Способ получения калликреинтрипсин-ингибитора

Авторы патента:

C07K14/78 - пептиды, связывающие ткань, например коллаген, эластин, ламинин фибронектин, витропектин, глобулин, нерастворимый на холоде (ГНХ)

C07K14/47 - из млекопитающих

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

I пп 5035II

Союз Советских

Социалистических

Республик

Х ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (51) М. Кл.2С 07С 103 52 (22) Заявлено 31.03.72 (21) 1765857, 28-13 (23) Приоритет вЂ” (32) 03.04.71 (31) P 2116377.9 (33) ФРГ

Опубликовано 15.02.76. Бюллетень ¹ 6

Государственный комитет

Совета Министров СССР ро делам изобретений и цтхрытнК (53) УДК 615.779.94 (088.8) Дата опубликования описания 06.05.76 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Эрих Рауенбуш и Кристиан Гелькер (ФРГ) Иностранная фирма

«Байер АГ» (ФРГ) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ

КАЛЛ ИКРЕИН-ТРИПСИН-ИНГИБИТОРА

Изобретение относится к медицинской промышленности, а именно к получению лекарственных препаратов.

Известен способ получения калликреинтрипсин-ингибитора, заключающийся в том, что органы крупного рогатого скота, например легкие, измельчают и после экстракции целевой продукт осаждают кислотами, например сульфосалициловой кислотой, с последующей кристаллизацией целевого продукта после его обессоли вания. Однако известный способ является трудоемким.

С целью упрощения процесса экстракт подкисляют до рН 1,0 вЂ”,3,0, вводят в него соли, например сульфат аммон|ия в концентрации ! вЂ 4 г/л, подвергают контакту с нейтральным нерастворимым в воде сшитым полимером пористой структуры из стирола и дивинилбензола с активной поверхностью 10вЂ”

1000 м /г, последовательно промывают полимер водой или разбавленной соляной кислотой и раствором соли этилендиаминотетрауксусной кислоты, элюируют целевой продукт градиентом воды и смешивающегося с водой органического растворителя.

Для осуществления способа существенным является качество сырого экстракта. Для этого орган, например легкое или околоушную слюнную железу, обрабатывают путем .метанольной экстракции и метанол затем снова полностью удаляют из экстракта. Сферическая активность составляет 70 вЂ” 90 единиц калликреин-ингибитора на 1 мг сухого веса.

Если переведение в растворимую форм осуществляют путем добавления карбоновой или минеральной кислоты, то после осветления адсорбция ингибитора на смоле является неполной, но ее можно улучшить посредст10 вом предварительной обработки сырого экстракта, например, путем добавления таких солей, как, например, сульфат аммония, или переведение в растворимую форму осуществля1от в присутствии сульфата аммония. Адсорб15 ция улучшается вследствие повышающейся концентрации соли, причем как верхний предел концентрация начинающегося осаждения ингибитора не должна быть превышена. Для сульфата аммония таким пределом является

20 насыщенность 0,2 вЂ” 0,5 при значении рН 1 вЂ” 2,5.

Свойство смолы также имеет большое значение, применяют пористые полимеризаторы из стирола и дивинилбензола с большой внут25 ренней поверхностью.

Адсорбцию ингибитора на смоле осуществляют из кислого раствора при значении рН

1 вЂ” 3. После проведенной адсорбции ингибптора смолу промывают волн м раствором.

503511

Наряду с чистой водой применяют и 0,01 М соляную кислоту и затем 0,02 М раствор натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты. При этом удаляют примеси. Вымывание ингибитора из смолы осуществляют органическими, смешиваемыми с водой раствори телями, например метанолом, этанолом, изопропанолом, ацетоном.

Концентрация, при которой вымывают калликреин-трипсин-ингибитор, зависит от вида растворителя. Добавки к растворителю могут изменить процесс десорбцин, Так, например, добавка аммиака содействует ускорению вымывания, причем вымываются и красящие компоненты. Полученный таким обра-ом калликреин-трипсин-ингибитор как показал электрофорез в полиакриламиде или на ацетилцеллюлозе, в значительной степени свободен от других сопутствующих полипептидов и солей. Специфическая активность составляет

3000 вЂ” 4000 единиц калликреин-ингибитора на

1 мг сухого веса. Выход составляет 60 вЂ” 80% содержания ингибитора сырого экстракта при обогащении в 30 вЂ” 40 раз.

