагмента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид содержит 21 смежный нуклеотид с последовательностью на 100% комплементарной ДНК-последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859 или ее фрагмента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид представляет собой одноцепочечную молекулу РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотид представляет собой молекулу дцРНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид представляет собой одноцепочечную молекулу ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид представляет собой двухцепочечную молекулу ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид представляет собой гибридную молекулу РНК/ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид содержит по меньшей мере один сегмент (например, цепь РНК или сегмент цепи РНК) с последовательностью от около 95% до около 100% идентичной или комплементарной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или ее фрагмента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид содержит по меньшей мере один сегмент (например, цепь РНК или сегмент цепи РНК) с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или ее фрагмента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид содержит по меньшей мере один сегмент из 21 смежных нуклеотидов (например, цепь РНК или сегмент цепи РНК), которая комплементарна или идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидная композиция дополнительно содержит один или более агент-переносчик, поверхностно-активное вещество, кремнийорганический, катионный липид, полинуклеотидную гербицидную молекулу, неполинуклеотидную гербицидную молекулу, неполинуклеотидный пестицид, фунгицид, антидот, аттрактант насекомых, и регулятор роста насекомых. Варианты осуществления инсектицидных композиций включают неполинуклеотидные инсектициды, например, продуцируемый бактериями инсектицидный белок.

[0008] Несколько вариантов осуществления изобретения относятся к способу обеспечения растения, имеющего улучшенную устойчивость к насекомому, включающему экспрессирование в растении рекомбинантной ДНК-конструкта, причем конструкт рекомбинантной ДНК кодирует инсектицидный полинуклеотид, содержащий последовательность, которая по существу идентична или по существу комплементарна фрагменту по меньшей мере одного гена-мишени насекомого, и причем прием внутрь насекомым инсектицидного полинуклеотида приводит к гибели или задержке роста насекомого. В некоторых вариантах реализации изобретения, ген-мишень является выбранным из группы состоящей из актина, Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpL13, RpL14, RpS21, RpS4, RpS14, Rpn2, Rpn3, Rpn7, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах реализации изобретения, ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой одноцепочечную РНК (оцРНК). В других вариантах реализации изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК (дцРНК), которая может включать одноцепочечные части, такие как петля в стволе-петля структуре. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой одноцепочечную молекулу ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой двухцепочечную молекулу ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой гибридную молекулу РНК/ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит последовательность от около 95% до около 100% идентичную или комплементарную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или их фрагмента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит последовательность по меньшей мере из 21 смежных нуклеотидов, которые комплементарны или идентичны последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой РНК (например, цепь РНК или сегмент цепи РНК), содержащую по меньшей мере 21 смежный нуклеотид последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или его фрагмент.

[0009] Несколько вариантов осуществления изобретения относятся к конструкту рекомбинантной ДНК, содержащей гетерологичный промотор, функционально связанный с ДНК, кодирующей инсектицидный полинуклеотид, содержащий последовательность от около 95% до около 100% идентичной или комплементарной по меньшей мере 21 смежному нуклеотидам последовательности, выбранной из группы состоящий из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или его фрагмента. Несколько вариантов осуществления изобретения относятся к коммерческой единице семян, такой как мешок, в котором все или практически все семена содержат конструкт рекомбинантной ДНК, содержащей гетерологичный промотор, функционально связанный с ДНК, кодирующей инсектицидный полинуклеотид, содержащий последовательность от около 95% до около 100% идентичной или комплементарной по меньшей мере 21 смежным нуклеотидам последовательности, выбранной из группы состоящий из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или его фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой одноцепочечную РНК (оцРНК). В других вариантах реализации изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК (дцРНК), которая может включать одноцепочечные части, такие как петля в стволе-петля структуре. В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой одноцепочечную ДНК (оцДНК). В других вариантах реализации изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой двухцепочечную ДНК (дцДНК), которая может включать одноцепочечные части, такие как петля в ствол-петля структуре. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой гибридную молекулу РНК/ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит цепь РНК или сегмент цепи РНК, содержащий последовательность от около 95% до около 100% идентичную или комплементарную по меньшей мере 21 смежным нуклеотидам последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или его фрагмент. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит цепь РНК или сегмент цепи РНК, состоящую из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или ее фрагмента.

[0010] В связанных аспектах, представленных в данном документе, представлены антропогенные композиции, содержащие описанный в данном документе инсектицидный полинуклеотид, такой как оцРНК, дцРНК, оцДНК, дцДНК или составы гибридных РНК/ДНК, используемые для местного нанесения на растение или вещество, нуждающееся в защите от заражения насекомыми; рекомбинантные конструкции и векторы, пригодные для получения трансгенных растительных клеток и трансгенных растений; составы и покрытия, используемые для обработки растений (включая семена растений или частей размножения, таких как клубни); семена растений или части размножения, такие как клубни, обработанные с или содержащие полинуклеотид как описано в данном документе, а также товарную продукцию и продукты питания, произведенные из таких растений; семена или части размножения (особенно товарную продукцию и продукты питания, имеющие обнаруживаемое количество полинуклеотида, описанного в данном документе). Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к поликлональным или моноклональным антителам которые связывают пептид или белок, кодируемый с помощью последовательности или фрагмента последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к поликлональным или моноклональным антителам которые связывают пептид или белок, кодируемый с помощью последовательности или фрагмента последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или ее комплемента. Такие антитела производят с помощью рутинных способов как известно среднему специалисту в данной области техники.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0011] Настоящие варианты осуществления изобретения относятся к способам и композициям для борьбы с насекомыми-вредителями, в частности группой жесткокрылых насекомых, широко известных как ʺблошкиʺ, среди которых существует несколько родов. Описанные в данном документе гены-мишени определены как полезные для разработки инсектицидных полинуклеотидных агентов для предотвращения или лечения заражений блошкой, особенно коммерчески важных растений. Способы и композиции являются особенно полезными для предотвращения или лечения заражений блошкой коммерчески важных видов Brassica, включая виды, используемые в промышленности в качестве масличного сырья, продуктов питания, или корма для скота (например, канола, рапс, репа, полевая горчица или масличная репа). Такие виды Brassica включают B. napus, B. juncea, B. carinata, B. rapa, B. oleracea, B. rupestris, B. septiceps, B. nigra, B. narinosa, B. perviridus, B. tournefortii, и B. fructiculosa. Также описаны последовательности для подавления одного или более генов-мишеней блошки. Несколько вариантов осуществления изобретения относятся к инсектицидным полинуклеотидным агентам, которые подавляют гены мишени земляной блошки. В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются инсектицидные полинуклеотиды и рекомбинантные молекулы ДНК и конструкты полезные для способов борьбы с насекомыми-вредителями, особенно земляными блошками. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к инсектицидным композициям, а также к трансгенным растениям устойчивым к заражению насекомыми-вредителями. Несколько вариантов осуществления изобретения относятся к способам идентификации эффективных инсектицидных полинуклеотидных агентов, например одноцепочечных молекул РНК, двухцепочечных молекул РНК, одноцепочечных молекул ДНК, двухцепочечных молекул ДНК или гибридных молекул РНК/ДНК для борьбы с насекомыми-вредителями и способы идентификации генов-мишеней, которые, вероятно, выполняют важные функции, что делает эти гены предпочтительными мишенями для РНКи-опосредуемого сайленсинга и борьбы с насекомыми-вредителями.

[0012] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к способам и композициям для ингибирования или контролирования заражения растения блошками с помощью ингибирования экспрессии одного или более гена-мишеней блошки, выбранными из группы состоящей из актина, Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpL13, RpL14, RpS21, RpS4, RpS14, Rpn2, Rpn3, Rpn7, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах реализации изобретения, ингибирование экспрессии одного или более гена-мишени у земляной блошки приводит к замедлению роста или гибели.

[0013] Несколько вариантов осуществления изобретения относятся к инсектицидной молекуле полинуклеотида, такой как оцРНК, дцРНК, оцДНК, дцДНК или гибридная РНК/ДНК, который содержит один или более сегментов, содержащих 18 или более смежных нуклеотидов, например 21 или более смежных нуклеотидов, имеющую от 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100%) комплементарности с фрагментом гена-мишени насекомого, выбранного из группы, состоящей из актина, Act5C, аргинин-киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpL13, RpL14, RpS21, RpS4, RpS14, Rpn2, Rpn3, Rpn7, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13 В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит множество сегментов, каждый из 18 или более смежных нуклеотидов, с последовательностью от около 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100%) комплементарности с фрагментом последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит по меньшей мере 21 смежный нуклеотид, имеющий 100% комплементарность с фрагментом последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит сегменты, комплементарные различным участкам гена-мишени, или может содержать несколько копий сегмента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид включает несколько сегментов, каждый из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100%) комплементарности с фрагментом другого гена-мишени; таким образом, можно подавить множественные гены-мишени или множественные виды насекомых.

[0014] Несколько вариантов осуществления относятся к инсектицидному полинуклеотиду (например, оцРНК, дцРНК, оцДНК, дцДНК или РНК/ДНК гибрид), которая ингибирует экспрессию одного или более генов-мишеней насекомых, выбранных из группы, состоящей из актина, Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpL13, RpL14, RpS21, RpS4, RpS14, Rpn2, Rpn3, Rpn7, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13 Несколько вариантов осуществления изобретения относятся к инсектицидному полинуклеотиду, имеющему длину, большую, чем та, которая характерна для встречающихся в природе регуляторных малых РНК (таких как эндогенно продуцируемые миРНК и зрелые микроРНК), например, полинуклеотид составляет по меньшей мере около 30 смежных пар оснований в длину. В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидный полинуклеотид имеет длину от между около 50 до около 500 пар оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидный полинуклеотид имеет по меньшей мере 50 пар оснований в длину. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид образуется из двух отдельных, по существу комплементарных нитей (например, где каждая цепь отдельно обеспечивается или где каждая нить кодируется отдельной молекулой ДНК или где две нити кодируются на отдельных участках ДНК и отдельно транскрибируются или разделяются, например, действием рекомбиназы или нуклеазы), где по меньшей мере одна нить содержит последовательность от около 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100%) идентичной или комплементарной по меньшей мере 21 смежному нуклеотидам последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или ее фрагмента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид является двухцепочечным и тупоконечным, например двумя отдельными нитями равной длины, которые образуют двухцепочечный полинуклеотид посредством межмолекулярной гибридизации. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид является двухцепочечным и имеет липкий конец на одном или обоих концах (концевые), например, две отдельные нити неравномерной длины, которые образуют двухцепочечный полинуклеотид посредством межмолекулярной гибридизации; липкий конец может представлять собой один нуклеотид или 2, 3, 4, 5, 6 или более нуклеотидов и может быть расположен на 5'-конце или на 3'-конце нити. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит по меньшей мере один петля-стебель, например, одну молекулу полинуклеотида, которая образует двухцепочечный участок посредством внутримолекулярной гибридизации рядом со вторичной структурой «шпильки». В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид образуется из одной самогибридизующейся шпильки, где одно «плечо» шпильки содержит последовательность от около 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100%) идентичной или комплементарной по меньшей мере 21 смежному нуклеотиду последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или ее фрагмента. В вариантах осуществления изобретения, самогибридизирующиеся полинуклеотиды, которые образуют шпильки (или частичные шпильки), включают полинуклеотидные молекулы, которые содержат «спейсерные» нуклеотиды или одноцепочечную «область петли» между двунитевыми образующими комплементарными «плечами» смысловой последовательности и анти-смысловой последовательности. В вариантах реализации изобретения, такие спейсеры или петли включают в себя нуклеотиды, имеющие последовательность несвязанного (не комплементарных или идентичных) гена-мишени, соответствующего двухцепочечному фрагменту шпильки. В вариантах осуществления изобретения, такие спейсеры или петли включают нуклеотиды, имеющие последовательность, комплементарную или идентичную гену-мишени. Примеры спейсеров или петель включают в себя те, которые кодируются SEQ ID NO: 1719-1721.В вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит множество петля-стебель с или без спейсерных нуклеотидов между каждой петлей-стеблем. В вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит модифицированную петлю-стебель, такую как «стабилизированная антисмысловая» петля или «стабилизированная смысловая» петля; см., например, патенты США 7855323 и 9006414, которые включены в данный документ в качестве ссылки во всей их полноте.

[0015] Инсектицидный полинуклеотид может быть химически синтезирован (например, с помощью in vitro транскрипции, такой как транскрипция с использованием T7 полимеразы или других полимераз), или может быть получен путем экспрессии в микроорганизме, путем экспрессии в растительной клетке, или путем микробной ферментации. Инсектицидный полинуклеотид может быть химически модифицирован, например, для улучшения стабильности, легкости приготовления или эффективности. В некоторых вариантах осуществления изобретения, молекула инсектицидного полинуклеотида предоставляется в микробной или растительной клетке, которая экспрессирует инсектицидный полинуклеотид (такой как шпилечная форма дцРНК) или в продукте микробной ферментации.

[0016] Различные способы для конструирования и производства разнообразных форм инсектицидного полинуклеотида известны в данной области техники и являются полезными в композициях и способах, описанных в данном документе. См., например, следующие патенты, которые включены в данный документ в качестве ссылки в полном объеме: (1) патент США № 8598332 Waterhouse и др., в котором раскрываются конструкты рекомбинантной ДНК, включая ДНК, кодирующую последовательность смысловой РНК и анти-смысловой РНК в одном транскрипте, который формирует искусственную ʺшпильковуюʺ РНК структуру с двухцепочечным стеблем РНК с помощью спаривания оснований между смысловыми и анти-смысловыми нуклеотидными последовательностями; варианты реализации изобретения включают шпильки со спейсерными нуклеотидами между смысловыми и анти-смысловыми нуклеотидными последовательностями; (2) патент США № 8158414 Rommens и др., в котором раскрываются конструкты рекомбинантной ДНК, включая конвергентно ориентированные первый и второй промоторы, которые производят, например, дуплекс РНК, которая сформирована с помощью отжига двух отдельных РНК транскриптов; и (3) патент США № 7855323 и 9006414 Huang и др., которые раскрывают рекомбинантные ДНК конструкты, содержащие ДНК, кодирующую ʺстабилизированные анти-смысловыеʺ транскрипты которые формируют петлю анти-смысл-ориентированной РНК для подавления одного или более генов-мишеней; рекомбинантные ДНК конструкты могут быть сконструированы для подобного кодирования ʺстабилизированных смысловыхʺ транскриптов, которые формируют петлю смысл-ориентированной РНК для подавления одного или более генов-мишеней.

[0017] Варианты композиций, содержащих инсектицидные полинуклеотиды, описанные в данном документе, дополнительно содержат один или более дополнительных компонентов или адъювантов, например агент-переносчик, инкапсулирующий агент, эмульгирующий агент, поверхностно-активное вещество, кремнийорганический, катионный липид, расширяющий агент, фотозащитный агент, агент устойчивости к осадкам, полинуклеотидную гербицидную молекулу, неполинуклеотидную гербицидную молекулу, неполинуклеотидный пестицид, неполинуклеотидный фунгицид, антидот, аттрактант насекомых, феромоны насекомых, и регулятор роста насекомых. В вариантах реализации изобретения, эти дополнительные компоненты или адъюванты являются съедобными или усваиваются, если попадают в организм блошки.

[0018] В вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид, описанный в данном документе, используется в сочетании с ненуклеотидным пестицидным агентом, таким как пестицидный агент с малой молекулой или белковоподобный пестицидный агент, одновременно или последовательно. Примеры ненуклеотидных пестицидных агентов включают пататины, лектины растений, фитоэкдистероиды и бактериальные инсектицидные белки (например, инсектицидные белки от Bacillus thuringiensis, Xenorhabdus sp., Photorhabdus sp., Brevibacillus laterosporus (ранее Bacillus laterosporus), Lysinibacillus sphaericus (ранее Bacillus sphaericus), Chromobacterium sp., Chromobacterium subtsugae, Paenibacillus sp., Paenibacillus lentimorbus и Paenibacillus popilliae), бактерия, которая продуцирует инсектицидный белок, и энтомицидных бактериальных видов. В вариантах осуществления изобретения, композиции, содержащие полинуклеотиды для борьбы с земляной блошкой, такие как инсектицидный полинуклеотид, описанный в данном документе, могут дополнительно содержать или могут использоваться одновременно или последовательно с обычными пестицидами, такими как спиромезифен, спиродиклофен, спиротетрамат, пиридабен, тебуфенпирад, толфенпирад, фенпироксимат, флуфенерим, пиримидифен, феназахин, ротенон, циенопирафен, гидраметилнон, ацехиноцил, флуакрипирим, фосфид алюминия, фосфид кальция, фосфин, фосфид цинка, цианид, диафентиурон, азоциклотин, цигексатин, оксид фенбутатина, пропаргит, тетрадифон, бенсультап, тиоциклам, тиосултап-натрия, флоникамид, этоксазол, клофентезин, дифловидазин, гекситиазокс, хлорфлуазурон,бистрифлурон, дифлубензурон, флуциклоксурон, флуфеноксурон, гексафлумурон, луфенурон, новалурон, новифлумурон, тефлубензурон, трифлумурон, бупрофезин, циромазин, гидропрен, кинопрен, метопрен, феноксикарб, пирипроксифеном, пиметрозин, пирифлукваиназон, хлорфенапир, тралопирил, B.t. (Bacillus thuringiensis) var. aizawai, B.t. var. israelensis, B.t. var. kurstaki, B.t. var. sphaericus, B.t. var. tenebrionensis, Bacillus thuringiensis белки сельскохозяйственных культур, включая Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Fa, Cry2Ab, mCry3A, Cry3Ab, Cry3Bb, Cry34/35Ab1, бромистый метил и другие алкилгалогениды, хлорпикрин, фторид серы, бенклотиаз, хинометионат, криолит, метилнеодеканамид, бензоксимат, цимиазол, флуенсульфон, азадирахтин, бифеназат, амидофлумет, дикофол, плифенат, цифлуметофен, пиридалил, Beauveria bassiana GHA, сульфоксафлор, спинеторам, спиносад, эмамектинбензоат, лепимектин, милбемектин, абамектин, метоксифенозид, хромафенозид, галофенозид, тебуфенозид, амитраз, хлорантранилипрол, циантранилипрол, флубендиамид, альфа-эндосульфан, хлордан, эндосульфан, фипронил, ацетопрол, этипрол, пирафлупрол, пирипрол, индоксакарб и метафлумизон, акринатрин, аллетрин, аллетрин-цис-транс, транс-аллетрина, бета-цифлутрин, бета-циперметрин, бифентрин, биоаллетрин, биоаллетрин S-циклопентенил, биоресметрин, циклопротрин, цифлутрин, цигалотрин, циперметрин, цифенотрин [(1R)-транс-изомеры], димефлутрин, эмпентрин [(EZ)-(1R)-изомеры], эсфенвалерат, этофенпрокс, фенпропатрин, фенвалерат, флюцитринат, флюметрин, гамма-цигалотрин, лямбда-Цигалотрин, меперфлутрин, метофлутрин, перметрин, фенотрин [(1R)-транс-изомер], праллетрин, профлутрин, протрифенбут, ресметрин, силафлуофен, тау-флувалинат, тефлутрин, тетраметрин, тетраметрин [(1R)-изомеры], тетраметилфлутрин, тета-циперметрин, тралометрин, трансфлутрин, дзета-циперметрин, альфа-циперметрин, дельтаметрин, DDT и Метоксихлор, тиодикарб, аланикарб, алдикарб, бендиокарб, бенфуракарб, бутоксикарбоксим, карбарил, карбофуран, карбосульфан, этиофенкарб, фенобукарб, форметанат, фуратиокарб, изопрокарб, метиокарб, метомил, метолкарб, оксамил, пиримикарб, пропоксур, тиофанокс, триазамат, триметакарб, ХМС, ксилилкарб, хлорпирифос, малатион, ацефат, азаметифос, азинфос-этил, азинфос-метил, кадусафос, хлоретоксифос, хлорфенвинфос, хлормефос, хлорпирифосметил, кумафос, цианофос, метилмеркаптофос, диазинон, дихлорвос/ДДВФ, дикротофос, диметоат, диметилвинфос, дисульфотон, EPN, этион, этопрофос, фамфос, фенамифос, фенитротион, фентион, фонофос, фостиазат, имициафос, изофенфос-метил, мекарбам, метамидофос, метидатион, мевинфос, монокротофос, налед, ометоат, оксидеметон-метил, паратион, паратион-метил, фентоат, форат, фосалон, фосмет, фосфамидон, фоксим, пиримофоз-этил, профенофос, пропафос, пропетамфос, протиофос, пираклофос, пиридафентион, хиналфосом, сульфотеп, тебупиримфос, темефос, тербуфос, тетрахлорвинфос, тиометон, триазофос, хлорофос, вамидотион имидаклоприд, тиаметоксам, ацетамиприд, клотиандин, динотефуран, нитенпирам, нитиозин, никотин, тиаклоприд, хлорантранилипрол и циантранилипрол. В вариантах осуществления изобретения, композиции, содержащие инсектицидный полинуклеотид для борьбы с земляной блошкой у видов Brassica,включая рапс, дополнительно содержат или используются одновременно или последовательно с лиственными спреями, содержащими один или более пестицидов, выбранных из группы, состоящей из дельтаметрина, циперметрина, лямбда-цигалотрина, перметрина, карбарила, карбофурана и малатиона, или обработкой семян, содержащей один или более пестицидов, выбранных из группы, состоящей из тиаметоксама, имидаклоприда и клотианадина.

[0019] В вариантах осуществления изобретения, композиции, содержащие инсектицидные полинуклеотиды для борьбы с земляной блошкой, описанные в данном документе, могут дополнительно включать, или могут использоваться параллельно или последовательно с обычными фунгицидами, такими как бупиримат, диметиримол, этиримол, ципродинил, пириметанил, мепанипирим, фенпиклонил, флудиоксонил; фениламиды, беналаксил, фуралаксил, металаксил, R-металаксил, офурак, оксадиксил, беномил, карбендазим, дебакарб, фуберидазол, тиабендазол, хлозолинат, дихлозолин, ипродин, миклозолин, процимидон, винклозолин, карбоксин, фенфурам, флутоланил, мепронил, оксикарбоксин, тифлузамид, гуазатин, додин, иминоктадин, азоксистробин, крезоксим-метил, метоминостробин или трифлоксистробин, фербам, манкозеб, манеб, метирам, пропинеб, тирам, зинеб, зирам, каптафол, каптан, дихлофлуанид, флуоромид, фолпет, толуфлуанид, гидроксид меди, оксихлорид меди, сульфат меди, оксид меди, манкуппер, оксин-медь, динокап, нитротал-изопропил, эдифенфос, ипробенфос, изопротиолан, фосдифен, пиразофо, токлофос-метил, ацибензолар-S-метил, харпин, анилазин, бластицидин-S, хинометионат, хлоронеб, хлороталонил, цимоксанил, дихион, дикломезин, диклоран, диэтофенкарб, диметоморфу, дитианон, этридиазол, фамоксадон, фенамидон, фентин, фенпиразамине, феримзон, флуазинам, флусульфамид, фосетил-алюминий, гимексазол, касугамицин, метасульфокарб, пенцикурон, фталид, полиоксины, пробеназол, пропамокарб, пироквуилон, хиноксифен, квинтозин, сера, триазоксид, трициклазол, валидамицин, азаконазол, битертанол, пропиконазол, дифеноконазол, диниконазол, ципроконазол, эпоксиконазол, флухинконазол, флусилазол, флутриафол, гексаконазол, имазалил, имибенконазол, ипконазол, тебуконазол, тетраконазол, фенбуконазол, метконазол, миклобутанил, перфуразоат, пенконазол, бромуконазол, пирифенокс, прохлораз, триадимефон, триадименол, трифлумизол, тритиконазол, трифорин, анцимидол, фенаримол или нуаримол, додеморф, фенпропидин, фенпропиморф, спироксамин, тридеморф и фенгексамид. В вариантах реализации изобретения, композиции, содержащие инсектицидные полинуклеотиды для борьбы с земляной блошкой у видов Brassica включая рапс, дополнительно содержат или используются одновременно или последовательно с лиственными спреями, содержащими один или более фунгицид, выбранный из группы, состоящей из азоксистробина, Bacillus subtilis штамма QST 2808, боскалида, флуксопироксада, пираклостробина, метконазола, протиоконазола, пентиопирада, пикоксистробина и тиофанат метила, или обработкой семян, содержащей один или более фунгицид, выбранный из группы, состоящей из азоксистробина, металаксила, трифлоксистробина, пираклостробина, седаксана, пенфлуфена, флудиоксонила и мефеноксама.

[0020] В вариантах осуществления изобретения, композиции, содержащие инсектицидные полинуклеотиды для борьбы с земляной блошкой, описанные в данном документе, могут дополнительно включать, или могут использоваться параллельно или последовательно с обычными гербицидами, такими как глифосат, ауксин-подобными гербицидами, такими как дикамба, фосфинотрицин, глюфосинат, 2,2-дихлоропропионовая кислота (далапон), ингибиторы ацетолактат синтазы, такие как сульфонилмочевины, имидазолинон, триазолопиримидин, пиримидилоксибензоаты, и фталид, бромоксинил, циклогександион (сетоксидим) и арилоксифеноксипропионат (галоксифоп), сульфонамид гербициды, триазиновые гербициды, 5-метилтриптофан, аминоэтил цистеин, пиридазиноновые гербициды, такие как норфлуразон, циклопропилизоксазол гербициды, такие как изоксафлютол, ингибиторы протопорфириноген-оксидазы, гербициды, содержащие фрагмент арилоксиалканоата, фенокси ауксины, такие как 2,4-D и дихлорпроп, пиридилокси ауксины, такие как фтороксипира и триклопира, арилоксифеноксипропионаты (AOPP), ингибиторы ацетил-коэнзим A карбоксилазы (ACCase), такие как галоксифоп, хизалофоп и дислофоп, и 5-замещенные ингибиторы феноксиацетат протопорфириноген-оксидазы IX, такие как пирафлуфен и флумиклорак. В вариантах реализации изобретения, композиции, содержащие инсектицидные полинуклеотиды для борьбы с блошкой у видов Brassica, включая рапс, дополнительно содержат или используются одновременно или последовательно с одним или более послевсходовых гербицидов, выбранных из группы, состоящей из хизалофопа, сетоксидима, клетодима, и клопиралида. В вариантах реализации изобретения, композиции, содержащие инсектицидные полинуклеотиды для борьбы с блошкой у устойчивых к гербицидам видов Brassica, включая устойчивый к гербицидам рапс, дополнительно содержат или используются одновременно или последовательно с одним или более гербицидов, выбранных из группы, состоящей из имазамокас, глифосата и глюфосината.

[0021] Описанные композиции и способы являются полезными для ингибирования или контролирования заражения блошкой растения, такого как виды Brassica. В вариантах осуществления изобретения, композиции и способы используются для лечения растущего растения, такого как полевые растения Brassica. Варианты осуществления изобретения включают композиции, содержащие инсектицидные полинуклеотиды, описанные в данном документе, в композиции в форме твердого вещества, жидкости, порошка, суспензии, эмульсии, спрея, инкапсуляции, микрогранул, частиц носителей, пленки, матрицы, орошения почвы, или композиции для обработки семян. В вариантах осуществления изобретения такие композиции наносятся на поверхность растения нуждающегося в защите от или лечении от заражения блошками, или наносятся прямо на блошек, или предусмотрены в пищевой для блошек форме. В вариантах осуществления изобретения, композиция, содержащая инсектицидные полинуклеотиды, описанные в данном документе, наносится прямо на не проросшие семена (такие как не проросшие семена видов Brassica), обеспечивая растению, проросшему из обработанных семян, повышенную устойчивость к заражению блошками; примеры способов обработки семян описаны в патентной заявке США 14/143836, которая включена посредством ссылки во всей своей полноте в данный документ. Вариант осуществления изобретения включает семя Brassica, которое обрабатывают путем непосредственного контактирования семян с инсектицидным полинуклеотидом (таким как оцРНК, дцРНК, оцДНК, дцДНК или гибридная молекула РНК/ДНК), описанным в данном документе, с последующим прорастанием в растение Brassica, которое проявляет повышенную устойчивость к заражениям земляной блошкой.

[0022] Если не указано иное, используемые технические и научные термины имеют то же значение, которое обычно понимается средним специалистом в данной области техники. Как правило, используемая номенклатура и производственные или лабораторные методики, описанные ниже, являются хорошо известными и широко используемыми в данной области техники. Обычные способы используются для выполнения этих процедур, таких, как те, которые предусмотрены в данной области техники и различных общих ссылках. В случае, когда термин предусмотрен в единственном числе, авторы данного изобретения также рассматривают аспекты, описываемые множественным числом этого термина. Там, где есть расхождения в терминах и определениях, используемых в ссылках, которые включены посредством ссылки, термины, используемые в данной заявке, должны иметь приведенные определения. Другие технические термины имеют их обычное значение в данной области техники, в которой они используются, как проиллюстрировано с помощью различных технико-специфических словарей, например, ʺThe American Heritage® Science Dictionaryʺ (Editors of the American Heritage Dictionaries, 2011, Хоутон Миффлин Харкорт, Бостон и Нью-Йорк), ʺMcGraw-Hill Dictionary of Scientific and Technical Termsʺ (6th edition, 2002, МакГроу-Хилл, Нью-Йорк), или ʺOxford Dictionary of Biologyʺ (6th edition, 2008, Oxford University Press, Оксфорд и Нью-Йорк). Авторы данного изобретения не намерены ограничиваться механизмом или способом действия. Ссылка к ним предоставляется только для иллюстрации.

