Всесоюзная imm-\i^:^'^^^(^''-'\bhc.-a'---^'i'^iiili,^
35I375
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
Союз Соеетскит
СоцквлиотикесKих
РеоотОо 1к
Зависимый от патента ¹
М. Кл. С 12d 13, 06
Заявлено 28.VIII.1970 (№ 1462271/28-13) Приоритет
Комитет оо делвге иеовретений и открытий при Совете Миииотров
СССР
УДК 663.132:576.8.097 (088.8) Опубликовано 13.IX.1972. Бюллетень ¹ 27
Дата опубликования описания 2б.IX.1972
Авторы изобретения
Иностранцы
Йосеф Эрнст Тиманн и Хермес Паган (Италия) llностранная фирма
«Лепетит» (Италия) Заявитель
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРИПТОФАНА
Изобретение относится к огикробиологичсской промышленности, а именно к способам получения I -триптофана.
Известен способ получения 1.-триптофапа путем глубинного культивирования продуцирующих его микроорганизмов на водной питательной среде, содержащей в качестве источника углевода глюкозу, соли фосфора, магния, азота в присутствии предшественника триптофана, например индола, антраниловой кислоты и аэрации среды.
Предлагаемый способ позволяет увеличить выход 1 -триптофана.
Для этого в качестве продуцирующих микроорганизмов используют штамм бактерий
Bacillus subtilis S-10.
Штамм получают следующим образом.
10 м.г синтетической среды № 40, содержащей
200 у/мл 5-метил-триптофана (5-МТ) заливают в чашки Петри (диаметром 9 мм). Затем прибавляют 2,5 лл бактериальной суспензии
Bacillus subtilis и 0,5 мл раствора, содержащего 1000 т/лл 5-МТ. После инкубации при
28 С появляются резистентные по отпошеншо к 5-МТ колонии, некоторые из которы.: образуют побочные культуры не резистентных бактери й.
Колонии, образующие побочные культуры представляют собой мутанты, способные к поглощению 1 -триптофана культуральной среФ дой. Из этих рсзистентных мутантов выбирают культуру S-10, которую используют в процессе получения т -триптофана.
Синтетическая среда имеет следующий состав, т
КН;Р О. 0,1
koSO, Н,О 0,05 (ХН ) ..$0.г 0,35
Аспарагин 0,15
Глюкоза 1
Водопроводная вода 100 игл
Культивирование проводят на водной питательной среде, содержащей в качестве источ15 ника углевода глюкозу, соли фосфора, магния, азота в присутствии предшественника триптофана, например, индо Ia, антраниловой кислоты в течение 24 — 9б час при аэрации среды прн рН 5 — 8 и температуре 20 — 40 С.
20 Выход L-триптофана составляет 1,500—
11,000 угм.г и более в зависимости от состава среды и выбранных условий времени и температуры.
Морфологические и культуральные призна25 ки штамма.
Морфология. Палочкообразные клетки, 07—
0,8: 2,0 — 3,0 мк, неразветвлены. Споры имеют форму цилиндра, центральную или парацентральную форму. Подвижны посредством жгуЗ0 тиков, имеющих несколько латерально распо352375 тательной среды. Бродильную среду, которая привита видом S-10, обрабатывают при таких жс условиях как в примере 1. После суточного брожения и в часовых интервалах прибавляют
25 у/лгл антраниловой кислоты и 30 у/ячл аммониевого сульфата. В конце брожения аккумулировано 2686 у/лл L-триптофана.
Пример 3. S-10 культуру прополаскивают из скошенного агара и прививают питательной среде (100 >ил) указанного в примере 1 состава. После 24 час при 28 С среду наливают в сосуд, содержащий 4 л такой же среды.
Культуру перемешивают при 800 oo/ÿèí и проветривают. После 24 час 5% объема предкультуры заливают в сосуд, содержащий среду следующего состава, г:
Глюкоза 7 (NH4) в$04 0,7
КНгРО4 0,2
MgS04 ° 7Н20 0,5
Водопроводная вода до 100 лг.г
Значение рН после стерилизации 6,7.