Пример 1. 700 г легкого крупного рогатого скота, освобожденного от соединительной ткани и измельченного, переводят в растворимую форму метанолом при добавке хлорида кальция. Суспензию отдел я ют центрифугированием и в вакууме в ротационном испарителе сгущают до 275 мл. Метанол полностью удаляют. Значение рН раствора 1,5 устанавливают, добавляя 2 н. соляную кислоту, затем снова центрифугируют. Отделившийся сверху слой содержит 880000 единиц калликреин-ингибитора. Этот раствор вводят в следующую колонну.

50 г пористой полистирольной смолы с поверхностью 330 м /г поглощают в метаноле и до тех пор промывают, пока метанол не станет практически свободен от адсорбируемых при ультрафиолетовом облучении (280 HM) веществ. Затем метанол декантируют н заменяют кипяченой дистиллированной водой.

Водную суспензию смолы (примерно 100 мл), свободную от пузырей, вводят в стеклянную колонну и промывают 200 мл воды.

Содержащий ингибитор сырой экстракт вводят в колонну с пропускной скоростью

100 мл/ч, промывают 200 мл 0,01 М соляной кислоты и затем 200 мл натриевой соли 0,02 М этилендиаминтетрауксусной кислоты и 100 мл воды. Ингибитор при этом с линейным градиентом 1 л воды к 80% метанола вымывают и фракционированно улавливают. Содержащую ингибитор фракцию объединяют, метанол выпаривают в вакууме и водный раствор подвергают сублимационной сушке. Получают 180 мг ингибитора с 714 единицами калликреин-ингибитора, что составляет 81% содержания ингибитора. Специфическая активность составляет 3960 единиц калликреин-ингибитора на 1 мг.

Пример 2. 4 кг измельченного легкого крупного рогатого скота смешивают с 7,2 л

5 !

1 I3

5()

60 г дистиллированной воды. По истечении 10 мин размешивания добавляют 350 мл 10% -ной (по объему) HqS04 до установления значения рН 1,9. Дополняют до 12 л, дополняют 200 мл толуола и размешивают в течение ночи при комнатной температуре. Суспензию центрифугнруют в течение 10 мин при 4800 об/мин.

Общая активность в отстоявшемся наверху слое 8,15 !0 единиц калликреин-ингибитора.

Размешивая в течение 30 мин, добавляют (NIR<) SO> до насыщения 0,45. Значение рН посредством добавки концентрированной

IdqSO4 устанавливают на 1,5, в качестве фильтровального вспомогательного вещества добавляют 320 г кизельгура и немедленно фильтруют.

7 л этого раствора (общая активность

4,38)(10 единиц) калликреин-ингибитора вводят в колонну примерно с 2 л пористой полистирольной смолы с поверхностью

150 м /г. Перед этим кислоту промывают 1 н. метанольным HCI, метанолом и водой. После введения экстракта колонну промывают 4 л

0,01 и, НС1, 4 л 0,02 ЕДТА (натриевая соль этилендиаминотетрауксусной кислоты) и 2 л дистиллированной воды, затем вымывают линеарным градиентом, состояющим из 5 л дистиллированной воды и 5 л 80%-ного метанола. Активные фракции объединяют, метанол отгоняют в вакууме и раствор лиофилизируют. Получают 1,3 г вещества со специфической активностью 2500 единиц калликреин-ингибитора на 1 мг (общая активность

3,22)(10 единиц калликреин-ингибитора), что соответствует выходу 73,5% .