[0023] Если не указано иное, последовательности нуклеиновых кислот в тексте данного описания изобретения приведены так, что читаются слева направо в направлении 5' к 3' концу. Специалисту в данной области техники будет известно, что данная последовательность ДНК понимается для определения соответствующей последовательности РНК, которая идентична последовательности ДНК за исключением замены нуклеотидов тимина (T) в ДНК на нуклеотиды урацила (U). Таким образом, для обеспечения определенной последовательности ДНК понимают эквивалент РНК и наоборот. Данная первая полинуклеотидная последовательность, будь то ДНК или РНК, дополнительно определяет последовательность ее точного комплемента (который может быть ДНК или РНК), то есть второй полинуклеотид, который идеально гибридизируется с первым полинуклеотидом путем формирования Уотсона-Криковских пар оснований. Под термином "по существу комплементарный" подразумевается, что полинуклеотидная цепь (или по меньшей мере одна цепь двухцепочечного полинуклеотида) сконструирована для гибридизации (как правило, при физиологических условиях, таких как те, что можно найти в клетке живых растений или животных) с геном-мишенью, или с фрагментом гена-мишени, или с транскриптом гена-мишени или фрагмента гена-мишени; специалисту в данной области техники будет понятно, что такая гибридизация не обязательно требует 100% идентичности или комплементарности последовательности. Первая последовательность нуклеиновой кислоты "функционально" соединена или "связана" со второй последовательностью нуклеиновой кислоты, когда первая последовательность нуклеиновой кислоты находится в функциональной связи со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, последовательность промотора является ʺфункционально связаннойʺ с ДНК если промотор обеспечивает транскрипцию или экспрессию ДНК. Как правило, функционально связанные последовательности ДНК являются смежными.

[0024] Термин ʺполинуклеотидʺ обычно относится к молекуле ДНК или РНК, содержащей несколько нуклеотидов, и в общем относится к обеим ʺолигонуклеотидамʺ (полинуклеотидная молекула из 18-25 нуклеотидов в длину) и более длинным полинуклеотидам из 26 или более нуклеотидов. Полинуклеотиды также включают молекулы, содержащие несколько нуклеотидов, включая неканонические нуклеотиды или химически модифицированные нуклеотиды, как это обычно практикуется в данной области техники; см., например, химические модификации, раскрытые в техническом руководстве ʺRNA Interference (RNAi) and DsiRNAsʺ, 2011 (Integrated DNA Technologies Коралвиль, Айова).

[0025] Как правило, инсектицидные полинуклеотиды, как описано в данном документе, будь то ДНК или РНК, или оба, и будь то одно- или двухцепочечный, содержат по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов (или в случае двухцепочечных полинуклеотидов по меньшей мере 18 смежных пар оснований), которые, по сути, идентичны или комплементарны фрагменту эквивалентного размера ДНК гена-мишени или РНК транскрипта гена-мишени. На протяжении этого описания, "по меньшей мере 18 смежных" означает "от около 18 до около 10000, включая каждую целую точку между ними". Таким образом, варианты реализации изобретения включают композиции, содержащие олигонуклеотиды, имеющие длину от 18-25 нуклеотидов (18-членные, 19-членные, 20-членные, 21-членные, 22-членные, 23-членные, 24-членные, или 25-членные), или средней длины полинуклеотиды, имеющие длину от 26 или более нуклеотидов (полинуклеотиды из 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, около 65, около 70, около 75, около 80, около 85, около 90, около 95, около 100, около 110, около 120, около 130, около 140, около 150, около 160, около 170, около 180, около 190, около 200, около 210, около 220, около 230, около 240, около 250, около 260, около 270, около 280, около 290, или около 300 нуклеотидов), или длинные полинуклеотиды, имеющие длину, более чем около 300 нуклеотидов (например, полинуклеотиды от между около 300 до около 400 нуклеотидов, между около 400 до около 500 нуклеотидов, между около 500 до около 600 нуклеотидов, между около 600 до около 700 нуклеотидов, между около 700 до около 800 нуклеотидов, между около 800 до около 900 нуклеотидов, между около 900 до около 1000 нуклеотидов, между около 300 до около 500 нуклеотидов, между около 300 до около 600 нуклеотидов, между около 300 до около 700 нуклеотидов, между около 300 до около 800 нуклеотидов, между около 300 до около 900 нуклеотидов, или около 1000 нуклеотидов в длину, или даже более чем около 1000 нуклеотидов в длину, например, по всей длине гена-мишени, содержащего кодирующие или некодирующие или оба кодирующие или некодирующие участки гена-мишени). Когда инсектицидный полинуклеотид является двухцепочечным, таким как дцРНК, описанные в рабочих примерах, его длину можно аналогичным образом описать в терминах пар оснований. Двухцепочечные инсектицидные полинуклеотиды можно дополнительно описать в терминах одного или более одноцепочечных компонентов.

[0026] Инсектицидные полинуклеотиды, описанные в данном документе, могут быть одноцепочечными (оц) или двухцепочечными (дц). ʺДвухцепочечныйʺ относится к спариванию оснований, которое возникает между полностью комплементарными, анти-параллельными цепями нуклеиновой кислоты для формирования двухцепочечной структуры нуклеиновой кислоты, как правило, при физиологически соответствующих условиях. Варианты реализации изобретения включают те, в которых полинуклеотид выбирают из группы, состоящей из смысловой одноцепочечной ДНК (оцДНК), смысловой одноцепочечной РНК (оцРНК), двухцепочечной РНК (дцРНК), двухцепочечной ДНК (дцДНК), двухцепочечного ДНК/РНК гибрида, анти-смысловой оцДНК, или анти-смысловой оцРНК; смесь полинуклеотидов любого из этих видов может быть использована. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК длиной большей, чем та, которая является типичной для встречающиеся в природе регуляторных малых РНК (таких как эндогенно образующиеся миРНК и зрелые микроРНК). В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК из по меньшей мере 30 смежных пар оснований в длину. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК с длиной между 50 до около 500 пар оснований. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид может содержать компоненты, отличные от стандартных рибонуклеотидов, например, вариант осуществления изобретения представляет собой РНК, которая содержит терминальные дезоксирибонуклеотиды.

[0027] Инсектицидные полинуклеотиды любого размера могут быть использованы по отдельности или в сочетании, в различных способах и композициях, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения, один инсектицидный полинуклеотид используется для получения композиции (например, композиции для местного применения). В других вариантах осуществления изобретения, используется смесь или пул различных инсектицидных полинуклеотидов; в таких случаях инсектицидные полинуклеотиды могут быть для одного гена-мишени или для нескольких генов-мишеней.

[0028] В различных вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид, как описано в данном документе, включает встречающиеся в природе нуклеотиды, такие как те, которые возникают из ДНК и РНК. В определенных вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид представляет собой комбинацию рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов, например, синтетические полинуклеотиды, состоящие в основном из рибонуклеотидов, но с одним или более терминальных дезоксирибонуклеотидов или одним или более терминальных дидеоксирибонуклеотидов или синтетических полинуклеотидов, состоящих в основном из дезоксирибонуклеотидов, но с одним или более терминальных дидеоксирибонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит неканонические нуклеотиды, такие как инозин, тиоуридин или псевдоуридин. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит химически модифицированные нуклеотиды. Примеры химически модифицированных олигонуклеотидов или полинуклеотидов хорошо известны в данной области техники; см., например, публикацию патента США 2011/0171287, публикацию патента США 2011/0171176, публикацию патента США 2011/0152353, публикацию патента США 2011/0152346, и публикацию патента США 2011/0160082, которые включены в данный документ посредством ссылки. Иллюстративные примеры включают, но без ограничения, встречающиеся в природе фосфодиэфирный остов олигонуклеотида или полинуклеотид, который может быть частично или полностью модифицирован с фосфоротиоатом, фосфородитиоатом, или метилфосфонатными межнуклеотидными модификациями связи, модифицированные основания нуклеозидов или модифицированные сахара могут быть использованы в синтезе олигонуклеотида или полинуклеотида, и олигонуклеотиды или полинуклеотиды могут быть помечены флуоресцентными фрагментами (

[0029] Термин «рекомбинантный», используемый для обозначения полинуклеотида (такого как молекулы инсектицидного полинуклеотида или конструкты рекомбинантных ДНК, описанные в данном документе), означает, что полинуклеотид не является естественной молекулой, т. е. требуется вмешательство человека для существования полинуклеотида. Рекомбинантный полинуклеотид получают с использованием методики рекомбинантной нуклеиновой кислоты, или путем химического синтеза, и может включать комбинации последовательностей, которые не встречаются в природе (например, комбинации гетерологичного промотора и ДНК, кодирующей экспрессируемую РНК, или молекулу РНК, содержащую связанные сегменты гена-мишени которые в природе не встречаются рядом друг с другом). Рекомбинантный полинуклеотид может быть биологически произведен в клетке (такой как бактериальная, или растительная или животная клетка), например, когда эту клетку трансфицируют или трансформируют с вектором, кодирующим рекомбинантный полинуклеотид (например, вектор, кодирующий дцРНК формы шпилька, продуцируемый в бактерии). Рекомбинантный полинуклеотид может содержать последовательности нуклеотидов, разработанных in silico, с использованием соответствующих алгоритмов.

[0030] Инсектицидные полинуклеотиды, описанные в данном документе, как правило, сконструированы для супрессии или подавления одного или более генов (ʺгенов-мишенейʺ). Термин ʺгенʺ относится к любому участку нуклеиновой кислоты, который обеспечивает экспрессию транскрипта или кодирует транскрипт, или который является наследуемой последовательностью нуклеиновой кислоты. ʺГенʺ может включать, но без ограничения, участок промотора, 5' нетранслируемый участок, кодирующий транскрипт участок, который может включать интронный участок, 3' нетранслируемый участок, или комбинации этих участков. В вариантах осуществления изобретения, гены-мишени могут включать кодирующую или некодирующую последовательность или обе. В других вариантах осуществления изобретения, ген-мишень имеет последовательность, идентичную или комплементарную к матричной РНК, например, в вариантах осуществления изобретения геном-мишенью является кДНК.

[0031] Как используется в данном документе, термин ʺизолированныйʺ относится к отделению молекулы от других молекул обычно связанных с ней в своем нативном или естественном состоянии. Термин ʺизолированныйʺ таким образом, может относиться к молекуле ДНК, которая была отделена от других молекул(ы) ДНК, которые обычно связаны с ней в своем нативном или естественном состоянии. Такая молекула ДНК может присутствовать в рекомбинированном состоянии, таком как рекомбинантная молекула ДНК. Таким образом, молекулы ДНК, слитые с регуляторными или кодирующими последовательностями с которыми они обычно не связаны, например посредством рекомбинантных технологий, рассматриваются изолированно, даже при интегрировании в качестве трансгена в хромосому клетки или присутствии с другими молекулами ДНК.

[0032] Под «инсектицидно-эффективным» подразумевается эффективный способ индуцирования физиологического или поведенческого изменения у насекомого (например, взрослого или личинок земляных блошек), которое заражает растение, таких как, но без ограничения, отставание в росте, повышенная смертность, снижение репродуктивного потенциала или снижение плодовитости, уменьшение или прекращение пищевого поведения или движения, или уменьшение или прекращение стадии развития метаморфоза. В некоторых вариантах реализации изобретения, применение инсектицидно-эффективного количества инсектицидного полинуклеотида, такого как молекула дцРНК, на растение повышает устойчивость растений к заражению насекомым. В некоторых вариантах осуществления изобретения, применение инсектицидно-эффективного количества инсектицидного полинуклеотида в растениеводстве улучшает урожай (например, увеличивает биомассу, повышает семенную или плодовую продукцию, или увеличивает содержание масла, крахмала, сахара или белка) культурного растения, в сравнении с культурным растением не обработанным инсектицидным полинуклеотидом. В то время как не существует верхнего предела концентраций и доз инсектицидного полинуклеотида, как описано в данном документе, которые могут быть полезны в способах и композициях, представленных в данном документе, более низкие эффективные концентрации и дозировки, как правило, будут искать для эффективности и экономии. Неограничивающие варианты осуществления изобретения эффективных количеств инсектицидного полинуклеотида включают диапазон от около 10 нанограмм на миллилитр до около 100 микрограмм на миллилитр инсектицидного полинуклеотида в жидкой форме распыляемого на растение, или от около 10 микрограмм на акр до около 100 грамм на акр полинуклеотида применяемого к полевым растениям, или от около 0,001 до около 0,1 микрограмм на миллилитр полинуклеотида в искусственном питании для кормления насекомых. В то время как композиции, описанные в данном документе, наружно применяют на растение, концентрация может быть скорректирована с учетом объема спрея или обработки, применяемой к листьям растений или другим частям поверхности растения, таким как лепестки цветка, стебли, клубни, плоды, пыльники, пыльца, листья, корни или семена. В одном варианте осуществления изобретения, полезная обработка травянистых растений с использованием инсектицидных полинуклеотидов, как описано в данном документе, составляет около 1 наномоля (нмоль) полинуклеотида на растение, например, от около 0,05 дo 1 нмоль полинуклеотида на растение. Другие варианты осуществления изобретения для травянистых растений включают полезные диапазоны от около 0,05 до около 100 нмоль, или около 0,1 до около 20 нмоль, или около 1 нмоль до около 10 нмоль полинуклеотидов на растение. В определенных вариантах осуществления изобретения, применяется от около 40 до около 50 нмоль одноцепочечного полинуклеотида, как описано в данном документе. В определенных вариантах осуществления изобретения, применяется от около 0,5 нмоль до около 2 нмоль инсектицидного полинуклеотида, как описано в данном документе. В определенных вариантах осуществления изобретения, применяется композиция, содержащая около 0,5 до около 2,0 миллиграмм на миллилитр, или около 0,14 миллиграмм на миллилитр инсектицидного полинуклеотида (или одноцепочечного 21-членного), как описано в данном документе. В определенных вариантах осуществления изобретения, применяется композиция от около 0,5 до около 1,5 миллиграмм на миллилитр инсектицидного полинуклеотида, как описано в данном документе, от около 50 до около 200 или более нуклеотидов. В определенных вариантах осуществления изобретения, применяется от около 1 нмоль до около 5 нмоль инсектицидного полинуклеотида на растение, как описано в данном документе. В определенных вариантах реализации изобретения, полинуклеотидная композиция как наружно применяемая к растению содержит по меньшей мере один полинуклеотид, как описано в данном документе, в концентрации от около 0,01 дo около 10 миллиграмм на миллилитр, или около 0,05 дo около 2 миллиграмм на миллилитр, или около 0,1 дo около 2 миллиграмм на миллилитр. Очень большие растения, деревья или лианы, требуют соответственно больших количествах инсектицидных полинуклеотидов. При использовании длинных инсектицидных молекул полинуклеотида, которые могут быть переработаны в несколько олигонуклеотидов (например, множественные олигонуклеотиды, кодируемые одной молекулой рекомбинантной ДНК, как описано в данном документе), могут использоваться более низкие концентрации. Неограничивающие примеры эффективных режимов обработки инсектицидным полинуклеотидом включают обработку от между около 0,1 дo около 1 нмоль молекул полинуклеотида на растение, или между около 1 нмоль дo около 10 нмоль молекул полинуклеотида на растение, или между около 10 нмоль дo около 100 нмоль молекул полинуклеотида на растение.

Способы, вызывающие гибель насекомых, и способы борьбы с инвазией насекомых

[0033] Несколько вариантов осуществления изобретения относятся к способу вызывания гибели или задержки роста в насекомого, включающему предоставление в рационе насекомого по меньшей мере одного инсектицидного полинуклеотида, содержащего по меньшей мере один подавляющий элемент по существу идентичный или по существу комплементарный фрагменту последовательности гена-мишени насекомого, отличающийся тем, что последовательность гена мишени выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1-859, и при этом поедание инсектицидного полинуклеотида насекомым приводит к гибели или задержке развития насекомого. Эти способы могут быть использованы для борьбы с заражением насекомыми растения, например, для предотвращения или лечения заражения земляной блошкой сельскохозяйственного растения, особенно коммерчески важных видов Brassica.

[0034] В вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере один подавляющий элемент содержит последовательность около 95% до около 100% идентичную или комплементарную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или их фрагмента. В вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере один подавляющий элемент содержит 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью на 100% комплементарной фрагменту гена-мишени насекомого, причем ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей их SEQ ID NOs: 1-859. В вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере один подавляющий элемент содержит по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или ее фрагмента. В вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере один подавляющий элемент содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или ее фрагмента. В вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере один подавляющий элемент содержит последовательность от около 95% до около 100% идентичную или комплементарную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или их фрагмента.

[0035] В вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид предоставляется в микробной или растительной клетке, которая экспрессирует инсектицидный полинуклеотид, или в продукте микробной ферментации, или химически синтезируется. В вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит дцРНК. В вариантах осуществления изобретения, дцРНК является тупоконечной, или имеет "липкий" конец на по меньшей мере одном конце, или содержит по меньшей мере одну шпильку. В вариантах осуществления изобретения, дцРНК обеспечивается удобными, обычно используемыми методами. В вариантах осуществления изобретения, дцРНК является химически синтезированной, полученной путем экспрессии в микроорганизме, полученной путем экспрессии в растительной клетке, или полученной путем микробной ферментации. В вариантах осуществления изобретения, дцРНК изготавливается из встречающихся в природе рибонуклеотидов; в других вариантах осуществления изобретения, дцРНК является химически модифицированной.

[0036] В вариантах осуществления изобретения, способ полезен для вызывания смертности или задержки роста у насекомых, которые являются вредителями коммерчески важных сельскохозяйственных растений, таких как насекомые-вредители видов Brassica. В вариантах осуществления изобретения, насекомое представляет собой земляную блошку. В вариантах осуществления изобретения, насекомое представляет собой вид рода, выбранного из группы, состоящей из родов Altica, Anthobiodes, Aphthona, Aphthonaltica, Aphthonoides, Apteopeda, Argopistes, Argopus, Arrhenocoela, Batophila, Blepharida, Chaetocnema, Clitea, Crepidodera, Derocrepis, Dibolia, Disonycha, Epitrix, Hermipyxis, Hermaeophaga, Hespera, Hippuriphila, Horaia, Hyphasis, Lipromima, Liprus, Longitarsus, Luperomorpha, Lythraria, Manobia, Mantura, Meishania, Minota, Mniophila, Neicrepidodera, Nonarthra, Novofoudrasia, Ochrosis, Oedionychis, Oglobinia, Omeisphaera, Ophrida, Orestia, Paragopus, Pentamesa, Philopona, Phygasia, Phyllotreta, Podagrica, Podagricomela, Podontia, Pseudodera, Psylliodes, Sangariola, Sinaltica, Sphaeroderma, Systena, Trachyaphthona, Xuthea и Zipangia. В вариантах осуществления изобретения, насекомое представляет собой вид, выбранный из группы, состоящей из Altica ambiens (блошки ольхи), Altica canadensis (блошки земляной), Altica chalybaea (блошки виноградной), Altica prasina (блошки тополя), Altica rosae (блошки розы), Altica sylvia (блошки голубики), Altica ulmi (блошки вяза), Chaetocnema pulicaria (блошки кукурузной), Chaetocnema conofinis (блошки сладкого картофеля), Epitrix cucumeris (блошки картофельной), Systena blanda (бледнополосатой блошки), и Systena frontalis (рыжей блошки). В вариантах осуществления изобретения, насекомое представляет собой вид, выбранный из группы, состоящей из Phyllotreta armoraciae (блошки хреновой), Phyllotreta cruciferae (блошки канолы), Phyllotreta pusilla (западной черной блошки), Phyllotreta nemorum (блошки земляной светлоногой), Phyllotreta atra (блошки репы), Phyllotreta robusta (садовой блошки), Phyllotreta striolata (блошки полосатой), Phyllotreta undulata, Psylliodes chrysocephala, и Psylliodes punctulata (блошки конопляной).

[0037] Варианты осуществления способа включают те, в которых инсектицидный полинуклеотид сконструирован для подавления гена-мишени родо- или видоспецифическим способом, например, где (a) насекомое представляет собой вид Phyllotreta и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1-551; (b) насекомое представляет собой Phyllotreta atra (блошка репы) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1-296; (c) насекомое представляет собой Phyllotreta cruciferae (блошка канолы) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 297-532; (d) насекомое представляет собой Phyllotreta striolata (полосатая блошка) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 533-551; (e) насекомое представляет собой виды Psylliodes и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 552-859; или (f) насекомое представляет собой Psylliodes chrysocephala и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 552-859. Варианты осуществления способа также включают те, в которых (а) насекомое представляет собой вид Phyllotreta, а инсектицидный полинуклеотид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1410 или ее фрагмента; (b) насекомое представляет собой Phyllotreta atra (блошка репы), а инсектицидный полинуклеотид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1155 или ее фрагмента; (c) насекомое представляет собой Phyllotreta cruciferae (блошка канолы), а инсектицидный полинуклеотид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1156-1391, 1731-1972 и 1974 или ее фрагмента; (d) насекомое представляет собой Phyllotreta striolata (полосатая блошка), а инсектицидный полинуклеотид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1392-1410, 1973 и 1975 или ее фрагмента; (e) насекомое представляет собой вид Psylliodes, а инсектицидный полинуклеотид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1411-1718 или ее фрагмента; или (f) насекомое представляет собой Psylliodes chrysocephala, а инсектицидный полинуклеотид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1411-1718 или ее фрагмента.

[0038] Варианты осуществления способа включают те, в которых по меньшей мере один инсектицидный полинуклеотид представлен в композиции, содержащей инсектицидный полинуклеотид, причем композицию наносят на поверхность насекомого или на поверхность семян или растений, нуждающихся в защите от заражения насекомым. Варианты осуществления изобретения таких композиций, включают те, где композиция представляет собой твердое вещество, жидкость, порошок, суспензию, эмульсию, спрей, инкапсуляцию, микрогранулы, частицы носителей, пленки, матрицы, орошения почвы, или обработку семян. Во многих вариантах осуществления изобретения, композицию составляют в форме, которая поедается насекомым. В вариантах осуществления изобретения, композиция дополнительно содержит один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из агента-переносчика, поверхностно-активного вещества, кремнийорганики, полинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидного пестицида, фунгицида, антидота, удобрения, микроэлемента, аттрактанта насекомых, и регулятора роста насекомых. В вариантах осуществления изобретения, композиция дополнительно содержит по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous, инсектицидного белка Bacillus sphaericus, бактерии, которая продуцирует инсектицидный белок, энтомицидных видов бактерий, Lysinibacillus sphaericus (Bacillus sphaericus), Brevibacillus laterosporus (Bacillus laterosporus), видов Chromobacterium, Chromobacterium subtsugae, видов Paenibacillus, Paenibacillus lentimorbus и Paenibacillus popilliae.

[0039] Несколько вариантов осуществления изобретения относятся к способу борьбы с заражением насекомыми растения, включающему контактирование растения и/или насекомого, которое заражает растение, с инсектицидным полинуклеотидом, причем инсектицидный полинуклеотид содержит по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100%) комплементарности с фрагментом гена-мишени насекомого, выбранного из группа, состоящей из актина, Act5C, аргинин-киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpL13, RpL14, RpS21, RpS4, RpS14, Rpn2, Rpn3, Rpn7, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью на около 95% до около 100% комплементарной фрагменту последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1-859. В некоторых вариантах реализации изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит по меньшей мере один сегмент из 21 смежных нуклеотидов с последовательностью на 100% комплементарной фрагменту последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1-859. В этом контексте ʺконтролированиеʺ включает стимулирование физиологических или поведенческих изменений у насекомого (взрослого, или личинки. или нимфы) таких как, но без ограничения, отставание в росте, повышенная смертность, снижение репродуктивного потенциала, уменьшение или прекращение пищевого поведения или движения, или уменьшение или прекращение стадии развития метаморфоза. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1155 или ее фрагмента, или его комплемента.

[0040] В различных вариантах осуществления изобретения, насекомое представляет собой земляную блошку, например, вид рода, выбранного из группы, состоящей из родов Altica, Anthobiodes, Aphthona, Aphthonaltica, Aphthonoides, Apteopeda, Argopistes, Argopus, Arrhenocoela, Batophila, Blepharida, Chaetocnema, Clitea, Crepidodera, Derocrepis, Dibolia, Disonycha, Epitrix, Hermipyxis, Hermaeophaga, Hespera, Hippuriphila, Horaia, Hyphasis, Lipromima, Liprus, Longitarsus, Luperomorpha, Lythraria, Manobia, Mantura, Meishania, Minota, Mniophila, Neicrepidodera, Nonarthra, Novofoudrasia, Ochrosis, Oedionychis, Oglobinia, Omeisphaera, Ophrida, Orestia, Paragopus, Pentamesa, Philopona, Phygasia, Phyllotreta, Podagrica, Podagricomela, Podontia, Pseudodera, Psylliodes, Sangariola, Sinaltica, Sphaeroderma, Systena, Trachyaphthona, Xuthea и Zipangia. В некоторых вариантах осуществления изобретения, насекомое выбирают из группы, состоящей из Altica ambiens (блошки ольхи), Altica canadensis (блошки земляной), Altica chalybaea (блошки виноградной), Altica prasina (блошки тополя), Altica rosae (блошки розы), Altica sylvia (блошки голубики), Altica ulmi (блошки вяза), Chaetocnema pulicaria (блошки кукурузной), Chaetocnema conofinis (блошки сладкого картофеля), Epitrix cucumeris (блошки картофельной), Systena blanda (бледнополосатой блошки), и Systena frontalis (рыжей блошки). В некоторых вариантах осуществления изобретения, насекомое выбирают из группы, состоящей из Phyllotreta armoraciae (блошки хреновой), Phyllotreta cruciferae (блошки канолы), Phyllotreta pusilla (западной черной блошки), Phyllotreta nemorum (блошки земляной светлоногой), Phyllotreta atra (блошки репы), Phyllotreta robusta (садовой блошки), Phyllotreta striolata (блошки полосатой), Phyllotreta undulata, Psylliodes chrysocephala, и Psylliodes punctulata (блошки конопляной).

[0041] Растением может быть любое растение, которое подвержено заражению насекомым, которые могут контролироваться инсектицидными полинуклеотидами, описанными в данном документе. Растения, представляющие особый интерес, включают коммерчески значимые растения, включая пропашные культуры растений, овощи и фрукты, а также другие растения сельскохозяйственного или декоративного использования. Примеры подходящих растений представлены под рубрикой ʺРастенияʺ. Способ особенно полезен для борьбы с заражением насекомыми у декоративного растения или сельскохозяйственного растения. Различные варианты осуществления способа включают те, в которых растение представляет собой растение семейства Brassicaceae, включая виды Brassica, выбранные из группы, состоящей из B. napus, B. juncea, B. carinata, B. rapa, B. oleracea, B. rupestris, B. septiceps, B. nigra, B. narinosa, B. perviridus, B. tournefortii, и B. fructiculosa. В других вариантах осуществления изобретения, растение выбирают из группы, состоящей из Glycine max, Linum usitatissimum, Zea mays, Carthamus tinctorius, Helianthus annuus, Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana, Betholettia excelsa, Ricinus communis, Cocus nucifera, Coriandrum sativum, Gossypium spp., Arachis hypogaea, Simmondsia chinensis, Solanum tuberosum, Elaeis guineensis, Olea europaea, Oryza sativa, Cucurbita maxim, Hordeum vulgare и Triticum aestivum.

[0042] Способы включают те, которые разработаны для конкретных вредителей земляных блошек для данного растения, например, где растение представляет собой растение картофеля, а насекомым является Epitrix cucumeris (блошка картофельная). В некоторых вариантах осуществления изобретения, конкретные гены-мишени идентифицируются как мишени для РНКи-опосредованного контроля у данного вида насекомых. Различные варианты осуществления способа включают те, в которых (a) насекомое представляет собой Phyllotreta atra (блошка репы) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1-296; (b) насекомое представляет собой Phyllotreta cruciferae (блошка канолы) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 297-532; (с) насекомое представляет собой Phyllotreta striolata (полосатая блошка) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 533-551; или (d) насекомое представляет собой Psylliodes chrysocephala и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 552-859.