Условия получения культуры идентичны с вышеописанными за исключением того, что значение рН выдерживают при 5,8 — б прибавлецием СаСО>. После 16 час роста индол предшественника прибавляют каждый час согласно следующим данным:
30 16 — 19 час по 100 у/>ил
20 — 24 час по 150 у/гил
25 — 31 час по 125 у/мл
32 — 42 час по 100 у/лгл
43 — 45 «ас по 150 у/лл
35 48 — 62 «ас по 100 у/лгл
68 — 69 час по 100 у/лгл
80 — 86 «ас по 60 у/,1г.г
Концентрация в у/лгл 1-триптофана в среде представляет:
40 через !б час 57 через 24 час 1826 через 26 час 4460 через 48 час 6452 через 70 час 7444
45 через 72 час 9296 через 84 час 9064 черсз 96 час 10380 ложснных pc3IIIIII. Грамм - поло>китсль11о.
Лэробпо.
Культуральные признаки. Агар-колонии.
Рост умеренный, грубый, нспрозрачный рост по поверхности, кремовый цвет.
Глвкозный агар. Рост в изобилии и тя>келее, чем на агаре.
Глюкозно-аспарагиновый агар. Рост в изобилии.
Тирозиновый агар. Продукт умеренный с рассеянным коричневым пигментом.
Бульон, Помутнение с ломкими пелликулами.
NaC2 бульон. Хороший рост до концентрации 12%.
Картофель. Хороший рост, морщинистый, рост по поверхности, желтый до коричневого цвета.
Физиологические признаки. Стабильная >келатина, разжижение слоевидпое.
Молоко лакмуса. Псптонизировано, щелочно.
Крахмал. Гндролизован.
Цитраты. Использованы.
Нитраты. Из нитратов получены нитриты.
Углеводы. Рост на глюкозе, арабинозс, сукрозе и мепнитоле. Образуетсл кислота, по газа не образуется.
Этилметилкарбинол. Получается.
Температурные условия. Оптимальный рост между 28 и 37 С.
Источник. Мутант выделяется обработкой
5-метил-1>1 -триптофацом.
Пример 1. $-10 культуру прополаскивают из скошенного агара и прививают питательной среде (100 ггл) следующего состава, г:
1 люкоза 8
КНОРР 04 О,1
МО$04 7НгО 0,05 (NH4) q $04 0,35
Водопроводная вода до 100 1г.г рН доводят до 7,0 прибавление>1 Na0H, после стерилизации рН падает до 6,7. Микроорганизм оставляют расти в течение 24 «ас при 28 С, потом его вливают в 4 л питательной среды такого >ке состава как описано выше и хранят в стеклянном ферментере. Бродильный сосуд выдерживают при 28 С, перемешивают при 800 об/лгин и проветриваюг.
Значение рН контролируют периодическим прибавлением стерильного СаСО„н поддерживают его равным 6,0 — 6,5.
B часовых интервалах в первый раз после
24 час, прибавляют 25 у/и.г аптраннловой кислоты. После 72 час брожения аккумулнровапо
1675 у/лгл L-триптофана, который выделяют стандартными методами при помощи древесного угля и элюирования.
Пример 2. Повторяют способ как описано в примере 1 при примсненпи такой ке п11Составит
Редактор Л. Народная Техред
Предмет изобретения
Способ получения 1-триптофана путем глубшшого культивирования продуцирующих его микроорганизмов на водной питательной средс, содержащей в качестве источника углевода глюкозу, соли фосфора, магния, азота в присутствии предшественника триптофана, например нпдола, антранн IQBQH кислоты и аэрации среды, oT,ãèчагощийся тем, что, с целью
1Bc;IH:Iåíèÿ выхода (.-триптофаца, в качестве продуцирующих микроорганизмов используют штамм бактерий Bacillus subtilis S-10. ель В. Дунье
3. Твраненко Корректор О. Тюрина
Типография, пр Сапунова, 2
Заказ 3036/15 Изд. Ао 1292 Тираж 406 Подписное
ЦНИИПИ Когиитета по делзгч изобретений и открытий при Совете Министров СССР
Москва, >К-35, Рзушскзя наб., д. 4/5