Пример 3. 120 кг легкого крупного рогатого скота метанолом при добавке хлорида кальция согласно примеру 1 переводят в растворимую форму. Из 400 л полученного прозрачного фильтрата метанол тщательно отгоняют. Водный раствор, содержащий калликреин-трипсин-ингибитор в сыром виде, подкисляют НС! до значения рН 1,5 и вводят в колонну с 8 л пористой полистирольной смолы с поверхностью 150 м /г. Общая активность

152)(10 единиц калликреин-ингнбитора. Колонну промывают 16 л 0,01 н. НС1, 16 л 0,02 М

ЕДТА и 10 л дистиллированной воды. Затем активное вещество вымывают линеарным градиентом из 20 л дистиллированной воды и

20 л 80%-ного метанола. Фракции, содержащие активное вещество, объединяют, метанол отгоняют и раствор лиофилизируют. Получают 25,7 г твердого вещества со специфической активностью 4200 единиц калликреин-ингибитора на 1 мг (общая активность 10 10 единиц калликреин-ингибитора), что соответствует выходу 71%.

П р и мер 4. 120 л легкого крупного рогатого скота, переведенного согласно примеру 1 с метанолом вЂ” хлоридом кальция в растворимую форму, после удаления метанола, установления значения рН 1,5 и центрифугирования дали 67 мл отделившегося сверху слоя с !

50000 единицами калликреин-ингибитора. В

503511

Составитель С. Малютина

Техред 3. Тараненко

Редактор Е. Хори на

Корректор О. Тюрина

Заказ 906jl3 Изд Хз 1116 Тираж 575 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, К-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр, Сапунова, 2

5 этот сырой раствор ингибитора вводят 10 мл пористой полистирольной смолы. После

30 мин на нутч-фильтре смолу отсасывают и промывают 100 мл воды, Затем смолу суспендируют и в течение 30 мин размешивают в растворе 20 мл изопропанола, дополненного водой до 100 мл. Смолу отсасывают и в фильтрате после отгонки изопропанола в вакууме определяют ингибитор. Выход 123 единиц калликреин-ингибитора, что составляет 80% имевшегося содержания ингибитора.

Формула изобретения

Сгюсоб получения калликреин-трипсин-ингибитора путем селективного выделения из сырого экстракта органов крупного рогатого скота, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, экстракт подкисляют до рН 1 0 вЂ” 3 О, вводят в него соли, например

5 сульфат аммония, в концентрации 1 вЂ” 400 г/л, подвергают контакту с нейтральным нерастворимым в воде сшитым полимером пористой структуры из стирола и дивинилбензола с активной поверхностью 10 вЂ” 1000 мз/г, после10 довательно промывают полимер водой или разбавленной соляной кислотой и раствором соли этилендиаминотетрауксусной кислоты, элюируют целевой продукт градиентом воды и смешпвающегося с водой органического ра15 створителя.

Способ получения калликреинтрипсин-ингибитора

Аналог-агонист амилина, его фармацевтически приемлемые соли, композиция, проявляющая свойства агониста амилина // 2130463

Днк-фрагмент, кодирующий нейротропный фактор мозга (bdnf), белок bdnf и способ его получения // 2131926

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии

Полиэтиленгликолевое производное полипептидов нейротрофического фактора и способ их получения // 2136694

Онкоингибин, способ его получения и фармацевтическая композиция, содержащая онкоингибин // 2139087

Изобретение относится к медицине, а именно к области препаративной биохимии, и касается онкоингибина, способа его получения и фармацевтической композиции, содержащей онкоингибин

Пептиды для ингибирования высвобождения пепсина, фармацевтическая композиция // 2144038

Ингибитор пролиферации стволовых клеток и его использование // 2155066

Изобретение относится к области медицины, а именно к использованию ингибиторов пролиферации стволовых клеток

Терапевтический белок // 2155810

Изобретение относится к новому белку - человеческому фактору стволовых клеток (ФСК, SCP), ДНК - последовательностям, кодирующим этот белок, его применению в терапии, в частности при оплодотворении in vitro, а также к фармацевтическим композициям, содержащим такой белок

Способы и препараты для стимулирования роста и дифференцировки мегакариоцитов // 2158603

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии, а именно к новым белкам, являющимся факторами роста и развития мегакариоцитов (MGDFs; в основном обозначенных как Mp1-лиганды), биологическая активность которых заключается в стимулировании роста мегакариоцитов и их дифференцировки или созревания, что в конечном счете приводит к образованию тромбоцитов