[0043] В некоторых вариантах осуществления изобретения, определенные инсектицидные полинуклеотиды разработаны для конкретных генов-мишеней данного вида насекомых. Варианты осуществления способа включают те, в которых (а) насекомое представляет собой Phyllotreta atra (блошка репы), а инсектицидный полинуклеотид содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1155 или ее фрагмента; (b) насекомое представляет собой Phyllotreta cruciferae (блошка канолы), а инсектицидный полинуклеотид содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1156-1391, 1731-1972 и 1974 или ее фрагмента; (с) насекомое представляет собой Phyllotreta striolata (полосатая блошка), а инсектицидный полинуклеотид содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1392-1410, 1973 и 1975 или ее фрагмента; или (d) насекомое представляет собой Psylliodes chrysocephala, а инсектицидный полинуклеотид содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1411-1718 или ее фрагмента.

[0044] Способ включает контактирование насекомого, такого как блошка, с инсектицидным полинуклеотидом. Варианты осуществления изобретения включают контактирование через пероральное введение насекомому, или не пероральное введение насекомому, или комбинацию перорального и не перорального введения насекомому. Варианты осуществления изобретения включают контактирование насекомых во взрослой стадии, или в личиночной стадии, или в стадии яйца. В некоторых вариантах осуществления изобретения, контактирование приводит к гибели (смерти) или задержки роста (отставание в росте, или снижение или прекращение стадии развития метаморфоза) насекомого, тем самым предотвращая или вылечивая заражение растения насекомым. В некоторых вариантах осуществления изобретения, контактирование приводит к стимулированию физиологических или поведенческих изменений у насекомого (взрослого, или личинки, или нимфы), что приводит к уменьшенной способности насекомого заражать или повреждать растение, например, снижение репродуктивного потенциала, уменьшение или прекращение пищевого поведения или движения.

[0045] В некоторых вариантах осуществления способа контактирование включает в себя применение композиции, содержащей один или более инсектицидных полинуклеотидов, к поверхности насекомого или к поверхности растения, зараженного насекомым. Композиция может содержать или быть в форме твердого вещества, жидкости, порошка, суспензии, эмульсии, спрея, инкапсуляции, микрогранул, частиц носителей, пленки, матрицы, орошения почвы, или обработки семян. В вариантах осуществления изобретения, контактирование включает предоставление инсектицидного полинуклеотида в композиции, которая дополнительно включает один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из агента-переносчика, поверхностно-активного вещества, кремнийорганики, полинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидного пестицида, фунгицида, антидота, аттрактанта насекомых, и регулятора роста насекомых. В некоторых вариантах осуществления изобретения, контактирование включает в себя предоставление одного или более инсектицидных полинуклеотидов в композиции, которая дополнительно содержит по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous, инсектицидного белка Bacillus sphaericus, бактерии, которая продуцирует инсектицидный белок, энтомицидных видов бактерий, Lysinibacillus sphaericus (Bacillus sphaericus), Brevibacillus laterosporus (Bacillus laterosporus), видов Chromobacterium, Chromobacterium subtsugae, видов Paenibacillus, Paenibacillus lentimorbus и Paenibacillus popilliae.

[0046] В некоторых вариантах осуществления способа, контактирование включает предоставление одного или более инсектицидных полинуклеотидов в композиции, которая поедается насекомым, такой как жидкость, эмульсия или порошок, применяемые к растению на котором питается насекомое или в виде приманки. Такие композиции могут дополнительно содержат один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из агента-переносчика, поверхностно-активного вещества, кремнийорганики, полинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидного пестицида, фунгицида, антидота, аттрактанта насекомых, и регулятора роста насекомых. Такие композиции могут дополнительно содержать по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous, инсектицидного белка Bacillus sphaericus, бактерии, которая продуцирует инсектицидный белок, энтомицидных видов бактерий, Lysinibacillus sphaericus (Bacillus sphaericus), Brevibacillus laterosporus (Bacillus laterosporus), видов Chromobacterium, Chromobacterium subtsugae, видов Paenibacillus, Paenibacillus lentimorbus и Paenibacillus popilliae. В вариантах осуществления изобретения, комбинация инсектицидного полинуклеотида и неполинуклеотидного пестицидного агента, обеспечивает уровень контроля над насекомыми, который больше, чем сумма эффектов компонентов инсектицидного полинуклеотида и неполинуклеотидного пестицидного агента, если они тестируются отдельно.

Инсектицидные Композиции

[0047] Несколько вариантов осуществления изобретения относятся к инсектицидной композиции, содержащей инсектицидно-эффективное количество инсектицидного полинуклеотида, такого как оцРНК, дцРНК, оцДНК, дцДНК или гибридная молекула РНК/ДНК, причем инсектицидный полинуклеотид содержит по меньшей мере 18 или более смежных нуклеотидов с последовательностью от около 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100%) комплементарности с фрагментом гена-мишени насекомого, выбранного из группы, состоящей из актина, Act5C, аргинин-киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpL13, RpL14, RpS21, RpS4, RpS14, Rpn2, Rpn3, Rpn7, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VATФaзы E, VATФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФaзы A), Vha68-2 (V-ATФaзы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит по меньшей мере 18 или более смежных нуклеотидов, имеющих около 95% до около 100% комплементарности фрагменту последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1-859. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит по меньшей мере 21 смежный нуклеотид, имеющий 100% комплементарность с фрагментом последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-859. В вариантах осуществления изобретения, инсектицидный полинуклеотид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или ее фрагмента.

[0048] В различных вариантах осуществления инсектицидной композиции, насекомое представляет собой земляную блошку, например, вид рода, выбранного из группы, состоящей из родов Altica, Anthobiodes, Aphthona, Aphthonaltica, Aphthonoides, Apteopeda, Argopistes, Argopus, Arrhenocoela, Batophila, Blepharida, Chaetocnema, Clitea, Crepidodera, Derocrepis, Dibolia, Disonycha, Epitrix, Hermipyxis, Hermaeophaga, Hespera, Hippuriphila, Horaia, Hyphasis, Lipromima, Liprus, Longitarsus, Luperomorpha, Lythraria, Manobia, Mantura, Meishania, Minota, Mniophila, Neicrepidodera, Nonarthra, Novofoudrasia, Ochrosis, Oedionychis, Oglobinia, Omeisphaera, Ophrida, Orestia, Paragopus, Pentamesa, Philopona, Phygasia, Phyllotreta, Podagrica, Podagricomela, Podontia, Pseudodera, Psylliodes, Sangariola, Sinaltica, Sphaeroderma, Systena, Trachyaphthona, Xuthea и Zipangia. В некоторых вариантах осуществления изобретения, насекомое выбирают из группы, состоящей из Altica ambiens (блошки ольхи), Altica canadensis (блошки земляной), Altica chalybaea (блошки виноградной), Altica prasina (блошки тополя), Altica rosae (блошки розы), Altica sylvia (блошки голубики), Altica ulmi (блошки вяза), Chaetocnema pulicaria (блошки кукурузной), Chaetocnema conofinis (блошки сладкого картофеля), Epitrix cucumeris (блошки картофельной), Systena blanda (бледнополосатой блошки), и Systena frontalis (рыжей блошки). В некоторых вариантах осуществления изобретения, насекомое выбирают из группы, состоящей из Phyllotreta armoraciae (блошки хреновой), Phyllotreta cruciferae (блошки канолы), Phyllotreta pusilla (западной черной блошки), Phyllotreta nemorum (блошки земляной светлоногой), Phyllotreta atra (блошки репы), Phyllotreta robusta (садовой блошки), Phyllotreta striolata (блошки полосатой), Phyllotreta undulata, Psylliodes chrysocephala, и Psylliodes punctulata (блошки конопляной).

[0049] Инсектицидная композиция применима для обработки растения или участка в непосредственной близости от растения для обеспечения защиты или лечения от насекомых, особенно блошек. Связанный аспект представляет собой растение, обработанное инсектицидной композицией, как описано в данном документе, или семена обработанных растений, отличающиеся тем, что растение проявляет повышенную устойчивость к насекомым (например, улучшенная устойчивость к земляным блошкам). В некоторых вариантах осуществления изобретения, растение, проявляющее улучшенную стойкость к насекомым, характеризуется улучшенным урожаем, по сравнению с растением, не обработанным инсектицидной композицией. В одном варианте осуществления изобретения, урожай (биомасса семян масличных культур или содержание масла) канолы или растений масличного рапса улучшается путем применения инсектицидно-эффективного количества инсектицидного полинуклеотида, содержащего один или более генов, идентифицированных у Phyllotreta cruciferae (блошки канолы); в конкретных вариантах осуществления изобретения, ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 297-532. Растением может быть любое растение, которое подвержено заражению насекомым, которые могут контролироваться с помощью инсектицидной композиции. Растения, представляющие особый интерес, включают коммерчески значимые растения, включая пропашные культуры растений, овощи и фрукты, а также другие растения сельскохозяйственного или декоративного использования. Примеры подходящих растений представлены под рубрикой ʺРастенияʺ. Способ особенно полезен для борьбы с заражением насекомыми у декоративного растения или сельскохозяйственного растения. Различные варианты осуществления включают те, в которых растение представляет собой растение семейства Brassicaceae, включая виды Brassica, выбранные из группы, состоящей из B. napus, B. juncea, B. carinata, B. rapa, B. oleracea, B. rupestris, B. septiceps, B. nigra, B. narinosa, B. perviridus, B. tournefortii, и B. fructiculosa. В других вариантах осуществления изобретения, растение выбирают из группы, состоящей из Glycine max, Linum usitatissimum, Zea mays, Carthamus tinctorius, Helianthus annuus, Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana, Betholettia excelsa, Ricinus communis, Cocus nucifera, Coriandrum sativum, Gossypium spp., Arachis hypogaea, Simmondsia chinensis, Solanum tuberosum, Elaeis guineensis, Olea europaea, Oryza sativa, Cucurbita maxim, Hordeum vulgare и Triticum aestivum.

[0050] В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидная композиция разработана для конкретных вредителей земляных блошек для данного растения, например, где растение представляет собой растение картофеля, а насекомым является Epitrix cucumeris (блошка картофельная). В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидная композиция разработана для конкретных генов-мишеней у данного вида насекомых. Конкретные варианты осуществления инсектицидной композиции включают те, в которых (a) насекомое представляет собой Phyllotreta atra (блошка репы) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1-296; (b) насекомое представляет собой Phyllotreta cruciferae (блошка канолы) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 297-532; (с) насекомое представляет собой Phyllotreta striolata (полосатая блошка) и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 533-551; или (d) насекомое представляет собой Psylliodes chrysocephala и ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 552-859.

[0051] В некоторых вариантах осуществления изобретения молекула инсектицидного полинуклеотида, используемая в этом способе, предоставляется в виде изолированной молекулы инсектицидного полинуклеотида (не является частью экспрессируемого конструкта, например, не содержит дополнительных элементов, таких как промотор или последовательности терминатора). Такие молекулы инсектицидных полинуклеотидов могут быть относительно короткими, такими как одно- или двухцепочечные молекулы РНК, ДНК или гибридные молекулы РНК/ДНК от между около 18 до около 300 или между около 50 до около 500 нуклеотидов (для одноцепочечных полинуклеотидов) или между около 18 до около 300 или между около 50 до около 500 пар оснований (для двухцепочечных полинуклеотидов). В вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид представляет собой дцРНК, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или ее фрагмента.

[0052] В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидная композиция находится в форме, выбранной из группы, состоящей из твердого вещества, жидкости, порошка, суспензии, эмульсии, спрея, инкапсуляции, микрогранул, частиц носителей, пленки, матрицы, орошения почвы, пищи насекомых или приманки насекомых, и обработки семян. В некоторых вариантах осуществления изобретения, инсектицидная композиция представлена в форме, которая поедается насекомым, такой как жидкость, эмульсия или порошок, применяемые к растению на котором питается насекомое или в виде приманки. Инсектицидные композиции могут дополнительно содержат один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из агента-переносчика, поверхностно-активного вещества, кремнийорганики, полинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидной гербицидной молекулы, неполинуклеотидного пестицида, фунгицида, антидота, аттрактанта насекомых, и регулятора роста насекомых. Инсектицидные композиции могут дополнительно содержать по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous, инсектицидного белка Bacillus sphaericus, бактерии, которая продуцирует инсектицидный белок, энтомицидных видов бактерий, Lysinibacillus sphaericus (Bacillus sphaericus), Brevibacillus laterosporus (Bacillus laterosporus), видов Chromobacterium, Chromobacterium subtsugae, видов Paenibacillus, Paenibacillus lentimorbus и Paenibacillus popilliae. В некоторых вариантах осуществления изобретения, комбинация молекулы инсектицидного полинуклеотида и неполинуклеотидного пестицидного агента, обеспечивает уровень контроля над насекомыми, который больше, чем сумма эффектов молекулы инсектицидного полинуклеотида и неполинуклеотидного пестицидного агента, если они тестируются отдельно.

[0053] Варианты реализации композиций дополнительно содержат соответствующие наклейки и смачиватели, необходимые для эффективного лиственного покрытия, а также УФ-протекторы для защиты инсектицидных полинуклеотидов, такие как дцРНК от УФ-повреждений. Такие добавки обычно используются в биоинсектицидной промышленности и известны специалистам в данной области техники. Композиции для нанесения на грунт могут содержать гранулированные составы, которые служат приманкой для личинок насекомых. Варианты осуществления изобретения включают агент-переносчик, поверхностно-активное вещество, кремнийорганику, полинуклеотидную гербицидную молекулу, неполинуклеотидную гербицидную молекулу, неполинуклеотидный пестицид, фунгицид, антидот, аттрактант насекомых, и регулятор роста насекомых.

[0054] Варианты реализации композиций могут включать ʺагент переносаʺ: агент, который в сочетании с композицией, содержащей инсектицидный полинуклеотид, как описано в данном документе, который наружно применяют на поверхность организма, давая возможность полинуклеотиду проникать в клетки этого организма. Такие агенты переносчики могут быть включены как часть композиции, содержащей инсектицидный полинуклеотид, как описано в данном документе, или могут быть применены до, одновременно с или после нанесения композиции, содержащей инсектицидный полинуклеотид, как описано в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения, агент переноса представляет собой агент, который улучшает поглощение инсектицидного полинуклеотида насекомым. В некоторых вариантах осуществления изобретения, агентом переноса является агент, который находится на поверхности растительной ткани, например, семян, листьев, стеблей, корней, цветов, или плодов, для проникновения полинуклеотида в клетки растений. В некоторых вариантах осуществления изобретения, агент переноса обеспечивает путь для полинуклеотида через кутикуло-восковые барьеры, устьица, и/или клеточную стенку или мембранные барьеры в клетки растений.

[0055] Подходящие агенты переноса включают в себя агенты, которые повышают проницаемость внешней части организма, или которые увеличивают проницаемость клеток организма для полинуклеотидов. Подходящие агенты переноса включают в себя химический агент, или физический агент, или их сочетания. Химические агенты для создания необходимых условий или переноса включают (a) поверхностно-активные вещества, (b) органический растворитель, или водный раствор или водную смесь органических растворителей, (c) окисляющие агенты, (d) кислоты, (e) основания, (f) масла, (g) ферменты, или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления изобретения, применение инсектицидного полинуклеотида и агента переноса необязательно включает один или более этапов инкубации, стадию нейтрализации (например, для нейтрализации кислоты, основания или окисляющего агента или для инактивации фермента), стадию отмывания, или их комбинации. Подходящий агент переноса может быть в форме эмульсии, обратной эмульсии, липосомы, или другой мицелло-подобной композиции, или может вызывать переход полинуклеотидной композиции в форму эмульсии, обратной эмульсии, липосомы, или другой мицелло-подобной композиции. Варианты реализации агентов переноса включают противоионы или другие молекулы, которые, как известно, ассоциируются с молекулами нуклеиновых кислот, например, катионные липиды, неорганические ионы аммония, ионы алкил аммония, ионы лития, полиамины такие как спермин, спермидин или путресцин, и другие катионы. Варианты реализации агентов переноса включают органические растворители, такие как ДМСО, ДМФ, пиридин, N-пирролидин, гексаметилфосфорамид, ацетонитрил, диоксан, полипропилен гликоль или другие растворители смешиваемые с водой или растворяющие фосфонуклеотиды в неводных системах (такие как, используются в синтетических реакциях). Варианты осуществления агентов переноса включают природные или синтетические масла с поверхностно-активными веществами или эмульгаторами или без них, например, масла из растительных источников, растительных масел (таких как те, которые перечислены в 9th Compendium of Herbicide Adjuvants, в открытом доступе в режиме онлайн на herbicide.adjuvants.com), парафиновых масел, эфиров жирной кислоты и многоатомного спирта, или масел с короткими цепочками молекул, модифицированных амидами или полиаминами, такими как полиэтиленимин или N-пирролидин.

[0056] Варианты реализации агентов переноса включают кремнийорганические препараты. Например, подходящий агент переноса представляет собой кремнийорганический препарат, который коммерчески доступен как SILWET L-77® бренд поверхностно-активного вещества, имеющего номер CAS 27306-78-1 и номер EPA: CAL.REG.NO. 5905-50073-AA, и в настоящее время доступен в Momentive Performance Materials, Олбани, Нью-Йорк. В вариантах осуществления изобретения, где кремнийорганический препарат SILWET L-77® с поверхностно-активным веществом используется в качестве агента переноса в форме обработки распылением (применяется перед, одновременно с, или после нанесения композиции, содержащей инсектицидный полинуклеотид, как описано в данном документе) листьев растений или других растительных поверхностей, свежеприготовленные концентрации в диапазоне от около 0,015 до около 2 мас.% (мас.%) (например, около 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,5 массового процента) эффективны при подготовке листа или другой поверхности растения для переноса полинуклеотида, как описано в данном документе, в растительные клетки через местное нанесение на поверхность. Один вариант осуществления изобретения включает композицию, которая содержит полинуклеотид и агент переноса, включающий кремнийорганический препарат, такой как Silwet L-77, в диапазоне от около 0,015 до около 2 мас.% (мас.%) (например, около 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,5 мас.%). Один вариант реализации изобретения включает композицию, которая содержит полинуклеотид и агент переноса, содержащий SILWET L-77® бренд поверхностно-активного вещества в диапазоне от около 0,3 до около 1 мас.% (мас.%) или около 0,5 до около 1% по массе (мас.%).

[0057] Кремнийорганические соединения, используемые как агенты переноса для использования в композициях и способах, описанных в данном документе, включают, но без ограничения, соединения, которые включают: (a) головную группу трисилоксана, которая ковалентно связана с, (b) алкильный линкер, включая, но без ограничения, n-пропил линкер, который ковалентно связан с, (c) цепь полигликоля, которая ковалентно связана с, (d) терминальной группой. Головные группы трисилоксана таких кремнийорганических соединений включают, но без ограничения, гептаметилтрисилоксан. Алкильные линкеры могут включать, но без ограничения, n-пропил линкер. Полигликолевые цепи включают, но без ограничения, полиэтиленгликоль или полипропиленгликоль. Полигликолевые цепи могут включать смесь, которая обеспечивает среднюю длину цепи ʺnʺ около ʺ7,5ʺ. В определенных вариантах осуществления изобретения, средняя длина цепи ʺnʺ может варьировать от около 5 дo около 14. Терминальные группы могут включать, но без ограничения, алкильные группы, такие как метильная группа. Кремнийорганические соединения, используемые как агенты переноса для использования в композициях и способах, описанных в данном документе, включают, но без ограничения, трисилоксан этоксилатных поверхностно-активных веществ или полиалкиленоксид модифицированный гептаметил трисилоксаном. Пример агента переноса для использования в композициях и способах, описанных в данном документе, представляет собой Соединение I:

(Соединение I: полиалкиленоксид гептаметилтрисилоксан, среднее n=7,5).

[0058] Кремнийорганические соединения, используемые в качестве агентов переноса для использования в композициях и способах, описанных в данных документах, используются, например, в виде свежеприготовленных концентраций в диапазоне от около 0,015 до около 2 мас.% (мас.%) (например, около 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,5 мас.%).

[0059] Варианты реализации агентов переноса включают одну или более солей, таких как хлорид аммония, тетрабутилфосфонил бромид, и сульфат аммония, представленные в или используемые в композиции, содержащей инсектицидный полинуклеотид, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения, хлорид аммония, тетрабутилфосфонил бромид, и/или сульфат аммония используют в концентрации от около 0,5% до около 5% (м./об.), или около 1% до около 3% (м./об.), или около 2% (м./об.). В некоторых вариантах осуществления изобретения, композиция, содержащая инсектицидный полинуклеотид, содержит соль аммония в концентрации большей или равной 300 миллимолям. В определенных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая инсектицидный полинуклеотид, содержит кремнийорганический агент переноса в концентрации около 0,015 до около 2 процентов по массе (массовый процент), а также сульфат аммония в концентрации от около 80 до около 1200 миллимолей или около 150 миллимолей до около 600 миллимолей.

[0060] Варианты реализации агентов переноса включают фосфатные соли. Фосфатные соли используемые в композиции, содержащей инсектицидный полинуклеотид, включают, но без ограничения, кальциевые, магниевые, калиевые, или фосфат-натриевые соли. В определенных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая инсектицидный полинуклеотид, содержит фосфатную соль в концентрации по меньшей мере около 5 миллимолей, по меньшей мере около 10 миллимолей, по меньшей мере около 20 миллимолей. В определенных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая инсектицидный полинуклеотид, содержит фосфатную соль в диапазоне от около 1 миллимоля до около 25 миллимолей или в диапазоне от около 5 миллимолей до около 25 миллимолей. В определенных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая инсектицидный полинуклеотид, содержит фосфат натрия в концентрации по меньшей мере около 5 миллимолей, по меньшей мере около 10 миллимолей, по меньшей мере около 20 миллимолей. В определенных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая инсектицидный полинуклеотид, содержит фосфат натрия в концентрации от около 5 миллимолей, около 10 миллимолей, или около 20 миллимолей. В определенных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая инсектицидный полинуклеотид, содержит соль фосфата натрия в диапазоне от около 1 миллимоля до около 25 миллимолей или в диапазоне от около 5 миллимолей до около 25 миллимолей. В определенных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая инсектицидный полинуклеотид, содержит соль фосфата натрия в диапазоне от около 10 миллимоля до около 160 миллимолей или в диапазоне от около 20 миллимолей до около 40 миллимолей. В определенных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая инсектицидный полинуклеотид, содержит натрий-фосфатный буфер при рН около 6,8.

[0061] Варианты реализации агентов переноса включают поверхностно-активные вещества и/или эффективные молекулы, содержащиеся в них. Поверхностно-активные вещества и/или эффективные молекулы, содержащиеся в них, включают, но без ограничения, натриевые или литиевые соли жирных кислот (таких как талловый жир или амины или фосфолипиды таллового жира) и кремнийорганические поверхностно-активные вещества. В определенных вариантах реализации изобретения, композиция, содержащая инсектицидный полинуклеотид, составлена из противоионов или других молекул, которые, как известно, связываются с молекулами нуклеиновых кислот. Не ограничивающие примеры включают, ионы тетраалкил аммония, ионы триалкил аммония, ионы сульфония, ионы лития, и полиамины, такие как спермин, спермидин или путресцин. В некоторых вариантах осуществления изобретения, композиция, содержащая инсектицидный полинуклеотид, составлена с использованием не полинуклеотидного гербицида, например, глифосата, ауксин-подобных гербицидов бензойной кислоты, включающих дикамбу, хлорамбен и ТВА, глуфосинат, ауксин-подобных гербицидов, включающих гербицид фенокси карбоксильной кислоты, гербицид пиридин карбоксильной кислоты, гербицид хинолин карбоксильной кислоты, гербицид пиримидин карбоксильной кислоты, и беназолин-этиловый гербицид, сульфонилмочевину, имидазолиноны, бромоксинил, делапон, циклохезанедион, ингибиторы протопорфириноген-оксидазы, и 4-гидроксифенил-пируват-диоксигеназо ингибирующих гербицидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, композиция, содержащая инсектицидный полинуклеотид, составлена с использованием не полинуклеотидного пестицида, например пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous, и инсектицидного белка Bacillus sphaericus.

Способы обеспечения растений с улучшенной устойчивостью к насекомым

[0062] Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к способу обеспечения растения, имеющего повышенную устойчивость к насекомому, включающему экспрессию в растении рекомбинантного ДНК конструкта, причем рекомбинантный ДНК конструкт, содержит ДНК, кодирующую инсектицидный полинуклеотид, содержащую последовательность по меньшей мере из 21 смежных нуклеотидов, которые по существу идентичны или по существу комплементарны фрагменту по меньшей мере одного гена-мишени насекомого, выбранного из группы, состоящей из актина, Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpL13, RpL14, RpS21, RpS4, RpS14, Rpn2, Rpn3, Rpn7, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VАТФaзы E, VАТФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФазы A), Vha68-2 (V-ATФазы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах осуществления изобретения, ДНК конструкт содержит ДНК, кодирующую инсектицидный полинуклеотид, содержащий последовательность по существу идентичную или по существу комплементарную фрагменту последовательности ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1-859. Несколько вариантов осуществления изобретения относятся к растению, полученному с помощью такого способа. В некоторых вариантах осуществления изобретения, конструкция ДНК содержит ДНК, кодирующую инсектицидный полинуклеотид, имеющий от около 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100%) идентичности или комплементарность по меньшей мере с 21 смежными нуклеотидами последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или ее фрагмента.

[0063] В некоторых вариантах осуществления изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт дополнительно содержит гетерологичный промотор функционально связанный с ДНК, кодирующей инсектицидный полинуклеотид, причем гетерологичный промотор является функционирующим в растительной клетке. ʺГетерологичныйʺ относится к последовательностям нуклеиновой кислоты, которые обычно функционально не связаны в нативном или встречающемся в природе геноме; с помощью ʺгетерологичного промотораʺ означает, что промотор изначально функционально не связан с ДНК, кодирующей инсектицидный полинуклеотид. Промоторы, функционирующие в растительной клетке, содержат те, которые перечислены под заголовком ʺПромоторыʺ.

[0064] В некоторых вариантах осуществления изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт экспрессируется в растении путем трансгенной экспрессии или транзиторной экспрессии. В некоторых вариантах осуществления изобретения, способ дополнительно включает экспрессию в растении по меньшей мере одного пестицидного агента, выбранного из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous, инсектицидного белка Bacillus sphaericus, бактерии, которая продуцирует инсектицидный белок, энтомицидных видов бактерий, Lysinibacillus sphaericus (Bacillus sphaericus), Brevibacillus laterosporus (Bacillus laterosporus), видов Chromobacterium, Chromobacterium subtsugae, видов Paenibacillus, Paenibacillus lentimorbus и Paenibacillus popilliae. Пестицидный агент может быть экспрессирован из того же рекомбинантного ДНК конструкта, который содержит ДНК, кодирующую инсектицидный полинуклеотид, или из другого рекомбинантного ДНК конструкта.

[0065] Связанный аспект представляет собой растение, обладающее повышенной устойчивостью к насекомому (например, повышенной стойкостью к блошкам), или семена такого растения, причем растение предусматривается способом, включающим экспрессию в растении рекомбинантного ДНК конструкта, причем рекомбинантный ДНК конструкт, содержит ДНК, кодирующую инсектицидный полинуклеотид, имеющий последовательность, по существу идентичную или по существу комплементарную фрагменту по меньшей мере одного гена-мишени насекомого, причем ген-мишень является выбранным из группы, состоящей из актина, Act5C, аргинин киназы, COPI (субъединицы коатомера) альфа, COPI (субъединицы коатомера) бета, COPI (субъединицы коатомера) бетаПрайм, COPI (субъединицы коатомера) дельта, COPI (субъединицы коатомера) эпсилон, COPI (субъединицы коатомера) гамма, COPI (субъединицы коатомера) зета, RpL07, RpL19, RpL3, RpL40, RpL13, RpL14, RpS21, RpS4, RpS14, Rpn2, Rpn3, Rpn7, Rpt6, Rpn8, Rpn9, Rpn6-PB-подобного белка, Sar1, sec6, sec23, sec23A, shrb (snf7), гамма-цепи тубулина, ProsAlpha2, ProsBeta5, Протеасомы альфа 2, Протеасомы бета 5, VАТФaзы E, VАТФaзы A, VATФaзы B, VATФaзы D, Vps2, Vps4, Vps16A, Vps20, Vps24, Vps27, Vps28, Vha26 (V-ATФазы A), Vha68-2 (V-ATФазы D/E), 40S рибосомального белка S14 и 60S рибосомального белка L13. В некоторых вариантах осуществления изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт содержит ДНК, кодирующую инсектицидный полинуклеотид, содержащий последовательность по существу идентичную или по существу комплементарную фрагменту последовательности ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1-859. В некоторых вариантах осуществления изобретения, растение, проявляющее улучшенную стойкость к насекомым, характеризуется улучшенным урожаем, по сравнению с растением не экспрессирующим рекомбинантный ДНК конструкт. В варианте осуществления изобретения, урожай (биомасса семян масличных культур или содержание масла) канолы или растений масличного рапса улучшается путем экспрессии в растениях канолы или масличного рапса инсектицидного полинуклеотида, такого как молекула дцРНК, нацеливающего один или более генов Phyllotreta cruciferae (блошки канолы), например, где ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 297-532. Несколько вариантов осуществления изобретения относятся к плоду, семенам, или частям размножения растения, предусмотренные этим способом, и проявляющие повышенную устойчивость к насекомым. Растением может быть любое растение, которое подвержено заражению насекомым, которое может контролироваться с помощью экспрессии у растения рекомбинантного ДНК конструкта соответственно этому способу. Растения, представляющие особый интерес, включают коммерчески значимые растения, включая пропашные культуры растений, овощи и фрукты, а также другие растения сельскохозяйственного или декоративного использования. Примеры подходящих растений представлены под рубрикой ʺРастенияʺ. Способ особенно полезен для создания декоративного растения или сельскохозяйственного растения с повышенной устойчивостью к блошкам. Различные варианты осуществления способа включают те, в которых растение представляет собой растение семейства Brassicaceae, включая виды Brassica, выбранные из группы, состоящей из B. napus, B. juncea, B. carinata, B. rapa, B. oleracea, B. rupestris, B. septiceps, B. nigra, B. narinosa, B. perviridus, B. tournefortii, и B. fructiculosa. В других вариантах осуществления изобретения, растение выбирают из группы, состоящей из Glycine max, Linum usitatissimum, Zea mays, Carthamus tinctorius, Helianthus annuus, Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana, Betholettia excelsa, Ricinus communis, Cocus nucifera, Coriandrum sativum, Gossypium spp., Arachis hypogaea, Simmondsia chinensis, Solanum tuberosum, Elaeis guineensis, Olea europaea, Oryza sativa, Cucurbita maxim, Hordeum vulgare и Triticum aestivum. В варианте осуществления способ предусматривает растение картофеля с повышенной устойчивостью к Epitrix cucumeris (картофельной блошке).

