Способ определения фракций казеина молока

 

302663

О П И С А Н И Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

Зависимое от авт. свидетельства №

Заявлено 09.Ч1.1969 (№ 1336310/28-13) с присоединением заявки №вЂ”

Приоритет

Опубликовано 28.1V.1971. Бюллетень № 15

Дата опубликования описания 1Х11.1971

МПК б Oln 33/04

Комите1 по делам изобретений и открытий при Совете Министров

СССР

УДК 637.127.3(088.8) Авторы изобретения

3. Сеитов и Ж. Жумашев

Алма-Атинский зооветеринарный институт

Заявитель

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФРАКЦИЙ

КАЗЕИНА МОЛОКА

Изобретение относится к области химического анализа молока.

Известен способ определения фракций казеина молока, предусматривающий разбавление агара в буфере, содержащем мочевину, заливку полученного геля в камеру, растворение казеина в буфере, внесение раствора казеина в гель, установку камеры в кювету с буферным раствором, с последующим проведением процессов электрофореза, фиксации и сушки геля, а также окрашивания электрофореграммы, определения количества фракций путем элюирования раствором щелочи и определения оптической плотности фракций.

Цель изобретения — более полное качественное и количественное определение фракции казеина.

Это достигается тем, что разбавление агара, растворение казеина и установление кам ры ,в кювету осуществляют с .использованием ооратно-ацетатного буфера,с рН, равным 8,6—

8,9, .при этом концентрацию буфера в кюзете устанавливают в два раза меньше, чем при разбавлении агара.

Для приготовления бор атно-ацетатн ого буфера используют ацетата,натрия 47,5 г, бор,ной кислоты 52,56 г и буры 76,28 г на 10 л воды.

Перед определением фракций казеина, последний .высушивают ацетоном, а из агара перед его разбавлением удаляют термолабильные фракции.

Процесс электрофореза,проводят,при концентрации белка, равной 1,5 — 2,5о/о, темпера5 туре +2 — 8 С в течение 17 — 18 час с .использованием платиновых электродов.

Используют общий казеин коровьего молока, полученный кислотным переосаждением и высушенный холодным ацетоном.

10 Переносят 45 г Корсаковского агара в широкогорлую колбу на 2 л с меткой. Заливают водой, перемешивают,и оставляют на 3 — 4 час.

Воду сливают через марлевые фильтры, находящиеся на горлышке колбы. Через эти же

15 фильтры при помощи воронки заливают воду.

Перемешивают и оставляют на ночь. Воду сливают как можно полнее и объем суспензни агара доводят водой до метки 2 л. Гомогенный раствор агара получают нагреванием в

20 кипяченой водяной бане (преимущественно не более 2 час,путем глубокого погружения колбы в воду) .

Раствор агара фильтруют на воронке Бюхнера через ватные фильтры (фильтры предва25 рительно,промывают кипяченой водой на воронке). Фильтр собирают, нагревают до 70—

75 С и отфильтровывают снова. В раствор добавляют мертполат и хранят в холодильнике.

Затем используют электрофоретичеокую а30 меру, выполненную,из плексигласа, 302663

Предмет изобретения

Составитель Г. Субботина

Техред Л. Л. Евдонов Корректор Т. А. Абрамова

Редактор С. Ежкова

Заказ 1780, 5 Изд. № 736 Тираж 473 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4 5

Типография, пр. Сапунова, 2

В качестве основного буферного раствора используют боратно-ацетатный буфер следующего состава: ацетат,натрия — 43,55 г, борная кислота 52,56 г, бура — 76,28 г на 10 л воды. Все реактивы марки «ХЧ». рН такого раствора 8,57. Буферным раствором для геля служат отфильтрованный раствор 9 м мочевины в боратно-ацетатном буфере с рН 9,4—

9,45, 1% -ный гель агара получают, смешивая 10 равные части буфера,и 2% агара. рН полученного 1%-ного раствора arapa при 33 — 35 С составляет примерно 8,6.

