Способ выделения эндонуклеазы
СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ЭНДОНУК- ЛЕАЗЫ из культуральной жидкости Serratia marcescens путем осаждения сульфатом аммония с последующей хроматографической очисткой, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и его степени чистоты, хроматографию осуществляют на полистироль ной анионообменной смоле типа АН 17.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИК (19) (11) 3(Я) С 12 Н 9/10
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н ABTOPCHGMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21 ) 1780634/13 (22) 03.05,72 (46) 30.01.84. Бюл. Р 4 (72) О.И. Полидорова, P.È. Салганик, Л.П. Сенженко и В.К. Старостина (71) Специальное конструкторско"технологическое бюро биологически активных веществ (53) 615.779.94 (088.8) I (54) (57) СПОСОБ В6ЩЕЛЕНИЯ ЭНДОНУКЛЕА36) из культуральной жидкости
Serratia rnarcescens путем осаждения сульфатом аммония с последующей хроматографической очисткой, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и его степени чистоты, хроматографию осуществляют на полистирольной анионообменной смоле типа АВ 17. г
537512
Редактор 3. Бородкина Техред A.Áàáèíåö Корректор А. Зимокосов о
Тираж 522 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Заказ 1065/3
Филиал ППП "Патент", r Ужгород, ул. Проектная,4
Изобретение относится к биологии, а именно к способам получения ферментных препаратов.
Известен способ получения эндонуклеазы, заключающийся в том, что целевой продукт высаливают иэ куль- 5 туральной жидкости Serratia marcescens с помощью сульфата аммония с последующими хроматографией раствора на смоле Амберлит РЯС=50, обессоливанием на биогеле Р-6, хро- fp матографией на смоле Сефадекс A-50 и концентрированием раствора фермента.
С целью повышения выхода целевого продукта и его степени чистоты хроматографию осуществляют на полистирольной анионообменной смоле типа AB 17.
Способ выделения и очистки эндонуклеазы из культуральной жидкости
Serratia marcescens штамма В 10М1 и 10 осуществляют следующим образом.
Выращивание проводят по известной методике. Для этого 2 л культуральной жидкости, содержащей
300 ед. акт./мл эндонуклеазы (за единицу активности эндонуклеазы принимают прирост оптической плотности в кислоторастворимой фракции ца 1 единицу оптической плотности, измеренной при 260 нм, за 20 мин 30 при 37 C), 0,1-0,2% от активности эндонуклеазы ФМЭ и 1-23 от активности эндонуклеазы ФДЭ, центрифугируют, к супернатанту добавляют (NHq)> ЯО до 40Ъ насыщения и смесь 35 снова центрифугируют. Осадок отбрасывают, к супернатанту добавляют (МНц) $0, до 80% насыщения и смесь центрифугируют. Осадок собирают и растворяют его в 30 мл 0,05 М трис-HCR рН 8,2, 0,005 М MgCIg .
Затем раствор фермента центрифугируют, нерастворимый осадок отбрасывают. Выход эндонуклеаэы по активности составляет 80-90%. !
Супернатант, содержащий около 3 г белка, 5000000 ед.акт. эндонуклеазы, 0,1% ФМЭ и 0,2-0;5% ФДЭ, наносят на колонку с анионообменной смолой
AB 17x2 в фосфатной форме, уравновешенную 0,01 М Na-фосфатным буфером, рН 7,5. Фермент не сорбируется на смоле и элюируется 0,01 М Na-фосфатным буфером, рН 7,5, в объеме
500 мл. Пигменты, балластные белки, а также фосфатаза и фосфодиэстераза задерживаются на анионообменнике.
Выход фермента по активности составляет 80-90%.
Раствор фермента концентрируют при упаривании на ротационном испарителе при 30 С до объема 100 мл.
В результате очистки получают раствор фермента, содержащий около
100 мг белка, 4000000 ед.акт, эндонуклеаэы, около 0,01% ФДЭ и не более 0,001% ФМЭ. Общий выход фермента по активности составляет 60-70%.
В ходе очистки активность фосфатазы и фосфодиэстеразы уменьшается в
100 раз.