[0066] Варианты осуществления способа обеспечивают растение, обладающее повышенной устойчивостью к одному или более видам земляных блошек, например, вид рода, выбранного из группы, состоящей из родов Altica, Anthobiodes, Aphthona, Aphthonaltica, Aphthonoides, Apteopeda, Argopistes, Argopus, Arrhenocoela, Batophila, Blepharida, Chaetocnema, Clitea, Crepidodera, Derocrepis, Dibolia, Disonycha, Epitrix, Hermipyxis, Hermaeophaga, Hespera, Hippuriphila, Horaia, Hyphasis, Lipromima, Liprus, Longitarsus, Luperomorpha, Lythraria, Manobia, Mantura, Meishania, Minota, Mniophila, Neicrepidodera, Nonarthra, Novofoudrasia, Ochrosis, Oedionychis, Oglobinia, Omeisphaera, Ophrida, Orestia, Paragopus, Pentamesa, Philopona, Phygasia, Phyllotreta, Podagrica, Podagricomela, Podontia, Pseudodera, Psylliodes, Sangariola, Sinaltica, Sphaeroderma, Systena, Trachyaphthona, Xuthea и Zipangia. В вариантах осуществления изобретения, насекомое выбирают из группы, состоящей из Altica ambiens (блошки ольхи), Altica canadensis (блошки земляной), Altica chalybaea (блошки виноградной), Altica prasina (блошки тополя), Altica rosae (блошки розы), Altica sylvia (блошки голубики), Altica ulmi (блошки вяза), Chaetocnema pulicaria (блошки кукурузной), Chaetocnema conofinis (блошки сладкого картофеля), Epitrix cucumeris (блошки картофельной), Systena blanda (бледнополосатой блошки), и Systena frontalis (рыжей блошки). В вариантах осуществления изобретения, способ обеспечивает растение, имеющее улучшенную устойчивость к насекомому, выбранному из группы, состоящей из Phyllotreta armoraciae (блошки хреновой), Phyllotreta cruciferae (блошки канолы), Phyllotreta pusilla (западной черной блошки), Phyllotreta nemorum (блошки земляной светлоногой), Phyllotreta atra (блошки репы), Phyllotreta robusta (садовой блошки), Phyllotreta striolata (блошки полосатой), Phyllotreta undulata, Psylliodes chrysocephala, и Psylliodes punctulata (блошки конопляной).

[0067] В некоторых вариантах осуществления изобретения, способ разработан для конкретных генов-мишеней у данного вида насекомых. В некоторых вариантах реализации изобретения, представлено растение, имеющее повышенную стойкость к Phyllotreta atra (блошке репы), причем ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1-296. В некоторых вариантах реализации изобретения, представлено растение, имеющее повышенную стойкость к Phyllotreta cruciferae (блошке канолы), причем ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs:297-532. В некоторых вариантах реализации изобретения, представлено растение, имеющее повышенную стойкость к Phyllotreta striolata (блошке полосатая), причем ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs:533-551. В некоторых вариантах осуществления изобретения, представлено растение, имеющее повышенную стойкость к Psylliodes chrysocephala, причем ген-мишень имеет последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs:552-859. В некоторых вариантах реализации изобретения, представлено растение, имеющее повышенную стойкость к Phyllotreta atra (блошке репы), которое экспрессирует из рекомбинантного ДНК конструкта цепь дцРНК, содержащую последовательность от около 95% до около 100% идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 860-1155 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, представлено растение, имеющее повышенную стойкость к Phyllotreta cruciferae (блошке канолы), которое экспрессирует из рекомбинантного ДНК конструкта инсектицидный полинуклеотид, содержащий последовательность от около 95% до около 100% идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1156-1391, 1731-1972 и 1974 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, представлено растение, имеющее повышенную стойкость к Phyllotreta striolata (полосатой блошке), которое экспрессирует из рекомбинантного ДНК конструкта инсектицидный полинуклеотид, содержащий цепь, содержащую последовательность от около 95% до около 100% идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1392-1410, 1973 и 1975 или их фрагмента. В некоторых вариантах реализации изобретения, представлено растение, имеющее повышенную стойкость к Psylliodes chrysocephala, которое экспрессирует из рекомбинантного ДНК конструкта инсектицидный полинуклеотид, содержащий цепь, содержащую последовательность от около 95% до около 100% идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs:1411 -1718 или их фрагмента.

Рекомбинантные ДНК-конструкты, кодирующие инсектицидные полинуклеотиды для борьбы с насекомыми

[0068] Несколько вариантов осуществления относятся к рекомбинантному конструкту ДНК, содержащему гетерологичный промотор, функционально связанный с ДНК, кодирующей инсектицидный полинуклеотидный транскрипт, содержащий последовательность от около 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100%) идентичной или комплементарной по меньшей мере 21 смежным нуклеотидов последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или ее фрагмента.

[0069] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантного ДНК конструкта транскрипт инсектицидного полинуклеотида содержит последовательность от около 95% до около 100% (например, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или около 100%) идентичной или комплементарной по меньшей мере с 21 смежными нуклеотидами последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или ее фрагмента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, транскрипт инсектицидного полинуклеотида образует дцРНК двухцепочечного инсектицидного полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления изобретения, транскрипт инсектицидного полинуклеотида представляет собой дцРНК, содержащую цепь РНК, содержащую по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов последовательности РНК, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или фрагмента его. В некоторых вариантах осуществления изобретения, транскрипт инсектицидного полинуклеотида представляет собой дцРНК, содержащую цепь РНК, содержащую по меньшей мере один сегмент из 21 смежных нуклеотидов последовательности РНК, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или фрагмента его. В некоторых вариантах осуществления изобретения, транскрипт инсектицидного полинуклеотида представляет собой дцРНК, содержащую по меньшей мере одну цепь РНК, содержащую последовательность от около 95% до около 100% идентичную или комплементарную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или их фрагмента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, транскрипт инсектицидного полинуклеотида представляет собой дцРНК, содержащую цепь РНК, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или фрагмента его. В некоторых вариантах осуществления изобретения, транскрипт инсектицидного полинуклеотида образует одноцепочечный инсектицидный полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления изобретения, транскрипт инсектицидного полинуклеотида представляет собой оцРНК, содержащую по меньшей мере один сегмент из 18 или более смежных нуклеотидов последовательности РНК, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или фрагмента его. В некоторых вариантах осуществления изобретения, транскрипт инсектицидного полинуклеотида представляет собой оцРНК, содержащую по меньшей мере один сегмент из 21 смежных нуклеотидов последовательности РНК, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или фрагмента его. В некоторых вариантах осуществления изобретения, транскрипт инсектицидного полинуклеотида представляет собой оцРНК, содержащую последовательность от около 95% до около 100% идентичную или комплементарную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или их фрагмента. В некоторых вариантах осуществления изобретения, транскрипт инсектицидного полинуклеотида представляет собой оцРНК, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или фрагмента его.

[0070] В некоторых вариантах реализации рекомбинантного ДНК конструкта, гетерологичный промотор является функционирующим для экспрессии инсектицидного полинуклеотидного транскрипта в бактериях. В некоторых вариантах реализации изобретения, отличающихся тем, что рекомбинантный ДНК конструкт должен экспрессироваться в бактерии, бактерию выбирают из группы, состоящей из Escherichia coli, видов Bacillus, видов Pseudomonas, видов Xenorhabdus, или видов Photorhabdus. В других вариантах осуществления изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт содержит гетерологичный промотор, который является функционирующим в растительной клетке.

[0071] В некоторых вариантах осуществления изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт содержится в рекомбинантном векторе, таком как вектор рекомбинантного растительного вируса или рекомбинантный вектор бакуловируса. В вариантах осуществления изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт интегрирован в растительную хромосому или пластиду, например, путем стабильной трансформации.

[0072] Связанные аспекты включают трансгенную растительную клетку, содержащую в своем геноме рекомбинантный ДНК конструкт, и трансгенное растение, содержащее такую трансгенную растительную клетку. Трансгенные растительные клетки и растения созданы с помощью способов, известных в данной области техники, таких как описанные под заголовком ʺСоздание и использование трансгенных растительных клеток и трансгенных растенийʺ. Дополнительные аспекты включают товарный продукт, полученный из такого трансгенного растения, и семян трансгенных потомства или частей размножения трансгенного растения.

Дополнительная информация и методы

Растения

[0073] Способы и композиции, описанные в данном документе, для лечения и защиты растений от насекомых-вредителей могут быть использованы у широкого спектра растений. Подходящие растения, у которых способы и композиции, описанные в данном документе, могут быть использованы, включают, но без ограничения, зерновые и кормовые травы (рис, кукурузу, пшеницу, ячмень, овес, сорго, просо, пальчатое просо, кормовые травы холодного сезона и гречку заметную), масличные культуры (сою, масличные рода капусты, включая канолу и масличный рапс, подсолнечник, арахис, лен, кунжут и сафлор), бобовые, зерновые и кормовые растения (обыкновенную фасоль, китайскую вигну, горох, стручковую фасоль, чечевицу, фасоль остролистную, азиатскую фасоль, голубиный горох, вику, нут, люпин, люцерну и клеверы), фрукты и орехи умеренного пояса (яблоко, грушу, персик, сливы, ягодные культуры, вишни, виноград, оливы, миндаль и грецкий орех), тропические и субтропические фрукты и орехи (цитрусовые, включая лимоны, апельсины и грейпфруты; банан и банан райский, ананас, папайю, манго, авокадо, киви, маракуйю и хурму), овощные культуры (растения семейства пасленовых, включая помидоры, баклажаны и перцы; овощи рода капуста; редис, морковь, тыквы, луки, спаржи и листовые овощи), сахарные, клубневые и лубяные культуры (сахарный тростник, сахарную свеклу, стевию, картофель, сладкий картофель, маниоку и хлопок), плантационные культуры, декоративные растения и газонные травы (табак, кофе, какао, чай, каучуковое дерево, лекарственные растения, декоративные растения и газонные травы) и виды лесных деревьев. Особыми видами растений являются растения семейства Brassicaceae, в том числе виды Brassica включают B. napus, B. juncea, B. carinata, B. rapa, B. oleracea, B. rupestris, B. septiceps, B. nigra, B. narinosa, B. perviridus, B. tournefortii, и B. fructiculosa. Дополнительные виды растений, представляющие интерес: Glycine max, Linum usitatissimum, Zea mays, Carthamus tinctorius, Helianthus annuus, Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana, Betholettia excelsa, Ricinus communis, Cocus nucifera, Coriandrum sativum, Gossypium spp., Arachis hypogaea, Simmondsia chinensis, Solanum tuberosum, Elaeis guineensis, Olea europaea, Oryza sativa, Cucurbita maxim, Hordeum vulgare и Triticum aestivum.

Дополнительные элементы конструкта

[0074] Варианты осуществления полинуклеотидов и молекул нуклеиновых кислот, описанных в данном документе, могут содержать дополнительные элементы, такие как промоторы, сайты распознавания малых РНК, аптамеры и рибозимы, дополнительные и дополнительные кассеты экспрессии для экспрессирования кодирующих последовательностей (например, для экспрессии трансгена, такого как инсектицидный белок или выбираемый маркер) или некодирующие последовательности (например, для экспрессии дополнительных подавляющих элементов). Например, аспект обеспечивает рекомбинантный ДНК конструкт, содержащий гетерологичный промотор функционально связанный с ДНК, кодирующей РНК транскрипт, содержащий последовательность от около 95% до около 100% идентичную или комплементарную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 860-1718 и 1722-1975 или их фрагмента. В другом варианте осуществления изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт, содержащий промотор функционально связанный с ДНК, кодирующей: (a) РНК транскрипт, содержащий последовательность от около 95% до около 100% идентичную или комплементарную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 860-1718 и 1722-1975 или их фрагмента, и (b) аптамер, стабильно интегрированный в растительный геном, из которого РНК транскрипт, содержащий РНК аптамер и подавленный элемент РНК, экспрессируются в клетках растения; аптамер служит для направления подавленного элемента РНК в нужное место в клетке. В другом варианте осуществления изобретения, включение одного или более сайтов распознавания для связывания и расщепления с помощью малой РНК (например, с помощью микроРНК или миРНК, которые экспрессируются только в определенной клетке или ткани) позволяет более точно экспрессировать паттерны в растении, в котором экспрессия рекомбинантного ДНК конструкта подавляется, где экспрессируются малые РНК. Такие дополнительные элементы описаны ниже.

Промоторы

[0075] Промоторы, используемые в композициях и способах, описанных в данном документе, являются функциональными в клетке, в которой данная конструкция предназначена для транскрипции. Как правило, эти промоторы являются гетерологичными промоторами, как используется в рекомбинантных конструктах, т.е. они не обнаружены в природе функционально связанными с другими нуклеиновыми элементами, используемыми в конструктах. В различных вариантах осуществления изобретения, промотор является выбранным из группы, состоящей из конститутивного промотора, пространственно специфического промотора, специфического во времени промотора, связанного с развитием специфического промотора и индуцибельного промотора. Во многих вариантах осуществления изобретения, промотор представляет собой промотор функциональный в растении, например, pol II промотор, pol III промотор, pol IV промотор, или pol V промотор.

[0076] Неконститутивные промоторы, пригодные для применения с конструктами рекомбинантной ДНК, описанными в данном документе, включают пространственно специфические промоторы, специфические во времени промоторы и индуцибельные промоторы. Пространственно специфические промоторы могут включать органело-, клеточно-, ткане- или органоспецифические промоторы (например, пластидспецифический, корнеспецифический, пыльцаспецифический или семяспецифический промотор для экспрессии в пластидах, корнях, пыльце или семенах соответственно). Во многих случаях особенно пригоден семяспецифический, эмбрионоспецифический, алейроноспецифический или эндоспермоспецифический промотор. Специфические во времени промоторы могут включать промоторы, которые имеют тенденцию промотировать экспрессию во время определенных стадий развития в цикле роста растения или в течении различного времени дня или ночи, или в различные времена года. Индуцибельные промоторы включают промоторы, индуцируемые химическими веществами или условиями окружающей среды, таким как, но без ограничения, биотический или абиотический стресс (например, недостаток воды или засуха, жара, холод, высокие или низкие количества питательных веществ или соли, высокие или низкие уровни света, или вредитель или патогенная инфекция). Промоторы микроРНК могут быть полезны, особенно те, которые имеют паттерн временной специфичности, пространственной специфичности или индуцибельной специфичности; примеры миРНК промоторов, а также способов для идентификации миРНК промоторов, имеющих специфические паттерны экспрессии, представлены в публикации заявки на патент США 2006/0200878, 2007/0199095 и 2007/0300329, которые специально включены в данный документ в качестве ссылки. Промотор со специфической экспрессией может также включать промоторы, которые обычно конститутивно экспрессируются, но с разной степенью или "силой" экспрессии, включая промоторы, обычно рассматриваемые как "сильные промоторы" или как "слабые промоторы.

[0077] Промоторы включают следующие примеры: промотор опалинсинтазы, выделенный из Т-ДНК Agrobacterium; промотор вируса мозаики цветной капусты 35S; усовершенствованные промоторные элементы или химерные промоторные элементы, такие как усовершенствованный промотор вируса мозаики цветной капусты (CaMV) 35S, связанный с энхансерным элементом (интрон белка теплового шока 70 Zea mays); корнеспецифические промоторы, такие как те, что описаны в патентах США 5837848; 6437217 и 6426446; промотор олеозина кукурузы L3, описанный в патенте США 6433252; промотор для гена ядра растений, кодирующий пластидлокализованную альдолазу, описанную в публикации заявки на патент США 2004/0216189; промоторы, индуцируемые холодом, описанные в патенте США 6084089; соли-индуцируемые промоторы, описанные в патенте США 6140078; светоиндуцируемые промоторы, описанные в патенте США 6294714; индуцируемые патогеном промоторы, описанные в патенте США 6252138; и промоторы, индуцируемые дефицитом воды, описанные в публикации заявки на патент США 2004/0123347 A1. Все описанные выше патенты и патентные публикации, описывающие промоторы и их использование, особенно в рекомбинантных ДНК конструктах, функциональных в растениях, включены в данный документ посредством ссылки.

[0078] Интересующие растительные сосудо- или флоэмоспецифические промоторы включают rolC или rolA промотор Agrobacterium rhizogenes, промотор Т-ДНК гена 5 Agrobacterium tumefaciens, промотор гена RSs1 сахарозосинтазы риса, промотор баднавируса желтой крапчатости Commelina, промотор вируса лиственного распада кокоса, промотор палочковидного вируса риса тунгро, промотор гена GS3A глутамин синтетазы гороха, промоторы генов invCD111 и invCD141 инвертазы картофеля, промотор, изолированный из Arabidopsis, который имеет флоэмоспецифическую экспрессию у табака, что показано Kertbundit и др. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 88:5212-5216, промотор VAHOX1 участка, промотор гена инвертазы клеточной стенки гороха, промотор гена кислой инвертазы из моркови, промотор гена сульфат транспортера Sultr1;3, промотор гена синтазы сахарозы растения и промотор гена переносчика сахарозы растений.

[0079] Промоторы, пригодные для применения с конструктом рекомбинантной ДНК или полинуклеотидом, описанными в данном документе, включают промоторы полимеразы II (ʺpol IIʺ) и промоторы полимеразы III (ʺpol IIIʺ). РНК полимераза II транскрибирует структурные и каталитические РНК, которые обычно короче, чем 400 нуклеотидов в длину, и распознает простой запуск Т-остатков в качестве сигнала терминации; она была использована для транскрибирования миРНК дуплексов (см., например, Lu et al. (2004) Nucleic Acids Res., 32:e171). Промоторы рol II являются предпочтительными в некоторых вариантах реализации изобретения, где короткий РНК-транскрипт должен быть получен из рекомбинантного ДНК конструкта. В одном варианте осуществления изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт содержит промотор pol II для экспрессирования РНК транскрипта, фланкированного с помощью саморасщепляющихся последовательностей рибозима (например, саморасщепляющихся рибозимов типа hammerhead), в результате чего обработанная РНК, такая как одноцепочечная РНК, которая связывается с транскриптом гена-мишени блошки, с определенными 5' и 3' концами, свободна от потенциально интерферирующих фланкирующих последовательностей. В альтернативный подходе используются промоторы pol III для создания транскриптов с относительно определенными 5' и 3' концами, т.е. для транскрибирования РНК с минимальными 5' и 3' фланкирующими последовательностями. В некоторых вариантах осуществления изобретения, промоторы Pol III (например, промоторы U6 или H1) являются предпочтительными для добавления короткого AT-насыщенного сайта терминации транскрипции, что приводит к 2 парам оснований липких концов (UU) в транскрибируемой РНК; это полезно, например, для экспрессии конструктов миРНК-типа. Сообщалось об использование промоторов pol III для запуска экспрессии конструктов миРНК; см. van de Wetering и др. (2003) EMBO Rep., 4: 609-615, и Tuschl (2002) Nature Biotechnol., 20: 446-448. Промоторы бакуловируса, такие как полиэдрин бакуловируса и промоторы p10, известны в данной области техники и коммерчески доступны; см., например, Invitrogen's ʺGuide to Baculovirus Expression Vector Systems (BEVS) and Insect Cell Culture Techniquesʺ, 2002 (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния) и F. J. Haines и др. ʺBaculovirus Expression Vectorsʺ, без указания даты (Oxford Expression Technologies, Оксфорд, Великобритания).

[0080] Элемент промотора может содержать последовательности нуклеиновых кислот, которые не являются природными промоторами, или промоторными элементами или их гомологами, но которые могут регулировать экспрессию гена. Примеры таких "ген независимых" регуляторных последовательностей включают природные или искусственно созданные последовательности РНК, которые содержат лиганд-связывающий участок, или аптамер (см. ʺАптамерыʺ, ниже) и регуляторный участок (который может быть цис-активным). См., например, Isaacs et al. (2004) Nat. Biotechnol., 22:841-847, Bayer and Smolke (2005) Nature Biotechnol., 23:337-343, Mandal and Breaker (2004) Nature Rev. Mol. Cell Biol., 5:451-463, Davidson and Ellington (2005) Trends Biotechnol., 23:109-112, Winkler et al. (2002) Nature, 419:952-956, Sudarsan et al. (2003) RNA, 9:644-647, и Mandal and Breaker (2004) Nature Struct. Mol. Biol., 11:29-35. Такие "риборегуляторы" можно выбирать или конструировать для конкретной пространственной или временной специфичности, например, для регуляции трансляции ДНК, которая кодирует подавленный элемент гена-мишени только в присутствии (или в отсутствие) данной концентрации подходящего лиганда. Одним из примеров является риборегулятор, который реагирует на эндогенный лиганд (например, жасмонова кислота или салициловая кислота), продуцируемый растением при стрессе (например, абиотическом стрессе, такого как вода, температура, или стресса питательных веществ, или биотическом стрессе, такого как прикрепление вредителей или патогенов); при стрессе, уровень эндогенного лиганда увеличивается до уровня, достаточного для риборегулятора для начала транскрипции ДНК, которая кодирует подавленный элемент для подавления гена-мишени.

Трансгенные транскрипционные единицы

[0081] В некоторых вариантах осуществления изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт или полинуклеотид, описанные в данном документе, содержат трансгенную транскрипционную единицу. Трансгенная транскрипционная единица содержит последовательность ДНК, кодирующую представляющий интерес ген, например природный белок или гетерологичный белок. Представляющий интерес ген может быть кодирующей или некодирующей последовательностью любых видов (включая, но без ограничения, не эукариотов, таких как бактерии и вирусы; грибы, протисты, растения, беспозвоночные и позвоночные животные). Конкретные гены, представляющие интерес, представляют собой гены, кодирующие один или более белков, придающих устойчивость к гербициду и генам, кодирующим по меньшей мере один пестицидный агент, выбранный из группы, состоящей из пататина, растительного лектина, фитоэкдистероида, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка, Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous, инсектицидного белка Bacillus sphaericus, и инсектицидного белка, продуцируемого любым из Lysinibacillus sphaericus (Bacillus sphaericus),Brevibacillus laterosporus (Bacillus laterosporus), видов Chromobacterium, Chromobacterium subtsugae, видов Paenibacillus, Paenibacillus lentimorbus и Paenibacillus popilliae. Трансгенная транскрипционная единица может дополнительно содержать 5' или 3' последовательность или оба как требуется для транскрипции трансгена.

Интроны

[0082] В некоторых вариантах осуществления изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт или полинуклеотид содержат ДНК, кодирующую сшивающий интрон. ʺИнтронʺ обычно означает сегмент ДНК (или РНК, транскрибированную из такого сегмента), который расположен между экзонами (белок-кодирующими сегментами ДНК или соответствующей транскрибированной РНК), причем, в ходе созревания матричной РНК, интрон присутствует ферментативно "сращенным из" или удален из цепи РНК с помощью процесса расщепления/лигирования, который происходит в ядре эукариот. Термин ʺинтронʺ также применяется для некодирующих последовательностей ДНК, которые транскрибируются в сегментах РНК, которые могут быть сращены из созревания РНК-транскрипта, но интроны не обнаружены между белок-кодирующих экзонами. Один пример этих сшивающих последовательностей, которые обладают способностью усиливать экспрессию расположенной ниже кодирующей последовательности в растениях (в некоторых случаях, особенно у однодольных); эти сшивающие последовательности в норме расположены в 5' нетранслируемом участке некоторых генов растений, а также в некоторых вирусных генах (например, 5' лидерная последовательность вируса мозаики табака или лидер «омега», описанный как усиление экспрессии в растительных генах Gallie и Walbot (1992) Nucleic Acids Res., 20: 4631-4638). Эти сшивающие последовательности или ʺусиливающие экспрессию интроныʺ могут быть искусственно вставлены в 5' нетранслируемый участок гена растения между промотором, но до любого белок-кодирующих экзонов. Примеры таких усиливающих экспрессию интронов включают, но без ограничения, алкогольдегидрогеназу кукурузы (Zm-Adh1), Bronze-1 усиливающий экспрессию интрон кукурузы, интрон актина 1 (Os-Act1) риса, Shrunken-1 (Sh-1) интрон, интрон синтетазы сахарозы кукурузы, интрон белка теплового шока 18 (hsp18) и интрон белка теплового шока 82 килодальтон (hsp82). Патенты США 5593874 и 5859347, специально включены в данный документ посредством ссылки, описывают способы улучшения рекомбинантных ДНК конструктов для применения у растений с помощью включения усиливающего экспрессию интрона, полученного из белка теплового шока 70 килодальтон (hsp70) в нетранслируемом лидере, расположенном в 3' от промотора гена и 5' от первого белок-кодирующего экзона.

Элементы супрессии генов

[0083] В некоторых вариантах осуществления изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт или полинуклеотид содержат ДНК, кодирующую дополнительный элемент супрессии гена для подавления гена-мишени отличного от гена-мишени блошки. Ген-мишень который должен быть подавлен может содержать кодирующую или не кодирующую последовательность или обе.

[0084] Подходящие элементы супрессии гена подробно описаны в публикации заявки на патент США 2006/0200878, описание которых специально включено в данный документ с помощью ссылки, и содержат один или более из:

(a) ДНК, которая содержит по меньшей мере один сегмента анти-смысловой ДНК, который является анти-смысловым к по меньшей мере одному сегменту гена, который должен быть подавлен;

(b) ДНК, которая содержит многочисленные копии по меньшей мере одного сегмента анти-смысловой ДНК, который является анти-смысловым к по меньшей мере одному сегменту гена, который должен быть подавлен;

(c) ДНК, которая содержит по меньшей мере один сегмента смысловой ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом гена, который должен быть подавлен;

(d) ДНК, которая содержит многочисленные копии по меньшей мере одного сегмента смысловой ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом гена, который должен быть подавлен;

(e) ДНК, которая транскрибирует РНК для подавления гена, который должен быть подавлен с помощью формирования двухцепочечной РНК, и содержит по меньшей мере один сегмент анти-смысловой ДНК, который является анти-смысловым к по меньшей мере одному сегменту гена, который должен быть подавлен, и по меньшей мере один сегмент смысловой ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом гена, который должен быть подавлен;

(f) ДНК, которая транскрибирует РНК для подавления гена, который должен быть подавлен с помощью формирования двухцепочечной РНК, и содержит многочисленные серии сегментов анти-смысловой ДНК, которые являются анти-смысловыми к меньшей мере одному сегменту гена, который должен быть подавлен, и многочисленным сериям сегментов смысловой ДНК, которые являются по меньшей мере одним сегментом гена, который должен быть подавлен;

(g) ДНК, которая транскрибирует РНК для подавления гена, который должен быть подавлен, с помощью формирования многочисленных двойных цепочек РНК и содержит многочисленные сегменты анти-смысловой ДНК, которые являются анти-смысловыми к по меньшей мере к одному сегменту гена, который должен быть подавлен, и многочисленными сегментами смысловой ДНК, которые являются по меньшей мере одним сегментом гена, который должен быть подавлен, и при этом многочисленные сегменты анти-смысловой ДНК и многочисленные сегменты смысловой ДНК расположены в серии инвертированных повторов;

(h) ДНК, которая содержит нуклеотиды, полученные из растительной микроРНК;

(i) ДНК, которая содержит нуклеотиды миРНК;

(j) ДНК, которая транскрибируется в РНК аптамер, способный связываться с лигандом; и

(k) ДНК, которая транскрибируется в РНК аптамер, способный связываться с лигандом и ДНК, которая транскрибируется в регуляторную РНК, способную к регулированию экспрессии гена, который должен быть подавлен, причем регулирование зависит от конформации регуляторных РНК и конформация регуляторной РНК аллостерически влияет на состояния связывания РНК аптамеров.

