Патент ссср 401667
ОПИСАНИ
40I667
Союз Советских
Социалистических
Реслублик
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Зависимое от авт. свидете1bcTBa ¹
Заявлено 05Х11.1971 (№ 1678416!23-4) с присоединением заявки ¹
Приоритет
Опубликовано 12.Х.1973. Бюллетень,¹ 41
Дата опубликования описания 27.1!.1974
М. Кл. С 07d 51 54
Гасударственный камнтет
Саввта Мииистраа СССР па делам иэааретеиий и открытий
УД К 547.857.7.07 (088.8) Авторы изобретения
Н. С. Сидорова, Э. М. Коган, К. А. Авербург, А. В. Грачева, С. Е. Бреслер, А. Л. Тимковский, В. М. Чернаенко и Л. Г. Бондаржевская
Институт высокомолекулярных соединений АН СССР
Заявитель
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИГУАНИЛОВОЙ КИСЛОТЫ
Изобретение относится к усовершенствованному способу получения полигуаниловой кислоты, которая может найти применение для биохимических, биологических и генетических исследований.
Известен способ получения высокомолекулярной полигуаниловой кислоты поликонденсацией гуанозин-5 -дифосфата в присутствии высокоочищенного фермента — полинуклеотидфосфорилазы из Escherichia coli (E. coli) с удельной активностью больше 100 и солей
Мп++. При этом процесс протекает нормально только с дифосфатами, не содержащими начального неорганического фосфора. Однако используемый гуанозин-5 -дифосфат легко разлагается при хранении и все продажные препараты, как правило, содержат отщепившийся неорганический фосфор и гуанозин-5 монофосфат. Очистка дифосфата от этих соединений технологически сложна. Кроме того, применяемый по известному способу фермент требует очень сложной шестистадийной очистки, в том числе трех стадий очистки методами колоночной хроматографии. Полигуаниловая кислота, получаемая по такому способу, является неиндивидуальным продуктом и не образует комплекса с полицитидиновой кислотой без дополнительной очистки.
С целью упрощения процесса по предлагаемому способу в качестве фермента используют частично очищенную полинуклеотидфосфорилазу с удельной активностью больше 1.
Применяемый гуанозин-5 -дифосфат может содержать до 25% неорганического фосфора.
5 Поликонденсацию целесообразно проводить в присутствии мочевнны, например, при концентрации 0.4 Ч.
Применяемый по предлагаемому способу фермент очищают в три стадии, исключая
10 колоночную хроматографию. Поскольку для синтеза полигуаниловой кислоты используют малоактивныи фермент, то полимер может содержать значительные примеси белка, для очистки от которого проводят дополнительную
15 депротеинизацию полимера смесью изоамиловый спирт — хлороформ.
Выход целевого продукта достигает 50% при использовании гуанозин-5 -дифосфата, не содержащего примесей неорганического фос20 фора, и 30 — 40% при содержании последнего
l5 — 25%.
Лиофильно высушенная полигуан илов ая кислота белого цвета не содержит нуклеотидных примесей, имеет молекулярный вес более
25 300000, не содержит примесей олигогуаниловой. и низкомолекулярной полигуаниловой кислот и образует комплекс с очищенной по лицитидиновой кислотой.
Пример l. 40 мл реакционной смеси, 30 содержащей 213 мг (400 мкмоль) гуанозин-5 401667
Составитель В. Жесткой
Редактор 3. Горбунова Техред Т. Миронова Корректор Т. Гревцова
Заказ 408/17 Изд. № 159 Тираж 523 Подписное
ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий
Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Типография, пр. Сапунова, 2
3 дифосфата фирмы «Calbiochem», 4 мл 1М трис-НС1-буфера (рН 8,5), 4 мл 0,02М MnSO4, 40 ед. активности полинуклеотидфосфорилазы из Е. coli третьей стадии очистки (фракция насыщена 34 — 43% сульфата аммония, уд. активность 2,28) и 32 мл бидистиллированной воды, инкубируют при 60 С. 3а ходом поликондексации следят по приросту неорганического фосфора в зависимости от времени. Реакцию заканчивают через 5 час. Прирост неорганического фосфора 59%.
Для выделения полигуаниловой кислоты реакционную смесь, охлажденную до 0 С, дважды экстрагируют при 0 С равным весовым количеством 90 -ного раствора свежеперегнанного фенола в 0,1М трис-НС1-буфере (рН 7,4).
Фенольный слой отделяют от водного центрифугированием в течение 40 мин при 0 С и
15000 g. Затем фенольный слой 4 раза промывают 0,1М трис-НС1-буфером с целью удаления полигуаниловой кислоты. Объединенный водный слой обрабатывают при 0 С смесью изоамиловый спирт — хлороформ (1: 2,5), используя на каждые 10 мл водного раствора
3,5 мл смеси. Следы фенола удаляют эфиром, полигуаниловую кислоту высаживают из водного раствора двукратным объемом спирта с кристалликами хлористого натрия и выдерживают в холодильнике в течение ночи. Выпавший осадок отделяют центрифугированием, растворяют в минимальном объеме 0,1 М трисНС1-буфера, диализуют в 2,5 л 0,2М раствора хлористого натрия, содержащего 0,001 моль
ЭДТА, трижды в бидистиллированной воде и лиофилизуют. Выделяют 213 мкмоль полигуаниловой кислоты. Выход 50%.
Пример 2. 30 мл реакционной смеси, содержащей 172 мг (330 мкмоль) гуанозин-5 дифосфата фирмы Реанал (примесь неорганического фосфора 18,6%), 3 мл 1М трис-НС15 буфера (рН 8,5), 3 мл 0,02М Мп304, 793 мг мочевины, 30 ед. активности полинуклеотидфосфорилазы из Е. coli третьей стадии очистки (фракция 34 — 43% насыщения сульфатом аммония, уд. активность 2,28) и 24 мл биди10 стиллированной воды, инкубируют при 60 С.
За ходом поликонденсации следят по приросту неорганического фосфора в зависимости от времени. Реакцию заканчивают через
5 час. Прирост неорганического фосфора 65 .
15 Полигуаниловую кислоту выделяют по примеру 1. Получают 121 мкмоль полигуаниловой кислоты. Выход 38%.
20 Предмет изобретения
1. Способ получения полигуаниловой кислоты поликонденсацией гуанозин-5 -дифосфата в присутствии фермента — полинуклеотидфос25 форилазы из Escherichia coli и солей Мп++ с последующим выделением целевого продукта известным способом, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, используют частично очищенную полинуклеотидфосфорилазу
30 с удельной активностью больше 1.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что гуанозин-5 -дифосфат содержит до 25% неорганического фосфора.
3 Способ по п. 1, отличающийся тем, что
35 поликонденсацию проводят в присутствии мочевины.
