Способ получения фитопреципитина

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских.Социалистических

Республик

395085

Зависимое от авт. свидетельства %в

=.àÿâëåíî 18.Ч1.,1971 (¹ 1671889/31-16) с присоединением заявки ¹â€”

Приоритет—

Опубликовано 28 Ч!11.1973. Бюллетень № 35

Дата опубликования описания 4.Xli. г 973

И, Кл. А 61k 23/00

Государственный номитет

Совета Министров СССР по делам изооретеннй и открытий ДК 612.398.133 (088.8) .Авторы .изобретения

М. Д. Луцик и И. И. Литвин

Львовский государственный медицинский институт

Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФИТОПРЕЦИ ПИТИ НА

Изобретение относится IK области бактериологии и биологии.

Известен способ получения фитопреципити на, согласно,котороьму гороховую муку экстра пируют растворо м хлорида натрия, центрифугируют, осаждают белок добавлением этанола, центрифугируют, добавляют 2 í. раствор NaOH до PH 7,5, лиофилизируют. Получе н ный преципитин не требует адсорби рова ния. Одна ко, фитопрец и пити н та киви способом получают в аморфном аиде.

Цель изобретен ия — пол учение фитопреципитина в кристаллическом, виде, что IIQBblшает его качество.

Это достигается тем, что белок осаждают сульфатом аммония в ии|слой среде, адсорбируют,на декстрановом геле из фосфатного буфера, содержащего 1% хлористого нагрия, рН 7,5, элюируют тем же буфером с добавкой

0,5 ноль глюкозы с последуюпсизг,переосаждением и кристаллизацией из спирто-водного раствора при рН 5,6 и температуре 4 — 5 С.

Пipm м ер:

1. Высаливание. 0,5 кг муки из лущенного гороха зкстрапуют 1,5 л 1 го -ным растворовг хлористого натрия 4 час,при перемешивали и и затем це нтрифугируют 15 лгин.

2. Выса,гивание алмониг1 сульфатом. К полученному экстракту доба вляют аммоний сульфат до 0,3 насыщения (19 г/100 лл), осадок удаляют центрифугированиезг 15 .иин. пр и 3000 об/лгин. К надосадочной жидкости добавляют авгзгоний сульфат до 0,6 насыщения (20 г/100 гял) и осадок, содержащий цре6 ципитич, собирают центрифугированиезь Выход составляет 28 г белка.

3. Высаливание в кис гой среде. Осадок белка, полученный .на гсредыдущей стадии, растворяют в 50 я.г воды, добавляют 1 н. со1О ляной кислоты до рН 2 — 2,5 (около 0,1 объема) и измеряют общий объем раствора. Вычисляют степень насыщения амхьоний сульфатом (насыщение осадка прин имают равным

0,6) и добавляют насыщенный распвор азгзгоний сульфата до 0,3 насыщения. Осадок удаляют центрпфугированием. К надосадочной жидкосги добавляют твердый амзго ний сульфат до 0,6.насыщения. Осадок собирают центрифугированием и подсушивают на воронке

20 Бюхнера. Выход составляет 5 г белка.

4. Адсорбиия на геле «Сефадекс Г-150».

Осадок белка растворяют в 15 — 20 .и.г,воды и нейтрализуют едким натровг до рН 5,6. Затезг раствор разбавляют водой в 4 раза и ооразовавшийся осадок через 30 гяин удаляют ценгрвпфугированием. Надосадочную жидкость доводят до рН 7,5 ед кизг нат ркг и наносят на,колонку размером 10Х20 ся, заполненную гелевг Сефадекса и уравновешенную

0,03 м фосфатным буфером, содержапвихг 1 0

Зо5085

Предмет изобретения!

Составитель Т. Головина

Текред Е. Борисова Корректор В. Жолудева

Редактор Д. Пинчук

Заказ 689/227! Изд. М 940 Тираж 467 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, )К-35, Раушская наб., д. 4/5

Тип. Харьк. Фил. пред. «Патент» хлористого натрия, рН 7,5. Колонку промывают буфером до исчезновения .белка в элюате.

Фитопреципити>н, ад>со>рбированный на геле, элюируют те>м,же буфером, к которому добавляют глюкозу до 9 7р (0,5 ноль). Вытекающую жт!дкость собирают на,коллекторе фракции и пробы, содержащие, белок, объеди>няют. Фитопрец!!>пг!ти!и элюируют в объе>ме 150 — 200,ял; его осаждают ам>моний сульфатом при 0,6 насыщения. Выход — 0,25 г белка.

5. Кристаллизаиия. Для удаления неорган>ичес>!<их,солей (аммоний сульфат) осадо . преци>п>итина (0,25 г) растворяют в 5 гпл воды, устанавливают,рН 5,6 помощью 1 н. уксусной кислоты. Затем постепенно добавляют

1,5 объема .этанола,,не допуская подъема темпе>ратуры выше 20 С, для чего посудину со смесью оьхлаждают водопроводной водой.

Осадок центрифуги>руют, растворяют в 5 ли! воды и повторно осаждают эта>налом. После втор ияного центрифугирования осадок р астворяют в 4 лл воды, раствор осветляют центрифупирова>нием пр>и 7000 об/л!ин и оставляют при 4 С на 24 час. При стоянии выпадают кристаллы,,которые >имеют форму тетраэдров с выпуклым>и граня>ми. б. Перекристаллизаиия. Кристаллы растворяют в воде при рН 8 (концентрация белка

3 — 4 >0 ), небольшую муть удаляют центрнфунирова>ние>м, после чего рН доводят до 5,6 и дооавляют несколько капель спирта. Оставляют,на 24 час при 4 С, 5 Количество получаемого бе,тка составляет

400 — 500 яг из 1 кг гороха, степень очистки ——

150 раз.

Все операции, .кроме специально указанHbIx, провозят >при комнатной температуре. !

О Активность приц>ипит>ина на различных стадиях очистки контролир>уют методом гемаглютинации в проб «р«ах.

Способ получения фитопрец>и>пит>ина путем экстра>кции го>роковой муки раствором хлорида натрия, осаждения бел>ка и его очистки, отличающийся те>м, что с целью повышения

20 каче".òâà целевого проду>кта, белок осаждают сульфато>м а>ммо>н>ия,B кислой среде, адсорбируют:на декстрановом геле из фосфатного буфера, содержащего 1% хлористого натрия, рН 7,5, элюируют тем же буфером с добав25 кой 0,5 моль глюкозы с последующим переосажде ние>м и кристаллизацией >из спиртоводного раствора при рН 5,6 и температуре

4 — 5 С.