[0085] В некоторых вариантах осуществления изобретений, интрон используется для доставки элемента супрессии гена в отсутствии любого белок-кодирующего экзона (кодирующей последовательности). В одном примере, интрон, такой как усиливающий экспрессию интрон (предпочтительный в некоторых вариантах реализации изобретения), прерывается путем встраивания в интрон элемента супресси гена, причем, при транскрипции элемент супресси гена вырезается из интрона. Таким образом, белок-кодирующие экзоны не требуются для обеспечения функции подавления гена конструктов рекомбинантной ДНК, описанных в данном документе.

Транскрипционные регуляторные элементы

[0086] В некоторых вариантах осуществления изобретения, рекомбинантный ДНК конструкт или полинуклеотид содержат ДНК, кодирующую транскрипционный регуляторный элемент. Транскрипционные регуляторные элементы содержат элементы, которые регулируют уровень экспрессии рекомбинантного ДНК конструкта (относительно их экспрессии в отсутствии таких регуляторных элементов). Примеры подходящих транскрипционных регуляторных элементов включают рибопереключатель (цис- или транс-действующие), стабилизирующие транскрипт последовательности и сайты узнавания микроРНК, как подробно описано в публикации заявки на патент США 2006/0200878, специально включенной в данный документ с помощью ссылки.

Трансгенные растительные клетки и трансгенные растения

[0087] Рекомбинантные ДНК конструкты, описанные в данном документе, могут быть уложены с другой рекомбинантной ДНК для придания дополнительных особенностей (например, в случае трансформированных растений, особенности включают устойчивости к гербицидам, устойчивости к вредителям, устойчивости к холодному проращиванию, устойчивости к водному дефициту и так далее), например, с помощью экспрессирования или подавления других генов. Конструкты для скоординированного уменьшения и увеличения экспрессии генов представлены в публикации заявки на патент США 2004/0126845 A1, специально включенные в качестве ссылки.

[0088] В определенных трансгенных растительных клетках и трансгенных растениях, иногда желательно, чтобы одновременно экспрессировался интересующий ген, в то время как также модулируется экспрессия гена-мишени блошки. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретений, трансгенное растение содержит рекомбинантную ДНК, дополнительно содержащую элемент экспрессии гена для экспрессирования по меньшей мере одного интересующего гена, и транскрипция рекомбинантного ДНК конструкта для борьбы с блошкой предпочтительно осуществляется с одновременной транскрипцией элемента экспрессии гена. В вариантах реализации изобретения, трансгенное растение экспрессирует ДНК, кодирующую транскрипт инсектицидного полинуклеотида, как описано в данном документе, для подавления гена-мишени блошки, и также экспрессирует ДНК, кодирующую не-нуклеотидный пестицидный агент, такой как пестицидный агент с малой молекулой или белковоподобный пестицидный агент; такие ДНК могут быть уложены в один рекомбинантный конструкт или экспрессионную кассету, или, альтернативно, могут быть экспрессированы из дискретных рекомбинантных конструкций или кассет экспрессии. Примеры ненуклеотидных пестицидных агентов включают пататины, лектины растений, фитоэкдистероиды и бактериальные инсектицидные белки (например, инсектицидные белки от Bacillus thuringiensis, Xenorhabdus sp., Photorhabdus sp., Brevibacillus laterosporus (Bacillus laterosporus), Lysinibacillus sphaericus (Bacillus sphaericus), Chromobacterium sp., Chromobacterium subtsugae, Paenibacillus sp., Paenibacillus lentimorbus и Paenibacillus popilliae). В вариантах реализации изобретения, трансгенное растение экспрессирует ДНК, кодирующую рекомбинантный РНК транскрипт, как описано в данном документе, для подавления гена-мишени блошки, и также экспрессирует ДНК, кодирующую один или более белков, отвечающих за толерантность к гербицидам. Примеры белков, несущих толерантность к гербициду, включают 5-енолпирувильшикимат-3-фосфатсинтазы (EPSPS, см., например, патенты США 5627061, 5633435, RE39247, 6040497 и 5094945 и публикации международной заявки PCT WO04074443 и WO04009761), глифозат-оксидоредуктазу (GOX, патент США № 5463175), глифосатдекарбоксилазу (публикация международной заявки PCT WO05003362, патент США 7405347 и публикация заявки на патент США 2004/0177399), глифосат-N-ацетилтрансферазу (GAT, патент США 7,714,188), дающую толерантность к глифосату; дикамба-монооксигеназу, придающую устойчивость к ауксиноподобным гербицидам, таким как дикамба (патент США № 7105724); фосфинотрицин-ацетилтрансферазу (pat или bar), придающую толерантность к фосфинотрицину или глюфосинату (патент США № 5646024); 2,2-дихлорпропионовую кислоту, дающую устойчивость к 2,2-дихлорпропионовой кислоте (Далапон) (публикация международной заявки PCT WO9927116); ацетогидроксикислота-синтазу или ацетолактатсинтазу, придающую толерантность к ингибиторам ацетолактатсинтазы, таким как сульфонилмочевина, имидазолинон, триазолопиримидин, пиримидилоксибензоаты и фталид (патент США № 6225105); галогенарилнитрилазу (Bxn) для обеспечения толерантности к бромоксинилу (патент США №4810648); модифицированный ацетил-коэнзим А карбоксилазу для обеспечения устойчивости к циклогександиону (сетоксидиму) и арилоксифеноксипропионату (галоксифоп) (патент США № 6414222); дигидроптероат-синтазу (sul I) для обеспечения толерантности к сульфонамидным гербицидам (патент США № 5719046); 32 кДа полипептид фотосистемы II (psbA) для обеспечения толерантности к триазиновым гербицидам (Hirschberg et al., 1983, Science, 222: 1346-1349); антранилатсинтазу для обеспечения толерантности к 5-метилтриптофану (патент США № 4581847); синтазу дигидродипиколиновой кислоты (dap A) для обеспечения толерантности к аминоэтилцистеину (публикация международной заявки PCT WO8911789); фитоендесатуразу (crtI) для обеспечения толерантности к пиридазиноновым гербицидам, таким как норфлуразон (патент Японии JP06343473); гидроксифенилпируват диоксигеназу, оксидазу 4-гидроксифенилуксусной кислоты и 4-гидроксифенилуксусную 1-гидролазу (патент США 7304209) для обеспечения толерантности к гербицидам циклопропилизоксазола, таким как изоксафлутол (патент США 6268549); модифицированную протопорфириноген оксидазу I (protox) для обеспечения толерантности к ингибиторам протопорфириногеноксидазы (патент США № 5939602); арилоксиалканоат диоксигеназу (AAD-1) для обеспечения толерантности к гербициду, содержащему арилоксиалканоатную часть (WO 05107437); серин гидроксиметилтрансферазу (публикация патентной заявки США, 2008/0155716), глифозинат-толерантную глутаминсинтазу (публикация заявки на патент США 2009/0018016). Примеры таких гербицидов включают фенокси ауксины (такие как 2,4- D и дихлорпроп), пиридоксин ауксины (такие как флуроксипир и трихлопир), ингибиторы арилоксифеноксипропионат (AOPP) ацетилкоэнзим A карбоксилазы (ACCase) (такие как галоксифоп, хизалофоп и диклофоп), и ингибиторы 5-замещенной феноксиацетат протопорфириноген-оксидазы IX (такие как пирафлуфен и флумиклорак). Нуклеотидные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие белки гербицид-толерантности и последовательности белков гербицид-толерантности, как описано в патенте США и публикациях заявки на патент, цитируемые в этом параграфе, включены в данный документ посредством ссылки.

[0089] В некоторых вариантах осуществления изобретения, конструкты рекомбинантный ДНК, описанные в данном документе, могут быть транскрибированы в любой растительной клетке или ткани или в целом растении на любой стадии развития. Трансгенные растения могут быть получены из любого однодольного или двудольного растения, такого как, но без ограничения, растения коммерческого или сельскохозяйственного интереса, такие как культурные растения (особенно сельскохозяйственные растения, используемые для продуктов питания человека или корма для животных), дерево- или целлюлозо-продуцирующие деревья, овощные растения, плодовые растения и декоративные растения. Примеры растений, представляющих интерес, включают растения зерновых злаков (таких как пшеница, овес, ячмень, кукуруза, рожь, тритикале, рис, просо, сорго, квиноа, амарант и гречку); растения кормовых культур (например, кормовые травы и кормовые двудольные включая люцерну, вику, клевер и т.п.); растения масличных культур (таких как хлопок, сафлор, подсолнечник, соя, канолу, рапс, лен, арахис и масличную пальму); древесные орехи (такие как грецкий орех, кешью, фундук, пекан, миндаль, и т.п.); сахарный тростник, кокос, финиковую пальму, оливу, сахарную свеклу, чай, кофе; дерево- или целлюлозно-продуцирующие деревья; растения овощных культур, таких как бобовые (например, фасоли, горохи, чечевицы, люцерна, арахис), салат-латук, спаржа, артишоки, сельдерей, морковь, редис, крестоцветные (например, капусты, кормовые капусты, горчицы и другие листовые крестоцветные, брокколи, цветная капусту, брюссельскую капусту, репу, кольраби), пищевые тыквенные (например, огурцы, дыни, летние тыквы, зимние тыквы), пищевые луковые (например, луки, чеснок, луки-порей, луки-шалот, лук-резанец), съедобные представители Solanaceae (например, помидоры, баклажаны, картофель, перец, физалис), и съедобные представители Chenopodiaceae (например, свекла, мангольд, шпинат, квиноа, амарант); растения плодовых культур, таких как яблоки, груши, цитрусовые (например, апельсин, лайм, лимон, грейпфрут и другие), косточковые плоды (например, абрикос, персик, слива, нектарин), банан, ананас, виноград, киви, папайя, авокадо, и ягоды; растения, выращенные для биомассы или биотоплива (например, травы Miscanthus, просо, ятрофа, масличная пальма, эукариотические микроводоросли, такие как Botryococcus braunii, Chlorella spp. и Dunaliella spp., и эукариотические макроводоросли, такие как Gracilaria spp. и Sargassum spp.); и декоративных растений, включая декоративные цветущие растения, декоративные деревья и кустарники, декоративные почвопокровные растения и декоративные травы. Особые виды растений, представляющие интерес, в которых рекомбинантный ДНК конструкт транскрибируется для обеспечения устойчивости к земляным блошкам, являются растениями семейства Brassicaceae, в том числе виды Brassica включают B. napus, B. juncea, B. carinata, B. rapa, B. oleracea, B. rupestris, B. septiceps, B. nigra, B. narinosa, B. perviridus, B. tournefortii, и B. fructiculosa. Дополнительные виды растений, представляющие интерес, в которых рекомбинантный ДНК конструкт транскрибируется для обеспечения устойчивости к земляным блошкам, представляют собой Glycine max, Linum usitatissimum, Zea mays, Carthamus tinctorius, Helianthus annuus, Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana, Betholettia excelsa, Ricinus communis, Cocus nucifera, Coriandrum sativum, Gossypium spp., Arachis hypogaea, Simmondsia chinensis, Solanum tuberosum, Elaeis guineensis, Olea europaea, Oryza sativa, Cucurbita maxim, Hordeum vulgare и Triticum aestivum.

[0090] Кроме того, в данном документе описаны товарные продукты, полученные из трансгенной растительной клетки, растения или семян, экспрессирующих рекомбинантный ДНК конструкт, придающий повышенную устойчивость к блошкам, описанным в данном документе, включающие, но без ограничения, собранные листья, корни, побеги, клубни, стебли, плоды, семена или другие части растения, муку, масла, экстракты, продукты ферментации или расщепления, дробленые или цельные зерна или семена растения, или любой пищевой или непищевой продукт, включая такие товарные продукты полученные из трансгенной растительной клетки, растения или семян как описано в данном документе. Обнаружение одной или более последовательностей нуклеиновой кислоты конструктов рекомбинантной ДНК для борьбы с блошками, как описано в данном документе, в одном или более товаров или товарных продуктах, рассмотренных в данном документе, является de facto доказательством того, что товар или товарный продукт содержит или получено из трансгенной клетки растения, растения или семян, экспрессирующих такой рекомбинантный ДНК конструкт.

[0091] Обычно трансгенное растение, имеющее в своем геноме рекомбинантный ДНК, как описано в данном документе, проявляет повышенную стойкость к заражению насекомым, в частности, повышенную устойчивость к заражению блошкой. В различных вариантах осуществления изобретения, например, где трансгенное растение экспрессирует рекомбинантный ДНК конструкт для борьбы с блошкой, который уложен с другой рекомбинантной ДНК для придания дополнительных особенностей, трансгенное растение имеет по меньшей мере один дополнительный измененный признак по отношению к растению с отсутствующим рекомбинантным ДНК конструктом, выбранный из группы признаков, состоящей из:

(a) повышенной толерантности к абиотическому стрессу;

(b) повышенной толерантности к биотическому стрессу;

(c) модифицированного состава первичных метаболитов;

(d) модифицированного состава вторичных метаболитов;

(e) модифицированного состава микроэлементов, каротиноидов или витаминов;

(f) повышенного урожая;

(g) повышенной способности усваивать азот, фосфат или другие питательные вещества;

(h) модифицированных агротехнических характеристик;

(i) модифицированных характеристик роста и репродукции; и

(j) улучшенных качества сбора урожая, хранения и обработки.

[0092] В некоторых вариантах осуществления изобретения, трансгенное растение характеризуется: повышенной толерантностью к абиотическому стрессу (например, толерантность к дефициту воды или засухе, теплу, холоду, неоптимальным уровням питательных веществ или соли, неоптимальные уровни освещенности) или биотическому стрессу (например, скученность, аллелопатия или ранение); модифицированным основным метаболитным составом (например, жирной кислотой, маслом, аминокислотой, белком, сахаром или углеводом); модифицированным вторичным метаболитным составом (например, алкалоиды, терпеноиды, поликетиды, не рибосомальные пептиды и вторичные метаболиты смешанного биосинтетического происхождения); модифицированным составом микроэлементов (например, железо, цинк), каротиноидов (например, бета-каротин, ликопен, лютеин, зеаксантин или другие каротиноиды и ксантофилы) или витаминов (например, токоферолов); улучшенным урожаем (например, улучшенный урожай в условиях отсутствия стресса или улучшенный урожай при биотическом или абиотическом стрессе); улучшенной способностью использовать азот, фосфат или другие питательные вещества; модифицированными агрономическими характеристиками (например, замедленное созревание, замедленное старение, ранняя или поздняя зрелость, повышенная толерантность к тени, улучшенная устойчивость к полеганию корней или стеблей, улучшенная устойчивость к «зеленой привязке» стеблей, модифицированная реакция на фотопериода); модифицированным ростом или репродуктивными характеристиками (например, преднамеренная карликовость, преднамеренная мужская стерильность, полезная, например, в улучшенных процедурах гибридизации, улучшенная вегетативная скорость роста, улучшенное прорастание, улучшенная мужская или женская фертильность); улучшение качества урожая, хранения или обработки (например, повышенная устойчивость к вредителям при хранении, повышенная устойчивость к поломке, улучшение доставки к потребителям); или любой комбинаций этих признаков.

[0093] В другом варианте осуществления изобретения, трансгенные семена или семена, образуемые трансгенным растением, имеют модифицированный состав первичных метаболитов (например, жирной кислоты, масла, аминокислоты, белка, сахара или углевода), модифицированный состав вторичных метаболитов, модифицированный состав микроэлементов, каротиноидов или витаминов, улучшенные свойства для сбора урожая, хранения и качества обработки или их комбинацию. В другом варианте осуществления изобретения, может быть желательно изменить уровни нативных компонентов трансгенного растения или семян трансгенного растения, например, уменьшить уровни аллергенного белка или гликопротеина или токсичного метаболита.

Примеры

Пример 1:

[0094] Этот пример иллюстрирует неограничивающие варианты реализации кодирующих ДНК последовательностей, полезных в качестве генов-мишеней для борьбы с видами насекомых и для изготовления композиций для борьбы с насекомыми и устойчивых к насекомым трансгенных растений, и определяет последовательности инсектицидного полинуклеотида, полезного для борьбы с видами насекомых. Более конкретно, варианты реализации генов-мишеней, идентифицированных по имени (аннотации) и идентификатору последовательности (SEQ ID NO.), для борьбы с блошками представлены в SEQ ID NOs: 1-859, и варианты осуществления последовательностей дцРНК, расположенные по размеру от 135 дo 352 пар оснований и сконструированные для подавления этих генов-мишеней, представлены в SEQ ID NOs: 860-1718.

Таблица 1

Ген-мишень SEQ ID NO. дцРНК SEQ ID NO.* Ген-мишень SEQ ID NO. дцРНК SEQ ID NO.* Ген-мишень SEQ ID NO. дцРНК SEQ ID NO.* Ген-мишень SEQ ID NO. дцРНК SEQ ID NO.*
1 860 216 1075 431 1290 646 1505
2 861 217 1076 432 1291 647 1506
3 862 218 1077 433 1292 648 1507
4 863 219 1078 434 1293 649 1508
5 864 220 1079 435 1294 650 1509
6 865 221 1080 436 1295 651 1510
7 866 222 1081 437 1296 652 1511
8 867 223 1082 438 1297 653 1512
9 868 224 1083 439 1298 654 1513
10 869 225 1084 440 1299 655 1514
11 870 226 1085 441 1300. 656 1515
12 871 227 1086 442 1301. 657 1516
13 872 228 1087 443 1302. 658 1517
14 873 229 1088 444 1303. 659 1518
15 874 230 1089 445 1304. 660 1519
16 875 231 1090 446 1305. 661 1520
17 876 232 1091 447 1306. 662 1521
18 877 233 1092 448 1307. 663 1522
19 878 234 1093 449 1308. 664 1523
20 879 235 1094 450 1309. 665 1524
21 880 236 1095 451 1310. 666 1525
22 881 237 1096 452 1311. 667 1526
23 882 238 1097 453 1312. 668 1527
24 883 239 1098 454 1313. 669 1528
25 884 240 1099 455 1314. 670 1529
26 885 241 1100 456 1315. 671 1530.
27 886 242 1101 457 1316. 672 1531.
28 887 243 1102 458 1317. 673 1532.
29 888 244 1103 459 1318. 674 1533.
30 889 245 1104 460 1319. 675 1534.
31 890 246 1105 461 1320. 676 1535.
32 891 247 1106 462 1321. 677 1536.
33 892 248 1107 463 1322. 678 1537.
34 893 249 1108 464 1323. 679 1538.
35 894 250 1109 465 1324. 680 1539.
36 895 251 1110 466 1325. 681 1540
37 896 252 1111 467 1326. 682 1541
38. 897 253 1112 468 1327. 683 1542
39 898 254 1113 469 1328. 684 1543
40 899 255 1114 470 1329. 685 1544
41 900 256 1115 471 1330. 686 1545
42 901 257 1116 472 1331. 687 1546
43 902 258 1117 473 1332. 688 1547
44 903 259 1118 474 1333. 689 1548
45 904 260 1119 475 1334. 690 1549
46 905 261 1120 476 1335. 691 1550
47 906 262 1121 477 1336. 692 1551
48 907 263 1122 478 1337. 693 1552
49 908 264 1123 479 1338. 694 1553
50 909 265 1124 480 1339. 695 1554
51 910 266 1125 481 1340. 696 1555
52 911 267 1126 482 1341. 697 1556
53 912 268 1127 483 1342. 698 1557
54 913 269 1128 484 1343. 699 1558
55 914 270 1129 485 1344. 700 1559
56 915 271 1130. 486 1345. 701 1560
57 916 272 1131. 487 1346. 702 1561
58 917 273 1132. 488 1347. 703 1562
59 918 274 1133. 489 1348. 704 1563
60 919 275 1134. 490 1349. 705 1564
61 920 276 1135. 491 1350. 706 1565
62 921 277 1136. 492 1351. 707 1566
63 922 278 1137. 493 1352. 708 1567
64 923 279 1138. 494 1353. 709 1568
65 924 280 1139. 495 1354. 710 1569
66 925 281 1140 496 1355. 711 1570
67 926 282 1141 497 1356. 712 1571
68 927 283 1142 498 1357. 713 1572
69 928 284 1143 499 1358. 714 1573
70 929 285 1144 500 1359. 715 1574
71 930 286 1145 501 1360. 716 1575
72 931 287 1146 502 1361. 717 1576
73 932 288 1147 503 1362. 718 1577
74 933 289 1148 504 1363. 719 1578
75 934 290 1149 505 1364. 720 1579
76 935 291 1150 506 1365. 721 1580
77 936 292 1151 507 1366. 722 1581
78 937 293 1152 508 1367. 723 1582
79 938 294 1153 509 1368. 724 1583
80 939 295 1154 510 1369. 725 1584
81 940 296 1155 511 1370. 726 1585
82 941 297 1156 512 1371. 727 1586
83 942 298 1157 513 1372. 728 1587
84 943 299 1158 514 1373. 729 1588
85 944 300 1159 515 1374. 730 1589
86 945 301 1160 516 1375. 731 1590
87 946 302 1161 517 1376. 732 1591
88 947 303 1162 518 1377. 733 1592
89 948 304 1163 519 1378. 734 1593
90 949 305 1164 520 1379. 735 1594
91 950 306 1165 521 1380. 736 1595
92 951 307 1166 522 1381. 737 1596
93 952 308 1167 523 1382. 738 1597
94 953 309 1168 524 1383. 739 1598
95 954 310 1169 525 1384. 740 1599
96 955 311 1170 526 1385. 741 1600
97 956 312 1171 527 1386. 742 1601
98 957 313 1172 528 1387. 743 1602
99 958 314 1173 529 1388. 744 1603
100 959 315 1174 530 1389. 745 1604
101 960 316 1175 531 1390. 746 1605
102 961 317 1176 532 1391. 747 1606
103 962 318 1177 533 1392. 748 1607
104 963 319 1178 534 1393. 749 1608
105 964 320 1179 535 1394. 750 1609
106 965 321 1180 536 1395. 751 1610
107 966 322 1181 537 1396. 752 1611
108 967 323 1182 538 1397. 753 1612
109 968 324 1183 539 1398. 754 1613
110 969 325 1184 540 1399. 755 1614
111 970 326 1185 541 1400 756 1615
112 971 327 1186 542 1401 757 1616
113 972 328 1187 543 1402 758 1617
114 973 329 1188 544 1403 759 1618
115 974 330 1189 545 1404 760 1619
116 975 331 1190 546 1405 761 1620
117 976 332 1191 547 1406 762 1621
118 977 333 1192 548 1407 763 1622
119 978 334 1193 549 1408 764 1623
120 979 335 1194 550 1409 765 1624
121 980 336 1195 551 1410 766 1625
122 981 337 1196 552 1411 767 1626
123 982 338 1197 553 1412 768 1627
124 983 339 1198 554 1413 769 1628
125 984 340 1199 555 1414 770 1629
126 985 341 1200 556 1415 771 1630.
127 986 342 1201 557 1416 772 1631.
128 987 343 1202 558 1417 773 1632.
129 988 344 1203 559 1418 774 1633.
130 989 345 1204 560 1419 775 1634.
131 990 346 1205 561 1420 776 1635.
132 991 347 1206 562 1421 777 1636.
133 992 348 1207 563 1422 778 1637.
134 993 349 1208 564 1423 779 1638.
135 994 350 1209 565 1424 780 1639.
136 995 351 1210 566 1425 781 1640
137 996 352 1211 567 1426 782 1641
138 997 353 1212 568 1427 783 1642
139 998 354 1213 569 1428 784 1643
140 999 355 1214 570 1429 785 1644
141 1000 356 1215 571 1430. 786 1645
142 1001 357 1216 572 1431. 787 1646
143 1002 358 1217 573 1432. 788 1647
144 1003 359 1218 574 1433. 789 1648
145 1004 360 1219 575 1434. 790 1649
146 1005 361 1220 576 1435. 791 1650
147 1006 362 1221 577 1436. 792 1651
148 1007 363 1222 578 1437. 793 1652
149 1008 364 1223 579 1438. 794 1653
150 1009 365 1224 580 1439. 795 1654
151 1010 366 1225 581 1440 796 1655
152 1011 367 1226 582 1441 797 1656
153 1012 368 1227 583 1442 798 1657
154 1013 369 1228 584 1443 799 1658
155 1014 370 1229 585 1444 800 1659
156 1015 371 1230. 586 1445 801 1660
157 1016 372 1231. 587 1446 802 1661
158 1017 373 1232. 588 1447 803 1662
159 1018 374 1233. 589 1448 804 1663
160 1019 375 1234. 590 1449 805 1664
161 1020 376 1235. 591 1450 806 1665
162 1021 377 1236. 592 1451 807 1666
163 1022 378 1237. 593 1452 808 1667
164 1023 379 1238. 594 1453 809 1668
165 1024 380 1239. 595 1454 810 1669
166 1025 381 1240 596 1455 811 1670
167 1026 382 1241 597 1456 812 1671
168 1027 383 1242 598 1457 813 1672
169 1028 384 1243 599 1458 814 1673
170 1029 385 1244 600 1459 815 1674
171 1030. 386 1245 601 1460 816 1675
172 1031. 387 1246 602 1461 817 1676
173 1032. 388 1247 603 1462 818 1677
174 1033. 389 1248 604 1463 819 1678
175 1034. 390 1249 605 1464 820 1679
176 1035. 391 1250 606 1465 821 1680
177 1036. 392 1251 607 1466 822 1681
178 1037. 393 1252 608 1467 823 1682
179 1038. 394 1253 609 1468 824 1683
180 1039. 395 1254 610 1469 825 1684
181 1040 396 1255 611 1470 826 1685
182 1041 397 1256 612 1471 827 1686
183 1042 398 1257 613 1472 828 1687
184 1043 399 1258 614 1473 829 1688
185 1044 400 1259 615 1474 830 1689
186 1045 401 1260 616 1475 831 1690
187 1046 402 1261 617 1476 832 1691
188 1047 403 1262 618 1477 833 1692
189 1048 404 1263 619 1478 834 1693
190 1049 405 1264 620 1479 835 1694
191 1050 406 1265 621 1480 836 1695
192 1051 407 1266 622 1481 837 1696
193 1052 408 1267 623 1482 838 1697
194 1053 409 1268 624 1483 839 1698
195 1054 410 1269 625 1484 840 1699
196 1055 411 1270 626 1485 841 1700
197 1056 412 1271 627 1486 842 1701
198 1057 413 1272 628 1487 843 1702
199 1058 414 1273 629 1488 844 1703
200 1059 415 1274 630 1489 845 1704
201 1060 416 1275 631 1490 846 1705
202 1061 417 1276 632 1491 847 1706
203 1062 418 1277 633 1492 848 1707
204 1063 419 1278 634 1493 849 1708
205 1064 420 1279 635 1494 850 1709
206 1065 421 1280 636 1495 851 1710
207 1066 422 1281 637 1496 852 1711
208 1067 423 1282 638 1497 853 1712
209 1068 424 1283 639 1498 854 1713
210 1069 425 1284 640 1499 855 1714
211 1070 426 1285 641 1500 856 1715
212 1071 427 1286 642 1501 857 1716
213 1072 428 1287 643 1502 858 1717
214 1073 429 1288 644 1503 859 1718
215 1074 430 1289 645 1504

*Последовательности РНК предоставлены для анти-смысловой цепи дцРНК в 5' дo 3' направлении.

** T44966 и T44967 являются положительным контролем, основанным на мРНК аргинин киназы Phyllotreta striolata, описанной в Zhao и др. (2008), Eur. J. Entomol., 5:815.

[0095] Варианты осуществления последовательностей дцРНК, предоставленные в Таблице 1, как правило, полезны для РНК-опосредованного подавления соответствующего гена-мишени указанного в Таблице 1. Эти дцРНК полезны для борьбы с насекомыми, особенно с блошками, включая вид-источник, у которого гены-мишени из Таблицы 1 были идентифицированы. РНК-опосредованное подавление одного или более генов-мишеней, представленных в Таблице 1, или использование одной или более дцРНК, представленных в Таблице 1, полезно для того, чтобы вызвать смертность или задержку роста или иным образом контролировать целевые виды насекомых в следующих родах: Altica, Anthobiodes, Aphthona, Aphthonaltica, Aphthonoides, Apteopeda, Argopistes, Argopus, Arrhenocoela, Batophila, Blepharida, Chaetocnema, Clitea, Crepidodera, Derocrepis, Dibolia, Disonycha, Epitrix, Hermipyxis, Hermaeophaga, Hespera, Hippuriphila, Horaia, Hyphasis, Lipromima, Liprus, Longitarsus, Luperomorpha, Lythraria, Manobia, Mantura, Meishania, Minota, Mniophila, Neicrepidodera, Nonarthra, Novofoudrasia, Ochrosis, Oedionychis, Oglobinia, Omeisphaera, Ophrida, Orestia, Paragopus, Pentamesa, Philopona, Phygasia, Phyllotreta, Podagrica, Podagricomela, Podontia, Pseudodera, Psylliodes, Sangariola, Sinaltica, Sphaeroderma, Systena, Trachyaphthona, Xuthea и Zipangia. В вариантах осуществления изобретения, композиции, содержащие дцРНК для подавления одного или более генов-мишеней, представленных в Таблице 1 (например, композиция, содержащая эффективное количество одной или более дцРНК, представленных в Таблице 1), полезны для контроля по меньшей мере одного из Altica ambiens (блошки ольхи), Altica canadensis (блошки земляной), Altica chalybaea (блошки виноградной), Altica prasina (блошки тополя), Altica rosae (блошки розы), Altica sylvia (блошки голубики), Altica ulmi (блошки вяза), Chaetocnema pulicaria (блошки кукурузной), Chaetocnema conofinis (блошки сладкого картофеля), Epitrix cucumeris (блошки картофельной), Systena blanda (бледнополосатой блошки), и Systena frontalis (рыжей блошки), что предотвращает или вылечивает заражение растений этими видами. Например, композиция, содержащая эффективное количество одной или более из дцРНК, представленных в Таблице 1, полезна для предотвращения или лечения заражения растений картофеля Epitrix cucumeris (картофельная блошка).

