Способ получения диагностикума для выявления псевдотуберкулеза

 

офа.о i> sR+» иэ

ОП ÍÅ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социелистимеских

Республик (») 29832 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 14.08.74 (21) 2053690/13 (51) М. Кл.

A 61 К 35/66 с присоединением заявки №

Государственный иомитет

Совета Министров СССР по делам изобретений н открытий (23) Приоритет (43) Опубликовано 30.09.76 Бюллетень № 36 (45) Дата опубликования описания 03.12.76 (53) ДК 616-097:616-00 2.7 1 (08 8. 8) М. Ф. Дзадзиева (72) Автор изобретения

Впадивостокский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии (71) Заявитель

{ 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ

ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗА

Изобретение относится к микробиологии и касается выделения биологически активных комплексов из бактериальной клетки.

Известен способ получения диагностикума для выявления псевдотуберкупеза, заключающийся в том, что исходную культуру выращивают на плотной среде, суспензию микроорганизма прогревают в течение 1,5 час при 100 С, отделяют осадок, надосадочную жидкость используют для сенсиби- 10 лизации эритроцитов.

Известен также способ получения диагностикума дпя выявления псевдотуберкупеза путем выращивания культуры псевдотуберкупезных бактерий на питательной среде, их обезвреживания и выдепения целевого продукта.

Однако известные способы не обеспечивают высокой чувствитепьности к специфичности препарата. Кроме того, они обладают 0 высокой токсичностью.

Uenb изобретения — повысить чувствитепытость и специфичнссть препарата.

Это достигается тем, что выращенную культуру отдепяют от токсических поверх- 25

2 ностных субстанций, обезвреживание ведут ацетоном и целевой продукт выдепяют экстракцией мочевиной.

Пример. Производят посев на 30 матрасов объемом 2 л с мясо-пептонным агаром (MfIA) 250 мл суточчой культуры

>. ps ev 4о 4 и b е г с и Г î s i s в 5 мл стерильного физиологического раствора и выращивают о бактериапьную массу при 22-24 С в течение 48 час.

Бактериальную массу смывают и трехкратно от экстрацеллюпярных компонентов стерильным физиологическим раствором центрифугированием со скоростью 6000 об/мин в течение 30 мин.

Отделение жгутиков и поверхностных токсических субстанций проводят на дезинтеграторе (встряхиванием бактерий в конч центрации 2 10 в стаканах порциями по

30 мп в течение 15 мин) с поспедующим отделением осадка центрифугированием со скоростью 6000 об/мин в течение 30 мин, Полноту снятия капсупы контролируют мазком с окраской по Бурри. Обезвреживают оставшуюся бактериальную массу ацетоном

529833

Составитель С. Малютина

Редактор М. дмитриева Техред Н. Андрейчук Корректор С. Болдижар

Заказ 5209/958 Тираж 630 Подписное

БНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 в соотношении 1:10 с выстаиванием в холодильнике в течение суток. Стерильность суспензии контролируют посевом на чашки

Петри с МПА. Отделение ацетона производят центрифугированием со скоростью б

3000 об/мин в течение 20 мин. Затем бактериальную массу высушивают в вакууме или на воздухе.

После этого белки трехкратно экстрагируют стерильным 2,5%-ным раствором поварен10 ной соли (20,15 и 10 объемами по отношению к объему "ацетонового" порошка бактерий с выстаиванием в рефрижераторе, по 24 час) с предварительным встряхиванием в течение 30 мин на Шуттель-аппарате.

Копсервируют растворы TQJpjoJIolvf. Осадок отделяют центрифугированием со скоростью

6000 об/мин в течение 30 мин. Бактериаль. ный остаток экстрагируют стерильным

2,5 М раствором мочевины (1:20) в тече- 0 нпе 7? час с периодическим встряхиванием о в термостате при 38 С. Консервируют толуолом (5 капель на 1 л жидкости). Осадок отделяют центрифугированием, Д ализ суперпатанита производят в холодильнике на магнитной мешалке против дистиллированной воды до отрицательной реакции на мочевину с нитропуссидом натрия. Полученное вещество лиофилизируют.

Зффект иммунизации против инфекции . ° pse doke 02Рс 0 (os 5

Препарат в концентрации 500 мкг в мл растворяют в стерильном физиологическом растворе, фильтруют через мембранные фильтры ¹ 2 (поры 213 ммк). Белых мы- З ей весом 12-14 r иммунизируют подкожно в дозе 0,1 мл (50 мкг). Через 14 дней животных заражают внутрибрюшинно 10 ðO (1Q смертельных доз) в 0,1 мл физиологического раствора вирулентной культурой щ

9.p eudotubercukos

Оос группы мышей наблюдают в течение

21 дня. Иммунизированные мыши выживают в 90% случаев, контрольные — погибают 45 в течение 15««20 дней.

Определение сенсибилизирующей активности липопротеинополисахаридного (ЛППС) комплекса J, pseud dotu bevc,u EosLs

Препарат растворяют в физиологическом Я

4 растворе на фосфатном буфере рН 7,2 в концентрации 100 мкг в мл. Формалинизированные эритроциты барана или человека 1 (О) группы, обработанные по известному способу Dngt e hиrn 1965, сенсибили зируют приготовленным раствором в течео ние 2 час в термостате при 37 С с периодическим встряхиванием. От избытка ЛППС комплекса трехкратно отмывают физиологическим раствором с добавлением 1% нормальной кроличьей сыворотки (центрифугированием со скоростью 1500 об/мин в течение 20 мин). Сенсибилизированные таким образом эритроциты человека или животных применяют для реакции непрямой гемагглютинации по известному способу.

Определение антигенных свойств ЛППС комплекса

Препарат, разведенный в физиологическом растворе, стерилизуют фильтрацией через мембранные фильтры м 2 (213 ммк) и вводят внутривенно кроликам весом 0,5 кг из расчета 35 мкг на кг веса. Кровь для исследования на наличие антител берут накануне инъекции, через 3,7,14, 28 и 60 дней. Титры антител определяют в реакциях агглютинации, непрямой агглютинации, бактериального лизиса (РА, РНГА и РБЛ).

Полученный препарат найдет применение в получечии гипериммунных сывороток: приготовлении эритроцитарного диагностикума, крайне необходимо для диагностики псевдотуберкулеза человека (дальневосточной скарлатиноподобной лихорадки), а также как иммуногенный аппарат в борьбе с инфекцией.

Формула изобретения

Способ получения диагностикума для выявления псевдотуберкулеза путем выращивания культуры псевдотуберкулезных бактерий на питательной среде, их обвзвреживания и выделения целевого продукта, о т л и— ч а ю шийся тем, что ° с целью повышения чувствительности и специфичности препарата, выращенную культуру отделают от токсических поверхностных субстанций, обвзвреживание ведут ацетоном и выделяют целевой продукт экстракпией мочевиной.