Буферные растворы для электродных кювет получают из раствора 9 м мочевины в 15 боратно-ацетатном буфере разбавлением водой 1; 1. рН полученного раствора (обычно

9,1) доводят до 8,6 при помощи 1 NHCI, При 35 — 36 С из 1%-ного раствора агара выладает мелкий, желтоватый, хлопьевидный 20 осадок. Поэтому раствор arapa отфильтровывают на воронке Бюхнера через, ватные фильтры и камеру заливают агаром с температу:рой 32 — 33 С. Толщина геля 4,5 — 5 мм.

Через 20 мик устанавливают трафарет для 25 образования лунок и оставляют в холодипьнике на ночь.

На следующий день снимают трафарет и наносят растворы белков в лунки. Для этого готовится 5%-ный раствор общего казеина 30 (высушенного ацетоном) в 9 м мочевине. Велок распворяется быстро и .полностью. Перед нанесением 0,6 мл 5%-ного раствора казеина смешивают с 0,4 мл 9 я мочевины в буфере и добавляют 1 мл 2% раствора агара в воде 35 (предвар,ительно охлажденного до 40 — 42 С).

После тщательного перемешивания раствор белка наносят в лунки, заполняя их до краев.

Через 30 мик, поверхность лунок заливают

1%-,ным раствором агара,в мочевине,и остав- 40 ляют на 30 мин. В заключение лунки:вторично заплавляют 2%-ным раствором arapa,â воде.

Для проведения электрофореза в каждую кювеТу наливают по 1,5 л буфера в 4,5 м мо- 45 чевине с рН 8,6 и сразу же включают ток.

Электродами служат .платиновые проволоки,,источником питания УИП-1. Электрофорез проводят при напряжении 4 в/см, силе тока

75 — 80 мА, температуре 2 — 4 C в течение 50

18 час 30 мин. Концентрация белка 1,4 — 1,5%, количество лунок — 8.

Фиксирование, сушка геля, окрашивание и отмывка электрофореграмм,проводятся известным методом. На электрофореграмме обна- 55 руживаются четко разделенных 15 казеиновых фракций.

Для количественного определения фракций электрофореграмму разрезают вдоль всех фракций по обеим ее сторонам, затем из этой ленты вырезают каждую фракцию,в отдельности и,измеряют ее длину в мм. Для контроля в пространстве между лентами электрофореграммы в светлом участке вырезают кусочки геля по ширине, равной ширине ленты.

Каждую фракцию после измерения их длины измельчают, помещают в пробирке и заливают 2 мл 0,1N раствора NaOH, содержащего

0,5 г ЭДТА в 1 л. Содержимое пробирок в процессе экстрагиро вания (30 мин) взбалтывают, затем раствор краски переливают в другую пробирку, а кусочки агара снова заливают 2 мл раствора щелочи. Перемешивают и оставляют на 30 мин. Элюат объединяют и измеряют оптическую плотность на СФ-4 при 590 ммк. По сумме оптических плотностей лроиз водят,расчет процентного содер>кания каждой .из 15 фракций казвина.

1. Способ определения фракций казеина молока, предусматривающий разбавление агара в буфере, содержащем мочевину, заливку полученного геля,в камеру, растворение казенна в буфере, внесение раствора казеина в гель, установку камеры в кювету с буферным раетвором, с последующим проведением процессов электрофореза, фиксации и сушки геля, и также окрашивания электрофореграммы, определения количества фракций путем элюирования раствором щелочи и определения оптической плотности фракций, отличающийся тем, что, с целью более полного качественного и количественного определения фракций казеина, используют боратно-ацетатный буфер с рН, равным 8,6 — 8,9, при этом концентрацию буфера в кювете устанавливают .в два раза меньше, чем при разбавлении агара.

2. Способ .по п. 1, отличающийся тем, что для приготовления боратно-ацетатного буфера используют ацетата натрия 47,5 г, борной кислоты 52,56 г и буры 76,28 г на 10 л воды.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что перед определением фракций казеина, последний высушивают ацетоном, а из агара перед его разоавлекием удаляют термолабильные фракции.

4, Способ,по п. 1, отличающийся тем, что процесс электрофореза,проводят при концентрации белка, равной 1,5 — 2,5%, температуре

+2 — 8 С в течение 17 — 18 час с использованием платиновых электродов.