[0096] В вариантах осуществления изобретения, РНК-опосредованное подавление одного или более генов-мишеней, представленных в Таблице 1, или использование одной или более дцРНК, представленных в Таблице 1, полезно для вызывания смертности или задержки роста у видов блошек в родах Phyllotreta и Psylliodes, таким образом предотвращая или вылечивая заражение растений этими видами. В конкретных вариантах осуществления изобретения, РНК-опосредуемое подавление одного или более генов-мишеней, представленных в Таблице 1, или использование одной или более из дцРНК, представленных в Таблице 1, полезно для того, чтобы вызвать смертность или задержку роста по меньшей мере у одного вида блошек из группы, состоящей из Phyllotreta armoraciae (блошки хреновой), Phyllotreta cruciferae (блошки канолы), Phyllotreta pusilla (западной черной блошки), Phyllotreta nemorum (блошки земляной светлоногой), Phyllotreta atra (блошки репы), Phyllotreta robusta (садовой блошки), Phyllotreta striolata (блошки полосатой), Phyllotreta undulata, Psylliodes chrysocephala, и Psylliodes punctulata (блошки конопляной). В вариантах реализации изобретения, РНК-опосредованное подавление одного или более генов-мишеней, имеющих последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1-296, используется для вызывания гибели или задержки роста у взрослой или личинок Phyllotreta atra (блошки репы), например, с помощью контактирования взрослых, личинок или яиц Phyllotreta atra с эффективным количеством дцРНК, содержащей последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 860-1155. В вариантах реализации изобретения, РНК-опосредованное подавление одного или более генов-мишеней, имеющих последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 297-532, используется для вызывания гибели или задержки роста у взрослой или личинок Phyllotreta cruciferae (блошка канолы), например, с помощью контактирования взрослых, личинок или яиц Phyllotreta cruciferae с эффективным количеством дцРНК, содержащей последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1156-1391, 1731-1972 и 1974. В вариантах реализации изобретения, РНК-опосредованное подавление одного или более генов-мишеней, имеющих последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 533-551, используется для вызывания гибели или задержки роста у взрослой или личинок Phyllotreta striolata (полосатая блошка), например, с помощью контактирования взрослых, личинок или яиц Phyllotreta striolata с эффективным количеством дцРНК, содержащей последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1392-1410, 1973 и 1975. В вариантах реализации изобретения, РНК-опосредованное подавление одного или более генов-мишеней, имеющих последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 552-859, используется для вызывания гибели или задержки роста у взрослой или личинок Phyllotreta chrysocephala, например, с помощью контактирования взрослых, личинок или яиц Phyllotreta chrysocephala с эффективным количеством дцРНК, содержащей последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1411-1718.

[0097] Растения, которые могут быть защищены от такого заражения с помощью трансгенной экспрессии или местного применения одной или более дцРНК, представленных в Таблице 1, включают любой вид растения или сорт, который подвержен заражению блошками, особенно растений, имеющих важное экономическое значение, включая декоративные растения и сельскохозяйственных растения. Варианты реализации таких растений включают растения из семейства Brassicaceae (семейство крестоцветных), такие как растение из рода Brassica включающие, например, один из следующих вариантов: B. napus (рапс, включая сорта, такие как канола и рутабага), B. juncea (индийская горчица), B. carinata (абиссинская горчица), B. rapa (репа), B. oleracea (дикая капуста, включая одомашненные сорта, такие как, кормовая капуста, капуста, брокколи, цветная капуста, брюссельская капуста и т. д.), B. rupestris (коричневая горчица), B. septiceps (семилетняя горчица), B. nigra (черная горчица), B. narinosa (капуста ноздреватая), B. perviridus (горчица шпинатная), B. turstfortii (азиатская горчица) и B. fructiculosa (средиземноморская капуста). В дополнительных вариантах осуществления изобретения, растения-мишени могут включать, но без ограничения, один из следующих вариантов: Glycine max (соя), Linum usitatissimum (льняное семя/лен), Zea mays (кукуруза), Carthamus tinctorius (сафлор), Helianthus annuus (подсолнечник), Nicotiana tabacum (табак), Arabidopsis thaliana, Betholettia excelsa (бразильский орех), Ricinus communis (клещевина), Cocos nucifera (кокосовый орех), Coriandrum sativum (кориандр), Gossypium spp. (хлопок), Arachis hypogaea (земляной орех или арахис), Simmondsia chinensis (жожоба), Solanum tuberosum (картофель), Elaeis guineensis (масляная пальма), Olea europaea (олива), Oryza sativa (рис), Cucurbita maxima (тыква), Hordeum vulgare (ячмень) и Triticum aestivum (пшеница).

[0098] Аспект включает композиции, содержащие эффективное количество одной или более дцРНК, представленных в Таблице 1, для местного лечения растения которое нужно обработать для, или защищать от заражения блошкой. Другой аспект включает рекомбинантный ДНК конструкт, кодирующий по меньшей мере одну цепь по меньшей мере одной дцРНК, представленных в Таблице 1, для трансгенной экспрессии в растении, которое имеет повышенную устойчивость к заражению блошкой по сравнению с растением не экспрессирующим такой конструкт.

Пример 2:

[0099] Этот пример иллюстрирует неограничивающие варианты осуществления тестирования эффективности последовательностей дцРНК и проверки полезности дцРНК для подавления экспрессии генов-мишеней для борьбы с видами насекомых. Более конкретно, этот пример иллюстрирует способ, включающий контактирование насекомого, такого как взрослая земляная блошка или личинка, с одной или более дцРНК, предназначенными для вызывания задержки роста или смертности у насекомого. Другие варианты осуществления изобретения включают способы, в которых дцРНК доставляется насекомому перорально (например, на или в пищевом материале, попадающем в организм насекомого), или посредством не-пероральной доставки (например, доставка через кутикулу насекомого или доставки с помощью контактирования с яйцом насекомого).

[00100] В одном варианте осуществления изобретения, анализ питания используется для определения эффективности дцРНК, вызывающей задержку роста или смертность у насекомых, таких как блошки. Для того, чтобы проверить эффективность дцРНК для уничтожения или задержки роста блошек, одна дискриминирующая доза (например, 100 нанограмм/миллилитр) используется для идентификации дцРНК с измеряемой способностью уничтожать или задерживать рост блошек в этой дозе. Отрицательный контроль дцРНК, такой как нацеливающийся зеленый флуоресцентный белок дцРНК (GFP), также включены в анализ. Каждую дцРНК наносят равномерно на диски листьев рапса диаметром 1,0 сантиметр и помещают в многолуночные планшеты с 2 самцами и 2 самками взрослых блошек или 4 личинками блошки на лунку. Каждые 24 часа в течение заданного периода (например, 2 недели) предоставляются новые листья с новым покрытием. Отставание в росте и смертности периодически оцениваются (например, ежедневно или каждые 2 или 3 дня).

[00101] ДцРНК, которые демонстрируют эффективность в этом одно дозовом анализе, тестируются дополнительно. Используя подобный протокол, тестируются различные дозы дцРНК, как описано выше, для определения LC50 дозы для каждой из активных дцРНК. Биоанализы включают 12-24 насекомых на дозу, выполненных в трех повторностях. Отставание в росте и смертность, оценивающиеся в течение 2-недельного периода, оценивают каждый третий день.

[00102] Последовательности дцРНК, которые подтвердили свою эффективность в подавлении гена-мишени последовательность-специфичным образом, полезны для идентификации эффективных агентов доставки РНК и составов. Инсектицидная активность составов, содержащих дцРНК, может быть оптимизирована с помощью различных методов, таких как модифицирование химических объектов в составе или модифицирование соотношения химических компонентов в составе. Не ограничивающие примеры агентов доставки и составов представлены в Примере 5.

Пример 3:

[00103] Этот пример иллюстрирует неограничивающие варианты реализации способов для проверки эффективности дцРНК для подавления или сайленсинга гена-мишени в клетке насекомого или вызывания отставания в росте или смертности у насекомого. Более конкретно, этот пример иллюстрирует методы тестирования дцРНК на эффективность в предотвращении или лечении заражений блошкой у целых растений.

[00104] Полинуклеотиды (такие как последовательности дцРНК, описанные в Примерах 1 и 2), у которых была подтверждена эффективность в подавлении гена-мишени последовательность-специфичным образом, дополнительно оценивали в анализах целого растения. В одном способе полинуклеотиды (например, антисмысловая РНК, дцРНК) наносят непосредственно на поверхность насекомых (например, путем распыления или пыления). В другом способе полинуклеотиды предоставляются насекомому в рационе насекомых (например, в бактериальной или растительной клетке, экспрессирующей полинуклеотид, такой как дцРНК формы шпилька, или искусственная приманка, содержащая полинуклеотид). Отставание в росте и смертности периодически оцениваются, как описано в Примере 2.

[00105] В различных способах, которые также подходят для крупномасштабного применения (например, на полях сельскохозяйственных культур), полинуклеотиды наносятся внекорневой подкормкой через воздушное или наземное распыление или опудривание, или внесение ядохимикатов с поливной водой на листовую поверхность, чтобы контролировать ранние сезонные повреждения от взрослой стадии жизненного цикла, или наносятся как обработка семян, чтобы контролировать личиночную или взрослую стадию жизненного цикла насекомого, или наносятся в грунт внутрирядно или нанесением смачиванием, чтобы контролировать личиночную или взрослую стадию жизненного цикла насекомого. Пример режима лиственного тестирования включает обработку растения сразу же после появления из земли и оценки лиственного повреждения, причиненного взрослыми блошками через 1-2 недели после появления всходов. Для внутрирядной или обработки семян следует аналогичный временной паттерн для оценки ущерба.

Пример 4:

[00106] Полинуклеотиды, как правило, сконструированы для модулирования экспрессии путем индукции регулирования или подавления гена-мишени насекомого и сконструированы, чтобы иметь нуклеотидную последовательность, по существу, одинаковую или по существу, комплементарную нуклеотидной последовательности гена-мишени насекомого или кДНК (например, SEQ ID NO: 1-859) или к последовательности РНК, транскрибируемой из гена-мишени насекомого, которая может быть кодирующей последовательностью или некодирующей последовательностью. Этот пример описывает неограничивающие методики полезные в конструировании и выборе полинуклеотидов для модулирования экспрессии гена-мишени насекомого.

Выбор эффективных полинуклеотидов методом «Перекрывания"

[00107] Полинуклеотиды, используемые в композициях и способах, описанных в данном документе, не обязательно должны быть полной длины гена-мишени и во многих вариантах реализации изобретения имеют гораздо меньшую длину по сравнению с геном-мишенью. Примером методики, которая будет полезна для выбора эффективных полинуклеотидов для борьбы с насекомыми, является ʺперекрываниеʺ, или оценка полинуклеотидов, соответствующих смежным или частично перекрывающим друг друга сегментам гена-мишени.

[00108] Эффективные полинуклеотиды можно идентифицировать с помощью «перекрывающихся» генов-мишеней в фрагментах выбранной длины, например, фрагменты длиной 200-300 нуклеотидов с частично перекрывающимися участками, например, около 25 нуклеотидов по длине гена-мишени. Для подавления одного гена, полинуклеотиды, сконструированные для соответствия (имеют нуклеотидную идентичность или комплементарность с) участками, которые являются уникальными для гена-мишени; выбранный участок гена-мишени может содержать кодирующую последовательность или некодирующую последовательность (например, участки промотора, 3' нетранслируемые участки, интроны и тому подобное) или их комбинацию.

[00109] Там, где это представляет интерес для конструирования полинуклеотида, эффективного в подавлении множественных генов-мишеней, множественные последовательности гена-мишени выравниваются и полинуклеотиды, сконструированные для соответствия участкам с высокой гомологией последовательности общей среди множественных мишеней. И наоборот, там, где это представляет интерес для разработки полинуклеотида, эффективного в селективном подавлении одной среди нескольких последовательностей-мишеней, последовательности множественных генов-мишеней были выровнены и полинуклеотиды сконструированы для соответствия участкам с отсутствующей или низкой гомологией последовательности общей среди множественных мишеней.

[00110] В неограничивающем примере полинуклеотиды (например, антисмысловые одноцепочечные РНК, дцРНК, антисмысловые одноцепочечные ДНК, дцДНК), способные индуцировать подавление, предназначены для каждого из генов-мишеней, перечисленных в Таблице 1 следующим образом. Несколько полинуклеотидов, каждый из 200-300 нуклеотидов в длину и содержащих последовательность, комплементарную фрагменту гена-мишени, имеющего последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-859, сконструированы так, что каждая последовательность полинуклеотида перекрывает около 25 нуклеотидов следующего смежного полинуклеотида, таким образом, что множественные полинуклеотиды в комбинации охватывают всю длину гена-мишени. (Аналогично, двухцепочечные полинуклеотиды могут быть сконструированы путем обеспечения пар смысловых и антисмысловых полинуклеотидов, причем каждая пара полинуклеотидов перекрывает следующую соседнюю пару полинуклеотидов.)

[00111] Полинуклеотиды тестируются любым удобным способом на эффективность в подавление экспрессии гена-мишени насекомого. Примеры подходящего теста включают биоанализы, описанные в данном документе в рабочих примерах. Другой тест включает местное применение полинуклеотидов либо напрямую к отдельным насекомых, или на поверхности растения, которое должно быть защищено от заражения насекомым. Одним из желаемых результатов лечения полинуклеотидом, описанным в данном документе, является предотвращение или контроль заражения насекомыми, например, с помощью индуцирования у насекомого физиологических или поведенческих изменений таких как, но без ограничения, отставание в росте, повышенная смертность, снижение репродуктивного потенциала, уменьшение или прекращение пищевого поведения или движения, или уменьшение или прекращение стадии развития метаморфоза. Другим желаемым результатом обработки полинуклеотидом, как описано в данном документе, является обеспечение растения, которое демонстрирует повышенную устойчивость к заражению насекомыми.

[00112] Процедуру перекрывания при желании можно повторить. Полинуклеотид, обеспечивающий требуемую активность, может быть сам подвергнут процедуре перекрывания. Например, сконструированы множественные перекрывающиеся полинуклеотиды, каждый из которых имеет длину 50-60 нуклеотидов и содержит последовательность, комплементарную фрагменту гена-мишени, имеющую последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-859, для которой была установлена эффективность одного полинуклеотида из 300 нуклеотидов. Дополнительные циклы анализа перекрывания могут быть проведены, где тестируются полинуклеотиды короче, чем 18, 19, 20 или 21 нуклеотидов.

[00113] Эффективные полинуклеотиды любого размера могут использоваться по отдельности или в комбинации, в различных способах, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения, один полинуклеотид используют для получения композиции (например, композиции для местного применения, или рекомбинантный ДНК-конструкт, пригодный для получения трансгенного растения). В других вариантах осуществления изобретения, используется смесь или пул различных полинуклеотидов; в таких случаях полинуклеотиды могут быть для одного гена-мишени или для нескольких генов-мишеней. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид предназначен для нацеливания на различные участки гена-мишени, например, инсектицидный полинуклеотид может содержать несколько сегментов, которые соответствуют различным экзонным участкам гена-мишени, и «спейсерные» нуклеотиды, которые не соответствуют гену-мишени могут быть необязательно использованы между сегментами или рядом с ними.

Термодинамические соображения при выборе инсектицидных полинуклеотидов

[00114] Полинуклеотиды могут быть сконструированы или их последовательность оптимизирована с использованием термодинамических соображений. Например, инсектицидные полинуклеотиды могут быть выбраны на основе термодинамики, контролирующей гибридизацию между одной цепью нуклеиновой кислоты (например, полинуклеотидом или индивидуальной миРНК) и другой (например, транскриптом гена-мишени)

[00115] Способы и алгоритмы для прогнозирования нуклеотидных последовательностей, которые, вероятно, будут эффективными при РНКи-опосредованном подавлении гена-мишени, известны в данной области техники. Не ограничивающие примеры таких способов и алгоритмов включают ʺi-scoreʺ, описанную Ichihara и др. (2007) Nucleic Acids Res., 35 (18): 123e; «Oligowalk», общедоступный в rna.urmc.rochester.edu/servers/oligowalk и описанный в Lu et al. (2008) Nucleic Acids Res., 36: W104-108; и «оценка Рейнольдса», описанная Khovorova и др. (2004) Nature Biotechnol., 22:326-330.

Допустимые несовпадения

[00116] "По существу идентичный" или "по существу комплементарный" означает, что полинуклеотид (или по меньшей мере одна цепь двухцепочечного полинуклеотида) обладает достаточной идентичностью и комплементарностью к гену-мишени или РНК, транскрибированной из гена-мишени (например, транскрипт) для подавления экспрессии гена-мишени (например, для снижения уровня или активности транскрипта гена-мишени и/или кодируемого белка). Полинуклеотидам не нужно иметь 100-процентную идентичность или комплементарности к гену-мишени или РНК, транскрибированной из гена-мишени, для подавления экспрессии гена-мишени (например, для снижения уровня или активности транскрипта гена-мишени или закодированного белка или для обеспечения контроля над видами насекомых). В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид или его часть сконструированы, чтобы быть по существу идентичными или по существу комплементарными последовательности по меньшей мере 18 или 19 смежных нуклеотидов в любом гене-мишени или РНК, транскрибированной из гена-мишени. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид или его часть сконструированы, чтобы быть точно идентичными или точно комплементарными последовательности из 21 смежного нуклеотида в любом гене-мишени или РНК, транскрибированной из гена-мишени. В определенных вариантах реализации изобретения, ʺпо существу идентичныйʺ полинуклеотид имеет 100-процентную идентичность или по меньшей мере около 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99-процентную идентичность последовательности при сравнении с последовательностью из 18 или более смежных нуклеотидов гена-мишени или РНК, транскрибируемой из гена-мишени. В определенных вариантах реализации изобретения, ʺпо существу комплементарныйʺ полинуклеотид имеет 100-процентную комплементарность последовательности или по меньшей мере около 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99-процентную комплементарность последовательности к 18 или более смежным нуклеотидам гена-мишени или РНК, транскрибируемой из гена-мишени.

[00117] Полинуклеотиды, содержащие несовпадения гена-мишени или транскрипта, могут быть использованы в определенных вариантах реализации композиций и способов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид содержит по меньшей мере 18 или по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов, которые по существу идентичны или по существу комплементарны сегменту эквивалентной длины в гене-мишени или транскрипте гена-мишени. В определенных вариантах реализации изобретения, полинуклеотид из 19 смежных нуклеотидов, которые являются по существу идентичными или по существу комплементарными сегменту эквивалентной длины в гене-мишени или транскрипте гена-мишени, может иметь 1 или 2 несовпадения с геном-мишенью или транскриптом. В определенных вариантах реализации изобретения, полинуклеотид из 20 или более нуклеотидов, который содержит смежный 19 нуклеотидный промежуток идентичности или комплементарности к сегменту эквивалентной длины в гене-мишени или транскрипте гена-мишени, может иметь 1 или 2 несовпадения с геном-мишенью или транскриптом. В определенных вариантах реализации изобретения, полинуклеотид из 21 непрерывных нуклеотидов, которые являются по существу идентичными или по существу комплементарными сегменту эквивалентной длины в гене-мишени или транскрипте гена-мишени, может иметь 1, 2 или 3 несовпадения с геном-мишенью или транскриптом. В определенных вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид из 22 или более нуклеотидов, который содержит смежный 21 нуклеотидный промежуток идентичности или комплементарности к сегменту эквивалентной длины в гене-мишени или транскрипте гена-мишени, может иметь 1, 2 или 3 несовпадения с геном-мишенью или транскриптом.

[00118] При конструировании полинуклеотидов с несовпадениями с геном-мишенью или РНК, транскрибированной из гена-мишени, могут быть использованы несовпадения определенных типов и в определенных позициях, которые, скорее всего, будут допускаться. В определенных иллюстративных вариантах реализации изобретения, используются несовпадения образованные между остатками аденина и цитозина или гуанозина и урацила, как описано Du и др. (2005) Nucleic Acids Res., 33:1671-1677. В некоторых вариантах осуществления изобретения, несовпадения в 19 паре оснований участков перекрытия расположены при низкой толерантности к позициям 5, 7, 8 или 11 (от 5' конца 19-нуклеотидной мишени), при средней толерантности к позициям 3, 4 и 12-17 (от 5' конца 19-нуклеотидной мишени), и/или при высокой толерантности к позициям на любом конце участка комплементарности, например, положения 1, 2, 18 и 19 (от 5'-конца 19-нуклеотидной мишени), как описано Du et al. (2005) Nucleic Acids Res., 33:1671-1677. Допускаемые несовпадения могут быть эмпирически определены в рутинных анализах, такие как те, что описаны в данном документе в рабочих примерах.

[00119] В некоторых вариантах реализации изобретения, полинуклеотиды содержат дополнительные нуклеотиды (например, для обеспечения стабильности или для удобства клонирования и синтеза). В одном вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид представляет собой одноцепочечную РНК, содержащую РНК цепь с сегментом из по меньшей мере 21 смежных нуклеотидов последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 860-1718 и 1722-1975, и дополнительно содержащую дополнительный 5' G или дополнительный 3' C или оба, смежные с сегментом. В одном вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид представляет собой дцРНК, содержащую РНК цепь с сегментом из по меньшей мере 21 смежных нуклеотидов последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 860-1718 и 1722-1975, и дополнительно содержащую дополнительный 5' G или дополнительный 3' C или оба, смежные с сегментом. В другом варианте осуществления изобретения, полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК, содержащую дополнительные нуклеотиды для формирования "липкого" конца, например, дцРНК, содержащая 2 дезоксирибонуклеотида для формирования 3' "липкого" конца.

Встраивание активных инсектицидных полинуклеотидов в нейтральную последовательность

[00120] В одном варианте осуществления изобретения, полинуклеотид с последовательностью, комплементарной гену-мишени и которая ответственна за наблюдаемое подавление гена-мишени, встраивается в «нейтральную» последовательность, например, вставлена в дополнительные нуклеотиды, которые не имеют идентичности или комплементарности последовательности к гену-мишени. Нейтральная последовательность может быть желательной, например, для увеличения общей длины полинуклеотида. Например, может быть желательно, чтобы полинуклеотид был определенного размера для обеспечения стабильности, эффективности в производстве или биологической активности.

[00121] Сообщалось, что в другого вида жесткокрылых, Diabrotica virgifera, дцРНК, большие чем или равные приблизительно 60 парам оснований (п.о.), необходимы для биологической активности в биоанализе искусственного корма; см. Bolognesi и др. (2012) PLoS ONE 7(10): e47534. doi:10.1371/journal.pone.0047534. Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения, дцРНК из 21-пары оснований, соответствующий гену-мишени из Таблицы 1 и обеспечивающий контроль за заражением насекомым, вставлен в нейтральную последовательность из дополнительных 39 пар оснований, формируя таким образом полинуклеотид из около 60 пар оснований. В другом варианте осуществления изобретения, один полинуклеотид из 21-пары оснований оказывается эффективным, когда он встроен в большие участки нейтральной последовательности, например, когда общая длина полинуклеотида составляет от около 60 до около 300 пар оснований. В другом варианте реализации изобретения, по меньшей мере один сегмент из по меньшей мере 21 смежных нуклеотидов последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 860-1718 и 1722-1975, вставлен в большие участки нейтральной последовательности для обеспечения эффективного инсектицидного полинуклеотида. В другом варианте осуществления изобретения, сегменты из нескольких последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 860-1718 и 1722-1975, вставлены в большие участки нейтральной последовательности для обеспечения эффективного инсектицидного полинуклеотида.

[00122] Предполагается, что комбинация определенных рекомбинантных полинуклеотидов, описанных в данном документе (например, одноцепочечная РНК, дцРНК, одноцепочечная ДНК или дцДНК, состоящая из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 860-1718 и 1722-1975 или ее активных фрагментов), с одним или более не полинуклеотидными пестицидными агентами приведет к улучшению профилактики или борьбы с заражениями насекомыми, по сравнению с эффектом, полученным только с одним полинуклеотидом или не полинуклеотидным пестицидным агентом. Рутинные биоанализы насекомого, такие как биоанализы, описанные в данном документе в рабочих примерах, могут быть использованы для определения дозы-ответов для гибели личинок или ингибирования роста, используя комбинации из полинуклеотидов, описанных в данном документе, и один или более не-полинуклеотдиных пестицидных агентов (например, пататин, растительный лектин, фитоэкдистероид, инсектицидный белок Bacillus thuringiensis, инсектицидный белок Xenorhabdus, инсектицидный белок Photorhabdus, инсектицидный белок Bacillus laterosporous, и инсектицидный белок Bacillus sphaericus). Специалист в данной области может тестировать комбинации полинуклеотидов и пептидных агентов, отличных от полинуклеотидов, в обычных биоанализах для определения комбинаций биоактивных веществ, которые эффективны для использования в защите растений от заражения насекомыми.

Пример 5:

[00123] Этот пример иллюстрирует неограничивающие варианты реализации способов тестирования эффективности инсектицидных полинуклеотидов у блошек. Более конкретно этот пример иллюстрирует способ, включающий пероральное введение полинуклеотидов блошкам, в результате чего задерживается рост или наступает гибель блошек.

[00124] P. cruciferae были собраны с поля канолы, где никакие пестициды не применялась в предыдущие 3-х месяца. Три группы дцРНК (SEQ ID NO: 1169, 1193 и 1392), нацеленные на гены Phyllotreta, и одну дцРНК отрицательного контроля, нацеленную на GFP, тестировали в группах по 30 P. cruciferae. ДцРНК были ресуспендированы в воде и нанесены на 6 миллиметровые диски листа (55 ± 6 миллиграмм каждый) в дискриминирующей дозе 50 нанограмм дцРНК/миллиграмм ткани листа, которые были даны с кормом группам из 5 блошек. Листовые диски с свеженанесенной дцРНК заменяли каждый день, и количество выживших особей был зарегистрировано за 2-недельный период. Низкий показатель коэффициента неспецифической смертности наблюдался в группе отрицательного контроля насекомых (3 из 30 насекомых, умирающих за 2 недели, или 10% от неспецифической смертности). Смертности наблюдается в начале 4-й дня и продолжается в течение 2 недельного периода. Специфическая смертность наблюдалось для всех дцРНК обработок (Таблица 2). Исправление для неспецифической смертности (вычитая коэффициент неспецифической смертности для 3 насекомых на группу для исправления N=27), процент смертности, наблюдаемый в конце 2-недельного периода, составил 85% (SEQ ID NO: 1169), 0,70% (SEQ ID NO: 1193) и 0,63% (SEQ ID NO: 1392). Эти результаты показали эффективность дцРНК для вызывания гибели блошек при предоставлении в рационе блошек.

Таблица 2 Совокупное количество мертвых P. cruciferae (N=30)

День Отрицательный контроль SEQ ID NO:1169 SEQ ID NO:1193 SEQ ID NO:1392
0 0 0 0 0
2 1 2 1 1
4 2 6 2 2
6 2 9 3 3
8 2 13 8 9
10 3 18 16 15
12 3 23 19 18
14 3 26 22 20

[00125] Во второй серии экспериментов, проведенных аналогичным образом, несколько дцРНК испытывали при различной дозе 50 нанограмм дцРНК/миллиграмм ткани листа на P. cruciferae; также были испытаны две более низкие дозы (15 нанограмм дцРНК/миллиграмм ткани листа и 2 нанограмма дцРНК/миллиграмм ткани листа). Десять блошек были протестированы в каждой дозе. Используемый отрицательный контроль (пять повторов) представлял собой дцРНК, нацеленную на бактериальный ген uidA, кодирующий бета-глюкуронидазу (номер доступа NCBI NC_000913.3). Листовые диски с свеженанесенной дцРНК заменяли каждый день, и смертность была зафиксирована в течение 12-дневного периода. Общий коэффициент смертности для отрицательного контроля составил ~4% вероятно из-за манипуляционных повреждений) в течение 12-дневного периода наблюдения. Наблюдаемая кумулятивная смертность (N=10) после 12 дней воздействия дцРНК представлена в Таблице 3; значения отрицательного контроля смертности приведены как среднее (N=5). Восемь дцРНК (показаны с помощью рейтинга смертности +++) вызывали 90-100% смертность при самой высокой дозе и были все еще эффективны (80% смертность или выше) при самой низкой протестированной дозе. Некоторые дцРНК (показаны с помощью рейтинга смертности ++) вызывали смертность у части насекомых при самой высокой дозе, но были менее эффективны при более низких дозах (<20% смертности).