Белки из печени козы, обладающие противоопухолевой активностью, фармацевтическая композиция // 2163243

Визуализирующий агент и способ обнаружения материала, содержащего фибрин // 2109750

Изобретение относится к диагностике и лечению таких заболеваний, как атеросклероз и тромбоз

Новые синтетические пептиды, легочная поверхностно-активная композиция, лекарственный препарат для лечения респираторного дистресс-синдрома // 2144925

Полипептиды, обладающие активностью легочно-поверхностно активного вещества, и фармкомпозиция // 2145611

Изобретение относится к легочным поверхностно-активным полипептидам, способу их получения и к содержащим их композициям

Богатые гидроксипролином белки и содержащие их косметические препаративные формы // 2163266

Изобретение относится к богатым гидроксипролином гликопротеинам, которые имеют среднюю молекулярную массу 20000 Дальтон и высокую растворимость в воде

Культивируемые эндотелиальные клетки, экспрессирующие белок, обладающий ib-активностью, последовательность днк, кодирующая белок, рекомбинантная конструкция днк, способ получения клеток, белок, обладающий ib-активностью // 2164415

Изобретение относится к медицине

Способ стерилизации нативного коллагена в жидкой среде, полученный стерильный нативный коллаген, содержащие его композиции и их применение // 2188206

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения коллагена из солюбилизированного и очищенного, возможно, пепсинизированного экстракта нестерильного нативного или ателопептидного коллагена, включающему: i) стадию перемешивания и сдвига указанного экстракта в смесителе с двойными поперечными резцами при поэтапном повышении первоначальной скорости перемешивания на 500-1000 об/мин без превышения скорости 10000 об/мин и при поэтапном повышении температуры на 2-10oС, предпочтительно на 3-5oС, таким образом, чтобы увеличить исходную окружающую температуру экстракта до максимально контролируемой температуры, составляющей не выше 50oС, а затем ii) стадию стерилизации в жидкой среде указанного экстракта с получением стерильного коллагена в нативной или ателопептидной форме, к нативному или ателопептидному коллагену типа I, полученному в условиях вышеуказанного способа, имеющему следующие характеристики или свойства: соотношение 2(I)1/1(I)2 от 0,48 до 0,52; стерильность в соответствии со стандартом Европейской Фармакопеи; общее содержание азота от 17,0 до 18,7%; гидроксипролин от 12 до 13,9%; не содержит триптофан, аминогликаны и полипептиды с мол.м

Меченые аналоги глутамина и лизина // 2205186

Изобретение относится к соединениям формулы Y-(CR2)n-X-NHJ, где Х представляет собой С=O или CR2; n является целым числом, имеющим значение от 1 до 6; Y представляет собой L(A)m- или R1R2CR-, где L - металлокомплексообразующий агент, А представляет собой -CR2-, -NRCO-, -CONR- или полиалкиленгликоль; m является целым числом, имеющим значение от 0 до 10; где один из R1 и R2 является -NH(B)p Z1 и другой является -CO(B)qZ2, где р и q являются целыми числами, имеющими значение от 0 до 20, и каждый В независимо выбирают из Q или остатка аминокислоты, где Q является циклическим пептидом; Z1 и Z2 - защитные группы, которые являются биосовместимыми группами, которые ингибируют или подавляют метаболизм пептида in vivo; J и каждую R-группу независимо выбирают из Н, C1-4 алкила или С1-4 алкоксиалкила; при условии, что (i) общее число остатков аминокислот в R1 и R2 группах не превышает 20; (ii) если Х является CR2, то Y является -CRR1R2, и Z2 является металлокомплексообразующим агентом; (ii) если Y является -CRR1R2, то по крайней мере один из R1 и R2 несет, по крайней мере, одну детектируемую частицу

Низкомолекулярные производные пептидов как ингибиторы взаимодействия ламинина/нидогена // 2262509

Рецептор edb-домена фибронектина // 2280254

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине

Низкомолекулярные производные пептидов как ингибиторы взаимодействия ламинина/нидогена // 2380371