Таблица 3

совокупная смертность (N=10) Оценка смертности*
дцРНК SEQ ID NO **: 50 нг/мг 15 нг/мг 2 нг/мг
870 3 1 0 -
876 3 1 0 -
1156 2 0 0 -
1157 10 3 0 -
1158 2 0 0 -
1159 5 2 0 -
1160 2 0 0 -
1161 10 3 1 -
1163 4 4 2 -
1164 10 8 4 ++
1165 8 7 5 ++
1166 5 2 2 -
1167 6 2 0 -
1168 8 5 0 -
1169 10 10 8 +++
1170 9 5 3 -
1171 10 10 6 ++
1392 3 2 0 -
1393 6 1 0 -
1186 9 7 5 -
1394 9 9 5 -
1187 9 9 8 +++
1193 10 10 9 +++
1210 6 3 1 -
1219 8 3 2 -
1224 10 9 8 +++
1234 10 7 6 ++
1243 5 2 0 -
1258 9 4 2 -
1396 9 6 5 ++
1397 6 3 0 -
1398 8 7 7 ++
1399 10 10 8 +++
1400 2 1 1 -
1403 9 6 6 -
1404 10 7 4 -
1405 6 6 2 -
1406 9 9 7 +++
1407 10 9 8 +++
1408 9 9 9 +++
отрицательный контроль (GFP) 0,6 0,6 0,4 -
отрицательный контроль (бета-глюкуронидаза) 0,4 0,6 0,2 -
отрицательный контроль (только вода) 0,2 0,4 0,6 -

*+++ оценка указывает на высокую (>80%) смертность для всех трех доз; ++ оценка указывает на высокую смертность для самой высокой дозы, и в пределах 40 дo 70% смертности с двумя низкими дозами.

**последовательности предоставлены для анти-смысловой цепи дцРНК в 5' дo 3' направлении.

[00126] Рассматриваются другие способы доставки этих или подобных инсектицидных полинуклеотидов и включают нанесение полинуклеотидов непосредственно на поверхность насекомых (например, путем распыления или опудривания) или предоставление полинуклеотида для насекомых в рационе или приманке (например, в бактериальной или растительной клетке, экспрессирующей дцРНК или в искусственной приманке, содержащей дцРНК). В одном варианте осуществления изобретения, сконструирован вариант «шпилька» инсектицидного полинуклеотида Phyllotreta с последовательностью SEQ ID NO: 1169; эта версия «шпильки» кодируется последовательностью ДНК SEQ ID NO: 1722, которая содержит в последовательности от 5 'до 3' антисмысловую последовательность (положения нуклеотидов 1-267), последовательность «петли» (положения нуклеотидов 268-373), которая не содержат совпадения с последовательностями Phyllotreta, и последовательность восприятия (положения нуклеотидов 374-640). Эта последовательность ДНК экспрессируется как одноцепочечный РНК транскрипт, в котором анти-смысловые и смысловые участки отжигаются для формирования двухцепочечного участка ʺстебляʺ шпильки. Конструкт экспрессируется в бактерии, такой как E. coli; полученная дцРНК «шпилька», произведенная в бактерии, предоставляется блошкам в виде неочищенного или очищенного продукта ферментации, или в форме бактериальных клеток. Подобные конструкты сконструированы кодирующими дцРНК, имеющими модифицированные шпильки, такие как ʺстабилизированные анти-смысловыеʺ и ʺстабилизированные смысловыеʺ версии, которые содержат стабилизированные петли, образованные с помощью расширенной анти-смысловой или смысловой последовательности, соответственно, последовательности, соответствующей предполагаемому гену-мишени.

Пример 6:

[00127] Этот пример описывает варианты осуществления изобретения, относящиеся к полинуклеотидным молекулам, имеющим нуклеотидную последовательность, содержащую определенные модификации, такие как нуклеотидные замены. Варианты реализации таких модификаций содержат модифицированные полинуклеотиды, которые обеспечивают улучшенную дискриминацию последовательности между предполагаемым геном-мишенью интересующего насекомого-вредителя и генетическими последовательностями других, не целевых видов.

[00128] Выбранные дцРНК, идентифицированные в таблице 1, были подвергнуты скринингу на незапланированные совпадения последовательности с последовательностью по меньшей мере из 19 смежных нуклеотидов, идентифицированных в нецелевом гене или нецелевом организме (NTO, например Apis mellifera, Bombus impatiens и B. terrestris; Coleomegilla sрp., Danaus plexippus, Homo sapiens, Megachile rotundata, Mus musculus и Brassica rapa). Изменения нуклеотидов производятся в оригинальной полинуклеотидной последовательности, чтобы исключить смежные последовательности, совпадающие с нецелевым геном или нецелевым организмом. Примеры таких модифицированных полинуклеотидных последовательностей приведены в SEQ ID NO: 1723, что соответствует SEQ ID NO: 1393 (которая нацелена на один и тот же ген земляной блошки, как и инсектицидный полинуклеотид SEQ ID NO: 1392) и SEQ ID NO: 1724, что соответствует SEQ ID NO: 1169.

Пример 7:

[00129] Этот пример описывает варианты осуществления изобретения, относящиеся к полинуклеотидным молекулам, имеющим нуклеотидную последовательность для подавления гена-мишени у более чем одного вида. Варианты осуществления изобретения включают последовательности дцРНК из по меньшей мере 21 смежных нуклеотидов, определенных как имеющие 100% комплементарность или идентичность с более чем одному ортологу гена-мишени.

[00130] Таблица 4 содержит перечень последовательностей, каждая из по меньшей мере 21 смежных нуклеотидов в длину и идентифицированных по координатам последовательности в дцРНК для одного вида блошки, причем идентичная последовательность также находится в дцРНК для разных видов блошек. Эти последовательности полезны для разработки инсектицидных полинуклеотидов против множества видов, у которых последовательности встречаются совместно. Например, SEQ ID NO: 1186 (нацеливающаяся на COPI альфа ген-мишень Phyllotreta cruciferae, SEQ ID NO: 327) содержит пять последовательностей по меньшей мере из 21 смежных нуклеотидов в положениях 1-71, 88-116, 136-209, 238-266, и 274-296, все из которых совпадают с последовательностью в SEQ ID NO: 882 и 888 (нацеливающаяся на COPI альфа ген-мишень Phyllotreta atra, SEQ ID NO: 23 и 29, соответственно); эти пять последовательностей поэтому полезны для нацеливания на ген в двух видах Phyllotreta.

Таблица 4

Полинуклеотид ЗАПРОСА Полинуклеотид
СУБЪЕКТА
Полинуклеотид ЗАПРОСА Полинуклеотид СУБЪЕКТА
SEQ ID NO: старт конец SEQ ID NO: SEQ ID NO: старт конец SEQ ID NO:
1186 1 71 882, 888 1333 329 351 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1186 88 116 882, 888 1334 42 98 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1186 136 209 882, 888 1334 109 185 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1186 238 266 882, 888 1334 187 254 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1186 274 296 882, 888 1334 271 302 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191 51 96 900-908, 910 1335 2 47 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191 137 177 900-908, 910 1335 49 116 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191 179 216 900-908, 910 1335 133 164 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191 218 255 900-908, 910 1335 229 251 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191 257 342 900-908, 910 1336 34 90 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192 2 25 900-908, 910 1336 101 177 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192 66 106 900-908, 910 1336 179 246 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192 108 145 900-908, 910 1336 263 294 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192 147 184 900-908, 910 1338 40 96 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192 186 271 900-908, 910 1338 107 183 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192 273 298 900-908, 910 1338 185 252 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192 300 330 900-908, 910 1338 269 300 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191 58 96 900-908, 910 1328 35 59 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192 300 336 900-908, 910 1331 60 84 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191 44 96 900-908, 910 1332 1 26 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191 179 200 900-908, 910 1333 36 60 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192 108 129 900-908, 910 1334 74 98 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191 218 242 900-908, 910 1336 66 90 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192 147 171 900-908, 910 1338 72 96 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191 257 277 900-908, 910 1331 1 26 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192 186 206 900-908, 910 1334 2 40 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191 257 334 900-908, 910 1336 2 32 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192 186 263 900-908, 910 1338 2 38 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1191 257 320 900-908, 910 1328 36 59 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1192 186 249 900-908, 910 1331 61 84 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1193 15 101 911, 915, 916, 919 1332 3 26 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1194 6 92 911, 915, 916, 919 1333 37 60 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1195 2 107 911, 915, 916, 919 1334 75 98 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1195 121 207 911, 915, 916, 919 1336 67 90 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1196 2 122 911, 915, 916, 919 1338 73 96 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1196 136 222 911, 915, 916, 919 1329 172 191 1039-1043 1045
1197 2 20 911, 915, 916, 919 1329 265 296 1039-1043 1045
1197 22 42 911, 915, 916, 919 1329 298 317 1039-1043 1045
1197 44 180 911, 915, 916, 919 1329 319 343 1039-1043 1045
1197 194 280 911, 915, 916, 919 1330 181 200 1039-1043 1045
1198 18 38 911, 915, 916, 919 1330 274 305 1039-1043 1045
1198 40 176 911, 915, 916, 919 1330 307 326 1039-1043 1045
1198 190 276 911, 915, 916, 919 1330 328 352 1039-1043 1045
1199 5 25 911, 915, 916, 919 1335 283 302 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1199 27 163 911, 915, 916, 919 1337 1 19 1043, 1045
1199 177 263 911, 915, 916, 919 1337 93 124 1043, 1045
1200 16 152 911, 915, 916, 919 1337 126 145 1043, 1045
1200 166 252 911, 915, 916, 919 1337 147 171 1043, 1045
1201 19 105 911, 915, 916, 919 1329 319 352 1039-1043 1045
1202 2 119 911, 915, 916, 919 1337 147 180 1043, 1045
1202 133 219 911, 915, 916, 919 1386 2 38 1054-1057, 1060, 1496, 1498
1203 14 100 911, 915, 916, 919 1386 40 59 1054-1057, 1060, 1496, 1498
1193 123 189 911, 915, 916, 919 1386 70 95 1054-1057, 1060, 1496, 1498
1194 114 180 911, 915, 916, 919 1386 103 161 1054-1057, 1060, 1496, 1498
1195 229 295 911, 915, 916, 919 1386 196 262 1054-1057, 1060, 1496, 1498
1196 244 310 911, 915, 916, 919 1388 2 51 1054-1057, 1060, 1496, 1498
1197 302 350 911, 915, 916, 919 1388 53 72 1054-1057, 1060, 1496, 1498
1198 298 350 911, 915, 916, 919 1388 83 108 1054-1057, 1060, 1496, 1498
1199 285 352 911, 915, 916, 919 1388 116 174 1054-1057, 1060, 1496, 1498
1200 274 340 911, 915, 916, 919 1388 209 275 1054-1057, 1060, 1496, 1498
1201 127 193 911, 915, 916, 919 1390 88 119 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1202 241 307 911, 915, 916, 919 1390 145 194 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1203 122 188 911, 915, 916, 919 1390 196 215 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1193 123 196 911, 915, 916, 919 1390 226 251 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1193 198 230 911, 915, 916, 919 1390 259 317 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1194 114 187 911, 915, 916, 919 1391 19 50 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1194 189 221 911, 915, 916, 919 1391 76 125 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1195 229 302 911, 915, 916, 919 1391 127 146 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1195 304 336 911, 915, 916, 919 1391 157 182 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1196 1 122 911, 915, 916, 919 1391 190 248 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1196 244 317 911, 915, 916, 919 1391 283 349 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1196 319 351 911, 915, 916, 919 1384 20 39 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1197 60 180 911, 915, 916, 919 1384 62 84 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1198 56 176 911, 915, 916, 919 1384 134 204 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1199 43 163 911, 915, 916, 919 1384 206 249 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1199 285 351 911, 915, 916, 919 1384 251 270 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1200 32 152 911, 915, 916, 919 1384 284 305 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1200 274 347 911, 915, 916, 919 1385 21 40 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1201 127 200 911, 915, 916, 919 1385 63 85 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1201 202 234 911, 915, 916, 919 1385 135 205 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1202 241 314 911, 915, 916, 919 1385 207 250 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1202 316 348 911, 915, 916, 919 1385 252 271 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1203 122 195 911, 915, 916, 919 1385 285 306 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1203 197 229 911, 915, 916, 919 1387 2 21 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1204 6 25 920, 921, 922, 923, 924 1387 23 42 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1204 27 49 920, 921, 922, 923, 924 1387 56 77 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1204 51 118 920, 921, 922, 923, 924 1389 1 55 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1204 186 214 920, 921, 922, 923, 924 1389 57 100 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1204 219 268 920, 921, 922, 923, 924 1389 102 121 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1204 270 295 920, 921, 922, 923, 924 1389 135 156 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1204 306 351 920, 921, 922, 923, 924 1386 196 255 1054-1057, 1060, 1496, 1498
1205 180 199 920, 921, 922, 923, 924 1388 209 268 1054-1057, 1060, 1496, 1498
1205 201 223 920, 921, 922, 923, 924 1391 283 342 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1205 225 292 920, 921, 922, 923, 924 1387 257 321 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1206 10 29 920, 921, 922, 923, 924 1387 332 351 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1206 31 53 920, 921, 922, 923, 924 1390 25 56 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1206 55 122 920, 921, 922, 923, 924 1384 284 321 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1206 190 218 920, 921, 922, 923, 924 1385 285 322 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1206 223 272 920, 921, 922, 923, 924 1387 56 93 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1206 274 299 920, 921, 922, 923, 924 1389 135 172 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1206 310 351 920, 921, 922, 923, 924 1386 196 332 1054-1057, 1060, 1496, 1498
1207 11 33 920, 921, 922, 923, 924 1388 209 345 1054-1057, 1060, 1496, 1498
1207 35 102 920, 921, 922, 923, 924 1391 283 352 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1207 170 198 920, 921, 922, 923, 924 1384 323 348 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1207 203 252 920, 921, 922, 923, 924 1385 324 349 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1207 254 279 920, 921, 922, 923, 924 1387 95 120 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1207 290 335 920, 921, 922, 923, 924 1387 128 153 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1208 18 40 920, 921, 922, 923, 924 1387 161 186 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1208 42 109 920, 921, 922, 923, 924 1387 191 210 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1208 177 205 920, 921, 922, 923, 924 1389 174 199 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1208 210 259 920, 921, 922, 923, 924 1389 207 232 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1208 261 286 920, 921, 922, 923, 924 1389 240 265 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1208 297 342 920, 921, 922, 923, 924 1389 270 289 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1209 101 120 920, 921, 922, 923, 924 1283 177 208 1064-1070
1209 122 144 920, 921, 922, 923, 924 1284 130 161 1064-1070
1209 146 213 920, 921, 922, 923, 924 1284 301 351 1064-1070
1209 281 309 920, 921, 922, 923, 924 1286 210 241 1064-1070
1209 314 351 920, 921, 922, 923, 924 1287 126 157 1064-1070
1205 2 91 920, 921, 922, 923, 924 1287 297 351 1064-1070
1205 114 142 920, 921, 922, 923, 924 1288 326 351 1064-1070, 1071
1205 144 178 920, 921, 922, 923, 924 1289 41 72 1064-1070
1209 35 63 920, 921, 922, 923, 924 1289 212 288 1064-1070
1209 65 99 920, 921, 922, 923, 924 1289 320 351 1064-1070
1204 306 347 920, 921, 922, 923, 924 1290 178 209 1064-1070
1207 290 331 920, 921, 922, 923, 924 1291 228 259 1064-1070, 1071
1208 297 338 920, 921, 922, 923, 924 1292 43 74 1064-1070
1207 290 352 920, 921, 922, 923, 924 1292 214 290 1064-1070
1208 297 351 920, 921, 922, 923, 924 1292 322 351 1064-1070
1205 18 91 920, 921, 922, 923, 924 1293 330 351 1064-1070, 1071
1224 1 43 947-949, 951-956 1377 37 68 1064-1070
1224 57 95 947-949, 951-956 1377 208 284 1064-1070
1224 97 145 947-949, 951-956 1377 316 348 1064-1070
1224 147 175 947-949, 951-956 1289 212 274 1064-1070
1224 177 208 947-949, 951-956 1292 214 276 1064-1070
1224 210 262 947-949, 951-956 1377 208 270 1064-1070
1224 285 350 947-949, 951-956 1285 123 148 1067-1069, 1071
1225 150 192 947, 949, 951-956 1288 107 132 1064-1070, 1071
1225 206 244 947, 949, 951-956 1291 9 34 1064-1070, 1071
1225 246 294 947, 949, 951-956 1293 111 136 1064-1070, 1071
1225 296 324 947, 949, 951-956 1287 297 347 1064-1070
1225 326 351 947, 949, 951-956 1289 212 262 1064-1070
1226 258 300 947, 949, 951-955 1292 214 264 1064-1070
1226 314 351 947, 949, 951-955 1377 208 258 1064-1070
1227 253 295 947, 949, 951-955 1287 297 352 1064-1070
1227 309 347 947, 949, 951-955 1289 212 266 1064-1070
1228 206 248 947, 949, 951-956 1292 214 268 1064-1070
1228 262 300 947, 949, 951-956 1377 208 262 1064-1070
1228 302 350 947, 949, 951-956 1285 18 61 1067-1069, 1071
1229 171 213 947, 949, 951-956 1288 2 45 1064-1070, 1071
1229 227 265 947, 949, 951-956 1293 6 49 1064-1070, 1071
1229 267 315 947, 949, 951-956 1357 1 40 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1229 317 345 947, 949, 951-956 1357 63 85 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1230 252 294 947, 949, 951-955 1357 102 157 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1230 308 346 947, 949, 951-955 1357 159 189 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1231 191 233 947, 949, 951-956 1357 191 322 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1231 247 285 947, 949, 951-956 1358 25 47 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1231 287 335 947, 949, 951-956 1358 64 119 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1232 196 238 947, 949, 951-956 1358 121 151 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1232 252 290 947, 949, 951-956 1358 153 284 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1232 292 340 947, 949, 951-956 1359 31 53 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1233 209 251 947, 949, 951-956 1359 70 125 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1233 265 303 947, 949, 951-956 1359 127 157 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1233 305 351 947, 949, 951-956 1359 159 290 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1224 177 202 947-949, 951-956 1360 38 60 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1225 1 72 947, 949, 951-956 1360 77 132 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1225 74 135 947, 949, 951-956 1360 134 164 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1225 137 192 947, 949, 951-956 1360 166 297 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1226 110 180 947, 949, 951-955 1361 1 41 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1226 182 243 947, 949, 951-955 1361 64 86 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1226 245 300 947, 949, 951-955 1361 103 158 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1227 105 175 947, 949, 951-955 1361 160 190 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1227 177 238 947, 949, 951-955 1361 192 323 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1227 240 295 947, 949, 951-955 1362 31 53 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1228 58 128 947, 949, 951-956 1362 70 125 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1228 130 191 947, 949, 951-956 1362 127 157 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1228 193 248 947, 949, 951-956 1362 159 290 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1229 23 93 947, 949, 951-956 1363 33 55 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1229 95 156 947, 949, 951-956 1363 72 127 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1229 158 213 947, 949, 951-956 1363 129 159 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1230 104 174 947, 949, 951-955 1363 161 292 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1230 176 237 947, 949, 951-955 1364 4 59 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1230 239 294 947, 949, 951-955 1364 61 91 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1231 43 113 947, 949, 951-956 1364 93 224 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1231 115 176 947, 949, 951-956 1365 35 57 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1231 178 233 947, 949, 951-956 1365 74 129 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1232 48 118 947, 949, 951-956 1365 131 161 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1232 120 181 947, 949, 951-956 1365 163 294 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1232 183 238 947, 949, 951-956 1366 2 26 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1233 61 131 947, 949, 951-956 1366 28 58 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1233 133 194 947, 949, 951-956 1366 60 191 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1233 196 251 947, 949, 951-956 1367 2 116 1079, 1080, 1081, 1082, 1152, 1153, 1154
1224 227 262 947-949, 951-956 1358 322 345 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1224 57 94 947-949, 951-956 1359 328 350 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1225 2 72 947, 949, 951-956 1362 328 351 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1225 206 243 947, 949, 951-956 1363 330 352 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1226 1 96 947, 949, 951-955 1364 262 285 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1226 98 180 947, 949, 951-955 1365 332 351 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1227 2 91 947, 949, 951-955 1366 229 252 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1227 93 175 947, 949, 951-955 1367 154 177 1079-1082, 1152-1154
1227 309 346 947, 949, 951-955 1358 322 344 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1228 2 44 947, 949, 951-956 1362 328 350 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1228 46 128 947, 949, 951-956 1364 262 284 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1228 262 299 947, 949, 951-956 1366 229 251 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1229 11 93 947, 949, 951-956 1367 154 176 1079-1082, 1152-1154
1229 227 264 947, 949, 951-956 1368 126 145 1083, 1087
1230 2 90 947, 949, 951-955 1368 153 177 1083, 1087
1230 92 174 947, 949, 951-955 1368 186 208 1083, 1087
1230 308 345 947, 949, 951-955 1368 224 253 1083, 1087
1231 2 29 947, 949, 951-956 1369 161 180 1083, 1084, 1089
1231 31 113 947, 949, 951-956 1370 124 143 1083, 1087
1231 247 284 947, 949, 951-956 1370 151 175 1083, 1087
1232 2 34 947, 949, 951-956 1370 184 206 1083, 1087
1232 36 118 947, 949, 951-956 1370 222 251 1083, 1087
1232 252 289 947, 949, 951-956 1369 278 303 1083, 1084, 1089
1233 2 47 947, 949, 951-956 1369 182 201 1083, 1084, 1089
1233 49 131 947, 949, 951-956 1371 1 71 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1233 265 302 947, 949, 951-956 1371 82 122 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1226 7 96 947, 949, 951-955 1371 124 180 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1227 1 91 947, 949, 951-955 1371 182 244 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1226 8 96 947, 949, 951-955 1372 16 56 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1227 3 91 947, 949, 951-955 1372 58 114 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1230 1 90 947, 949, 951-955 1372 116 178 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1226 54 96 947, 949, 951-955 1373 2 61 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1227 49 91 947, 949, 951-955 1373 72 112 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1228 1 44 947, 949, 951-956 1373 114 170 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1230 48 90 947, 949, 951-955 1373 172 234 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1233 5 47 947, 949, 951-956 1374 1 68 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1224 125 145 947-949, 951-956 1374 79 119 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1225 274 294 947, 949, 951-956 1374 121 177 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1228 330 350 947, 949, 951-956 1374 179 241 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1229 295 315 947, 949, 951-956 1375 2 41 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1231 315 335 947, 949, 951-956 1375 52 92 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1232 320 340 947, 949, 951-956 1375 94 150 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1233 333 351 947, 949, 951-956 1375 152 214 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1234 50 135 960, 964 1376 7 47 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1234 149 168 960, 964 1376 49 105 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1234 170 350 960, 964 1376 107 169 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1235 175 260 960, 963, 964 1371 124 148 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1235 274 293 960, 963, 964 1372 58 82 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1235 295 351 960, 963, 964 1373 114 138 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1236 190 275 960, 963, 964 1374 121 145 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1236 289 308 960, 963, 964 1375 94 118 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1236 310 351 960, 963, 964 1376 49 73 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1237 269 350 960, 963, 964 1371 182 276 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1238 51 136 960, 964 1371 278 333 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1238 150 169 960, 964 1372 116 210 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1238 171 350 960, 964 1372 212 267 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1239 50 135 960, 964 1372 269 309 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1239 149 168 960, 964 1372 311 352 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1239 170 351 960, 964 1373 172 266 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1240 103 188 960, 963, 964 1373 268 323 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1240 202 221 960, 963, 964 1373 325 351 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1240 223 351 960, 963, 964 1374 179 273 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1241 269 351 960, 963, 964 1374 275 330 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1242 87 172 960, 963, 964 1374 332 351 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1242 186 205 960, 963, 964 1375 152 246 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1242 207 351 960, 963, 964 1375 248 303 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1235 2 23 960, 963, 964 1375 305 345 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1235 25 114 960, 963, 964 1376 107 201 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1236 2 38 960, 963, 964 1376 203 258 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1236 40 129 960, 963, 964 1376 260 300 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1237 2 39 960, 963, 964 1376 302 342 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1237 41 117 960, 963, 964 1371 278 303 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1237 119 208 960, 963, 964 1372 212 237 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1240 2 42 960, 963, 964 1373 268 293 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1241 2 39 960, 963, 964 1374 275 300 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1241 41 117 960, 963, 964 1375 248 273 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1241 119 208 960, 963, 964 1376 203 228 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1242 2 26 960, 963, 964 1371 124 155 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1234 38 135 960, 964 1372 58 89 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1234 170 211 960, 964 1373 114 145 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1235 25 136 960, 963, 964 1374 121 152 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1235 163 260 960, 963, 964 1375 94 125 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1235 295 336 960, 963, 964 1376 49 80 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1236 1 38 960, 963, 964 1371 182 241 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1236 40 151 960, 963, 964 1372 116 175 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1236 178 275 960, 963, 964 1373 172 231 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1237 81 117 960, 963, 964 1374 179 238 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1237 119 230 960, 963, 964 1375 152 211 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1237 257 350 960, 963, 964 1376 107 166 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1238 39 136 960, 964 1371 278 325 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1238 171 212 960, 964 1372 212 259 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1239 38 135 960, 964 1373 268 315 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1239 170 211 960, 964 1374 275 322 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1240 2 64 960, 963, 964 1375 248 295 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1240 91 188 960, 963, 964 1376 203 250 1093-1095, 1098, 1100 -1103
1240 223 264 960, 963, 964 1309 1 69 1114, 1115
1241 81 117 960, 963, 964 1309 71 96 1114, 1115
1241 119 230 960, 963, 964 1309 98 144 1114, 1115
1241 257 351 960, 963, 964 1309 152 195 1114, 1115
1242 2 48 960, 963, 964 1309 197 237 1114, 1115
1242 75 172 960, 963, 964 1309 254 352 1114, 1115
1242 207 248 960, 963, 964 1310 25 92 1114, 1115
1243 118 158 965, 966, 968, 969 1310 94 119 1114, 1115
1243 283 304 965, 966, 968, 969 1310 121 167 1114, 1115
1243 310 348 965, 966, 968, 969 1310 175 218 1114, 1115
1244 165 205 965, 966, 968, 969 1310 220 260 1114, 1115
1244 330 351 965, 966, 968, 969 1310 277 351 1114, 1115
1246 205 245 965, 966, 967, 968, 969 1311 7 74 1114, 1115
1247 206 246 965, 966, 967, 968, 969 1311 76 101 1114, 1115
1248 163 203 965, 966, 968, 969 1311 103 149 1114, 1115
1248 328 349 965, 966, 968, 969 1311 157 200 1114, 1115
1245 1 20 967 1311 202 242 1114, 1115
1245 22 42 967 1311 259 351 1114, 1115
1245 104 135 967 1312 9 76 1114, 1115
1245 137 155 967 1312 78 103 1114, 1115
1245 187 209 967 1312 105 151 1114, 1115
1246 36 58 965, 966, 967, 968, 969 1312 159 202 1114, 1115
1247 37 59 965, 966, 967, 968, 969 1312 204 244 1114, 1115
1244 330 352 965, 966, 968, 969 1312 261 352 1114, 1115
1249 2 20 970, 973, 974, 978, 979 1309 2 69 1114, 1115
1250 5 84 969-971, 973-979 1309 254 327 1114, 1115
1250 86 270 969-971, 973-979 1310 22 92 1114, 1115
1250 278 306 969-971, 973-979 1310 277 350 1114, 1115
1250 326 351 969-971, 973-979 1311 4 74 1114, 1115
1251 2 52 969-971, 973-979 1311 259 332 1114, 1115
1251 54 238 969-971, 973-979 1312 6 76 1114, 1115
1251 246 274 969-971, 973-979 1312 261 334 1114, 1115
1251 294 322 969-971, 973-979 1315 56 87 1117, 1119-1125
1253 115 194 969-971, 973-979 1315 91 114 1117, 1119-1125
1253 196 351 969-971, 973-979 1315 116 144 1117, 1119-1125
1254 3 31 970, 971, 973, 974, 977-979 1315 146 171 1117, 1119-1125
1254 51 79 970, 971, 973, 974, 977-979 1315 185 225 1117, 1119-1125
1255 282 352 970, 971, 973-978, 1626, 1629 1315 275 294 1117, 1119-1125
1256 1 53 970, 971, 973-978 1315 317 342 1117, 1119-1125
1256 55 239 970, 971, 973-978 1316 22 45 1117, 1119-1125
1256 247 275 970, 971, 973-978 1316 47 75 1117, 1119-1125
1256 295 323 970, 971, 973-978 1316 77 102 1117, 1119-1125
1257 6 85 970, 971, 973-978 1316 116 156 1117, 1119-1125
1257 87 271 970, 971, 973-978 1316 206 225 1117, 1119-1125
1257 279 307 970, 971, 973-978 1316 248 273 1117, 1119-1125
1257 327 351 970, 971, 973-978 1316 275 317 1117, 1119-1125
1250 1 84 969-971, 973-979 1318 144 175 1117, 1119-1125
1250 326 352 969-971, 973-979 1318 179 202 1117, 1119-1125
1251 294 319 969-971, 973-979 1318 204 232 1117, 1119-1125
1253 112 194 969-971, 973-979 1318 234 259 1117, 1119-1125
1254 51 76 970, 971, 973, 974, 977-979 1318 273 313 1117, 1119-1125
1255 279 352 970, 971, 973-978, 1626, 1629 1319 2 20 1117, 1119-1125
1256 295 320 970, 971, 973-978 1319 24 47 1117, 1119-1125
1257 3 85 970, 971, 973-978 1319 49 77 1117, 1119-1125
1252 31 89 972 1319 79 104 1117, 1119-1125
1252 91 236 972 1319 118 158 1117, 1119-1125
1252 238 266 972 1319 208 227 1117, 1119-1125
1252 277 337 972 1319 250 275 1117, 1119-1125
1249 2 23 970, 973, 974, 978, 979 1319 277 319 1117, 1119-1125
1249 25 44 970, 973, 974, 978, 979 1313 17 81 1118, 1125
1250 34 84 969-971, 973-979 1313 92 117 1118, 1125
1251 1 52 969-971, 973-979 1313 137 204 1118, 1125
1251 294 325 969-971, 973-979 1313 215 240 1118, 1125
1251 327 346 969-971, 973-979 1313 242 291 1118, 1125
1253 144 194 969-971, 973-979 1313 293 329 1118, 1125
1254 51 82 970, 971, 973, 974, 977-979 1314 22 89 1118-1125
1254 84 103 970, 971, 973, 974, 977-979 1314 100 125 1118-1125
1255 311 352 970, 971, 973-978, 1626, 1629 1314 127 176 1118-1125
1256 3 53 970, 971, 973-978 1314 178 214 1118-1125
1256 295 326 970, 971, 973-978 1317 25 92 1118, 1120-1122, 1124, 1125
1256 328 347 970, 971, 973-978 1317 103 128 1118, 1120-1122, 1124, 1125
1257 35 85 970, 971, 973-978 1317 130 179 1118, 1120-1122, 1124, 1125
1250 47 84 969-971, 973-979 1317 181 217 1118, 1120-1122, 1124, 1125
1251 15 52 969-971, 973-979 1314 332 351 1118-1125
1253 157 194 969-971, 973-979 1315 27 51 1117, 1119-1125
1255 324 352 970, 971, 973-978, 1626, 1629 1316 275 306 1117, 1119-1125
1256 16 53 970, 971, 973-978 1318 115 139 1117, 1119-1125
1257 48 85 970, 971, 973-978 1319 277 308 1117, 1119-1125
1250 2 84 969-971, 973-979 1314 330 351 1118-1125
1250 86 241 969-971, 973-979 1315 25 51 1117, 1119-1125
1251 54 209 969-971, 973-979 1316 275 303 1117, 1119-1125
1253 1 68 969-971, 973-979 1317 333 351 1118, 1120-1122, 1124, 1125
1253 91 194 969-971, 973-979 1318 113 139 1117, 1119-1125
1253 196 352 969-971, 973-979 1319 277 305 1117, 1119-1125
1255 169 235 970, 971, 973-978, 1626, 1629 1314 262 293 1118-1125
1255 258 352 970, 971, 973-978, 1626, 1629 1314 295 314 1118-1125
1256 55 210 970, 971, 973-978 1314 316 351 1118-1125
1257 1 85 970, 971, 973-978 1315 11 51 1117, 1119-1125
1257 87 242 970, 971, 973-978 1317 265 296 1118, 1120-1122, 1124, 1125
1250 86 110 969-971, 973-979 1317 298 317 1118, 1120-1122, 1124, 1125
1251 54 78 969-971, 973-979 1317 319 351 1118, 1120-1122, 1124, 1125
1253 2 68 969-971, 973-979 1318 45 76 1117, 1119-1125
1253 196 220 969-971, 973-979 1318 78 97 1117, 1119-1125
1255 39 130 970, 971, 973-978, 1626, 1629 1318 99 139 1117, 1119-1125
1255 132 235 970, 971, 973-978, 1626, 1629 1316 275 324 1117, 1119-1125
1256 55 79 970, 971, 973-978 1319 277 326 1117, 1119-1125
1257 87 111 970, 971, 973-978 1299 50 96 1126-1131, 1651-1653
1250 326 350 969-971, 973-979 1300 2 43 1126-1131, 1651-1653
1251 294 318 969-971, 973-979 1300 66 112 1126-1131, 1651-1653
1253 110 194 969-971, 973-979 1300 123 154 1126-1131, 1651-1653
1254 51 75 970, 971, 973, 974, 977-979 1300 183 211 1126-1131, 1651-1653
1255 277 352 970, 971, 973-978, 1626, 1629 1300 213 232 1126-1131, 1651-1653
1256 295 319 970, 971, 973-978 1300 264 310 1126-1131, 1651-1653
1257 327 352 970, 971, 973-978 1301 1 35 1126-1131
1250 32 84 969-971, 973-979 1301 37 84 1126-1131
1253 142 194 969-971, 973-979 1301 107 153 1126-1131
1255 309 352 970, 971, 973-978, 1626, 1629 1301 164 195 1126-1131
1257 33 85 970, 971, 973-978 1301 224 252 1126-1131
1249 46 68 970, 973, 974, 978, 979 1301 254 273 1126-1131
1250 61 84 969-971, 973-979 1301 305 351 1126-1131
1251 29 52 969-971, 973-979 1302 26 54 1126-1131, 1651-1653
1253 171 194 969-971, 973-979 1302 56 75 1126-1131, 1651-1653
1254 105 127 970, 971, 973, 974, 977-979 1302 107 153 1126-1131, 1651-1653
1256 30 53 970, 971, 973-978 1303 11 39 1126-1131, 1651-1653
1257 62 85 970, 971, 973-978 1303 41 60 1126-1131, 1651-1653
1259 192 226 999-1004 1303 92 138 1126-1131, 1651-1653
1259 249 298 999-1004 1299 50 114 1126-1131, 1651-1653
1259 321 352 999-1004 1299 131 162 1126-1131, 1651-1653
1260 190 224 999-1004 1299 215 236 1126-1131, 1651-1653
1260 247 296 999-1004 1299 248 270 1126-1131, 1651-1653
1260 319 351 999-1004 1299 272 309 1126-1131, 1651-1653
1261 99 133 999-1004 1300 264 328 1126-1131, 1651-1653
1261 156 205 999-1004 1302 107 171 1126-1131, 1651-1653
1261 228 289 999-1004 1302 188 219 1126-1131, 1651-1653
1261 300 334 999-1004 1302 272 293 1126-1131, 1651-1653
1262 82 116 999-1004 1302 305 327 1126-1131, 1651-1653
1262 139 188 999-1004 1302 329 351 1126-1131, 1651-1653
1262 211 272 999-1004 1303 92 156 1126-1131, 1651-1653
1262 283 317 999-1004 1303 173 204 1126-1131, 1651-1653
1262 319 350 999-1004 1303 257 278 1126-1131, 1651-1653
1263 324 351 999-1004 1303 290 312 1126-1131, 1651-1653
1264 191 225 999-1004 1303 314 351 1126-1131, 1651-1653
1264 248 297 999-1004 1299 272 352 1126-1131, 1651-1653
1264 320 351 999-1004 1299 272 344 1126-1131, 1651-1653
1265 98 132 999-1004 1299 272 318 1126-1131, 1651-1653
1265 155 204 999-1004 1299 272 310 1126-1131, 1651-1653
1265 227 288 999-1004 1304 2 25 1132, 1134, 1135, 1136
1265 299 333 999-1004 1304 36 169 1132, 1134, 1135, 1136
1259 95 145 999-1004 1304 186 214 1132, 1134, 1135, 1136
1259 165 226 999-1004 1304 231 250 1132, 1134, 1135, 1136
1260 93 143 999-1004 1304 264 307 1132, 1134, 1135, 1136
1260 163 224 999-1004 1306 2 70 1132, 1134, 1135, 1136
1261 1 52 999-1004 1306 87 115 1132, 1134, 1135, 1136
1261 72 133 999-1004 1306 132 151 1132, 1134, 1135, 1136
1262 1 35 999-1004 1306 165 208 1132, 1134, 1135, 1136
1262 55 116 999-1004 1307 1 27 1132, 1134, 1135, 1136
1263 227 277 999-1004 1307 29 69 1132, 1134, 1135, 1136
1263 297 351 999-1004 1307 80 213 1132, 1134, 1135, 1136
1264 94 144 999-1004 1307 230 258 1132, 1134, 1135, 1136
1264 164 225 999-1004 1307 275 294 1132, 1134, 1135, 1136
1265 2 51 999-1004 1307 308 351 1132, 1134, 1135, 1136
1265 71 132 999-1004 1308 2 33 1132, 1134, 1135, 1136
1259 15 40 999-1004 1308 44 177 1132, 1134, 1135, 1136
1259 42 64 999-1004 1308 194 222 1132, 1134, 1135, 1136
1259 66 88 999-1004 1308 239 258 1132, 1134, 1135, 1136
1259 90 145 999-1004 1308 272 315 1132, 1134, 1135, 1136
1259 165 219 999-1004 1347 2 28 1132, 1134, 1135, 1136
1260 13 38 999-1004 1347 39 172 1132, 1134, 1135, 1136
1260 40 62 999-1004 1347 189 217 1132, 1134, 1135, 1136
1260 64 86 999-1004 1347 234 253 1132, 1134, 1135, 1136
1260 88 143 999-1004 1347 267 310 1132, 1134, 1135, 1136
1260 163 217 999-1004 1305 1 133 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1261 2 52 999-1004 1305 135 154 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1261 72 126 999-1004 1305 156 178 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1262 55 109 999-1004 1305 195 280 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1263 1 60 999-1004 1305 330 351 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1263 105 127 999-1004 1344 13 35 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1263 147 172 999-1004 1344 52 137 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1263 174 196 999-1004 1344 187 208 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1263 198 220 999-1004 1345 50 181 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1263 222 277 999-1004 1345 183 202 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1263 297 352 999-1004 1345 204 226 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1264 14 39 999-1004 1345 243 328 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1264 41 63 999-1004 1346 2 81 1133, 1137, 1138
1264 65 87 999-1004 1346 131 152 1133, 1137, 1138
1264 89 144 999-1004 1304 1 25 1132, 1134, 1135, 1136
1264 164 218 999-1004 1304 264 334 1132, 1134, 1135, 1136
1265 71 125 999-1004 1306 165 235 1132, 1134, 1135, 1136
1259 190 226 999-1004 1307 46 69 1132, 1134, 1135, 1136
1260 188 224 999-1004 1308 10 33 1132, 1134, 1135, 1136
1261 97 133 999-1004 1308 272 342 1132, 1134, 1135, 1136
1262 80 116 999-1004 1347 5 28 1132, 1134, 1135, 1136
1263 322 351 999-1004 1347 267 337 1132, 1134, 1135, 1136
1264 189 225 999-1004 1304 101 169 1132, 1134, 1135, 1136
1265 96 132 999-1004 1306 1 70 1132, 1134, 1135, 1136
1259 96 145 999-1004 1306 237 310 1132, 1134, 1135, 1136
1260 94 143 999-1004 1306 312 352 1132, 1134, 1135, 1136
1261 3 52 999-1004 1307 145 213 1132, 1134, 1135, 1136
1263 228 277 999-1004 1308 109 177 1132, 1134, 1135, 1136
1264 95 144 999-1004 1347 104 172 1132, 1134, 1135, 1136
1265 1 51 999-1004 1307 38 69 1132, 1134, 1135, 1136
1259 165 218 999-1004 1308 1 33 1132, 1134, 1135, 1136
1260 163 216 999-1004 1344 187 239 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1261 72 125 999-1004 1344 241 272 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1262 55 108 999-1004 1344 286 308 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1263 2 60 999-1004 1344 310 329 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1263 297 350 999-1004 1346 131 183 1133, 1137, 1138
1264 164 217 999-1004 1346 185 216 1133, 1137, 1138
1265 71 124 999-1004 1346 230 252 1133, 1137, 1138
1266 2 39 1016-1023 1346 254 273 1133, 1137, 1138
1266 41 87 1016-1023 1305 227 280 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1266 89 129 1016-1023 1344 84 137 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1267 2 74 1016-1023 1345 275 328 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1267 76 122 1016-1023 1346 28 81 1133, 1137, 1138
1267 124 164 1016-1023 1346 290 351 1133, 1137, 1138
1268 2 53 1016-1023 1348 44 66 1139, 1140, 1141, 1142
1268 55 101 1016-1023 1348 104 129 1139, 1140, 1141, 1142
1268 103 143 1016-1023 1348 131 156 1139, 1140, 1141, 1142
1269 2 72 1016-1023 1348 158 195 1139, 1140, 1141, 1142
1269 74 120 1016-1023 1348 167 189 1139, 1140, 1141, 1142
1269 122 162 1016-1023 1348 197 237 1139, 1140, 1141, 1142
1270 2 107 1016-1023 1348 215 234 1139, 1140, 1141, 1142
1270 109 155 1016-1023 1348 4 49 1139, 1140, 1141, 1142
1270 157 197 1016-1023 1348 4 74 1139, 1140, 1141, 1142
1271 2 62 1016-1023 1348 4 85 1139, 1140, 1141, 1142
1271 64 110 1016-1023 1349 19 90 1143
1271 112 152 1016-1023 1349 146 207 1143
1266 131 177 1016-1023 1349 209 256 1143
1266 179 207 1016-1023 1350 32 51 1144-1151, 1703
1266 209 243 1016-1023 1350 71 90 1144-1151, 1703
1267 166 212 1016-1023 1351 118 137 1144-1151
1267 214 242 1016-1023 1351 157 176 1144-1151
1267 244 278 1016-1023 1353 81 100 1144-1151
1268 145 191 1016-1023 1353 120 139 1144-1151
1268 193 221 1016-1023 1354 1 42 1144-1151
1268 223 257 1016-1023 1354 218 237 1144-1151
1269 164 210 1016-1023 1354 257 276 1144-1151
1269 212 240 1016-1023 1356 43 62 1144-1151
1269 242 276 1016-1023 1356 82 101 1144-1151
1270 199 245 1016-1023 1350 176 201 1144-1151, 1703
1270 247 275 1016-1023 1350 209 231 1144-1151, 1703
1270 277 311 1016-1023 1350 236 267 1144-1151, 1703
1271 154 200 1016-1023 1351 262 287 1144-1151
1271 202 230 1016-1023 1351 295 317 1144-1151
1271 232 266 1016-1023 1351 322 351 1144-1151
1266 209 294 1016-1023 1353 225 250 1144-1151
1266 296 316 1016-1023 1353 258 280 1144-1151
1267 1 74 1016-1023 1353 285 316 1144-1151
1267 244 329 1016-1023 1356 187 212 1144-1151
1267 331 351 1016-1023 1356 220 242 1144-1151
1268 223 308 1016-1023 1356 247 278 1144-1151
1268 310 330 1016-1023 1350 236 265 1144-1151, 1703
1269 242 327 1016-1023 1351 322 352 1144-1151
1269 329 349 1016-1023 1353 285 314 1144-1151
1270 35 107 1016-1023 1356 247 276 1144-1151
1270 277 351 1016-1023 1350 287 306 1144-1151, 1703
1271 232 317 1016-1023 1350 323 348 1144-1151, 1703
1271 319 339 1016-1023 1352 2 21 1147, 1150, 1151, 1703
1266 296 318 1016-1023 1352 38 63 1147, 1150, 1151, 1703
1267 4 74 1016-1023 1355 5 24 1147, 1150, 1151, 1703
1268 310 332 1016-1023 1355 41 66 1147, 1150, 1151, 1703
1269 1 72 1016-1023 1356 298 317 1144-1151
1269 329 351 1016-1023 1358 322 351 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1270 37 107 1016-1023 1364 262 291 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1271 319 341 1016-1023 1366 229 258 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1266 131 157 1016-1023 1367 154 183 1079-1082, 1152-1154
1267 166 192 1016-1023 1361 2 41 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1268 145 171 1016-1023 1210 1 35 1431
1269 164 190 1016-1023 1211 30 63 1431
1270 199 225 1016-1023 1213 15 48 1431
1271 154 180 1016-1023 1217 19 52 1431
1295 113 168 1026, 1027, 1024 1357 162 200 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1295 170 201 1026, 1027, 1024 1358 124 162 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1295 203 233 1026, 1027, 1024 1359 130 168 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1295 236 258 1026, 1027, 1024 1360 137 175 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1297 128 183 1026, 1027, 1024 1361 163 201 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1297 185 216 1026, 1027, 1024 1362 130 168 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1297 218 248 1026, 1027, 1024 1363 132 170 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1296 1 44 1025, 1028, 1029, 1515-1518, 1520 1364 64 102 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1298 7 57 1025, 1028, 1029 1365 134 172 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1298 59 96 1025, 1028, 1029 1366 31 69 1079-1082, 1152-1154, 1455, 1457, 1458
1298 110 132 1025, 1028, 1029 1054 198 244 1492, 1496, 1497, 1498
1298 143 210 1025, 1028, 1029 1054 285 319 1492, 1496, 1497, 1498
1295 17 87 1026, 1027, 1024 1056 191 237 1492, 1496, 1497, 1498
1297 32 102 1026, 1027, 1024 1056 278 312 1492, 1496, 1497, 1498
1294 127 153 1027 1057 14 60 1492, 1496, 1497, 1498
1295 17 46 1026, 1027, 1024 1057 101 135 1492, 1496, 1497, 1498
1297 32 61 1026, 1027, 1024 1057 233 264 1492, 1496, 1497, 1498
1298 5 57 1025, 1028, 1029 1060 269 315 1492, 1496, 1497, 1498
1320 249 268 1033, 1035, 1076 1390 10 50 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1324 2 23 1036, 1037, 1038 1390 142 173 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1326 14 38 1036, 1037, 1038 1391 73 104 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1326 95 117 1036, 1037, 1038 1055 85 131 1493, 1494, 1495, 1499, 1500
1326 152 174 1036, 1037, 1038 1058 117 163 1493, 1494, 1495, 1499, 1500
1326 227 248 1036, 1037, 1038 1059 118 164 1493, 1494, 1495, 1499, 1500
1327 44 65 1036, 1037, 1038 1061 109 155 1493, 1494, 1495, 1499, 1500
1321 65 86 1037 1062 222 268 1493, 1494, 1495, 1499, 1500
1321 88 132 1037 1063 262 308 1493, 1494, 1495, 1499, 1500
1322 2 34 1037 1054 15 64 1492, 1496, 1497, 1498
1322 36 67 1037 1054 165 196 1492, 1496, 1497, 1498
1322 135 156 1037 1056 8 57 1492, 1496, 1497, 1498
1322 158 202 1037 1056 158 189 1492, 1496, 1497, 1498
1323 1 35 1037 1060 86 135 1492, 1496, 1497, 1498
1323 37 68 1037 1060 236 267 1492, 1496, 1497, 1498
1323 136 157 1037 1386 199 248 1054-1057, 1060, 1496, 1498
1323 159 203 1037 1388 212 261 1054-1057, 1060, 1496, 1498
1324 2 51 1036, 1037, 1038 1391 286 335 1054-1057, 1060, 1492, 1496-1498
1324 56 93 1036, 1037, 1038 1384 311 351 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1324 95 126 1036, 1037, 1038 1385 312 351 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1324 194 215 1036, 1037, 1038 1387 83 123 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500, 1057
1324 217 261 1036, 1037, 1038 1389 162 202 1055, 1058, 1059, 1061-1063, 1500
1325 2 31 1037 1296 69 101 1025, 1028, 1029, 1515, 1516, 1517, 1518, 1520
1325 33 64 1037 909 305 340 1531
1325 132 153 1037 960 70 101 1543, 1551
1325 155 199 1037 964 259 290 1543, 1551
1326 227 276 1036, 1037, 1038 1305 180 226 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1326 281 318 1036, 1037, 1038 1133 195 226 1580, 1581
1326 320 350 1036, 1037, 1038 1137 52 83 1580, 1581
1327 44 93 1036, 1037, 1038 1344 37 83 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1327 98 135 1036, 1037, 1038 1345 228 274 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1327 137 168 1036, 1037, 1038 1305 180 217 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1327 236 257 1036, 1037, 1038 1344 37 74 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1327 259 303 1036, 1037, 1038 1345 228 265 1133, 1137, 1138, 1580, 1581, 1583
1324 2 24 1036, 1037, 1038 1039 176 210 1590, 1594, 1597, 1598
1326 227 249 1036, 1037, 1038 1040 142 176 1590, 1594, 1597, 1598
1327 44 66 1036, 1037, 1038 1041 248 282 1590, 1594, 1597, 1598
1328 3 59 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 1042 141 175 1590, 1594, 1597, 1598
1328 70 146 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 1328 175 209 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1328 148 215 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 1331 2 54 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1328 232 263 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 1331 200 234 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1328 328 350 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 1332 142 176 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1329 22 53 1039-1043 1045 1333 176 210 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1329 118 140 1039-1043 1045 1334 16 68 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1330 31 62 1039-1043 1045 1334 214 248 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1330 127 149 1039-1043 1045 1335 76 110 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1331 28 84 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 1336 8 60 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1331 95 171 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 1336 206 240 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1331 173 240 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 1338 14 66 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1331 257 288 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 1338 212 246 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598
1332 2 26 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 1255 165 199 970, 971, 973-978, 1626, 1629
1332 37 113 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 976 129 163 1626, 1629
1332 115 182 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 1299 98 129 1126-1131, 1651-1653
1332 199 230 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 1300 312 343 1126-1131, 1651-1653
1332 295 317 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 1302 155 186 1126-1131, 1651-1653
1333 4 60 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 1303 140 171 1126-1131, 1651-1653
1333 71 147 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 1350 314 345 1144-1151, 1703
1333 149 216 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 1352 29 60 1147, 1150, 1151, 1703
1333 233 264 1039-1043, 1045, 1594, 1597, 1598 1355 32 63 1147, 1150, 1151, 1703

Пример 8:

[00131] Этот пример описывает варианты осуществления изобретения, относящиеся к полинуклеотидным молекулам, имеющим нуклеотидную последовательность, содержащую определенные модификации, такие как нуклеотидные замены. Варианты реализации таких модификаций содержат модифицированные полинуклеотиды, которые обеспечивают улучшенную дискриминацию последовательности между предполагаемым геном-мишенью интересующего насекомого-вредителя и генетическими последовательностями других, не целевых видов.

[00132] Двухцепочечные РНК, идентифицированные в таблице 1, были подвергнуты скринингу на соответствие последовательности по меньшей мере 19 смежным нуклеотидам, идентифицированным в нецелевом гене или нецелевом организме (NTO, например, Apis mellifera, Bombus impatiens и B. terrestris; Bombyx mori; Bos taurus; Canis lupus familiaris, Coleomegilla maculata, Danio rerio, Danaus plexippus, Daphnia pulex, Equus caballus, Gallus gallus, Homo sapiens, Megachile rotundata, Mus musculus, Sus scrofa, Brassica napus, Brassica oleracea, Brassica rapa, Glycine max, Gossypium raimondii, Solanum tuberosum, Solanum lycopersicum и Zea mays) Нуклеотидные изменения производятся для устранения смежных последовательностей, соответствующих более 19 нуклеотидам, к нецелевому генам или нецелевому организму. Примеры таких модифицированных полинуклеотидных последовательностей представлены в SEQ ID NO: 1725, что соответствует SEQ ID NO: 870 (которая нацелена на ген-мишень, имеющий SEQ ID NO: 11), SEQ ID NO: 1726, которая соответствует SEQ ID NO: 1224 (которая нацелена на ген-мишень, имеющий SEQ ID NO: 365), SEQ ID NO: 1727, которая соответствует SEQ ID NO: 875 (которая нацелена на ген-мишень с SEQ ID NO: 16), SEQ ID NO: 1728, которая соответствует SEQ ID NO: 1193 (которая нацелена на ген-мишень, имеющий SEQ ID NO: 334), SEQ ID NO: 1729, которая соответствует SEQ ID NO: 871 (которая нацелена на ген-мишень с SEQ ID NO: 12) и SEQ ID NO: 1730, которая соответствует SEQ ID NO: 1187 (которая нацелена на ген-мишень, имеющий SEQ ID NO: 328).

[00133] Эти модифицированные полинуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1725-1730 полезны для конструирования полинуклеотидов для обеспечения улучшенной дискриминации между предполагаемыми видами-мишенями и нецелевыми организмами. Например, варианты осуществления инсектицидных композиций, полезных для борьбы или предотвращения заражения блошками, содержат эффективное количество дцРНК, содержащее одну цепь РНК, имеющую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1725-1730 или ее фрагмента. В вариантах осуществления изобретения, инсектицидные композиции для вызывания замедления или смертности у блошек содержат эффективное количество дцРНК, содержащее одну цепь РНК, имеющую по меньшей мере один сегмент по меньшей мере из 21 смежных нуклеотидов последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1725-1730. В вариантах осуществления изобретения, инсектицидные композиции для вызывания замедления или смертности у блошек содержат эффективное количество молекулы РНК, содержащей по меньшей мере один сегмент по меньшей мере из 21 смежных нуклеотидов последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1725-1730, причем по меньшей мере один сегмент встроен в большие участки нейтральной последовательности, чтобы обеспечить эффективный инсектицидный полинуклеотид. В другом варианте осуществления изобретения, сегменты по меньшей мере из 21 смежных нуклеотидов из множества последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1725-1730, введены в большие участки нейтральной последовательности, чтобы обеспечить эффективный инсектицидный полинуклеотид для борьбы с блошками. Способы отбора эффективных инсектицидных полинуклеотидов описаны в другом месте в этой заявке, например, способ, включающий пероральную доставку инсектицидных полинуклеотидов блошкам, что приводит к задержке роста или смертности у блошек, описанных в примере 5. Эти модифицированные полинуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1725-1730 полезны в способе вызывания смерти или задержки роста у насекомого, включая обеспечение в рационе насекомого, такого как земляная блошка, по меньшей мере одного полинуклеотида, который содержит по меньшей мере один сегмент по меньшей мере из 21 смежных нуклеотидов последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1725-1730, причем прием полинуклеотида насекомым приводит к смерти или задержке роста у насекомого; в вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1725-1730. Полинуклеотиды, содержащие последовательность SEQ ID NO: 1725-1730, полезны в способе борьбы с заражением насекомыми растения, включающим контактирование с полинуклеотидом насекомого, которое заражает растение, причем полинуклеотид содержит по меньшей мере один сегмент по меньшей мере из 21 смежных нуклеотидов последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1725-1730, посредством которой контролируется заражение насекомыми; в вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1725-1730. Полинуклеотиды, как описано в данном документе, применимы в способе обеспечения растения с повышенной устойчивостью к насекомому, включающему экспрессию в растении рекомбинантного ДНК-конструкта, причем рекомбинантная ДНК кодирует полинуклеотид, который содержит по меньшей мере один сегмент по меньшей мере из 21 смежных нуклеотидов последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1725-1730, причем прием полинуклеотида насекомым приводит к смерти или задержке роста у насекомых; в некоторых вариантах осуществления изобретения, полинуклеотид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1725-1730.

Пример 9:

[00134] Этот пример описывает дополнительные молекулы инсектицидных полинуклеотидов с комплементарностью как к Phyllotreta cruciferae, так и Psylloides striolata. Были сконструированы в общей сложности двести сорок (240) полинуклеотидных последовательностей (SEQ ID NO: 1731-1971). Эти полинуклеотиды нацеливаются на транскрипты гена для кальмодулина, казеинкиназы 1а и фактора удлинения 1-альфа у обоих видов блошек. Пятьдесят один полинуклеотид являются перекрывающимися полинуклеотидами, которые покрывают длину транскрипта этих генов. В следующей таблице 5 приведены эти пятьдесят один перекрывающийся полинуклеотид и целевые транскрипты.

Таблица 5. Инсектицидные полинуклеотиды и транскрипты мишени

Инсектицидный полинуклеотид
SEQ ID NO:
Транскрипт мишень
1731 Rpn7_PHYST-05JAN16-TRPT0002041:1
1732 Rpn7_PHYST-05JAN16-TRPT0002041:3
1733 ТубулинG_PHYST-05JAN16-TRPT0002886:1
1734 ТубулинG_PHYST-05JAN16-TRPT0002886:2
1735 ТубулинG_PHYST-05JAN16-TRPT0002886:3
1736 ТубулинG_PHYST-05JAN16-TRPT0002886:4
1737 ТубулинG_PHYST-05JAN16-TRPT0002886:5